Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистологическое и цитологическое исследование сперматогенеза у крыс после действия химического супермутагена нитрозометилмочевины

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Гистологическое и цитологическое исследование сперматогенеза у крыс после действия химического супермутагена нитрозометилмочевины"

МОСКОВСКИЙ ГССУДАРСТ1Ш1ШШ УНИВЕРСИТЕТ Ю1 и. а ЛОМОНОСОВА

Р Г 5 ОД

, - . ■ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

- 3 ¡,,-Л ,

На правах рукописи УДК 576: 591

ЭЛЬ- САЯЕД КАСЕЫ АБДКЛЬ-ХАДИ КАСКИ

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У КРЫС ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ХИШЧЕСНОГО СУПКРМУТАГКНА ШПРОЗОМЕТИЛМОЧШОШ

(03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология)

АВТОРЕ®РАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994 год

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета (Декан- профессор ИВ. Гусев) Московского государственного университета им. Ы. В. Ломоносова

Научный руководитель - доктор биологических наук

С. Т. Захндов

Официальные оппоненты:' доктор биологических наук, профессор

Т. К. Дубовая кандидат биологических наук, доцент Ы. А. Ланге

Ведущее' учреждение- Институт биологии развития им. R. Г_ Ксдьцовз, Российской академии наук

Защита диссертации состоится " <$<гк¿5-19мв /5 t"i i на заседании специализированного совета Д. 053.05.68 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете им U. В. Ломоносова по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. M. Е Ломоносова

Автореферат разослан "¿д," ^tâfipZ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук К- Н. Калистратова

ОЕЦЛЯ ХЛРШЕРСТККЛ PABOTÜ

Актуальность проблем». Исследованиям проблем сперматогенеза посвящено огромное число работ, многообразных по содержанию. Живой интерес к различным аспектам сперматогенеза объясняется уникальностью процессов развития мужских половых клеток, в ходе которых происходят необычные морфологические и биохимические изменения ядерных и клеточных структур. Сперматогенный процесс, как известно, завершается образованием большого количества мобильных клеток- сперматозоидов, способных к автономному существованию и переносу отцовской генетической информации в яйцеклетку (Ру-зен-Ранге, 1981; Mann, Lutvak-Мзпп, 1991; Захидов, 1993). Многочисленные сравнительные и экспериментальные исследования мужского гаметогенеза у позвоночных и беспозвоночных сыграли и продолжают играть не последнюю роль в решении ряда вопросов теоретической биологии.

В последние годы в области биологии размножения одно из центральных мест занимают исследования, в которых в качестве методического приема для активного вмешательства в процессы сперматогенеза нередко выступают химические соединения различного класса. Такие исследования имеют глубокое значение, как для выяснения механизмов биологического действия ксенобиотиков, так и для установления клеточных мишеней, источников восстановления структурно-функциональной целостности сперматогенного эпителия, механизмов, лежащих в основе некоторых форм мужского бесплодия. Получены также данные, свидетельствующие о широких возможностях использования сперматогенеза млекопитающих в качестве биологического дозиметра и индикатора хромосомно-ядерных аномалий, вызываемых ионизирующими излучениями, химическими воздействиями, болезнями, нарушениями структуры питания (Hacker-Klom, 1984; Evenson et al., 1984; Pinkel, 1994).

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было комплексное изучение некоторых закономерностей сперматогенеза у крыс, подвергшееся прямым или комбинированным эффектам супермутагена нитрозометилмочевины (ЯШ).

Конкретными задачами исследования были:

- морфологический и количественный анализ развивающихся сперматогенных клеток в различные моменты времени после хими-

ческих во?действий.

- научение цитогенетической чувствительности клеток профазы I мейова н спермзтогонпалыюго компартмента, глубины индуцированных хромосомных изменений в стволовых клетках.

- изучение цитохимических свойств хроматина спермиев.

- оценка адаптивной реакции сперматогенных клеток на комбинированные аффекты НШ м фосфорорганического пестицида рогора.

Частными задачами работы были: - изучение некоторых цитологических особенностей клеток Серто-ли после химических воздействий.

- определение возможности использования клеток спермат^ген-ного эпителия млекопитающих как индикаторной систеш ( по критерию микроядер) для оценки отдаленных генетических последствий химических агентов.

Научная новизна работы. Впервые благодаря комплстаному методическому подходу подробно описаны специфические особенности дифференцирующихся' сперматогенных клеток, вставших на путь атипичного развития, в условиях индуцированного химического мутагенеза; одновременно детальна прослезкена динамика количественных изменений клеточных популяций в процессе разрушения сперматогенного эпителия и его последующей регенерации.

Установлены различия в реакции половых клеток на цитотоксн-ческпе эффекты 1ШМ: наиболее поражаемыми оказались митотически размножающиеся клетки. Впервые дана сравнительно полная характеристика сперматогенным клеткам, развивающимся е семенниках половозрелых крыс, которые подверглись действию НШ в первые дни постнатального развития. Отдаленные последствия мутагенного удара по стволовым сперматогониям проявляются в виде ядерно-хромосомных аномалий и ¡щеточных потерь в популяциях спермиогенных клеток.

Доказана способность аберрантных сперматогониэр преодолевать мейотическнй барьер и достигать постмейотических стадий сперматогенеза, о чем свидетельствует высокая частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами на отдаленных сроках последействий Оригинальными наблюдениями впервые доказана способность е норме не лролиферирующнх, дифференцированных клеток Сертоли по; давлением мутагенов переходить к митотичееким делениям, благодаря которым идет обновление данной клеточной популяции.

На примере сперматогенеза крыс получены принципиально новы« данные о модифицирующих цитогенетических эффектах фосфороргани-

- з -

ческого пестицида ротора и супермутвгена IBM.

Полученные в работе результаты делают более ясными механизмы, лежащие в основе патологических явлений сперматогенного процесса, а следовательно, объяснют возможные причины некоторых форм мужской стерильности.

Практическая значимость работы. Методология настоящего исследования может быть использована для решения практических задач репродуктивной токсикологии. Результаты исследований свидетельствуют об эффективности метода учета сперматогенных микроядер и перспективности их широкого внедрения для скрининга индивидуализированных химических соединений на мутагенность и цитогенети-ческого мониторинга.

Результаты исследований должны войти в регистры мутагенов и должны учитываться специалистами, в круг интересов которых входит создание противоопухолевых препаратов и средств химической защиты от вредителей сельского хозяйства.

Сведения, полученные в ходе выполнения настоящей работы, нашли место в курсе лекций, читаемом на кафедре эмбриологии МГУ им. LL В. Ломоносова.

Апробация работы. Материалы настоящей диссертации докладывались на семинарах кафедры эмбриологии МГУ, годичной научной конференции РНАН (1994, Москва) и совещании "Экологическая биохи-мия'ЧИБР РАН, Москва, 1994).

Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликованы 3 научные работа

Объем работы. Диссертация изложена по общэпринятой научной схеме и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, изложения результатов, обсуждения и выводов. Работа представлена на 147 страницах, и состоит из 9 таблиц и 33 рисунков. Список литературы включает 172 названий, из них 32 - на русском языке.

I. МАТЕРИМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Объекты исследований н постановка опытов.

В работе использованы половозрелые и неполовозрелые самцы крыс Вистар.

В первой серии опытов были использованы молодые крысята в

возрасте 7-10 дней. Этим животным инъецировали однократно внутрибрюшинно НШ в дозах 25, 50 или 100 мг/кг. Фиксацию материала проводили через 3 мес после начала эксперимента.

Во второй серии опытов крыс в возрасте 2-3 мес. подвергали однократному воздействию нитрозометилмочевины (НШ) в дозе 25 или 100 от/кг. Контролем служили интактные животные или животные, которым однократно внутрибрюшинно инъецировали ДМСО.

В третьей серии наших опытов были использованы половозрелые самцы крыс. Подопытным животным в течение 3 дней внутрибрюшинно вводили фосфорорганический пестицид диметоат (или рогор, С^Н^МО^

в дозах 5 или 10 мг/кг, затем части животным из этих групп инъецировали однократно НММ в дозах 25 или 50 мг/кг. В другой серии опытов крысам в течение 5 дней вводили по 5 мг/кг НШ после чего части из этих животных инъецировали высокую дозу 50 мг/кг. Отрицательным контролем служили интактные и получавшие однократно и внутрибрюшинно по 0.4 мл ДШО, а в качестве позитивного контроля выступали крысы, подвергшиеся однократному воздействию НШ в дозах 25 или 50 мг/кг.

Всех животных забивали под легким наркозом в зависимости от поставленных задач через различные интервалы времени после начала эксперимента.

11.2. Приготовление и фиксация дрэяаратов.

Извлеченные семенники взвешивали, и затем один из них целиком помещали в уксусно-глицериновую смесь (1:1) на 2 нед. Другой семенник разрезали и готовили отпечатки. После высушивания на воздухе эти препараты фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине в течение 15 мин. Другую часть семенника фиксировали в растворе Буэна в течение 1 нед.

На следующем этапе работы гонады, фиксированные в УГС механически разрушали и суспендировали. Содержимое анализировали в камере Горяева с помощью фазово-контрастного устройства при общэм увеличении 400х ("0р1оп", Германия).

Для гистологического анализа семенники, фиксированные в растворе Еуэна, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации по 40 мин в каждой смене, а затем заливали в парафин при температуре 50-58 С. Приготавливали срезы толщиной 5 мкм.

- 5 -

II. 3. Онтяитчяс препаратов.

Для проведения цитогенетических и цитохимических исследований были выбраны следующее условия окрашивания по Фельгену: кислотный гидролиз отпечатков семенников проводили в 5 н HCl при температуре 37 С в течение 12 мин. и затем окрашивали в реактиве Шиффа -1ч. при комнатной температуре.

Часть препаратов перед окрашиванием по Фельгену обрабатывали ДНКаэой I (Koch Light, Швейцария) -.100 ед/мл, 10 мМ трис-HCI, 10 мМ MgCI2 (pH 7.4) при 37 С в течение 20 мин. Нуклеазный гидролиз останавливали путем отмывки препаратов в трис-HDI буфере.

Препараты для гистологических наблюдений окрашивали гема-токс илин- эоэ ином.

Л. 4L Метод учета спещптозспних шшровдер и двуядеряьи клеток

Для оценки генатоксических з<М>ектов химических соединений на мейотические, спермагогониальные и стволовые клетки проводили подсчет частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках контрольных и подопытных крыс черев различные интервалы времени после действия. При общем увеличении lOOOx просматривали не менее 1000 клеток от каждого животного (фотомикроскоп "Оптон", Германия). Определяли также частоту встречаемости двуя-дерных округлых сперматид. Число генетически аномальных клеток выражали в промилле.

IF. 5. Ыикроспекярофптоиетрш ÄWL

В нашей работе количественное определение содержание ДНК-фуксина проводили в сперматозоидах и клетках Сертоли с помощью метода прямой сканирующей денситометрии. Для этого был использован сканирующий микроденситометр Виккерс-МВ6(Англия). Количество ДНК измеряли дифференциальным методом - вычитая из интегральной плотности объекта фон такой же плопрди.

II. ff. Статиеттесний анализ данных.

Вариационно-статистический анализ цифрового материала проводили по алгоритмам, представленным в книге В. ЙУрбаха (1964) и по компьютерным программам А. П.Кулаичева (МГУ). При оценке достоверности различий использовали критерий Ст-ыодента, а в случае малых выборок непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова.

- 6 -

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

111.1. Сперматогенез jr крыс, подвергшихся действию ШМ на ранних стадиях постнатального развития.

III. 1.1. ГистлогтескнА анализ.

Вначале отметим, что практически во всех вариантах опытов НШ не вызывала статистически значимого уменьшения веса семенников у крыс, т. е. не проявила гонадотоксических эффектов.

Отдаленные гистологические последствия действия этого мутагена были видны при всех изученных дозах (25, 50 или 100 мг/кг); различия носили количественный характер. Главными морфологическими особенностями атипичного развития сперматогенных клеток были: вакуолизация в области расположения сперматогониальных клеток и клеток Сертоли, вакуолизация лептотенных сперматоцитов и округлых сперматид, образование в результате гибели сперматид пустых пространств, пикноз, отслоение, дву- и многоядерные клетки на разных стадиях дифференцировки, образование сперматид с гигантскими ядрами, спермин с деформированными головками, слущивание клеток.

III. 1. 2. Иаличественвый анализ.

Подсчеты числа различных типов сперматогенных клеток и клеток Сертоли в семенниках половозрелых крыс, проведенные через 3 месяца после действия НШ в дозах 25, 50 или 100 мг/кг, приведены в таблице 1. Пул сперматогониальных клеток и сперматоцитов I порядка статистически достоверно не отличался от kgp¡.ü!, хотя при дозе 50 мг/кг клеточные потери на стадии профазы I мэйоза составляли примерно 26% от контрольного значения. Далее видно, что при дозах в 50 или 100 мг/кг НШ вызывала значительное снижение числа округлых сперматид. При дозе НШ в 50 мг/кг весьма ощутимые потери наблюдались также на стадии сформировавшихся спермиев. Во всех остальных случаях клеточные популяции сперматогенного эпителия подопытных крыс в количественном отношении не отличались от контроля.

Через 3 мес. после действия НШ в дозе 25 мг/кг число клеток Сертоли значимо не отличалось от нормы, но при дозе 50 мг/кг этот супермутаген вызывал статистически достоверное снижение числа клеток Сертоли (потери составили 37.5% от контроля); и, наоборот, НШ в дозе 100 мг/кг приводила к увеличению данной клеточной популяции более, чем на 60%.

Таблица. 1. Число различных типов сперматогешшх клеток на

7

семенник контрольных и подопытных крыс (хЮ )

Варианты х + m к

опытов

СГ СЦ а: С

Контроль 1.3 + 0.2 8.4 + 0.5 12.9 + 0.7 17.7 + 0.4

НШ

25 мг/кг 1.6 + 0.2 7. 0 + 0. б 11.0 + 0.7 17.6 + 1.3

50 мг/кг 1.3 + 0. 01 6. 2 + 1. 0 8.1 + 1.1* 12.0 + 2. 7*

100 мг/кг 1. 4 + 0. 08 7. 7 + 0. 5 8.0 + 0. 2* 17.1 + 0.4

Примечание: СГ -сперматогонии, СЦ- пахитекные сперматоциты, ОС-округлые сперматады, С-спермин, * - разли-

чия статистически достоверны при р<0.05. ..

III. 1. Э. Цнтогенеттеский анализ

На рис, 1 приведены, полученные с помощи метода учета микроядер, результаты цитогенетической оценки отдаленных последствий действия НШ на стволовые клетки молодых крыс. Видно, что частота встречаемости округлых сперматид со следами хромосомных аномалий в семенниках подопытных зшвотных статистически достоверно увеличивается после действия супермутагена в дозах 50 и 100 мг/кг, но при дозе НШ в 25 от/кг выход генетически аберрантных клеток оставался на уровне спонтанного мутагенеза.

III.2. Сперматогенез £ крыс, подвергшихся действию ЖМ в половозрелом возрасте

III. 2.1. Гистологический анализ.

Светооптические наблюдения срезов семенников контрольных крыс свидетельствуют о нормальной структуре семенных канальцев, в которых половые клетки расположены правильными, концентрическими зонами, образуя различные клеточные ассоциации. В семенниках крыс, получавших ДМСО, морфологически атипичные сперматогенкые клетки встречались крайне редко.

Рис. 1. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами (в у„ ) в семенниках крыс через 3 мес. после действия различных доа НШ-, * - различия статистически достоверны при р<0.05. ШЯ - контроль, - 25 мг/кг, ЕПЗ - 50 мг/кг, Т77Л -100 мг/кг

В семенниках подопытных животных, которым инъецировали однократно НШ в дозе 100 мг/кг, уже на 1 день после действия этого мутагена наблюдались заметные отклонения от нормы. К ним относятся: вакуолизация цитоплазмы в сперматогониях, прелептотенных сперматоцитах, аномальные деления мейоэа, некротические клетки, образование двуядерных сперматид, вакуоли вдоль базальной мембраны семенного канальца.

На 3 день после начала эксперимента отмечалось усиление процессов атипичного развития сперматогенных клеток, которое выражалось в утке наступающей дезинтеграции сперматогенного эпителия, в слущивание е просвет канальцев округлых сп'ермтид, появления большого числа вакуолей в цитоплазме лептотенкых сперматоцитах, среди которых встречались пикнотические двуядерные клетки; обнаружены также пахитенные сперматоциты, ядра которых имели признаки дегенерации. Среди округлых сперматид встречались дву- и трехядерные клетки, в ядрах сперматид возможно из-за нарушения процессов кон-

денсации ядерного материала обнаруживались полости различных размеров, хроматин располагался ободком вдоль ядерной мембраны. Клетки Сертоли содержали вакуоли.

На 8 декь фиксации во многих канальцах в результате нарушения целостности клеток Сертоли наблюдалось отслоение от баэальной мембраны сперматогенного эпителия, в котором с большой частотой встречались двуядерные и трехядерные пахитенные сперматоциты, хроматин которых нередко имел дегенеративный характер, а также дву- и трехядерные сперматиды. Около баэальной мембраны были видны сперыатогонии с цитоплазыатическими вакуолями, на некоторых гистологических срезах отмечено дезориентированное расположение половых клеток и присутствие пустых пространств различна размеров, которые могут формироваться в результате дегенерации, э фагоцитоза сперматид и спермагоцитов. Важно добавить, что весьма частым событием, с которым мы сталкивались при анализе срезов семенников в это время эксперимента бьши также семенные канальцы с признакам!! полной атрофии.

Многие клеточные и ядерные патологии, которые были описаны выше, также обнаруживались и на 19 день после действия ННМ. Различия носили количественный характер и были более выражены. В структурно аномальных канальцах сперматогенный эпителий практически был полностью разрушен, присутствовали гигантские некротические клетки и аномальные спермин.

На 25 день фиксации разнообразие таких аномалий, как вакуолизация, многоядерные клетки, отслоение эпителия от баэальной мембраны, дезориентация клеток, дегенеративные изменения ядер, нарушения конденсации хроматина в сперматидах, встречались также с большой частотой.

На 32 день фиксации у одного из изученных самцов семенники были полностью атрофированы. Как показала гистологическая проверка, во всех семенных канальцах развивающиеся половые клетки отсутствовали, а встречались только клетки Сертоли и сперматого-нии, в отдельных канальцах были видны крупные вакуоли и слущива-ние клеток в просвет канальца. У других животных канальцы имели полностью регрессивный характер.

Вызванные НММ патологические изменения в семенниках крыс были широсо представлены и на 50 день фиксации. Практически во асех семенных канальцах были выявлены нарушения структуры эпителия.

Выявлено присутствие большого числа двуядерных лептотенных сперматоцитов, гибнущей мейотической метафазы, сперматид с пикноти-ческими ядрами, спермиев е деформированными головками, двуядерные спермин, некротические клетки.

На 100 день фиксации гистологическая картина семенников подопытных крыс во многом была идентична контролю.

III. 2. 2. Количественная оценка

Результаты, характеризующие динамику количественных изменений различных типов сперматогенных клеток в ответ на действие супермутагена НШ в доае 100 мг/кг, представлены в виде процентных соотношений на рис. 2а,С.

Общий процент сперштогониальных клеток в течение первых 3 нед эксперимента постепенно уменьшался, достигая на 19 день фиксации максимальных потерь, которые составляли примерно 68% от контроля на 8 и 19 дни фиксации. 8атем наступал процесс постепенного увеличения числа сперматогониев - на 25 и 32 дни фиксации оно составляло, соответственно 75 и 78% от контрольных значений. На 50 день после начала эксперимента nyi сперматогониев полностью соответствовал уровню контроля, а на 100 день фиксации на 20% даже' превышал норму.

В семенниках подопытных крыс процентное содержание пахитен-ных сперматоцитов значительно снижалось на 8 день фиксации, составляя 65% от контроля. Ощутимые потери пахитенных сперматоцитов были видны на 19 и 32 дни фиксации - они составляли, 54 и 46%. И хотя на 25 день фиксации клеточные потери на стадии профазы I мейоза тоже были сравнительно большими (32%), здесь значимость различий не установлена Тенденция к нормализации пула сперматоцитов I порядка видна на 50 и 100 дни фиксации.

При всех выбранных сраках фиксации резких количественных изменений пула округлых сперматид не наблюдалось. Тем не менее можно констатировать, что число этих клеток, по.крайней мере, на 8, 32 и 50 дни фиксации в среднем на 30% ниже нормы, в. последнем случае доказана достоверность этого снижения по сравнению с контролем.

До 32 дня фиксации число спермиев статистически достоверно не отличалось от контроля. Однако на 32 день эксперимента наблюдалось резкое увеличение количества спермиев- примерно на 60%.

Шсле этого (50 и 100 дни фиксации) спермин шли по пути нормали-

- 11 -

зации, достигая в конечном счете исходных уровней.

На 3 и 8 дни после действия НММ число клеток Сертоли уменьшалось. соответственно на 25 и 40% от контроля. Из полученных данных также видно, что несмотря на отсутствие статистически зна-

Рис.2а- Динамика количественных изменений сперматогониев (•) и пахитенных сперматоцитов (+) в семенниках крыс после действия НШ в дозе 100 иг/кг. Hb горизонтали - дни фиксации, по вертикали - число клеток в X от контроля.. * - различия статистически достоверны при р<0.05. чимых различий дефицит клеток Сертоли на конечных этапах эксперимента имеет место.

III. г. 3. Цитологическая характеристика атипично рззЕЯваздяяея свещатогенйых клеток.

Начиная с 3 дня после введения животным НММ и затем на последующи сроках фиксации вплоть до 50 дня, в их семенниках обнаруживалось большое число клеток с различными ядерно-хромосомными аномалиями. Для популяции сперматогониев и сперматоцитов наи-

более характерными были двуядерные клетки, клетки со следами хромосомных поломок, или микроядрами.

На стадии делений мейоэа были видны: выброс хромосом эа

Рис.26- Динамика количественных изменений округлых сперма-тид (•) и спермиев (+) в семенниках крыс после действия НШ в дозе 100 мг/кг. По горизонтали - дни фиксации, по вертикали - число клеток в % от контроля.

* - различия статистически достоверны при р<0.05.

пределы веретена, образование одиночных или множественных мостов, ассиметричное расположение хромосом на пластинках.

В популяции округлых сперматид обнаруживались клетг^: е мик-ропдрами - одни были мелкие и пикнотические, другие имели крупные размеры и чаще всего диффузный характер хроматина. Обычно около основного ядра располагалось одно микроядро, клетки с двумя микроядрами были весьма редким событием. Среди округлых сперматид часто встречались дву- и трехядерные клетки, клетки с гигантскими ядрами и нарушенной морфологией хроматина.

Микроядра, деформированные, морфологически аномальные ядра с нарушенной структурой хроматина наблюдались также в удлиняющиея -сперматидах и сперших.

В популяции клеток Сертоли были идентифицированы микроядерные клетки, двуядерность, хотя в контроле такие отклонения от нормы мы не регистрировали вообще.

III. 2. 4. ЦитавпгтичсскиЯ анализ

Результаты подсчета частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках крыс через различные интервалы времени после действия ШЛИ в довах 2Б или 100 иг/кг суммированы на рис. За.

Уже через 3 дня после действия мутагена число округлых сперматид с микроядрами достоверно превышало контрольный уровень, что указывает на высокую чувствительность хромосом на стадиях диаки-неза-поздней пахитены. В профазе I мейоэа высокую генетическую чуаствитэльгость обнаружили также хромосомы на стадиях средней пахитены и прелептотены-лептотены. Это доказывается появлением большого числа округлых сперматид с микроядрами на 8 и 19 дни фиксации, На 25 день фиксации НШ при дозе 25 мг/кг не вызывала статистически значимого увеличения округлых сперматид с микроядрами, хотя при дозе 100 мг/кг выход хромосомных мутаций был значителен- он превышал контрольный уровень более чем в 15 раз. НШ при дозе 100 мг/кг индуцировала образование большого числа округлых сперматид со следами хромосомных аномалий и на 32 день после начала эксперимента. Регистрация генетически аберрантных сперматид при этих двух последних сроках фиксации свидетельствует о по-ражаемости хромосом дифференцирующихся спермзтогониев высокой дозой НЖ О степени влияния НШ на генетический материал стволовых сперматогониев судили по частоте встречаемости округлых сперматид с микроядрами на 50 и 100 дни фиксации: в первом случае уровень аберрантных клеток еще продолжал достоверно превышать фоновое значение, во-втором - число таких клеток соответствовало исходному, контрольному уровню.

В ходе наших цитологических наблюдений проводился также учет двуядерных клеток как в семенниках контрольных, так и в семенниках подопытных крыс. Проведенные подсчеты показали (рис. 36) , что после действия НШ в дозах 25 или 100 мг/кг на профазные сперма-тациты, находившиеся на стадиях диакинеаа-поздней пахитены, сред-

Рис.За. Число округлых спермагид с микроядрами (в ) в семенниках крыс через раличные интервалы времени после действия НММ. По горизонтали - дни фиксации.

ES2- контроль

K\N\N _ pe .m/t-r.

N\\\\ LU BU / . ы.

|ГГЩ- 100 мг/кг * -различия статистически недостоверны при р<0.05

ней пахитены и прелептотены-лептотены частота встречаемости двуя-дерных округлых сперматид, соответственно, на 3, 8 и 19 дни фиксации увеличивалась в несколько раз по сравнению с контролем. На 25 и 50 дни фиксации, когда анализу подвергались постмейоти-ческие клетки, произошедшие, соответственно, от дифференцирующихся и стволовых сперматогониев выход двуядерных округлых спермагид также достоверно превышал контрольный уровень. Однако при более отдаленном сроке фиксации (100 день фиксации) число двуядерных клеток не отличалось от спонтанного уровня.

рис. 36. Число двуядерных округлых сперматид (в %. ) в семенниках крыс через различные интервалы времени после действия НШ. Ш горизонтали- дни фиксации, контроль ■I- 25 мг/кг |5£]- 100 мг/кг * -разлитая статистически недостоверны при р<0.05

111.2.5. Цихофотоивтрмеспий аиадиз ДШ в спещнях и клетках

Серхояи.

Как видно из результатов цитофотометрических измерений (рис.4), через 8 и 25 дней после действия НШ в дозе 100 мг/кг количество ДНК-фуксина в гаметах снижается по сравнению с контролем только на 10%, однако различия статистически достоверны.

Шсде обработки препаратов ДНКааой 1 количество ДНК-фуксина в сперматозоидах контрольных крыс практически оставалось без изменений. Однако уже через 8 дней после действия НЫМ количество

Таблица. 2. Содержание ДНК-фуксина в ядрах спермиев контрольных и подопытных крыс.

Варианты Обработка * + mj

опыта препаратов

Контроль - 84.5 + 2.3 (16)

ft II II И «1 ДНКаэа I 82.0 + 2.4 (20)

НШ, 100 мг/кг

8 день фиксации - 78.0 + 1.7 (13)

к i* II «i II ДНКаза I 62.0 + 1.6* (16)

25 день фиксации - 77.0 + 1.8 (18)

•i и ti и ti ДНКаза I 61.0 + 1.4* (15)

БО день фиксации - 84.6 + 2.0 (14)

1Г II II II II ДНКаза I 65.0 + 1.7* (17)

Примечание: •* - в сравнении с необработанным контролем внутри каждого варианта опыта различия статистически достоверны при р<0.05, в скобках - коэффициенты вариации в %.

ДНК-фуксина в обработанных нуклеааой спермиях уменьшалось на 20%. Аналогичные потери (21£) в интенсивности окрашивания ядер после нуклеазного гидролиза наблюдались и в препаратах спермиев, приготовленных через 25 дней после действия мутагена. На 50 день фиксации в ответ на действие ДНКазы I также выявлено снижение количества ДНИ-фуксина в спермиях примерно на 23%.

Измерения содержания ДНК-фуксина проводили также в клетках Сертоли. На 8 день фиксации количество ДНК достоверно снижалось по сравнению с контролем примерно на 15%. На 25 день фиксации потери количества ДНК-фуксина в клетках Сертоли улс составляли 22.6% (различия также были статистически достоверны при р<0.05). И хотя на 50 день фиксации количество ДНК-фуксина отличалось от контрольных значений только на 7. ЗХ, и в этом случае была установлена достоверность различий.

111. Э. Особенности сперматогенеза £ половозрелых крыс после прямых и комбинированных эффектов НШ и рогора.

II 1.3.1. Гистологический анализ.

Сильных гистологических изменений в семенниках крыс через 19 дней после действия рогора не было обнаружено. Шсле действия НШ в дозе 50 мг/кг по отдельности или в сочетании с различными дозами рогора или в сочетании с малой дозой НШ в семенниках крыс наблюдались существенные морфологические отклонения от нормы, схожие с теми, что были описаны выше.

II1.3.2. Колтествеввая оцввка

Подсчеты различных типов сперматогенных клеток, проведенные через 19 дней после химических воздействий, показали, что практически во всех случаях число спермагогониальных клеток и спермато-цитов I порядка достоверно не отличалось от контроле Тем не мен-нее число округлых сперматид и спермиев также во всех случаях достоверно (при р<0.05) уменьшалось по сравнению с контролем - на 25-32% (рис.4).

НШ и рогор, как при прямых, так и при сочетанных эффектах не влияли на пул клеток Сертоли.

III.3.Цитогеветияеский анализ

Результаты цитогенетического изучения представлены в табл. 3. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках крыс, получавших суммарные дозы рогора 15 или 30 мг/кг существенно превышала уровень, наблюдавшийся при спонтанном мутагенезе. У крыс, которым однократно инъецировали НШ в дозах 25 или 50 мг/кг, уровень округлых сперматид со следами хромосомных поломок также достоверно превышал контрольные значения.

Когда крысам до однократного введения НШ в дозах 25 или 50 мг/кг инъецировали в течение 3 дней по 5 мг/кг рогора, в их семенниках по сравнению с позитивными контролями наблюдалось снижение частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами, соответственно, в 2.5 и 3.4 раза Суммарная доза рогора в 30 мг/кг также приводила к последующему уменьшению (соответственно, в 2.4 и 2.1 раза ) выхода генетически аберрантных клеток в семенниках

•7

рис. 4- Число округлых сперматид и спермиев (х10 ) в семеннике крыс через 19 дней после химических воздействий. 1-контроль, 2- рогор, 5 иг/кг; 3- рогор, 10 мг/кг; 4- НММ, 25 мг/кг; 5- НММ, 50 мг/кг; 5- рогор (5x3) + НММ (25); 7- рогор (5x3) + НШ (50); 8- рогор (10x3) + НШ (50); 9- НШ, 5 мг/кг; 10- НЫМ (5) + НШ (50).

Ш- сперыатиды

ШЗ- спермии

животных, подвергшихся аатем однократному воздействию НШ в дозах 25 или 50 мг/кг.

Малая доза НШ ( 5 мг/кг), вводимая крысам в течение 5 дней, выаывала слабое, но статистически достоверное по сравнению с отрицательным контролем увеличение частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами. Уровень хромосомных мутаций значительно возрастал (оолее чем в 1.5 раза) в популяции ранних постмейоти-ческих клеток после последующего введения этим животным высокой дозы НШ (50 мг/кг).

Таблица 3. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках контрольных и подопытных крыс.

Варианты Дозы Число

опытов веществ аберрантных

мг/кг клеток, х + т^

Контроль 1.1 + 0.2 (5)

Рогор 5 X 3 7.1 + 1.4* (5)

Ю X 3 7.5 + 0.9* (4)

НШ 25 X 1 17.0 + 2.0* (4)

БО X 1 7.6 + 0.6* (4)

Рогор+ШМ 5 X 3 + 25 X 1 7.0 + 0. 9**(4)

10 X 3 + 25 X 1 7.1 + 0. 5**(4)

5 X 3 + 50 X 1 2.2 + 0. 5**(4)

10 X 3 + 50 X 1 .. 3.5 + 0.6**( 4)

НШ 5 X 5 4.3 + 0. 4* (4)

НШ + НШ 5 X 5 + 50 X 1 12.1 + 0.5**( 4)

Примечание: * - различия в сравнении с отрицательным контролем статистически достоверны при р< 0.05, ** - различия в сравнении с позитивным контролем статистически достоверны пр:з р< 0.05, в скобках - число изученных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящей работы, полученные с помощью комплексного методического подхода, детально характеризуют ряд сторон индуцированных процессов деструкции и последующего восстановления сперматогенного эпителия млекопитающих. Анализ наших данных показывает, что морфологический ответ развивающихся сперматогенных клеток крыс на краткосрочные и отдаленные аффекты НШ аналогичны тем нарушениям, которые были описаны в ряде других экспериментальных исследованиях. Наш наблюдения на количественном, морфологическом, цитогенетическом уровнях подтверждают (СЬарШ et а1., 1983; Куа11 а1. ,1984), что семенники неполовозрелых крыс более чувствительны к действию токсических соединений, чем гонады поло-

возрелых самцов. Поражаемость популяции примитивных стволовых клеток радиацией и химическими токсикантами гораздо выше по сравнению с дефинитивными стволовыми сперматогониями половозрелых животных.

Результаты нашего анализа ранних гистопатологических эффектов НШ на крыс показали, что в сперматогенном эпителии млекопитающих несколько мишеней -это, помимо сперматогониев, профазные сперматоциты, делящиеся сперматоциты, дифференцирующиеся сперма-тиды. Поражение этих мишеней может быть опосредовано нарушениями структурно-функциональной целостности клеток Сертоли, но с другой стороны, клетки Сертоли могут участвовать в переброске НШ или ее активных метаболитов в стан спермагогеннык клеток.

Если рассматривать наши результаты количественного анализа сперматогенных клеток через различные интервалы времени после воздействия НШ, опираясь на данные по кинетике сперматогенеза у крыс, то тогда увидим, что округлые и удлиняющиеся сперматиды сохраняли способность трансформироваться в спермин. Весьма высокую устойчивость к цитотоксическим эффектам НШ обнаружили также сперматоциты на стадиях мейотических делений, пахитены, прелепто-тены-лептотены, а также, возможно, поздние сперматогонии.

Количественные колебания клеток Сертоли, появление среди них микроядерных и двуядерных клеток, выявленные в семенниках крыс после действия НШ, служит еще одним из доказательств перехода клеток Сертоли из состояния митотической инертности к делениям. Тем не менее восстановление пула клеток Сертоли ещз не означает, что их метаболизм нормален ( Rich, de Krester, 1977; Délie et al., 1986). В наших экспериментах функциональная неполноценость клеток Сертоли была доказана с помощью цитофотометрического анализа содержания ДНК-фуксина.

Изучения по критерию микроядер, регистрируемых в округлых сперматидах через различные интервалы времени после действия НШ, показала высокую чувствительность хромосом профазных сперматоци-тов, дифференцирующихся сперматогониев, стволовых клеток. Однако поражения стволовых сперматогониев носили обратимый характер.

Высокая чувствительность ДНК тестикулярных спермиев к ДНКазе I, на 8, 25 и 50 дни фиксации может быть следствием индуцированных ШМ нарушений, соответственно, метаболизма основных ядерных белков в спермиогенезе, синтеза РНН в мейозе и генетического ап-

парата сперматогониальных клеток.

Сочетанные эффекты малых и высокой доз НММ, не приводили к адаптации, а вызывали усиление генотоксической активности этого агента. Тем самым наши наблюдения подтверждают сложность явления предадаптации, когда в одних случаях отмечаются защитные эффекты,-а в других - происходит сенсибилизация. Возможно, при изменениях условий эксперимента или в других тест-системах положительный эффект будет достигнут. Ведь "уступчивость" НШ показана в ряде наблюдений Шрощенко, Абилев, 1988; Захидов и др. 1994). И, наконец, из результатов настоящей работы следует, что при сочетанных эффектах рогора и НШ уровни хромосомных поломок в популяции округлых сперматид сильно снижались. Механизм, лежапщй в основе этого явления пока неизвестен. Весьма вероятно, что столкновение этих двух ксенобиотиков в живом организме может приводить к их взаимному уничтожению как мутагенных факторов, но подтвердить или опровергнуть это предположение могут только физико-химические исследования.

вшоды

1. В семенниках крыс, подвергшихся действию химического супермутагена НШ в первые дни после рождения, процессы сперматогенеза шли по атипичному пути. Нарушения в развитии мужских половых клеток выявлялись на всех уровнях исследования - количественном, гистологическом и цитогенетическом.

2. Деструктивные, цито-гистологические изменения в спермато-генном эпителии крыс, подвергшихся действию НШ в половозрелом возрасте, имели обратимый характер.

3. В ряду развивающихся сперматогенных клеток высокую чувствительность к цитотоксическим эффектам НШ обнаружили клетки сперматогониального компартмента.

4. Генетически поврежденные профазные сперматоциты, дифференцирующиеся и стволовые сперматогонш сохраняли способность преодолевать мейатический барьер, о чем свидетельствует высокая частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами, двундерных клеток, морфологически аномальных спермиев в определенные моменты времени после действия. Индуцированные в стволовых клетках хромосомные изменения недолгоживущи.

5. Цитохимический количественный анализ ДНК показал, что индуцированные в сперматогониях, пахитенных сперматоцитах и сперма-тидах изменения приводят к формированию гамет с нарушенной структурой хроматина.

6. Выявлены морфологические и количественные изменения клеток Сертоли в ответ на действие НШ. Цитохимическое изучение обнаружили высокую вариабельность и уменьшенное содержания ДНК-фуксина в клетках Сертоли у подоопытных крыс. Доказана способность клеток Сертоли переходить к митотическим делениям.

■ 7. Сочетанные эффекты малых и высоких доз НШ приводили к структурным нарушениям сперматогенного эпителия, клеточным потерям на постмейотических стадиях дифференцировки и значительному увеличению по сравнению с позитивными контролями числа аберрантных клеток.

8. При выбранных условиях эксперимента фосфорорганический пестицид рогор оказывал морфологические, цито- и генотоксические эффекты на сперматогенные клетки половозрелых крыс.

9. При комбинированном воздействии рогора и НШ на профазные сперматоциты выход округлых сперматид со следами хромосомных поломок резко снижался по сравнению с позитивным контролем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.Т.Захидов, Л.П.Паранюшкина, Хода.А. X. Ыахран, Эль-Саед Касем Абделъ-хади, ЕА. Голиченков. 1994. Влияние химических мутагенов на сперматогенез млекопитающих. Цитогенетический анализ// Известия РАН, сер. биол., N 3, с. 353-362.

2. С.Т.Захидов, Л. П.Паранюшкина, Хода А.X. Махран, Эль-Саед Касем Абдель-хади, Е А. Голиченков. 1994. Влияние химических мутагенов на сперматогенез млекопитающих. Количественная оценка// Известия РАН, сер. биол., N 6, с. 870-879.

3. ЕА. Голиченков, С.Т.Захидов, Эль-Саед Касем Абдель-хади, Т. А. Волошина 1994. Парадоксальные биологические эффекты пестицидов// Тезисы докладов У1 конференций РНАН, отд. экологии, Шсква, с. 11-12.