Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белок-белковые взаимодействия в мембране: димеризация трансмембранных сегментов мембранных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Белок-белковые взаимодействия в мембране: димеризация трансмембранных сегментов мембранных белков"

На правах рукописи

ГОНЧАРУК Марина Валерьевна

БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МЕМБРАНЕ: ДИМЕРИЗАЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ МЕМБРАННЫХ

БЕЛКОВ

Специальность 03 00 02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

UUÜ446BOU

Москва - 2008

003446990

Работа выполнена в ИБХ РАН, на Кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ)

Научный руководитель:

академик

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Кирпичников Михаил Петрович

Аксенов Сергей Иванович

Машко Сергей Владимирович

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 16 октября 2008 г в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д501 001 96 по адресу 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан 15 сентября 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ТЕ Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение внутримембранных белок-белковых взаимодействий - чрезвычайно актуальная и интересная задача современной молекулярной биологии Интегральные мембранные белки (МБ) играют исключительно важную роль в биологических процессах, составляющих основу жизнедеятельности клетки В свою очередь, трансмембранные (ТМ) сегменты (ТМС) принимают непосредственное участие в поддержании структуры МБ и их функционировании Действие не менее половины лекарств, выпускаемых в настоящее время, нацелено на МБ, однако молекулярные механизмы функционирования МБ, к сожалению, еще очень слабо изучены На начало сентября 2008 года полностью известна трехмерная атомная структура примерно двух сотен МБ (http //bianco biomol uci edu/Membrane_Proteins_xtal html), что составляет менее 1% от всех структур белков, представленных в Protein Data Bank В первую очередь это связано со сложностью получения очищенных препаратов МБ в количествах, необходимых для проведения структурно-функциональных исследований В частности, основными возникающими проблемами являются токсичность для клетки-хозяина, а также гидрофобность мембранных участков, затрудняющая последующую очистку МБ

Известно, что функционирование ряда МБ часто сопряжено с процессом димеризации Анализ большого числа аминокислотных последовательностей МБ, потенциально способных к димеризации, а также введение точечных мутаций позволили исследователям обнаружить последовательности аминокислот (мотивы), присутствие которых в ТМ областях МБ является достаточным условием димеризации этих молекул Изучение механизмов, управляющих димеризацией, понимание аспектов, связанных с ролью ТМС в активации и функционировании, расшифровка пространственной структуры МБ заложат основу современного подхода к рациональному дизайну лекарственных препаратов нового поколения, например, основанному на синтетических пептидах, регулирующих свойства и функции рецепторов и каналов биологической мембраны

Цель и задачи исследования

Целью данной диссертационной работы является изучение белок-белковых взаимодействий в составе димерных комплексов различных ТМ пептидов в мембране и/или мембраноподобном окружении Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи а) разработка универсальной системы эффективной экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках Е coli, а также создание универсального протокола очистки ТМ пептидов, б) изучение процессов димеризации ТМ пептидов m vitro в средах, имитирующих биологическую мембрану, при помощи оптических методов анализа, спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения и методов молекулярного моделирования, в) изучение димеризационной способности ТМ сегментов в бактериальной мембране

Объекты и методы исследования

В работе использовали традиционные методы генетической инженерии и белковой химии полимеразная цепная реакция (ПЦР), рестрикция, лигирование, электрофорез ДНК, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей, выделение плазмидной ДНК из Е colt, трансформация клеток Е coli плазмидной ДНК, денатурирующий электрофорез белков,

1

различные типы хроматографии, методы спектроскопии кругового дихроизма (КД), динамического светорассеяния, ЯМР-спектроскопии, молекулярного моделирования

В качестве объектов исследования были выбраны ТМ области с прилегающими аминокислотными остатками следующих МБ ОрА, В№рЗ, ЭсиБ (второй ТМС), ЕгЬВ1, ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ, ЕгЬВ4, ЕрЬА1, ЕрЬА2 (далее для обозначения соответствующего объекта исследования используется сокращенное наименование Пп [белок-источник])

Гликофорин А (ОрА) человека представлен на поверхности эритроцитов, играет важную роль во взаимодействии этих клеток между собой, а также определяет их поведение в кровотоке Бактериальный белок ОсиБ относится к сенсорным гистидиновым протеин-киназам Он входит в состав двухкомпонентных регуляторных систем, обеспечивающих своевременный клеточный ответ на изменение внешних факторов Проапоптозный белок В№рЗ является членом семейства Вс12 апоптозных факторов, активирующихся в ответ на гипоксию и участвующих в инициации клеточной смерти Семейство рецепторов эпидермального фактора роста, или ЕгЬВ, представляет собой важный класс рецепторных тирозинкиназ (РТК), играющих ведущую роль в процессах клеточного роста, развития и дифференцировки Нерегулируемая экспрессия рецепторов ЕгЬВ, в частности, ЕгЬВ1 и ЕгЬВ2, связана с развитием и злокачественным характером многочисленных видов рака человека Семейство эфриновых рецепторов, или ЕрЬ, является самым большим классом РТК Во взрослом организме взаимодействия ЕрЬ рецептора с лигандом могут вызывать, например, изменение подвижности, адгезию, отталкивание, особенно нейрональных и эндотелиальных клеток, обусловливать гибкость синапсов, обучение, формирование памяти и психические расстройства Нерегулируемая экспрессия рецепторов ЕрЬ на поверхности клетки, по-видимому, характерна для процессов опухолеобразования и метастазирования

Для активации и функционирования молекул гликофорина А необходимо образование стабильных, энергетически выгодных димеров, происходящее в результате самоассоциации молекул в области ТМ а-спиральных участков (остатки 73 - 95) При помощи сайт-направленного мутагенеза было обнаружено, что определяющими для образования димерного комплекса являются 7 остатков (1ЛххОУххОУххТ) ТМ сегмента ОрА, что было подтверждено при помощи спектроскопии ЯМР высокого разрешения На основе анализа различных теоретических и экспериментальных данных показано существование нескольких характерных димеризационных мотивов в ТМ доменах белков Обнаружение схожих мотивов в структурно не охарактеризованных белках делает последние интересными объектами исследования Предполагается, что наличие характерных «димеризационных» мотивов в В№рЗ, БсиБ (второй ТМС), ЕгЬВ1, ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ, ЕгЪВ4, ЕрЬА1, ЕрИА2 достаточно для димеризации МБ с их последующей активацией

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработаны оригинальная система эффективной экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках Е соЬ и универсальный протокол выделения ТМ пептидов Универсальность и эффективность разработанного протокола подтверждены на примере 9 ТМ пептидов из различных МБ, а именно ¡тврА, йпОсиЗ, Ш1В№рЗ, ЬпЕгЬВ1, ЦпЕгЬВ2,йпЕгЬВЗ, ИпЕгЬВ4, 1шЕрЬА1, 1тЕрИА2 Предложенные подходы могут быть использованы для суперэкспрессии генов, соответствующих другим ТМ пептидам

С использованием предложенной системы были получены ТМ пептиды и их изотопно-меченые 15N-, isN/'3C- производные в количествах, достаточных для установления их структурной организации в мембраноподобном окружении с помощью оптических методов анализа и спектроскопии ЯМР Это позволило впервые получить структурную информацию о димерных комплексах tmBNip3, tmErbB2, tmErbB4, tmEphAl, tmEphA2 в мембраноподобном окружении

На основании системы ToxR создан экспериментальный протокол, позволивший впервые выявить интерфейс димеризации ТМ участка EphAl в бактериальной мембране Созданный протокол может быть использован для изучения димеризационной способности ТМС других белков в мембране бактерии

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на XVII Зимней школе ИБХ РАН (Москва, 2004), XLVII Научной конференции МФТИ (Москва, 2004), XLVIII Научной конференции МФТИ (Москва, 2005), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова (Москва, 2006), VIII международном семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология) (Ростов-на-Дону, 2006), Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter, 3rd meeting (St Petersburg, 2006), Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter, 4th meeting (St Petersburg, 2007)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них в рецензируемых журналах - 2, в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК - 2, тезисов докладов на международных конференциях и семинарах - 4, тезисов докладов на российских научных конференциях - 4

Объем и структура работы

Диссертация состоит из Введения, трех глав, включая Литературный обзор, Заключения и Выводов Общий объем работы составляет 133 страницы текста, включая 26 рисунков, 3 таблицы и список литературы, содержащий 135 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Рассмотрена актуальность выбранной темы, обоснована практическая значимость, сформулирована цель работы, и определены задачи исследования

Глава 1. Обзор литературы

В диссертационной работе обзор литературы представлен тремя разделами Первый посвящен МБ, которые, как известно, играют важную роль во многих биологических процессах, их классификации, рассмотрению примеров и способов передачи внешнего сигнала внутрь клетки, а также взаимосвязи функционирования некоторых МБ с гомо- или гетероассоциацией их ТМС Приводятся аргументы в пользу актуальности исследования спираль-спирального взаимодействия внутри биологической мембраны Раздел иллюстрирован кратким описанием

некоторых МБ, механизм функционирования которых до сих пор не полностью изучен, но предположительно связан с димеризацией их ТМС

Второй раздел посвящен рассмотрению основных используемых на данный момент подходов к получению МБ и ТМС, описанию часто встречающихся проблем и способов их решения для достижения высокоуровневой экспрессии рекомбинантных МБ

Третий раздел содержит сводную информацию о структурных методах исследования МБ, широко применяемых в настоящее время, таких как спектроскопия ЯМР, кристаллография Кроме этого, рассматриваются дополнительные методы исследования физико-химических свойств МБ (атомно-силовая микроскопия, электронный парамагнитный резонанс, флуоресцентная спектроскопия, молекулярное моделирование, ToxR-системы), использование которых делает структурно-функциональное исследование более полным

Глава 2 Материалы и методы

Во второй главе содержатся сведения, касающиеся использованных в работе бактериальных штаммов, плазмидных векторов, ферментов, реактивов, олигонуклеотидов, культуральных сред, буферных растворов, хроматографических смол и других материалов Приведены описания методик, использованных для выполнения поставленных задач

Данные КД-спектроскопии, динамического светорассеяния, ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования были получены совместно с сотрудниками Отдела структурной биологии ИБХ РАН

Глава 3 Результаты и обсуждение

Глава посвящена результатам, полученным в ходе выполнения данной диссертационной работы, а также их обсуждению

Разработка универсальной системы экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках Е coli

Для достижения высокого уровня экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в бактериях такие подходы, как прямая и секреторная экспрессия, чаще всего оказываются неприменимыми Это объясняется способностью рекомбинантных МБ накапливаться в клеточной мембране бактерии При суперэкспресии это приводит к дестабилизации мембраны, нарушению ее целостности и гибели клетки Чтобы избежать возможной токсичности ТМ пептидов для клеток бактерий мы прибегли к конструированию гибридных систем бактериальной экспрессии (здесь и далее под "ТМ пептидом" будут подразумеваться соответствующие фрагменты исследуемых МБ - tmGpA, tmDcuS, tmBNip3, tmErbBl, tmErbB2, tmErbB3, tmErbB4, tmEphAl, tmEphA2) В качестве белка-партнера был выбран тиоредоксин Е coli (Тгх А) - небольшой белок, молекулярная масса которого составляет примерно 12 кДа Ряд свойств этого белка делают его эффективным партнером для систем гибридной экспрессии, в частности, высокая растворимость (до 40 % от общего белка Е coli), а также доступность N- и С-концов для размещения белков-партнеров Так как тиоредоксин по сравнению с другими белками-носителями обладает небольшим размером, его доля в химерном полипептиде обычно сравнима с долей целевого белка, что также немаловажно

Часто токсичность МБ или ТМС по отношению к клетке-хозяину проявляется и в случае гибридной экспрессии целевого белка В нашей системе на N- конце тиоредоксина был предусмотрен специальный Н-таг, устраняющий токсичность гибридной конструкции, который представляет собой N-концевой фрагмент мембрано-активного белка из Helicobacter pylori С целью последующего отщепления целевого белка от белка-носителя между последовательностями тиоредоксина и ТМ пептида была предусмотрена аминокислотная последовательность DDDDK, представляющая собой сайт узнавания энтерокиназы человека Этот высокоспецифичный фермент селективно гидролизует пептидную связь, находящуюся непосредственно после сайта узнавания (за исключением связи Lys-Pro) В результате расщепления полипептидной цепи при помощи энтерокиназы можно получить белок с нативным N-концом, не содержащим лишних аминокислот Для обеспечения доступности сайта узнавания энтерокиназы непосредственно перед последовательностью DDDDK был введен так называемый гибкий линкер, состоящий из чередующихся остатков глицина и серина Это придавало участку, соединяющему тиоредоксин с пептидом, гибкость и гидрофильность, а также уменьшало вероятность возникновения стерических препятствий при работе фермента. Кроме этого, непосредственно между С-концом тиоредоксина и гибким линкером присутствовала последовательность из шести гистидинов (His-таг) для последующей очистки гибридного белка при помощи металлохелатной аффинной хроматографии (МХАХ) Далее для краткости аминокислотную последовательность (гибкий линкер)-(Н13-таг)-(гибкий линкер)-(сайт узнавания энтерокиназы) будем называть просто "линкер", а для последовательности (Н-таг)-(Тгх А)-(линкер) введем название TRX

Конструирование экспрессионных векторов pGEMEX-l/(TKX-[TM пептид])

Аминокислотные последовательности ТМ пептидов выбирали из природных последовательностей МБ (Табл I) При выборе длины участков, прилегающих к ТМ области, руководствовались несколькими основными критериями, в частности, учитывали суммарный заряд пептидов при кислом и щелочном значениях рН, отсутствие в последовательности потенциальных сайтов узнавания энтерокиназы, длину N-концевого гидрофильного участка молекулы и некоторые другие свойства

Табл 1 Аминокислотные последовательности и основные свойства ТМ пептидов

В аминокислотной последовательности ТМ пептидов серым указаны предположительные ТМ области, а жирным шрифтом - характерные мотивы, участвующие в дичеризации ТМ пептидов

ТМ пептид Длина, а о Аминокислотная последовательность Расчетное значение Pi Молекулярным вес, кДа

tmdDcuS 30 DSRWSIIWSVLFGMLVGLIGTCXLVKVLKK 107 34

tmDcuS 38 SRVTQQINDSRMSIIWSVLFGMLVGLtGTCILViO/LKK 11 5 43

tmGpA 38 RVQLAHH FSEPE1TLIIFGVMAGVIGTILLIS¥GIRRL 98 42

tmBNip3 45 RNTSVMKKGGIFSAEFLKVFLPSLLLSHLLAIGLGIilGRRLTTS 114 49

tmErbBl 44 EGCPTNGPKIPSXAiGMVGAtLLttWaLGIGLFMRRRHIVRKR 126 47

tmErbB2 44 GC PAEQRAS gLTSI ISAVyGILLVWbGWFGILIKRRQQKI RK 12 4 47

tmErbB3 44 QTLVLIGKTHLtMALTVIAGLWIiMMLGGTFLiWRGRRIQNKR 124 50

tmErbB4 44 STLPQHARTFblftAGVIGGLFitVIVGLTFAVYVRRKSIKKKRA 124 48

tmEphAl 38 sppvsrgltggeivavifglllgaalllgxlvfrsrra 124 39

tmEphA2 41 EFQTLSPEGSGNIAVIGGVAVGWLLbVIAGVGFFXHRRRK 112 43

Рис 1 Основные этапы

рСШЕХ-1/(ТЮС-[ТМ пептид])

сборки

экспрессионной

конструкции

5' праймер

ймер |

3' праймер

Амплификация

ТИХ

ТМ пептид

Т7

Рекомбинация ^ ТЯХ-[ТМ пептид]

3' праймер

Гидролиз зндоиуклеазами I рестрикции йлг11,йотШ I

Я«- II ВатН1

4. ТЙХ-[ТМ пептид] ^

/г5гП ГЯХ-/ТМ пептид] Т7 рг<г ^^ „ЯошШ

Рис 2 Схема сборки экспрестонных векторов рСЕМЕХ-1/(ТЮС-Ьписи5) и

рСЕМЕХ-Т/СГКХ-ЬтЮсиЗ)

Птй III

ИЕвРА

г „, _ рСЕМЕХ-1/ &"Ш=>П (ТКХ-ЬЕСР)

ТЯХ^

,„,.„ .у«. рСЕМЕХ-1/ (ТИХ-ЬЕСР)

гях

Т7рг

ЗК1

у 5. ЗКСу;1 /у (

//таги

ЕсяШ XI'

Т7 рг

Гидролиз зндонуклеазами рестрикции ГсоШ, ЯшсШI

5'_

/с»К1 3'

чЧП II1111 И/У 11111-

5К2 5' 3' ЭК Сув2 5'

^ Отжиг и лигирование

¡тсЮсиЗ_3. „шаш

Яш(1111

¡тсЮсиЭ

ТЯХ

/^еоШ^И рОЕМЕХ-1/ «ТЮМпкФсиБ)!

Т7рг

Повышение суммарного заряда ТМ пептидов открывает возможность использования ионообменной хроматографии на заключительном этапе их очистки Отсутствие потенциальных сайтов узнавания энтерокиназы необходимо для специфичного расщепления гибридного белка, а оптимальная длина N-концевого гидрофильного участка пептида обусловливает доступность сайта расщепления, см ниже

Гены ТМ пептидов собирали из синтетических олигонуклеотидов (четырех в случаях tmDcuS и tmdDcuS, шести в случаях tmBNip3, tmGpA, tmEphAl, tmEphA2 и восьми в остальных случаях) В целях повышения эффективности экспрессии нуклеотидные последовательности генов ТМ пептидов составляли с учетом частоты встречаемости кодонов для Е coli

Для экспрессии использовали вектор pGEMEX-1, в котором ген гибридного белка находится под контролем Т7 промотора Сборку экспрессионных конструкций pGEMEX-l/(TRX-[TM пептид]) для всех ТМ пептидов, кроме tmDcuS и tmdDcuS, проводили сходным образом (Рис 1) На первом этапе отжигали соответствующие олигонуклеотиды и собирали матрицу для амплификации гена ТМ пептида при помощи ПЦР с использованием фланкирующих праймеров Для последующей рекомбинации и клонирования последовательность прямого праймера включала участок, комплементарный 3'- концевой области гена TRX, а в последовательности обратного праймера был предусмотрен сайт рестрикции ВатНХ Ген TRX амплифицировали с использованием ранее полученного в лаборатории вектора pGEMEX-l/(TRX) в качестве матрицы и рекомбинировали с геном соответствующего ТМ пептида Полученный продукт, включающий в себя последовательности состыкованных генов TRX и ТМ пептида, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Rsrll и ВатШ и лигировали с гидролизованным теми же рестриктазами вектором pGEMEX-1 /(TRX) ДНК выделенных клонов анализировали при помощи ПЦР-анализа, затем секвенировали в пределах вставки Результирующий вектор получил название pGEMEX-l/(TRX-[TM пептид])

В случае tmdDcuS сборку экспрессионного вектора pGEMEX-l/(TRX-tmdDcuS) проводили в 4 этапа (Рис 2) На первом этапе лигировали химически синтезированные олигонуклеотиды Последовательности этих олигонуклеотидов были спроектированы таким образом, что в результате дотирования образовывался полноразмерный ген tmdDcuS, фланкированный липкими концами, комплементарными последовательностям, получаемым при гидролизе рестриктазами £со RI и ffmdIII, для последующего клонирования Олигонуклеотиды отжигали друг на друга и лигировали с линеаризованным рестриктазами ЕсоШ и ffmdIII фрагментом вектора pGEMEX-1 /(TRX-hEGF), содержащим Т7 промотор, терминатор и ген устойчивости к ампициллину Анализ полученной конструкции pGEMEX-l/(TRX-tmdDcuS) осуществляли, как описано ранее для остальных ТМ пептидов Экспрессионный вектор, несущий ген удлиненного ТМ сегмента сенсорной киназы Е coli {tmDcuS), собирали по той же схеме

Оптимизация условий культивирования рекомбинантных штаммов Е coli

Для наработки гибридного белка соответствующим плазмидным вектором трансформировали компетентные клетки штамма Е coli BL21(DE3)pLysS, содержащего хромосомную копию гена РНК-полимеразы фага Т7, а также плазмиду pLysS с геном лизоцима фага Т7 Вследствие того, что лизоцим эффективно ингибирует Т7 РНК-полимеразу, базальный уровень индукции в клетках данного штамма существенно снижен, что особенно важно при

Рис. 3. Подбор условий индукции TRX-tmDcuS HÜTT.

Электрофорез клеточного лизата штамма BL21(DE3)pLysS в 14% трис-глициновом полиакриламидном геле (ПААГ). Средняя дорожка соответствует максимальному накоплению TRX-tmDcuS в меточной биомассе (полоса, соответствующая гибридному белку, отмечена стрелкой).

О ь О ь о & о ь к

хЛ ЕЕ зс |_Г s у i t с: X

25 2 1 1 1 3S 5

о 5 О в о к о

экспрессии генов токсичных белков.

В процессе подбора оптимальных условий культивирования рекомбинантных штаммов было установлено, что при высоких температурах (37°С) гибридный белок ТЯХ-йпОсив , накапливается в клетках преимущественно в виде телец включения. Наиболее простым из известных способов повышения внутриклеточной растворимости белка является понижение температуры культивирования. Мы воспользовались этим фактом и обнаружили, что в этом I случае белок оказывается полностью растворимым в присутствии 1% Тритона Х-100. Кроме |

этого, по нашим наблюдениям, рост клеток до индукции при температуре 37°С не всегда 1 приводит к накоплению целевого белка. С учетом полученного опыта, гены гибридных белков, соответствующие ЦгЮрА, тиЕгЬВЬ ЦпЕгЬВ2, ПпЕгЬВЗ, 1тЕгЬВ4, ИпЕрИАК ИпЕрЬАг, экспрессировали в клеточных культурах, растущих при 28°С до индукции и при 13°С после добавления индуктора.

Максимальный уровень синтеза рекомбинантного белка ТЯХ-ЬпОсив (до приблизительно 200 мг/л богатой среды) наблюдали при выращивании культуры в течение суток в присутствии 0.05 мМ ИПТГ (изопропил-р-О-тиогалактозид) (Рис. 3). При подборе условий культивирования клеток на среде М9 было установлено, что максимальное количество гибридного белка (около 50 мг/л культуры) синтезировалось на вторые сутки при температуре выращивания после индукции 13°С и концентрации индуктора 0.05 мМ. Анализ результатов ! экспериментов по подбору условий культивирования бактериальных клеток, несущих плазмиды с генами остальных гибридных белков, выявил, что максимальное количество ТЮ(-[ТМ пептид] синтезируется при выращивании рекомбинантных штаммов в тех же условиях, что и штамма-продуцента ТЯХ-йпОсиЗ, за исключением различий в концентрациях индуктора 1 1 (Табл. 2). При культивировании культуры клеток, содержащих гены целевых гибридных белков

! ТЯХ-[ТМ пептид], на богатой среде продукты соответствующих генов накапливались в

максимальных количествах (от 200 до 400 мг/л культуры) в течение первых суток клеточного

I 8

Табл 2 Сводная таблица данных для гибридных белков TRX-ITM пептид] и

трансмембранных (ТМ) пептидов

ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалаюпозид, ¡3-МЭ - [1-меркаптоэтанол, а о - аминокислотный остаток, ЕК - энтерокиназа, ед - единица (активности фьрмеита), ТВ - среда для выращивания (Terrific Broth), М9 -минимальная солевая среда М9, TRX-/TM пептид] -гибридныи белок

ТМ пептид Конц ИПТГ, мМ Темп, "С Компоненты в составе лнзис-буфера Число N-концевых а о Аминокислотная поел N-концевого околомембранного участка Кол-во ЕК, (VI.MI белка Выход TRX-ITM пептид!, мг/л Выход ТМ пептидов, мг/л

7 в | ш р-мэ Mo4t вина ТВ т 1В М9

tmdDcuS 0 05 37 - - 3 DSR - - -

tmErbB2 0 05 0 25 28 + + 9 GCPAEQRAS 50 250 50 60 10

[шЕгЬВЗ 0 05 0 25 28 + + 10 QTLVLIGKTH 50 150 20 10 2

tmErbB4 0 05 0 25 28 + - 10 HSTLPQHART 50 300 60 60 10

tmErbBl 0 05 0 25 28 + + 10 EGCPTNGPKI 25 200 40 40 6

tmGpA 0 05 28 - - 10 RVQLAHHFSE 3 400 70 40 6

tmDcuS 0 05 37 - - 11 SRVTQQINDSR 2 200 50 40 7

tmEphAl 0 05 28 + + 12 3PPVSRGLTGGE 25 250 40 50 7

tmEphA2 0 05 |0 25 28 - - 12 EFQTLSPEGSGN 25 300 60 50 6

tmBNip3 0 05 37 + - 18 RNTSVMKKGGIFSAEFLK 70 400 100 100 10

роста При использовании среды М9 (как с введением изотопных меток 15N- и/или 13С-, так и без них) накопление гибридных белков происходило за двое суток, а выходы в среднем составили около 70 мг/л культуры (Табч 2)

Очистка гибридных белков TRX-ITM пептид]

В качестве первой стадии очистки гибридных белков после вскрытия биомассы и осветления клеточного лизата центрифугированием была выбрана МХАХ Аффинная хроматография обеспечивает высокую степень очистки рекомбинантных белков (около 90%) В частности, она позволяет эффективно избавиться от внутриклеточных протеаз и избежать тем самым деградации гибридного белка

Необходимо отметить, что вследствие гидрофобности ТМ пептидов для поддержания их и соответствующих гибридных белков в растворимой форме на всех стадиях очистки было необходимо присутствие детергента По этой причине все буферные растворы, используемые в процессе очистки, содержали 1 % мягкого неионного детергента Тритон Х-100 Такая концентрация не препятствовала полному расщеплению гибридных белков энтерокиназой и способствовала поддержанию ТМ пептидов в растворимом виде после удаления белка-носителя

При проведении МХАХ белок наносили на Chelating Sepharose FF с иммобилизованными на ней ионами никеля Так как гибридные белки TRX-[TM пептид] содержали последовательность из шести гистидинов, то они связывались с никелем, в то время как большинство белков Е coh не сорбировалось смолой (Рис 4) Следует отметить, что, видимо, вследствие образования олигомерных комплексов в присутствии детергента, гибриды, состоящие из тиоредоксина и ТМ пептидов, связывались с сорбентом сильнее, чем ранее полученные в нашей лаборатории гибридные конструкции тиоредоксина с водорастворимыми белками

Анализ результатов первой стадии очистки TRX-[TM пептид] при помощи гель-

Рис. 4. Очистка гибридных белковТИХ-ШОсиЗ (А) и ТЛХ-ШВШрЗ (б) с помощью

металлохелатной аффинног(хроматографии.

Электрофорез в 14% трис-глицшювом ПААГ.

электрофореза показал, что все гибридные белки имеют подвижность, отличную от расчетной. Причиной этого явления, предположительно, являлось формирование гибридными белками димеров в присутствии детергента, что подтверждалось соответствующей подвижностью гибридных белков, а также их профилем элюции при проведении МХАХ. В случае ТЯХ-НпЭсиЗ (Рис. 4. А), в отличие от всех других гибридных белков {Рис. 4, Б), на геле наблюдались не четкие полосы, соответствующие наличию преимущественно одного состояния гибридного белка, а диффузные полосы в области молекулярных масс между димерной и мономерной организацией ТЯХ^шОсиБ. Возможно, этот эффект был обусловлен меньшей, по сравнению с остальными гибридными белками, склонностью к димеризации молекул этого белка в присутствии детергента.

Выходы гибридных белков ТЯХ-[ТМ пептид] после данной стадии очистки составили в среднем около 300 мг/л богатой и примерно 70 мг/л минимальной среды (Табл. 2).

Очистка ТМ пептидов

Как уже отмечалось, для расщепления гибридных белков был предусмотрен специальный линкер, содержащий сайт узнавания энтерокиназы. При подборе условий гидролиза гибридных белков ТЯХ-[ТМ пептид] при комнатной температуре выясняли влияние концентрации имидазола, соли, а также времени инкубации, на эффективность работы фермента. В случае всех гибридных белков уменьшение концентрации соли и имидазола способствовало повышению эффективности работы энтерокиназы (Рис. 5). При этом трехкратное увеличение времени инкубации с ферментом (до 36 часов) приводило к значительному росту эффективности образования продукта только в случае ЦпОсиБ.

С учетом полученных данных гидролиз гибридных белков проводили в течение 12 часов после пятикратного снижения концентрации соли и имидазола в реакционной смеси. Количество фермента варьировали от 2 до 70 единиц энтерокиназы на 1 мг гибридного белка (Табл. 2). При добавлении избыточного количества фермента в некоторых случаях проявлялась неспецифичность работы энтерокиназы, поэтому использовали минимальные концентрации фермента, достаточные для полного расщепления.

10

Рис. 5. Расщепление гибридного белка ТЮС-ЬпСрА энтерокиназой.

Электрофорезе 14% трициновом полиакриламидиом геле.

$

шЩ*?

Ж» •

ч— тю<

■

3.5

Без Пятикратное разбавления разбавление

Пятикратное

При сравнении количества фермента, необходимого для эффективного и специфичного расщепления (Табл. 2), можно выявить определенные закономерности. Эффективность расщепления, по-видимому, зависит от длины Ы-концевого участка пептида, связывающего его ТМ область с последовательностью ТИХ Так, нам не удалось подобрать условий для эффективного расщепления гибридного белка ТЯХ-НпсЮсиЗ. Возможно, это объясняется тем, что выбранная нами последовательность второго ТМ сегмента Оси5 (ЦпсГОсиЗ, Табл. 2) содержала слишком короткий гидрофильный участок с Ы-конца пептида, в результате чего сайт расщепления оказывался стерически недоступным для фермента.

Наша гипотеза подтвердилась после удлинения Ы-концевой последовательности второго ТМ сегмента ОсиБ на 8 а.о. В этом случае расщепление гибрида происходило при добавлении 2 ед. энтерокиназы на I мг гибридного белка (ЦпОси5, Табл. 2). Наличие длинной гидрофильной области с Ы-конца ТМ пептида также затрудняло работу фермента (как в случае цпВЫфЗ, Табл. 2).

Для разделения продуктов гидролиза всех гибридных белков проводили повторную МХАХ на №2+-С11е1аПг^ ЗерЬагове РР. Выбор этой стадии объясняется тем, что при ее использовании продукты гидролиза, имеющие в своем составе последовательность из шести гистидинов (недорасщепленный гибридный белок и белок-носитель ТЯХ), а также примесные белки, обладающие неспецифическим сродством к №2+-С11е1аЦгщ ЗерЬагозе РР, задерживаются смолой. На следующей стадии проводили дополнительную очистку не связавшегося со смолой ТМ пептида при помощи ионообменной хроматографии. Исходя из значения изоэлектрических точек ТМ пептидов, расположенных в щелочной области рН (Табл.1), для очистки была выбрана сильная катионообменная смола (БР БерЬагозе РР). Пептиды элюировали с носителя линейным градиентом КаС1 (Рис. 6).

Для дальнейшего исследования очищенных ТМ пептидов методом спектроскопии ЯМР перед нами стояла задача получения белков, не содержащих Тритон X—100, поскольку даже следовые концентрации детергента мешают интерпретации спектров. С этой целью ТМ

Рис. 6. Основные этапы очистки ШОсиЭ.

Электрофорез в 14% трициновом полиакриламидпом геле.

# # # //

-ТРОитРсиЭ

6.5

^тЭсиЭ

пептиды вместе с Тритоном Х-100 осаждали из раствора при помощи трихлоруксусной кислоты, а затем осадок трехкратно промывали ацетоном. На этом этапе Тритон Х-100 переходил в растворимую фракцию, а чистый белок, свободный от детергента, оказывался в осадке.

В соответствии с разработанным протоколом нами были получены чистые ТМ пептиды ЦпОсиЗ, йпВ№рЗ, ЦпСрА, ИпЕгЬВ1, йпЕгЬВ2, 1тЕгЬВЗ, йпЕгЬВ4, ИпЕрЬА1, (тЕрЬА2, а также изотопно-меченые Ы-, |5Ы/|3С- производные в количествах, достаточных для исследования белок-белковых взаимодействий в мембраноподобном окружении при помощи спектроскопии ЯМР.

Спектроскопия ЯМР, расчет пространственных структур и релаксация методом молекулярной динамики (МД)

Были исследованы и 15Ы/13С- меченые ПпВМрЗ, ппЕгЬВ2, йпЕгЬВ4, шЕрЬАЕ ЦпЕрЬА2 в бицеллах, ЦпСрА - в бицеллах и мицеллах, 1:тЕгЬВ1 - в мицеллах. При этом использовали мицеллы додецилфосфохолина (ДФХ) и бицеллы димиристоилфосфатидилхолина / дигексаноилфосфатидилхолина (ДМФХ/ДГФХ).

Перед началом работы с дорогостоящими изотопно-мечеными пептидами для проверки эффективности встраивания в липидное окружение были приготовлены и охарактеризованы оптическими методами немеченые образцы всех ТМ пептидов в липидных бицеллах или мицеллах. В качестве оптических методов были выбраны КД-спектроскопия и динамическое светорассеяние. Для всех ТМ пептидов показано, что в выбранном мембраноподобном окружении белок находится в основном (~60% белка) в а-спирапьной конформации (Рис. 7, А), что соответствует ожидаемому значению для исследуемых объектов. Стоит отметить, что спектры КД белков, солюбилизированных в ДГФХ/ДМФХ бицеллах и моноламеллярных липосомах из ДМФХ (липидный бислой), практически не отличаются по форме.

Для всех исследуемых ТМ пептидов были измерены размеры частиц в выбранном липидном окружении с помощью динамического светорассеяния. Во всех случаях значения гидродинамического радиуса составили около 25 А, при этом (кроме 1гаЕрЬА2 и цпЕгЬВ4) была

Рис. 7. Спектр кругового дихроизма ЬпЕр)1А1 (А) и распределения частиц по размеру (Б, В).

А: ТМ пептид ШЕрНАТ. в бицеллах ДГФХ/ДМФХ и моноламелирных липосомах ДМФХ; Б, Б: Данные 40 измерений эффективного гидродинамического радиуса методом динамического светорассеянии для ТМ сегментов тирозиикиназных рецепторов ЫЕрНА1 (Б) и ЬпЕгЬВ4 (В) в бицеллах ДМФХ/ДГФХ.

А.

1тЕрИА1 в бицеллах 1тЕрЬА1 в липосомах

-20 ООО

Б. 90 В. 70

80 60

70

50

60

о 50 § 40

г

о С 40 ё 30

35 30

20

20 !

10 ; 10

(1 I 1 д

0.1 1.0 10.0 100.0 01

Радиус, нм

/к

1.0 10.0 100.0 Радиус, нм

получена малая относительная дисперсия, равная примерно 3%. Это указывало на присутствие в растворе частиц только одного размера, т.е. полученные образцы были практически однородными (Рис. 7, Б). Дисперсность частиц, состоящих из бицелл ДМФХ/ДГФХ со встроенными молекулами ТМ пептидов, в случаях 1шЕрЬА2 и йпЕгЫЭД составила ~5 и~18% (в каждом пике), соответственно. Гидродинамические радиусы для 1тЕгЬВ4 в бицеллах ДМФХ/ДГФХ составили 2,6±0,4, 3,4±0,6 и 12,0±1,0 нм. Это указывало на неоднородность по размеру и составу частиц, т.е. помимо димеризации присутствовала олигомеризация йпЕгЬВ4 и 1шЕрИА2 в липидных бицеллах (Рис. 7, В). Таким образом, полученные оптическими методами данные для всех ТМ пептидов косвенно свидетельствуют о том, что выбранные системы для исследования ТМ пептидов хорошо моделируют липидный бислой и подходят по размеру для исследования методами ЯМР.

Спектроскопия ЯМР была следующим этапом работы по изучению взаимодействия димеров ТМ пептидов в мембраноподобном окружении. Для отнесения 'Н-, 13С- и резонансов, расчета пространственной структуры и описания внутримолекулярной динамики ТМ пептидов, солюбилизированных в детергентных мицеллах или липидных бицеллах, были получены и обработаны серии гетероядерных ЯМР спектров (Рис. 8).

Для изучения пространственной структуры и внутримолекулярной динамики гомодимеров ТМ пептидов использовали игЮрА в качестве модельного объекта. Было установлено, что среды как из мицелл ДФХ, так и бицелл ДГФХ/ДМФХ адекватно имитируют мембранное окружение и, следовательно, пригодны для изучения взаимодействия между ТМ спиралями (Рис. 9). На интерфейсе взаимодействия йгЮрА как в мицеллах, так и в бицеллах расположены остатки 761, "в, 80У. 830. 84У. 87Т. Боковые цепи остатков валина упакованы вместе с атомами глицинов, также близко находятся атомы остатков 72Е и '"I двух мономеров. Помимо этого, во взаимодействии участвуют ароматическая группа 78Р и метильная группа 82А, экранирующие основную цепь белка от гидрофобного окружения.

Рис. 8. Примеры гетероядерных 2D15N-HSQC спектров ТМ пептидов: tmBNip3 (А) и ЬпЕгЬВ2 (Б).

Бнцеллы ДГФХ/ДМФХ, 40° С, pH 5.0. На спектрах отмечено отнесение кросс-пиков от HN групп основных и боковых цепей белков. 108

А.

«G40

Ф

0178 QG1SS

с,«О

■те sm

О А <

N6H,N147

а щ

1Ч

мд.

114

1«

sin

о "АО "

С4 v

«.♦•о

9.0 «.5 8.0 7.5 7.0 8.5 8.0 7.5 7.0

1Н, М.Д. 1Н,М.Д.

Основным результатом структурно-динамического исследования ТМ пептидов можно считать определение с высоким разрешением пространственных структур и внутримолекулярной динамики гомодимерных ТМ пептидов ПпОрА (уточнена структура в мицеллах, известная из литературы, и получена структура в бицеллах, см. выше), ЬпВМрЗ, ЦпЕгЬВ2, ИпЕгЬВ4, йпЕрЬА1 и 1тЕрЬА2, солюбилизированных в липидных бицеллах и мицеллах детергента имитирующих мембранное окружение (Рис. 10). Все димеры, за исключением Ш1Ер11А2, имеют сверхзакрученную (правую) а-спиральную структуру, угол между спиралями составляет примерно -40", расстояние между осями спиралей - примерно 6-8 А. Пептид тЕрЬА2 имеет сверхзакрученную (левую) а-спиральную структуру, угол между спиралями составляет примерно +25°, расстояние между осями спиралей - около 7 А.

Детальный анализ ЯМР-спектров, полученных для проапоптозного белка ПпВЬНрЗ, позволил найти 28 межмономерных контактов и установить интерфейс димеризации, состоящий на Ы-конце из ароматических остатков, а в ТМ участке белка - в основном из гидрофильных (в центре) и слабополярных остатков. Анализ полученных результатов и сопоставление их с литературными данными позволили выявить отдельные механизмы апоптоза-некроза клеток при гипоксии тканей человека. Была выдвинута гипотеза о том, что белок В№рЗ, встраиваясь во внешнюю мембрану митохондрии, образует протонный канал, который понижает рН в межмембранном пространстве и электрохимический потенциал на внешней мембране митохондрии, тем самым, изменяя потоки метаболитов, дестабилизируя работу и пространственную организацию митохондрии. В свою очередь это приводит к инициации апоптозо-некрозного каскада в клетке.

Кроме этого, был проведен расчет пространственных структур и релаксация методом молекулярной динамики димерных комплексов ЦпЕгЬВ2, ЦпЕгЬВД, йпЕр11А1, 1тЕрЬА2. В аминокислотной последовательности 1тЕгЬВ2:

6С РАЕ (ЖАБ РЬ^ТЭ И6568АУУ660ет ЪЪ664УУУ"Ь£УУ611Яй IЬIККЯООК1ИК (здесь и далее подчеркнуты и отмечены жирным шрифтом остатки, участвующие в димеризации; ТМ спиральный участок отмечен серым цветом), остатки 652Тххх6568ххх6б0С

14

Рис. 9. Пространственные ЯМР структуры гомодимера ШСрА после релаксации

методом молекулярной динамики (МД) в явно заданных гидратированных мицелле ДФХ (А) и бислое ДМФХ (Б).

Пространственные ЯМР структуры димеров 1тСрА в мицеллах ДФХ и бицеллах ДГФХ/ДМФ) были получены с высоким разрешением и хорошим качеством. Лучшие ЯМР структур1 подвергали энергетической релаксации методом МД в явно заданных гидратированных мицелла. ДФХ и мембране ДМФХ, т.е. влияние мембраны учитывали с высокой степенью реалистичности Это позволило детально описать тонкие эффекты, обусловленные внутри- и межмолекулярныли взаимодействиями, а также исследовать стабильность полученных пространственных структу) в мембранном окружении.

Рис. 10. Примеры полученных пространственных ЯМР структур.

А: Совмещенные по атомам основной цепи остатков 548-568 и 536-558 двенадцать лучших ЯМР структур димеров ¡тЕрИА! (слева) и ШЕркА! (справа), соответственно, в бицеллах ДМФХ/ДГФХ.

Б: Ленточное представление ЯМР структур димеров 1тЕр1гА1 (слева) и ШЕр11А2 (справа). Желтым цветом выделены остатки с малой боковой цепью, синим - заряженные остатки.

1тЕрИА2

(здесь и далее х - любой аминокислотных остаток) образуют характерный димеризационный тандемный «гликофориновый» мотив, дополненный переключающимися межмономерными водородными связями с участием боковых цепей остатков 652Т и 656S из обоих мономеров В аминокислотной последовательности tmErbB4

stlpqhartp652liaa656gvig660glf663ilvivglt671favyvrrksikkkra

остатки 655A656Gxx659G660G образуют димеризационный сдвоенный «гликофориновый» мотив В аминокислотной последовательности tmEphA 1

sppvsrgltg546geiv550avif554glll558gaalllgilv568frsrra

остатки 550Axxx554Gxxx558G образуют характерный димеризационный тандемный «гликофориновый» мотив Кроме того, полученный интерфейс димеризации tmEphA 1 в мембраноподобном окружении хорошо согласуется с данными ToxR-анализа в мембране бактерии (см ниже) Согласно данным, полученным при помощи спектроскопии ЯМР, ТМ спирали мономеров в tmEphA2 димере имеют левую закрутку, а димеризационный интерфейс tmEphA2 представлен последовательностью 535Lxxx539Gxx542A543Vxx545V (tmEpliA2

efqtlspegsgn535lavi539ggv542avg545wlllvlagvgs56ffihrrrk) Использование молекулярного моделирования в явно заданном окружении для релаксации комплексов ТМ пептидов позволяет существенно повысить качество структуры Помимо уточнения структуры, данный подход позволяет наглядно рассмотреть динамические характеристики димера и его влияние на мембрану, проникновение воды, замыкание водородных связей Знание этих характеристик необходимо для понимания функциональной активности МБ

Димеризация tmErbB2, tmErbB4, tmEphA 1, tmEphA2 в отсутствие внеклеточных и цитоплазматических доменов этих рецепторов, исследованная при помощи спектроскопии ЯМР, позволила говорить о непосредственном участии ТМ доменов в работе РТК Кроме того, анализ результатов молекулярного моделирования процесса димеризации ТМ пептидов белков семейства РТК способствовал обнаружению нескольких возможных моделей пространственной структуры гомодимеров, образованных молекулами этих белков (Рис //) Наличие двух областей контакта свидетельствует в пользу предложенного ранее для РТК поворотно-связанного механизма функционирования, благодаря которому происходит передача сигнала через биологическую мембрану Находясь в энергетически выгодном димерном состоянии (задействована первая область контакта), рецепторные молекулы оказываются способны к связыванию лиганда, которое, в свою очередь, приводит к переходу димерного комплекса в другую конформацию с взаимодействием по второй возможной области контакта

Из анализа литературных данных следует, что димерный комплекс tmErbB2 с межмономерным взаимодействием в области N-концевого «гликофоринового» мотива соответствует активному состоянию рецептора Ключевая роль остатков, расположенных на интерфейсе димеризации, в функционировании рецептора подтверждается литературными сведениями Так, мутацию I655V связывают с повышенным риском развития рака груди, а онкогенная замена V659E, изначально обнаруженная в ЕгЬВ2 крысы, приводит к смещению равновесия между активным и инактивированным состояниями рецептора т vivo Анализ структуры димерного комплекса tmErbB2 позволяет предположить, что в первом случае увеличение стабильности активированного состояния димера ЕгЬВ2 объясняется более плотной упаковкой мономеров вследствие замены объемной боковой цепи 6551 на менее объемную цепь

16

Рис. 11. Изопотенциалъные двумерные карты молекулярного гидрофобного потенциала

(МГП) на поверхностях ТМ а-спиралъных участков пептидов tmEpliAl и tmEphA2.

Коптуриыми изолиниями показаны гидрофобные области поверхности с МГП > 0.07. Значения по оси X соответствуют углу вращения относительно оси спирали (в град.). Значения по оси Y показывают смещение вдоль оси спирали (в А). Позиции остатков подписаны. Возможные области контакта спираль-спираль выделены овалами.

А: Область А1 - основная поверхность контакта, соответствующая структуре димерпого комплекса, рассчитанного на основании данных, полученных при помощи спектроскопии ЯМР. А2 - область, возможно, реализуемая как минорная конформация при поворотно-связанном механизме функционирования рецептора.

Б: Реализуются симметричные левозакручениые димеры с контактом по области В1, а также несимметричные правозакрученные димеры с контактом по областям В1/В2. Симметричных димеров с контактом по области 62 не наблюдалось.

A. EphA1 Б. EphA2

А2 A1 B1 В2

О 60 120 180 240 300 360 0 60 120 180 240 300 360 Угол вращения относительно оси Угол вращения относительно оси

спирали, град. спирали, град.

V. В свою очередь, замена У659Е может вызывать образование сети межмономерых водородных связей, стабилизирующих димер РТК в активном состоянии, что приводит к спонтанной активации рецептора с последующей трансформацией клетки и неконтролируемой пролиферации.

Анализ структуры и динамики димерного комплекса 1шЕрЬА1 выявил, что конформационные изменения происходят в зависимости от ионизационного состояния карбоксильной группы остатка 547Е. Вследствие этого, незначительные изменения условий окружающей среды, а также состава мембраны в непосредственной близости к рецептору могут влиять на некоторые свойства ЕрЬА! и на результат от его связывания с лигандом. Не исключено, что аминокислотный остаток 547Е может выполнять функцию своеобразного сенсора на поверхности клетки, который реагирует на изменение условий окружающей среды. В этом случае эффективность передачи сигнала между вне- и внутриклеточной частями молекулы будет зависеть от состояния з47Е. Депротонирование остатка может частично нарушать эту связь. Наличие расположенного в мембране остатка, ионизационное состояние которого зависит от рН, делает ЕрЬА1 уникальным представителем семейства рецепторов ЕрЬ. При этом полученные структурные данные свидетельствуют о возможности совместного существования альтернативных димерных конформаций ТМ домена ЕрЬА1, соответствующих активной и неактивной конфигурациям рецептора, при физиологических значениях рН, что является аргументом в пользу "вращательно-связанного'' механизма активации РТК.

Определение степени ассоциации ТМ участков МБ в клеточной мембране

Стабилизация структуры димериого комплекса на атомном уровне может осуществляться либо посредством прямых контактов между мономерами (например, при помощи водородных связей), либо опосредованно (например, за счет взаимодействия полярных областей, не участвующих в межмономерных контактах, с полярными головками липидов) Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия являются одними из ключевых в стабилизации структуры димера в отсутствии водородных связей и солевых мостиков В целом структура олигомеров мембранных белков определяется тонким балансом как межмономерных взаимодействий, так и взаимодействий мономеров с окружением, энтропийных факторов и т д При этом аминокислотные остатки белка находят наиболее энергетически выгодное для них окружение Обычно гидрофобные остатки ТМ спирали белка располагаются внутри мембраны, а полярные концевые остатки взаимодействуют с липидными головками и водой Заряженные остатки на границе мембраны нередко образуют водородные связи с полярными головками липидов Интерфейс димеризации включает алифатические остатки с большой боковой цепью (лейциновый зиппер) и/или представлен полярной областью ТМ спирали, образованной малыми остатками со стабилизацией димерного комплекса посредством межмономерных водородных связей

В середине 90-х годов для изучения степени ассоциации ТМ сегментов в природной мембране была разработана система, основанная на свойстве МБ ToxR из Vibrio cholerae активировать промотор ctx только в результате образования белкового комплекса за счет димеризации ТМС На основе ToxR сконструирован химерный белок ToxR-TMC-MalE, в состав которого входит цитоплазматическая часть ToxR, периплазматический домен мальтоза-связывающего белка Е coh MalE и ТМС, степень димеризации которого предполагается выяснить Если последний способен к гомодимеризации в составе химерного белка ToxR-TMC-MalE, то цитоплазматическая часть ToxR активирует ctx промотор Это в свою очередь запускает экспрессию репортерного гена, находящегося под его контролем (Р-галактозидазы, хлорамфеникол- ацетилтрансферазы и некоторых других) Мы использовали современный высокочувствительный вариант ToxR-системы, в котором активность Р-галактозидазы измеряли с помощью флуорогенного субстрата MUG (4-метилумбеллиферил-Р-О-галактопиранозид), при этом результаты совпадали с полученными при использовании классической системы с субстратом ONPG (о-нитрофенил-р-О-галактопиранозид)

ToxR система, наряду с явными достоинствами, обладает рядом существенных ограничений В частности, установлено, что существует оптимальная длина исследуемого ТМС (13 аминокислотных остатков), которая, однако, может меняться в зависимости от его расположения в мембране Кроме того, важную роль играет ориентация вставки относительно ToxR и MalE доменов Для каждого нового ТМС необходимо проверять четырехкратным пошаговым «проворотом» все его возможные ориентации в составе химерного белка

Основываясь на литературных данных о димеризации ТМС EphAl, GpA в биологической мембране и в системе ToxR, а также исходя из наличия мотивов, предположительно достаточных для димеризации, мы провели исследования способности ТМС EphAl к димеризации в системе ToxR При этом в качестве положительного контроля использовали ТМС GpA, а в качестве отрицательного контроля - химерный белок без ТМС

Рис. 12. Изонотенциалъные двумерные карты молекулярного гидрофобного потенциала поверхностей ТМ фрагментов ToxR конструкций со вставками AZ2, GpA,

Контурными изолиниями показаны гидрофобные области поверхности с молекулярным гидрофобным потенциалом > 0.07. Значения по оси X соответствуют углу вращения относительно оси спирали. Значения по оси У показывают смещение вдоль оси спирали. Позиции остатков подписаны. Возможные области контакта (по экспериментальным данным или теоретическим расчетаи) выделены серыми овалами. Незакрашенными овалами выделены области конструкции, важные для детекции днмеризации в системе ToxR.

AZ2

О 180

Угол вращения относительно оси спирали, град

0 --:--т 360

Угол вращения относительно оси спирали, град

Выбор ТМ участков для проверки димеризационной способности в системе ToxR осуществляли с привлечением методик молекулярного моделирования. Для этого сначала проводили анализ гидрофобных свойств пептидов, димеризация которых была показана методом ToxR в литературе (GpA, модельный пептид AZ2, Рис. 12). Области димеризации GpA и AZ2 включают в себя полярные участки химерной последовательности (NR на N-конце и NP на С-конце ТМ области). Было высказано предположение о том, что наличие таких участков является необходимым условием для детекции димеризации методом ToxR. Эта гипотеза была успешно использована при выборе ТМ участков для изучения их димеризационной способности в бактериальной мембране.

При проведении исследования ТМС EphA 1 в системе ToxR С-концевой фрагмент ТМС EphAl способности к димеризации в мембране бактерии не проявлял. В случае N-концевого участка для определения оптимальной длины вставки и ее ориентации была проведена количественная оценка степени димеризации 17 различных ТМС EphAl. После выявления максимально димеризующегося в данной системе N-концевого участка EphAl (обозначенного EphAl макс, Рис. 13) путем введения точечных мутаций и последующего анализа димеризационной активности были выявлены аминокислотные остатки, в большей или меньшей степени задействованные в процессе димеризации (Рис. 14). При этом по характеру воздействия на димерные комплексы, мутации можно подразделить на три группы -блокирующие димеризацию; потенциально усиливающие этот процесс; мутации, не влияющие на димерное состояние комплекса.

Для разрушения димерных комплексов вводили замены небольших аминокислотных остатков, лежащих на интерфейсе димеризации на остаток Не с объемной боковой цепью. Это создавало стерические препятствия образованию димерного комплекса, а замены A550I, G554I, G558I привели к ослаблению димеризации. Кроме того, на основании полученных данных

Рис. 13. Эффект «провороти» ТМС на активность /3-галактозидазы в ТохЛ системе.

Данные представлены в М11, единицах активности ¡}-гамктозидазы.

Светло-серым цветом отмечены положительный (+) и отрицательный (-) контроли - ТМС врА (ЬПЕСУМАСУЮТ)* и ТМС СрА-С831 (ШЮУМА1УЮТ), соответственно. Серым цветом - активности вариантов, соответствующие «провороту» ГМС ЕрНА1 в составе химеры ТохЯ-ТМС-Ма1Е.: 1 - (Е1УАУ1¥С1ИСААЩ; 2**-(СЕ1УАУ1¥СШСАА1), 3 - (ССЕ1УАУ1ТСИЕСАА), 4 - (ТССЕ1УАУ1РСШСА).

Черным цветом обозначена активность, соответствующая полноразмерному ТМС ЕрНА1 в составе химеры: ТМ (7УЛ ViFGI.LLGAALLLG.ILV,) - димеризация не наблюдается. * В скобках приведены аминокислотные последовательности ТМС, исследуемых в ТохЯ-системе.

** ТМСЕркА! с максимальной степенью дшсернзации в ТохК-системе (Ер11А1макс).

Рис. 14. Влияние введения точечных мутаций в последовательность Ер11А1макс па

способность к димеризации в системе ТохК

В верхнем ряду указана аминокислотная последовательность ТМС ЕрНА1, обладающего максимальной степенью димеризации в системе ТохК (в составе химеры ТохЯ-ТМС-Ма1Е). Аминокислотные остатки ТМС ЕрНА1 пронумерованы в соответствии с природной последовательностью ЕрЬА1. Слева показаны аминокислоты, па которые были сделаны замены. Размер точек отражает величину эффекта от введения мутации ш проявляемую димеризационную активность (с нормировкой па активность, соответствующую активности [1-галактозидазы немутированного ЕрНА1шкс).

546 547 548 549 550 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561

Условные обозначения:

• 10-25% # 50-75%

• 25-50% ф 75-100%

X нет димеризации

можно сделать предположение относительно вклада остатков в образование димерных комплексов Так, остаток 550А менее важен - его замена приводит к 50% уменьшению димеризации, в то время как замены 554G и 558G практически полностью ее блокируют Интересно, что такой вывод нельзя сделать из анализа интерфейса, полученного на основе данных спектроскопии ЯМР или молекулярного моделирования В этих структурах малые остатки участвуют в димеризации примерно равнозначно (по площади и энергии контакта)

Для усиления димеризационной способности ТМС, было решено увеличить ширину гидрофильной области поверхности пептида Для этого был введен ряд аминокислотных замен, направленных на уменьшение гидрофобности остатков непосредственно в пределах или вблизи интерфейса димеризации (замены A550G, V551G, L555A) Однако к обнаружению искомого эффекта это не привело

Для проверки предположения о слабом влиянии на димеризационную способность ТМС аминокислотных остатков, расположенных вне мотива, были введены замены, приводившие к образованию стерических препятствий (замены A559I и A560I), а также увеличению гидрофильной поверхности контакта (V549G, I552A, A559G, A560G, F553A, L555V, L557G) Во всех случаях (кроме L557G) введение замен, как и предполагалось, не привело к изменению димеризационной способности ТМС более чем на 20% Замена L557G практически полностью устраняла димеризацию либо вследствие непосредственного участия этого остатка в поддержании структуры димера, либо из-за глобальных перестроек в системе, например разрушения спирали Действительно, в последовательности ТМС присутствует 3 малых остатка подряд (558GA560A) Учитывая повышенную подвижность этого участка по данным ЯМР и молекулярного моделирования, добавление еще одного остатка Gly усиливает дестабилизацию спирали

Чтобы убедиться, что введение в ТМ участок точечных мутаций или изменение длины ТМС не оказывали влияния на уровень экспрессии химерных белков, мы использовали технику вестерн блота Показано, что уровень экспрессии химерных белков в среднем примерно одинаков для ТМС, вызывающих как сильную, так и слабую активность Р-галактозидазы

Таким образом, исследование димеризации в мембране бактерии при помощи системы ToxR не только способствует выявлению интерфейса димеризации с определением относительного вклада отдельных аминокислотных остатков, но и выяснению динамических особенностей димерных комплексов Так, в процессе димеризации ТМС тирозинкиназы EphAl в клеточной мембране участвует тандемный «гликофориновый» мотив 550Axxx554Gxxx558G Полученный интерфейс димеризации ТМ участка EphAl в биологической мембране хорошо согласуется и дополняет данные структурного анализа в мембраноподобном окружении (см выше)

Выявление интерфейса димеризации ТМ пептидов в мембраноподобном окружении и ТМС EphAl в мембране бактерии, а также определение вклада в димеризацию конкретных аминокислотных остатков не достаточно для создания прототипов эффективных лекарственных препаратов, действие которых основано на разрушении димерных комплексов МБ Известно, что клеткам раковых опухолей свойственна повышенная экспрессия рецепторных тирозинкиназ, активация которых посредством димеризации приводит к делению, а также увеличению подвижности клеток Создание пептида с увеличенной димеризационной способностью заложит основу создания прототипов лекарственных препаратов нового

поколения, направленных на разрушение димерных комплексов в мембране и, как следствие, приостановке роста раковых опухолей Однако в настоящее время основных принципов белок-белковых взаимодействий в мембране не сформулировано, а вопрос об увеличении димеризационной способности ТМ пептидов остается открытым

Заключение

Диссертационная работа является частью разработанного в Лаборатории инженерии белка и Отделе структурной биологии ИБХ РАН комплексного подхода, направленного на определение структурно-динамических характеристик ТМ доменов МБ Комплексный подход органически объединяет разнообразные современные физико-химические методы исследования белков, не имеет аналогов в мире и уникален тем, что на основе синтеза экспериментальных и теоретических методик (биоинженерия, молекулярное моделирование, ЯМР и оптическая спектроскопия) позволяет изучать пространственную структуру и внутримолекулярную динамику гомо- и гетеродимеров из ТМ а-спиралей в средах, имитирующих мембранное окружение (мицеллы детергентов, липидные бицеллы)

В данной работе с учетом принципов оптимизации процесса выделения целевых пептидов выбирали оптимальные ТМ фрагменты исследуемых белков, включающие внутримембранный гидрофобный сегмент с прилегающими к нему внемембранньгми гидрофильными участками На следующем этапе проводили разработку и оптимизацию бактериальных систем экспрессии и очистки выбранных ТМ пептидов с последующим получением рекомбинантных целевых белков, меченых изотопами 13С- и |5М- После поиска оптимальных методик реконструкции ТМ пептидов в мембраноподобное окружение осуществляли подбор приемлемых условий получения ЯМР-спектров образцов Для отнесения 'Н-, |3С- и "Ы- резонансов, расчета пространственной структуры и описания внутримолекулярной динамики применяли современные методики гетероядерной спектроскопии ЯМР Результирующие модели пространственных структур димерных комплексов ТМ пептидов помещали в явно заданный липидный бислой для проведения итоговой энергетической релаксации методом молекулярной динамики с использованием экспериментально полученных конформационных ограничений Это позволило получить детальную информацию о взаимодействиях белок-белок и белок-липид на атомном уровне Для изучения роли конкретных аминокислотных остатков в димеризации ТМ сегментов белков на основании системы ТохЯ создан экспериментальный протокол, предназначенный для количественной оценки степени ассоциации ТМ спиралей в мембране Е соЬ

После получения точной структурно-динамической информации о конформации ТМ пептидов в дальнейшем предполагается моделирование новых видов прототипов лекарственных препаратов, так называемых «пептидов-перехватчиков», связывающихся с а-спиральным ТМ доменом белка для изменения (нарушения) его димеризационной способности в клеточной мембране При этом выбор самых активных пептидов предполагается осуществлять с помощью имеющихся методов анализа и ТохИ системы

выводы

1 Разработана система эффективной экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках Е соЬ Разработан универсальный протокол выделения ТМ пептидов Предложенный протокол успешно апробирован на примере 9 ТМ пептидов шЮрА, ипВ№рЗ, ЦтЮсиЗ, 1тЕгЬВ1,1тЕгЬВ2,ЦпЕгЬВЗ, 1тЕгЬВ4,1тЕрЬА1,НпЕрИЛг

2 Все исследуемые ТМ пептиды, в том числе их изотопно-меченые 15№, |5М/'3С-производные, получены в количествах, достаточных для установления их структурной организации в мембраноподобном окружении с помощью оптических методов анализа и спектроскопии ЯМР Это позволило получить структурную информацию о димерных комплексах ЦпСрЛ, йпВЫфЗ, 1тЕгЬВ2, Ит1ЕгЬВ4, ИпЕрЬА1, 1тЕрЬА2 в искусственной мембране

3 На основании системы ТохЯ создан экспериментальный протокол, позволивший в результате введения точечных замен аминокислотных остатков выявить интерфейс димеризации ТМ участка ЕрЬА1 в бактериальной мембране Полученные для ЕрЬА1 результаты полностью совпали с данными, установленными при помощи спектроскопии ЯМР в мембраноподобном окружении

4 Полученные данные по гомодимеризации ипВ№рЗ, йпЕгЬВ2, ппЕгЬВ4, ИпЕр11А1, йпЕр11А2, сопоставленные с литературными сведениями, позволили выявить взаимосвязь структуры и функции исследуемых объектов На основании анализа пространственной организации йпВЫфЗ выдвинута гипотеза об образовании протонного канала при встраивании белка во внешнюю мембрану митохондрии, что, по-видимому, связано с инициацией апоптозо-некрозного каскада в клетке при гипоксии Димерная структура ИпЕгЬВ2, ЦпЕгЬВ4, 1тЕрЬА1, ЦпЕрЬА2 свидетельствует об их активном участии в функционировании соответствующих рецепторов и хорошо согласуется с предложенным в литературе поворотно-связанным

1 МП Кирпичников, MB Гончарук, Я С Ерчолюк, С А Гончарук, А А Шульга, ИВ Масленников, А С Арсеньев (2005) Структурная биология мембранных пептидов Технология живых систем, 2(1-2), С 20-27

2 Е V Bocharov, Yu Е Pustovalova, К V Pavlov, Р Е Volynsky, М V Goncharuk, Ya S Ermolyuk, DV Karpumn, A A Shulga, MP Kirpichmkov, RG Efremov, IV Maslennikov, AS Arsemev (2007) Unique dimeric structure of BNip3 transmembrane domain suggests membrane permeabilization as a cell death trigger J Biol Chem, 282, P 16256 - 16266

3 MB Ремизова (Гончарук), С А Гончарук, Я С Ермолюк, А А Шульга (2004) Бактериальный синтез трансмембранных сегментов сенсорной киназы Е coli XVII Зимняя школа ИБХРАН, Москва, С 38

механизмом передачи сигнала в клетку

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

4 MB Гончарук, С А Гончарук, Я С Ермолюк, А А Шульга, ИВ Масленников, АС Арсеньев, МП Кирпичников (2004) Бактериальный синтез трансмембранных сегментов SK, BNIP3, miniK, KCNE1 XLV1IНаучная конференция МФТИ, Москва, С 135-136

5 КС Минеев, ЭВ Бочаров, MB Гончарук, Я А Верещага, МА Дубинный, ЮА Косинский, ИВ Масленников (2005) Изучение спираль-спиральных взаимодействий в трансмембранных белках методами спектроскопии ЯМР на примере трансмембранного домена гликофоринаА XLVII1 Научная конференция МФТИ, Москва, С 140

6 ЮЕ Пустовалова, ЭВ Бочаров, ИВ Масленников, Я С Ермолюк, MB Гончарук, МП Кирпичников, А С Арсеньев (2006) Конформация трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 семейства BCL-2 в комплексе с липидной бицеллой VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва, С 91

7 10 Е Пустовалова, ЭВ Бочаров, ИВ Масленников, Я С Ермолюк, MB Гончарук, А С Арсеньев (2006) Пространственная структура димера трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 VIII международный семинар по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология), Ростов-на-Дону, С 44

8 КС Минеев, MB Гончарук, ЭВ Бочаров, ИВ Масленников, Я С Ермолюк, А С Арсеньев (2006) Структура димера трансмембранного сегмента гликофорина А в различных средах, моделирующих мембранное окружение VIII международный семинар по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология), Ростов-на-Дону, С 45

9 YuE Pustovalova, Е V Bocharov, I V Maslennikov, Ya S Ermolyuk, M V Goncharuk, A S Arsentev (2006) NMR study of transmembrane domain of pro-apoptotic protein BNIP3 in lipid bicelles Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter, St Petersburg, P 97

10 M Mayzel, E Mineeva, M Goncharuk, E Tkach, Ya Ermoluk, T Balashova, E Bocharov, A Arseniev (2007) NMR study of transmembrane domain of ephnn receptor EphAl m lipid bicelles Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter, St Petersburg, P 93

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

(3-МЭ - Р-меркаптоэтанол,

М9 - минимальная солевая среда М9,

MUG -4-метилумбеллиферил-(3-0-

галактопиранозид, ONPG - о-нитрофенил-Р-О-гапактопиранозид, ТВ - среда для выращивания (Terrific Broth),

TRX-[TM пептид] - гибридный белок, а о - аминокислотный остаток, ДГФХ - дигексаноилфосфатидилхолин, ДМФХ- димиристоилфосфатидилхолин ДФХ - додецилфосфохолин, ед - единица (активности фекмента), ЕК - энтерокиназа,

ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактозид, КД - круговой дихроизм, МБ - мембранный белок, МГП - молекулярный гидрофобный

потенциал, МД - молекулярная динамика, МХАХ - металлохелатная аффинная

хроматография, ПААГ - полиакриламидный гель, ПЦР - полимеразная цепная реакция, РТК - рецепторная тирозинкиназа, ТМ -трансмембранный, ТМС - трансмембранный сегмент, ЯМР -ядерный магнитный резонанс

Принято к исполнению' 07 09 2008 г. Тиран.: 100 экз

Исполнено. 07 09 2008 г Заказ № 175

Копицентр ФМБФ МФТИ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гончарук, Марина Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

LI. МЕМБРАННЫЕ БЕЖИ.

1.2. ПЕРЕДАЧА ИНФОРМАЦИИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ.

1.2.1. Гликофорин А человека.

1.2.2. Сенсорная кияазаЕ. coli.

1.2.3. Проапоптозный белок BNip3.

1.2.4. Семейство ErbB.

1.2.4.1. ErbBl.

1.2.4.2. ЕгЪВ2.

1.2.4.3. ЕгЬВЗ.

12.4.4. ЕгЬВ4.

1.2.5. Эфриновые рецепторы Eph.

1.3. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ МЕМБРАННЫХ БЕЖОВ В КЛЕТКАХ E.coli.

1.3.1. Основные подходы для получения трансмембранных сегментов в клетках Е. coli.

1.3.2. Основные возникающие проблемы и как с ними бороться.

1.3.3. Прямая экспрессия.

1.3.4. Гибридная экспрессия.

1.4. СТРУКТУРНАЯ БИОЛОГИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ МЕМБРАННЫХ БЕЖОВ.

1.4.1. Кристаллография: рентгено-структурный анализ и другие методы

1.4.2. Спектроскопия ЯМР.

1.4.3. Рентгеноструктурный анализ или спектроскопия ЯМР?.

1.4.4. Другие методы.

1.4.5. Изучение димеризационной способности трансмембранных сегментов в мембране бактерии.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

11.1. МАТЕРИАЛЫ.

II. 1.1. Штаммы Е. coli.

II. 1.2. Вектора и плазмиды.

И. 1.3. Среды для выращивания Е. coli.

II. 1.4. Ферменты.

II. 1.5. Олигонуклеотиды.

II. 1.6. Реактивы.

11.2. МЕТОДЫ.

11.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

11.2.2. Рестрикция.

11.2.3. Лигирование.

11.2.4. Электрофорез ДНК.

11.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

11.2.6. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

11.2.1. ПЦР анализ клонов.

11.2.8. Секвенирование ДНК.

11.2.9. PIPES - трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

11.2.10. Конструирование экспрессионных векторов pGEMEX- 1/(TRX— [TM пептид]).

11.2.11. Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ.

11.2.12. Иммуноблот.

11.2.13. Подбор условий индукции ИПТГ.

11.2.14. Выращивание рекомбинантного штамма Е. coli.

11.2.15. Буфера, используемые при выделении белков.

11.2.16. Выделение гибридных белков TRX-tmDcuS, TRX-tmBNip3, TRX-tmGpA, TRX-tmErbBl, TRX-tmErbB2, TRX-tmErbB3, TRX-tmErbB4, TRX-tmEphAl и TRX-tmEphA2 из клеток E. coli.

11.2.17. Получение трансмембранных пептидов tmDcuS, tmBNip3, tmGpA, tmErbBl, tmErbB2, tmErbB3, tmErbB4, tmEphAl и tmEphA2.

11.2.18. Солюбилизация трансмембранных пептидов.

11.2.19. Спектроскопия ЯМР, расчет пространственных структур и МД-релаксация.

11.2.20. Изучение димеризационной способности трансмембранных пептидов в мембране E.coli (система ToxR).

11.2.21. Снятие спектров кругового дихроизма (КД).

11.2.22. Динамическое светорассеяние.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Разработка универсальной системы экспрессии синтетических генов трансмембранных пептидов в клетках E.coli.

III.2. Конструирование экспрессионных векторов pGEMEX-l/(TRX-[TM пептид]).

Ш.З. Оптимизация условий культивирования рекомбинантных штаммов Е. coli.

111.4. Очистка гибридных белков TRX-[TM пептид].

111.5. Очистка трансмембранных пептидов.

111.6. Спектроскопия ЯМР, расчет пространственных структур и релаксации методом молекулярной динамики (МД).

111.7. Определение степени ассоциации трансмембранных участков мембранных белков в клеточной мембране.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белок-белковые взаимодействия в мембране: димеризация трансмембранных сегментов мембранных белков"

Изучение внутримембранных белок-белковых взаимодействий -чрезвычайно актуальная и интересная задача современной молекулярной биологии. Интегральные мембранные белки (МБ) играют исключительно важную роль в биологических процессах, составляющих основу жизнедеятельности клетки. В свою очередь, трансмембранные (ТМ) сегменты (ТМС) принимают непосредственное участие в поддержании структуры и функционировании МБ, так как именно эти участки связывают внеклеточную и цитоплазматическую части белка (1). Характерно, что действие не менее половины лекарств, выпускаемых в настоящее время, нацелено именно на МБ (2). Однако молекулярные механизмы функционирования МБ, к сожалению, еще очень слабо изучены. На начало сентября 2008 года полностью известна трехмерная атомная структура примерно двух сотен МБ1,что составляет менее 1% от всех структур белков, представленных в Protein Data Bank (PDB). В первую очередь, это связано со сложностью получения очищенных препаратов МБ в количествах, необходимых для проведения структурно-функциональных исследований. В частности, основными возникающими проблемами являются токсичность для клетки-хозяина, а также гидрофобность мембранных участков, затрудняющая последующую очистку МБ.

Известно, что функционирование ряда МБ часто сопряжено с процессом димеризации. Анализ большого количества аминокислотных последовательностей димеризующихся МБ, а также введение точечных мутаций позволили исследователям обнаружить последовательности аминокислот (мотивы) (3, 14), присутствие которых в ТМ областях МБ, предположительно, достаточно для димеризации этих молекул. Изучение

1 http://blanco.biornol.uci.edu/MernbraneProteinsxtal.html. 7 механизмов, управляющих димеризацией, понимание аспектов, связанных с ролью ТМС в активации и функционировании, раскрытие пространственной структуры МБ, заложат основу современного подхода к рациональному дизайну лекарственных препаратов нового поколения, например, основанному на синтетических пептидах, регулирующих свойства и функции рецепторов и каналов биологической мембраны.

Целью данной диссертационной работы является изучение белок-белковых взаимодействий в составе димерных комплексов различных ТМ пептидов в мембране и/или мембраноподобном окружении. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи: а) разработка универсальной системы эффективной экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках Е. coli; а также разработка универсального протокола очистки ТМ пептидов; б) изучение процессов димеризации ТМ пептидов in vitro в средах, имитирующих биологическую мембрану, при помощи оптических методов анализа, спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения и методов молекулярного моделирования;' в) изучение димеризационной способности ТМ сегментов в бактериальной мембране.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гончарук, Марина Валерьевна

выводы

1. Разработана система эффективной экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках Е. coli. Разработан универсальный протокол выделения ТМ пептидов. Предложенный протокол успешно апробирован на примере 9 ТМ пептидов: tmGpA, tmBNip3, tmDcuS, tmErbBl, tmErbB2, tmErbB3, tmErbB4, tmEphAl, tmEphA2.

2. Все исследуемые TM пептиды, в том числе их изотопно-меченые 15N-, 151чГ/13С-производные, получены в количествах, достаточных для установления их структурной организации в мембраноподобном окружении с помощью оптических методов анализа и спектроскопии ЯМР. Это позволило получить структурную информацию о димерных комплексах tmGpA, tmBNip3, tmErbB2, tmErbB4, tmEphAl, tmEphA2 в искусственной мембране.

3. На основании системы ToxR создан экспериментальный протокол, позволивший в результате введения точечных замен аминокислотных остатков выявить интерфейс димеризации ТМ участка EphAl в бактериальной мембране. Полученные для EphAl результаты полностью совпали с данными, установленными при помощи спектроскопии ЯМР в мембраноподобном окружении.

4. Полученные данные по гомодимеризации tmBNip3, tmErbB2, tmErbB4, tmEphAl, tmEphA2, сопоставленные с литературными сведениями, позволили выявить взаимосвязь структуры и функции исследуемых объектов. На основании анализа пространственной организации tmBNip3 выдвинута гипотеза об образовании протонного канала при встраивании белка во внешнюю мембрану митохондрии, что, по-видимому, связано с инициацией апоптозо-некрозного каскада в клетке при гипоксии. Димерная структура tmErbB2, tmErbB4, tmEphAl, tmEphA2 свидетельствует об их активном участии в функционировании соответствующих рецепторов и хорошо согласуется с предложенным в литературе поворотно-связанным механизмом передачи сигнала в клетку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа является частью разработанного в Лаборатории инженерии белка и Отделе структурной биологии ИБХ РАН комплексного подхода, направленного на определение структурно-динамических характеристик ТМ доменов МБ. Комплексный подход органически объединяет разнообразные современные физико-химические методы исследования белков, не имеет аналогов в мире и уникален тем, что на основе синтеза экспериментальных и теоретических методик (биоинженерия, молекулярное моделирование, ЯМР и оптическая спектроскопия) позволяет изучать пространственную структуру и внутримолекулярную динамику гомо- и гетеродимеров ТМ а-спиралей в средах, имитирующих мембранное окружение (мицеллы детергентов, липидные бицеллы).

В данной работе с учетом принципов оптимизации процесса выделения целевых пептидов выбирали оптимальные ТМ фрагменты исследуемых белков, включающие внутримембранный гидрофобный сегмент с прилегающими к нему внемембранными гидрофильными участками. На следующем этапе проводили разработку и оптимизацию бактериальных систем экспрессии и очистки выбранных ТМ пептидов с последующим получением рекомбинантных целевых белков, меченых изотопами С- и Ж После поиска оптимальных методик реконструкции ТМ пептидов в мембраноподобное окружение осуществляли подбор приемлемых условий получения ЯМР-спектров образцов. Для отнесения !Н-, 13С- и резонансов, расчета пространственной структуры и описания внутримолекулярной динамики применяли современные методики гетероядерной спектроскопии ЯМР. Результирующие модели пространственных структур димерных комплексов ТМ пептидов помещали в явно заданный липидный бислой для проведения итоговой энергетической релаксации методом молекулярной динамики с использованием экспериментально полученных конформационных ограничений. Это позволило получить детальную информацию о взаимодействиях белок-белок и белок-липид на атомном уровне. Для изучения роли конкретных аминокислотных остатков в димеризации ТМ сегментов белков на основании системы Тох!1 создан экспериментальный протокол, предназначенный для количественной оценки степени ассоциации ТМ спиралей в мембране Е.соН.

После получения точной структурно-динамической информации о конформации ТМ пептидов в дальнейшем предполагается моделирование новых видов прототипов лекарственных препаратов, так называемых «пептидов-перехватчиков», связывающихся с а-спиральным ТМ доменом белка для изменения (нарушения) его димеризационной способности в клеточной мембране. При этом выбор самых активных пептидов предполагается осуществлять с помощью имеющихся методов анализа и ТохК. системы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончарук, Марина Валерьевна, Москва

1. Y. Shai (1995) Molecular recognition between membrane-spanning polypeptides. Trends Biochem. Sci., 20(11), 460 464.

2. J.P. Overington, B. Al-Lazikani, A.L. Hopkins (2006) How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug. Discov., 5(12), 993 996.

3. A.R. Curran, D.M. Engelman (2003) Sequence motifs, polar interactions and conformational changes in helical membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 13(4), 412-417.

4. P. Геннис (1997) Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Мир, Москва, Россия.

5. J.L. Popot, D.M. Engelman (2000) Helical membrane protein folding, stability and evolution. Ann. Rev. Biochem., 69, 881— 922.

6. J.U. Bowie (1997) Helix packing in membrane proteins. J. Mol. Biol, 272, 780 789.

7. G. von Heijne (1999) Recent advances in the understanding of membrane protein assembly and structure. O. Rev. Biophys., 32, 285 307.

8. A.H. Delcour (2002) Structure and function of pore-forming betabarrels from bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 4, 1 — 10.

9. R. Koebnik, K.P. Locher, P. Van Gelder (2000) Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol. Microbiol., Ъ1, 239-253.

10. M.E. binder, A.G. Gilman (1992) G protein. Sci. Am., 267, 36 43.

11. K.E. Onagari, J. Teissie, H. Benoist (1995) Glycophorin A protects K562 cells from natural killer cell attack. J. Biol. Chem., 270(45), 26970 26975.

12. Л.И. Иржак (2001) Состав и функции крови. С.О.Ж., 7(2), 11-19.

13. M.T. Young, M.J.A. Tanner (2003) Distinct regions of human glycophorin A enhance human red cell anion exchanger (Band 3; AE1) transport function and surface trafficking. J. Biol. Chem., 278(35), 32954 -32961.

14. K.R. MacKenzie, J.H. Prestegard, D.H. Engelman (1997) A transmembrane helix dimer: structure and implications. Science, 276, 131 — 133.

15. I.G. Janausch, I. Garsia-Moreno, G. Unden (2002) Function of DcuS from Escherichia coli as a fumarate-stimulated histidine protein kinase in Vitro. J. Biol. Chem., 277(42), 39809 39814.

16. M.A. Lemmon, H.R. Treutlein, P.D. Adams, A.T. Brunger, D.M. Engelman (1994) A dimerization motif for transmembrane a—helices. Struct. Biol., 1(3), 157- 163.

17. C. Vande Velde, J. Cizeau, D. Dubik, J. Alimonti, T. Brown, S. Israels, R. Hakem, A.H. Greenberg (2000) BNIP3 and genetic control of necrosis-like cell death through the mitochondrial permeability transition pore. Mol. Cell. Biol., 20(15), 5454-5468.

18. G. Chen, J. Cizeau, C. Vande Velde, J.H. Park, G. Bozek, J. Bolton, L. Shi, D. Dubik, A. Greenberg (1999) Nix and Nip3 form a subfamily of pro-apoptotic mitochondrial proteins. J. Biol. Chem., 274(1), 7- 10.

19. M. Yasuda, P. Theodorakis, T. Subramanian, G. Chinnadurai (1998) Adenovirus E1B-19K/BCL-2 interacting protein BNIP3 contains a BH3domain and a mitochondrial targeting sequence. J. Biol. Chem., 273(20), 12415- 12421.

20. R. Zaraora, L. Alarcon, Y. Vodovotz, B. Betten, P.K.M. Kim, K.F. Gibson, T.R. Billiar (2001) Nitric oxide suppresses the expression of Bcl-2 binding protein BNIP3 in hepatocytes. J. Biol. Chem., 276(50), 46887 46895.

21. E.S. Sulistijo, T.M. Jaszewski, K.R. MacKenzie (2003) Sequence-specific dimerization of the transmembrane domain of the "BH3-only" protein BNIP3 in membranes and detergent. J. Biol. Chem., 278(51), 51950 51956.

22. J. Schlessinger (2000) Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell, 103(2), 211 -225.

23. M.A. Olayioye, R.M. Neve, H.A. Lane, N.E. Hynes (2000) The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBOJ., 19(13), 3159-3167.

24. T. Rajkumar, W.J. Gullick (1994) The type I growth factor receptors in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat., 29(1), 3-9.

25. H. Toyoda, T. Komurasaki, D. Uchida, Y. Takayama, T. Isobe, T. Okuyama, K. Hanada (1995) Epiregulin. A novel epidermal growth factor with mitogenic activity for rat primary hepatocytes. J. Biol. Chem., 270(13), 7495 7500.

26. K.L. Carraway, S.J. Burden (1995) Neuregulins and their receptors. Curr. Opin. Neurobiol, 5(5), 606 612.

27. K.G. Tanner, J. Kyte (1999) Dimerization of the extracellular domain of the receptor for epidermal growth factor containing the membrane-spanning segment in response to treatment with epidermal growth factor. J. Biol. Chem., 274(50), 35985 35990.

28. T. Moriki, H. Maruyama, I.N. Maruyama (2001) Activation of preformed EGF receptor dimers by ligand-induced rotation of the transmembrane domain. J. Mol. Biol., 311(5), 1011 1026.

29. J.R. Woodburn (1999) The epidermal growth factor receptor and its inhibition in cancer therapy. Pharmacol. Ther., 82, 241 250.

30. M.A. Lemmon, Z. Bu, J.E. Ladbury, M. Zhou, D. Pinchasi, I. Lax, D.M. Engelman, J. Schlessinger (1997) Two EGF molecules contribute additively to stabilization of the EGFR dimer. EMBO J., 16(2), 281 294.

31. R.V. Aroian, M. Koga, J.E. Mendel, Y. Ohshima, P.W. Sternberg (1990) The let-23 gene necessary for Caenorhabditis elegans vulval induction encodes a tyrosine kinase of the EGF receptor subfamily. Nature, 348(6303), 693 699.

32. J.D. Wasserman, M. Freeman (1997) Control of EGF receptor activation in Drosophila. Trends Cell Biol., 7(11), 431 436.

33. W.H. Daughaday, T.F. Deuel (1991) Tumor secretion of growth factors. Endocrinol. Metab. Clin. North Am., 20(3), 539 — 563.

34. M.J. Hayman, P.J. Enrietto (1991) Cell transformation by the pidermal growth factor receptor and v-erbB. Cancer Cells, 3(8), 302 307.

35. D.S. Salomon, R. Brandt, F. Ciardiello, N. Normanno (1995) Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit. Rev. Oncol. HematoL, 19(3), 183 232.

36. B.A. Бурлев, A.C. Гаспаров, H.C. Аванесян, Н.И. Волков, Д.А. Стыгар (1998) Факторы роста и их роль в регуляции репродуктивной функции у больных с синдромом поликистозных яичников. Пробл. Репрод., 3, 17-25.

37. D. Harari, Y. Yarden (2000) Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene, 19, 6102 6114.

38. L.N. Klapper, H. Waterman, M. Sela, J. Yarden (2000) Tumor-inhibitory antibodies to HER-2/ErbB-2 may act by recruiting c-Cbl and enhancing ubiquitination ofHER-2. Cancer Res., 60, 3384 3388.

39. R. Mass (2000) The role ofHER-2 expression in predicting response to therapy in breast cancer. Semin. Oncol., 27, 46 52.

40. S.A. Prigent, N.R. Lemoine, C.M. Hughes, G.D. Plowman, C. Selden, W.J. Gullick (1992) Expression of the c-erbB-3 protein in normal human adult and fetal tissues. Oncogene, 7(7), 1273 1278.

41. N.R. Lemoine, D.M. Barnes, D.P. Hollywood, C.M. Hughes, P. Smith, E. Dublin, S.A. Prigent , W.J. Gullick, H.C. Hurst (1992) Expression of the ERBB3 gene product in breast cancer. Br. J. Cancer., 66(6), 1116 1121.

42. F.E. Jones, J.P. Golding, M. Gassmann (2003) ErbB4 signaling during breast and neural development: novel genetic models reveal unique ErbB4 activities. Cell Cycle, 2(6), 555 -559.

43. T.Y. Kew, J.A. Bell, S.E. Pinder, H. Denley, R. Srinivasan, W.J. Gullick, R.I. Nicholson, R.W. Blarney, I.O. Ellis (2000) c-erbB-4 protein expression in human breast cancer. Br. J. Cancer, 82(6), 1163 -1170.

44. N.L. Barnes, S. Khavari, G.P. Boland, A. Cramer, W.F. Knox, N.J. Bundled (2005) Absence of HER4 expression predicts recurrence of ductal carcinoma in situ of the breast. Clin. Cancer Res., 11(6), 2163 -2168.

45. G.A. Vidal, D.E. Clark, L. Marrero, F.E. Jones (2007) A constitutively active ERBB4/HER4 allele with enhanced transcriptional coactivation and cell-killing activities. Oncogene, 26(3), 462 466.

46. M.P. Junier (2000) What role(s) for TGFalpha in the central nervous system? Prog. NeurobioL, 62(5), 443 473.

47. D. Graus-Porta, R.R. Beerli, J.M. Daly, N.E. Hynes (1997) ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling. EMBO J., 16(7), 1647-1655.

48. A. Bennasroune, M. Fickova, A. Gardin, S. Dirrig-Grosch, D. Aunis, G. Cremel, P. Hubert (2004) Transmembrane peptides as inhibitors of ErbB receptor signaling. Mol. Biol. Cell, 15(7), 3464 3474.

49. J.P. Duneau, A.P. Vegh, J.N. Sturgis (2007) A dimerization hierarchy in the transmembrane domains of the HER receptor family. Biochemistiy, 46(7), 2010-2019.

50. J.M. Mendrola, M.B. Berger, M.C. King, M.A. Lemmon (2002) The single transmembrane domains of ErbB receptors self-associate in cell membranes. J. Biol. Chem., 277(7), 4704 4712.

51. K.R. Mackenzie (2006) Folding and stability of alpha-helical integral membrane proteins. Chem Rev., 106(5), 1931 1977.

52. V.C. Dodelet, E.B. Pasquale (2000) Eph receptors and ephrin ligands: embryogenesis to tumorigenesis. Oncogene, 19(49), 5614 5619.

53. J.P. Himanen, D.B. Nikolov (2003) Eph receptors and ephrins. Int. J. Biochem. Cell Biol., 35(2), 130 134.

54. S. Hanna., C.M. Patrick, S. Ravi (2004) The role of ephrins and Eph receptors in cancer. Cytokine & Growth Factor Reviews, 15,419 — 433.

55. R. Gerlai (2001) Eph receptors and neural plasticity. Nat. Rev. Neurosci., 2(3), 205 209.

56. J. Toth, T. Cutforth, A.D. Gelinas, K.A. Bethoney, J. Bard, C.J. Harrison (2001) Crystal structure of an ephrin ectodomain. Dev. Cell, 1(1), 83 92.

57. J.P. Himanen, N. Saha, D.B. Nikolov (2007) Cell-cell signaling via Eph receptors and ephrins. Curr. Opin. Cell Biol., 19, 534 542.

58. M.G. Coulthard, J.D. Lickliter, N. Subanesan, K. Chen, G.C. Webb, A.J. Lowiy, S. Koblar, C.D. Bottema, A.W. Boyd (2001) Characterization of the Ephal receptor tyrosine kinase: expression in epithelial tissues. Growth Factors, 18(4), 303-317.

59. B. de Saint-Vis, C. Bouchet, G. Gautier, J. Valladeau, C. Caux, P. Garrone (2003) Human dendritic cells express neuronal Eph receptor tyrosine kinases: role of EphA2 in regulating adhesion to fibronectin. Blood, 102(13), 4431 -4440.

60. C. Hafher, B. Becker, M. Landthaler T. Vogt (2006) Expression profile of Eph receptors and ephrin ligands in human skin and downregulation of EphAl in nonmelanoma skin cancer. Modern Pathol., 19, 1369 1377.

61. C. Haiher, G. Schmitz, S. Meyer, F. Bataille, P. Hau, T. Langmann, W. Dietmaier, M. Landthaler, T. Vogt (2004) Differential gene expression of Eph receptors and ephrins in benign human tissues and cancers. Clin. Chem., 50(3), 490 499.

62. B.P. Fox, R.P. Kandpal (2004) Invasiveness of breast carcinoma cells and transcript profile: Eph receptors and ephrin ligands as molecular markers of potential diagnostic and prognostic application. Biochem. Biophys. Res. Commun., 318(4), 882 892.

63. I. Konstantinova, G. Nikolova, M. Ohara-Imaizumi, P. Meda, T. Kucera, K. Zarbalis, W. Wurst, S. Nagamatsu, E. Lammert (2007) EphA-Ephrin

64. A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell, 129(2), 359 370.

65. A.I. Ivanov, A.A. Romanovsky (2006) Putative dual role of ephrin-Eph receptor interactions in inflammation. IUBMB Life., 58(7), 389 394.

66. L.E. Fisher, D.M. Engelman (2001) High-yield synthesis and purification of an a-helical transmembrane domain. Anal. Biochem., 293, 102 — 108.

67. C. Klammt, D. Schwarz, F. Lohr, B. Schneider, V. Dötsch, F. Bernhard (2006) Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. FEBS J., 273(18), 4141 4153.

68. C. Klammt, F. Lohr, B. Schäfer, W. Haase, V. Dötsch, H. Rüterjans, C. Glaubitz, F. Bernhard (2004) High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. Eur J Biochem., 271(3), 568 580.

69. B. Miroux, J.E. Walker (1996) Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol, 260, 289 — 298.

70. С. Montigny, F. Penin, С. Lethias, P. Falson (2003) Overcoming the toxicity of membrane peptide expression in bacteria by upstream insertion of Asp-Pro sequence. Biochem. Biophys. Acta, 1660, 53 — 65.

71. S.C. Makrides (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev., 60(3), 512 — 538.

72. A.H. Вульфсон, P.B. Тихонов, C.E. Печёнов (2001) Общий подход к ренатурации рекомбинантных белков, продуцируемых в составе тел включения. Доклады академии наук, 380(3), 400 — 403.

73. A. Mitraki, J. Kling (1989) Protein folding intermediates and inclusion body formation. Biotechnology, 7, 690 — 697.

74. D.L. Wilkinson, R.G. Harrison (1991) Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnology, 9(5), 443 448.

75. Y. Shirano, D. Shibata (1990) Low temperature cultivation of Escherichia coli carrying a rice lipoxygenase L-2 cDNA produces a soluble and active enzyme at a high level. FEBS Lett., 271, 128 130.

76. C.H. Schein (1989) Production of soluble recombinant proteins in bacteria. Biotechnology, 7, 1141 1149.

77. S. Cabilly (1989) Growth at sub-optimal temperatures allows the production of functional, antigen-binding Fab fragments in Escherichia coli. Gene, 85, 553 557.

78. М.П. Кирпичников, M.B. Гончарук, Я.С. Ермолюк, С.А. Гончарук, A.A. Шульга, И.В. Масленников, A.C. Арсеньев (2005) Структурная биология мембранных пептидов. Технология живых систем, 2(1-2), 20 — 27.

79. S. Peng, L.P. Liu, A.Q. Emili, C.M. Deber (1998) Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: expression and helicity of a double membrane-spanning segment. FEBS Lett., 431(1), 29 33.

80. S.C. Lee, P.O. Olins (1992) Effect of overproduction of heat shock chaperones GroESL and DnaK on human procollagenase production in

81. Escherichia coli. J. Biol. Chem., 267(5), 2849 2852.

82. T. Yasukawa, C. Kanei-Ishii, T. Maekawa, J. Fujimoto, T. Yamamoto, S. Ishii (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem., 270(43), 25328-25331.

83. J.R. Blackwell, R. Horgan (1991) A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. FEBS Lett., 295, 10 12.

84. F. Baneyx (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 411 —421.

85. D.B. Smith, K.S. Johnson (1988) Singles-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 67(1), 31 -40.

86. X. Zuo, S. Li, J. Hall, M.R. Mattern, H. Tran, J. Shoo, R. Tan, S.R. Weiss, T.R. Butt (2005) Enhanced expression and purification of membrane proteins by SUMO fusion in Escherichia coli. J. Struct. Funct. Genomics., 6(2-3), 103 111.

87. R. Grisshammer, J Little, D. Aharony (1994) Expression of rat NK-2 (neurokinin A) receptor in E. coli. Receptors Channels, 2, 295 302.

88. A.K. Mohanty, М.С. Wiener (2004) Membrane protein expression and production: effects of polyhistidine tag length and position. Protein Expr. Purif., 33,311 -325.

89. P.-A. Nygren, S. Stahl, M. Uhlen (1994) Engineering proteins to facilitate bioprocessing. Trends Biotechnol., 12, 184- 188.

90. Y. Fujiyoshi (1998) The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Adv. Biophys., 35, 25 — 80.

91. K. Murata, K. Mitsuoka, T. Hirai, T. Waltz, P. Agre, J.B. Heymann, A. Engel, Y. Fujiyoshi (2000) Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature, 407(6804), 599 605.

92. J.L. Rubinstein (2007) Structural analysis of membrane protein complexes by single particle electron microscopy. Methods, 41, 409 416.

93. T. Wagenknecht, M. Samso (2002) Three-dimensional reconstruction of ryanodine receptors. Front. Biosc., 7, 1464— 1474.

94. E.B. Кудряшова, A.K. Гладилин, A.B. Левашов (2002) Белки в надмолекулярных ансамблях: исследование структуры методом разрешено-временной флуоресцентной анизотропии. Успехи биологической химии, 42, 257 — 294.

95. B.N. Giepmans, S.R. Adams, М.Н. Ellisman, R.Y. Tsien (2006) The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science, 312(5771), 217-224.

96. N. Hayes, E. Howard-Cofield, W. Gullick (2004) Green fluorescent protein as a tool to study epidermal growth factor receptor function. Cancer Lett., 206, 129-135.

97. J.E. Com, P.J. Pease, G.L. Hura, J.M. Berger (2005) Crosstalk between primase subunits can act to regulate primer synthesis in trans. Mol. Cell, 20, 391 -401.

98. L.E. Fisher, D.M. Engelman, J.N Sturgis (1999) Detergents modulate dimerization, but not helicity, of the glycophorin A transmembrane domain. J. Mol. Biol., 293(3), 639 -651.

99. R.G. Efremov, P.E. Volynsky, D.E. Nolde, A.S. Arseniev (2001) Implicit two-phase solvatation model as a tool to assess conformation and energetics of proteins in membrane-mimetic media. Theor. Chem. Acc., 106, 48 54.

100. D. Langosch, B. Brosig, H. Kolmar, H.J. Fritz (1996) Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J. Mol. Biol., 263(4), 525 530.

101. B. Brosig, D. Langosch (1998) The dimerization motif of the glycophorin A transmembrane segment in membranes: importance of glycine residues. Protein Sei., 7(4), 1052 1056.

102. W.P. Russ, D.M. Engelman (1999) TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96(3), 863 868.

103. R. Gurezka, D. Langosch (2001) In vitro selection of membrane-spanning leucine zipper protein-protein interaction motifs using POSSYCCAT. J. Biol. Chem., 276(49), 45580 45587.

104. A. Bennasroune, A. Gardin, С. Auzan, Е. Clauser, S. Dirrig-Grosch, M. Meira, A. Appert-Collin, D. Aunis, G. Cremel, P. Hubert (2005) Inhibition by transmembrane peptides of chimeric insulin receptors. Cell Mol. Life Sci., 62(18), 2124-2131.

105. L. Roth, C. Nasarre, S. Dirrig-Grosch, D. Aunis, G. Cremel, P. Hubert, D. Bagnard (2008) Transmembrane domain interactions control biological functions of neuropilin-1. Mol. Biol. Cell., 19(2), 646 654.

106. D. Schneider, D.M. Engelman (2003) GALLEX, a measurement of heterologous association of transmembrane helices in a biological membrane. J. Biol. Chem., 278(5), 3105 3111.

107. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сембрук (1984) Молекулярное клонирование. Мир, Москва, Россия.

108. А.В. Lee, Т.А. Cooper (1995) Improved direct PCR screen for bacterial colonies: wooden toothpicks inhibit PCR amplification. Biotechniques, 18(2), 225-226.

109. H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23 28.

110. U.K. Laemmli (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(259), 680 685.

111. H. Schagger, G. von Jagow (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 166(2), 368 379.

112. M.E. Gasparian, V.G. Ostapchenko, A.A. Schulga, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov (2003) Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 31, 133- 139.

113. J. Cavanagh, W.J.Fairbrother, A.G. Palmer, N.J. Skelton (2006) Protein NMR spectroscopy: principles and practice, 2nd ed., Academic Press, San-Diego, USA.

114. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сембрук (1984) Молекулярное клонирование. Мир, Москва, Россия.

115. E. Lindahl, B. Hess, D. van der Spoel (2001) GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod., 7, 306 -317.

116. Дж. Миллер (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Мир, Москва, Россия, 324 328.

117. N. Sreerama, R.W. Woody (2000) Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set. Anal. Biochem., 287(2), 252 260.

118. Ю.Е. Пустовалова (2006) Исследование пространственной структуры трансмембранного домена проапоптозного белка BNip3 методом спектроскопии ЯМР. Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук, Москва, Россия.