Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета

Врублевская, Вероника Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета"

На правах рукописи

Врублевская Вероника Валерьевна

ГЛИКОПРОТЕИНЫ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ:

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ КЛЕТОК И РОЛЬ В ИНДУКЦИИ ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА

Специальность «Биохимия» 03.00.04.

АВТОРЕФЕРАТ— диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2007

003066845

Работа выполнена в лаборатории культур клеток и клеточной инженерии Института биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Моренков Олег Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Новоселов Владимир Иванович

доктор физико-математических наук, профессор Акатов Владимир Семенович

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д И Ивановского Российской академии медицинских наук

Защита состоится 18 октября 2007 г в 14 00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, д 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, д.З

Автореферат разослан «■/£» 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, ^

кандидат биологических наук /'//6 ' Смолихина Т.И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Альфагерпесвирусы (семейство Herpesviridae, подсемейство Alphaherpesvirmae) включают в себя ряд опасных патогенов человека и животных (вирусы простого герпеса человека 1 и 2 типа, вирус ветрянки и опоясывающего лишая, вирус инфекционного ринотрахеита, вирус болезни Ауески и др ) В оболочке альфагерпесвирусов насчитывается более 10 гликопротеинов В ряду других гликопротеинов, гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов занимают особое место У отдельных альфагерпесвирусов гликопротеин gB, наряду с гликопротеином gC, играет важную роль в первичной гепарансульфат (ГС)-зависимой адсорбции вируса на клетках (Byrne et al, 1995, Li et al, 1995, Herold et al, 1994) Гликопротеин gD участвует в процессе формирования более стабильного, ГС-независимого связывания вирусов с плазматической клеточной мембраной, которое следует за первичной адсорбцией вируса (Reske et al, 2007, McCIam and Fuller, 1994, Karger and Mettenleiter, 1993) К настоящему времени идентифицированы клеточные рецепторы гликопротеина gD (Spear, 2004, Spear and Longnecker, 2003) После стабильного связывания альфагерпесвирусов с клетками происходит слияние вирусной оболочки с плазматической клеточной мембраной В данном процессе участвуют вирусные гликопротеины gB, gD и комплекс gH-gL (Campadelli-Fiume et al, 2007, Spear, 2004) Гликопротеин gK, а также ряд белков тегумента вируса, играют модулирующую роль в этом процессе (Spear et al, 2000, Roizman and Spear, 1996) Кроме того, gB альфагерпесвирусов необходим для распространения вируса от клетки к клетке (Nixdorf et al, 2000) и проявления синцитиального фенотипа вирусов (Navarro et al, 1992)

Несмотря на интенсивное изучение молекулярной биологии альфагерпесвирусов, функционирование гликопротеинов gB и gD на ранних этапах взаимодействия вирусов с клетками остается недостаточно исследованным Имеются лишь фрагментарные данные, касающиеся клеточных белков, вовлеченных в процессы взаимодействия с гликопротеином gB альфагерпесвирусов, не определена роль клеточных белков в слиянии вирусной и клеточной мембран Изучение взаимодействия gB и gD альфагерпесвирусов с клеточными рецепторными структурами представляет не только значительный теоретический интерес, но и может явиться основой для разработки противовирусных препаратов, так как блокирование взаимодействия клеточных рецепторов и вирусных антирецепторов представляется перспективным направлением в создании средств защиты от вирусных инфекций

Кроме центральной роли гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в проникновении вирусов в клетки, эти гликопротеины играют важнейшую роль в индукции противовирусного иммунитета Для многих альфагерпесвирусов показано, что гликопротеины gD и gB являются основными мишенями противовирусного иммунитета, индуцируя как гуморальный, так и клеточный иммунитет (van Rooij et al, 2005, Hong et al, 2002, Packiarajah et al, 1998) В настоящее время гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов рассматриваются в качестве основных кандидатов на использование в вакцинах нового поколения (субъединичные вакцины, ДНК-вакцины)

Центральная роль гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в функционировании вирусов и в формировании противовирусного иммунитета определяет важность и актуальность дальнейшего исследования роли этих гликопротеинов на разных стадиях развития вирусов в клетках и в индукции противовирусного иммунитета

Вирус болезни Ауески (ВБА, Suid herpesvirus 1) является типичным представителем альфагерпесвирусов и поражает многие виды диких и домашних животных (Wittman, 1991) Гликопротеины gB и gD ВБА характеризуются высоким уровнем структурной и функциональной гомологии с соответствующими гомологами других альфагерпесвирусов (Mettenleiter, 1994) Так, например, гликопротеин gB ВБА способен комплементировать gB-негативный мутант вируса простого герпеса человека 1-го типа, gB вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота способен комштементировать gB-негативный мутант ВБА (Miethke et al, 1995, Knopp and Mettenleiter, 1992, Rauh et al, 1991) Учитывая высокий уровень структурно-функциональной гомологии гликопротеинов gB и gD ВБА и других альфагерпесвирусов, ВБА является удобной моделью для изучения молекулярных механизмов взаимодействия гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов с рецепторными структурами плазматических мембран чувствительных клеток, а также изучения их роли в индукции защитного иммунитета Достоинством этой модели является апатогенность вируса для человека, легкость культивирования вируса на различных культурах клеток и наличие лабораторных моделей животных, чувствительных к вирусу (мыши, морские свинки, кролики)

Цель и задачи работы

Целью работы было изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD вируса болезни Ауески с плазматическими мембранами чувствительных клеток и их роли в индукции противовирусного иммунитета Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи

1 Получить и охарактеризовать панель моноклональных антител к гликопротеинам gD и gB ВБА и разработать методы иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB

2 Исследовать взаимодействие гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами чувствительных клеток

3 Реконструировать вирусные гликопротеины в мембраны искусственных липосом и исследовать с помощью полученных протеолипосом роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на плазматические мембраны чувствительных клеток

4 Исследовать антигенную структуру гликопротеина gD ВБА и индукцию гуморального иммунитета на этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных

5 Изучить роль гликопротеинов gD и gB ВБА в индукции противовирусного иммунитета с использованием очищенных гликопротеинов и реконструированных липосом

Работа была выполнена в Институте биофизики клетки РАН, Пущино. Отдельные фрагменты работы были выполнены совместно с Институтом Ветеринарной Медицины УААН (Киев, Украина)

Научная новизна работы

1 Впервые показано, что гликопротеин gB ВБА играет важную роль в адсорбции вируса на клетках

2 Впервые доказано, что гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками Установлено, что гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере, частично, конформационно-зависимым

3 Впервые проведена реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом Полученные протеолипосомы (виросомы) специфически связывались с плазматическими клеточными мембранами и эффективно интернализовались клетками С помощью виросом подтверждена важная роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на клетках Продемонстрировано, что виросомы на основе белков ВБА являются удобной моделью для изучения взаимодействия вирусных гликопротеинов с клетками и могут быть использованы для доставки биологически-активных молекул в клетки

4 Впервые показано, что реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности

5. Установлено, что конформационные эпитопы гликопротеина gD ВБА играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа на этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных

6 Показана высокая консервативность антигенной структуры гликопротеина gD

ВБА

Практическая значимость работы.

1 Полученные в работе данные, касающиеся роли гликопротеинов ВБА в индукции противовирусного защитного иммунитета, а также иммуногенности липосомальных вирусных антигенов, могут лечь в основу разработки субъединичных и липосомальных вакцин против болезни Ауески

2 Разработан иммуноферментный метод серологической диагностики болезни Ауески, основанный на выявлении в сыворотке животных антител к гликопротеину gD ВБА, который по своим характеристикам не уступает имеющимся тест-системам для диагностики болезни Ауески

Апробаиия работы Основные результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых (Пущино, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005 гг), на XIV международной молодежной научной школе (Москва, 2002 г), на 16-ом международном конгрессе IPVS (Австралия, 2000 г), на международной научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии животных» (Украина, 2001 г)

Публикаиии По теме диссертации опубликовано 6 статей и 9 тезисов докладов

Структура диссеотаиии Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, содержащего источников Диссертация изложена на '/¿/З страницах машинописного текста, иллюстрирована еРес рисунками и ■// таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и вирусы В работе использовали клеточные культуры ВНК-21 и MDBK, чувствительные к ВБА Лабораторные штаммы ВБА (Ka, Phylaxia, К, BUK 628, Арский и В ГНК И), вакцинные штаммы (Bartha К61, NIA-4, Begonia и 77/3) и 10 ^охарактеризованных полевых изолятов ВБА были получены из коллекций Ветеринарного Медицинского Института (Будапешт, Венгрия) и Института ветеринарной медицины УААН (Киев, Украина) Вирусы культивировали на клетках ВНК-21 Очистку вирионов осуществляли центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, как описано ранее (Ben-Porat al, 1974) Для получения вирионов, меченных [35S]-MexHOHHHOM, вирус нарабатывали в среде без метионина с добавлением 10 мкКи/мл [35S]-MeraoHiffla

Сыворотки животных Сыворотки неинфицированных, инфицированных ВБА и вакцинированных против БА свиней, использованные в работе, были получены из коллекций Института ветеринарной медицины (Киев, У(фаина) и Центрального ветеринарного института (Будапешт, Венгрия) В работе также использовались сыворотки мышей и кроликов, иммунизированных препаратами очищенных вирионов ВБА и гликопротеинов gB и gD ВБА

Получение моноклональных антител к гликопротеинам ВБА Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (мкАТ) против белков ВБА, получали стандартным методом (Goding, 1980) Для иммунизации использовали очищенные инактивированные формалином вирионы ВБА (штамм К) и очищенные гликопротеины gB и gD ВБА Скрининг гибридом на продукцию вирус-специфических мкАТ проводили с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунопероксидазного окрашивания ВБА-инфицированных клеток мкАТ Ь51-с5-1, 4bl-lcll и с14-с27, направленные к gD ВБА, любезно предоставил доктор Т Меттенлейтер (Дюссельдорфский Университет, Германия) Антитела очищали из асцитной жидкости хроматографией на ДЭАЭ-Тойоперл (Oppermann, 1992) Конъюгаты мкАТ с пероксидазой хрена получали методом перйодатного окисления (Wilson and Nakane, 1978)

Очистка гликопуотеинов sD и яВ с помощью аффинной хроматографии Аффинные сорбенты gD- и gB-специфических мкАТ с сефарозой CL-6B получали, как описано (Stults et al, 1989) Гликопротеины gD и gB выделяли из инфицированных ВБА клеток или из очищенных вирионов с помощью иммуноаффинной хроматографии (Zaripov et al, 1998) Гликопротеины gD и gB, меченые [35Sj-метионином, выделяли из ВБА-инфицированных клеток или из очищенных вирионов, меченых [358]-метионином

Электрофорез и гшмуноблоттинг Электрофорез белков проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) Иммуноблоттинг проводили с использованием gD-, gE- и gB-специфических мкАТ, как описано ранее (Zaripov et al, 1998)

Получение реконструированных липосом Экстракцию вирусных гликопротеинов из оболочки очищенных вирионов ВБА осуществляли с помощью ß-октилгликозида Реконструкцию вирусных гликопротеинов в мембраны липосом на основе фосфатидилхолина осуществляли методом диализа детергента, как описано (Jojnson, 1984) Реконструированные протеолипосомы осаждали центрифугированием (200000g, 2 ч) Радиоактивно-меченные реконструированные липосомы получали, как описано

выше, используя для реконструкции лизат очищенных вирионов ВБА, меченных [35в]-метионином Для получения липосом, нагруженных пероксидазой хрена (ПХ) или флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), реконструкцию вирусных гликопротеинов в мембраны липосом осуществляли в присутствии ПХ или ФИТЦ

Исследование связывания гликопротеинов ч>Р и еВ и виросом с клетками Клетки ВНК-21 или МОВК охлаждали до +4°С и инкубировали в течение 1 ч при +4°С с мечеными [358]-метионином гликопротеинами ¿О, gB, или с [338]-, ПХ-, ФИТЦ-мечеными виросомами После отмывки, связывание с клетками [358]-меченых ¿И, §В или виросом оценивали по величине радиоактивности, ассоциированной с клетками Связывание ПХ-виросом с клетками регистрировали с помощью светового микроскопа после окрашивания диамнобензидином Адсорбцию ФИТЦ-виросом на клеточной поверхности выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа

СпеииФичностъ взаимодействия гликопротеинов еР. яВ и виросом с клетками Специфичность взаимодействия гликопротеинов и §В и виросом с клетками оценивали по их конкуренции с вирионами ВБА, гликопротеинами §В и ВБА и гепарином за связывание с клетками Эксперименты проводили как описано выше, за исключением того, что инкубацию меченых гликопротеинов и виросом с клетками проводили в присутствии немеченых конкурирующих агентов (очищенные вирионы, гликопротеины и §£> ВБА, гепарин) в разных концентрациях Количество гликопротеинов и виросом, связавшихся с клеточной плазматической мембраной, оценивали, как описано выше

Интернализаиия виросом клетками Клетки ВНК-21 или МОВК инкубировали с ПХ-мечеными виросомами при +4°С в течение 1 ч Клетки отмывали и инкубировали в течение различных интервалов времени при +37°С Далее клетки отмывали и обрабатывали раствором трипсин/гепарин для удаления с плазматической клеточной мембраны виросом, адсорбированных на клеточной поверхности Клетки отмывали, лизировали и оценивали активность ПХ, проникшей внутрь клеток

Эпитопное картирование гликопротеина гР Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали аффинно-очшценным ВБА После этого в лунках инкубировали различные §р-специфические мкАТ в насыщающих концентрациях После промывки в лунках инкубировали конъюгаты различных ^-специфических мкАТ Лунки отмывали, проявляли реакцию с помощью о-фенилендиамина и регистрировали оптическую плотность при 492 нм После этого определяли степень конкуренции ¿О-специфических мкАТ между собой

Определение титров ВБА-спеиифических антител Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали препаратами аффинно-очищенных гликопротеинов ВБА или вирионов ВБА В лунках инкубировали исследуемые сыворотки животных или мкАТ, затем лунки отмывали и инкубировали с пероксидазным конъюгатом против 1§0 свиней (при исследовании сывороток свиней) или с пероксидазным конъюгатом против мышей (при исследовании мышиных сывороток и мкАТ) Лунки отмывали и проявляли реакцию как описано выше За титр специфических антител принимали разведение антител (сывороток), при котором оптическая плотность была в 3 раза выше фонового значения

Определение титров эпитоп-спеиифических антител Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали гликопротеином gD и инкубировали с исследуемыми сыворотками в разных разведениях После промывки в лунках инкубировали gD-специфические мкАТ. Лунки отмывали, инкубировали с пероксидазным конъюгатом против IgG мыпш, снова отмывали и проявляли реакцию, как описано выше За титр эпитоп-специфических антител принимали разведение сывороток, при котором наблюдалось 50%-ное ингибирование оптической плотности по сравнению с негативными сыворотками

Оценка влияния антител на развитие вирусной инфекции m vitro Вирус-нейтрализующую активность антител исследовали стандартным методом вирус-нейтрализации в присутствии и в отсутствие комплемента Влияние антител на проникновение вируса внутрь клеток и на распространение вируса от клетки к клетке оценивали, как описано (Highlander et al, 1984) Вирусные бляшки выявляли с помощью иммунопероксидазного окрашивания клеток gB-специфическими моноклональными антителами (Моренков и др, 1994)

Активная и пассивная иммтизаиия мышей. В экспериментах использовали самцов мышей линии BALB/c (3-4 недели) Для активной иммунизации мышей иммунизировали антигенами (очищенные gD и gB, инакгавированные формалином вирионы ВБА, липосомальные препараты) внутрибрюшинно, однократно или двукратно (с интервалом между иммунизациями 2 недели) Количество вводимых антигенов на одну иммунизацию составляло 0,1-10 мкг/мышь Контрольное инфицирование вирусом (штамм К) проводили на 21-й день после последней иммунизации посредством внутримышечного введения 3-5хЛДюо ВБА После инфицирования животных наблюдали в течение двух недель

В экспериментах по пассивной иммунизации очищенные мкАТ вводили мышам внутрибрюшинно (1 мг/мышь) Контрольное инфицирование вирусом проводили через 24 ч, как описано выше

Остальные иммунохимические, биохимические и вирусологические исследования проводили по стандартным методикам

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение моноклональных антител к гликопротеином gD и gB ВБА и разработка методов очистки гликопротеинов gB и gD

Начальный этап работы был посвящен получению моноклональных антител (мкАТ) к гликопротеинам gD и gB ВБА, которые были необходимы для разработки методов очистки и контроля гликопротеинов, а также для изучения роли гликопротеинов в индукции противовирусного иммунитета

В результате, после проведения серии слияний, получены 12 гибридомных клонов, продуцирующих мкАТ к гликопротеину gD ВБА, а также ряд гибридомных клонов, продуцирующих мкАТ к гликопротеину gB ВБА Специфичность мкАТ к гликопротеинам gD и gB ВБА доказывали с помощью иммунопероксидазного окрашивания вирус-инфицированных клеток, непрямого ИФА, иммуноблоттинга и радиоиммунопреципитации Характеристика gD-специфических мкАТ приведена ниже в разделе 3

На основе gD- и g В-специфических антител были синтезированы аффинные сорбенты и разработаны методы одноступенчатой иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB из вирус-инфицированных клеток и очищенных вириоиов. Разработанные методы позволяли получать препараты gD и gB с чистотой 95-98% (Рис. 1 и 2).

2 3 4 5 6 789 Рис. 1. Анализ очищенного гликопротеина gD ВБА с помощью электрофореза (а) и иммуноблоттинга (б). Электрофорез -выполняли тю методу Леммли (Laemmli, 1970). (б) Реактивность ¿D ВБА с моноклональными антителами. ] и 2 - gB-специфические мкАТ 34/2 и 89/11; 3 и 4 - gE-специфические мкАТ 80/10 и 106/27; 5 и б - gD-специфичсекие мкАТ 42/11 и 38/22; 7, 8 и 9 -мышиные негативные антитела. Слева - положение маркерных белков с указанием молекулярной массы (кДа). В препарате очищенного gD наблюдается полоса с молекулярной массой 50-55 кДа.

94-

43-

В препаратах очищенных гликопротеинов другие вирусные белки не выявлялись в ИФА и в иммуноблоттннге. У очищенных гликопротеинов и гликопротеинов в составе вирионов профили реактивности в непрямом ИФА с панелью антител, направленных к конформационным эпитопам этих глико протеинов, практически совпадали (данные не приведены), что свидетельствовало о сохранении очищенными гликонротеинами gD и gB ВБА нативной структуры в процессе очистки.

Полученные очищенные гоикопротеины §В и ц,0 ВБА использовали для изучения их взаимодействия с клетками и роли в индукции противовирусного иммунитета.

946743-

Рие. 2. Электрофорет1[ческш1 анализ гликопротеина gB ВБА, очищенною с помощь ю иммуноаффинной хроматографии.

] и 2 -гликопротеин gB, нанесение 2 мкг и 5 мкг, соответственно. Слева - положение маркерных белков с указанием молекулярной массы (кДа), В препарате очищенною gB наблюдаются 3 полосы, соответствующие субъединицам гликопротеина gBa (115-!25 кДа), аВЬ (67-70 кДа) и еВс (56-5? кДа).

2. Изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембрана.»» чувствительных клеток

Следующий этап работы был посвящен изучению взаимодействия глико протеин о в gB и gD ВБА с плазматическими мембранами клеток in vitro. Работа проводилась на клеточных линиях ВНК-21 и M DR К, чувствительных к ВБА.

2.1. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию вируса на клетках

Показано, что очищенный gB ВБА дозо-зависимо связывался с клетками (Рис. 3). При использовании высокой концентрации gB (2 мг/мл) наблюдалась тенденция к

насыщению связывания §3 с клетками На клетках МОВК связывалось в 2-3 раза больше гликопротеина £В по сравнению с клетками ВНК-21 Взаимодействие гликопротеина с клетками было специфичным, о чем свидетельствовала конкуренция за связывание с клетками меченого [35 8]-метионином §В с немеченым gB и очищенными вирионами (Рис 4) Было показано, что инкубация клеток с очищенным §В блокирует адсорбцию вируса на клетках (Рис 5) Таким образом, впервые получены данные, свидетельствующие о важной роли гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на клетках

0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Концентрация gB (мг/мл)

Рис. 3 Дозо-зависимое связывание очищенного гликопротеина gB с клетками ВНК-21 (о) и МОВК (•)

Клетки инкубировали в присутствии разных

концентраций gB, после чего определяли количество связавшегося с клетками гликопротеина

^ 2000 -в г

1500 ■

вд

« 1000

500

аа О

{М

1.0 0 3 0.1 без 1.0 0.3 0.1 без

Немеченый §В (концентрация мг/мл)

1:2 1:6 1:18 без ВБА

Очищенный ВБА (разведение)

Рис. 4 Специфичность связывания гликопротеина gB ВБА с клетками ВНК-21 (темные столбцы) и МОВК (светлые столбцы) (А) Клетки инкубировали в присутствии разных концентраций немеченого §В и одинакового количества [ 58]-меченого ¿В, после чего определяли величину радиоактивности, связавшейся с клетками (В, С) Клетки инкубировали в присутствии разных концентраций немеченого gB (В) или с разными разведениями вирионов ВБА (С) Затем клетки отмывали и инкубировали с [358]-меченым gB После этого определяли радиоактивность, связавшуюся с клетками

Очищенный немеченый gB (концентрация мг/мл)

Рис. 5 Влияние гликопротеина gB ВБА на формирование вирусных бляшек (А, В, С) и на связывание вирионов ВБА (Б, Е, Б) с клетками ВНК-21 (черные столбцы) и МВВК (белые столбцы)

Клетки обрабатывали различными концентрациями немеченого в течение 2 ч перед добавлением инфекционного (В, С) или [358]-меченого (Е, Б) вируса, или одновременно с добавлением инфекционного (А) или [ 58]-меченого вируса (Б) В вариантах В и Е не проводили отмывки перед добавлением вирионов В вариантах С и Б проводили отмывку перед добавлением вирионов Результаты учитывали по количеству выросших вирусных бляшек (А, В, С) или по радиоактивности связавшихся [ 8]-меченых вирионов ВБА (О, Е, Б)

2.2. Роль гепарансульфатов плазматических клеточных мембран в связывании гликопротеина gB

Известно, что у ряда альфагерпесвирусов гликопротеин gB играет важную роль в гепарансульфат (ГС)-зависимой адсорбции (Jacquet et al, 1998, Byrne et al, 1995, Herold et al, 1994) Мы показали, что очищенный гликопротеин gB ВБА связывался с иммобилизованным на сефарозе гепарином (структурный аналог ГС), и специфически элюировался с сорбента гепарином (Таблица 1) Было установлено, что гепарин препятствовал связыванию gB с клетками 50% ингибирование связывания наблюдалось при концентрации гепарина 0,02-0,05 мкг/мл (Рис 6) При использовании гепарина в концентрации 2 мкг/мл связывание gB с клетками практически отсутствовало Предварительно сорбированный на клетках гликопротеин gB также эффективно элюировался гепарином 50% адсорбированного на клетках gB элюировалось с клеточной поверхности при концентрации гепарина 0,03-0,07 мкг/мл Однако, 25-30% адсорбированного на клетках gB не элюировалось с клеточной поверхности даже при высоких концентрациях гепарина (100 мкг/мл) Обработка клеток гепариназой также приводила к существенному снижению связывания gB с клетками, однако полного

ингибирования связывания не наблюдалось даже при высоких концентрациях гепариназы (Рис 7) Полученные данные позволили сделать вывод, что ГС плазматических мембран участвуют в связывании гликопротеина gB ВБА с клеточной поверхностью Наличие фракции gB, которая не элюируется при обработке клеток гепарином, свидетельствует в пользу существования на плазматической клеточной мембране дополнительной структуры, с которой связывается гликопротеин gB ВБА и которая не является ГС, что согласуется с данными, полученными при изучении других герпесвирусов (Jacquet et al, 1998)

Таблица 1 Взаимодействие гликопротеина gB ВБА с гепарин-сефарозой

Условия инкубации [35S]-Me4eHoro gB с гепарин-сефарозой Условия элюции gB Количество элюированного gB (%)*

2 мг/мл гепарина, 2% ДСН, 90°С 100

2 M NaCl, 0,5% Тритон Х-100, 90°С 96

ТСБ-Т 0,1 мг/мл гепарина 43

2 мг/мл гепарина 67

0,5 M NaCl 90

2 M NaCl 93

ТСБ-Т ТСБ-Т, 0,1 мг/мл гепарина ТСБ-Т, 1 мг/мл гепарина 2 мг/мл гепарина, 2% ДСН, 90°С 100 31 И

ТСБ-Т - 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 7,4, содержащий 150 мМ NaCl и 0,1% Тритон Х-100 * - эффективность элюции gB в буфере, содержащем 2 мг/мл гепарина и 2% ДСН при обработке гепарин-сефарозы при 90°С в течение 10 мин принимали за 100%

Концентрация гепарина (мкг/мл) Концентрация гепарина (мкг/мл)

Рис. б Влияние гепарина на связывание гликопротеина §В ВБА с клетками ВНК-21 (Д) и МБВК (А) и на гликопротеин gB, предварительно адсорбированный на клетках ВНК-21 (о) и МБВК (•) (А) Клетки инкубировали в присутствии [358]-меченого гликопротеина gB и разных концентраций гепарина при 4°С После инкубации клетки отмывали и определяли количество связанного с клетками [358]-меченого gB (В) Клетки инкубировали в присутствии [358]-меченого гликопротеина gB при 4°С После отмывки клетки обрабатывали различными концентрациями гепарина и определяли количество связанного с клетками меченого gB

О 125 2.5 5

Гепариназа (U/мл)

50000 45000 ■ 40000 35000 30000 25000 ■ 20000 ■ 15000 -10000

1.25 2 5 5 10

Гепариназа(и/мл)

Рис. 7 Влияние обработки клеток гепариназой на связывание гликопротеина gB (А) и вирионов ВБА (В) с клетками ВНК-21 (•) и МОВК (о) Клетки обрабатывали различными концентрациями гепариназы в течение 1 ч при 37°С, охлаждали и инкубировали при 4°С с [358]-мечеными гликопротеином §В или вирионами ВБА После отмывки определяли количество радиоактивности, связанной с клетками

2.3. Характеристика гепарансульфат-связывающего центра гликопротеина gB

В отличие от гликопротеина gB вируса простого герпеса человека типа I, gB-гомологи ВБА, цитомегаловируса человека и вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота не содержат канонической гепарансульфат-связывающей последовательности, однако связываются с гепарансульфатами (Carlson et al, 1997, Li et al, 1995) Для gB цитомегалавируса человека было показано, что гепарансульфат-связывающая активность gB зависит от нативности третичной структуры гликопротеина (Carlson et al, 1997) Мы также исследовали влияние денатурации gB ВБА на его связывание с гепарин-сефарозой Денатурацию осуществляли посредством обработки gB 0,3% додецилсульфатом натрия в восстанавливающих условиях при нагревании Полноту денатурации gB контролировали по реактивности денатурированного gB с gB-специфическими мкАТ, направленными к конформационным эпитопам gB Показано, что денатурация гликопротеина приводит к снижению связывания gB с иммобилизованным на сефарозе гепарином на 50-80% (Таблица 2) Эти данные свидетельствуют о том, что гепарансульфат-связывающая активность гликопротеина gB ВБА зависит от целостности третичной структуры гликопротеина, т е гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере частично, конформационно-зависимым

2.4. Взаимодействие гликопротеина gD с клетками

Ранее был идентифицирован ряд клеточных рецепторов gD альфагерпесвирусов (Spear, 2004) В экспериментах с очищенным гликопротеином gD ВБА мы показали, что гликопротеины gD и gB ВБА не конкурируют между собой за связывание с клетками, те gD и gB ВБА имеют различные сайты связывания на плазматической клеточной

мембране (данные не приведены) Мы также показали, что клеточные гепарансульфаты не участвуют в связывании гликопротеина §£) ВБА (данные не приведены)

Таблица 2 Влияние денатурации гликопротеина §В ВБА на связывание с гепарин-сефарозой

Условия денатурации gB Количество связанного с гепарин-сефарозой (%)*

Без денатурации 20 мМ ДТТ, 37°С, 1 ч 20 мМ ДТТ, 70°С, 15 мин 3% ДСН, 37°С, 1 ч 3% ДСН, 70°С, 15 мин 3% ДСН + 20 мМ ДТТ, 37°С, 1 ч 3% ДСН + 20 мМ ДТТ, 70°С, 15 мин 100 93 85 84 75 33 26

* представлены данные по связыванию [•'^-меченого ¿В с гепарин-сефарозой, выраженные в процентах Эффективность связывания неденатурированного £В принимали за 100%

2.5. Изучение взаимодействия вирусных гликопротеинов gD и gB ВБА с клетками с использованием метода реконструированных липосом

На следующем этапе нашей работы мы провели реконструкцию гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом на основе фосфатидилхолина и исследовали взаимодействие реконструированных протеолипосом с клетками Реконструкцию вирусных гликопротеинов в мембраны липосом осуществляли методом диализа детергента ф-октилгликозида), с последующим осаждением полученных виросом ультрацентрифугированием С помощью электронной микроскопии показано, что виросомы имеют размер 40-200 нм Виросомы были непроницаемы для одновалентных катионов, что свидетельствовало о целостности мембран реконструированных протеолипосом Было установлено, что в мембранах реконструированных виросом 9095% гликопротеина и 95-98% гликопротеина §В ориентированы также, как в вирионах ВБА - наружу эктодоменными фрагментами

Для проведения экспериментов по связыванию виросом с клетками использовали [358]-меченные виросомы или виросомы, нагруженные ФИТЦ или пероксидазой (ПХ) На рисунке 8 представлены фотографии клеток, с которыми связались ФИТЦ- и ПХ-содержащие виросомы

Виросомы дозо-зависимо связывались с клетками, и при высокой концентрации виросом наблюдалась тенденция к насыщению связывания (Рис 9) На клетках МОВК связывалось в 2-3 раза больше виросом по сравнению с клетками ВНК-21 Показано, что [358]-виросомы конкурировали с вирионами ВБА и гликопротеином gB за связывание с мембранными клеточными структурами (Рис 10), что свидетельствовало о специфичности их взаимодействия с клетками и важной роли гликопротеина в адсорбции виросом на клетках Гепарин эффективно ингибировал связывание виросом с клетками 50%-ное ингибирование связывания виросом с клетками наблюдалось при концентрации гепарина 1-2 мкг/мл (Рис 11) Это свидетельствовало о том, что гепарансульфаты плазматических клеточных мембран являются основными

йяэываюшими структурами, ответствекными та первичную адсорбцию вируса и виросом на к легки.

Рис. 8. Связывание реконструированных протещшпосом с клетками Клетки MDBK инкубировали с ФИТ11- и 11Х-вироеомами ((а) и (в), соответственно) и с нерсконструированными ФИТЦ- и ПХ-ли посомам и ((б) и (г), соответственно). Об. 40 <, ок. 15х.

Рис, 9. Дозо-зависимос связывание реконструированных про-теолипосом с клетками ВНК-2 ] (•) и МОВК (о). Клетки инкубировали и присутствии различных разведений IIX- или [5 ]-меченых в просом, после чего определяли количество связавшихся с клетками нирооом по уровню радиоактивности или активности ПХ, ассоциирован ной с клегками.

Рис. 10, Специфичность связывании реконструированпых липосом С клетками. 131S [меченные реконструированные протеолииоеомы п различных разведениях инкубировали I ч при 4°С с клепками Ml) В К в отсутствие конкурентов (•) или прису гетиии конкурентов очищенных внрионов 11Г>Л (Л), очищенного гликопротеина gB ВБА (100 мкг/мл) (о) или гепарина 50 мкг/мл (Т). После промывки определяли радиоактивность связавшихся с клетками виросом.

Рис. 11 Влияние гепарина на связывание реконструированных липосом (О) и вирионов ВБА (•) с клетками МЪВК

[358]-меченые виросомы или вирионы ВБА инкубировали в течение 1 ч при 4°С с клетками МОВК в присутствии различных концентраций гепарина После промывки определяли

радиоактивность связавшихся с клетками виросом или вирионов

Мы показали, что при инкубации адсорбированных на клетках виросом в течение 1 ч при 37°С, 25-40% протеолипосом проникали внутрь клеток Это свидетельствовало о том, что виросомы, связавшиеся с клеточной поверхностью, активно поглощались клетками

Полученные с использованием реконструированных липосом результаты подтвердили, что гликопротеин gB ВБА играет важную роль в связывании вируса с клетками и что гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в первичной адсорбции вируса на клетках Очевидно, что реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом является перспективным методом исследования взаимодействия гликопротеинов альфагерпесвирусов с плазматическими клеточными мембранами Кроме этого, виросомы на основе гликопротеинов ВБА могут рассматриваться в качестве эффективного средства доставки биологически-активных веществ в клетки

3. Изучение антигенной структуры гликопротеина gD ВБА и его роли в индукции противовирусного иммунитета

Следующий этап работы был посвящен изучению антигенной структуры гликопротеина gD ВБА и его роли в индукции противовирусного иммунитета

3.1. Топографическое эпитопное картирование гликопротеина gD ВБА

Топографическое картирование эпитопов gD ВБА проводили с помощью конкурентного ИФА с использованием полученных gD-специфических мкАТ На рис 12 представлены данные эпитопного картирования gD ВБА и топологическая эпитопная карта gD На гликопротеине выявлено 7 топологически отличных эпитопов (В, С, D, Е, G, H, J), реагирующих с индивидуальными мкАТ, и 2 антигенных домена (A, F), с которыми реагируют более одного антитела Отдельные эпитопы частично перекрывались между собой Полученное из лаборатории Т Меттенлейтера антитело Ь51-с5-1 реагировало с антигенным доменом А, антитело 4bl-lcll реагировало с эпитопами D, Е и F, антитело с14-с27 не конкурировало ни с одним из полученных нами антител, те представляло топологически отдельный эпитоп С учетом этого, в

антигенной структуре гликопротеина §0 ВБА можно выделить как минимум 10 топологически отличных эпигонов и эештопных групп.

ПХ-конъюгаты мкАТ

Илз 41Л1 11:3 П75 41.11 131 7*Л 4 14а 1 (LT С it7 ЗЗЛ 11/»

[ Д

шзНН

1 — S

41 ,'11 ЯЕ

Н V3I

СJ ТЦ4

2 3 14«

: U'IS

и о ¡Л

139

а 11/19

4Ы- Ш

tl4-

Ml- j&L ■

Ингибировавие > 30%

Ингибирование 3040%

^ Ич. и сурова нио с 30%

Эпягопнаи карта гликопротеина gD

Рис. 12, Эпитонное картирование гликопротеина gD ВБА с помощью §0-специфических мо поклон ал ышх антител методом конкурентного ИФА. Оценивали конкуренцию §0-специфических мкАТ с ПХ-КОНЪЮ гатами gD-спсцифических мкАТ за связывание с антигенными детерминантами гликопротеина gD ВБА. При ингибировании связывания ПХ-конъюгата антителом более чем на 30% считали, что антитело и ПХ-конъюгат направлены к одной антигенной детерминанте.

3.2, Характеристика титопов гликопротеина gD BKA

Исследовали реактивность полученных мкАТ с ели ко протеином gD в непрямом ИФА после термальной денатурации gD в восстанавливающих я не восстанавливающих условиях. Среди полученных нами gD-специфических мкАТ, только 2 мкАТ - 5/7 и 33/9 не меняли реактивности при денатурации gD (данные не представлены). Эпигоны этих мкАТ были отнесены к линейным эпитопам. так как их реактивность с антителами не зависела от нативной koi г формации gD. Эпигоны остальных 10 gD-специфических мкАТ оказались чувствительными к денатурирующим воздействиям и были отнесены к группе кон форм анионных эп иго по в, зависящих от нативной конфирмации глнкопротеинов. Следует отметить, что кок форм анионные эпнтопы gD обнаружили высокую чувствительность к восстанавливающим агентам, что свидетельствовало о важной роли дисульфидных связей в формировании антигенной структуры этого гликопротеина BKA.

Все 12 полученных gD-специфических мкАТ и 3 мкАТ из лаборатории Т, Меттенлейтера реагировали с гл и ко протеи ном gD всех исследованных нами вирусных штаммов и и:! оля то и {4 вирулентных лабораторных штамма, 6 вакцинных штаммов и 10 полевых изолятов). Полученные данные свидетельствовали о высокой консервативности выявленных нами эпитопов гликопротеина gD у различных штаммов ВБА.

.О. Эпитоп-специфичеекий гуморальный иммунный ответ на тикопротеин gD

В данной работе неследовали гуморальный иммунный ответ на гликоиротеин gD BÉA при инфицировании и иммунизации животных вирусом. Исследования проводили с помощью непрямого ИФА с применением аффииио-очищен но го gD. Показано, что при денатурации очищенного gD наблюдалось резкое снижение реактивности гликопротенпа с сыворотками от Инфицированных и иммунизированных животных. Результаты свидетельствовали о том. что в сыворотках животных, инфицированных или иммунизированных BVîA. антитела против конфирмационных эпигонов gD составляют значительную часть от всех gD-специфических антител.

С помощью конкурентного ИФА с использованием gD-специфических мкАТ на гликопротеипс gD были выделены 3 группы эпигонов, в зависимости от их способности индуцировать образование антител (Рис. 13). К иммунодОминантныM эпигонам, индуцирующей при инфицировании животных антитела в высоких титрах, относились эпигоны МкАТ 38/22, 42/11. 3/32 и 78/14 (топологические эпигоны A. D и Е).

Рис, 13. Ohhtoi ¡-специфический tyморальный иммунный ответ на гликоиротеин gD при

инфицировании свиней ВЬА (ближний ряд столбцов), при однократной иммунизации свиней против ЬА (средний ряд столбцов} и при многократной иммунизации свиней вакциной против SA (дальний рял столбцов). Представлены титры эпитоп-спсцифических антител в сыворотках животных.

Остальные эпигоны gD индуцировали антитела в меньших титрах по сравнению е выявленными иммуподомииаптными эпигонами. Группа имму но доминантных эпигонов gD состояла исключительно из конфирмационных эпигонов; линейные эпигоны, в целом, индуцировали антитела » более низких титрах в сравнении с коиформационными эпитопами. Показано, чго при многократной иммунизации различия между кмМу но доминантны м и эпигонами и остальными эпитопами gD стирались (Рис. 13).

S.4. Влияние gD-специфических мкА Т на развитие вирусной инфекции in vitro

Показано, что большинство gD-спецнфических МкАТ нейтрализовали вирус в отсутствие комплемента (Таблица 3). Все gD-специфические мкАТ нейтрализовали вирус в присутствии комплемента, при этом вирус-нейтрализующая активность мкАТ увеличивалась в 5-30 раз.

Установлено, что семь gD-специфических мкАТ и поликлональпая сыворотка против аффинно-очищеннЬго gD нейтрализовали вирус (без комплемента) на этапе его проникновения в клетку (Таблица 3),

— .-)

Эпнтопы глнко протеин a g"

Показано, что поликлональная сыворотка против аффинно-очищенного gD и все gD-cпeцифичecкиe мкАТ ингабировали распространение вируса от клетки к клетке, что приводило к уменьшению размеров вирусных бляшек (Таблица 3)

Следует отметить, что антитела, нейтрализующие вирус, блокирующие проникновение вируса в клетки и распространение вируса от клетки к клетке, были направлены к различным топологическим эпитопам и антигенным доменам gD

Таблица 3 Влияние gD-специфических мкАТ на развитие вирусной инфекции in vitro

Номер мкАТ Нейтрализация вируса in vitro # Блокирование проникновения вируса в клетки* Ингибирование распространения вируса от клетки к клетке**

M комплемент О комплемент

38/22 + (<1 мкг/мл) - - +

42/11 + (<1 мкг/мл) + (3 мкг/мл) + +

12/13 + (<1 мкг/мл) + (10 мкг/мл) + +

17/25 + (3 мкг/мл) + (30 мкг/мл) + +

41/11 + (3 мкг/мл) - - +

3/32 + (1 мкг/мл) + (30 мкг/мл) - +

78/14 + (3 мкг/мл) - - +

14/2 + (<1 мкг/мл) + (3 мкг/мл) + +

18/18 + (1 мкг/мл) + (10 мкг/мл) + +

5/7 + (3 мкг/мл) + (10 мкг/мл) + +

33/9 + (3 мкг/мл) + (50 мкг/мл) - +

11/15 + (10 мкг/мл) - + +

Анти-gB мкАТ 34/2 + (3 мкг/мл) + (50 мкг/мл) - +

Анти-gB мкАТ 26/33 + (10 мкг/мл) + (100 мкг/мл) - +

Анти-gE мкАТ 75/7 - - -

Анти-gE мкАТ 101/9 - - -

Анги-gD сыворотка 1 5120 1 512 + +

Анти-gB сыворотка 1 10240 1 512 + +

# - в скобках представлены концентрации мкАТ (мкг/мл), дающие 50%-ное ингибирование инфекционности вируса, * - считали, что антитела не ингабировали проникновение вируса, если уменьшение количества сформированных вирусных бляшек не превышало 20% при концентрации антител 100 мкг/мл, ** - считали, что антитела влияли на распространение вируса от клетки к клетке, если при концентрации антител 100 мкг/мл размеры вирусных бляшек уменьшались более чем в 1,5 раза

3.5. Пассивная иммунизация мышей gD-cneцuфuчecкuмu антителами

В экспериментах по пассивной иммунизации животных §р-специфическими антителами показано, что большинство исследованных мкАТ обладало защитным потенциалом 40-100% мышей выживало после контрольного инфицирования вирусом (Таблица 4) Это свидетельствовало о том, что антитела против индуцирующиеся в организме инфицированных и вакцинированных животных, вероятно, играют важную роль в защите животных от инфекции и в элиминации вируса из инфицированного организма

Таблица 4. Пассивная защита животных с помощью ¡^-специфических антител

Специфичность антител Номер Всего Количество % выживших

мкАТ животных выживших животных животных

38/22 10 7 70

42/11 14 14 100

12/13 10 7 70

17/25 9 5 56

41/11 14 7 50

Гликопротеин 3/32 10 8 80

78/14 10 9 90

14/2 11 4 36

18/18 13 8 62

5/7 13 8 62

11/15 10 7 70

Гликопротеин ¿В 34/2 7 7 100

26/33 7 6 86

Гликопротеин ^ 75/7 7 0 0

101/9 7 0 0

5-бром-2'-дезоксиуридин В-32 7 0 0

Контроль 10 0 0

3.6. Активная иммунизация мышей гпикопротеином ВБА

Мыши, 2-кратно иммунизированные очищенными гликопротеинами ^ и давали выраженный специфический гуморальный иммунный ответ на соответствующие гликопротеины (титры антител 1 2500 - 1 100000) При иммунизирующей дозе гликопротеина 1 мкг/мышь обеспечивалась полная защита мышей от

инфицирования. Индукция защитного иммунитета при иммунизации §£> была несколько выше по сравнению с гликопротеином gB ВБА Совместная иммунизация низкими дозами гликопротеинов и ВБА (0,1 мкг каждого гликопротеина) не сопровождалась существенным увеличением защиты от инфицирования (Таблица 5), т.е синергического эффекта в индукции защитного иммунитета двух основных гликопротеинов ВБА не наблюдалось Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что гликопротеин ¿О является мощным индуктором защитного иммунитета при активной иммунизации мышей, что согласуется с данными других авторов

3.7. Индукция противовирусного иммунитета при иммунизации мышей вирусными антигенами, реконструированными в мембраны виросом

Исследовали иммуногенность гликопротеинов ВБА, реконструированных в мембраны искусственных липосом Мышей иммунизировали разными дозами виросом однократно, внутримышечно Титры антител на гликопротеины ¿Р и £В ВБА были в 4-6 раз выше по сравнению с контрольными животными, иммунизированными переконструированными вирусными белками (Таблица 6) При иммунизации мышей виросомами 50%-ная защита животных наблюдалась при иммунизирующей дозе 0,3

мкг/мышь (по гликопротеину ВБА), в то время как при иммунизации животных переконструированными гликопротеинами, 50%-ная защита животных наблюдалась при иммунизирующей дозе 3 мкг/мышь (по гликопротеину gB ВБА) Полученные данные указывают на то, что реконструкция гликопротеинов вируса болезни Ауески в мембраны липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности Это позволяет рассматривать реконструкцию белков альфагерпесвирусов в мембраны липосом в качестве перспективного подхода к созданию высокоэффективных вакцинных препаратов против альфагерпесвирусных инфекций

Таблица 5 Иммуногенность гликопротеина ВБА при активной иммунизации мышей

Антиген Иммунизир доза (мкг/мышь) Титр антител в ИФА* Результаты экспериментального инфицирования мышей

анти-gD анти-gB Общее количество животных % выживших животных

Гликопротеин вР 0,1 1 2500 - 15 67

0,3 1-7000 - 15 85

1 1 100000 - 15 100

10 1 100000 - 15 93

Гликопротеин gB 0.1 - 1 1000 15 20

0,3 - 1 10000 15 53

1 - 1 30000 15 73

10 - 1 100000 15 73

Гликопротеины ЯриеВ 0,1+0,1 1 3000 1 1000 15 67

Инактивиро-ванный вирус но 1 500 1 1000 15 100

Контроль 15 0

* - титр антител определяли в непрямом ИФА с использованием аффинно-очищенных гликопротеинов и §В для сорбции, н о - не определяли

Таблица 6 Иммуногенность виросом б экспериментах по активной иммунизации мышей

Тип антигена Доза антигена (по гликопроетину gB) Титр антител Процент выживших животных после инфицирования

Анти-gD Анти-gB вн- антитела

Виросомы 0,1 мкг 1 125 1 410 1 4 31%

0,3 мкг 1 390 1 840 1 8 47%

1 мкг 1.1350 1 2045 1 32 73%

3 мкг 1 3400 1 7120 1 128 100%

Вирусный лизат 0,1 мкг <1 50 1 125 <1 4 12%

0,3 мкг 1 155 1 230 <14 27%

1 мкг 1-370 1 550 1-8 40%

3 мкг 1 730 1-1250 1 16 51%

Контроль - - - 0%

В группах было не менее 15 животных

3.8. Разработка ИФА для серологической диагностики БА

На основе полученных мкАТ, направленных против иммунодоминантных эпитопов gD, разработан блокирующий прямой ИФА (ôn-gD-ИФА) для выявления gD-специфических антител в сыворотках животных В основе ôn-gD-ИФА лежит конкуренция конъюгатов gD-специфических мкАТ и эпитоп-специфических антител сыворотки за связывание с эпитопом гликопротеина gD, сорбированного на твердой фазе. В результате проведенной работы был разработан ôn-gD-ИФА на основе пероксидазного конъюгата gD-специфического мкАТ 42/11 и аффинно-очшценного гликопротеина gD

Чувствительность и специфичность ôn-gD-ИФА оценивали с использованием большой панели сывороток от неинфицированных, инфицированных и вакцинированных животных Чувствительность ôn-gD-ИФА составила 99%, специфичность 100% По данным параметрам, а также по пороговой чувствительности, разработанный ôn-gD-ИФА не уступал другим вариантам ИФА, разработанным нами ранее, а также коммерчески доступным тест-системам для диагностики БА Разработанный 6n-gD-H®A имеет значительный потенциал в качестве скринингового и подтверждающего теста для серологической диагностики БА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью данной работы было изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами чувствительных клеток и их роли в индукции противовирусного иммунитета Полученные нами данные позволили заключить, что гликопротеин gB играет важную роль в адсорбции ВБА на плазматические мембраны чувствительных клеток и что гепарансульфаты играют основную роль в связывании gB с клетками Кроме этого, ряд полученных данных свидетельствуют в пользу того, что кроме гапарансульфатов на плазматической клеточной мембране имеется дополнительный(е) сайт(ы) связывания гликопротеина gB ВБА неизвестной природы Возможно, что этот дополнительный сайт связывания участвует в формировании комплекса вирусных и клеточных белков, необходимого для слияния вирусной и клеточной мембраны Полученные данные закладывают основу для дальнейшего изучения функционирования гликопротеина gB ВБА на этапе проникновения вируса в клетку и представляют большой интерес с точки зрения поиска противовирусных препаратов, ингибирующих взаимодействие гликопротеина gB ВБА с клеточными структурами

В результате проведенной работы по изучению индукции противовирусного иммунитета гликопротеином gD ВБА мы показали, что gD играет важную роль в индукции противовирусного иммунитета gD ВБА индуцирует мощный защитный иммунитет при активной иммунизации gD-специфические поликлональные и моноклональные антитела способны нейтрализовать вирус m vitro, ингибировать проникновение вируса в клетки и распространение вируса от клетки к клетке, а также пассивно защищать мышей от летального инфицирования вирусом Все эти механизмы могут быть задействованы в формировании защитного противовирусного иммунитета при инфицировании и иммунизации животных вирусом Очевидно, что гликопротеин gD является одним из основных кандидатов, наряду с гликопротеином gB, на

использование в качестве иммуногенов в вакцинах нового поколения против БА (субъединичные и ДНК-вакцины)

Обнаруженное в работе выраженное повышение иммуногенности вирусных гликопротеинов ВБА при их реконструкции в мембраны липосом открывает новые возможности в создании эффективных липосомальных вакцинных препаратов против альфагерпесвирусных инфекций

ВЫВОДЫ

1 Получена и охарактеризована панель моноклональных антител к гликопротеинам gD и gB ВБА С использованием полученных антител разработаны методы иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB ВБА

2 Гликопротеин gB ВБА принимает участие в процессе адсорбции вируса на клетки in vitro Гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками Гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере частично, конформационно-зависимым

3 Реконструированы гликопротеины ВБА в мембраны искусственных липосом и исследовано их взаимодействие с клетками Протеолипосомы специфически связывались с плазматическими мембранами клеток и эффективно интернализовались клетками Полученные протеолипосомы являются удобной моделью для изучения взаимодействия вирусных гликопротеинов с клетками и могут быть использованы для доставки биологически-активных веществ в клетки

4. Исследована антигенная структура гликопротеина gD ВБА На гликопротеине идентифицировано 10 топологически различных эпитопов и эпитопных групп, большинство из которых являются конформационными Показана высокая консервативность антигенной структуры gD ВБА

5 Гликопротеин gD ВБА индуцирует выраженный гуморальный и защитный противовирусный иммунитет Основная роль в индукции гуморального иммунного ответа принадлежит конформационным эпитопам gD С использованием gD-специфических мкАТ разработан эффективный метод конкурентного gD-ИФА для серологической диагностики болезни Ауески

6 Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности Это позволяет рассматривать реконструкцию белков альфагерпесвирусов в мембраны липосом в качестве перспективного подхода к созданию эффективных липосомальных вакцинных препаратов против альфагерпесных инфекций

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Morenkov О S, Smirnov S V, Vrublevskava VV Isolation of mutants of Aujeszky's disease virus with antigenically altered glycoprotein by affinity chromatography using monoclonal antibodies //./ Virol Methods 1999 Jan, 77 (i)p 101-108

2 Моренков О С, Собко Ю А, Панченко О А, Сергеев В А, Врублевская В В Разработка скрининговых и подтверждающих иммуноферментных тестов для

серологической диагностики болезни Ауески // Научный вестник национального аграрного университета Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии животных», 2001, с 47-49

3 Vrublevskava V V . Kornev А N, Smirnov S V, Morenkov О S Cell-binding properties of glycoprotein В of Aujeszky's disease virus // Virus research 2002 Jun, 86 (1-2), 7-19

4 Врублевская В В . Винокуров M Г, Холодков О А, Корнев А H, Моренков О С Встраивание гликопротеинов вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus 1) в мембраны искусственных липосом и их взаимодействие с клетками // Вопросы вирусологии, 2004, № 2, с 32-37

5 Врублевская В В. Мусиенко В С, Моренков О С Взаимодействие гликопротеина gB вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus I) с клеточными гепарансульфатами // Вопросы вирусологии, 2005, № 5 40-43

6 Врублевская В В . Мусиенко В С , Моренков О С Иммунологическая характеристика гликопротеина вируса болезни Ауески // Вопросы вирусологии, 2007, № 52 (3), 33-37

Тезисы докладов

1 Morenkov, О S , Sobko, Yu А, Panchenko, О А, Smirnov, S V , Vrublevskava. V V and Sergeev, V A Development and comparison of ELISA tests for the detection of swine infected with Aujeszky's disease virus among non-vaccinated animals // Proc IPVS Congress, Melbourne, 17-20 September 2000

2 Врублевская В В , Моренков О С. Взаимодействие гликопротеина gB вируса болезни Ауески с плазматическими мембранами клеток ВНК-21 // Тезисы 5-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2001 г, с 116

3 Врублевская В В . Моренков О С , Корнев А H Взаимодействие гликопротеина gB вируса болезни ауески (Suid herpesvirus 1) с гепаран-сульфатами плазматических мембран клеток // Тезисы XIV международной молодежной научной школы Москва, 11-15 февраля 2002 г, с 19

4 Врублевская В В , Корнев А H, Моренков О С Исследование гепарин-связывающей активности гликопротеина gB вируса болезни ауески (Suid herpesvirus 1) // Тезисы 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2002 г, с 231

5 Врублевская В В, Винокуров M Г, Корнев А H, Моренков О С Реконструкция гликопротеинов вируса болезни ауески (Suid herpesvirus 1) в мембраны липосом и исследование их взаимодействия с клетками // Тезисы 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2002 г, с 232

6 Врублевская В В . Корнев А H, Моренков О.С Разработка метода очистки гликопротеина gD вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus 1) с помощью аффинной хроматографии на основе моноклональных антител // Тезисы 7-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2003 г, с. 320

7 Врублевская В В, Моренков О С Иммунологическая характеристика гликопротеина gD вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus 1) // Тезисы 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2004 г, с 50

8 Врублевская В В . Моренков О С Изучение взаимодействия гликопротеина gD вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus Г) с плазматическими мембранами клеток ВНК-21 //Тезисы 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2004 г, с 51

9 Врублевская В В. Моренков О С Исследование иммуногенности гликопротеинов вируса болезни АУЕСКИ (SUID HERPESVIRUS 1) реконструированных в мембраны искусственных липосом // Тезисы 9-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2005 г, с 73

Подписано в печать 12 09 2007 г Исполнено 12 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ №700 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Врублевская, Вероника Валерьевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика болезни Ауески

1.2. Общая характеристика вируса болезни Ауески

1.3. Структурно-функциональная характеристика гликопротеинов gB и gD ВБА

1.3.1. Структурная характеристика гликопротеина gB ВБА

1.3.2. Структурная характеристика гликопротеина gD ВБА

1.3.3. Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в проникновении вируса в клетки

1.3.3.1. Первичное гепарансульфат-зависимое взаимодействие альфагерпесвирусов с клетками

1.3.3.2. ГС-независимое связывание альфагерпесвирусов с клетками

1.3.3.3. Слияние вирусной оболочки и плазматической клеточной мембраной

1.3.3.4. Распространение альфагерпесвирусов от клетки к клетке

1.4. Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в индукции противовирусного иммунитета

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета"

Актуальность проблемы

Альфагерпесвирусы (семейство Herpesviridae, подсемейство Alphaherpesvirinae) включают в себя ряд опасных патогенов человека и животных (вирусы простого герпеса человека 1 и 2 типа, вирус ветрянки и опоясывающего лишая, вирус инфекционного ринотрахеита, вирус болезни Ауески и др.). В оболочке альфагерпесвирусов насчитывается более 10 гликопротеинов. В ряду других гликопротеинов, гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов занимают особое место. У отдельных альфагерпесвирусов гликопротеин gB, наряду с гликопротеином gC, играет важную роль в первичной гепарансульфат (ГС)-зависимой адсорбции вируса на клетках (Li et al., 1995; Byrne et al., 1995; Herold et al., 1994). Гликопротеин gD участвует в процессе формирования более стабильного, ГС-независимого связывания вирусов с плазматической клеточной мембраной, которое следует за первичной адсорбцией вируса (Reske et al., 2007; McClain and Fuller, 1994; Karger and Mettenleiter, 1993). К настоящему времени идентифицированы клеточные рецепторы гликопротеина gD (Spear, 2004; Spear and Longnecker, 2003). После стабильного связывания альфагерпесвирусов с клетками происходит слияние вирусной оболочки с плазматической клеточной мембраной. В данном процессе участвуют вирусные гликопротеины gB, gD и комплекс gH-gL (Campadelli-Fiume et al., 2007; Spear, 2004). Гликопротеин gK, а также ряд белков тегумента, играют модулирующую роль в этом процессе (Spear et al., 2000; Roizmanand Spear, 1996). Кроме того, gB альфагерпесвирусов необходим для распространения вируса от клетки к клетке (Nixdorf et al., 2000) и проявления синцитиального фенотипа вирусов (Navarro et al., 1992).

Несмотря на интенсивные исследования молекулярной биологии альфагерпесвирусов, механизмы взаимодействия гликопротеинов gB и gD с клетками остаются недостаточно исследованными. Имеются лишь фрагментарные данные, касающиеся клеточных белков, вовлеченных в процессы взаимодействия с гликопротеином gB альфагерпесвирусов, не определена роль клеточных белков в слиянии вирусной и клеточной мембран. Изучение взаимодействия gB и gD альфагерпесвирусов с клеточными рецепторными структурами представляет не только значительный теоретический интерес, но и может явиться основой для разработки противовирусных препаратов, так как блокирование взаимодействия клеточных рецепторов и вирусных антирецепторов представляется перспективным направлением в создании средств защиты от вирусных инфекций.

Кроме центральной роли гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в проникновении вирусов в клетки, эти гликопротеины так же играют важнейшую роль в индукции противовирусного иммунитета. Для многих альфагерпесвирусов показано, что гликопротеины gD и gB являются основными мишенями противовирусного иммунитета, индуцируя как гуморальный, так и клеточный иммунитет (Hong et al., 2002; van Rooij et al., 2000; Erratum, 2000; Packiarajah et al., 1998). В настоящее время гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов рассматриваются в качестве основных кандидатов на использование в вакцинах нового поколения (субъединичные вакцины, ДНК-вакцины).

Вирус болезни Ауески (ВБА, Suid herpesvirus 1), является типичным представителем альфагерпесвирусов и поражает многие виды диких и домашних животных (Wittman et al., 1991). Гликопротеины gB и gD ВБА характеризуются высоким уровнем структурной и функциональной гомологии с соответствующими гомологами других альфагерпесвирусов (Mettenleiter, 1994). Так, например, гликопротеин gB ВБА способен комплементировать gB-негативный мутант вируса простого герпеса человека 1-го типа; gB вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота способен комплементировать gB-негативный мутант ВБА (Miethke et al., 1995; Knopp and Mettenleiter, 1992; Rauh et al., 1991). Учитывая высокий уровень структурно-функциональной гомологии гликопротеинов gB и gD ВБА и других альфагерпесвирусов, ВБА является удобной моделью для изучения молекулярных механизмов взаимодействия гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов с рецепторными структурами плазматических мембран чувствительных клеток, а также изучения их роли в индукции защитного иммунитета. Достоинством этой модели является апатогенность вируса для человека, легкость культивирования вируса на различных культурах клеток и наличие лабораторных моделей животных, чувствительных к вирусу (мыши, морские свинки, кролики).

Цель и задачи работы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить и охарактеризовать панель моноклональных антител к гликопротеинам gD и gB ВБА и разработать методы иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB.

2. Исследовать взаимодействие гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами чувствительных клеток.

3. Реконструировать вирусные гликопротеины в мембраны искусственных липосом и исследовать с помощью полученных протеолипосом роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на плазматические мембраны чувствительных клеток.

4. Исследовать антигенную структуру гликопротеина gD ВБА и индукцию гуморального иммунитета на этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных.

5. Изучить роль гликопротеинов gD и gB ВБА в индукции противовирусного иммунитета с использованием очищенных гликопротеинов и реконструированных липосом.

Научная новизна работы

1. Впервые показано, что гликопротеин gB ВБА играет важную роль в адсорбции вируса на клетках.

2. Впервые доказано, что гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками. Установлено, что гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере, частично, конформационно-зависимым.

3. Впервые проведена реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом. Полученные протеолипосомы (виросомы) специфически связывались с плазматическими клеточными мембранами и эффективно интернализовались клетками. С помощью виросом подтверждена важная роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на клетках. Продемонстрировано, что виросомы на основе белков ВБА являются удобной моделью для изучения взаимодействия вирусных гликопротеинов с клетками и могут быть использованы для доставки биологически-активных молекул в клетки.

4. Впервые показано, что реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности.

6. Показана высокая консервативность антигенной структуры гликопротеина gD ВБА.

Практическая значимость работы

1. Полученные в работе данные, касающиеся роли гликопротеинов ВБА в индукции противовирусного защитного иммунитета, а также иммуногенности липосомальных вирусных антигенов, могут лечь в основу разработки субъединичных и липосомальных вакцин против болезни Ауески.

2. Разработан иммуноферментный метод серологической диагностики болезни Ауески, основанный на выявлении в сыворотке животных антител к гликопротеину gD ВБА, который по своим характеристикам не уступает имеющимся тест-системам для диагностики болезни Ауески.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Гликопротеин gB вируса болезни Ауески играет важную роль в адсорбции вируса на клетках in vitro.

2. Гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками. Гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере, частично, конформационно-зависимым.

3. Гликопротеины gD и gB ВБА имеют различные сайты связывания на плазматической клеточной мембране. Клеточные гепарансульфаты не участвуют в связывании гликопротеина gD с клетками.

4. Конформационные эпитопы гликопротеина gD ВБА играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа при инфицировании и иммунизации животных.

5. Гликопротеин gD ВБА играет важную роль в индукции защитного иммунитета при инфицировании и иммунизации животных.

6. Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Врублевская, Вероника Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Получена и охарактеризована панель моноклональных антител к гликопротеинам gD и gB ВБА. С использованием полученных антител разработаны методы иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB ВБА.

2. Гликопротеин gB ВБА принимает участие в процессе адсорбции вируса на клетки in vitro. Гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками. Гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере частично, конформационно-зависимым.

3. Реконструированы гликопротеины ВБА в мембраны искусственных липосом и исследовано их взаимодействие с клетками. Протеолипосомы специфически связывались с плазматическими мембранами клеток и эффективно интернализовались клетками. Полученные протеолипосомы являются удобной моделью для изучения взаимодействия вирусных гликопротеинов с клетками и могут быть использованы для доставки биологически-активных веществ в клетки.

4. Исследована антигенная структура гликопротеина gD ВБА. На гликопротеине идентифицировано 10 топологически различных эпитопов и эпитопных групп, большинство из которых являются конформационными. Показана высокая консервативность антигенной структуры gD ВБА.

5. Гликопротеин gD ВБА индуцирует выраженный гуморальный и защитный противовирусный иммунитет. Основная роль в индукции гуморального иммунного ответа принадлежит конформационным эпитопам gD. С использованием gD-специфических мкАТ разработан эффективный метод конкурентного gD-ИФА для серологической диагностики болезни Ауески.

6. Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности. Это позволяет рассматривать реконструкцию белков альфагерпесвирусов в мембраны липосом в качестве перспективного подхода к созданию эффективных липосомальных вакцинных препаратов против альфагерпесных инфекций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью данной работы было изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD вируса болезни Ауески с плазматическими мембранами чувствительных клеток и их роли в индукции противовирусного иммунитета.

Полученные нами данные позволили заключить, что гликопротеин gB ВБА принимает участие в адсорбции ВБА на плазматических мембранах чувствительных клеток и что гепарансульфаты играют основную роль в связывании gB с клетками. Охарактеризован ГС-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА. Доказано, что ГС-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере частично, конформационно-зависимым. Кроме этого, ряд полученных данных свидетельствуют в пользу того, что кроме гапарансульфатов на плазматической клеточной мембране имеется дополнительный(е) сайт(ы) связывания гликопротеина gB ВБА неизвестной природы. Возможно, что этот дополнительный сайт связывания участвует в формировании комплекса вирусных и клеточных белков, необходимого для слияния- вирусной и клеточной мембраны. Установлено, что ГС клеток не участвуют в связывании гликопротеина gD ВБА с клетками и что сайты связывания гликопротеинов gB и gD ВБА на клетках различны. Полученные данные закладывают основу для дальнейшего изучения функционирования гликопротеина gB ВБА на этапе проникновения вируса в клетку и представляют большой интерес с точки зрения поиска противовирусных препаратов, ингибирующих взаимодействие гликопротеина gB ВБА с клеточными рецепторными структурами.

В результате проведенной работы по изучению индукции противовирусного иммунитета на гликопротеин gD ВБА мы показали, что gD играет важную роль в индукции противовирусного иммунитета. Гликопротеин gD ВБА индуцирует мощный защитный иммунитет при активной иммунизации, не уступая в эффективности основному вирусному антигену - гликопротеину gB. Показано, что gD-специфические антитела проявляют мощную противовирусную активность in vitro. Они способны нейтрализовать вирус in vitro, ингибировать проникновение вируса в клетки и распространение вируса от клетки к клетке. В экспериментах на животных показано, что gD-специфические антитела способны пассивно защищать мышей от летального инфицирования вирусом. Полученные данные свидетельствует, что антитела против gD ВБА, индуцирующиеся в организме инфицированных и вакцинированных животных, вероятно играют важную роль в защите животных от инфекции и в элиминации вируса из инфицированного организма. Очевидно, что гликопротеин gD ВБА является одним из основных кандидатов, наряду с гликопротеином на использование в качестве иммуногенов в вакцинах нового поколения против БА (субъединичные и ДНК-вакцины).

Мы впервые обнаружили выраженное повышение иммуногенности гликопротеинов ВБА при их реконструкции в мембраны липосом. Это открывает новые возможности в создании эффективных липосомальных вакцинных препаратов против альфагерпесвирусных инфекций. Кроме этого, на модели маркерного ферменты - пероксидазы хрена мы показали, что протеолипосомы на основе гликопротеинов ВБА способны эффективно доставлять препараты, заключенные в липосомах, в клетки. Без сомнения, виросомы на основе белков альфагерпесвирусов имеют перспективу в качестве средства доставки биологически-активных веществ в клетки.

Разработанный нами на основе полученных gD-cпeцифичecкиx моноклональных антител иммуноферментный анализ для диагностики болезни Ауески не уступал имеющимся аналогичным тест-системам, что определяет перспективу разработанного gD-ИФA в диагностике БА, особено в качестве подтверждающего теста.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Врублевская, Вероника Валерьевна, Пущино

1. Morenkov O.S, Smirnov S.V, Vrublevskaya V.V. Isolation of mutants of Aujeszky's disease virus with antigenically altered glycoprotein by affinity chromatography using monoclonal antibodies. IIJ Virol Methods. 1999 Jan; 77 (1) p. 101-108.

2. Vrublevskaya V.V., Kornev A.N, Smirnov S.V, Morenkov O.S. Cell-binding properties of glycoprotein В of Aujeszky's disease virus. // Virus research. 2002 Jun; 86(1-2), 7-19.

3. Врублевская В.В, Мусиенко B.C., Моренков О.С. Взаимодействие гликопротеина gB вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus Г) с клеточными гепарансульфатами. // Вопросы вирусологии, 2005, № 5 40-43.

4. Врублевская В.В, Мусиенко B.C., Моренков О.С. Иммунологическая характеристика гликопротеина gD вируса болезни Ауески. // Вопросы вирусологии, 2007, № 52 (3), 33-37.1. Тезисы докладов

5. Врублевская В.В, Моренков О.С. Взаимодействие гликопротеина gB вируса болезни Ауески с плазматическими мембранами клеток ВНК-21. // Тезисы 5-й Путинской конференции молодых ученых «Биология наука 21-го века», Пущино, 2001 г, с. 116.

6. Врублевская В.В., Корнев А.Н., Моренков О.С. Исследование гепарин-связывающей активности гликопротеина gB вируса болезни ауески (Suid herpesvirus I).// Тезисы 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология наука 21-го века», Пущино, 2002 г., с. 231.

7. Врублевская В.В., Моренков О.С. Иммунологическая характеристика гликопротеина gD вируса болезни Ауески (Suid herpesvirus I). II Тезисы 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. «Биология наука 21-го века», Пущино, 2004 г., с. 50.

8. Зарипов М.М., Моренков О.С., Шматченко В.В., Смирнов C.B., Фунтиков В. А., Фодор И. Иммунологическая и функциональная характеристика эпитопов и областей гликопротеина gB вируса болезни Ауески. // Вопросы Вирусологии, 2001, 2, 41-45.

9. Конопаткин A.A. Болезнь Ауески. // Эпизоотология и инфекц. болезни с.-х. животных. М. 1984. С. 189-197.

10. Малярец П.В., Гусева Е.В., Ануфриева Т.А. Болезнь Ауески. (Обзор литературы). // Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных. 1993. 26 с.

11. Моренков О.С. Разработка иммуноферментных методов выявления антител к гликопротеину gB вируса болезни Ауески в сыворотке свиней. // Вопросы вирусологии. 2000, № 3, с. 45-48.

12. Мэрфи Ф.А. Таксономия вирусов. // Вирусология. Под ред. Б. Филдса Б и Д. Найпа. М.: Мир. 1989. т. 1. 29 с.

13. Ройзман Б., Баттерсон. Герпесвирусы и их репликация. // Вирусология. Под ред. Б. Филдса Б и Д. Найпа. М.: Мир. 1989. т. 3. гл.29. 190 с.

14. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. // Урожай. 1993. 368с.

15. Сосов Р.Ф., Ведерников В.А. Болезнь Ауески. Болезни свиней. // 3-е изд. М. 1980. С. 62-69.

16. Ambrosch F, Wiedermann G, Jonas S, Althaus В, Finkel В, Gluck R, Herzog С. Immunogenicity and protectivity of a new liposomal hepatitis A vaccine. // Vaccine. 1997 Aug; 15(11):1209-13.

17. Angel J, Chaperot L, Molens JP, Mezin P, Amacker M, Zurbriggen R, Grichine A, Plumas J. Virosome-mediated delivery of tumor antigen to plasmacytoid dendritic cells. // Vaccine. 2007 May 10;25( 19):3913-21.

18. Bagai S, Sarkar DP. Reconstituted Sendai virus envelopes as biological carriers: dual role of F protein in binding and fusion with liver cells. // Biochim

19. Biophys Acta. 1993 Oct 10;1152(1): 15-25.

20. Bagai S, Sarkar DP. Targeted delivery of hygromycin B using reconstituted Sendai viral envelopes lacking hemagglutinin-neuraminidase. // FEBS Lett. 1993 Jul 12;326(l-3):183-8.

21. Basgoz N, Qadri I, Navarro D, Sears A, Lennette E, Youngblom J, Pereira L. The amino terminus of human cytomegalovirus glycoprotein B contains epitopes that vary among strains. // J.Gen.Virol. 1992. V. 73. P. 983-988.

22. Bender FC, Whitbeck JC, Lou H, Cohen GH, Eisenberg RJ. Herpes simplex virus glycoprotein B binds to cell surfaces independently of heparan sulfate and blocks virus entry. //J Virol. 2005 Sep;79(18):l 1588-97.

23. Ben-Porat T, DeMarchi J.M, Kaplan A.S. Characterization of defective interfering viral particles present in a population of pseudorabies virions. // Virology. 1974. V. 61. P. 29-37.

24. Ben-Porat T, DeMarchi J.M, Lomniczi B, Kaplan A.S. Role of glycoproteins of pseudorabies virus in eliciting neutralizing antibodies. // Virology. 1986. V. 154. P. 325-334.

25. Bernfield, M, Kokenyesi, R, Kato, M, Hinkes, M. T, Spring, J, Gallo, R. L. and Lose, E. J. (1992) Biology of the syndecans: a family of transmembrane heparan sulfate proteoglycans. // Annu. Rev. Cell Biol. 8, 165-193.

26. Blewett E.L, Misra V. Cleavage of bovine herpesvirus glycoprotein B is not essential for its function. //J.Virol. 1991. V. 72. P. 2083-2090.

27. Boyle K.A, Compton T. Receptor-binding properties of a soluble form of human cytomegalovirus glycoprotein B. // J.Virol. 1998. V. 72. P. 1826-1833.

28. Bungener L, de Mare A, de Vries-Idema J, Sehr P, van der Zee A, Wilschut J, Daemen T. A virosomal immunization strategy against cervical cancer and premalignant cervical disease. 11 Antivir Ther. 2006; 11 (6):717-27.

29. Byrne, K, Horohov, D.W., Kousoulas, K.G, 1995. Glycoprotein B of bovine herpesvirus-1 binds heparin. // Virology 209, 230-235.

30. Campadelli-Fiume G, Amasio M, Avitabile E, Cerretani A, Forghieri C, Gianni T, Menotti L. The multipartite system that mediates entry of herpes simplex virus into the cell. // Rev Med Virol. 2007 Sep-Oct;17(5):313-26.

31. Carlson C, Britt W.J, Compton T. Expression, purification, and characterization of a soluble form of human cytomegalovirus glycoprotein B. // Virology. 1997. V. 239. P. 198-205.

32. Caselli E, Boni M, Di Luca D, Salvatori D, Vita A, Cassai E. A combined bovine herpesvirus 1 gB-gD DNA vaccine induces immune response in mice. // Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2005 Mar;28(2): 155-66.

33. Cheshenko N, Herold BC. Glycoprotein B plays a predominant role in mediating herpes simplex virus type 2 attachment and is required for entry and cell-to-cell spread. // J Gen Virol. 2002 Sep;83(Pt 9):2247-55.

34. Chou S. Comparative analysis of sequence variation in gp 116 and gp55 components of glycoprotein B of human cytomegalovirus. // Virology. 1992. V. 188. P. 388-390.

35. Coe N.E, Mengeling W.L. Mapping and characterization of neitralizing epitopes of glycoproteins gill and gp50 of the Indiana-Funkhauser strain of pseudorabies virus.//Arch. Virol. 1990. V. 110. N 1/2. P. 137-142.

36. Cowen P, Li S., Guy J.S, Ericson G.A., Blanchard D. Reactivation of pseudorabies virus infection in vaccinated commercial sows. // Am. J. Vet. Res. 1990. V.51. P. 354-358.

37. Davison AJ, Scott JE. DNA sequence of the major capsid protein gene of herpes simplex virus type 1. // J Gen Virol. 1986 Oct;67 ( Pt 10):2279-86).

38. Dijkstra J.M., Visser N.,Mettenleiter T.C., Klupp B.G. Identification and characterization of pseudorabies virus glycoprotein gM as a nonessential virion component. //J.Virol. 1996. V. 70. P. 5684-5688.

39. Doolittle, R. F. (1992) Reconstructing history with amino acid sequences. // Protein Sci. 1, 191-200.

40. Eloit M., Bouzghaia H., Toma B. Identification of antigenic sites on pseudorabies virus glycoprotein gp50 implicated in virus penetration of the host cell. // J.Gen.Virol. 1990. V.71. N 9. P. 2179-2183.

41. Eloit M., Frageaud D., L'Haridon R., Toma B. Identification of the pseudorabies virus glycoprotein gp50 as a major target of neutralizing antibodies. // Arch.Virol. 1988. V. 99. P. 45-56.

42. Eloit M., Frageaud, D., Vannier, P. and Toma B. Development of an EL1SA to differentiate between animals either vaccinated with or infected by Aujeszky's disease virus. //Vet.Record 1988. V.124. P. 91-94.

43. Favoreel HW, Van De Walle GR, Nauwynck HJ, Mettenleiter TC, Pensaert MB Pseudorabies virus (PRV)-specific antibodies suppress intracellular viral protein levels in PRV-infected monocytes. // J Gen Virol. 2003 Nov;84(Pt 11):2969-73.

44. Fish K.N, Soderberg-Naucler C, Nelson J.A. Steady-state plasma membrane expression of human cytomegalovirus glycoprotein gB is determined by the phosphorylation state of ser900. // J.Virol. 1998. V. 72. P. 6657-6664.

45. Fitzpatrick D.R, Redmond M.J, Attah-Poku S.K, Van Drunen S, Van Den Hurk L, Babiuk L.A, Zamb T.J. Mapping of 10 epitopes on bovine herpesvirus type 1 glycoproteins gl and gill. //Virology. 1990. V. 176. P. 145-157.

46. Flynn S.J, Ryan P. The receptor-binding domain of pseudorabies virus glycoprotein gC is composed of multiple discrete units that are functionally redundant. //J.Virol. 1996. V. 70. P. 1355-1364.

47. Geraghty RJ, Krummenacher C, Cohen GH, Eisenberg RJ, Spear PG. Entry of alphaherpesviruses mediated by pcliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. // Science. 1998 Jun 5;280(5369):1618-20.

48. Gerber SI, Belval BJ, Herold BC. Differences in the role of glycoprotein C of HSV-1 and HSV-2 in viral binding may contribute to serotype differences in cell tropism. //Virology. 1995 Dec l;214(l):29-39.

49. Gluck R. Adjuvant activity of immunopotentiating reconstituted influenza virosomes (IRIVs).//Vaccine. 1999 Mar 26; 17(13-14): 1782-7.

50. Gluck R, Burri KG, Metcalfe I. Adjuvant and antigen delivery properties of virosomes. // Curr Drug Deliv. 2005 Oct;2(4):395-400.

51. Goding, J.W. Antibody production by hybridomas. // J.Immulol.Methods. 1980. V. 39. P. 285-308.

52. Granzow H, Weiland F, Juns A, Klupp B.G, Karger A, Mettenleiter T.C. Ultrastructural analysis of the replication cycle of pseudorabies virus in cell culture: a reassessment. //J.Virol. 1997. V. 71. P. 2072-2082.

53. Gruenheid S, Gatzke L, Meadows H, Tufaro F. Herpes simplex virus infection and propagation in a mouse L cell mutant lacking heparan sulfate proteoglycans. //J Virol. 1993 Jan;67(l):93-100.

54. Gustafson P.D. Pseudorabies. Diseases of swine. // Ed. by H.W. Dunne. Iowa State University Press. 3rd edition. 1970. P. 337-355.

55. Cusi MG. Applications of influenza virosomes as a delivery system. // Hum Vaccin. 2006 Jan-Feb;2(l):l-7.

56. Haagmans BL, van Rooij EM, Dubelaar M, Kimman TG, Horzinek MC, Schijns VE, Bianchi AT. Vaccination of pigs against Pseudorabies virus with Plasmid DNA encoding glycoprotein D. //Vaccine. 1999 Mar 5;17(9-10):1264-71.

57. Hammerschmidt W., Contraths F., Mankertz J., Pauli G., Ludwig H., Buhk H.J. Conservation of a gene cluster including glycoprotein B in bovine herpesvirus type 2 (BHV-2) and herpes simplex virus type 1 (HSV-1). // Virology. 1988. V. 165. P. 388-405.

58. Hampl H., Ben-Porat T., Ehrlicher L., Habermail K.O., Kaplan A.S. Characterization of the envelope proteins of Pseudorabies virus. // J.Virol. 1984. V. 52. P. 583-590.

59. Hayashi, K., Madri, J. A. and Yurchenco, P. D. (1992) Endothelial cells interact with the core protein of basement membrane perlecan through bl and b3 integrins: an adhesion modulated by glycosaminoglycans. // J. Cell Biol. 119, 945959

60. Herold B.C., WuDunn D., Soltys N., Spear P.G. Glycoprotein C of herpes simplex virus type 1 plays a principal role in the adsorption of virus to cells and in infectivity. //J Virol. 1991. V. 65. P. 1090-1098.

61. Herold B.C., Visaiii R.J., Susmarski N., Brandt C.R., Spear P.G. Glycoprotein C-independent binding of herpes simplex virus to cells requires cell surface heparan sulphate and glycoprotein B. // J.Gen.Virol. 1994. V. 75. P. 12111222.

62. Hong W, Xiao S, Zhou R, Fang L, He Q, Wu B, Zhou F, Chen H.). Protection induced by intramuscular immunization with DNA vaccines of pseudorabies in mice, rabbits and piglets. // Vaccine. 2002 Jan 15;20(7-8): 120514).

63. Huff V., Cai W., Glorioso J.C., Levine M. The carboxy terminal 41 amino acids of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B are not essential for production infectious virus particles. // J.Virol. 1988. V. 62. P. 4403-4406.

64. Huang R.T., Wahn K., Klenk H.D., Rott R. Fusion between cell membrane and liposomes containing the glycoproteins of influenza virus. // Virology. 1980. -Vol. 104.-P. 294-302.

65. Hwang D.Y., Lee J.B., Kim T.J., Song J.Y., Hyun B.H., Song C.S., Park S.Y. Induction of immune responses to glycoprotein gD of Aujeszky's disease virus with DNA immunization. //J. Vet. Med. Sci., 2001, 63 (6), 659-662.

66. Jacobs L., Moonen-Leusen B.M.W.M., Bianchi A.T.J., Kimman T.G. Glycoprotein gl of pseudorabies virus: epitope-specific antibody response in mice and pigs. // Acta Vet.Hungarica. 1994. V. 42. P. 347-351.

67. Jacquet, A., Haumont, M., Chellum, D., Massaer, M., Tufaro, F., Bollen, A., Jacobs, P., 1998. The varicella zoster virus glycoprotein B (gB) plays a role in virus binding to cell surface heparan sulfate proteoglycans. // Virus Res. 53, 197-207.

68. Jackson, R.L., Busch, S.J., Cardin, A.D., 1991. Glycosaminoglycans: molecular properties, protein interactions, and role in physiological processes. // Physiol. Rev. 71,481-539.

69. Johnson D.C., Ligas M.W. Herpes simplex viruses lacking glycoprotein D are unable to inhibit virus penetration: quantitative evidence for virus-specific cell surface receptors. // J.Virol. 1988. V. 62. P. 4605-4612.

70. Johnson D.C., Wittels M., Spear P.G. Binding to cells of virosomes containing herpes simplex virus type 1 glycoproteins and evidence for fusion. // J Virol. 1984. - Vol. 52. - P. 238-247.

71. Kaneda Y. Improvements in gene therapy technologies. // Mol Urol. 20011. Summer;5(2):85-9.

72. Karger A., Mettenleiter T.C. Glycoprotein gill and gp50 play dominant roles in biphasic attachment of pseudorabies virus. // Virology. 1993. V. 194. P. 654-664.

73. Karger A, Schmidt J, Mettenleiter TC. Infectivity of a pseudorabies virus mutant lacking attachment glycoproteins C and D. // J Virol. 1998 Sep;72(9):7341-8.

74. Kari B., Gehrz R. A human cytomegalovirus glycoprotein complex designated gC-II is a major heparin-binding component of the envelope. // J.Virol. 1992. V. 66. P. 1761-1764.

75. Katz J.B., Pederson J.C. Analysis of glycoprotein I (gl) negative and aberrant pseudorabies viral diagnostic isolates. Am.J.Vet.Res. 1992. V.53. P. 2259-2266.

76. Klupp BG, Mettenleiter TC. Glycoprotein gL-independent infectivity of pseudorabies virus is mediated by a gD-gH fusion protein. // J Virol. 1999 Apr;73(4):3014-22.

77. Knopp A., Mettenleiter T.C. Stable rescue of a glycoprotein gll deletion mutant of pseudorabies virus by glycoprotein I of bovine herpesvirus 1. // J. Virol.1992. V. 66. P. 2754-2764.

78. Kopp A., Blewett T., Misra V.O.L., Mettenleiter T.C. Proteolytic cleavage of bovine herpes virus 1 (BHV-1) glycoprotein gB is not necessary for its function in BHV-1 or pseudorabies virus. //J.Virol. 1994. V. 68. P. 1667-1674.

79. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

80. Laquerre S., Person S, Glorioso J.C. Glycoprotein B of herpes simplex virus type 1 oligomerizes through the intermolecular interaction of a 28-amino-acid domain. //J.Virol. 1996. V. 70. P. 1640-1650.

81. Lee W.C., Fuller O. Herpes simplex virus type 1 and pseudorabies virus bind to a common saturable receptor on Vero cells that is not heparan sulfate. // J.Virol.1993. V. 67. P. 5088-5097.

82. Li Y., Liang X., van Drunen Littel, van den Hurk S., Babiuk L.A.

83. Characterization of cell-binding properties of bovine herpesvirus 1 glycoproteins B,

84. C, and D: identification of dual cell-binding function of gB. // J.Virol. 1995. V. 69. P. 4758-4768.

85. Li Y., van Drunen Littel, van den Hurk S., Liang X., Babiuk L. Functional analysis of the transmembrane anchor region of bovine herpesvirus 1 glycoprotein gB. // Virology. 1997. V. 228. P. 39-54.

86. Ligas MW, Johnson DC. A herpes simplex virus mutant in which glycoprotein D sequences are replaced by beta-galactosidase sequences binds to but is unable to penetrate into cells. //J Virol. 1988 May;62(5): 1486-94).

87. Lindahl U, Kusche-Gullberg M, Kjellen L. Regulated diversity of heparan sulfate. // J Biol Chem. 1998 Sep 25;273(39):24979-82.

88. Lowe-Krentz, L. J., Thompson, K. and Patton II, W. A. (1992) Heparin releasable and nonreleasable forms of heparan sulfate proteoglycan are found on the surfaces of cultured porcine aortic endothelial cells. // Mol. Cell. Biochem. 109, 51-60.

89. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J.Biol.Chem., 1951, 193, 265-275.

90. Lukacs N., Thiel H.-J., Mettenleiter T.C., Rziha H.-J. Demonstration of three major species of pseudorabies virus glycoproteins and identification of a disulfide-1 inked glycoprotein complex. // J.Virol. 1985. V. 49. P. 970-979.

91. Massague, J. (1992) Receptors for the TGF-beta family. // Cell 69, 10671070.

92. Marchioli C., Yancey R.J., Timmins J.G., Post L.E., Young P.R., Povendo

93. D.A. Protection of mice and swine from pseudorabies virus-induced mortality by administration of pseudorabies virus-specific mouse monoclonal antibodies. //

94. Am.J.Vet.Res. 1988. V. 49. P. 860-864.

95. Matsuda A, Okada N, Katayama S, Okabe T, Sasaki N. Characterization of protective viral glycoproteins for Pseudorabies virus infection. // J.Vet.Med.Sci. 1991. V. 53. P. 737-741.

96. Matsuda A, Okada N, Katayama S, Okabe T, Sasaki N. The adsorption of Pseudorabies virus glycoprotein gill to the host cell. // J.Vet.Med.Sci. 1991. V. 53. P. 957-958.

97. Matsuda A, Katayama S, Okada N, Okabe T, Sasaki N. Protection from Pseudorabies virus challnge in mice by a combination of purified gll, gill and gVI antigens. // J.Vet.Med.Sci. 1992. V. 54. P. 447-452.

98. Mayo M.A, Pringle C.R. Virus taxonomy 1997. // J. Gen. Virol. 1998. V. 79. P. 649-657.

99. McClain, D.S. and Fuller, A.O. Cell-specific kinetics and efficiency of herpes simplex virus typel are determined by two distinct phases of attachment. Virology 1994, 198, 690-702.

100. Mettenleiter T.C. Molecular biology of Pseudorabies (Aujeszky's disease) virus. // ComP.Immun.Microbiol.Infect.Dis. 1991. V. 14. P. 151-163.

101. Mettenleiter TC, Klupp BG, Granzow H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. // Curr Opin Microbiol. 2006 Aug;9(4):423-429.

102. Mettenleiter TC. Budding events in herpesvirus morphogenesis. // Virus Res. 2004 Dec;106(2).T67-180.

103. Mettenleiter T. C. Glycoprotein gill deletion mutants of Pseudorabies virus are impared in virus entry. // Virology. 1989. V. 171. N 2. P. 623-625.

104. Mettenleiter T.C. Immunobiology of Pseudorabies (Aujeszky's disease). // Vet.Immunol.Immunopathol. 1996. V. 54. P. 221-229.

105. Mettenleiter TC. Herpesvirus assembly and egress. // J Virol. 2002 Feb;76(4): 1537-47.

106. Mettenleiter T.C. Pseudorabies (Aujeszky's disease virus): State of the art. August 1993. //Acta Veterinaria Hungarica. 1994. V. 42. P. 153-177.

107. Mettenleiter TC. Initiation and spread of alpha-herpesvirus infections. // Trends Microbiol. 1994 Jan;2(l):2-4).

108. Mettenleiter TC. Aujeszky's disease (Pseudorabies) virus: the virus and molecular pathogenesis-state of the art, June 1999. // Vet Res. 2000 Jan1. Feb;31(l):99-115.

109. Mettenleiter T.C., Spear P. Glycoprotein gB (gll) of pseudorabies virus can functionally substitute for glycoprotein gB in herpes simplex virus type 1. // J.Virol. 1994. V. 68. P. 500-504.

110. Mettenleiter T.C., Zsak L., Zuckermann F., Sugg N., Kern H., Ben-Porat T. Interaction of glycoprotein gill with a cellular heparinlike substance mediates adsorbtion of pseudorabies virus. //J.Virol., 1990. v. 64, p. 278-286.

111. Mettenleiter T.C., Schreurs C., Thiel H.J., Rziha H.J. Variability of pseudorabies virus glycoprotein I expression. // Virology. 1987. V.158. P. 141-146.

112. Mettenleiter TC, Klupp BG, Weiland F, Visser N. Characterization of a quadruple glycoprotein-deleted pseudorabies virus mutant for use as a biologically safe live virus vaccine. // J Gen Virol. 1994 Jul;75 ( Pt 7): 1723-33.

113. Mikloska Z, Cunningham AL. Herpes simplex virus type 1 glycoproteins gB, gC and gD are major targets for CD4 T-lymphocyte cytotoxicity in HLA-DR expressing human epidermal keratinocytes. // J Gen Virol. 1998 Feb;79 ( Pt 2):353-61.

114. Montalvo E.A., Grose C. Assembly and processing of the disulfide-linked varicella-zoster virus glycoprotein gpll (140). // J.Virol. 1987. V. 61. P. 2877-2884.

115. Montgomery R.I., Warner M.S., Lum B., Spear P.G. Herpes simplex virus 1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. // Cell. 1996. V. 87. P. 427-436.

116. Morenkov O.S., Sobko Yu.A., Panchenko O.A. Glycoprotein gE blocking ELISAs to differentiate between Aujeszky's disease-vaccinated and infected animals. // J.Virol.Meth, 1997, 65, 83-94.

117. Morenkov O.S., Fodor N., Sobko Yu.A, Fodor I. Immunological characterisation of glycoprotein E of Aujeszky's disease virus. // Virus Research. 1997. V. 51. P. 65-79.

118. Morenkov OS, Fodor N, Fodor I. Indirect ELISAs based on recombinant andaffinity-purified glycoprotein E of Aujeszky's disease virus to differentiate between vaccinated and infected animals. 11 Acta Veterinaria Hungarica 1999, 47, 1, 137151.

119. Muggeridge M.I, Roberts S.R, Isola V.J., Cohen G.H, Eisenberg R.J. Herpes simplex virus. Immunochemistry of viruses II. The basis for serodiagnosis and vaccines. // Ed. M.H.V. Van Regenmortel and A.R. Neurath. Amsterdam. New York. Oxford. 1990.

120. Nakamura T, Ihara T, Nagata T, Ishihama A, Ueda S. A complement-dependent neutralising monoclonal antibody against glycoprotein II of Pseudorabies virus. // Vet.Microbiol. 1990. V. 24. P. 193-198.

121. Nakamura T, Ihara T, Nunoya T, Kuwahara H, Ishihama A, Ueda S. Role of Pseudorabies virus glycoprotein II in protection from lehtal infection. // Vet.Microbiol. 1993. V. 36. P. 83-90.

122. Nauwynck H.J, Pensaert M.B. Effect of specific antibodies on the cell-associated spread of Pseudorabies virus in monolayers of different cell types. // Arch.Virol. 1995. V. 140. P. 1137-1146.

123. Navarro D, Paz P, Pereira L. Domains of herpes simplex virus 1 glycoprotein B that function in virus penetration, cell-to-cell spread, cell fusion. // Virology. 1992. V. 186. P. 99-112.

124. Neubauer A, Braun B, Brandmbller C, Kaaden O.-R, Osterrieder N. Analysis of the contributions of the equine herpesvirus 1 glycoprotein gB homolog to virus entry and direct cell-to-cell spread. // Virology. 1997. V. 227. P. 281-294.

125. Nixdorf R, Klupp BG, Karger A, Mettenleiter TC. Effects of truncation of the carboxy terminus of Pseudorabies virus glycoprotein B on infectivity. // J Virol. 2000 Aug;74(15):7137-7145.

126. Nixdorf R, Klupp BG, Mettenleiter TC Restoration of function of carboxy-terminally truncated Pseudorabies virus glycoprotein B by point mutations in the ectodomain. // J Virol. 2001 Dec;75(23):l 1526-11533.

127. Nixdorf R, Schmidt J, Karger A, Mettenleiter TC. Infection of Chinese hamster ovary cells by Pseudorabies virus. // J Virol. 1999 Oct;73(10):8019-26.

128. Norais N, Tang D, Kaur S, Chamberlain S.H, Masiarz F.R, Burke P.L, Marcus F. Disulfide bonds of herpes simplex virus type 2 glycoprotein gB. // J.Virol. 1996. V. 70. P. 7379-7387.

129. Norais N, Hall J.A, Gross L, Tang D, Kaur S, Chamberlain S.H, Burke R.L, Marcus F. Evidence for phosphorylation site in cytomegalovirus glycoprotein gB. // J.Virol. 1996. V. 70. P. 5716-5719.

130. Okazaki K. Proteolytic cleavage of glycoprotein B is dispensable for in vitroreplication, but required for syncytium formation of pseudorabies virus. // J Gen Virol. 2007 Jul;88(Pt 7):1859-65.

131. Oppermann M. Anion exchange chromatography for purification of monoclonal IgG antibodies. // J.P.Peters and H.Baumgarten (Eds.) Monoclonal antibodies. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 1992. P. 271-275.

132. Otsuka H., Xuan X., Shibata I., Mori M. Protective immunity of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) recombinants which express pseudorabies virus (PRV) glycoproteins gB, gC, gD and gE. // J.Vet.Med.Sci. 1996. V. 58. P. 819-824.

133. Owais M, Gupta CM. Liposome-mediated cytosolic delivery of macromolecules and its possible use in vaccine development. Eur J Biochem. 2000 Jul;267(13):3946-56.

134. Quist P., Sorensen K.J., Mayling A. Monoclonal blocking ELISA detecting serum antibodies to the glycoprotein gll of Aujeszky's disease virus. // J. Virol. Meth. 1989. V.24. P. 169-180.

135. Peeters B., De Wind N., Hoosima M., Wagenaar F., Gielkens A., Moormann R. Pseudorabies virus envelope glycoproteins gp50 and gll are essential for virus penetration, but only gll is inV.ved in membrane fusion. // J.Virol. 1992. V. 66. P. 894-905.

136. Peeters B, de Wind N, Broer R, Gielkens A, Moormann R. Glycoprotein H of pseudorabies virus is essential for entry and cell-to-cell spread of the virus. // J Virol. 1992 Jun;66(6):3888-92.

137. Pensaert M., Gielkens A.L.J., Lomniczi B., Kimman T.G., Vannier P., Eloit M. Round table on controle of Aujeszky's disease and vaccine development based on molecular biology. // Vet.Microbiol. 1992. V. 33. P. 53-67.

138. Pereira L. Function of glycoprotein B homologues of the family herpesviridae. // Infect.Agents.Dis. 1994. V. 3. P. 9-28.

139. Petrovskis EA, Meyer AL, Post LE., Reduced yield of infectious pseudorabies virus and herpes simplex virus from cell lines producing viral glycoprotein gp50. // J Virol. 1988 Jun;62(6):2196-9.

140. Petrovskis E.A., Timmins J.G., Armentrout M.A., Marchioli C.C., Yancey R.J., Post L.E. DNA sequence of gene for pseudorabies virus gp50, a glycoprotein without N- linked glycosylation. // J.Virol. 1986. V.59. P. 216-223.

141. Pilling A, Rosenberg MF, Willis SH, Jager J, Cohen GH, Eisenberg RJ, Meredith DM, Holzenburg A. Three-dimensional structure of herpes simplex virus type 1 glycoprotein D at 2.4-nanometer resolution. // J Virol. 1999 Sep;73(9):7830-4.

142. Poltl-Frank F, Zurbriggen R, Helg A, Stuart F, Robinson J, Gluck R, Pluschke • G. Use of reconstituted influenza virus virosomes as an immunopotentiating delivery system for a peptide-based vaccine. // Clin Exp Immunol. 1999 Sep;117(3):496-503.

143. Ponimaskin E, Bareesel KK, Markgraf K, Reszka R, Lehmann K, Gelderblom HR, Gawaz M, Schmidt MF. Sendai virosomes revisited: reconstitution with exogenous lipids leads to potent vehicles for gene transfer. // Virology. 2000 Apr 10;269(2):391-403.

144. Pumphrey C.Y., Gray W.L. DNA sequence and transcriptional analysis of the simian varicella virus glycoprotein B gene. // J.Gen.Virol. 1994. V. 75. P. 32193227.

145. Radsak K., Eickmann M., Mockenhaupt T., Bogner E., Kern H., EisHubinger A., Reschke M. Retrieval of human cytomegalovirus glycoprotein B from the infected cell surface for virus envelopment. // Arch Virol. 1996. V. 141. P. 557572.

146. Ramani K, Hassan Q, Venkaiah B, Hasnain SE, Sarkar DP. Site-specific gene delivery in vivo through engineered Sendai viral envelopes. // Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Sep 29;95(20):11886-90.

147. Rauh I, Mettenleiter T.C. Pseudorabies virus glycoproteins gll and gp50 are essential for virus penetration. //J.Virol. 1991. V. 65. P. 5348-5356.

148. Rauh I, Weiland F, Feiler F, Keil G, Mettenleiter T.C. Pseudorabies virus mutants lacking the essentional glycoprotein gll can be complemented by glycoprotein gl of bovine herpesvirus 1. //J.Virol. 1991. V. 65. P. 621- 631.

149. Reske A, Pollara G, Krummenacher C, Chain BM, Katz DR. Understanding HSV-1 entry glycoproteins. // Rev Med Virol. 2007 May-Jun;17(3):205-15.

150. Riviere M, Tartaglia J, Percus M.E, Norton E.K, Bongermino C.M, Lacoste F, Duret C, Desmettre P, Paoletti E. Protection of mice and swine from pseudorabies virus conferred by vaccinia virus based recombinants. // J.Virol. 1992. V. 66. P. 3424-3434.

151. Robins A.K, Whealy M.E, Watson R.J, Enquist L.W. Pseudorabies virus gene encoding glycoprotein gill is not essential for growth in tissue culture. // J. Virol. 1986. V. 59. P. 635-645.

152. Roizman, B. and Spear, P.G, 1996. Herpes simplex viruses and their replication, In: B.N. Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley, et al, (Eds), Fields virology, 3rd ed. Lippincot-Raven Publishers, pp.2231-2295

153. Saksela, O, Moscatelli, D, Sommer, A. and Rifkin, D. B. (1988) Endothelial cell-derived heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic degradation. // J. Cell Biol. 107, 743-751).

154. Sawitzky D, Hampl H, Habermehl K.O. Comparison of heparin-sensitive attachment of pseudorabies virus (PRV) and herpes simplex virus type 1 and identification of heparin-binding PRV glycoproteins. // J.Gen.Virol. 1990. V. 71. P. 1221-1225.

155. Sawitzky D, Voigt A, Zeichhardt H, Hambermehl K.O. Glycoprotein B (gB) of pseudorabies virus interacts specifically with the glycosaminoglycan heparin. // Vims Res. 1996. V. 41. P. 101-108.

156. Schmidt J, Klupp BG, Karger A, Mettenleiter TC. Adaptability in herpesviruses: glycoprotein D-independent infectivity of pseudorabies virus. // J Virol. 1997 Jan;71(1): 17-24.

157. Schoen P, Chonn A, Cullis PR, Wilschut J, Scherrer P. Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles. // Gene Ther. 1999 May;6(5):823-32.

158. Schoenbaum M.A, Beran G.V, Murhy D.P. Pseudorabies virus latency and reactivation in vaccinated swine. // Am.J. Vet. Res. 1990. V. 51. P. 334-338.

159. Schreurs Ch, Mettenleiter T. C, Zuckerman F, Sugg N, Ben-Porat T. Glycoprotein gill of pseudorabies virus is multifunctional.// J. Virol. 1988. V. 62 P. 2251-2257.

160. Shukla D, Liu J, Blaiklock P, Shworak NW, Bai X, Esko JD, Cohen GH, Eisenberg RJ, Rosenberg RD, Spear PG. A novel role for 3-O-sulfated heparan sulfate in herpes simplex virus 1 entry. //Cell. 1999 Oct 1 ;99(1): 13-22.

161. Shukla D, Rowe CL, Dong Y, Racaniello VR, Spear PG. The murine homolog (Mph) of human herpesvirus entry protein B (HveB) mediates entry of pseudorabies virus but not herpes simplex virus types 1 and 2. // J Virol. 1999 May;73(5):4493-7.

162. Shukla D, Spear PG. Herpesviruses and heparan sulfate: an intimate relationship in aid of viral entry. // J Clin Invest. 2001 Aug;108(4):503-10.

163. Sithole I, Lee L.F, Velicer L.F. Synthesis and processing of the Marek'sdisease herpesvirus B antigen glycoprotein complex. // J.Virol. 1988. V. 62. P. 4270-4279.

164. Sorensen K.J., Lei J.C. Aujeszky's disease blocking ELISA for the detection of serum antibodies.//J. Virol. Meth. 1986. V. 13. P. 171-181.

165. Spaete R.R., Saxena A., Scott P.I., Song J.G., Probert W.S., Britt W.J., Gibson W., Rasmussen L., Pachl C. Sequence requirements for proteolytic processing of glycoprotein B of human cytomegalovirus strain Towne. // J.Virol. 1990. V. 64. P. 2922-2931.

166. Spatz S.J., Maes R.K. Immunological characterization of the feline herpesvirus-1 glycoprotein B and analysis of its deduced amino acid sequence. // Virology. 1993. V. 197. P. 125-136.

167. Spear P. G. Entry of alphaherpesviruses into cells. // Semin.Virol. 1993. V. 4. P. 167-180.

168. Spear P.G. Herpes simplex virus: receptors and ligands for cell entry. // Cellular Microbiology, 2004, 6(5), 401-410.

169. Spear PG. A first step toward understanding membrane fusion induced by herpes simplex virus. // Mol Cell. 2001 Jul;8(l ):2-4.

170. Spear PG, Longnecker R. Herpesvirus entry: an update. // J Virol. 2003 Oct;77(l 9): 10179-85.

171. Spear PG, Eisenberg RJ, Cohen GH. Three classes of cell surface receptors for alphaherpesvirus entry. // Virology. 2000 Sep 15;275(l):i-8.

172. Srikumaran S, Onisk D.V., Borca M.V., Nataraj C, Zamb T.J. Antiidiotype antibodies induce neutralizing antibodies to bovine herpesvirus 1. // Immunology. 1990. V. 70. P. 284-289.

173. Stegmann T., Morselt H.W., Booy F.P., van Breemen J.F., Scherphof G., Wilschut J. Functional reconstitution of influenza virus envelopes. // EMBO J. -1987.-Vol. 6.-P. 2651-2659.

174. Thaker S.R., Stine D.L., Zamb T.J., Srikumaran S. Identification of aputative cellular receptor for bovine herpesvirus 1. // J.Gen.Virol. 1994. V. 75. P. 2303-2309.

175. Tikoo S.K, Campos M, Babiuk L. Bovine herpesvirus (BHV-1): biology pathogenesis, and control. //AdV.Vir.Res. 1995. V. 45. P. 191-223.

176. Trybala E, Bergstrom T, Spillmann D, Svennerholm B, Olofson S, Flynn S.J, Ryan P. Mode of interaction between pseudorabies virus and heparan sulfate/heparin. // Virology. 1996. V. 218. P. 35-42.

177. Trybala E, Liljeqvist JA, Svennerholm B, Bergstrom T. Herpes simplex virus types 1 and 2 differ in their interaction with heparan sulfate. // J Virol. 2000 0ct;74(19):9106-14).

178. Tsujie M, Isaka Y, Nakamura H, Kaneda Y, Imai E, Hori M. Prolonged transgene expression in glomeruli using an EBV replicon vector system combined with HVJ liposomes. // Kidney Int. 2001 Apr;59(4): 1390-6.

179. Vanderpooten A, Goddeeris B, De Roose P, Hendrickx L, Biront P, Desmettre P. Evaluation of parenteral vaccination methods with glycoproteins against Aujeszky's disease in pigs. // Vet. Microbiol. 1997. V. 55. P. 81-89.

180. Van Drunen Littel, van den Hurk S, Babiuk L. Synthesis and processing of bovine herpesvirus 1 glycoproteins. //J.Virol. 1986. V. 59. P. 401-410.

181. Van Regenmortel M.H.V. The structure of viral epitopes. // Van Regenmortel M.H.V and Neurath A.R. (Eds). Immunochemistry of viruses II. The basis for serodiagnosis and vaccines. Elsevier, North Holland, Amsterdam. 1990. P. 1-17.

182. Wathen L.M.K., Piatt K.B., Wathen M.W., van Deusen R.A., Whetstone C.A., Pirtle E.C. Production and characterization of monoklonal antibodies against pseudorabies virus. // Virus Res. 1985. V. 4. P. 19-29.

183. Wathen M.V., Wathen L.M.K. Characterization and mapping of a nonessential pseudorabies virus glycoprotein. // J.Virol. 1986. V. 58. P. 173-178.

184. Wellington J.E., Cooley A.A., Love D.N., Whalley J.M. N-terminal sequence analysis of equine herpesvirus 1 glycoproteins D and B and evidence for internal cleavage of the gene 71 product. // J.Gen. Virol. 1996. V. 77. P. 75-82.

185. Whealy M.E., Robbins A. K., Enquist L.W. The export pathway of the pseudorabies virus virus gB homolog gll inV.ves oligomer formation in the endoplasmic reticulum and protease processing in the Golgi apparatus. // J.Virol. 1990. V. 64. P. 1946-1955.

186. Whealy M.E., Card J.P., Meade R.P., Robbins A.K., Enquist L.W. Effect of brefeldin A on alphaherpesvirus membrane protein glycosylation and virus egress. //J.Virol. 1991. V. 65. P. 1066-1081.

187. Wijburg OL, van den Dobbelsteen GP, Vadolas J, Sanders A, Strugnell RA, van Rooijen N. The role of macrophages in the induction and regulation of immunity elicited by exogenous antigens. // Eur J Immunol. 1998 Feb;28(2):479-87.

188. Williams, R.K. and Straus, S.E., 1997. Specificity and affinity of binding herpes simplex virus type 2 glycoprotein B to glycoaminoglycans. // J. Virol. 71, 1375-1380.

189. Wittman G. Spread and control of Aujeszky's Disease. // ComP. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1991. V. 14. P. 165-173.

190. Wittman G., Oilinger V., Rziha H.J. Occurence and reactivation of latent Aujeszky's disease virus following challenge in previously vaccinated pigs. // Arch.Virol. 1983. V.75.P. 29-41.

191. Wittman G., Rziha H.J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. // Herpesvirus diseases in cattle, horses and pigs. (Ed. by G.Wittman). Kluver, Boston. 1989. P. 230-325.

192. Wolfer U., Kruft D., Sawitzky D., Hampl H., Wittmann-Liebold B, Habermehl K.O. Processing of pseudorabies virus glycoprotein gll. // J.Virol. 1990. V. 64. P. 3122-3125.

193. Yamada S., Imada T., Nishimori T., Sekikawa M, Shimizu M. Antigenic variation of pseudorabies virus glycoproteins gll and gill demonstrated by neutralizing monoclonal antibodies. // Arch.Virol. 1991. V. 119. P. 285-290.

194. Yue Y, Zhou SS, Barry PA. Antibody responses to rhesus cytomegalovirus glycoprotein B in naturally infected rhesus macaques. // J Gen Virol. 2003 Dec; 841. Pt 12): 3371-9.

195. Zaripov, M.M., Morenkov, O.S., Fodor, N., Brown, A., Schmatchenko, V.V. and Fodor, I. Distribution of B-cell epitopes on the Pseudorabies virus glycoprotein B. Journal of General Virology, 1999, 80, 637-541.

196. Zaripov M.M., O.S.Morenkov, B.Siklodi, I.Barna-Vetro, A.Gyongyosi-Horvath, I. Fodor Glycoprotein B of Aujeszky's disease virus: topographical epitope mapping and epitope-specific antibody response. // Research in Virology, 1998, 149, 29-41.

197. Zhou F, Rouse BT, Huang L. Prolonged survival of thymoma-bearing mice after vaccination with a soluble protein antigen entrapped in liposomes: a model study.//Cancer Res. 1992 Nov 15;52(22):6287-91.

198. Zhu Z, Gershon MD, Hao Y, Ambron RT, Gabel CA, Gershon AA. Envelopment of varicella-zoster virus: targeting of viral glycoproteins to the trans-Golgi network. // Virol. 1995 Dec;69(12):7951-9.

199. Zsak L., Zuckermann F., Sugg N., Ben-Porat T. Glycoprotein gl of Pseudorabies virus promotes cell fusion and virus spread via direct cell-to-cell transmission. //J.Virol. 1992. V. 66. P. 2316-2325.

200. Zuckerman F., Mettenleiter T.C., Schreurs C., Sugg N., Ben-Porat T. Complex between glycoproteins gl and gp63 of Pseudorabies virus: its effect on virus replication. //J.Virol. 1988. V. 62. P. 4622-4626.

201. Zuckerman F., Zsak L., Reilly L., Sugg N., Ben-Porat T. Early interactions of Pseudorabies virus with host cells: functions of glycoprotein gill. // J. Virol. V.63 P.3323-3329.

Информация о работе

Врублевская, Вероника Валерьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы