Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида

Надеждин, Кирилл Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида"

на правах рукописи

Надеждин Кирилл Дмитриевич

Структура, динамика и механизм димеризации трансмембраиного домена белка-предшественника бета-амилоида

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

6 ДЕК 2012

Москва-2012

005056253

Диссертация выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Арсеньев Александр Сергеевич

доктор химических наук, профессор

Бочарова Ольга Владимировна

кандидат медицинских наук

Кутышенко Виктор Павлович

доктор физико-математических наук, профессор, Институт теоретической и экспериментальной биофизики (ИТЭБ РАН), заведующий лабораторией ЯМР-исследований биоструктур

Польшаков Владимир Иванович

доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, руководитель лаборатории магнитной томографии и спектроскопии

Федеральное государственное бюджетное Ведущая организация: образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится 13 декабря 2012 г. в 14 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 12 ноября 2012 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета

Страховская Марина Глебовна

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Болезнь Альцгеймера — самый распространенный вид нейродегенеративного заболевания в мире. С физиологической точки зрения заболевание характеризуется накоплением внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков в нервных тканях мозга. Важнейшую роль в развитии болезни играет белок-предшественник бета-амилоида (ПБА). Протеолиз этого белка в организме человека различными ферментативными системами ведет к образованию бета-амилоида — главного на сегодняшний день маркера болезни Альцгеймера. ПБА является мембранным белком длиной 695-770 а.о., поэтому современные попытки его структурных исследований испытывают ряд объективных трудностей. ПБА и его производные димеризуются в мембране клеток и эндосом. Более половины мутаций, являющихся основным фактором риска раннего развития заболевания, приходится на трансмембранный (ТМ) домен белка. На данный момент нет четкого понимания механизма влияния патогенных мутаций на прогрессирование болезни. Однако существует мнение, что на протеолиз белка могут влиять как мутации, так и липидный состав мембраны.

Для адекватной терапии болезни Альцгеймера необходимо понимание молекулярных основ развития заболевания. Наличие одной лишь структуры целевого белка часто не достаточно для эффективного поиска новых лекарственных препаратов. Именно поэтому глубокое изучение динамики, условий и механизма ферментативного процессинга белка-предшественника бета-амилоида представляется перспективной задачей для современной фундаментальной науки и медицины.

Цели и задачи исследования

Целью данной диссертационной работы являлось изучение структуры, динамических свойств и белок-белковых взаимодействий в составе димерных комплексов ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида в мембране и/или имитирующей мембранное окружение среде. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) разработка системы эффективной экспрессии синтетического гена ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида в клетках Е. coli, в том числе на средах, содержащих изотопы l5N и 13С;

2) разработка эффективного протокола очистки пептида;

3) изучение пространственной структуры и динамических характеристик пептида в мембранном окружении методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения;

4) определение мотивов димеризации, структуры димера и энергетических параметров процесса димеризации пептида.

Научная новизна и практическая значимость работы

Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые:

1) разработана эффективная система экспрессии в клетках Е. coli ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида;

2) разработана система очистки рекомбинантного ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида;

3) определена пространственная структура ТМ домена белка предшественника бета-амилоида методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, солю-билизированного в растворе мицелл из детергента додецилфосфохолина (ДФХ);

4) определена топология гомодимеризации пептида, а также описаны кинетические и энергетические параметры реакции димеризации.

Полученные данные о структуре и природе димеризации ТМ домена ПБА закладывают базис для адекватного описания молекулярных механизмов развития болезни Альц-геймера. Эти данные позволят не только расширить фундаментальные знания о влиянии старения или патогенных мутаций на процессы метаболизма в нейронах мозга, но и могут помочь выявить рациональный подход к эффективной терапии заболевания.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: EUROMAR-2009 (Гётеборг, Швеция, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); 36th FEBS CONGRESS (Турин, Италия, 2011), EUROMAR 2011 Magnetic Resonance Conference (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2011); Biophysical Society 56th Annual Meeting (Сан Диего, Калифорния, США, 2012); Российско-Германский симпозиум "Molecular Neurobiology Today and Tomorrow" (Москва, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 работы в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение») и выводов. Работа проиллюстрирована 40 рисунками, содержит 2 таблицы. Библиографический указатель содержит 110 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

APPjmtm 690 700 710 720

GSQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKK

Рис. 1. Первичная структура APPjmtm. Участок Glnm-Lys726 является частью последовательности полноразмерного ПБА, а N-концевые Gly-Ser остаются после протеолиза гибридного белка тромбином.

Аминокислотная последовательность пептида (обозначен APPjmtm), исследованного в настоящей работе, приведена на рис. 1.

Для достижения высокого уровня экспрессии синтетических генов ТМ пептидов (таких, как APPjmtm) в бактериях прямая и секреторная экспрессия чаще всего оказываются неприменимыми. Это объясняется способностью рекомбинантных мембранных белков накапливаться в клеточной мембране бактерий. При суперэкспрессии это приводит к дестабилизации мембраны, нарушению её целостности и гибели клетки. Во избежание возможной токсичности ТМ пептидов для бактериальных клеток использован метод конструирования гибридных систем бактериальной экспрессии. В качестве белка-партнера выбран тиоредоксин Е. coli (TRX) - небольшой белок, молекулярная масса которого составляет ~ 12 кДа. Этот белок участвует в различных восстановительных процессах и катализирует реакции тиол-дисульфидного обмена. Ряд свойств этого белка делают его эффективным партнером для систем гибридной экспрессии, в частности высокая растворимость (до 40 % от общего белка Е. coli), а также доступность N- и С-концов для размещения белков-партнеров.

TRX 6His LVPR GS QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIATVIVITLVMLKKK

Рис. 2 Схема строения гибридного белка. Серые блоки - место вставки последовательности тиоредоксина и сайт узнавания тромбином. Стрелкой показано место протеолиза тромбином, подчеркнута ТМ часть ПБА.

Получение рекомбинантного трансмембранного домена ПБА68&-726

(APPjmtm)

Между генами TRX и APPjmtm встраивалась последовательность из шести остатков гистидина (öHis-таг) для очистки гибридного белка, а также сайт протеолиза тромбином (последовательность LVPRGS, рис.2). Тромбин сохраняет ферментативную активность и специфичность в присутствии детергентов, необходимых для солюбилизации и последующего протеолиза гибридного белка. После расщепления тромбином на N-конце APPjmtm остается дипептид Gly-Ser, что, по нашим данным, не должно влиять на структуру и специфическое взаимодействие ТМ доменов белков.

Ген APPjmtm был собран из семи синтетических олигонуклеотидов. Для последующей рекомбинации и клонирования последовательность прямого праймера включала участок, комплементарный З'-концевой области гена TRX. В последовательности обратного праймера был предусмотрен сайт рестрикции BamHI. Полученный продукт, включающий в себя последовательности состыкованных генов Тгх и APPjmtm, гидролизовался эндонук-леазами рестрикции Cpol и BamHI, а потом дотировался вектором pGEMEX-1, гидролизо-ванного теми же рестриктазами.

Оптимизация условий экспрессии

В качестве экспрессионного штамма Е. coli был использован штамм BL21(DE3)pLysS, содержащий хромосомную копию гена РНК—полимеразы фага Т7, а также плазмиду pLysS с геном лизоцима фага Т7. Вследствие того, что лизоцим эффективно ингибирует Т7 РНК-полимеразу, фоновый уровень индукции в клетках данного штамма существенно снижен, что особенно важно при экспрессии генов токсичных белков, таких, как ТМ пептиды.

С целью получения максимального выхода гибридного белка был осуществлен подбор температуры выращивания бактерий и оптимальной концентрации химического индуктора изопропил—ß-D-тиогалактозида (ИПТГ). Максимальному накоплению белка в клеточной биомассе способствует 0,05 мМ концентрация ИПТГ для «богатой» среды ТВ и 0,25 мМ для минимальной среды М9 при 18°С.

На «богатой» среде ТВ гибридный белок накапливался в максимальных количествах в течение первых суток роста (выход 200 мг/л культуры), а на «бедной» среде М9 (включая рост на 15N- и 13С-содержащих средах с добавлением тотально меченых 15NH4C1 и 13С-глюкозы) - через 60-70 ч (выход 60 мг/л культуры).

ч <{S

/ ¿г

л0 .о' Л» Д» Л > „

димер Trx-APPjmtm

Trx-APPjmtm

26.6

16:9 14.2

6.5

Trx-APPj mtr i ■*— Trx

APPjmtm

Элюат (200 мМ имидазол)

Рис. 3. Металлохелаптая аффинная хроматография TRX-APPjmtm до и после протеолиза тромбином. Слева: Электрофорез проб в 12% трис-глициновом ПААГ после МХАХ клеточного лизата. Справа: Электрофорез проб в 12% трис-тргщиновом ПААГ после протеолиза тромбином и последующей вычитающей МХАХ.

Очистка APPjmtm

На всех этапах очистки ТМ фрагментов необходимо присутствие детергента. Это нужно для поддержания пептида APPjmtm и гибридного белка в растворимой форме вследствие их гидрофобности. По этой причине все буферные растворы, используемые в процессе очистки, содержали 1% мягкого неионного детергента Тритон X—100. Такая концентрация детергента не препятствовала полному расщеплению гибридного белка тромбином и способствовала поддержанию ТМ пептида в растворимом виде после удаления белка-партнера.

Очистка пептида проходила в несколько этапов. После лизиса клеток проводилась металлохелатная аффинная хроматография (МХАХ) на колонке с Мг+-хелатирующей се-фарозой. На этой стадии гибридный белок TRX-APPjmtm очищался от большинства посторонних бактериальных белков. Так как гибридный белок TRX-APPjmtm содержал последовательность из шести гистидинов (öHis-таг). он связывался с никелем, в то время как большинство белков Е. coli не сорбировалось смолой (рис. 3: белок, не связавшийся с колонкой). Связанный с сорбентом гибридный белок элюировался 200 мМ имидазолом (рис. 3. фракции 1-6).

После этого гибридный белок подвергался протеолизу тромбином в течение 16-18 часов. Было установлено, что для протеолиза оптимальным является соотношение фер-

мент/субстрат равное 1 единице активности на 1 мг гибридного белка. Более того, эффективность гидролиза повышалась при снижении концентрации ЫаС1 до 50 мМ и имидазола до 30 мМ.

Для разделения продуктов гидролиза гибридного белка проводилась повторная МХАХ на №2+-хелатирующей сефарозе. При этом продукты гидролиза, имеющие в своем составе последовательность из шести гистидинов (недорасщепленный гибридный белок и белок-партнер ТЮС), а также примесные белки, обладающие неспецифическим сродством к сефарозе, задерживались смолой, а целевой пептид оказывался в проскоке. Типичная картина состава проб после гидролиза и вычитающей МХАХ показана на рис. 3.

Окончательная очистка пептида проходила при помощи обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (оф-ВЭЖХ). Для нанесения пептида на колонку оф-ВЭЖХ было необходимо удалить детергент. С этой целью пептид АРРргШп, солю-билизированный в детергенте Тритоне Х-100, осаждался трихлоруксусной кислотой. После этого осадок 3 раза промывался ацетоном от детергента. На этом этапе Тритон X—100 переходил в растворимую фракцию, а чистый белок, свободный от детергента, оказывался в осадке.

После осаждения пептид растворялся в смеси трифторэтанол/вода в соотношении 1:1с добавлением ОД % трифторуксусной кислоты (ТФУ) и наносился на колонку для очи-

Рис. 4. Очистка АРР]тШ с помощью оф-ВЭЖХ (слева) и масс-спектр пептида (справа).

1 — область элюции 17—25 мин, содержащая примесные белки; 2 — пик, соответствующий элюции АРР)т1т. Пунктиром показан градиент раствора Б (1% за 10 мин), правая шкала. Справа приведен масс-спектр смеси немеченого и "Ы-меченного пептида (плюс ~50 Да к массе немеченого пептида) АРР]тЬп после стадии очистки на оф-ВЭЖХ. Измеренные массы пептидов 4445,1 и 4494,7 Да оказались в точном соответствии с теоретическими значениями (4445,6 Да для немеченого пептида).

щего 0,1 % ТФУ в воде. После нанесения на нее белка проводилась элюция градиентом раствора В, содержащего 0,1% ТФУ в ацетонитриле (рис. 4). Проверка на наличие примесей производилась посредством снятия гетероядерных двумерных 1 Н/15М-Н5<ЗС ЯМР-спектров для меченых образцов в смеси трифторэтанол/вода в соотношении 1:1. По данным анализа спектров ЯМР, доля примесей в меченых и немеченых препаратах после заключительной стадии очистки составляла менее 1%. Окончательные выходы АРР]тйп составили: 20 мг с литра богатой среды ТВ и 8 мг с литра минимальной среды М9.

Подбор условий для солюбилизации АРР^т

Ключевую роль в выборе имитирующей мембрану клетки среды для структурных исследований пептида играло время жизни образца, поэтому опытным путем был выбран детергент ДФХ. Солюбилизированный в мицеллах ДФХ пептид АРР.)'т1т проявлял наибольшую стабильность среди всех тестируемых мембранных сред, пригодных для проведения экспериментов (тестировались мицеллы ДФХ, ЛМФХ, ЛМФГ, ГФХ, ДСН, смешанные мицеллы из ДФХ и ДСН, бицеллы из ДМФХ/ДГФХ). Характерная дисперсия химических сдвигов в спектрах 'Н/15М-Н5()С и разброс значений полуширин кросс-пиков по протонному направлению от 15 до 25 Гц указывают на то, что ТМ домен АРР^ип встроен в мицеллу и имеет а-спиральную конформацию. При изменении молярного соотношения детергент/пептид в диапазоне от 80 до 30 (что соответствует от 1 до 2 молекул пептида на мицеллу) наблюдалось двоение сигналов в спектрах ЯМР из-за конформационных переходов мономер-димер.

Таким образом, предложенная стратегия экспрессии, очистки и солюбилизации позволяет получать ТМ домен ПБА в количестве, достаточном для структурно-динамических исследований спектроскопией ЯМР высокого разрешения.

Отнесение сигналов в спектрах ЯМР

Отнесение сигналов мономерной формы пептида АРР^йп, солюбилизированного в мицеллах ДФХ, было проведено при помощи двумерных спектров 'Н/15М-Н5(2С, 'Н/13С-НЭОС; а также трехмерных спектров 'Н/'^С/'^-НЫСА, 'Н/13С/15К-НК(С0)СА, 'Н/15!^-МОЕЗУ-ШСЗС и "С-НССН-ТОСБУ. Отнесение сигналов в спектре 'Н/'5Ы-Н5С>С для АРР^йп при соотношении Р/О 1:100 и рН 4,0 показано на рис. 5.

1718",,., ^ 1.72Л

У71М

..«О»

^ 4697

^^ Е693

Л719

{¿17.16 фР^ ^694 рб91 К724

1 ■ 2

А71^ К 699 к0686

N698 К725 |.-690 Л'710

1-70? А692

в704

К726

7 5 'Н, мл.

Р/Б 1:50 РД> 1:120

6709

0696

-4

Т714

$ 5697

М722 |718,У707

9 ™

1712 У7171

К699(|

Т719 М706Л

1.723 Е69Т" _____

$У695

1703 |«15 1=690 У710§ е.К725

1705

Р7,б г688 д .

А692 А701

1702

1720

ем

Рис. 5. Гетероядерный ЯМР-спектр Н80С рекомбинчнтно-го тотально ,3С/51У-меченного пептида АРР]тип. Пептид со-любчлизирован в водной суспензии мицелл ДФХ с молярным отношением пептид/детергент 1:100; рН 4,0; 45°С. Приведено отнесение сигналов для ,5МН-групп АРР]тШ.

Рис. 6. Наложение ге-тероядерных ЯМР-спектров

при рН 6.2, 45°С для разных соотношений пептид/ детергент в образце Пептид был солюбилизирован в водной суспензии мицелл ДФХ при соотношении пептид/детергент 1/120 (показан синим цветом), и при соотношении 1/50 (показан красным цветом). Отнесение сигналов показано для соотношения 1/120.

1—'—'—'—!—Г 8.5 8.0 7.5 7.0

Ч М.Д.

Отнесение сигналов в спектрах димера было проведено на основе имеющихся данных о химических сдвигах мономера АРРрПт. В спектре 'нЛ^-ШОС солюбилизирован-

ного в мицеллах ДФХ (при соотношении пептид/детергент 1:50) пептида APPjmtm наблюдалось характерное двоение некоторых сигналов. Это прямо указывает на появление нескольких форм APPjmtm при насыщении мицелл молекулами пептида. При этом в спектре 'H/I5N-HSQC, полученном при соотношении пептид/детергент 1:120, двоения не наблюдалось. На рис. 6 показано наложение спектров 'H/'5N-HSQC, полученных при одинаковых условиях, с одной лишь разницей в соотношении пептид/детергент (1:50 и 1:120). После снятия и отнесения 15N,13C-F1 -фильтрованного/КЗ-разделснного-ЬЮЕЗУ спектра, было установлено, что наблюдаемое двоение сигналов было вызвано димеризацией пептида. Следует отметить, что при дальнейшем насыщении мицелл происходило быстрое выпадение пептида в осадок (в течение 1 часа). Таким образом, стабилизация состояния образца происходила при соотношении пептид/детергент 1:50, а время его жизни составляло порядка 1-2 недель. Это позволило снять ЯМР спектры хорошего качества, которые оказались достаточными для отнесения сигналов и расчета структуры.

Спектры мономерной и димерной формы APPjmtm мало отличаются друг от друга. На основании этого можно заключить, что структура пептида не претерпевает серьезных изменений при димеризации. Разница в значениях химических сдвигов амидных протонов основной цепи (до 0,07 м.д.) остатков Met706, Gly709, Val717 и др. можно объяснить удлинением/укорачиванием водородной связи, образованной соответствующим протоном (известно, что изменение длины водородной связи на 0,05 Â ведет к изменению соответствующего химического сдвига HN протона на 0,1 м. д.).

В итоге отнесение сигналов мономерной формы APPjmtm проведено при соотношении пептид/детергент 1:100 и рН 4,0. Отнесение сигналов димера проведено при соотношении пептид/детергент 1:50 и рН 6,2.

Определение значения рК карбоксильных групп боковых цепей Glu693 и

Asp694

Так как протеолиз ПБА по амилоидогенному пути идет в кислой среде эндосом (рН~5), необходимо было проанализировать влияние рН раствора на состояние образца. В последовательности APPjmtm есть два аминокислотных остатка, рК карбоксильных групп боковых цепей которых могут лежать в районе рН 5 (Glu693 и Asp694). Для определения их рК был снят набор спектров, рН образца в которых варьировался от 2,9 до 7,2. В результате было определено, что рК титрующихся групп лежат диапазоне рН 4,3-4,9. Из получен-

ных данных был сделан вывод, что следует избегать структурных исследований в этом диапазоне pH, чтобы сузить количество неоднозначно интерпретируемых результатов.

Константа димеризации APPjmtm в мицеллах ДФХ

С целью более точного описания комплекса пептид-мицелла и определения кинетических параметров перехода димер-мономер в мицеллярном окружении были измерены константы ассоциации APPjmtm при различных соотношениях пептид/детергент в образце.

Зависимость константы димеризации от концентрации детергента можно учесть при помощи модели комплекса пептид-мицелла (Fleming et al, 2003; Fisher et al, 2003), в которой свободная энергия ассоциации дается формулой:

AGapp=AG0+yRT]n[Del]M, где AG0 — стандартная энергия ассоциации; у — коэффициент, характеризующий «идеальность» растворителя; [Det]M - концентрация детергента, входящего в состав мицелл (равна общей концентрации детергента в растворе за вычетом концентрации свободно плавающих молекул детергента, не образующих мицеллы, оценочно равной критической константе мицеллообразования). Формально у показывает порядок реакции по детергенту. Существует две интерпретации физического смысла этого коэффициента:

1) отображение изменения липидного состава мицеллы/бицеллы при димеризации;

2) описание зависимости энтальпии и энтропии системы от концентрации детергента.

Для определения константы димеризации/диссоциации был построен график зависимости видимой константы ассоциации Kaapp от соотношения пептид/детергент (P/D) в растворе (рис. 7). Проведенные эксперименты позволили определить значение параметра у.

При D/P более 70, то есть когда на одну мицеллу приходится менее одной молекулы пептида, параметр у равен 1,8. Значение свободной энергии димеризации AG0 при этом равно -1,4 ккал/моль, что является типичным значением для слабо взаимодействующих ТМ спиралей. Полученное значение для AGa само по себе не описывает энергетику димеризации, но включает также в себя свободную энергию, необходимую для переноса нескольких молекул детергента из мицеллы в мицеллу при ассоциации. В насыщенных пептидом мицеллах при D/P <70 параметр у=6, то есть при насыщении мицеллы молекулами пептида, то есть в случае, когда на одну мицеллу приходится в среднем более одной молекулы пептида, происходит резкое усиление димеризации и рост значения константы димеризации Kaapp.

Рис. 7. Кинетические параметры переходов мономер-димер.

A) Показана зависимость константы ассоциации (или димеризации) Кат, от соотношения P/D указывает на усиление димеризации APPjmtm в случаях, когда на одну мицеллу приходится в среднем более одной молекулы пептида (при P/D порядка 1/70 на одну мицеллу приходится одна молекула пептида в образце).

B) Приведена зависимость свободной энергии ассоциации AGapp от натурального логарифма концентрации детергента ДФХ, находящегося в мицеллярной форме. Мицеллы, занимаемые в среднем менее одной молекулой пептида, являются «неидеальным растворителем» с параметром у равным 1,8. При насыщении мицелл пептидом происходит усиление димеризации (у^б). В разбавленном случае (D/P>70) свободная энергия ассоциации AG0 равна -1.4 кксш/моль, что является типичным значением для слабо взаимодейств)'Ю1цих ТМ спиралей.

Элементы вторичной структуры

Опираясь лишь на значение химических сдвигов ядер 'Н, 13С и 15N, а также отнесение контактов ЯЭО в спектрах 'H^C-NOESY-HSQC и 'H/^N-NOESY-HSQC, можно сделать предположения о вторичной структуре белка. Отличия 13С химических сдвигов ядра С" от своего среднего значения в конформации «неупорядоченный клубок» указывают на тип вторичной структуры полипептидной цепи (так называемый вторичный химический сдвиг, Д8са=6са-белка-8клубок)- Он> как правило, имеет отрицательное значение для аминокислотного остатка в развернутом участке полипептидной цепи (ß-тяж) и положительное - в спиральной конформации.

Присутствие в спектре 'H/15N-NOESY-HSQC кросс-пиков контактов ЯЭО (Н\ Нам) и (HNi, Н".4), а также кросс-пиков (Н", Hßi+3) в спектре 'H/^C-NOESY-HSQC говорит об участии этих остатков в формировании а-спирали (рис. 8). Эти данные подкрепляются малыми значениями констант спин-спинового взаимодействия sJhnh<x (<6 Гц), говорящих о значении двугранного угла ф основной цепи порядка 65°±15° (что также характерно для а -спирали).

Качт

мМ'1 30-

Усилвние ' димеризации,'

20-

10"

■ицепла ептид

1:1

ВДО„

ккал/моль

-3-

0.01

0.02 p/D

1-" 7=1.8

-7-

-3

■ ln[DetM,J

Опираясь на полученные данные (рис. 8), можно предположить, что при рН 4.0 исследуемый пептид АРР]ш1т имеет два а-спиральных участка Ьу8687-Азр694 и О1у700-1.еи723.

700 723

В то же время при рН 6,2 спираль формируется только на участке 01у -Ьеи " . Полученные результаты прямо указывают на влияние рН раствора на структуру исследуемых объектов и подчеркивают важность корректного выбора условий внешней среды при структурных исследованиях.

Рис. 8. Определение элементов вторичной структуры на основе ЯМР-а> АРР]т^яокьуУг*ЕОТо5мк^1151.иусеу0у1АТУ1У1ть°ум1Л1кк данных. (А) Аминокислотная последовательность АРР^т. (Б) Межпротонные контакты ЯЭО при рН 4,0. (В) Вторичный химический сдвиг ядер иСа АРР]ттг при рН 4.0 (Г) Межпротонные контакты ЯЭО при рН 6,2. (Д) Вторичный химический сдвиг ядер ,3Са АРР]тШ при рН 6,2. (Е) Для мономера представлены данные о временах полуобмена. ¡¡/2, амидных протонов АРР]тШ на дейтерий растворителя. Заполненными кругами показаны остатки с 1т>2 ч. пустыми — с1< /1/2<2 ч; для остальных остатков ¡¡/2<1 ч. Квадратами обозначены остатки АРРут/т. сигналы амидных протонов которых претерпевают изменения химического сдвига более 3x10м. д. при изменении температуры на 1 "С. (Ж) ' Для димера при рН 6,2 заполненными кругами показаны амидные быстро обменивающиеся с водой амидные протоны. Пустыми кругами отмечены протоны со средней скоростью обмена. (3) Значения ОДК для всех отдельно стоящих кросс-пиков 15И-меченного образца АРР]т1т при рН 4,0. (И) Схематичное а5о-кьугЕаЕру5знКоАиеьмуаауУ1Ату1Угтьумь'ккк представление вторичной структуры

мономера АРР]т1т при рН 4,0.

Химические сдвиги для атомов N. Н Са, С0 и С15 являются чувствительными ко вторичной структуре белка, поэтому их значения были использованы для предсказаний значений торсионных углов основной цепи в программе ТАЬ05+, точность которой в применении к а-спиральным белкам составляет более 95%. Предсказанные значения тор-

сионных углов позднее использовались при расчете пространственной структуры пептида.

Динамические характеристики APPjmtm

Необходимым этапом исследования было измерение динамических характеристик отдельных участков полипептидной цепи APPjmtm. Для этого были определены времена продольной (Т]) и поперечной (Т2) релаксации, а также величина ЯЭО для ядер 15N всех остатков, высоту кросс-пиков от N/h-групп которых можно измерить в спектрах 'h/I5N-hsqc. Исходя из полученных параметров Т| и Т2, были рассчитаны эффективные времена корреляции броуновского вращения tr для большинства nh-векторов ТМ доменов по

формуле т„ х—!— 6—-7 (где uN-несущая частота спектрометра по ядру 15N в Герцах).

4луя\) Г,

Данные 15N релаксации позволяют сделать предположения о локальной подвижности и о вторичной структуре. Значения ^Nj'H} ЯЭО, Ть Т2 и tr зависят от расположения остатка в аминокислотной последовательности (рис. 9). Участки с низкой подвижностью (с высоким значением Tr) будут соответствовать встроенным в мицеллу ТМ спиралям, в то время как подвижные остатки (с низким значением tr) соответствуют более подвижным или неструктурированным участкам. Согласно динамическим характеристикам, а-спиралям соответствуют участки Gly700-Leu723 при значениях рН 4,0 и 6,2. Причем для некоторых остатков удалось определить значение tr как в мономерном, так и в димерном состоянии (рис. 9). Как и следовало ожидать, размер комплекса димер-мицелла несколько больше размера комплекса мономер-мицелла (разница значений времен вращательной корреляции Tr в среднем 2-4 не).

Исходя из данных по тк можно отметить, что при рН 4,0 подвижность примембран-ного (ПМ) участка Lys687-Asn698 для мономера ниже, чем при рН 6,2. Это хорошо прослеживается по разнице в тк на 2 не, что можно объяснить формированием вторичной структуры - короткой ПМ ос-спирали Lys687-Asp694. Также при рН 4,0 (это ниже рК титруемых боковых цепей Glu693 и Asp694) боковые цепи Glu693 и Asp694 протонируются и теряют отрицательный заряд. Это позволяет всей ПМ спирали плотнее контактировать с мицеллой за счет наличия гидрофобных взаимодействий с ацильными цепями детергента ДФХ и отсутствия кулоновских сил отталкивания заряженных боковых групп Glu693/Asp694 от отрицательно заряженных фосфатов липидных головок.

^5О111.уг'гАЕРуезмк|>11а1иуееу0у1Ату1Угт1°уи1ккк Рис. 9. Данные 15N релаксации Приведены релаксационные параметры для амидных групп АРР)тШ. (А) Значения гетероядерного ,5И{1Н} ЯЭО для мономерного состояния при рН 4,0. (Б) значения эффективного времени корреляции броуновского вращения Гц, рассчитанного из отношения 5ЛГ Т;/Тг при рН 4,0. (В) Значения тц при рН 6,2 для образца с динамическим равновесием димер-мономер. Темно-серым цветом показано значение Тц для димерного состояния. Светлосерым показано значение хц для мономера (если в спектре был отдельный пик) или равновесия димер-мономер (если пики в спектре были неразличимы).

Оценка массы супрамолекулярных комплексов мономер-мицелла и димер-мицелла,

9.18-10-3 (240 93 , т согласно эмпирическои зависимости гл =-—-ехр1 I N (где 1 - температура в

Кельвинах, N — число аминокислотных остатков в белке) из усредненного значения т[{ по спиральным участкам, дает величину около 25-30 кДа. Это соответствует мономе-ру/димеру АРР|гп1т, окруженному 60-70 молекулами детергента (что является типичным значением для мицеллы ДФХ).

Измерение остаточных дипольных констант

По значениям измеренных остаточных дипольных констант (ОДК) можно судить о взаимной ориентации различных доменов в белках и пептидах. Данный метод особенно актуален при изучении структуры пептида АРРцпШт. При анализе предварительных данных (химических сдвигов, релаксации, обмена с водой) было выявлено, что пептид при рН 4,0 состоит из двух структурированных участков - ПМ и ТМ а-спиралей. Однако имеется недостаток экспериментальных данных о петле, соединяющей эти два участка. В результате он приводит к неоднозначности взаимной ориентации ПМ и ТМ спиралей в пространстве относительно друг друга при расчете структуры. Измерение констант ОДК для амидных протонов позволяет снять данную неопределенность.

Исходя из предварительного анализа значений ОДК, можно утверждать, что ПМ (положительные значения ОДК) и ТМ (отрицательные значения ОДК) спирали по-разному ориентированы относительно общего тензора ориентации (рис. 8з). Точный ответ на вопрос о расположении ПМ и ТМ спиралей относительно друг друга был дан при расчете структуры с использованием значений ОДК в списке ограничений.

Рис. 10. Пространственная структура мономера APPjmtm при рН 4,0. (А) Набор из 20 ЯМР-структур APPjmtm, совмещенных по атомам основной цепи а-спирали Gly7""-Le.u72 . Показана основная цепь пептида. (Б) Набор из 20 ЯМР-структур. совмещенных по атомам основных iieneii а-спиралей Lys6S7—Aspm (ПМ спираль) и Gly00-Leu (ТМ спираль) по отдельности. Структуры приведены с разрывом в петлевом участке между остатками Gly6'"'-Ser6" . Показаны только тяжелые атомы. (В) Пространственная структура APPjmtm. Показаны ковалентные связи с участием тяжелых атомов (для а-спиралей зеленым цветом), а также амид-ных протонов (желтым). Красным выделены амидные группы остатков ТМ спирали с минимальными значениями вторичного химического сдвига. (Г) Представлено схематичное изображение мицеллы ДФХ со . встроенным мономером APPjmtm. ПМ и ТМ спирали выделены синим и красным соответственно. Под ПМ спиралью показаны места встраивания парамагнитных меток: 5- и 16-доксилстеариновой кислоты. Парамагнитные центры меток схематично показаны в виде звездочек. Под петлей между спиралями рядом с N-концом ТМ спирали схематично указан связывающий холестерин центр ТМ домена ПБА.

Расчет пространственной структуры пептида

Пространственная структура пептида была рассчитана методом симулированного отжига в пространстве торсионных углов в программе CYANA 3.0. Статистика расчета структуры приведена в таблице.

Качество расчета и структурная статистика

20 структур при рН 4,0 (мономер) 12 структур при рН 6,2 (димер)

Штрафная функция программы CYANA (А2) 0,38 ± 0,03 0,26 ±0,18

Попарное среднеквадратическое отклонение между структурами по атомам основной цепи (А)

регион 686-695 0,23 ± 0,09 0,52 ±0,16

а-спиральный регион 699-724 0,14 + 0,05 0,45 + 0,14

Димерный а-спиральный регион 699-724 - 0,80 ± 0,30

В результате расчета пространственной структуры установлено, что при рН 4.0 APPjmtm в мицеллах ДФХ состоит из двух а-спиралей - Lys6S7-Asp694 и GIy70(>-Leu72~ (рис. 10, код PDB: 2LLM), соединенных неструктурированным петлевым участком Val695-Lys699.

APP'mtGS0KLVFFAEDVG5NK™AI IGLMVGG^VIATVIVITLVMLKKK PUC. 11. ВтОриЧНЬШ XUMUUeCKUll

(■al 0 -0.2 -0.4

Б) 0.4

AX 0-2

(«al -0.2 -0.4

к—--.— I'-.«- Ill »1 liliiii

.1. 1 ill -■..iILiiL.ii Lilla

14 1 ■ i п

сдвиг сигналов протонов для мономерной конформации ЛРР/пИт при рН 4,0 (А) и димерной конформации при рН 6,2 (Б). На гистограмме указаны значения А8нн,, зависящие помимо прочего от длины водородной связи, в которой участвует амидный протон.

Оси ПМ и ТМ спиралей перпендикулярны друг другу (рис 10). Структура каждой а-спирали рассчитана с высокой точностью (таблица, рис. 1 Оа, 1 Об). Конформация основной цепи и боковых цепей точнее установлена для a-спирали Gly700-Leu723. Периодичность (i,i+ 4) вторичного химического сдвига сигналов протонов 'HN (рис. 11) указывает на периодичное изменение длин водородных связей HN—Oc вдоль ТМ спирали. Амидные группы остатков Leu705, Gly709, Ala713 и Val71', расположенные на одной стороне ТМ спирали (рис. 10в). образуют более короткие водородные связи HN - Oc, чем остатки с противоположной стороны спирали. Таким образом, у ТМ спирали в районе спаренных остатков Gly708-Gly709 имеется небольшая вогнутость со слабополярной поверхностью.

Значительная разница (~4 не) в значениях xR у остатков ПМ и ТМ спиралей частично объясняется топологией APPjmtm с перпендикулярным расположением a-спиралей в мицелле друг относительно друга. Помимо этого возможно вращение APPjmtm внутри мицеллы, а также повышенная латеральная подвижность ПМ спирали (по сравнению с ТМ сегментом) за счет неструктурированной соединительной петли Val695—Lys699.

Структура каждой субъединицы в составе димера очень похожа на структуру отдельного мономера. При рН 6,2 пептид содержит лишь один участок с ярко выраженной вторичной структурой — ТМ a-спираль Gly700-Leu723 длиной ~38 Â. обрамленную по концам положительно заряженными остатками Lys699 и Lys724. Также как и для мономера при рН 4,0 в районе остатков Gly708-Gly709 находится изгиб, который разделяет ТМ спираль на два региона, находящихся под углом 17±7° друг относительно друга. Вогнутость на N-конце ТМ спирали сформирована слабополярными остатками Gly700, Gly704, Gly70S и Gly709. Это хорошо видно по периодичности значений вторичного химического сдвига AôHn остатков Ile702, Met706, Val710, Thr714 (рис. 116). Места изгиба ТМ спирали в мономере и димере отличаются друг от друга сдвигом на один аминокислотный остаток спирали или поворотом на -90°.

Примембранный участок при рН 6,2 не формирует жесткую вторичную структуру. При анализе всех ЯМР данных в совокупности (контакты ЯЭО, вторичный химический сдвиг, Тя, КССВ "Vнына, ограничения на углы ф и \(/, скорость обмена амидных протонов с водой) можно предположить, что участок Ьу8687-Авр694 находится в динамическом равновесии между спиральной формой и конформацией «неупорядоченного клубка».

Контакты между мономерами и структура димера

1.0-

'Н

мл.

1.5 2.0 2.5

Рис. 12. Контакты между двумя субъединицами APPjmtm в составе димера. Слева: пример двумерных срезов 1С-фильтрованных/3С-разделенных спектров ЯЭО APPjmtm с сигналами между спиралями, которые использовались при расчете структуры димера. Справа: представление всех однозначно идентифицированных контактов ЯЭО между мономерами. На рисунке показан только ТМ регион пептида, черным цветом указана основная цепь, зеленым/фиолетовым — тяжелые атомы боковых цепей. Красными пунктирными линиями показаны обнаруженные контакты между спиралями.

Структура димера APPjmtm была рассчитана на основании контактов между спиралями, обнаруженных в фильтрованных по ядру ВС спектрах ЯЭО (рис. 12). В мицеллярном

700 723ч

окружении ТМ спирали APPjmtm (Gly -Leu ) ассоциируют с образованием левозакру-ченного параллельного димера по длинному гептадному мотиву 1702ХзМ706Х2С709ХзА713Х21716Хз1720Х21723. Расстояние между осями спиралей равно 8,3±0,5 А. Площадь контактирующих поверхностей составляет 630±60 А2. Угол в между (_-концевыми участками димера (Gly709-Lys724), где структура определена точнее, оказался равным 26±4°, в то время как в для N-концевого региона (Lys6"-Gly708) равен 60±11°. По всей длине стабилизация структуры левозакрученного димера происходит между длинными боковыми цепями лейцинов, изолейцинов, метионинов и валинов. Минимальное расстояние между спиралями наблюдается в районе остатков 709GxxxA713 (так называемый GG4 мотив) за счет малых боковых цепей и. следовательно, отсутствия затрудняющих сближению пространственных факторов.

Рис. 13. Пространственная структура димера APPjmtm и свойства поверхности интерфейса димеризации . (А) 12 структур пептида совмещены по атомам основной цепи ТМ доменов (Gly "-Leu723). Также показано альтернативное совмещение для ПМ спирали Gln686-Val69S. Приведены только тяжелые атомы. Основные цепи показаны черным цветом, а боковые - голубым и фиолетовым для каждой субъединицы димера. (Б) Схематическое представление структуры димера с поворотом на 90°. Желтым и зеленым цилиндрами иллюстрирована ТМ спираль с изломом в районе остатков Gly7"8-Gly709. Голубыми цилиндрами показана ПМ область, находящаяся в переходном состоянии между спиралью и неупорядоченным клубком. (В) Показана карта гидро-фобности. Возвышенности, которые соответствуют большим значениям молекулярного гидрофобного потенциала, показаны контурами. Участок взаимодействия спиралей при димеризации показан фиолетовыми точками. Остатки, образующие классический GG4 мотив димеризации G7mX}G7 4GXiG70l< (не используется), показаны зеленым цветом, а С709ХзА7 мотив (определен в работе) показан красным цветом. Остатки, мутации которых ведут к наследственным формам болезни Альцгеймера, обведены желтым цветом. Справа желтым и зеленым цветом показаны гидрофобные и гидрофильные области на поверхности ТМ спирали, соответственно.

Свойства поверхности димера и интерфейсы димеризации

Для структуры димера APPjmtm был проведен анализ гидрофобных свойств поверхности ТМ спирали с использованием теории молекулярного гидрофобного потенциала (Efremov et al, 1995). Этот эмпирический потенциал описывает свободную энергию переноса участка поверхности боковой цепи аминокислоты в составе а-спирали из гидрофобной среды в гидрофильную.

Карта гидрофобности угол поворота (в градусах)

Интерфейс димера изображен на карте гидрофобности поверхности ТМ спирали на рис. 13. В стабилизации димера участвуют гидрофобные области ТМ сегментов. Это согласуется с рядом гипотез о принципах упаковки ТМ спиралей, описанных в литературе (Gurezka et al, 1999). Альтернативный сайт димеризации (G700xxxG704GxxxG7üs мотив), который был предложен другими исследовательскими группами (Münter et al, 2007), формируется наиболее гидрофильной областью ТМ сегментов (рис. 13, код PDB: 2LOH).

Анализ карты гидрофобности показывает, что на поверхности ТМ спиралей есть несколько областей, по которым может происходить взаимодействие. Это дает возможность переключения с одного мотива димеризации на другой в результате, например, изменения условий окружающей среды белка (липидного состава мембраны. рН и других факторов).

Положение пептида в мицелле и взаимодействие с аналогом холестерина

Для определения топологии a-спиралей APPjmtm в мицелле ДФХ при рН 4,0 было проанализировано уширение сигналов протонов амидных групп пептида, вызванное их пространственной близостью к парамагнитным спиновым меткам 5- и 16-ДСК (5- и 16-доксилстеариновые кислоты), преимущественно распределяющихся вблизи поверхности и центра мицеллы, соответственно. На основании картины изменения интенсивности кросс-пиков в спектре 'H/15N-HSQC при добавлении спиновых меток (рис. 14), а также данных о замедленном обмене протонов амидных групп на дейтерий растворителя (рис. 8е) сделан вывод о том. что ПМ a-спираль Lys687-Asp6l)4 находится на поверхности мицеллы в области гидратированных полярных групп ДФХ, а ТМ a-спираль Gly700-Leu7:;3 пронизывает гидрофобную часть мицеллы.

APPi™gSQ1;LvTFAEDVGSMK™XIIGLMVGG7VVIATVIVITL''vMLKi;K PllC. 14. ДООШЛеНЧЧ К ОбрПЗЦу СПЫНОВЫХ

меток и холестерилсущинапш. (А)

Эффект от добавления к образцу спиновых меток 5- и 16-ДСК. Показано падение интенсивности относительно кон-llllllllllll llllllll рольного спектра сигналов амидных

lllllllllllHIII.I. ■■■ ■IIIIIHIIII групп APPjmtm в спектрах 'H/,3N-HSQC

после добавления 5- и 16-ДСК (в соот-

а)

5-ДСК W. 0.5

16-ДСК 1Л.0.5

..................................mil

б)

рш

0.05 Холест.

.1 li «!■

h. ai ношении одна спиновая метка на мицел

iL.ll iii»

П.1_-М|«.1.Ш ЛУ)- (Б) Изменение обобщенных химических сдвигов амидных протонов при рН 4.0 после добавления холестерилсукци-ната.

Для мономерной конформации при рН 4,0 было изучено связывание АРР]тНт1 с аналогом холестерина - холестерилсукцинатом. Из картины изменения химических сдвигов можно предположить, что после встраивания аналога холестерина в мицеллу ДФХ проис-

ходит его специфическое взаимодействие с исследуемым пептидом. Наиболее значимые изменения обобщенного химического сдвига AShn (вычисляемого по формуле

Д<У//Л. ' где &S¡h и Añ/jj.v — изменения протонного и азотного химиче-

ского сдвига, соответственно), при добавлении вещества к образцу наблюдалось для остатков Gly695, Ser696, Gly700, lie701, Не703 и Thr713 (рис. 146). Это указывает, что место встраивания холестерилсукцината находится в области подвижной петли Val695-Lys699 между спиралями и N-концевой части ТМ региона (рис. 1 Ог).

Стоит отметить, что существует и альтернативное объяснение изменения химических сдвигов амидных протонов с добавлением холестерина к образцу: вариация размера или других физических свойств мицеллы. Это может приводить к локальным изменением структуры APPjmtm (например, изгиба а-спирали).

Изменение внешних условий и окружения ПБА в клеточной мембране может влиять на конформацию петлевого участка между спиралями. Это должно привести к вариации взаимной ориентации ИМ и ТМ спиралей с возможным влиянием на связывание холестерина. Поэтому установление пространственной структуры ТМ домена ПБА со связывающим холестерин ПМ участком в мембраноподобной среде методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии стало весомым шагом в раскрытии молекулярного механизма альтернативного расщепления ПБА, ассоциированного с патогенезом болезни Альцгеймера.

Выводы

1) Разработана система эффективной экспрессии синтетического гена ТМ домена ПБА 686-726 в клетках Е. coli на богатой среде и минимальной среде, содержащей изотопы ,5N и 13С.

2) Разработан протокол очистки рекомбинантного ТМ домена ПБА 686-726.

3) Методом гетероядерной спектроскопии ЯМР определена пространственная структура трансмембранного домена ПБА 686-726 с его примембранным участком в имитирующей мембрану среде — мицеллах ДФХ. Структура получена для мономерной и димерной формы пептида. Для димерной формы определен мотив димеризации -гептадный мотив I702X3M706X2G709X3A713X2I716X3I720X2I723.

4) Определены энергетические параметры перехода мономер-димер в мицеллах ДФХ.

5) Полученная структура позволяет анализировать влияние патогенных наследственных мутаций на развитие заболевания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТИЦИН

Статьи

1. Bocharova O.V., Nadezhdin K.D., Bocharov E.V., Arseniev A.S. Expression and purification of a recombinant transmembrane domain amyloid precursor protein associated with Alzheimer's disease Bioorg. Khim. 2010 Jan-Feb; 36( 1 ): 105-11.

2. К.Д. Надеждпн, O.B. Бочарова, Э.В. Бочаров, A.C. Арсеньев. Пространственная структура и динамика трансмембранного домена белка-предшественника р-амилоида. Acta Naturae, 2011, Том 3 № 1 (8): 74-81

3. Nadezhdin KD, Bocharova О V, Bocharov EV, Arseniev AS. Dimeric structure of transmembrane domain of amyloid precursor protein in micellar environment. FEBS Lett. 2012 Jun 12;586(12): 1687-92.

1. Nadezhdin Kirill. Bocharova Olga, Bocharov Eduard, Arseniev Alexanger "Structural investigations of dimeric transmembrane domain of amyloid precursor protein"EUROMAR 2009, Gottenburg, Sweden, 2009, Сборник докладов, стр.44

2. Надеждпн К.Д.. Бочарова О.В., Бочаров Э.В., Арсеньев А.С. «Структурные исследования ди-мера трансмембранного домена белка-предшественника амилоида», Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова, Москва-Пушино, 2009, Сборник тезисов, стр. 298

3. K.D. Nadezhdin. O.V. Bocharova, E.V. Bocharov and A.S. Arseniev "Structural and dynamic studies of transmembrane domain of amyloid precursor protein" 36lh FEBS CONGRESS, Torino, Italy, 2011, Сборник докладов, стр. 121

4. Kirill D. Nadezhdin. Olga V. Bocharova, Eduard V. Bocharov, Alexander A. Arseniev "Structural and Dynamics Studies of Amyloid Precursor Protein's Transmembrane Domain" EUROMAR 2011 Magnetic Resonance Conference, Frankfurt am Main, Germany, 2011, Сборник докладов, стр. 186

5. Kirill Nadezhdin. Eduard Bocharov, Olga Bocharova, Alexander Arseniev "Structure of transmembrane domain and dimerization mechanism of amyloid precursor protein", Biophysical Society 56lh Annual Meeting, Сан Диего, Калифорния, США, 25-29 февраля, 2012, Сборник докладов, стр. 88

6. О. Bocharova, К. Nadezhdin, Е. Bocharov, A. Arseniev "Molecular Neurobiology Today and Tomorrow" Российско-Германский симпозиум, Москва, 25-29 апреля, 2012

Тезисы докладов

Список сокращений

ПБА — предшественник бета-амилоида ТМ — трансмембранный (регион) ПМ — примембранный (регион) ЯМР - ядерный магнитный резонанс ТЯХ - тиоредоксин

ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера (КОЕ эффект)

ПААГ — полиакриламидный гель МХАХ - металлохелатная аффинная хроматография

ОДК - остаточная дипольная константа оф-ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

P/D — молярное соотношения пептид/детергент кДа — килодальтон ДФХ - додецилфосфатидилхолин ЛМФХ - лизомиристоилфосфатидилхолин ЛМФГ -лизомиристоилфосфатидилглицерин ГФХ - гексаноилфосфатидилхолин ДСН - додецилсульфат натрия, ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин ДГФХ — дигексаноилфосфатидилхолин PDB - protein data bank

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Надеждин, Кирилл Дмитриевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Белок-предшественник бета-амилоида.

111 Пути протеолиза ПБА

112 Структура ПБА

113 Биологическая роль ПБА

1.2. Димеризация ПБА.

12 1 Димеризация полноразмерного ПБА и его внеклеточных доменов

12 2 Димеризация трансмембранного домена ПБА

123 Изучение димеризации ПБА флюоресцентными методами

12 4 Изучение димеризации ПБА при помощи мутагенеза

12 5 Изучение димеризации ТМ домена при помощи ТОХ-систем

12 6 Иссчедование димеризации ПБА методом ЯМР

12 7 Исследования димеризации ТМ домена in silico

Выводы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2 11 Штаммы и плазмиды

2 12 Среды для выращивания Е coli

2 13 Ферменты

2 14 Олигонуклеотиды и секвенирование генов

2 15 Реактивы

2.2. Методы.

2 2 1 Сборка экспрессионного вектора pGEMEX-1 /(TRX-APPjmtm)

2 2 2 Денатурирующий эчектрофорез белков в ДСН-ПААГ

2 2 3 Подбор условий индукции ИПТГ

2 2 4 Культивирование рекомбинантного штамма Е coli

2 2 5 Выделение гибридного белка Trx-APPjmtm из клеточной кучьтуры

2 2 6 Получение трансмембранного пептида

2 2 7 Масс-спектрометрия

2 2 8 Измерение pH образца

2 2 9 Приготовление образцов ЯМР

2 2 10 Спектроскопия ЯМР

2 2 11 Отнесение сигналов

2 2 12 Опредечение значений рК Glu693 и Asp694 47 2 2 13 Опредечение кинетических параметров перехода мономер-димер в мицеллярном окружении

2 2 14 Иссчедование ЯМР релаксации

2 2 15 Почучение верхних ограничений на расстояния

2 2 16 Получение ограничений на двугранные углы ip и ц/ основной цепи

2 2 17 Измерение остаточных дипольных констант

2 2 18 Расчет пространственной структуры

2 2 19 Опредечение положения пептида в мицечле

2 2 20 Взаимодействие APPjmtm с аналогом холестерина

2 2 21 Расчет гидрофобных свойств поверхности пептида и конструирование карты гидрофобности поверхности ТМспирачи

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3 1 Получение рекомбинантного трансмембранного домена АРР686—726 (APPjmtm) 60 3 2 Оптимизация усчовий экспрессии 61 3 3 Подбор концентрации тромбина 63 J 4 Очистка APPjmtm 63 3 5 Проверка идентичности APPjmtm методом масс-спектрометрии 68 3 6 Отнесение сигначов в спектрах ЯМР 68 3 7 Опредечение значения рК карбоксильных групп боковых цепей Glu693 и Asp694 72 3 8 Константа димеризации APPjmtm в мицеллах ДФХ 73 3 9 Элементы вторичной структуры

3 10 Динамические характеристики АРР]тШ

3 11 Опредеяение водородных связей

3 12 Измерение остаточных диполъных констант

3 13 Расчет пространственной структуры пептида

3 14 Межмономерные контакты и расчет структуры дичера

3 14 Свойства поверхности димера и интерфейсы димеризации

3 15 Взаимодействие комплекса пептид/мицелла с аналогом холестерина

3 16 Определение положение пептида в мицелле

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида"

Болезнь Альцгеймера - самый распространенный вид нейродегенера-тивного заболевания в мире [1]. С физиологической точки зрения заболевание характеризуется накоплением амилоидных бляшек и нейрофибрилляр-ных клубков в нервных тканях мозга. На молекулярном уровне важнейшую роль в развитии болезни играет белок-предшественник бета-амилоида (ПБА). Процессинг этого белка в организме человека различными ферментативными системами ведет к образованию основного маркера болезни Альцгеймера -бета-амилоида. ПБА является мембранным белком длиной 695-770 а.о., поэтому современные попытки его структурных исследований испытывают ряд объективных трудностей. ПБА и его производные димеризуются в мембране клеток и эндосом. Более половины мутаций, являющихся основным фактором риска раннего развития заболевания, приходится на его трансмембранный (ТМ) домен. На данный момент нет четкого понимания механизма влияния патогенных мутаций на прогрессирование болезни. Однако существует мнение, что на протеолиз белка могут влиять как мутации, так и липидный состав мембраны.

Целью данной диссертационной работы являлось изучение структуры, динамических свойств и белок-белковых взаимодействий в составе димер-ных комплексов ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида в мембране и/или имитирующей мембранное окружение среде. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

2) разработка эффективного протокола очистки пептида;

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Надеждин, Кирилл Дмитриевич

Выводы

1) Разработана система эффективной экспрессии синтетического гена ТМ домена ПБА 686-726 в клетках Е. coli на богатой среде и минимальной среде, содержащей изотопы 15N и 13С.

2) Разработан протокол очистки рекомбинантного ТМ домена ПБА 686726.

3) Методом гетероядерной спектроскопии ЯМР определена пространственная структура трансмембранного домена ПБА 686-726 с его при-мембранным участком в имитирующей мембрану среде - мицеллах ДФХ. Структура получена для мономерной и димерной формы пептида. Для димерной формы определен мотив димеризации - гептадный

-м0тив 1702ХзМ706Х2О709ХзА713Х21716Хз1720Х21723:-----

4) Определены энергетические параметры перехода мономер-димер в мицеллах ДФХ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Надеждин, Кирилл Дмитриевич, Москва

1. R.J. O'Brien, Р.С. Wong, Amyloid precursor protein processing and Alzheimer's disease, Annu. Rev. Neurosci. 34 (2011) 185-204.

2. S.K. Sonkusare, C.L. Kaul, P. Ramarao, Dementia of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders—memantine, a new hope, Pharmacol. Res. 51 (2005) 1-17.

3. А. Григоренко, Молекулярные основы болезни Альгеймера, Молекулярная медицина. 41 (2007) 331-345.

4. J.A. Duce, A. Tsatsanis, М.А. Cater, S.A. James, Е. Robb, К. Wikhe, и др., Iron-Export Ferroxidase Activity of (3-Amyloid Precursor Protein Is Inhibited-by line in-Alzheimer,s^Diseasereellrl-42 (2010) 857=867.--

5. С. Haass, D.J. Selkoe, Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (2007) 101-112.

6. H. Steiner, R. Fluhrer, C. Haass, Intramembrane proteolysis by gamma-secretase, J. Biol. Chem. 283 (2008) 29627-29631.

7. X. Xu, Gamma-secretase catalyzes sequential cleavages of the AbetaPP transmembrane domain, J. Alzheimers Dis. 16 (2009) 211-224.

8. S.J. Soscia, J.E. Kirby, K.J. Washicosky, S.M. Tucker, M. Ingelsson, B. Hyman, и др., The Alzheimer's disease-associated amyloid beta-protein is an antimicrobial peptide, PLoS ONE. 5 (2010) e9505.

9. A.P. Grigorenko, E.I. Rogaev, Molecular basics of Alzheimer's disease], Mol. Biol. (Mosk.). 41 (2007) 331-345.

10. A. Rauk, Why is the amyloid beta peptide of Alzheimer's disease neurotoxic?, Dalton Trans. (2008) 1273-1282.

11. D.J. Selkoe, Folding proteins in fatal ways, Nature. 426 (2003) 900-904.

12. K.A. Conway, E.W. Baxter, K.M. Felsenstein, A.B. Reitz, Emerging beta-amyloid therapies for the treatment of Alzheimer's disease, Curr. Pharm. Des. 9 (2003) 427^47.

13. D. Schenk, G.S. Basi, M.N. Pangalos, Treatment strategies targeting amyloid (3-protein, Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2012) a006387.

14. K.L. Puig, C.K. Combs, Expression and function of APP and its metabolites outside the central nervous system, Exp. Gerontol. (2012).

15. R. Postina, Activation of a-secretase cleavage, J. Neurochem. 120 Suppl 1 (2012) 46-54.

16. R. Vassar, The beta-secretase, BACE: a prime drug target for Alzheimer's disease, J. Mol. Neurosci. 17 (2001) 157-170.

17. S. Shah, S.-F. Lee, K. Tabuchi, Y.-H. Hao, C. Yu, Q. LaPlant, h ap., Nicas-trin functions as a gamma-secretase-substrate receptor, Cell. 122 (2005) 435-447. —--- —

18. A. Haapasalo, D.M. Kovacs, The many substrates of presenilin/y-secretase, J. Alzheimers Dis. 25 (2011) 3-28.

19. M.-T. Stockhausen, K. Kristoffersen, H.S. Poulsen, Notch signaling and brain tumors, Adv. Exp. Med. Biol. 727 (2012) 289-304.

20. S.N. Ozudogru, C.F. Lippa, Disease modifying drugs targeting |3-amyloid, Am J Alzheimers Dis Other Demen. 27 (2012) 296-300.

21. J.D. Buxbaum, N.S.M. Geoghagen, L.T. Friedhoff, Cholesterol depletion with physiological concentrations of a statin decreases the formation of the Alzheimer amyloid Abeta peptide, J. Alzheimers Dis. 3 (2001) 221-229.

22. M. Maulik, D. Westaway, J.H. Jhamandas, S. Kar, Role of Cholesterol in APP Metabolism and Its Significance in Alzheimer's Disease Pathogenesis, Mol. Neurobiol. (2012).

23. N. Kitaguchi, Y. Takahashi, Y. Tokushima, S. Shiojiri, H. Ito, Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity, Nature. 331 (1988) 530-532.

24. J. Rossjohn, R. Cappai, S.C. Feil, A. Henry, W.J. McKinstry, D. Galatis, h

25. Crystal structure of the N-terminal, growth factor-like domain of Alzheimer amyloid precursor protein, Nat. Struct. Biol. 6 (1999) 327-331.

26. Y. Wang, Y. Ha, The X-Ray Structure of an Antiparallel Dimer of the Human Amyloid Precursor Protein E2 Domain, Molecular Cell. 15 (2004) 343353.

27. M. Gralle, S.T. Ferreira, Structure and functions of the human amyloid precursor protein: the whole is more than the sum of its parts, Prog. Neurobiol. 82 (2007) 11-32.

28. L. -M. MuTTterrPr-Voigt, A. HarmeierrDrKadenri^ErGottschalkr& Weise^ h AP-, GxxxG motifs within the amyloid precursor protein transmembrane sequence are critical for the etiology of Abeta42, EMBO J. 26 (2007) 1702-1712.

29. P.M. Gorman, S. Kim, M. Guo, R.A. Melnyk, J. McLaurin, P.E. Fraser, h .zip., Dimerization of the transmembrane domain of amyloid precursor proteins and familial Alzheimer's disease mutants, BMC Neurosci. 9 (2008) 17.

30. M. Marenchino, P.T.F. Williamson, S. Murri, G. Zandomeneghi, H. Wunderli-Allenspach, B.H. Meier, h ^p., Dynamics and Cleavability at the alpha-cleavage site of APP(684-726) in different lipid environments, Biophys. J. 95(2008)1460-1473.

31. P.J. Barrett, Y. Song, W.D. Van Horn, E.J. Hustedt, J.M. Schafer, A. Hadziselimovic, h £p., The amyloid precursor protein has a flexible transmembrane domain and binds cholesterol, Science. 336 (2012) 1168-1171.

32. N. Miyashita, J.E. Straub, D. Thirumalai, Structures of beta-amyloid peptide 1-40, 1-42, and 1-55-the 672-726 fragment of APP-in a membrane environment with implications for interactions with gamma-secretase, J. Am. Chem. Soc. 131(2009)17843-17852.

33. J.C. Wiley, M. Hudson, K.C. Kanning, L.C. Schecterson, M. Bothwell, Familial Alzheimer's disease mutations inhibit gamma-secretase-mediated liberation of beta-amyloid precursor protein carboxy-terminal fragment, J. Neuro-chem. 94 (2005) 1189-1201.

34. Y. Le, W. Gong, H.L. Tiffany, A. Tumanov, S. Nedospasov, W. Shen, h Ap., Amyloid (beta)42 activates a G-protein-coupled chemoattractant receptor, FPR-like-1, J. Neurosci. 21 (2001) RC123.

35. R.P. Koldamova, I.M. Lefterov, M.I. Lefterova, J.S. Lazo, Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A beta aggregation and toxicity, Biochemistry. 40 (2001) 3553-3560.

36. R.E. Tanzi, R.D. Moir, S.L. Wagner, Clearance of Alzheimer's Abeta peptide: the many roads to perdition, Neuron. 43 (2004) 605-608.

37. D. Paris, T. Town, T.A. Parker, J. Tan, J. Humphrey, F. Crawford, h ¿ip., Inhibition of Alzheimer's beta-amyloid induced vasoactivity and proinflammatory response in microglia by a cGMP-dependent mechanism, Exp. Neurol. 157 (1999)211-221.

38. M.L. Giuffrida, F. Caraci, B. Pignataro, S. Cataldo, P. De Bona, V. Bruno, h ,ap., Beta-amyloid monomers are neuroprotective, J. Neurosci. 29 (2009) 10582-10587.

39. Q. Liu, C.V. Zerbinatti, J. Zhang, H.-S. Hoe, B. Wang, S.L. Cole, h ap.,tabolism through lipoprotein receptor LRP1, Neuron. 56 (2007) 66-78.

40. X. Cao, T.C. Sudhof, A transcriptionally correction of transcriptively] active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60, Science. 293 (2001) 115-120.

41. M.O.W. Grimm, H.S. Grimm, A.J. Patzold, E.G. Zinser, R. Halonen, M. Duering, h ap., Regulation of cholesterol and sphingomyelin metabolism by amyloid-beta and presenilin, Nat. Cell Biol. 7 (2005) 1118-1123.

42. T. Rajkumar, W.J. Gullick, The type I growth factor receptors in human breast cancer, Breast Cancer Res. Treat. 29 (1994) 3-9.

43. S. Isbert, K. Wagner, S. Eggert, A. Schweitzer, G. Multhaup, S. Weggen, h Zip., APP dimer formation is initiated in the endoplasmic reticulum and differs between APP isoforms, Cell. Mol. Life Sci. 69 (2011) 1353-1375.

44. D. Beher, L. Hesse, C.L. Masters, G. Multhaup, Regulation of amyloid protein precursor (APP) binding to collagen and mapping of the binding sites on APP and collagen type I, J. Biol. Chem. 271 (1996) 1613-1620.

45. P. Soba, S. Eggert, K. Wagner, H. Zentgraf, K. Siehl, S. Kreger, h pp., Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion, The EMBO Journal. 24 (2005) 3624-3634.

46. S. Scheuermann, B. Hambsch, L. Hesse, J. Stumm, C. Schmidt, D. Beher, h Zip., Homodimerization of amyloid precursor protein and its implication in the amyloidogenic pathway of Alzheimer's disease, J. Biol. Chem. 276 (2001)3.3923-33929.-------

47. T.R. Hynes, M. Randal, L.A. Kennedy, C. Eigenbrot, A.A. Kossiakoff, X-ray crystal structure of the protease inhibitor domain of Alzheimer's amyloid beta-protein precursor, Biochemistry. 29 (1990) 10018-10022.

48. I. Dulubova, A. Ho, I. Huryeva, T.C. Sudhof, J. Rizo, Three-Dimensional Structure of an Independently Folded Extracellular Domain of Human Amy-loid-(3 Precursor Protein f ' Biochemistry. 43 (2004) 9583-9588.

49. A. Pietraszewska-Bogiel, T.W.J. Gadella, FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology, Journal of Microscopy. 241 (2011) 111118.

50. H. Wang, L. Barreyro, D. Provasi, I. Djemil, C. Torres-Arancivia, M. Filizola, h ,ap., Molecular determinants and thermodynamics of the amyloid precursor protein transmembrane domain implicated in Alzheimer's disease, J. Mol. Biol. 408 (2011) 879-895.

51. W.P. Russ, D.M. Engelman, TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (1999) 863-868.

52. R. Ehehalt, P. Keller, C. Haass, C. Thiele, K. Simons, Amyloidogenic processing of the Alzheimer beta-amyloid precursor protein depends on lipid rafts, J. Cell Biol. 160 (2003) 113-123.

53. J. Zhang, T. Lazaridis, Calculating the free energy of association of transmembrane helices, Biophys. J. 91 (2006) 1710-1723.

54. J. Zhang, T. Lazaridis, Transmembrane helix association affinity can be modulated by flanking and noninterfacial residues, Biophys. J. 96 (2009) 44184427.

55. N. Miyashita, J.E. Straub, D. Thirumalai, Y. Sugita, Transmembrane structures of amyloid precursor protein dimer predicted by replica-exchange molecular dynamics simulations, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 3438-3439.

56. T. Luhrs, C. Ritter, M. Adrian, D. Riek-Loher, B. Bohrmann, H. Dobeli, и др., 3D structure of Alzheimer's amyloid-beta(l-42) fibrils, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.Arl02 (-2005)-l-7342H-7-34-7:-------

57. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сембрук, Молекулярное клонирование, Мир, 1984.

58. U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature. 227 (1970) 680-685.

59. H. Schagger, G. von Jagow, Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa, Anal. Biochem. 166 (1987) 368-379.

60. A. Krezel, W. Bal, A formula for correlating pKa values determined in D20 and H20, J. Inorg. Biochem. 98 (2004) 161-166.

61. J. Cavanagh, Protein NMR spectroscopy□: principles and practice, Academic Press, San Diego; London u.a.], 2007.

62. A.L. Davis, J. Keeler, E.D. Laue, D. Moskau, Experiments for recording pure-absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients, Journal of Magnetic Resonance (1969). 98 (1992) 207-216.

63. H. Kuboniwa, S. Grzesiek, F. Delaglio, A. Bax, Measurement of HN-H alpha J couplings in calcium-free calmodulin using new 2D and 3D water-flipback methods, J. Biomol. NMR. 4 (1994) 871-878.

64. A.C. Stuart, K.A. Borzilleri, J.M. Withka, A.G. Palmer, Compensating for Variations in 1 H- 13 C Scalar Coupling Constants in Isotope-Filtered NMR Experiments, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 5346-5347.

65. M. Ottiger, F. Delaglio, A. Bax, Measurement of J and dipolar couplings from simplified two-dimensional NMR spectra, J. Magn. Reson. 131 (1998) 373-378.

66. D. Marion, M. Ikura, R. Tschudin, A. Bax, Rapid recording of 2D NMR spectra without phase cycling. Application to the study of hydrogen exchange in proteins, Journal of Magnetic Resonance (1969). 85 (1989) 393-399.

67. L. Kay, P. Keifer, T. Saarinen, Pure absorption gradient enhanced heteronuclear single quantum correlation spectroscopy with improved sensitivity, Journal of the American Chemical Society. 114 (1992) 10663-10665.

68. M. Piotto, V. Saudek, V. Sklenar, Gradient-tailored excitation for singlequantum NMR spectroscopy of aqueous solutions, J. Biomol. NMR. 2 (1992) 661-665.

69. S. Hiller, G. Wider, T. Etezady-Esfarjani, R. Horst, K. Wuthrich, Managing the solvent water polarization to obtain improved NMR spectra of large molecular structures, J. Biomol. NMR. 32 (2005) 61-70.

70. D.B. Fulton, R. Hrabal, F. Ni, Gradient-enhanced TOCSY experiments with improved sensitivity and solvent suppression, Journal of Biomolecular NMR. 8 (1996).

71. R.L.J. Keller, K. Wuethrich, Optimizing the process of nuclear magnetic resonance spectrum analysis and computer aided resonance assignment, ETH, 6. jx.

72. K.G. Fleming, Standardizing the free energy change of transmembrane helix-helix interactions, J. Mol. Biol. 323 (2002) 563-571.

73. L.E. Fisher, D.M. Engelman, J.N. Sturgis, Effect of detergents on the association of the glycophorin a transmembrane helix, Biophys. J. 85 (2003) 3097-3-1:05. -----" ~

74. D. Josse, C. Ebel, D. Stroebel, A. Fontaine, F. Borges, A. Echalier, h ^p., Oligomeric states of the detergent-solubilized human serum paraoxonase (PON1), J. Biol. Chem. 277 (2002) 33386-33397.

75. K.S. Mineev, N.F. Khabibullina, E.N. Lyukmanova, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov, A.S. Arseniev, Spatial structure and dimer—monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles, Biochim. Biophys. Acta. 1808 (2011) 2081-2088.

76. T.K. Hitchens, G.S. Rule, Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy, Springer, New York], 2006.

77. J. Lauterwein, C. Bosch, L.R. Brown, K. Wuthrich, Physicochemical studies of the protein-lipid interactions in melittin-containing micelles, Biochim. Biophys. Acta. 556 (1979) 244-264.

78. L.E. Kay, D.A. Torchia, A. Bax, Backbone dynamics of proteins as studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease, Biochemistry. 28 (1989) 8972-8979.

79. V.A. Daragan, K.H. Mayo, Chemlnform Abstract: Motional Model Analyses of Protein and Peptide Dynamics Using 13C and 15N NMR Relaxation, Chemlnform. 28 (2010) no-no.

80. Y. Shen, F. Delaglio, G. Cornilescu, A. Bax, TALOS+: a hybrid method for predicting protein backbone torsion angles from NMR chemical shifts, J. Biomol. NMR. 44 (2009) 213-223.

81. P. Guntert, C. Mumenthaler, K. Wuthrich, Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA, J. Mol. Biol. 273 (1997)283-298.

82. P. Guntert, Automated NMR protein structure calculation, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 43 (2003) 105-125.

83. M.L. Connolly, Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids, Science. 221 (1983) 709-713.94.—J^L. Fauchere, PrQuaTendon~brKaettererrEstimating and representingTiy--drophobicity potential, Journal of Molecular Graphics. 6 (1988) 203-206.

84. A.K. Ghose, V.N. Viswanadhan, J.J. Wendoloski, Prediction of Hydrophobic (Lipophilic) Properties of Small Organic Molecules Using Fragmentai Methods: An Analysis of ALOGP and CLOGP Methods, The Journal of Physical Chemistry A. 102 (1998) 3762-3772.

85. R.G. Efremov, G. Vergoten, Hydrophobic Nature of Membrane-Spanning .alpha.-Helical Peptides as Revealed by Monte Carlo Simulations and Molecular Hydrophobicity Potential Analysis, J. Phys. Chem. 99 (1995) 10658-10666.

86. T. Yasukawa, C. Kanei-Ishii, T. Maekawa, J. Fujimoto, T. Yamamoto, S. Ishii, Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin, J. Biol. Chem. 270 (1995) 25328-25331.

87. D.S. Wishart, B.D. Sykes, F.M. Richards, Relationship between nuclear magnetic resonance chemical shift and protein secondary structure, J. Mol. Biol. 222 (1991)311-333.

88. T. Lazaridis, B. Mallik, Y. Chen, Implicit solvent simulations of DPC micelle formation, J Phys Chem B. 109 (2005) 15098-15106.

89. G. Wagner, A. Pardi, K. Wuethrich, Hydrogen bond length and proton NMR chemical shifts in proteins, J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) 5948-5949.

90. D. Langosch, J. Heringa, Interaction of transmembrane helices by a knobs-into-holes packing characteristic of soluble coiled coils, Proteins. 31 (1998) 150-159.

91. K.R. Mackenzie, Folding and stability of alpha-helical integral membrane proteins, Chem. Rev. 106 (2006) 1931-1977.

92. T.V. Pyrkov, A.O. Chugunov, N.A. Krylov, D.E. Nolde, R.G. Efremov,of biomolecular complexes, Bioinformatics. 25 (2009) 1201-1202.

93. R. Gurezka, R. Laage, B. Brosig, D. Langosch, A heptad motif of leucine residues found in membrane proteins can drive self-assembly of artificial transmembrane segments, J. Biol. Chem. 274 (1999) 9265-9270.

94. A. Botev, L.-M. Munter, R. Wenzel, L. Richter, V. Althoff, J. Ismer, h rp., The amyloid precursor protein C-terminal fragment CI00 occurs in monomeric and dimeric stable conformations and binds y-secretase modulators, Biochemistry. 50 (2011) 828-835.

95. E. Kojro, G. Gimpl, S. Lammich, W. Marz, F. Fahrenholz, Low cholesterol stimulates the nonamyloidogenic pathway by its effect on the alpha -secretase ADAM 10, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2001) 5815-5820.

96. K. Yanagisawa, Cholesterol and amyloid beta fibrillogenesis, Subcell. Bio-chem. 38 (2005) 179-202.

97. K.S. Vetrivel, G. Thinakaran, Membrane rafts in Alzheimer's disease beta-amyloid production, Biochim. Biophys. Acta. 1801 (2010) 860-867.

98. A.J. Beel, M. Sakakura, P.J. Barrett, C.R. Sanders, Direct binding of cholesterol to the amyloid precursor protein: An important interaction in lipid-Alzheimer's disease relationships?, Biochim. Biophys. Acta. 1801 (2010) 975982.1.jo hi c /m^

Информация о работе

Надеждин, Кирилл Дмитриевич
кандидата физико-математических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы