Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита

Козловская, Любовь Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита"

На правах рукописи

Козловская Любовь Игоревна

Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-2 пЕК ?010

МОСКВА 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов имени МП. Чумакова РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент

Карганова Галина Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Калинина Наталья Олеговна

доктор биологических наук

Гамбарян Александра Сергеевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится ОА аъ-1СС$ с^рд 2010 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, пос. Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПВЭ РАМН им.М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан О уСШ^р? 2010 года.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является переносимым клещами представителем рода Flavivirus, вызывающим тяжёлые заболевания человека с поражением центральной нервной системы.

Флавивирусы проникают в клетки рецептор-опосредованным эндоцитозом. Поверхностный вирионный белок Е отвечает за все начальные этапы цикла репродукции флавивирусов: связывание с рецепторами клеточной поверхности и проникновение вириона в клетку с последующим освобождением вирусного генома в цитоплазму. Структура эктодомена белка оболочки Е ВКЭ была впервые изучена Rey с соавторами (1995), затем был проведён рентгеноструктурный анализ частичных или полных белков Е для других представителей рода Flavivirus. Тем не менее, изучение свойств молекулы этого белка не проводилось, в том числе и методами молекулярного моделирования.

Гликозаминогликаны (ГАГ) - это линейные полисахаридные молекулы. Интерес к одному из структурных классов ГАГ, гепарансульфатам, связан с тем, что эта широко распространённая молекула обнаружена в организмах различных типов и почти на всех клетках млекопитающих. Разные по структуре вириона и схеме репликации вирусы используют ГАГ как молекулы связывания с поверхностью клетки и/или молекулы проникновения в клетку-мишень.

Для представителей нескольких вирусных семейств показано существование вариантов с повышенной аффинностью к ГАГ. Основным свойством всех этих вариантов является их низкая вирулентность для животных при периферическом заражении.

Описанные ранее лабораторные варианты флавивирусов, включая ВКЭ, с повышенной аффинностью к ГАГ, были получены в лабораторных условиях при адаптации вируса к клеткам ВНК-21, SW-13, Neuro-2 или к клещам разных видов. Эти ГАГ-связывающие варианты обладали специфическими свойствами, основными из которых являлись мелкобляшечный фенотип в культуре клеток почки свиньи и низкая нейроинвазивность. Все варианты приобретали мутации, повышающие заряд поверхностного гликопротеина Е. Влияние подобных мутаций, изменяющих

взаимодействие с рецептором, на структуру белка Е не изучалось, также как и существование ГАГ-связывающих вариантов в природной популяции флавивирусов, в том числе и в популяции ВКЭ.

Изучение влияния аминокислотных замен, изменяющих заряд поверхностного вирионного белка Е, на характеристики гликопротеина важно с теоретической точки зрения, а также имеет большое практическое значение. Это позволит учесть дополнительные параметры для рационального дизайна препаратов при создании новых лекарственных соединений.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение влияния аминокислотных замен, повышающих заряд молекулы поверхностного гликопротеина Е ВКЭ, на аффинность к клеточным ГАГ, структуру белка Е и биологические характеристики вируса.

Для этого необходимо было вешить следующие задачи:

1. Охарактеризовать свойства и аффинность к ГАГ набора штаммов ВКЭ, выделенных в разных частях России и стран Балтии.

2. С использованием нескольких штаммов ВКЭ с различной аффинностью к ГАГ определить, каждая ли мутация, повышающая заряд поверхностного гликопротеина Е, приводит к образованию варианта с ГАГ-связывающим фенотипом.

3. На основе набора вариантов штамма ЭК-328, полученных при адаптации к клещам и переадаптации к клеткам млекопитающих, изучить влияние некоторых мутаций на структуру белка Е, аффинность к ГАГ и другие свойства вируса.

Научная новизна

Впервые показано, что циркулирующие в природе варианты ВКЭ могут значительно различаться по аффинности связывания с ГАГ клетки.

Впервые выявлен и охарактеризован вариант с ГАГ-связывающим фенотипом среди природных изолятов ВКЭ, характеризующийся комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкой бляшкой в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности 4

(ГА) и неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе (РИЭФ).

Впервые проведено моделирование пространственной структуры эктодомена поверхностного белка Е представителей всех трёх подтипов ВКЭ.

Впервые in silico изучено поведение аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е и его связь с первичной нуклеотидной последовательностью белка. Показано, что одна аминокислотная мутация может привести к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е.

Впервые показано, что не любая аминокислотная замена, повышающая заряд поверхностного гликопротеина вириона, приводит к образованию вариантов с ГАГ-связывающим фенотипом.

Впервые показано, что данные, полученные при анализе молекулярной динамики (МД) эктодомена поверхностного белка вириона, позволяют предсказывать стабильность вирионов.

Впервые изучены молекулярные механизмы разной чувствительности ГА к детергентам и сниженной устойчивости вирионов ВКЭ к длительному температурному воздействию.

Научно-практическая значимость работы

Получена принципиально новая информация о конформационной стабильности эктодомена поверхностного гликопротеина Е представителей рода Flavivirus.

Апробирован новый подход к изучению свойств вирионов на основе анализа результатов МД эктодомена белка оболочки.

Предложен новый подход к оценке относительной подвижности элементов вторичной структуры в молекулах белков in silico на основе численного описания подвижности аминокислотных остатков.

Выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков эктодомена белка Е, что необходимо учитывать при разработке препаратов для лечения клещевого энцефалита на основе ингибиторов слияния и других

соединений, действие которых основано на связывании с поверхностным гликопротеином вириона. Также было выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к резкому изменению свойств вириона, в том числе его устойчивости к внешним воздействиям, что важно при разработке вакцинных препаратов.

Определены нуклеотидные последовательности белков оболочки Е для ряда штаммов, изолированных в разных частях России и стран Балтии, и депонированы в международной базе данных вспВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, №№ ОШ21963, ОШ21964, ОШ21965, ОШ21966, ОШ25720, 01Л25721, С1Л25722, ОШ21967, ОШ25719).

Апробация работы

Результаты были апробированы на заседании Межлабораторного учёного совета ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН (13 октября 2010 г.), а также на международных конгрессах 1МЕБ (23-25.02.2007, Вена, Австрия), Е8Е1 (30.0903.10.2007, Лиссабон, Португалия), «Человек и Лекарство» (12-13.04.2010, Москва, Россия), а также на конференциях молодых учёных ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН в 2008,2009 и 2010 годах.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборниках материалов конференций, 3 - в трудах ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН и 3 тезисных сообщения.

Объем и структура диссертации

Работа представлена 151 страницей печатного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 24 таблицами и состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и списка цитированной литературы, включающего 189 источников (17 отечественных и 172 иностранных).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты и обсуждение

I, Варианты с ГАГ-связыеающим фенотипом в природной популяции ВКЭ 1.Описание свойств коллекционных штаммов ВКЭ

На первом этапе мы попытались найти ГАГ-связывающие варианты среди штаммов из лабораторной коллекции, представляющих разные подтипы ВКЭ из разных источников выделения. Кроме того, в работе были использованы клоны штаммов Абсеттаров и Я10/89, полученные из популяции вирусов методом клонирования бляшек: Абсеттаров 18А, Я10/89 клоны 115 и 125 (Табл.1).

Таблица 1 - Штаммы ВКЭ, использованные в работе

ВКЭ штамм/ клои Район н год выделения Пассажи* Подтип ВКЭ штамм/ клон Район и год выделения Пассажн* Подтип

ЭК-328 Эстония, 1972, 1.регйи1саш М6С1М2 С1-2 Сиб** ЛК-138 Литва, 1972, пул I.ricinus М2С1-2 Евр

СофьинКГГ Приморский край, 1937, мозг больного Мх и С2-5 после клонирования ДВ ЮК4/13 Кемеровская область, 1969, I.persulcatus М4С1-2 Сиб

205КГГ Хабаровский край, 1973, ¡.репикашз М>20С1 ДВ ДВ 936k Приморский край, 1975, I.persulcatus М2-ЗС1-2 ДВ

80k Свердловская область, до 1970, кровь больного Мх и М5С1 после клонирования ДВ ПК-36 Приморский край, 1982, I.persulcatus М2-6С1 ДВ

Абсеттаров Ленинградская область, 1951, кровь больного М>20С1 Евр Я10/89 Ярославская область, 1989, пул I.persulcatus С4 -

Абсеттаров 18А С4 после клонирования Евр Я10/89 клон 115 С2 после клонирования Сиб

256 Белоруссия, до 1968,1.пстиз М>20С1 Евр Я10/89 клон 125 С2 после клонирования Сиб

Лесопарк Новосибирск, 1986, 1.рег$и1са1и$ МхМ4С1-2 Сиб

* М - пассажи через мозг белых мышей; С - пассажи в клетках СПЭВ, Мх -пассажи, пройденные вирусом до его получения в коллекции лаборатории

** Сиб - Сибирский, ДВ - Дальневосточный, Евр - Европейский подтипы ВКЭ

Сорбцию на гепарин-сефарозе - модельном аналоге ГАГ - проводили по методике, описанной нами ранее (Романова и др., 2007). Количество вируса, сорбированного на гепарин-сефарозе в течение 1 часа при 37°С, оценивали методом бляшек в клетках СПЭВ. Были выявлены 2 ГАГ-связывающих варианта - клон 125

штамма Я10/89 и штамм 80к, а также вариант с промежуточным сродством к ГАГ -штамм ПК-36 (Рис.1).

Дальнейшие исследования показали, что эти два ГАГ-связывающих варианта обладают комплексом специфических свойств, характерных для ГАГ-связывающего фенотипа:

1. сниженной нейроинвазивностью при периферическом введении лабораторным мышам (50% летальная доза (ЛД50) выражена в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ), вызывающих гибель 50% животных) (Рис.2),

2. мелкой бляшкой в культуре клеток СПЭВ (~1мм в диаметре) (Табл.2),

3. неспособностью образовывать направленный к катоду преципитат с антителами в РИЭФ,

4. сниженной или отсутствующей ГА.

Рис.1 - Сорбция исследуемых штаммов и Рис.2 - Нейроинвазивность исследуемых

клонов ВКЭ на гепарин-сефарозе. штаммов и клонов ВКЭ.

Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов РНК, кодирующих

белки оболочки Е, с консенсусной последовательностью соответствующего подтипа

показало наличие у ГАГ-связывающих вариантов мутаций, повышающих заряд

молекулы гликопротеина (Табл.2).

Неожиданным результатом явилось обнаружение у клона 18А штамма

Абсеттаров мутации, аналогичной таковой у штамма 80к, хотя этот клон не обладал

свойствами, характерными для ГАГ-связывающих вариантов (Табл.2).

Таблица 2 - Биологические, иммунохимические и вирусологические свойства штаммов и клонов ВКЭ

ВКЭ штамм/ клон Размер бляшек (мм) РИЭФ* ГА** [диапазон (оптимум) РН] Аминокислотные замены в белке £***

Абсеттаров 9,5±1,0 + 5,7-6,4 (6,4) -

Абсеттаров 18А 7,3±0,7 + 5,7-6,4 (6,0) Asp67—»Gly

256 8,3±0,9 + 5,7-6,8 (6,4) -

ЛК-138 9,2±0,8 + 5,7-6,4 (6,4) -

ЭК-328 7,0±0,5 + 5,7-7,0 (6,4) -

Лесопарк 8,0±1,5 + нд**** -

ЮК 4/13 11,3±1,8 + нд -

Я10/89 1,0:2,5 + 6,4 нд

Я10/89 клон 115 8,0±0,5 + 6,4-7,0 (6,4) -

Я10/89 клон 125 1,0±0,5 - 7,0 (7,0) GlU|22—i-Gly

СофьинКГГ 8,0±0,9 + 6,2-6,6 (6,4) -

205КГГ 9,0±1,5 + 6,2-6,4 (6,2-6,4) -

80k 1,0±0,5 - - Asp67—>Asn, Thr68—»Ala

ДВ 936k 10,0±0,5 + 6,2-7,0 (6,4-6,8) -

ПК-36 4,5±2,0 + 5,7-6,6 (6,4) -

* '+' - наличие направленного к катоду преципитата вирионов с антителами,- отсутствие направленного к катоду преципитата вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе (РИЭФ)

** ГА - гемагглютинирующая активность; диапазон - значения рН, при которых была отмечена ГА; оптимум -значение рН, при котором наблюдали максимальную ГА;- отсутствие ГА

*** нумерация аминокислотных остатков по последовательности белка Е ВКЭ; указаны замены относительно консенсусной последовательности соответствующего подтипа, приводящие к повышению заряда белка Е; '-* -отсутствие мутации **** нд - не делали

2. Моделирование и анализ МД белка Е для штаммов СофьинКГГ, 80к и клона 18А штамма Абсеттаров

Для того чтобы определить, почему клон Абсеттаров 18А с заменой, повышающей заряд молекулы белка Е, не изменил своей аффинности к ГАГ, мы провели анализ пространственной структуры эктодомена белка Е этого вируса и штамма 80к с аналогичной заменой в 67 позиции и ГАГ-связывающим фенотипом. Штамм СофьинКГГ Дальневосточного подтипа был использован для сравнения.

С помощью программ MODELLER 9v5 и SYBYL 8.0 на основании выравнивания аминокислотных последовательностей белков Е изучаемых вирусов и штамма Найдорфл, для которого с помощью рентгеноструктурного анализа (PDB 1SVB, Rey et al., 1995) была исследована пространственная структура эктодомена гликопротеина, были построены и оптимизированы модели структур белков Е выбранных вирусов. Затем поверхности этих моделей были окрашены согласно распределению электростатического потенциала (Рис.3). Поверхности эктодоменов

белков Е клона Абсеттаров 18А и штамма 80к оказались очень сходными. Следовательно, статичное представление структур белков Е не смогло дать объяснение наблюдаемому феномену.

Рис.3 - Поверхности моделей белка Е, окрашенные согласно распределению электростатического потенциала (модуль Molcad SYBYL 8.0). Белый квадратик отмечает 67 позицию.

С помощью комплекса программ AMBER 10 (Case et al., 2008) было проведено моделирование МД эктодоменов белков Е для трёх рассматриваемых | вирусов. Для аминокислотных остатков было использовано силовое поле AMBER | ff99SB (Hornak et al., 2006), для углеводного «хвоста» - GLYCAM06 (Kirschner et al., 2008). Алгоритм SHAKE (Ryckaert et al., 1977) был применён для расчёта длин связей, содержащих атомы водорода. Обобщение модели растворителя Борна (Tsui and Case, 2001) использовали для моделирования эффектов растворителя. Расчёт ( был осуществлен с помощью 256 процессоров суперкомпьютера СКИФ МГУ Чебышев. Эта часть исследований проводилась совместно с сотрудниками кафедры органической химии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

При анализе главных компонент траектории МД были выявлены 3 компоненты (Рис.4). Первая компонента, описывающая более 50% движения белка Е, соответствует его скручиванию вдоль продольной оси. Вторая и третья компонента, определяющие 15% и 10% движения, соответственно, были наиболее

заметны при визуальном анализе траекторий, представляют собой изгиб молекулы белка. 4-я компонента приведена для сравнения - это сложное скручивание.

Рис.4 - Анализ главных компонент траекторий МД для белка Е ВКЭ. Зеленоватой

кривой изображена аминокислотная цепь молекулы, а синими полосами - векторы движения, тонкая часть которых представляет начало движения.

Мы использовали изгиб молекулы для описания поведения всей молекулы во время моделирования МД (Рис.5). Начальная конформация соответствовала углу изгиба 180°, согласно таковому в исходной кристаллической структуре шаблона. Далее изгибание молекулы инициировалось тепловым движением молекулы. В течение приблизительно 5 не происходило установление характера движения молекулы. Молекула штамма СофьинКГГ претерпевала достаточно сильные изгибы от среднего значения 162,5°. Молекула клона Абсеттаров 18А довольно значительно изгибалась между 175°, 165° и 155°. Белок Е штамма 80к изгибался в районе среднего значения 163°.

Затем на основе результатов МД были построены корреляционные карты относительных движений аминокислотных остатков внутри димера белка Е (Рис.6). По осям X и Y последовательно отложены аминокислотные остатки субъединиц в димере белка Е. Точка на карте отражает характер движения Са-атома остатка на оси X относительно Са-атома остатка на оси Y. Если остатки движутся в одном направлении, то корреляция положительна, если в разных - то отрицательна. Области максимальной корреляции окрашены в белый цвет и соответствуют 1. Зоны максимальной антикорреляции соответствуют минус 1 и окрашены в синий цвет.

Ноль соответствует независимому движению остатков относительно друг друга и

штаммов 80к (оранжевый) и СофьинКГГ (фиолетовый) во время МД, представленное как зависимость изменения угла изгиба молекулы в градусах от

времени МД.

штамм СофьинКГГ клон 18А штамма Абсеттаров штамм 80к

Рис.6 Корреляционные карты для клона 18А штамма Абсеттаров, штаммов СофьинКГГ и 80к.

Поскольку димер эктодомена белка Е состоит из 790 аминокислотных остатков, что достаточно сложно для рассмотрения, мы ограничились описанием коррелятивных движений аминокислотных остатков одной субъединицы внутри димера (Рис.7). Карта окрашена согласно коэффициентам корреляции: максимум, равный 1, в жёлтый; минимум, равный минус 1, в синий; ноль - в красный цвет. Карта имеет чётко видимую структуру, соответственно доменам белка Е (домен I содержит 1-51, 136-189, 285-302, домен II - 52-135, 190-284, домен III - 303-395

аминокислотные остатки). Области согласованного движения принадлежат, в основном, движениям аминокислотных остатков внутри доменов, а области антикоррелированного движения - движениям остатков одного домена относительно другого.

Рис.8 - Корреляционная карта одной субъединицы в составе димера белка Е клона 18А штамма Абсетгаров, разбитая по движениям элементов вторичной структуры. Номера доменов, I, II и III, расставлены у границ областей движений остатков внутри них. Маленькими квадратами отмечены области движений элементов вторичной структуры.

Для оценки и сравнения корреляционных карт между собой мы разработали и применили оригинальный метод, основанный на рассмотрении относительных движений элементов вторичной структуры, а-спиралей и (3-тяжей, показанных на структуре эктодомена (Рис.8). Для упрощения численного описания коррелятивных движений мы разбили карту (рис.7) по элементам вторичной структуры белка Е, квадраты вдоль главной диагонали, и их относительным движениям, квадраты в

остальной части карты. Коэффициенты корреляции для этих областей были рассчитаны как среднее арифметическое коэффициентов корреляции отдельных аминокислотных остатков внутри выделенных квадратов.

Рис.7 - Структура эктодомена белка Е ВКЭ по отдельным доменам. Каждый домен представлен двухслойной вторичной структурой, отдельные слои представлены разными оттенками соответствующего цвета; дисульфидные мостики показаны линиями чёрных точек или диаграммами цистеиновых остатков; СНО - сайт гликозилирования (Rey et al., 1995).

Таким образом, карта значительно уменьшилась и упростилась для восприятия (Рис.9). По осям X и Y последовательно отложены элементы вторичной структуры белка Е ВКЭ в доменах I, II, и III в порядке их расположения в структуре эктодомена. Карта окрашена согласно среднеарифметическим коэффициентам корреляции аналогично рис.7. По сравнению с другими доменами самым скоррелированным является домен III - жёлтая область правого угла карты. Этот факт может быть объяснён специфичностью иммуноглобулиновой укладки этого домена, которая отличается плотностью и стабильностью упаковки. При рассмотрении движений доменов относительно друг друга заметна разнонаправленность движений доменов II и III (красно-синяя область центральной части карты), особенно листа gfeah домена II и всех элементов домена III.

ООООООООО

риш

iSISHHH

11ШI i 1 ШШШ

liillllllllli 1ШНЦШШНН;

< ffi ш Q О и. U

Рис. 9 - Упрощённая корреляционная карта одной субъединицы в составе димера белка Е клона 18А штамма Абсеттаров.

Численная оценка различий корреляционных карт для клона 18А штамма

Абсеттаров, штаммов 80к и СофьинКГГ (Рис.6) была проведена с помощью

построения упрощённых карт движений элементов вторичной структуры и карт

разности упрощённых карт для исследуемых вирусов. Карта разности (Рис. 11) окрашена согласно разности коэффициентов корреляции: максимум, равный 1, окрашен в красный, минимум, равный минус 1, - синий; ноль окрашен в белый цвет. Наиболее заметные отличия карты штамма 80к от двух других вирусов были заключены в подвижности |3-шпильки у домена II относительно окружающих её структур белка Е.

димеров белков Е штамма 80к и клона 18А штамма Абсеттаров

Рис.12 - Схема домена II белка Е ВКЭ (Rey et al., 1995)

Полученные данные свидетельствуют о том, что для домена II белка Е штамма 80к аминокислотная замена в 67 позиции, заключённая в тяже Ь подлежащего листа Ьс1с (3-сэндвича Ьс1с-у, приводит к снижению скоррелированности движений верхнего листа у (Рис.12). Таким образом, на поверхности образуется и способен достаточно долго существовать положительно заряженный кластер, необходимый для взаимодействия с ГАГ. При повышенной скоординированности листа у в движениях с окружающими структурами кластер не способен образоваться или

существовать достаточно долго для взаимодействия с ГАГ, что мы наблюдаем у клона Абсеттаров 18А.

II. Изучение влияния структуры белка Е на свойства вариантов ВКЭ 1. Выбор модели для исследования

Детальный анализ влияния аминокислотных замен, изменяющих заряд вириона, на подвижность структуры белка Е и свойства вирионов затруднительно проводить на модели штаммов, белки Е которых отличаются более чем десятью аминокислотами. Во второй части нашей работы мы решили использовать варианты одного штамма ВКЭ, ЭК-328, полученные при адаптации к клещам (вариант М) и переадаптации к млекопитающим (набор ревертантов), различающиеся точечными заменами в гликопротеине оболочки Е и некоторыми свойствами (Romanova et al., 2007) (Табл.3).

Таблица 3 - Характеристики вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ

Вирус Замена в белке Е Размер бляшки (мм) ГА Формальный заряд белка Е (модуль LeAp Amber 10)

64 122 124

ЭК-328 Lys Glu Lys 7 + -4

вариант М Lys Gly Lys <1 - -2

ревертант 57 Lys Gly Glu 7 + -6

ревертант 58 Lys Glu Lys 7 + -4

ревертант 59 Lys Gly Gin 4-5 + -4

ревертант 84 Gin Gly Lys 7 + -4

Благодаря мутациям в белке Е заряд вириона варианта М равен минус 2, ЭК-328 и одинакового с ним по белку Е рев.58, а также ревертантов 59 и 84 - минус 4, рев.57 - минус 6. Руководствуясь этими данными, можно было предположить, что вирусы будут различаться по сорбции на гепарин-сефарозе, и рев. 57 будет обладать наименьшей сорбцией.

2. Сорбция вирионов вариантов штамма ЭК-328 на гепарин-сефарозе Полученные нами результаты показали, что сорбция варианта М была статистически достоверно выше, чем у ревертантов и родительского штамма. Сорбция штамма ЭК-328, ревертанта 58, одинакового с родительским штаммом по последовательности белка Е, и ревертанта 59 не различалась; при этом их сорбция была достоверно ниже, чем сорбция ревертантов 57 и 84, которые достоверно не различались между собой (Рис.13).

Рис. 13 - Сорбция на гепарин-сефарозе вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ.

3. Моделирование и анализ МД белка Е для вариантов штамма ЭК-328 Как и в случае описанных выше вирусов, МД начиналась с плоской конформации шаблона 180° (Рис.14). До пятой наносекунды серьёзных отличий между вирусами, за исключением молекулы белка Е ревертанта 57, не наблюдалось. Далее наименьшие изменения претерпевали углы изгиба для белков Е рев.58/ЭК-328 и рев.59, колебавшиеся около среднего значения в 171° и 173°, соответственно. Довольно заметные скачки совершали углы изгиба для белков Е варианта М и рев.84, что удаляло среднее значения дальше от начальной конформации ещё на 10° до 166° и 164°, соответственно. Наиболее резкие изменения претерпевал угол изгиба молекулы ревертанта 57, он постепенно уменьшался, что не давало возможность оценить конечный угол конформации при заданных условиях.

Сравнительный анализ коррелятивных движений элементов вторичной структуры эктодоменов белков Е по разработанному нами методу выявил довольно сильные отличия рев.57 от структуры варианта М (Рис.15). Корреляционные карты белков Е ревертантов 58/ЭК-328, 59 и варианта М практически не отличались друг от друга. Карта ревертанта 84 отличались от таковой для варианта М чуть более значительно, но менее, чем карта рев.57. Таким образом, наиболее скоординированы и зависимы движения элементов вторичной структуры внутри белка Е рев.57, наименее - варианта М. Средним по относительной подвижности аминокислотных остатков является белок Е рев.84.

Анализ изгиба молекул белков Е во время МД в сочетании с данными о коррелятивных движениях аминокислотных остатков внутри одной субъединицы

позволил нам составить «шкалу конформационной подвижности эктодоменов белков Е». Наиболее подвижными являются эктодомены белков Е варианта М и ревертанта 57, наименее - рев.84; рев 58/ЭК-328 и рев.59 занимают промежуточное положение в шкале конформационной подвижности.

Рис.14 - Поведение молекул белков Е вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ во время молекулярной динамики, представленное как зависимость изменения угла изгиба молекулы в градусах от времени МД.

рев.5 9

рев.58/ЭК-328

Рис.15 - Корреляционные карты движений аминокислотных остатков в димерах белков Е вариантов штамма ЭК-328.

Конформационная стабильность белка определяется формированием солевых мостиков, водородных и дисульфидных связей, ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий. Анализ изгибания молекулы во время МД и корреляционных карт даёт представление о влиянии этих сил в эктодомене белка Е ВКЭ. Конформационная стабильность эктодомена белка оболочки Е может напрямую

определять стабильность вирусной частицы. Устойчивость вирионов можно оценивать по скорости термоинактивации при физиологических условиях, а также по устойчивости ГА к действию детергентов.

Поскольку белок Е определяет начальные этапы цикла репродукции ВКЭ в клетке-мишени, то температурная устойчивость вириона, определяемая по его инфекционности, целиком определяется термической стабильностью белка Е. Ранее было показано, что конформационная стабильность белка определяет его термическую стабильность (Luckey et al., 1991; Jaenicke and Böhm, 1998; Missimer et al., 2007). Таким образом, на основании анализа МД эктодомена белка Е можно сделать выводы о его термической стабильности, а значит и о термической стабильности вирусной частицы.

Ранее было показано, что аминокислотные замены в домене II белка Е могут влиять на ГА (Allison et al., 1995; Heinz and Allison, 2000). Это даёт возможность предположить, что мутации в домене II, влияя на конформационную стабильность вириона, изменяют устойчивость ГА к детергентам. Таким образом, изучая конформационную стабильность структуры эктодомена белка Е, мы сможем определить устойчивость ГА вирионов к действию детергентов.

Рис. 16 - Термоинактивация вариантов штамма ЭК-328 при инкубации при 37°С Согласно приведённой выше «шкале конформационной подвижности эктодоменов белков Е», полученные нами данные позволяют высказать

- * ре». 84

предположение о сравнительно высокой устойчивости вирионов рев.84, и низкой стабильности вирионов рев.57 и варианта М.

4. Температурная устойчивость и ГА вирионов вариантов штамма ЭК-328

Для экспериментального определения инфекционной устойчивости вирионов к длительному температурному воздействию вирус инкубировали при 37°С, замораживая пробы через 0, 1,5, 10, 24 часа, затем аликвоты титровали методом бляшек в клетках СПЭВ. Как и было предсказано на основании данных МД, наименее устойчивыми (Рис.16) оказались вирионы варианта М и рев.57. Все остальные варианты распределились согласно их расположению в «шкале подвижности». Достоверно и воспроизводимо самым устойчивым оказался рев.84. Эти факты подтвердили предположения, основанные на анализе результатов МД.

Для анализа устойчивости ГА к действию детергента 1^ошс]е1 Р-40 вирус перед проведением стандартной процедуры ГА инкубировали с детергентом в течение 1 часа при 4°С. Как можно заключить из полученных результатов (Табл.За и 36), только рев. 84 сохранил способность агглютинировать эритроциты гуся при том же оптимальном значении рН и с теми же титрами, что и без добавления детергента. Это также подтвердило правильность сделанного на основании анализа МД вывода о высокой стабильности вирионов этого ревертанта.

Таблица За - Гемагглютинируюшая активность вариантов штамма ЭК-328

Вирус Титр вируса (1йБОЕ /мл) спектр рН* оптимум рН** титр ГА (10Й2)

ЭК-328 7,8 5,7-7,0 6,4 9

вариант М 7,4 - - -

ревертант 57 7,9 5,7-6,6 6,4-6,6 8

ревертант 58 6,9 5,7-7,0 6,4 8

ревертант 59 8,1 5,7-6,6 6,4 8

ревертант 84 7,2 5,7-7,0 6,6 8

Таблица 36 - Гемагглютинирующая активность вариантов штамма ЭК-328 под _действием >)от(1е1 Р40_

Вирус Титр вируса (ЫБОЕ/мл) спектр рН оптимум рН титр ГА (10Й2)

ЭК-328 7,8 - - -

вариант М 7,4 - - -

ревертант 57 7,88 - - -

ревертант 58 6,88 - - -

ревертант 59 8,1 - - -

ревертант 84 7,2 5,7-6,6 6,6 7

* значения рН, при которых была отмечена ГА ** значение рН, при котором наблюдали максимальную ГА

Выводы

1. Циркулирующие в природе варианты вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) значительно различаются по аффинности связывания с гликозаминогликанами (ГАГ) поверхности клетки. ГАГ-связывающий фенотип характеризуется комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкобляшечным фенотипом в культуре клеток почки свиньи, низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности и неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе.

2. Не любая аминокислотная замена, повышающая заряд молекулы белка Е, приводит к повышению аффинности взаимодействия с ГАГ клетки и проявлению комплекса специфических свойств.

3. Одним из факторов, определяющих аффинность связывания вирионов вариантов ВКЭ с гепарансульфат ГАГ, является относительная подвижность аминокислотных остатков эктодомена белка Е.

4. Корреляционные карты, описывающие относительную подвижность аминокислотных остатков эктодоменов белков оболочки Е ВКЭ, могут значительно отличаться друг от друга. Варианты ВКЭ, значительно различающиеся по аминокислотной последовательности эктодомена белка Е (принадлежащие к различным подтипам), могут обладать сходными корреляционными картами, и варианты вируса, различающиеся только одной аминокислотной заменой в белке Е, могут значительно отличаться по подвижности его молекулы.

5. Конформационная подвижность эктодомена гликопротеина оболочки Е вносит существенный вклад в определение стабильности вирионов (устойчивость к длительному температурному воздействию и устойчивость гемагглютинирующей активности к детергентам).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Л.Ю. Романова, Л.И. Козловская, Т.И. Дживанян, J1.B. Гмыль, А.А. Румянцев, А.Н. Лукашев, А.П. Гмыль, Г.Г. Карганова. Молекулярные основы аттенуации вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам. Материалы всероссийской конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье". 19-22 мая 2005г., Суздаль, стр. 182-185.

2. Л.Ю. Романова, Л.И. Козловская, А.С. Шевцова, Г.Г. Карганова. 2006. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах. Вопросы вирусологии. 51(1), стр. 38-41.

3. Л.И. Козловская, В.И. Рудской. 2006. Разработка и применение математической модели для описания сорбции вирионов вируса клещевого энцефалита на клеточных рецепторах. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН. т. 23, стр. 82-89.

4. Л.Ю. Романова, Л.И. Козловская, Ю.В. Рогова, Т.И. Дживанян, А.П. Гмыль, Г.Г. Карганова. 2007. Стабильность популяции адаптированного к клещам варианта вируса клещевого энцефалита с повышенной сорбцией на клеточных гликозаминогликанах при пассажах в культуре клеток СПЭВ. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН, т. 24, стр. 73-79.

5. Л.Ю. Романова, Л.И. Козловская, Г.Г. Карганова. 2007. Взаимодействие вирионов с клеточными гепарансульфат гликозаминогликанами и нейроинвазивность вируса клещевого энцефалита. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ РАМН имени М.П. Чумакова, т. 24, стр. 273-279.

6. L.I. Kozlovskaya, D.I. Osolodkin, A.S. Shevtsova, L.Iu. Romanova, Y.V. Rogova, T.I. Dzhivanian, V.N. Lyapustin, G.P. Pivanova, A.P. Gmyl, V.A. Palyulin, G.G. Karganova. 2010. GAG-binding variants of tick-borne encephalitis virus. Virology. 398(2), p. 262-272.

Результаты работы были представлены в виде тезисов конференций

7. L. Romanova, L. Kozlovskaya, A. Gmyl, Y. Rogova, Т. Dzhivanian, D. Bakhmutov, A. Lukashev, G. Karganova. Tick-Borne Encephalitis Virus: GAG-binding Phenotype and Virulence. International Meeting on Emerging Diseases and Surveillance (IMED 2007). February 23-25, 2007, Vienna, Austria.

8. L.I. Kozlovskaya, V.I. Rudskoy, D.G. Maldov, L.Iu. Romanova, A.V. Timofeev, G.G. Karganova. Attachment of Tick-borne encephalitis virus variants with different virulence to the cell surface receptors. 4th Congress of the European Society for Emerging Infections. September 30 - October 3, 2007, Lisbon, Portugal.

9. Л.И. Козловская, Л.И. Осолодкин, А.С. Шевцова, Л.Ю. Романова, В.А. Палюлин, Г.Г. Карганова. Моделирование молекулярной динамики белка Е ВКЭ и свойства вариантов. Симпозиум «Биоинформатика и компьютерное конструирование лекарств» в рамках конгресса «Человек и Лекарство» 12-13 апреля 2010, Москва, Россия.

Заказ № 215-а/10/10 Подписано в печать 28.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \ I )) уму/, с/г. ги; е-таИ:'т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козловская, Любовь Игоревна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

I. Краткая характеристика рода Flavivirus.

1. Таксономическое положение рассматриваемых вирусов.

2. Краткая молекулярно-биологическая характеристика.

II. Белок Е.

1. Структура белка Е.

2. Изменение конформации белка Е при низком значении pH.

3. Проникновение вирионов в клетку.

III. Рецепторные молекулы для представителен рода Flavivirus.

1. Молекулы,клеточной адгезии (cell adhesion molecules, CAMs).

2. Высокоаффинный ламинин-связывающий белок (ВЛБ).

3. Другие молекулы клеточной/поверхности как возможные рецепторы для представителей рода Flavivirus.

IV. Гликозаминогликаны (ГАГ).

1. Краткая характеристика.

2. Стратегии вирусов по использованию гликозаминогликанов клетки.

3. Взаимодействие представителей рода Flavivirus с ГАГ.

4. Получение и свойства ГАГ-связывающих вариантов.

Материалы и методы.

Использованные в работе вирусы.

Культура клеток.

Животные.

Иммунные сыворотки.

Олигонукл еотиды.

Заражение культуры клеток.

Титрование инфекционного вируса методом бляшек под агаровым покрытием.

Окраска бляшек под агаровым покрытием с помощью генциан виолета.

Титрование вируса на мышах.

Клонирование вируса методом бляшек.

Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток.

Гемагглютинация (ГА).

Чувствительность ГА к действию детергентов.

Ракетный иммуноэлектрофорез.

Сорбция вируса на гепарин-сефарозе.

Выделение РНК.

Обратная транскрипция.

Полимеразная цепная реакция.

Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.

Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы

Определение нуклеотидной последовательности.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Моделирование белковых структур.

Моделирование молекулярной динамики (МД).

Метод построения и оценки корреляционных карт движений элементов вторичной структуры эктодомена белка Е.

Результаты.

I. Варианты с ГАГ-связывающим фенотипом в природной популяции ВКЭ.

1.Описание свойств коллекционных штаммов ВКЭ.

2. Моделирование и анализ молекулярной динамики белка Е для штаммов

СофьинКГГ и 80к, а также клона 18А штамма Абсеттаров.

II. Изучение влияния структуры белка Е на свойства вариантов одного штамма ВКЭ.

1. Выбор модели для исследования.

2. Сорбция вирионов вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ на гепарин-сефарозе.

3. Моделирование и анализ молекулярной динамики белка Е для вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ.

4. Температурная устойчивость вирионов вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ.

5. ГА вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ и её устойчивость к детергентам.

Обсуждение.

1. Существование вариантов с различной аффинностью к ГАГ в природной популяции ВКЭ.

2. Корреляционной карты движений димера поверхностного белка вириона Е ВКЭ и разработка подхода к её оценке.

3. Мутации, приводящие к повышению заряда белка Е ВКЭ, и ГАГ-связывающий фенотип.

4. Изучение влияния структуры эктодомена белка Е на свойства вариантов штамма ВКЭ.

5. Анализ молекулярной динамики белка Е ВКЭ для вирусов, принадлежащих к различным подтипам.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита"

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является переносимым клещами представителем рода Flavivirus, вызывающим тяжёлые заболевания человека, характеризующиеся поражением центральной нервной системы (ЦНС).

Гликозаминогликаны (ГАГ) - линейная полисахаридная молекула, которая экспрессируется на поверхности почти всех клеток млекопитающих, а также у организмов различных типов, таких как хордовые и членистоногие. Эти молекулы играют важную роль во взаимодействии клетки с внеклеточным матриксом, межклеточном сигналинге как рецепторы, и ко-рецепторы. Различные по структуре вириона и схеме репликации вирусы используют ГАГ как молекулы связывания с поверхностью клетки и/или молекулы, проникновения в клетку, однако в большинстве случаев эти молекулы не являются уникальными рецепторами.

Ранее на примере ВКЭ было показано, что флавивирусы используют два типа рецепторов на поверхности клеток-мишеней: малочисленный высокоаффинный и многочисленный низкоаффинный. Существует несколько типов молекул, претендующих на роль низкоаффинного рецептора: интегрины, высокоаффинный ламинин-связывающйй белок, гепарансульфат гликозаминогликаны (ГС-ГАГ) и другие.

Ранее для некоторых семейств вирусов, включая флавивирусы, были описаны варианты с повышенной аффинностью к ГАГ. Эти варианты объединяла высокая степень аттенуации для животных.

Описанные ранее лабораторные варианты флавивирусов, включая ВКЭ, с повышенной аффинностью к ГАГ, были получены при адаптации вируса к клеткам ВНК-21, SW-13, Neuro-2 или к клещам разных видов. Эти ГАГ-связывающие варианты обладали специфическими свойствами, основными из которых являлись мелкобляшечный фенотип в культуре клеток почки свиньи и низкая нейроинвазивность. Все варианты в процессе адаптации приобрели мутации, повышающие заряд поверхностного гликопротеина вириона Е. Влияние на структуру белка Е подобных мутаций, изменяющих взаимодействие вирионов с рецептором, не изучалось, также как и существование ГАГ-связывающих вариантов в природной-популяции флавивирусов, в том числе и в.популяции ВКЭ. .

Структура эктодомена молекулы белка оболочки Б ВКЭ была впервые получена Rey с соавторами (1995), затем был проведён-рентгеноструктурный анализ частичных или полных структур для других представителей рода Flavivirus. Изучение свойств молекулы белка не проводилось, в том? числе и моделированием молекулярной динамики in silico. Подобное изучение характеристик структуры белка может быть крайне полезно при создании, новых лекарственных соединений, так как позволит учесть дополнительные параметры для рационштьного дизайна препаратов:

Цель и задачи работы: Целью данной работы являлось изучение влияния аминокислотных замен, повышающих заряд молекулы поверхностного гликопротеина Е ВКЭ, на аффинность к клеточным ГАГ, структуру белка Е и биологические характеристики вируса.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

Научная новизна

Впервые выявлен и охарактеризован вариант с ГАГ-связывающим фенотипом среди природных изолятов ВКЭ, характеризующийся комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкой бляшкой- в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности (ГА) и. неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе (РИЭФ).

Впервые проведено моделирование пространственной^ структуры эктодомена поверхностного белка Е представителей всех трёх подтипов-ВКЭ.

Впервые in silico изучено поведение аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е и его связь с аминокислотной последовательностью белка. Показано, что одна аминокислотная мутация может привести к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е.

Научно-практическая ценность

• Выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков эктодомена белка Е, что необходимо учитывать при разработке препаратов для лечения клещевого энцефалита на основе ингибиторов слияния и других соединений, действие которых основано на связывании с поверхностным гликопротеином вириона. Также было выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к резкому изменению свойств вириона, в том числе его устойчивости к внешним воздействиям, что важно при разработке вакцинных препаратов.

Определены нуклеотидные последовательности белков оболочки Е для ряда штаммов, изолированных в разных частях России и стран Балтии, и депонированы в , международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, Ms GU121963, GU121964, GU121965, GU121966, GU125720, GU125721, GU125722, GU121967, GU125719).

Обзор литературы I. Краткая характеристика рода Flavivirus

Семейство Flaviviridae состоит из трёх родов Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus. Многие представители рода Flavivirus вызывают тяжёлые заболевания человека: вирус клещевого энцефалита, вирус жёлтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, четыре серотипа вируса Денге и другие.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Козловская, Любовь Игоревна

Выводы

1. Циркулирующие в природе варианты, вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) значительно различаются по аффинности связывания с гликозаминогликанами (ГАГ) поверхности клетки. ГАГ-связывающий фенотип характеризуется комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкобляшечным фенотипом в культуре клеток почки свиньи, низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности и неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе.

Благодарности

Я, искренне благодарна «д. б.н. Г.Г. Каргановой за научное руководство; неустанное внимание и поддержку.

Выражаю глубокую благодарность дирекции ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (академику РАМН С.Г. Дроздову и профессору М.И. Михайлову) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я выражаю искреннюю благодарность к.б.н. Медведкиной O.A. за неоценимую помощь на пути к официальной защите диссертации.

Благодарю сотрудников кафедры органической химии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова Осолодкина Д.И. за непосредственное' участие в настоящей работе и к.х.н. Палюлина В.А за внимание, ей посвященное.

Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН: к.б.н. Романову Л.Ю., Шевцову A.C., Рогову Ю.В., к.б.н. Гмыль JI.B., к.м.н.

Дживанян Т.И.], Блинову P.C., Морозову Т.П. за непосредственную помощь и участие в данной работе, к.б.н. Гмыль А.П. за поддержку, ценные советы и плодотворные научные дискуссии, к.м.н. Ливанову Г.П. за предоставление необходимых для настоящей работы материалов.

Я благодарна официальным оппонентам д.б.н. Калининой Н.О. и д.б.н. Гамбарян A.C., а также рецензенту к.б.н. Воровичу М.Ф. за внимательное прочтение работы и ценные замечания.

Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении исследований.

Я благодарю своих родителей, Козловского И.Ф. и Козловскую И.А., за помощь, внимание и любовь на каждой ступени моего пути к созданию этой работы.

Я благодарю своих друзей, особенно Селиванова A.B., за ненавящивую поддержку во время создания данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козловская, Любовь Игоревна, Москва

1. Грицун Т.С., Ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А. 1990. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол. № 6, стр. 471-474.

2. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Лисак В.М., Каштанова Г.М., Королев М.Б. 1986. Иммунохимические характеристики антигенов варианта вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам Hyalomma plumbeum. Вопр. вирусол. №1, стр. 92-96.

3. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. 1975. Изменчивость вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку при пассажах через клещей и позвоночных животных. Материалы IX симпозиума «Экология вирусов», г. Душанбе, стр. 22-24.

4. Дживанян Т.И., Батикова М., Грешикова М., Чунихин С.П. 1981. Различия штаммов вируса клещевого энцефалита по чувствительности их гемагглютининов к действию детергентов. Вопр. вирусол. №2, стр.237-240.

5. Карганова Г.Г. 1991. Зависимые от хозяина варианты вируса клещевого энцефалита и особенности их репродукции в клетках млекопитающих. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности вирусология.

6. Ляпустин В.Н., Чунихин С.П., Решетников И.Н., Лашкевич В.А. 1987. Изменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Вопр. вирусол. №4, стр. 451-456.

7. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н. и Локтев В.Б. 1997. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи анти-идиотипических антител. Вопр. виру con. №2, стр. 264-268.

8. Чунихин С.П. и Дживанян Т.И. 1977. «Экологические маркеры» арбовирусов. ДС-маркер вируса клещевого энцефалита. Вестник АМН СССР. №5, стр. 17-21.

9. Чунихин С.П1., Решетников И.Н., Ляпустин В:Н. 1986. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Мед. паразптол. и паразит, болезни. №6, стр. 58-61.

10. Чунихин С.П., Дживанян Т. И., Баннова Г.Г., Бабенко Л.В: 1975. Экспериментальное изучение роли иксодовых клещей в изменчивости вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку. Мед. паразитом, и паразит, болезни. № 3, стр. 344-347.

11. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff М., Roberts К., Walter P. 2008: Molecular biology of the cell, fifth ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, USA.

12. Allison S.L, Stiasny K., Stadler К., Mandl C.W., Heinz F.X. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. J.Virol. 73, p. 5605-5612.

13. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K., Mandl C.W., Kunz С., Heinz F.X. 1995. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH. J. Virol. 69(2), p. 695-700.

14. Alonso A., Goni F.M., Buckley J.T. 2000. Lipids favoring inverted phase enhance the ability of aerolysin to permeabilize liposome bilayers. Biochemistry. 39, p. 14019-14024.

15. Ammendolia M.G., Pietrantoni A., Tinari A., Yalenti P., Superti F. 2007. Bovine lactoferrin inhibits echovirus endocytic pathway by interacting with viral structural polypeptides. Antiviral. Res. 73(3), p. 151-60.

16. Andreo U., Maillard P., Kalinina O., Walic M., Meurs E., Martinot M., Marcellin P., Budkovvska A. 2007. Lipoprotein lipase mediates hepatitis С virus (HCY) cell entry and inhibits HCV infection. Cell. Microbiol. 9, p. 2445-2456.

17. Baranowski E., Ruiz-Jarabo C.M., Sevilla N., Andreu D., Beck E., Domingo, E. 2000. Cell recognition by foot-and-mouth disease virus that lacks the RGD integrin-binding motif: flexibility in aphtliovirus receptor usage. J. Virol. 74, p. 1641-1647.

18. Baranowski E., Sevilla N., Verdaguer N., Ruiz-Jarabo C.M., Beck E., Domingo E. 1998'. Multiple virulence determinants of foot-and-mouth disease virus in cell culture. J. Virol. 12, p.6362-6372.

19. Barker W.C., Mazumde, R., Vasudeva, S., Sagripant, J.L., Wu C.H. 2009. Sequence signatures in envelope protein may determine whether flaviviruses produce hemorrhagic or encephalitic syndromes. Virus Genes. 39(1), p. 1-9.

20. Barrett C.P., Hall B.A., Noble M.E.M. 2004. Dynamite: A Simple Way to Gain Insight into Protein Motions. Acta Cryst. 60(12-1), p.2280-2287.

21. Barth H., Schafer С., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Kinoshita-Toyoda A., Toida Т., Van Kuppevelt Т.Н., Depla E., Yon Weizsäcker F., Blum H.E., Baumert T.F. 2003.

22. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J. Biol. Chem. 278, p. 41003-41012.

23. Barth H., Schnober E.K., Zhang F., Linhardt R.J., Depla E., Boson B., Cosset F.L., Patel A.H., Blum H.E., Baumert T.F. 2006. Viral and cellular determinants of the hepatitis G virus envelope-heparan sulfate interaction. J. Virol. 80, p. 10579-10590.

24. Basu, A., Beyene, A., Meyer, K., Ray, R. 2004. The hypervariable region 1 of the E2 glycoprotein of hepatitis C virus binds to glycosaminoglycans, but this binding does not lead to infection in a pseudotype system. J. Virol. 78, p. 4478- 4486.

25. Basu A., Kanda T., Beyene A., Saito K., Meyer K., Ray R. 2007. Sulfated homologues of heparin inhibit hepatitis C virus entry into mammalian cells. J. Virol. 81, p. 3933-3941.

26. Bernard K.A., Klimstra W.B., Johnston R. E. 2000. Mutations in the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalitis virus confer heparan sulfate interaction, low morbidity, and rapid clearance from blood of mice. Virology. 276, p. 93-103.

27. Bressanelli S., Stiasny K., Allison S.L., Stura E.A., Duquerroy S., Lescar J., Heinz F.X., Rey

28. F.A. 2004. Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation. EMBOJ. 23, p. 728-738.

29. Burke D.S., Monath T.P. 2001. Flaviviruses. In D. M. Knipe, P. M. Howley et al. (eds.), Fields-virology, 4th ed. Lippincott- Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. p. 1042-1150.

30. Burlone M.E., Budkowska A. 2009. Hepatitis C virus cell entry: role of lipoproteins and cellular receptors. J. Gen. Virol. 90, p. 1055-1070.

31. Byrnes A.P., Griffin D.E. 1998. Binding of Sindbis virus to cell surface heparan sulfate. J. Virol 72(9), p. 7349-7356.

32. Calisher C.H., Gould E.A. 2003. Taxonomy of the virus family Flaviviridae. Adv. Vir. res. 59, p. 1-19.

33. Callens N., Ciczora Y., Bartosch B., Vu-Dac N., Cosset F.L., Pawlotsky J.M., Penin F., Dubuisson J. 2005. Basic residues in hypervariable region 1 of hepatitis C virus envelope glycoprotein e2 contribute to virus entry. J. Virol. 79, p. 15331-15341.

34. Cardosa M.J., Porterfield J.S., Gordon S. 1983. Complement receptor mediates enhanced Flavivirus replication in macrophages. J. Exp. Med. 158, p. 258-263.

35. Case D.A., Darden T.A., Cheatham III T.E., Simmerling C.L., Wang J., Duke R.E., Luo R., Crowley M., Walker R.C., Zhang W., Merz K.M., Wang B., Hayik S., Roitberg A., Seabra

36. Castle E., Nowak T., Leidner U., Wengler G. 1985. Sequence analysis of the viral core protein and the membrane-associated proteins VI and NV2 of the flavivirus West Nile virus and of the genome sequence for these proteins. Virology. 145, p. 227-236.

37. Chen Y.C., Wang S.Y., King C.C. 1999. Bacterial lipopolysaccharide inhibits DEN infection of primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent mechanism. J. Virol. 73, p. 2650-2657.44.

Информация о работе

Козловская, Любовь Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы