Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистологическое и цитологическое исследование сперматозоидов у крыс после действия химического супермутагена нитрозометилмочевины

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Гистологическое и цитологическое исследование сперматозоидов у крыс после действия химического супермутагена нитрозометилмочевины"

иосишсиия государственной униикрситег ии. и. в. ломоносом

ШОЛОГИЧКСИНЯ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576: 591

ЭЛЬ- САЯЕД КАСКИ АВДЕЛЬ-ХАДИ КАСКИ

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПКРЦАТОГКНКЗА У КРЫС ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ХИШЧШГОГО СУПЕРИУТАГЕНА НИТРОЖНЕТИЛМОЧЕВМШ

(03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994 год

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета (Декан- профессор ИВ. Гусен) псковского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель - доктор биологических наук

(1 Т. Закидав

Официальные оппоненты; доктор медицинских наук, профессор

Т. К. Дубовая кандидат биологических наук, доцент Ы А. Лалге

Ведущее учреждение- Институт биологии развития им. К 11 Кольцова,

Российской академии наук 3о

Защита диссертации состоится Мча в 13 М Л

на заседании специализированного совета Д. 053.05.68 по зап^сте диссертаций ка- соискание ученой степени кандидата биологически; наук при Московском государственном университете им 11 Б. -Ломоносова по адресу: Москва, 110699, Лгнинские горы, МГУ, Биолог ичес ки! Факультет.

С материалами диссертации мокно ознакомиться в библиотек! Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан "дд " рлЭбрЗ. 1994 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета ) 1

кандидат биологических наук Е. II. Калжтрагова

ОБОАЯ ХАРАКТЕРСТИКЛ PABOTU

Актуальность проблемы Исследованиям проблем сперматогенеза посвящено огромное число работ, многообразных по содержанию. Живой интерес к различным аспектам сперматогенеза объясняется уникальностью процессов развития мужских половых клеток, в ходе которых происходят необычные морфологические и биохимические изме- -нения ядерных и клеточных структур. Сперматогенный процесс, как известно, завершается образованием большого количества мобильных клеток- сперматозоидов, способных к автономному существованию и переносу отцовской генетической информации в яйцеклетку (Ру-эен-Ранге, 1981; Mann, Lutvak-Mann, 1991; Захидов, 1993). Многочисленные сравнительные и экспериментальные исследования мужского гаметогенеза у позвоночных и беспозвоночных сыграли и продолжают играть не последнюю роль в решении ряда вопросов теоретической биологии.

В последние годы в области биологии размножения одно из центральных мест занимают исследования, в которых в качестве методического приема для активного вмешательства в процессы сперматогенеза нередко выступают химические соединения различного класса. Такие исследования имеют глубокое значение, как для выяснения механизмов биологического действия ксенобиотиков, так и для установления клеточных мишеней, источников восстановления структурно-функциональной целостности сперматогенного эпителия, механизмов, лежащих в основе некоторых форм мужского бесплодия. Получены также данные, свидетельствующие о широких возможностях использования сперматогенеза млекопитающих в качестве биологического дозиметра и индикатора хромосомно-ядерных аномалий, вызываемых ионизирующими излучениями, химическими воздействиями, болезнями, нарушениями структуры питания (Haoker-Klom, 1984; Evenson et al., 1984; Pinkel, 1994).

Цель и задачи исследования. Основной целью настояпрй работы было комплексное изучение некоторых закономерностей сперматогенеза у крыс, подвергшихся прямым или комбинированным эффектам супермутагена нитрозометилмочевины (НШ).

Конкретными задачами исследования были:

- морфологический и количественный анализ развивающихся сперматогенных клеток в различные моменты времени после хими-

ческих воздействий.

- изучение цитогенетической чувствительности клеток профазы мейоэа и сперматогониального компартмента, глубины индуцированш хромосомных изменений в стволовых клетках.

- изучение цитохимических свойств хроматина спермиев.

- оценка адаптивной реакции сперматогенных клеток на комби: рованные эффекты ШМ и фосфорорганического пестицида рогора.

Частными задачами работы были: - изучение некоторых цитологических особенностей клеток Серт« ли после химических воздействий.

- определение возможности использования клеток сперматоге: ного эпителия млекопитающих как индикаторной системы ( по крит< рию микроядер) для оценки отдаленных генетических последствий х мических агентов.

Научная новизна работы. Впервые благодаря комплексному мет дическому подходу подробно описаны специфические особенности ди ференциругацихся сперматогенных клеток, вставших на путь атипичн го развития, в условиях индуцированного химического мутагенез одновременно детальна прослежена динамика количественных измен ний клеточных популяций в процессе разрушения сперматогеннс эпителия и его последующей регенерации.

Установлены различия в реакции половых клеток на цитотокс ческие эффекты НЖ- наиболее поражаемыми оказались митотичес размножающиеся клетки. Впервые дана сравнительно полная харага ристика сперматогенным клеткам, развивающимся в семенниках по.] возредых крыс, которые подверглись действию НШ в первые ) постнатального развития. Отдаленные последствия мутагенного уд; по стволовым сперматогониям проявляются в виде ядерно-хромосом] аномалий и клеточных потерь в популяциях спермиогенных клеток.

Доказана способность аберрантных сперматогониев преодолев: мейотический барьер и достигать постмейотических стадий сперма' генеэа, о чем свидетельствует высокая частота встречаемости I руглых еперматид с микроядрами на отдаленных сроках последейст Оригинальными наблюдениями впервые доказана способность норме не пролиферирующих, дифференцированных клеток Сертоли давлением мутагенов переходить к митотическим делениям, благод которым идет обновление данной клеточной популяции.

На примере сперматогенеза крыс получены принципиально на данные о модифицирующих цитогенетических эффектах фосфорорга

- з -

ческого пестицида рогора и супермутвгена НММ.

Полученные в работе результаты делают более ясными механизмы, демашде а основе патологических явлений сперматогенного процесса, а следовательно, объяснит возможные причины некоторых форы мужской стерильности.

Практическая значимость работы. Методология настоящего исследования может быть использована для решения практических задач репродуктивной токсикологии. Результаты исследований свидетельствуют об эффективности метода учета сперматогенных микроядер и перспективности их широкого внедрения для скрининга индивидуализированных химических соединений на мутагенность и цитогенети-ческого мониторинга.

Результаты исследований должны войти в регистры мутагенов и должны учитываться специалистами, в круг интересов которых входит создание противоопухолевых препаратов и средств химической защиты от вредителей сельского хозяйства.

Сведения, полученные в ходе выполнения настоящей работы,. нашли место в курсе лекций, читаемом на кафедре эмбриологии МГУ им. М. В. Ломоносова.

Апробация работы. Материалы настоящей диссертации докладывались на семинарах кафедры эмбриологии МГУ, годичной научной конференции РНАН (1994, №>сква) и совещании "Экологическая биохи-мия"( ИБР РАН, Шсква, 1994).

Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликованы 3 научные работы.

Объем работы. Диссертация изложена по общепринятой научной схеме и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, изложения результатов, обсуждения и выводов. Работа представлена на 147 страницах, и состоит ив 9 таблиц и 33 рисунков. Список литературы включает 172 названий, из них 32 - на русском языке.

I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Объекты исследований и постановка опытов.

В работе использованы половозрелые и неполовозрелые самцы срыс Вистар.

В первой серии опытов были использованы молодые крысята в

возрасте 7-10 дней. Этим животным инъецировали однократно внутрибрюшинно НММ в доаах 25, 60 или 100 мг/кг. Фиксацию материала проводили через 3 мес после начала эксперимента.

Во второй серии опытов крыс в возрасте 2-3 мес. подвергав! однократному воздействию нитроаометилмочевины (НММ) в дозе 25 или 100 мг/кг. Контролем служили интактные животные или животные, которым однократно внутрибрюшинно инъецировали ДДОО.

В третьей серии наших опытов были использованы половозрелые самцы крыс. Подопытным животным в течение 3 дней внутрибрюшинно вводили фосфорорганический пестицид диметоат (или рогор, CgH^NOj

в дозах 5 или 10 мг/кг, затем части животным из этих групп инъецировали однократно НММ в дозах 25 или 50 мг/кг. В другой серии опытов крысам в течение 5 дней вводили по 5 мг/кг ШМ после чего части из этих животных инъецировали высокую дозу 50 мг/кг. Отрицательным контролем служили интактные и получавшие однократно и внутрибрюшинно по 0.4 мл даго, а в качестве позитивного контроля выступали крысы, подвергшиеся однократному воздействию НММ в дозах 25 или 50 мг/кг.

Всех животных забивали под легким наркозом в зависимости от поставленных задач через различные интервалы времени после начала эксперимента.

II. 2. Приготовление и фиксация препаратов.

Извлеченные семенники взвешивали, и затем один из них целиком помещали в уксусно-глицериновую смесь (1:1) на 2 нед. Другой семенник разрезали и готовили отпечатки. После высушивания на воздухе эти препараты фиксировали в 101-ном нейтральном формалине в течение 15 мин. Другую часть семенника фиксировали в растворе Еуэна в течение 1 нед. , -

На следующем этапе работы гонады, фиксированные в УГС механически разрушали и суспендировали. Содержимое анализировали в камере Горяева с помощью фазово-контрастного устройства при общем увеличении 400х ("Opton", Германия).

Для гистологического анализа семенники, фиксированные в растворе Буэна, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации по 40 мин в каждой смене, а затем заливали в парафин при температуре 50-58 С. Приготавливали срезы толщиной 5 мкм.

- 5 -

II. 3. Он1>аяннянне препарггтв.

Для проведения цитогенетических и цитохимических исследований были выбраны следующие условия окрашивания по Фельгену: кислотный гидролиз отпечатков семенников проводили в 5 N HCl при температуре 37 С в течение 12 мин. и затем окрашивали в реактиве Шиффа -1ч. при комнатной температуре.

Часть препаратов перед окрашиванием по Фэльгену обрабатывали ДНКазой I (Koch Light, Швейцария) -.100 ед/мл, 10 мМ трис-HCI, 10 мМ L<gOI2 (pH 7.4) при 37 С в течение 20 мин. Нуклеазный гидролиз останавливали путем отмывки препаратов в трис-HCI буфере.

Препараты для гистологических наблюдений окрашивали гематоксилин-эозином.

II. 4. Уетод учета спермзтогенных микроядер и двуядерных клеток

Дня оценки генотоксических эффектов химических соединений на мейотические, сперматогониальные и стволовые клетки проводили подсчет частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках контрольных и подопытных крыс через различные интервалы времени после действия. При общем увеличении 1000х просматривали не менее 1000 клеток от каждого животного (фотомикроскоп "Оптон", Германия). Определяли также частоту встречаемости двуя-дерных округлых сперматид. Число генетически аномальных клеток выражали в промилле.

II. б. Иикроспектрофсггоиетрия £ПК.

В нашей работе количественное определение содержание ДНК-фуксина проводили в сперматозоидах и клетках Сертоли с помощью метода прямой сканирующей денситометрии. Для этого был использован сканирующий микроденситометр Виккерс-М36(Англия). Количество ДНК измеряли дифференциальным методом - вычитая из интегральной плотности объекта фон такой ж площади.

II. 6. Статистический анализ данных.

Вариационно-статистический анализ цифрового материала проводили по алгоритмам, представленным в книге В. ЕУрбаха (1964) и по компьютерным программам А.П.Кулаичева (МГУ). Щэи оценке достоверности различий использовали критерий Стъюдента, а в случае малых выборок непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова.

- 6 -

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

111.1. Сперматогенез £ крыс, подвергшихся действию НММ на ранних стадиях постнатального развития.

111.1.1. Гистологический анализ.

Вначале отметим, что практически во всех вариантах опытов НШ не вызывала статистически значимого уменьшения веса семенников у крыс, т.е. не проявила гонадотоксических эффектов.

Отдаленные гистологические последствия действия этого мутагена были видны при всех изученных дозах (25, 50 или 100 мг/кг); различия носили количественный характер. Главными морфологическими особенностями атипичного развития сперматогенных клеток были: вакуолизация в области расположения сперматогониальных клеток и клеток Сертоли, вакуолизация лептотенных сперматоцитов и округлых сперматид, образование в результате гибели сперматид пустых пространств, пикноз, отслоение, дву- и многоядерные клетки на разных стадиях дифференцировки, образование сперматид с гигантскими ядрами, спермин с деформированными головками, слуирвание клеток.

III. 1. 2. Количественный анализ.

Подсчеты числа различных типов сперматогенных клеток и клеток Сертоли в семенниках половозрелых крыс, проведенные через 3 месяца после действия НШ в дозах 25, 50 или 100 мг/кг, приведены в таблице 1. Пул сперматогониальных клеток и сперматоцитов I порядка статистически достоверно не отличался от нормы, хотя при дозе 50 мг/кг клеточные потери на стадии профазы I мейоза составляли примерно 26% от контрольного значения. Далее видно, что при дозах в 50 или 100 мг/кг НМЫ вызывала значительное снижение числа округлых сперматид. При дозе НШ в 50 мг/кг весьма ощутимые потери наблюдались также на стадии сформировавшихся спермиев. Во всех остальных случаях клеточные популяции сперматогенного эпителия подопытных крыс в количественном отношении не отличались от контроля.

Через 3 мес. после действия НММ в дозе 25 мг/кг число клеток Сертоли значимо не отличалось от нормы, но при дозе 50 мг/кг этот супермутаген вызывал статистически достоверное снижение числа клеток Сертоли (потери составили 37.5% от контроля); и, наоборот, НММ в дозе 100 мг/кг приводила к увеличению данной клеточной популяции более, чем на 60%.

Таблица. 1. Число различных типов сперматогенных клеток на семенник контрольных и подопытных крыс (к107)

Варианты х + т^ опытов ----------------------------

сг сц а:

С

Контроль НММ

25 мг/кг 50 мг/кг 100 мг/кг

1.3 + 0.2

1.6 + 0.2 1.3 + 0. 01 1. 4 + 0.08

8. 4 + 0.5

7.0 + 0.6

6. 2 +1.0

7. 7 + 0. 5

12.9 + 0.7

11.0 + 0.7 8.1 +1.1* 8.0 + 0.2*

17. 7 + 0. 4

17.6 + 1.3 12. 0 + 2.7* 17.1 + 0.4

Примечание: СГ -сперматогонии, СЦ- пахитенные сперматоциты, ОС-округлые сперматиды, С-спермии, * - разли-

чия статистически достоверны при р<0.05.

111.1.3. ищозенетичвскиА анализ

На рис. 1 приведены, полученные с помощью метода учета микроядер, результаты цитогенетической оценки отдаленных последствий действия НШ на стволовые клетки молодых крыс. Видно, что частота встречаемости округлых сперматид со следами хромосомных аномалий в семенниках подопытных животных статистически достоверно увеличивается после действия супермутагена в дозах 50 и 100 мг/кг, но при дозе НШ в 25 мг/кг выход генетически аберрантных клеток оставался на уровне спонтанного мутагенеза.

II1.2. Сперматогенез £ крыс, подвергшихся действию НММ в половозрелом воарасте

111.2.1. Гистологический анализ.

Светооптические наблюдения срезов семенников контрольных крыс свидетельствуют о нормальной структуре семенных канальцев, в которых половые клетки расположены правильными, концентрическими зонами, образуя различные клеточные ассоциации. В семенниках крыс, получавших ДШО, морфологически атипичныэ сперматсгенные клетки встречались крайне редко»

- о -

Рис. 1. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами (в у„ ) б семенниках крыс через 3 мес. после действия различных доз НШ; * - различия статистически достоверны при р<0.05. ■Щ' - контроль, ЕШ- 25 мг/кг, ЕШ - 50 мг/кг, Ч77Л-100 мг/кг

В семенниках подопытных животных, которым инъецировали однократно ШМ в дозе 100 мг/кг, уже на 1 день после действия этого мутагена наблюдались заметные отклонения от нормы. К ним относятся: вакуолизация цитоплазмы в сперматогониях, прелептотенных сперматоцитах, аномальные деления мейоза, некротические клетки, образование двуядерных сперматид, вакуоли вдоль базальной мембраны семенного канальца.

На 3 день после начала эксперимента отмечалось усиление процессов атипичного развития сперматогенных клеток, которое выражалось в уже наступающей дезинтеграции сперматогенного эпителия, в слущивание в просвет канальцев округлых сп'ермтид, появления больного числа вакуолей в цитоплазме лептотенных сперматоцитах, среди которых встречались пикнотические двуядерные клетки; обнаружены также пахитенные сперматоциты, ядра которых имели признаки дегенерации. Среди округлых сперматид встречались дву- и трехядерные клетки, в ядрах сперматид возможно из-за нарушения процессов кон-

денсации ядерного материала обнаруживались полости различных размеров, хроматин располагался ободком вдоль ядерной мембраны. Клетки Сертоли содержали вакуоли.

На 8 день фиксации во многих канальцах в результате нарушения целостности клеток Сертоли наблюдалось отслоение от базальной мембраны сперматогенного эпителия, в котором с большой частотой встречались двуядерные и трехядерные пахитенные сперматоцигы, хроматин которых нередко имел дегенеративный характер, а также дву- и трехядерные сперматиды. Около базальной мембраны были видны сперматогонии с цитоплаэматическими вакуолями, на некоторых гистологических срезах отмечено дезориентированное расположение половых клеток и присутствие пустых пространств различных размеров, которые могут формироваться в результате дегенерации, либо фагоцитоза еперматид и сперматоцитов. Важно добавить, что весьма частым событием, с которым мы сталкивались при анализе срезов семенников в это время эксперимента были также семенные ганальцы с признакам! полной атрофии.

Многие клеточные и ядерные патологии, которые были описаны выше, также обнаруживались и на 19 день после действия НШ. Различия носили количественный характер и были более выражены. В структурно аномальных канальцах сперматогенный эпителий практически был полностью разрушен, присутствовали гигантские некротические клетки и аномальные спермии.

На 25 день фиксации разнообразие таких аномалий, как вакуолизация, многоядерные клетки, отслоение эпителия от базальной мембраны, дезориентация клеток, дегенеративные изменения ядер, нарушения конденсации хроматина в сперматидах, встречались также с большой частотой.

На 32 день фиксации у одного из изученных самцов семенники были полностью атрофированы. Как показала гистологическая проверка, ви всех семенных канальцах развивающееся половые клетки отсутствовали, а встречались только клетки Сертоли и сперматогонии, в отдельных канальцах были видны крупные вакуоли и слущива-ние клеток в просвет канальца. У других животных канальцы имели полностью регрессивный характер.

Вызванные НШ патологические изменения в семенниках крыс были широко представлены и на 50 день фиксация. Практически во всех семенных канальцах были выявлены нарушения структуры эпителия.

Выявлено присутствие большого числа двуядернья лептотенных спер-матоцитов, гибнущей мейотической метафазы, сперматид с пикноти-ческими ядрами, спермиев с деформированными головками, двуядерные спермии, некротические клетки.

На 100 день фиксации гистологическая картина семенников подопытных крыс во многом была идентична контролю.

III. 2.2. Количественная оценка

Результаты, характеризующие динамику количественных изменений различных типов сперматогенных клеток в ответ на действие супермутагена НШ в дозе 100 мг/кг, представлены в виде процентных соотношений на рис. 2а, б.

Общий процент сперматогониальных клеток в течение первых 3 нед эксперимента постепенно уменьшался, достигая на 19 день фиксации максимальных потерь, которые составляли примерно 68% от контроля на 8 и 19 дни фиксации. Затем наступал процесс постепенного увеличения числа сперматогониев - на 25 и 32 дни фиксации оно составляло, соответственно 75 и 78% от контрольных значений. На 50 день после начала эксперимента пу.й сперматогониев полностью соответствовал уровню контроля, а на 100 день фиксации на 20% даже превышал норму.

В семенниках подопытных крыс процентное содержание пахитен-ных сперматоцитов значительно снижалось на 8 день фиксации, составляя 65% от контроля. Ощутимые потери пахитенных сперматоцитов были видны на 19 и 32 дни фиксации - они составляли, 54 и 46%. И хотя на 25 день фиксации клеточные потери на стадии профазы I мейоза тоже были сравнительно большими (32%), здесь значимость различий не установлена. Тенденция к нормализации пула сперматоцитов I порядка видна на 50 и 100 дни фиксации.

При всех выбранных сроках фиксации резких количественных изменений пула округлых сперматид не наблюдалось. Тем не менее южно констатировать, что число этих клеток, по.крайней мере, на 8, 32 и 50 дни фиксации в среднем на 30% ниже нормы, в. последнем случае доказана достоверность этого снижения по сравнению с контролем.

До 32 дня фиксации число спермиев статистически достоверно не отличалось от контроля. Однако на 32 день эксперимента наблюдалось резкое увеличение количества спермиев- примерно на 60%.

После этого (50 и 100 дни фиксации) спермии шли по пути нормали-

- 11 -

эации, достигая в конечном счете исходных уровней.

11а 3 и 8 дни после действия 15ММ число клеток Сертоли уменьшалось, соответственно на 25 и 40% от контроля. Из полученных данных также видно, что несмотря на отсутствие статистически зна-.

Рис.2а- Динамика количественных изменений сперматогониев (•) и пахитенных сперматоцитов (+) в семенниках крыс после действия НШ в дозе 100 мг/кг. По горизонтали - дни фиксации, по вертикали - число клеток в % от контроля.. * - различия статистически достоверны при р<0.05. чимых различий дефицит клеток Сертоли на конечных этапах эксперимента имеет место.

III. 2.3. Цитологическая характеристика атипичт рзаЕяваи2&хся спериатогенаых клеток.

Начиная с 3 дня после введения животным НШ и затем на последующих сроках фиксации вплоть до 50 дня, в их семенниках обнаруживалось большое число клеток с различны)® ядерно-хромосомными аномалиями. Для популяции сперматогониев и сперматоцитов наи-

более характерными были двуядерные клетки, клетки со лледама хромосомных поломок, или микроядрами.

Нз стадии делений мейоэа были видны: выброс хромосом ва

Рис.2б- Динамика количественных изменений округлых сперматид (•) и спермиев (+) в семённиках крыс после действия НЫМ в дозе 100 мг/кг. По горизонтали - дни фиксации, по вертикали - число клеток в % от контроля.

* - различия статистически достоверны при р<0.05.

пределы веретена, образование одиночных или множественных мостов, ассиметричное расположение хромосом на пластинках.

В популяции округлых сперматид обнаруживались клетки с микроядрами - одни были мелкие и пикнотические,.другие имели крупные размеры и чаще всего диффузный характер хроматина. Обычно около основного ядра располагалось одно микроядро, клетки с двумя мик-роядраш били весьма редким событием. Среди округлых сперматид часто встречались дву- и трехядерные клетки, клетки с гигантскими ядрами и нарушенной, морфологией хроматина.

Мпкроядра, деформированные, морфологически аномальные ядра с нарушенной отруглтрой хроматина наблюдались также б удлиняющихся сперматидах и спермиях.

В популяции меток Сертоли бшч идентифицированы микроядерные клетки, двуядерность, хотя в контроле такие отклонения от нормы мы не регистрировали вообще.

III. 2.4. Цтхх&няттпакий дг.уша

Результаты подсчета частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках крыс через различные интервалы времени после действия НШ в дозах 25 или 100 иг/кг суммированы на рис. За.

Уже через 3 дня после действия мутагена число округлых сперматид с микроядрами достоверно превышало контрольный уровень, что указывает на высокую чувствительность хромосом на стадиях диаки-неза-поздней пахитены. Я профазе Г мейоза высокую генетическую чувствительность обнаружили также хромосомы на стадиях средней пахитены и прелептотены-лептотены. Это доказывается появлением большого числа округлых сперматид с микропдрами на 0 и 19 дни фиксации. На 25 день фиксации НШ при дозе 25 мг/кг не вызывала статистически значимого увеличения округлых сперматид с микроядрами, хотя при дозе 100 мг/кг выход хромосомных мутаций был значителен- он превышал контрольный уровень более чем в 15 раз. НШ при дозе 100 мг/кг индуцировала образование большого числа округлых сперматид со следами хромосомных аномалий и на 32 день после начала эксперимента. Регистрация генетически аберрантных сперматид при этих двух последних сроках фиксации свидетельствует о по-ражаемости хромосом диф^ренцирующихся сперматогониев высокой дозой НШ. О степени влияния НШ на генетический материал стволовых сперматогониев судили по частоте встречаемости округлых спзрмлгид с микропдрами на 50 и 100 дни фиксации: в первом случае уровень аберрантных клеток еще продолжал достоверно превышать фоновое значение, во-втором - число таких клеток соответствовало исходному, контрольному уровню.

В ходе наших цитологических наблюдений проводился также учет' двуядерных клеток как в семенниках контрольных, так и в семенниках подопытных крыс. Проведенные подсчеты показали (рис. 36) , что поело действия КИМ в дозах 25 или 100 мг/кг на профазные сперма-тоциты, находившиеся на стадиях днаккнеза-поздней пахитены, сред-

Рис. За. Число округлых сперматид с микроядрами (в %.) в семенниках крыс через раличные интервалы времени после действия НММ. По горизонтали - дни фиксации. ЕИ - контроль Ш- 25 мг/кг (ЛТП- 100 мг/кг * -различия статистически недостоверны при р<0.05

ней пахитены и прелептотены-лептотены частота встречаемости двуя-дерных округлых сперматид, соответственно, на 3, 8 и 19 дни фиксации увеличивалась в несколько раз по сравнению с контролем. На 25 и 50 дни фиксации, когда анализу подвергались постмейоти-ческие клетки, произошедшие, соответственно, от дифференцирующихся и стволовых сперматогониев выход двуядерных округлых сперматид также достоверно превышал контрольный уровень. Однако при более отдаленном сроке фиксации (100 день фиксации) число двуядерных клеток не отличалось от спонтанного уровня.

го y

рис.36. Число двуядерных округлых сперматид (в %. ) в семенниках крыс через различные интервалы времени после действия НЖ Ш горизонтали- дни фиксации, контроль Ш- 25 мг/кг ISSh 100 мг/кг * -различия статистически недостоверны при р<0.05

III. 2.5. Цнтфотоиетртестй авале ДНК в соврияях я тетках

Серю ян.

Как видно из результатов цитофотометрических измерений (рис.4), через 8 и 25 дней после действия НММ в дозе 100 мг/кг количество ДНК-фуксина в гаметах снижается по сравнении с контролем только на 10%, однако различия статистически достоверны.

Пэсле обработки препаратов ДНКазой I количество ДНК-фуксина в сперматозоидах контрольных крыс практически оставалось без изменений. Однако уже через 8 дней после действия НММ количество

Таблица. 2. Содержание ДНК-фуксина в ядрах спермиев контрольных и подопытных крыс.

Варианты Обработка х +

опыта препаратов

Контроль - 84.5 + 2.3 (16)

1« II II К 1» ДНКаза I 82.0 + 2.4 (20)

НШ, 100 мг/кг

8 день фиксации - 78.0 + 1.7 (13)

•1 к к к II ДНКаза I 62.0 + 1.6* (16)

25 день фиксации - 77.0 + 1.8 (18)

И .11 II II 11 ДНКаза I 61.0 + 1. 4* (15)

БО день фиксации - 84.6 + 2.0 (14)

II II и и 11 ДНКаза I 65.0 + 1.7* (17)

Примечание: * - в сравнении с необработанным контролем внутри каждого варианта опыта различия статистически достоверны при р<0.05, в скобках - коэффициенты вариации в X.

ДНК-фуксина в обработанных нуклеаэой спермиях уменьшалось на 20%. Аналогичные потери (21%) в интенсивности окрашивания ядер после нуклеазного гидролиза наблюдались и в препаратах спермиев, приготовленных через 25 дней после действия мутагена. На 50 день фиксации в ответ на действие ДНКазы I также выявлено снижение количества ДНК-фуксина в спермиях примерно на 23%.

Измерения содержания ДНК-фуксина проводили такжэ в клетках Сертоли. На 8 день фиксации количество ДНК достоверно снижалось по сравнению с контролем примерно на 15%. На 25 день фпксаг/и потери количества ДНК-фуксина в клетках Сертоли уже составляли 22.5% (различия также были статистически достоверны при р<0.05). И хотя на 50 день фиксации количество ДНК-фуксина отличалось от контрольных значений только на 7.3%, и в атом случае была установлена достоверность различий.

II1.3. Особенности сперматогенеза £ половозрелых крыс после прямых и комбинированных эффектов НШ и рогора.

III. 3.1. Гистологический анализ.

Сильных гистологических изменений в семенниках крыс через 19 дней после действия рогора не было обнаружено. После действия НЫМ в дозе 50 мг/кг по отдельности или в сочетании с различными дозами рогора или в сочетании с малой дозой НШ в семенниках крыс наблюдались существенные морфологические отклонения от нормы, схожие с теми, что были описаны выше.

11 Г. 3.2. Нолтествевнав оценка

Яэдсчеты различных типов сперматогенных клеток, проведенные через 19 дней после химических воздействий, показали, что практически во всех случаях число сперматогониальных клеток и спермато-цитов I порядка достоверно не отличалось от контролз}. Тем не мен-нее число округлых сперматид и спермиев также во всех случаях достоверно (при р<0.05) уменьшалось по сравнению с контролем - на 25-32% (рис.4).

НММ и рогор, как при прямых, так и при сочетанных эффектах не влияли на пул клеток Сертоли.

111. 3. 5._ Циюгепетический анализ

Результаты цитогенетического изучения представлены в табл. 3. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках крыс, получавших суммарные дозы рогора 15 или 30 мг/кг существенно превышала уровень, наблюдавшийся при спонтанном мутагенезе. У крыс, которым однократно инъецировали НШ в дозах 25 или 50 мг/кг, уровень округлых сперматид со следами хромосомных поломок также достоверно превышал контрольные значения.

Когда крысам до однократного введения НШ в дозах 25 или 50 мг/кг инъецировали в течение 3 дней по 5 мг/кг рогора, в их семенниках по сравнению с позитивными контролями наблюдалось снижение частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами, соответственно, в 2.5 и 3.4 раза. Суммарная доза рогора в 30 мг/кг также приводила к последующему уменьшению (соответственно, в 2. 4 и 2.1 раза ) выхода генетически аберрантных клеток в семенниках

7

рис. 4- Число округлых сперматид и спермиев (хЮ ) в семеннике крыс через 19 дней после химических воздействий. 1-контроль, 2- рогор, 5 мг/кг; 3- рогор, 10 мг/кг; 4- НШ, 25 мг/кг; 5- НШ, 50 мг/кг; 6- рогор (5x3) + НММ (25); 7- рогор (5x3) + ИМ (50); 8- рогор (10x3) + НШ (50); 9- НММ, 5 мг/кг; 10- НШ (5) + НШ (50).

ВН- сперматиды спермии

животных, подвергшихся затем однократному воздействию НШ в дозах 25 или 50 мг/кг.

Малая доза НШ ( 5 мг/кг), вводимая крысам в течение 5 дней, вызывала слабое, но статистически достоверное по сравнению с отрицательным контролем увеличение частоты встречаемости округлых сперматид с микроядрами. Уровень хромосомных мутаций значительно возрастал (оолее чем в 1.5 раза) в популяции ранних постмейоти-ческих клеток после последующего введения этим животным высокой дозы НШ (50 мг/кг).

Таблица 3. Частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами в семенниках контрольных и подопытных крыс.

Варианты Дозы Число

опытов веществ аберрантных

мг/кг клеток, х + ш-

Контроль 1.1 + 0.2 (5)

Рогор 5 X 3 7.1 + 1.4* (5)

10 X 3 7.5 + 0.9* (4)

НММ 25 X 1 17.0 + 2.0* (4)

50 X 1 7.6 + 0.6* (4)

Рогор+НЫМ 5 X 3 + 25 X 1 7.0 + 0. 9**( 4)

ft_ff_ff_f*_ 10 X 3 + 25 X 1 7.1 + 0. 5**(4)

5 X 3 + 50 X 1 2.2 + 0. 5**(4)

Г»_«f_»f_»!_ 10 X 3 4- 50 X 1 .. 3.5 + 0. б**(4)

нш 5 X 5 4.3 + 0.4* (4)

НШ + НММ 5 X 5 + 50 X 1 12.1 + 0. 5**( 4)

Примечание: * - различия в сравнении с отрицательным контролем статистически достоверны при р< 0.05, ** - различия в сравнении с позитивным контролем статистически достоверны при р< 0.05, в скобках - число изученных животных.

IY. ОЕСУЩКННЕ

Результаты настоящей работы, полученные с помощью комплексного методического подхода, детально характеризуют ряд сторон индуцированных процессов деструкции и последующего восстановления сперматогенного эпителия млекопитающих. Анализ наших данных показывает, что морфологический ответ развивающихся сперматогенных клеток крыс на краткосрочные и отдаленные эффекты НМЫ аналогичны тем нарушениям, которые были описаны в ряде других экспериментальных исследованиях. Наши наблюдения на количественном, морфологическом, цитогенетическом уровнях подтверждают (Chapín et al., 1983; Kwall et al. ,1984), что семенники неполовозрелых крыс более чувствительны к действию токсических соединений, чем гонады поло-

возрелых самцов. Поражаемость популяции примитивных стволовых клеток радиацией и химическими токсикантами гораздо вше по сравнению с дефинитивными стволовыми сперматогониями половозрелых животных.

Результаты нашего анализа ранних гистопатологических эффектов НШ на крыс показали, что в сперматогенном эпителии млекопитающих несколько мишеней -это, помимо сперматогониев, профазные сперматоциты, делящиеся сперматоциты, дифференцирующиеся сперма-тиды. Поражение этих мишеней может быть опосредовано нарушениями структурно-функциональной целостности меток Сертоли, но с другой стороны, клетки Сертоли могут участвовать в переброске НМЫ или ее активных метаболитов в стан сперматогенных клеток.

Если рассматривать наши результаты количественного анализа сперматогенных клеток через различные интервалы времени после воздействия НШ, опираясь на данные по кинетике сперматогенеза у крыс, то тогда увидим, что округлые и удлиняющиеся сперматиды сохраняли способность трансформироваться в спермин. Весьма высокую устойчивость к цитотоксическим эффектам НШ обнаружили также сперматоциты на стадиях мейотических делений, пахитены, прелепто-тены-лептотены, а также, возможно, поздние сперматогонии.

Количественные колебания клеток Сертоли, появление среди них микроядерных и днуядерных клеток, выявленные в семенниках крыс после действия НШ, служит еще одним из доказательств перехода клеток Сертоли из состояния митотической инертности к делениям. Тем не менее восстановление пула клеток Сертоли еще не означает, что их метаболизм нормален ( Rich, de Krester, 1977; Delic et al., 1986). В наших экспериментах функциональная неполноценость клеток Сертоли была доказана с помощью цитофотометрического анализа содержания ДНК-фуксина.

Изучения по критерию микроядер, регистрируемых в округлых сперматидах через различные интервалы времени после действия НШ, показала высокую чувствительность хромосом профазных сперматоци-тов, дифференцирующихся сперматогониев, стволовых клеток. Однако поражения стволовых сперматогониев носили обратимый характер.

Высокая чувствительность ДНК тестикулярных спермиев к ДНКазе I, на 8, 25 и 50 дни фиксации может быть следствием индуцированных НШ нарушений, соответственно, метаболизма основных ядерных белков в спермиогенезе, синтеза РНК в мейозе и генетического ап-

парата сперматогониальных клеток.

Сочетанние эффекты малых и высокой доз НММ, не приводили к адаптации, а вызывали усиление генотоксической активности этого агента. Тем самым наши наблюдения подтверждают сложность явления предадаптации, когда в одних случаях отмечаются защитные эффекты,-а в других - происходит сенсибилизация. Возможно, при изменениях условий эксперимента или в других тест-системах положительный эффект будет достигнут. Ведь "уступчивость" НММ показана в ряде наблюденийПорощенко, Абилев, 1988; Захидов и др. 1994). И, наконец, из результатов настоящей работы следует, что при сочетанных эффектах рогора и НШ уровни хромосомных поломок в популяции округлых сперматид сильно снижались. Механизм, лежапщй в основе этого явления пока неизвестен. Весьма вероятно, что столкновение этих двух ксенобиотиков в живом организме может приводить к их взаимному уничтожению как мутагенных факторов, но подтвердить или опровергнуть это предположение могут только физико-химические исследования.

вшоды

1. В семенниках крыс, подвергшихся действию химического супермутагена НШ в первые дни после рождения, процессы сперматогенеза шли по атипичному пути. Нарушения в развитии мужских половых клеток выявлялись на всех уровнях исследования - количественном, гистологическом и цитогенетическом.

2. Деструктивные, цито-гистологические изменения в спермато-генном эпителии крыс, подвергшихся действию НШ в половозрелом возрасте, имели обратимый характер.

3. В ряду развивающихся сперматогенных клеток высокую чувствительность к цитотоксическим эффектам НШ обнаружили клетки сперматогониального компартмента.

4. Генетически поврежденные профазные сперматоциты, дифференцирующиеся и стволовые сперматогонии сохраняли способность преодолевать мейотический барьер, о чем свидетельствует высокая частота встречаемости округлых сперматид с микроядрами, двуядерных клеток, морфологически аномальных спермиев в определенные моменты времени после действия. Индуцированные в стволовых клетках хромосомные изменения недолгоживущи.

5. Цитохимический количественный анализ ДНК показал, что ин-Аудированные в сперматогониях, пахитенных сперматоцитах и сперма-тидах изменения приводят к формировании гамет с нарушенной структурой хроматина.

6. Выявлены морфологические и количественные изменения клеток Сертоли в ответ на действие НММ. Цитохимическое изучение обнаружили высокую вариабельность и уменьшенное содержания ДНК-фуксина в клетках Сертоли у подоопытных крыс. Доказана способность клеток Сертоли переходить к митотическим делениям.

7. Сочетанные эффекты малых и высоких доз НШ приводили к структурным нарушениям сперматогенного эпителия, клеточным потерям на постмейотических стадиях дифференцировки и значительному увеличению по сравнению с позитивными контролями числа аберрантных клеток.

8. При выбранных условиях эксперимента фосфорорганический пестицид рогор оказывал морфологические, цито- и гекотоксические эффекты на сперматогенные клетки половозрелых крыс.

9. При комбинированном воздействии рогора и НШ на профазные сперматоциты выход округлых сперматид со следами хромосомных поломок резко снижался по сравнению с позитивным контролем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С. Т. Захидов, Л. П. Паранюшкина, Хода. А. X. Махран, Эль-Саед Касем Абдель-хади, Е А. Голиченков. 1994. Влияние химических мутагенов на сперматогенез млекопитающих. Цитогенетический анализ// Известия РАН, сер. биол., N 3, с. 353-362.

2. С. Т. Захидов, Л. П. Паранюшкина, Уд да L X. Ыахран, Эль-Саед Касем Абдель-хади, Е А. Голиченков. 1994. Влияние химических мутагенов на сперматогенез млекопитающих. Количественная оценка// Известия РАН, сер. биол., N 6, с. 870-879.

3. Е А. Голиченков, С. Т. Захидов, Эль-Саед Касем Абдель-хади, Т. А. Волошина 1994. Парадоксальные биологические эффекты пестицидов// Тезисы докладов У1 конференции РНАН, отд. экологии, Мэсква, с. 11-12.