Гисто- и цитогенез печени человека и крысы в ходе пренатального развития и репаративной регенерации

Гумерова, Аниса Азатовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гисто- и цитогенез печени человека и крысы в ходе пренатального развития и репаративной регенерации
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Гисто- и цитогенез печени человека и крысы в ходе пренатального развития и репаративной регенерации"

005017761

На правах рукописи

ГУМЕРОВА АНИСА АЗАТОВНА

ГИСТО- И ЦИТОГЕНЕЗ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ В ХОДЕ II РЕ НАХАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ И РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

2 6 ДПР 20(2

Казань-2012

005017761

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития России

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Киясов Андрей Павлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна

доктор медицинских наук, профессор Челышев Юрий Александрович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России (г. Москва).

заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития России (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус Б).

Автореферат разослан « £ » Сси^Л^и^ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

Защита диссертации состоится

2012 г. в

» часов на

доктор медицинских наук, профессор

Залялютдинова Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Центральной проблемой современной гепатологии является идентификация региональной стволовой клетки печени. Необходимость решения этой проблемы продиктована значительной распространённостью хронических диффузных заболеваний печени, недостаточной эффективностью существующих методов их лечения, и, как следствие, - высокой частотой развития фиброза и цирроза печени в исходе этих заболеваний. В этом случае единственным методом лечения становится трансплантация печени. Однако существующий дефицит донорских органов, большие листы ожидания, высокая стоимость трансплантации и необходимость последующей иммуносупрессивной терапии (Lorenzini, Andreone, 2007) диктуют необходимость поиска новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Идентификация стволовой клетки печени позволила бы перейти к разработке принципиально новых методов лечения хронических диффузных заболеваний печени, основанных на стимуляции собственных стволовых клеток в печени больного и применении клеточной терапии, в том числе и генетически модифицированными стволовыми клетками.

Изучению проблемы поиска региональной стволовой клетки печени посвящено значительное число исследований, выполняемых, как правило, на разнообразных моделях регенерации печени у животных (Evarts et al., 1990; Fausto, 1990; Sell, 1990; Фактор, Радаева, 1991; Sigal et al., 1992; Dabeva, Shafritz, 1993; Factor et al., 1994; Sarraf et al., 1994; Урываева, 1997; Braun, Sandgren, 2000) или путём культивирования различных популяций клеток, изолированных из печени животных и человека (Yin et al., 2002; Herrera et al., 2006). При этом из печени выделяют клетки, несущие те или иные маркерные признаки стволовых клеток, или подобные признаки были выявлены или индуцированы у каких-либо клеток печени в процессе культивирования (Wang et al., 2003; Herrera et al., 2006). Однако, как это ни странно, вопрос о принадлежности этих стволовых клеток к какой-либо из описанных ныне клеточных популяций печени практически не обсуждается, и причина этого кроется, по-видимому, в самом подходе - клетки изучаются «сами по себе», вне связей с органом, из которого они были извлечены. Очевидно также, что если клетки были лишены своего привычного микроокружения, их свойства существенно отличаются от тех, которые они проявляют, находясь в естественной среде. Только исследования, проведённые in vivo, в условиях естественного микроокружения и взаимодействия клеток и межклеточного вещества, могут приблизить нас к идентификации региональной стволовой клетки печени. При этом основное внимание должно быть уделено, с одной стороны, изучению процессов внутриутробного развития органа, когда происходит первичная дифференцировка его клеток и закладка стволового компартмента, а с другой стороны - изучению фенотипа клеток во время репаративной регенерации органа, когда происходит активация его стволовых клеток.

Долгие годы одной из наиболее распространённых была теория, рассматривающая в качестве стволовых клеток печени так называемые овальные ( клетки, предположительно располагающиеся в начальных отделах желчевыводящих

путей - канальцах Геринга (Theise et al., 1999). Однако в последнее десятилетие опубликовано значительное количество работ, посвященных идентификации и/или изоляции других популяций стволовых клеток из взрослой печени, которые, как и эмбриональные, способны к многократным делениям и являются бипотентными (Wang et al., 2003). Особый интерес в этой связи вызывают данные, свидетельствующие о возможности развития как гепатобластов/гепатоцитов, так и холангиоцитов из кроветворных (Lagasse et al., 2000; Theise et al., 2000; Schwartz et al., 2002; Fiegel et al., 2003; Zhan et al., 2006) и мезенхимных (Schwartz et al., 2002; Sato et al., 2005; Lange et al., 2006; Talens-Visconti et al., 2006; Sgodda et al., 2007) стволовых клеток, что также не укладывается в традиционные представления о развитии эпителиальных клеток печени исключительно из энтодермального эпителия передней кишки (Wells, Melton, 1999), а значит, оставляет открытым вопрос о клеточных источниках развития печени как органа, и, в первую очередь, её паренхиматозных клеток и клеток внутрипечёночных желчных протоков.

Самым интригующим, безусловно, является факт развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки, т.е. клетки мезенхимной, а не энтодермальной. Также накапливается все больше сведений о ключевом влиянии на развитие печени окружающей ее мезенхимы (Le Douarin, 1975; Fukuda-Taira, 1981; Jung et al., 1999). В связи с этим возникает вопрос, могут ли постоянно присутствующие в печени мезенхимные синусоидные клетки быть источником образования гепатоцитов в ходе развития и регенерации, и какие именно клетки в составе окружающей печень мезенхимы являются главными для формирования её микроокружения. Для ответа на эти вопросы необходимы комплексные морфологические исследования эмбрионов и плодов человека и крысы различных сроков гестации с использованием иммуногистохимического выявления белков, специфических для определённых клеточных популяций печени и стволовых клеток. Особое внимание предполагается уделить изучению фенотипа мезенхимных синусоидных клеток печени и их взаимоотношений с эпителиальными клетками на ранних этапах развития печени человека, что позволит установить, какие из синусоидных клеток в наибольшей степени обладают признаками стволовых клеток и могут быть источником развития гепатоцитов. Наиболее перспективным кандидатом на эту роль может стать популяция звёздчатых клеток печени, поскольку именно они находятся в зрелой печени в непосредственном контакте с гепатоцитами, вырабатывают важнейшие факторы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку клеток (Bachem et al., 1992; Schirmacher et al., 1992; Maxwell et al., 1994; Eckardt, 1996; Asahina et al., 2002; Friedman, 2008), и могут быть получены из кроветворной стволовой клетки (Baba et al., 2004). В этой связи исследования по изучению стволовых потенций данной клеточной популяции как в онтогенезе, так и при репаративной регенерации, а также в условиях in vitro, представляются весьма актуальными. Однако вопрос о клеточных источниках развития самих звёздчатых клеток до сих пор не решён. Помимо мезенхимного, в литературе обсуждается как энтодермальное (Vassy et al., 1993; Suskind, Muench, 2004), так и нейральное (Geerts, 2001; Friedman, 2008)

происхождение этих клеток. Детальное изучение фенотипа звёздчатых клеток печени в пренатальном онтогенезе позволит прояснить накопившиеся противоречия.

Еще один чрезвычайно важный вопрос, на который и сегодня нет однозначного ответа, - это вопрос о развитии внутрипечёночных желчных протоков. Причиной этого, по сути, является нерешённость проблемы, связанной с клеточными источниками развития холангиоцитов. Для её решения требуется детальный сравнительный анализ фенотипов предполагаемых клеток-предшественниц на разных этапах пренатального онтогенеза человека. Кроме того, поскольку желчные протоки являются важнейшим, но не единственным компонентом портальной системы печени, очевидно, что их развитие вряд ли может происходить независимо от развития кровеносных сосудов портальных трактов - воротной вены и печёночной артерии. Однако до сих пор взаимодействия портальных структур друг с другом в процессе развития исследованы крайне недостаточно (5Ыо]т, 1992; ЫЫзгес1и й а1.,

2002; Ьета!дге, 2003; И^катв, Оеэте^ 2008). Поэтому весьма актуальным представляется изучение формирования внутрипечёночных желчных протоков во взаимосвязи с развитием кровеносных сосудов портальных трактов. Понимание источников и закономерностей формирования внутрипечёночного билиарного русла позволит прояснить механизмы развития врождённых атрезий и мальформаций желчных протоков, а изучение развития и регенерации печени с позиций поиска её стволовой клетки откроет наиболее перспективные направления разработки принципиально новых методов терапии хронических диффузных заболеваний печени с использованием клеточных технологий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтракт 16.512.11.2101), РФФИ (гранты 04-04-49164-а; 09-04-97013-р_поволжье_а) и фонда НИОКР РТ (грант 03-3.1-6/2006 (Г)).

Цель исследования:

Установить закономерности дифференцировки основных клеточных типов печени (гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток), выяснить возможные клеточные источники их развития и значение в этом процессе мезенхимных клеток, а также ключевые этапы формирования сосудистых систем печени в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.

Задачи исследования:

1. Выяснить основные фенотипические характеристики эпителиальных и мезенхимных клеток человека, участвующих в первичной и вторичной печёночной индукции, и установить сроки мезенхимально-эпителиальных взаимодействий в процессе вторичной печёночной индукции.

2. Установить, какие типы синусоидных клеток печени человека могут развиваться из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка.

3. На основании иммуногистохимического анализа экспрессии белков, специфичных для мезенхимных и эпителиальных клеточных типов печени человека, установить,

проявляют ли какие-либо из мезенхимных клеток признаки дифференцировки в эпителий в пренатальном онтогенезе. Установить возможность дифференцировки выявленных клеточных популяций, изолированных из печени крысы, в гепатоциты in vitro.

4. Установить, какие клеточные типы способны экспрессировать маркёры стволовых клеток в процессе пренатального и раннего постнатального развития печени человека и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.

5. Выяснить, какие клеточные типы образуют микроокружение для дифференцирующихся эпителиальных клеток и клеток кроветворных островков в пренатальном гистогенезе печени человека.

6. Охарактеризовать фенотипы дифференцирующихся и зрелых эпителиальных клеток печени человека (гепатобластов/гепатоцитов, холангиобластов/холангиоцитов) и сроки приобретения ими дефинитивного фенотипа в пренатальном онтогенезе.

7. Установить участие процессов пролиферации, апоптоза и миграции клеток при формировании протоковой пластинки и внутрипечёночных желчных протоков в пренатальном онтогенезе человека и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.

9. Установить этапы дифференцировки внутрипечёночных кровеносных сосудов (воротной и центральной вен, печёночной артерии) путём изучения экспрессии маркёров эндотелиальных и гладкомышечных клеток и провести анализ взаимодействий между развивающимися кровеносными сосудами и желчными протоками в пренатальном онтогенезе человека.

Научная новизна. В работе установлены новые данные о динамике экспрессии маркёров отдельных клеточных популяций в печени человека в ходе пренатального онтогенеза, которые позволили охарактеризовать закономерности формирования дефинитивного фенотипа эпителиальных и синусоидных клеток печени и возможные клеточные источники их развития. Результаты исследования показали, что в развивающейся печени человека все клетки могут быть разделены на группы в зависимости от продолжительности их дифференцировки: 1) клетки, приобретающие дефинитивный фенотип быстро, в течение 1-4 недель (эпителий желчного пузыря, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов); 2) клетки, приобретающие дефинитивный фенотип в течение длительного срока (8-10 недель) и в ряде случаев экспрессирующие в процессе дифференцировки белки, нехарактерные для них в зрелом состоянии (гепатоциты, холангиоциты, звёздчатые клетки печени, мезотелиальные клетки капсулы печени).

с энтодермальными эпителиальными клетками передней кишки (СК18 и СК19, эпителиальный специфический антиген (ESA)), что может указывать на возможность развития эпителиальных клеток печени (гепатоцитов и холангиоцитов) из двух источников — энтодермы и мезодермы. Кроме того, было продемонстрировано, что клетки мезенхимы вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени имеют практически идентичный фенотип, что позволяет говорить о происхождении последних именно из мезенхимы, а не из других источников. Сами же звёздчатые клетки печени - единственный клеточный тип, имеющий сходные с эмбриональными гепатобластами фенотипические признаки (десмин, СК18 и СК19) и экспрессирующий маркёры стволовых/прогениторных клеток в пренаталыюм периоде (Вс1-2) и в процессе репаративной регенерации (C-kit).

Данный факт, наряду с впервые установленной нами возможностью дифференцировки десмин-позитивных звёздчатых клеток крысы в гепатобласты/гепатоциты in vitro, позволяет рассматривать именно этот клеточный тип в качестве основного кандидата на роль региональной стволовой клетки печени. Принципиально новым является то, что основным фактором, определяющим возможность дифференцировки звёздчатых клеток в гепатоциты в культуре, является образование монослоя, то есть установление плотных межклеточных контактов между клетками. Стволовые потенции звёздчатых клеток крысы подтверждают и полученные нами экспериментальные данные, демонстрирующие способность этих клеток экспрессировать рецептор к фактору стволовых клеток C-kit в ходе регенерации печени, вызванной токсическим воздействием нитрата свинца или частичной гепатэктомией.

В работе впервые показано, что популяция эпителиальных клеток печени человека с самых ранних этапов эмбрионального развития неоднородна по форме, размерам и способности экспрессировать СК18 и CKI9, что свидетельствует о раннем разделении путей дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов. Установлены последовательность, основные этапы и сроки формирования дефинитивного фенотипа гепатоцитов и клеток внутрипечёночных желчных протоков. Критическим для развития гепатоцитов является период с 3-й до 8-й недели гестации (НГ), когда они, выселяясь из передней кишки, утрачивают способность экспрессировать характерный для кишечного эпителия эпителиальный мембранный антиген (ЕМА) и транзиторно экспрессируют ряд маркёров, которые отсутствуют в зрелых гепатоцитах (десмин, C-met, C-kit, ESA). После 8-й НГ экспрессия этих маркёров в большинстве гепатобластов существенно снижается, тогда как экспрессия специфических для гепатоцитов гепатоцитарного специфического антигена (HSA) и CD66a интенсивно нарастает. Несомненно, к новым следует отнести данные о центрах дифференцировки гепатоцитов в течение различных периодов онтогенеза. Так, если на ранних этапах ключевым фактором для запуска дифференцировки гепатоцитов является взаимодействие между гепатобластами и десмин-позитивными клетками мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, а затем звёздчатыми клетками печени, и этот процесс наиболее активно происходит на периферии печени,

то в последующем центры дифференцировки гепатоцитов смещаются к кровеносным сосудам.

Впервые показано, что критическим для дифференцировки холангиоцитов человека является период с 5-й по 13-ю НГ, когда эти клетки, расположенные среди гепатобластов, впервые можно отличить от последних по морфологии и набору выявляемых маркёров. Так, для них, в отличие от гепатобластов, не характерно присутствие десмина, C-met, HSA и CD66a. Установлено, что первые дифференцированные холангиоциты, экспрессирующие ЕМА и СК7, появляются при образовании просвета протоков на 12-13-й НГ, что на 2 месяца раньше, чем считалось ранее (Van Eyken et al., 1988). Впервые показано, что микроокружение для дифференцирующихся холангиобластов у человека образуют десмин-позитивные звёздчатые клетки, а не миофибробласты портальных трактов. Становление системы внутрипечёночных желчных протоков связано с формированием кровеносных сосудов портального тракта. Так, формирование протоковой пластинки начинается сразу после появления фенотипических отличий между афферентными и эфферентными венами внутри печени на фоне формирования системы воротной вены, а ремоделирование протоковой пластинки и образование первых желчных протоков неразрывно связано с предшествующим этому появлением в печени артериальных сосудов и формированием портальных трактов.

В проведённом исследовании впервые установлено, какие клеточные типы в развивающейся печени человека проявляют признаки стволовых клеток. Оказалось, что на разных этапах развитиях такие свойства можно выявить у весьма широкого круга клеток. Однако только звёздчатые клетки печени и сами гепатоциты сохраняют такую способность практически на всем протяжении пренатального развития, и именно эти клетки проявляют свойства прогениторных в ходе репаративной регенерации печени у человека и у крысы, экспрессируя C-kit, что позволяет говорить о возможности существования в печени как минимум двух типов региональных стволовых клеток - гепатоцитов и звёздчатых клеток.

Важнейшим фактом, установленным в результате исследования, стало то, что микроокружение кроветворных островков в первую очередь представлено десмин-позитивными звёздчатыми клетками печени.

Теоретическая и практическая значимость. Проведённые исследования позволили получить новые факты, которые раскрывают закономерности гистогенеза и межклеточных взаимодействий между эпителиальными и мезенхимными клетками печени в ходе пренатального развития печени человека. Фенотипическая характеристика дифференцирующихся и зрелых клеток развивающейся печени будет иметь несомненное значение для изучения процессов регенерации и канцерогенеза печени человека, а так же при проведении экспериментов in vitro, поскольку позволит выявлять и отличать клетки, имеющие разную степень дифференцированности. Данные сведения имеют и практическое значение для диагностики заболеваний печени и прогнозирования возможности развития первичного рака печени и/или степени его злокачественности.

Полученные в ходе исследования факты, указывающие на возможность развития эпителиальных клеток печени человека как из эпителия передней кишки, так и из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки, позволяют внести коррективы в устоявшуюся теорию развития печени, рассматривающую в качестве клеточного источника развития гепатоцитов только эпителий кишки. Кроме того, наиболее распространённая теория развития внутрипечёночных желчных протоков - теория трансформации - также нуждается в коррекции. С учётом полученных фактов сегодня вряд ли можно говорить о трансформации гепатобластов в холангиоциты. Более вероятным представляется другая последовательность событий: энтодермальная эпителиальная клетка-предшественница из передней кишки на самых ранних этапах развития печени (не позднее 4-Й-5-Й НГ) даёт начало двум популяциям - клеткам-предшественницам гепатоцитов (гепатобластам) и клеткам-предшественницам холангиоцитов (холангиобластам, сначала образующим протоковую пластинку, а затем - собственно желчные протоки). Кроме того, проведённый анализ развития внутрипечёночных желчных протоков и кровеносных сосудов свидетельствует о необходимости афферентного кровотока для формирования холангиоцитов и желчных протоков, что позволяет по-новому взглянуть на механизмы развития билиарной системы печени и приблизиться к пониманию причин развития атрезий внутрипечёночных желчных протоков.

Чрезвычайно важными как с теоретической, так и с практической точки зрения являются результаты комплексных исследований по выявлению клеточных популяций печени, обладающих свойствами стволовых клеток, которые позволили выделить звёздчатые клетки печени в качестве главных претендентов на роль региональной стволовой клетки печени. Совокупность полученных данных о значении звёздчатых клеток для дифференцировки гепатоцитов, холангиоцитов и кроветворных клеток позволяет по-другому взглянуть на биологию этой популяции синусоидных клеток и рассматривать их не только как депо ретиноидов и основной источник компонентов межклеточного матрикса, но, в первую очередь, как ключевой элемент в морфогенезе и регенерации печени. Имеющиеся на сегодняшний день данные о морфологии и физиологии звёздчатых клеток печени позволяют перейти к экспериментам по моделированию применения данного клеточного типа в качестве стволовых клеток для терапии различных заболеваний и повреждений печени.

нормальной анатомии и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета, а также в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Материалы диссертации включены в лекционные курсы для студентов кафедр гистологии, нормальной анатомии, инфекционных болезней и детских инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета, слушателей цикла повышения квалификации «Молекулярная и клеточная медицина» Казанского государственного медицинского университета и курсантов кафедры инфекционных болезней Казанской государственной медицинской академии.

Апробация работы состоялась на совместном научном заседании сотрудников кафедр нормальной анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета (10 января 2012 года).

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: итоговой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 40-летию КГМА (Кемерово, 1996); II-IV Республиканских конференциях молодых учёных и специалистов (Казань, 1996, 1997, 2001); IV Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных» (Казань, 1997); II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1997, 1999); Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 1997); научной конференции, посвящённой 35-летию ЦНИЛ КГМУ (Казань, 1997); конференции молодых учёных России с международным участием, посвящённой 240-летию ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 1998); международных симпозиумах «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry» (Братислава, 1995, 1998); IV, VIII, IX, XIV, XVI Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 1999, 2003, 2004, 2009, 2011);

IV Съезде Российских морфологов с международным участием (Ижевск, 1999); XI международном конгрессе по заболеваниям печени (Базель, 1999); XI и XIII международных конгрессах по гистохимии и цитохимии (Йорк, 2000; Сан-Диего, 2004); XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001); XXXVII, XXXXIV-XXXXVI встречах Европейской ассоциации по изучению печени (Мадрид, 2002; Копенгаген, 2009; Вена, 2010; Берлин, 2011); VI конгрессе международной ассоциации морфологов (Уфа, 2002);

гистологии человека БелГУ (Белгород, 2006); Британско-Российском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией по стволовым клеткам (Москва, 2007); научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Санкт-Петербург, 2007); объединённой Европейской гастронеделе (Вена, 2008); международной конференции Европейской ассоциации по изучению печени (Будапешт, 2009); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); 10-м юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010); IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); III Международном симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий» (Москва, 2010); И Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011), международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Гепатоциты человека развиваются из двух клеточных источников: энтодермального эпителия передней кишки и десмин-позитивных клеток мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки и их потомков -звёздчатых клеток печени, имеющих смешанный мезенхимально-эпителиальный фенотип и экспрессирующих маркёры стволовых клеток. Звёздчатые клетки печени крысы проявляют свойства прогениторных клеток печени также в процессе её репаративной регенерации, экспрессируя C-kit, и способны дифференцироваться в гепатоциты in vitro в чистой культуре при образовании монослоя.

3. Формирование системы внутрипечёночных желчных протоков у человека связано с развитием афферентных кровеносных сосудов: дифференциация ветвей воротной вены и центральных вен предшествует формированию протоковой пластинки, затем в печень прорастают ветви печёночной артерии, после чего начинается перестройка протоковой пластинки, приобретение холангиобластами дефинитивного фенотипа и их миграция в мезенхиму портального тракта и вдоль афферентных кровеносных сосудов. У человека и у крысы основными

механизмами восстановления внутрипечёночных желчных протоков после повреждения являются пролиферация холангиоцитов и ветвление протоков одновременно с ветвлением внутрипечёночных кровеносных сосудов.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 17 статей в ведущих российских научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов научных исследований. Общий объём публикаций - 12,16 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад - 8,99 условно печатных листа

Личное участие диссертанта. Приведённые в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, постановку задач, выбор методов исследования, проведение экспериментов, забор материала для исследования и его обработку, анализ экспериментальных данных. Автор провёл подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения экспериментов, методы, позволяющие решить поставленные задачи. Теоретическое обобщение результатов исследования, их анализ и оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 364 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 511 источников: 33 отечественных и 478 иностранных. Диссертация содержит 136 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В соответствии с целями и задачами работы закономерности дифференцировки различных клеточных типов печени в гисто- и органогенезе печени человека и крысы были изучены в комплексе с изменениями фенотипа основных клеточных типов печени в процессе репаративной регенерации печени при хронических гепатитах у человека и на двух моделях регенерации у крысы - после частичной гепатэктомии (ЧГ) и после токсического повреждения нитратом свинца (НС). В условиях in vitro была проверена выдвинутая в процессе выполнения работы гипотеза о возможной принадлежности звёздчатых клеток печени к региональным стволовым клетках этого органа.

При выполнении работы были использованы гистологические методы, методы культивирования клеток, иммуноцито- и гистохимические методы (Полак, Ван Норден, 1987; Угрюмов, 1991; Киясов, 1998). Проведение исследований одобрено Республиканским комитетом по этическим вопросам при проведении клинических испытаний-исследований лекарственных средств при Министерстве здравоохранения Республики Татарстан (протоколы № 2 от 21.02.2006, № 3 от 04.04.2006, № 3 от 21.03.11).

1. Изучение пренатального и раннего постнатального онтогенеза человека проведено на эмбриональном, плодовом и аутопсийном материале печени человека первых месяцев жизни (пациентов, умерших от причин, не связанных с патологией печени). Материал для исследования был получен в результате легальных медицинских абортов, самопроизвольных выкидышей и индуцированных преждевременных родов по медицинским показаниям на сроках от 3,5 до 36-ти НГ. Для определения сроков гестации измеряли теменно-копчиковый размер и длину эмбриона/плода, срок гестации определяли по таблицам (Фалин, 1976) с учётом анамнеза. До 14-ти НГ включительно интервал между сроками гестации материала, полученного для исследования, составил 3-4 дня, на более поздних сроках - 1-2 недели. На каждом сроке было изучено не менее трёх образцов. Ткани фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике (Меркулов, 1961). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически с использованием антител к различным антигенам (таблица).

2. Изучение пренатального и раннего постнатального онтогенеза крысы проведено на крысах линии Вистар, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Для получения датированной беременности самок подсаживали на ночь к самцам. День обнаружения спермиев во влагалищных мазках считали первым днём беременности (Бакунина, 1975). Начиная с 14-х суток гестации, крыс декапитировали под эфирным наркозом, у плодов извлекали печень. Кроме печени плодов, для исследования брали печень новорождённых, 1-, 3-, 6-, 8-, 9-, 11-, 13-, 14-дневных крысят и взрослых крыс (не менее трёх животных на каждом сроке развития). Кусочки органов замораживали в жидком азоте и готовили криостатные срезы. Срезы окрашивали иммуногистохимически (таблица).

3. Изучение регенерации печени человека проведено на 221 образце ткани печени, полученном с помощью прижизненной пункционной биопсии печени больных хроническими гепатитами различной этиологии (хронические вирусные гепатиты В и С, хронический алкогольный гепатит) биопсийными иглами типа Менгини (Подымова, 1993) в Республиканской клинической больнице РТ1. Биоптаты печени фиксировали в формалине и заливали в парафин, как описано выше. Парафиновые срезы печени человека окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически (таблица).

4. Изучение регенерации печени крысы на модели частичной гепатэктомии2 было проведено на 15 белых беспородных крысах-самцах весом 180-220 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Операция ЧГ печени проведена в условиях операционной под эфирным наркозом по методике Хиггенса и Андерсона (Higgins, Anderson, 1931) с небольшими модификациями в интервале между 9-ю и 12-ю часами дня для исключения суточных колебаний митотической активности клеток печени (Беляева, 1973). Удалённые во время операции доли печени взвешивали, фотографировали и использовали в

1 Забор биоптатов печени выполнен врачом отделения гастроэнтерологии РКБ МЗ РТ Л.С. Фатхеевой.

2 Данный фрагмент работы выполнен совместно с ассистентом кафедры нормальной анатомии КГМУ К.М.К. И.М. Газизовым.

Таблица

Антитела и визуализационные системы, использованные в работе

Антиген, краткая характеристика Эксперименты Клон, разведение, фирма-производитель

1 2 3

Первичные антитела

Виментин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мезодермальных клеток Онтогенез (человек) Культура клеток крысы Клон ЗВ4, 1:75 DAKO, Denmark

Коллаген I - белок межклеточного матрикса Культура клеток крысы Кроличьи поликлональные, 1:20 Sanbio, Netherlands

Коллаген III - белок межклеточного матрикса Культура клеток крысы Кроличьи поликлональные, 1:20 Sanbio, Netherlands

Коллаген IV - белок межклеточного матрикса Культура клеток крысы Кроличьи поликлональные, 1:20 Sanbio, Netherlands

Ламинин - белок межклеточного матрикса Культура клеток крысы Кроличьи поликлональные, 1:50 Sanbio, Netherlands

Десмин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мышечных клеток, маркер звездчатых клеток печени Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Культура клеток крысы Клон D33, 1:30-1:40 DAKO, Denmark

Цитокератин 18 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты) Онтогенез (человек) Культура клеток крысы Клон DC 10, 1:20 DAKO, Denmark

Цитокератин 8 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты) Культура клеток крысы Клон 4.1.18, 1:5 Boehringer, Germany

Цитокератин 19 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты, гепатобласты, овальные клетки) Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Клон BA17, 1:20 DAKO, Denmark

Онтогенез (крыса) Культура клеток крысы Клон 170.2.4, 1:10 Boehringer, Germany

Онтогенез (крыса) Регенерация (крыса) Клон LP2K 1:10 Amersham, UK

Цитокератин 7 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты) Онтогенез (человек) Регенерация (человек) Клон OVTL12/30, 1:20 DAKO, Denmark

Онтогенез (крыса) Регенерация (крыса) Клон Ks7.18, 1:5 Boehringer, Germany

Поли-цитокератины - белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток Онтогенез (крыса) Кроличьи поликлональные 1:400 DAKO, Denmark

ESA — эпителиальный специфический антиген Онтогенез (человек) Регенерация (человек) Клон VU-1D9, 1:50 Novocastra, UK

1 2 3

EMA - эпителиальный мембранный антиген Онтогенез (человек) Клон GF1.4, 1:200 Novocastra, UK

HSA - специфический антиген гепатоцитов Онтогенез (человек) Клон ОСН1Е5, 1:50 Novocastra, UK

CD66a - билиарный гликопротеин Онтогенез (человек) Клон 29Н2, 1:50 Novocastra, UK

А-ФП (а-фетопротеин) - секреторный протеин гепатобластов Культура клеток крысы Клон СЗ, 1:50 Novocastra, UK

А-ГМА (а-гладкомышечный актин) -маркер миофибробластов, гладкомышечных клеток Онтогенез (человек, крыса) Регенерация (человек, крыса) Культура клеток крысы Клон 1A4, 1:50 DAKO, Denmark

Кальпонин - функциональный протеин гладкомышечных клеток Онтогенез (человек) Клон Calp 1:75 Novocastra, UK

CD31 - маркёр эндотелия Онтогенез (человек) Клон1A10 1:20 Novocastra, UK

CD34 - маркёр кроветворных стволовых клеток и эндотелия Онтогенез (человек) Клон QBEnd/10 1:75 Novocastra, UK

CD117 (C-kit) - рецептор к фактору стволовых клеток, маркёр стволовых и прогениторных клетки Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Клон T595, 1:20 Novocastra, UK

CD133 — маркёр стволовых клеток Онтогенез (человек) Клон mAbcam27699, 1:100, Abeam, UK

C-met — рецептор к фактору роста гепатоцитов, рассеивающий фактор Онтогенез (человек) Регенерация (человек) Клон 8F11, 1:15 i Novocastra, UK

Вс1-2 - анти-апоптозный белок, маркёр стволовых и опухолевых клеток Онтогенез (человек) Клон 124, 1:15 • DAKO, Denmark

Bci-rambo - маркер апоптоза Онтогенез (человек) Клон 13E6, 1:50 Novocastra, UK

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток Онтогенез (человек) Регенерация (крыса) Клон PC 10, 1:100 DAKO, Denmark

Макрофагальный антиген - маркер тканевых макрофагов и моноцитов крови Онтогенез (человек) Клон LN-5, 1:50 Novocastra, UK

Внзуализациовные системы

Иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам мыши - вторичные антитела, меченые пероксидазой Онтогенез (крыса) Регенерация (крыса) Культура клеток крысы 1:100 DAKO, Denmark

Иммуноглобулины свиньи к иммуноглобулинам кролика - вторичные антитела, меченые пероксидазой Онтогенез (крыса) Культура клеток крысы 1:100 DAKO, Denmark

Иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам мыши - вторичные антитела (часть системы меченых иммунных комплексов щелочная фосфатаза/анти-щелочная фосфатаза) Онтогенез (крыса) 1:25 DAKO, Denmark

I 2 3

Мышиный комплекс ЩФАЩФ -комплекс щелочной фосфатазы с моноклональными мышиными антителами к щелочной фосфатазе (часть системы меченых иммунных комплексов щелочная фосфатаза/анти-щелочная фосфатаза) Онтогенез (крыса) Клон АР7/6/7, 1:50 DAKO, Denmark

LSAB2 - визуализационная система, меченая пероксидазой Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Готовые к использованию DAKO, Denmark

Novolink Polymer Detection System -визуализационная система, меченая пероксидазой Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Готовые к использованию Novocastra, UK

Novolink Polymer Detection System -визуализационная система, меченая щелочной фосфатазой Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Готовые к использованию Novocastra, UK

Catalyzed Signal Amplification (CSA) System - визуализационная система, меченая пероксидазой Онтогенез (человек) Регенерация (человек, крыса) Готовые к использованию DAKO, Denmark

Catalyzed Signal Amplification (CSA) System - визуализационная система, меченая щелочной фосфатазой Онтогенез (человек) Регенерация (крыса) Готовые к использованию DAKO, Denmark

качестве контроля. Объём удалённых долей составлял 68% от общего объёма печени.

Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 1, 2, 3, 5, 7 суток после операции. После забоя у животных извлекали печень для морфологического исследования. Кусочки ткани печени фиксировали в формалине, обезвоживали и заливали в парафин, как описано выше. Парафиновые срезы печени крысы окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически (таблица). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-кИ и десмина.

5. Изучение регенерации печени крысы на модели токсического повреждения НС было проведено на белых беспородных лабораторных крысах-самцах весом 180210 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. НС растворяли в воде для инъекций и вводили внутривенно однократно в хвостовую вену в дозе 100 мкМ/кг веса животного (БЬтогика <Х а1., 1994). Животным контрольной группы вместо раствора НС вводили внутривенно соответствующий объём растворителя. Чтобы исключить влияние суточных биологических ритмов на пролиферативные процессы, все инъекции НС были проведены в период с 9 до 12 ч утра (Беляева, 1973). Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 1, 2, 3,4, 5, 7 суток после введения НС или воды для инъекций. В каждой группе было не менее трёх животных. После забоя у животных извлекали для морфологического исследования печень. Для морфологического анализа часть ткани печени в виде кусочков размерами 4x4x5 мм замораживали в жидком азоте. Другую часть ткани печени фиксировали в формалине, обезвоживали и заливали в парафин, как описано выше. Криостатные и парафиновые срезы печени человека окрашивали

гематоксилин-эозином и иммуногистохимически3 (таблица). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии C-kit и десмина.

6. Эксперимент с чистой культурой звёздчатых клеток печени4

Звёздчатые клетки выделяли из печени крыс самцов весом 300-400 г, которые находились под нембуталовым наркозом (0,01 мл/100 г веса). Фракция синусоидных клеток была получена методом коллагеназо-проназной обработки печени (Knook et al., 1982; Alpini et al., 1994). Популяцию звёздчатых клеток печени получали в градиенте плотности найкоденса (Nycodenz, Nyegaard and Company AS, Oslo, Norway) (Gressner, Schäfer, 1989) и помещали в 24-луночные планшеты (0,25х106 клеток/мл). На дне лунок находились покровные стекла. Жизнеспособность клеток составляла 90% при окрашивании с трепановым синим. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и противогрибковые препараты. Планшеты находились во влажной среде С02

инкубатора (5% СОг) при 37 °С. Первую замену среды проводили через день, а затем каждые два дня. Клетки наблюдали в фазово-контрастном микроскопе. В первый день культивирования около 90% клеток содержали в своей цитоплазме капельки жира, что характерно для звёздчатых клеток печени. В момент замены культуральной среды часть покровных стёкол фиксировали в ацетоне для проведения иммуноцитохимических реакций. Культивирование клеток проводили до образования плотного единого монослоя. В ходе культивирования звёздчатых клеток печени крысы проводили гистохимическое выявление активности гамма-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) (Rutenberg et al., 1968).

В настоящей работе были использованы коммерческие моноклональные антитела (DAKO, Denmark; Novocastra, United Kingdom; Abeam, United Kingdom; Boehringer, Mannheim, Germany; Sanbio, Netherlands) к белкам, являющимся маркёрами различных клеточных типов печени (десмин, а-ГМА, цитокератины 7 и 19 и др.), стволовых и прогениторных клеток (CD34, CD117 (C-kit), CD133, Bcl-2 и др.), апоптоза (Bcl-rambo), а также антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA), позволяющие изучать пролиферативные процессы. Полный перечень использованных антител приведен в таблице. Для окрашивания были использованы: 1) непрямой иммунопероксидазный метод; 2) стрептавидин-биотиновый метод; 3) метод меченых иммунных комплексов; 4) метод меченых полимеров и их комбинации. В работе использованы вторичные антитела и визуализационные системы фирм DAKO (Denmark), Novocastra (United Kingdom). Для контроля специфичности иммуноцито- и гистохимических реакций производили замену первичных антител неиммунной сывороткой животного - донора первичных антител.

3 Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к C-kit выполнено совместно с ассистентом кафедры нормальной анатомии КГМУ к.м.н. Калигиным М.С.

4 Данный фрагмент рабты выполнен совместно со старшим научным сотрудником ЦНИЛ КГМУ К.6.Н.

Низамовым P.C.

При окрашивании парафиновых срезов печени человека и крысы с антителами к большинству изучаемых антигенов была использована предварительная демаскировка антигенов методом HI AR (Heat-Induced Antigen Retrieval) (Shi et al., 1991). В ходе изучения межклеточных взаимодействий между холангиоцитами и гладкомышечными клетками кровеносных сосудов было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание криостатных срезов плодов крысы на а-ГМА и холангиолярные цитокератины. Двойное окрашивание парафиновых срезов печени эмбрионов и плодов человека было проведено в сочетаниях: СК18/десмин, СК19/десмин, ESA/десмин, HSA/десмин, Вс1-2/десмин, C-met/десмин, C-kit/десмин, СОЭ4/десмин, CK18/CD34, CK19/CD34, HSA/CD34, ESA/CD34 и др. В процессе работы были оптимизированы методы двойного иммуногистохимического окрашивания. Микропрепараты после окрашивания фотографировали с помощью микроскопов Leica DMLS (аналоговая фотокамера Leica MPS32) и Leica DM 1000 (цифровая фотокамера DFC290).

Морфометрическими методами определяли число пролиферирующих холангиоцитов в процессе регенерации печени крысы, которое выражали в процентах от общего числа просчитанных клеток этого типа. Было исследовано не менее трёх срезов печени каждого животного. Подсчёт пролиферирующих холангиоцитов вели во всех перипортальных полях зрения. Статистический анализ результатов морфометрических исследований проводили с помощью табличного процессора MS Exel. Для оценки достоверности различий использовали /-критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведённое в соответствии с поставленными задачами изучение фенотипов эпителиальных и мезенхимных клеток в области закладки печени в процессе эмбрионального развития человека позволило установить, что взаимодействие клеток мезенхимы вентральной брыжейки и поперечной перегородки (виментин+/десмин+/СК18+/СК19+/Вс1-2+/С-ки+) с эпителиальными клетками печёночного дивертикула, выселяющими из эпителия двенадцащтиперстной кишки, продолжается до конца 7-й - начала 8-й НГ. В процессе выселения из кишки эпителиальные клетки меняют свой фенотип, утрачивая способность экспрессировать ЕМА, характерный для кишечного эпителия. Очевидно, что именно в период вторичной печёночной индукции влияние сигналов из мезенхимы на миграцию и дифференцировку эпителиальных клеток печени является самым важным, поэтому этот период является критическим этапом мезенхимально-эпителиальных взаимодействий. Более того, клетки мезенхимы вентральной брыжейки и поперечной перегородки не только оказывают индуктивные влияния на дифференцирующийся эпителий печени, но и сами могут являться клеточным источником для генерации этих клеток, поскольку экспрессируют эпителиальные маркёры, характерные для гепатоцитов и холангиоцитов - CK 18 и CK 19. Экспрессия мезенхимными клетками маркёров стволовых клеток Bcl-2, CD133 и C-kit также подтверждает их стволовые потенции. Таким образом, как минимум часть популяции мезенхимных клеток вентральной брыжейки и поперечной перегородки можно

рассматривать как источник развития её основных эпителиальных клеток -гепатоцитов.

Еще одним фенотипическим признаком мезенхимных клеток, окружающих печень, является экспрессия десмина. Поскольку десмин - признанный маркёр звёздчатых клеток печени, в частности, у грызунов (Уокхп е! а1., 1984), то можно предположить, что описанные десмин-позитивные мезенхимные клетки могут дифференцироваться не только в гепатобласты, но и в звёздчатые клетки печени.

Изучение фенотипа синусоидных клеток печени подтвердило наше предположение и позволило установить ряд новых фактов. Во-первых, можно утверждать, что синусоидные клетки, и, в частности, звёздчатые клетки, появляются в печени человека на 4-й неделе гестации, а не на 11-12-й неделе, как предполагалось ранее (Оеейв, 2004). Во-вторых, впервые достоверно показано, что звёздчатые клетки печени человека экспрессируют десмин - маркёр этих клеток у грызунов (Уокхм е1 а1., 1984) - с момента их появления и до конца 14-й недели гестации, что позволяет рассматривать его у человека как фенотипический маркёр только незрелых звёздчатых клеток.

Большинство синусоидных клеток печени в эмбриональном периоде имело фенотип, соответствующий описанному нами выше фенотипу мезенхимных !слеток (виментин+/десмин+/СК18+/СК19+/Вс1-2+/С-ки+). Поскольку десмин - маркёр только одного клеточного типа в печени, а именно — звёздчатых клеток, становится очевидным, что источником развития последних являются десмин-позитивные клетки мезенхимы вентральной брыжейки и поперечной перегородки, что подтверждает предположения, сделанные ранее другими учёными (ЯиЬЫа-ВгапсЙ е( а1., 1997).

В ходе исследования нами был установлен ещё один тип клеток, экспрессирующий фенотип, сходный с фенотипом мезенхимных клеток и звёздчатых клеток печени, - мезотелиальные и субмезотелиальные клетки, которые, по мнению ряда авторов, являются источником развития звёздчатых клеток печени (Ьоо, 2008) и могут иметь отношение к мезенхимально-эпителиальным взаимодействиям и дифференцировке гепатобластов в процессе развития печени (Ьоо, \\'и, 2008; АваЫпа & ей., 2009). Установленное нами сходство фенотипических характеристик мезотелиальных/субмезотелиальных и звёздчатых клеток печени свидетельствует о связи между данными популяциями клеток и, таким образом, подтверждает предположения, высказанные ранее другими авторами.

Поскольку большинство мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки в период их взаимодействия с эпителием передней кишки составляют десмин-позитивные клетки (будущие звёздчатые клетки печени), именно этот клеточный тип и его клеточные предшественники представляют собой важнейший фактор микроокружения, обеспечивающий гепатоцитарную дифференцировку эпителиальных клеток кишки. Высокая плотность десмин-позитивных звёздчатых клеток и их расположение в тесном контакте с дифференцирующимися гепатоцитами ранее были отмечены в пренатальной печени крысы (Уаээу е1 а!., 1993; ЮаБвоу е1 а!., 1995; Киясов и др., 1997). Важность

межклеточных контактов между звёздчатыми клетками печени и эпителиальными клетками-предшественницами была подтверждена и in vitro (Nagai et al., 2002). Именно звёздчатые клетки печени вырабатывают многие важнейшие факторы, необходимые для такой дифференцировки, — фактор роста фибробластов, морфогенетический белок кости BMP, фактор роста гепатоцитов HGF (Gohda et al., 1986; Gohda et al., 1988; Weidner et al., 1991; Jung et al., 1999; Rossi et al., 2001; Sekhon et al., 2004) и другие факторы (Friedman, 2008). Они синтезируют фактор стволовых клеток (Fujio et al., 1994), рецептор к которому (C-kit) мы выявили на гепатобластах, что не только подтверждает значение данного сигнального пути для пролиферации и дифференцировки последних, но и участие в нём звёздчатых клеток печени. Таким образом, становится очевидным, что основным мезенхимным клеточным типом, оказывающим индуктивные влияния на дифференцировку эпителиальных клеток печени, сначала являются десмин-позитивные клетки поперечной перегородки, а затем их потомки — звёздчатые клетки печени.

Фенотип эпителиальных клеток закладки желчного пузыря с момента своего появления полностью соответствовал фенотипу эпителия передней кишки -CK18+/CK19+/ESA+/EMA+, что подтверждает его развитие путём инвагинации эпителия передней кишки. Что касается дифференцировки гепатобластов, то с момента своего появления (3,5 НГ) они экспрессировали CK 18, CK 19 и ESA, но, как уже было отмечено выше, при выселении из кишечного эпителия, прекращали экспрессировать ЕМА. Возможно, это связано с потерей полярности у выселяющихся клеток. В последующем, уже у зрелых гепатоцитов, на билиарном полюсе вновь появляется ЕМА. Экспрессия CK 18 сохраняется в гепатобластах и гепатоцитах человека на всех этапах онтогенеза, то есть этот цитокератин является линейным маркёром данных клеток и поэтому не может быть использован для установления степени их дифференцированное™. Экспрессия же гепатобластами CK 19 и ESA оказалась транзиторной, она была характерна только для гепатобластов и отсутствовала в зрелых гепатоцитах. Наличие единичных CK 19+ гепатоцитов в печени человека в первые месяцы жизни указывает на незрелость фенотипа этих клеток и, следовательно, на незавершённость морфогенеза печени к рождению. СК19+ или ESA+ паренхиматозные клетки были выявлены нами также в печени больных хроническими гепатитами, что указывает либо на изменение фенотипа зрелых гепатоцитов или, что более вероятно, на появление новых, не до конца дифференцированных, клеток из стволовых клеток в процессе репаративной регенерации.

Дифференцирующиеся гепаггобласты человека, помимо маркёров эпителиальных клеток, экспрессируют целый ряд неэпителиальных маркёров, отсутствующих в эпителии передней кишки. Одним из них оказался десмин (4-5 НГ). Этот факт в сочетании с одновременной экспрессией мезенхимными и синусоидными клетками печени CK 18 и CK 19, по нашему мнению, указывает на родство этих клеточных популяций и возможность их развития из одного общего предшественника либо на развитие гепатобластов из десмин-позитивных звёздчатых клеток печени.

Впервые такое предположение было высказано тогда, когда похожие результаты были получены при изучении пренатальной печени крысы (Киясов и др., 1997). Ещё одним общим маркёром для звёздчатых клеток и фетальных гепатобластов мыши и крысы является сосудистая молекула клеточной адгезии VCAM-1 (Kubota et al., 2007). Возможность мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки звёздчатых клеток, выделенных из печени взрослых крыс (Li et al., 2003; Sicklick et al., 2006; Jelnes et al., 2007), и экспрессия ими ряда маркёров стволовых клеток, таких как Thy-1 (Норро et al., 2004; Derzso et al., 2007), CD133, Oct4 (Kordes et al., 2007), также подтверждают нашу гипотезу. Более того, мы установили, что звёздчатые клетки в онтогенезе печени человека экспрессируют еще один маркёр стволовых клеток -анти-апоптозный белок Bcl-2, а их мезенхимные клетки-предшественницы - C-kit, который появляется в звёздчатых клетках при регенерации печени крысы. Пространство Диссе, в котором располагаются звёздчатые клетки печени, может составлять микроокружение для последних, выполняя роль «ниши» стволовых клеток (Sawitza et al., 2009). Совокупность полученных нами данных в сочетании с результатами других авторов позволяет, таким образом, рассматривать звёздчатые клетки печени как региональные стволовые клетки печени, и сегодня правомерно говорить как минимум о двух возможных источниках развития гепатоцитов. Это, во-первых, энтодермальный эпителий передней кишки, а во-вторых - десмин-позитивные мезодермальные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка и их потомки - звёздчатые клетки печени.

Кроме десмина гепатобласты человека также экспрессируют маркёры стволовых клеток C-kit (4-8 НГ) и C-raet — рецептор к фактору роста гепатоцитов (4-16 НГ)- В регенерирующей печени больных хроническими гепатитами, а также крыс после ЧГ и химического повреждения НС были обнаружены как единичные, так и сгруппированные C-kit-позитивные гепатоциты, а экспрессия C-met отмечена в печени человека в мелких клетках воспалительного инфильтрата и в единичных гепатоцитах (в этих же зонах выявлены ESA+ клетки схожей морфологии). Экспрессия C-kit в гепатобластах в пренатальном онтогенезе и гепатоцитах при репаративной регенерации указывает в первую очередь на их высокую чувствительность к фактору стволовых клеток, а также на низкий уровень их дифференцированное™ и возможную принадлежность к категории прогенигорных клеток. Таким образом, полученные нами результаты подтверждают теорию о том, что гепатоциты — это коммитированные унипотентные стволовые клетки, в норме покоящиеся, но способные к активации и продукции одного вида клеток. Наличие же клеток, экспрессирующих C-met, может указывать на вероятность дифференцировки гепатоцитов не только из эпителия, но и из клеток мезенхимы. Возможность подобной трансформации была показана in vitra (Tsarfaty et al., 1994), когда мезенхимные клетки, экспрессирующие C-met, образовывали трубчатые структуры, то есть становились эпителиальными. В экспериментах возможность образования гепатоцитов из клеток мезодермы во взрослом организме неоднократно была подтверждена другими исследователями (Petersen et al., 1999; Alison et al., 2000;

Theise et al., 2000; Grompe, 2009). Полученные нами данные косвенно подтверждают такую возможность и у человека, причём как в онтогенезе, так и при репаративной регенерации. Об этом свидетельствует появление при регенерации одновременно с C-met+ клетками ESA-позитивных клеток схожей морфологии, поскольку ESA может экспрессироваться эпителиальными клетками не только энтодермалыюго, но и мезодермального генеза (Latza et al., 1990).

Первые гепатобласты, экспрессирующие специфический антиген гепатоцитов HSA, появляются на периферии печени человека после окончания 4-й НГ, а около крупных сосудов — на 6-й НГ. Далее число HSA+ гепатоцитов около сосудов значительно возрастает, а с конца 7-й НГ и далее в течение всей жизни все гепатоциты экспрессируют HSA. Дифференцировка билиарного полюса гепатоцитов начинается на сроке 4,5-5 НГ: первые CD66a+ гепатоциты появляются около крупных сосудов, и здесь их число максимально. В дальнейшем экспрессия этого антигена нарастает, и большинство желчных капилляров имеет просвет. После 12-ти НГ практически все гепатобласты формируют желчные капилляры и СОбба-позитивны. Экспрессия CD66a более интенсивна в перипортальных зонах по сравнению с перицентральными. Таким образом, маркёрами, указывающими на завершение дифференцировки гепатобластов в гепатоциты, являются СК18, HSA и CD66a —они появляются в гепатобластах с начала их дифференцировки (4-4,5 НГ), их экспрессия нарастает параллельно с дифференцированностью клеток и сохраняется в зрелых гепатоцитах на всех сроках индивидуального развития, т.е. присутствие этих маркёров характеризует фенотип зрелых гепатоцитов. Появление этих белков в гепатоцитах регенерирующей печени может быть использовано как показатель достижения ими полной морфологической дифференцировки и функциональной зрелости в ходе регенераторного процесса. Гепатобласты же транзиторно экспрессируют маркёры, указывающие на незрелость их фенотипа, - десмин, C-met, C-kit, ESA, CK 19. Их экспрессия уменьшается и прекращается по мере дифференцировки клеток. Таким образом, признаком дифференцированного состояния гепатоцитов кроме интенсивной экспрессии HSA и CD66a можно считать также отсутствие экспрессии десмина, C-met, C-kit, ESA и СК19.

Если рассматривать вопрос о бипотентности гепатобластов, то результаты наших исследований показали разнородность популяции гепатобластов с самых ранних этапов развития печени человека. Уже на сроке 4 НГ в ней можно выделить как минимум две субпопуляции эпителиальных клеток, отличающиеся размерами, формой и интенсивностью экспрессии CK 19 и CK 18. Поскольку CK 19 является маркёром в первую очередь клеток внутрипечёночных желчных протоков, логично предположить, что мелкие вытянутые клетки, наиболее интенсивно экспрессирующие этот цитокератин, могут быть названы предшественницами будущих холангиоцитов -холангиобластами. Термин же «гепатобласты», по-видимому, целесообразно использовать только для описания клеток-предшественниц гепатоцитов. Тот факт, что через 1-2 недели (5,5-6 НГ) часть описанных клеток (холангиобластов) группируется вдоль линий, соединяющих кровеносные сосуды, также подтверждает

наше предположение - очевидно, они «выстраиваются» вдоль оси будущего ацинуса. Интересно, что холангиобласты сохраняются в паренхиме печени как минимум до конца 15-й НГ, по-видимому являясь источником дифференцировки холангиоцитов для формирующихся протоковых пластинок и внутрипечёночных желчных протоков.

Самым ранним сроком пренатального развития человека, когда можно визуализировать структуры, напоминающие протоковую пластинку, является 6-я НГ, а не 8-я, как было описано ранее (Blankenberg et al., 1991). Именно в это время впервые можно видеть усиление градиента экспрессии ESA, CK 18 и CK 19 в гепатобластах по направлению ко всем сосудам печени. После 7-8-й НГ формировалась истинная протоковая пластинка, клетки которой имели веретенообразную форму и меньшие, чем гепатобласты размеры, тогда как ранее их описывали как уплощенные кубические эпителиальные клетки (Van Eyken et al., 1988; Blankenberg et al., 1991). Протоковая пластинка быстро становилась двухслойной. С середины 12-й НГ и далее в течение всего пренатального развития клетки протоковой пластинки выселялись и мигрировали вдоль кровеносных сосудов. При этом были хорошо видны канальцы Геринга, клетки которых также интенсивно экспрессировали СК18, СК19, ESA. Выявленная миграция клеток по ходу кровеносных сосудов свидетельствует о том, что одним из механизмов развития внутрипечёночных желчных протоков является их прорастание вглубь долек. В это время в области ворот печени впервые можно видеть желчные протоки, имеющие сформированный просвет и окружённые мезенхимой портальных трактов. Ещё через 2 недели сформированные желчные протоки с просветом появлялись внутри железы в образующихся портальных трактах. Обращает на себя внимание тот факт, что вокруг мелких ветвей воротной вены в это время ещё не было сформированных портальных трактов, однако выявлялась высокая интенсивность экспрессии ESA, СК18 и СК19 в прилежащих клетках и тонкая прослойка мезенхимных клеток вокруг сосуда.

Динамика экспрессии ЕМА и СК7 имела существенные отличия от закономерностей появления и экспрессии других эпителиальных маркёров. Эти антигены впервые появлялись у человека только в момент формирования собственно желчных протоков сначала в воротах печени (на 11,5 и 12 НГ соответственно), затем внутри железы и практически отсутствовали в протоковой пластинке. Нам удалось показать, что экспрессия СК7 начинается на 8 недель раньше, чем это было описано ранее (Van Eyken et al., 1988), что указывает на завершение в целом формирования системы внутрипечёночных желчных протоков к концу I триместра гестации. Большинство холангиоцитов становится позитивным по ЕМА уже на 14-й НГ, тогда как по СК7 — только к моменту рождения. Во второй половине гестации в печени человека видны бифуркации растущих желчных протоков в области портальных трактов, при этом также происходит ветвление кровеносных сосудов. Подобная картина ветвления внутрипечёночных желчных протоков и кровеносных сосудов была выявлена нами и при регенерации печени человека (хронические гепатиты) и крысы (ЧГ, повреждение НС). По-видимому, такое ветвление сосудов является одним

из основных механизмов формирования трубчатых структур печени не только у плодов человека, но и при образовании новых портальных трактов в регенерирующей печени человека и крысы. Формирование желчных протоков продолжается в печени человека и после рождения, на что указывает присутствие в ней в первые месяцы жизни как одиночных и сгруппированных клеток, экспрессирующих СК19 и СК7, так и образующихся из них мелких протоков и их ветвлений. Экспрессии HS А и CD66a в клетках протоковой пластинки, формирующихся внутрипечёночных желчных протоков и канальцев Геринга у человека не отмечено, однако они транзиторно экспрессировали C-kit на 7-7,5 НГ с последующим быстрым снижением экспрессии по мере дифференцировки клеток.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что мы вплотную подошли к тому моменту, когда новые факты не могут быть объяснены в рамках традиционных теорий. Если ранее многие учёные рассматривали протоковую пластинку как слой гепатобластов, дифференцирующихся в холангиоциты и формирующих желчные протоки (Van Eyken et al., 1988), то сегодня появились факты, которые противоречат такой трактовке. Фенотипы гепатобластов и холангиобластов действительно оказались весьма похожи, однако каждый клеточный тип экспрессирует также «свои» маркёры, которые отсутствуют в противоположной клеточной популяции. Для гепатобластов - это десмин, C-met, HSA, CD66a, для холангиобластов - ЕМА и СК7. Фенотипические отличия гепатобластов и холангиоцитов на ранних стадиях развития печени были установлены и другими авторами (Dudas et al., 2004; Shiojiri et al., 2004). Клетки, изолированные из фетальной печени крысы на 12-14-й дни гестации и трансплантированные во взрослую печень, были способны генерировать и гепатоциты, и холангиоциты, тогда как из клеток, изолированных на 18-й день гестации, могли образовываться только гепатоциты (Sandhu et al., 2001). Таким образом, у крысы дифференцировка бипотентного эпителиального предшественника и разделение его потомков на две линии происходит до 18-го дня гестации, а у человека, по нашим данным, - не позднее 5-6 НГ. В дальнейшем, именно холангиобласгы (а не гепатобласты) формируют протоковую пластинку и желчные протоки. Повышение градиента экспрессии изначально наблюдается около всех сосудов печени - как приносящих, так и выносящих. Однако клетки, интенсивно экспрессирующие СК18 и СК19, были расположены не только вблизи кровеносных сосудов, но и в паренхиме печени, и они появлялись там на 2-3 недели раньше, чем протоковая пластинка. По нашему мнению, на сроке 4-5 НГ происходит разделение путей дифференцировки клеток гепатоцитарного и холангиолярного рядов, изначально развивающихся из общего кишечного эпителиального предшественника. То есть протоковая пластинка состоит не из гепатобластов, а из незрелых холангиоцитов — холангиобластов, отличающихся от гепатобластов формой, размерами и фенотипом, которые сначала мигрируют вдоль стенки кровеносного сосуда (экспрессируя СК19, СК18, ESA, C-kit), а затем, когда их число в данном конкретном месте достигает необходимого уровня, формируют трубчатые структуры и экспрессируют только СК18, СК19, СК7 и ЕМА, причём СК7

и ЕМА появляются уже в достаточно дифференцированных клетках.

Таким образом, гепатоциты и холангиоциты, с одной стороны, могут происходить из общей кишечной эпителиальной клетки-предшественницы, и очевидно, что из этого источника развивается большинство клеток обеих популяций. С другой стороны, гепатоциты могут иметь альтернативный клеточный источник развития — мезенхимные десмин-позитивные (очевидно, звёздчатые) клетки, тогда как для холангиоцитов существование дополнительного источника развития пока ничем не подтверждается. При этом результаты проведённого исследования показали, что в ходе пренатального развития человека клетки протоковой пластинки окружены десмин-позитивными звёздчатыми клетками печени. Возможно, что клетки более зрелых протоков также находятся в тесном контакте со звёздчатыми клетками, однако сроки появления первых протоков совпадают с моментом прекращения экспрессии десмина в звёздчатых клетках печени человека, что не позволяет проследить данные взаимодействия. Аналогичные взаимоотношения между звёздчатыми клетками и клетками формирующихся внутрипечёночных желчных протоков были выявлены ранее в печени крысы (Киясов и др., 1997). Таким образом, десмин-позитивные звёздчатые клетки печени формируют микроокружение для клеток развивающихся внутрипечёночных желчных протоков и у крысы, и у человека, и, очевидно, оказывают влияние на процесс дифференцировки последних. Механизмами такого влияния могут быть прямые межклеточные контакты между десмин-позитивными звёздчатыми клетками и эпителием протоков, значение которых было показано в экспериментах in vitro (Petersen et al., 2001), a также продуцируемые звёздчатыми клетками печени и имеющие важное значение для морфогенеза протоков разнообразные ростовые факторы - HGF, трансформирующие факторы роста TGF-a, TGF-ß и др. (Schirmacher et al., 1992; Tan et al., 1995; Terada et al„ 1997; Asahina et al„ 2002; Lemaigre, 2003), а также белки межклеточного вещества (Doljanski, Roulet, 1934; Mäher et al., 1988; Shah, Gerber, 1990; Ramadori et al., 1991; Desmet, 1992; Madri, Basson, 1992; Terada, Nakanuma, 1994; Friedman, 2008). Предположение же о том, что микроокружение формирующихся протоков может быть образовано миофибробластами, происходящими из звёздчатых клеток печени (Libbrecht et al., 2002), не нашло своего подтверждения, поскольку маркёр миофибробластов а-ГМА ни на одном из сроков гестации у человека не был обнаружен вблизи протоков. Этот контрактильный белок всегда присутствовал только в ГМК вен и артерий. Аналогичные результаты были получены нами и при изучении пренатального развития кровеносных сосудов и желчных протоков у крысы.

Существует гипотеза, рассматривающая в качестве основных механизмов перестройки протоковой пластинки пролиферацию образующих её клеток и последующее удаление «лишних» клеток апоптозом (Fabris et al., 2000; Clotman et al., 2002; Roskams, Desmet, 2008). Оказалось, однако, что в развивающейся печени человека на всех сроках гистогенеза пролиферирующие клетки практически не встречаются в протоковой пластинке. Только во второй половине гестации в формирующихся желчных протоках, особенно мелких, можно было видеть

единичные РСЫА-позитивные клетки. Следовательно, пролиферативный процесс не играет значительной роли в формировании протоковой пластинки и её удвоении у человека, что подтверждает данные, полученные другой группой учёных (РаЬт с1 а!., 2000; СЫтап е1 а!., 2002). По-видимому, основной механизм формирования протоковой пластинки - дифференцировка холангиобластов, а не пролиферация клеток, которая становится более активной тогда, когда протоки уже более или менее сформированы. Однако при повреждении печени различной природы неизменно отмечается усиленная пролиферация многих клеток печени, в том числе и холангиоцитов. Пролиферацию этих клеток мы обнаружили и в печени больных хроническими гепатитами, и в печени крыс, регенерирующей после ЧГ или повреждения НС (около 35% пролиферирующих клеток через 2-3 суток после повреждения). Другими словами, по-видимому, во взрослом организме именно этот механизм обеспечивает восстановление клеток протоков после повреждения печени. Очевидно, что именно пролиферация холангиоцитов приводит к появлению единичных и сгруппированных СК19+/СК7(-) веретенообразных клеток, обнаруженных нами в регенерирующей печени и человека, и крысы. Они соответствуют по размеру и форме холангиобластам фетальной печени, и, так же как и они, имеют незрелый фенотип, на что указывает отсутствие в них СК7. Образовавшиеся холангиоциты формируют группы, что приводит затем к образованию новых протоков путём миграции клеток и ветвления имеющихся протоков.

Механизмы апоптоза также не играют значительной роли в перестройке протоковой пластинки: ни клетки протоковой пластинки, ни клетки внутрипечёночных желчных протоков в развивающейся печени человека не экспрессировали ни индуктор апоптоза Вс1-гатЬо, ни анти-апоптозный белок Вс1-2, хотя оба маркёра присутствовали в других клетках железы. Уменьшение экспрессии Вс1-2 в процессе пренатального развития рассматривается рядом авторов как доказательство удаления «лишних» клеток протоковой пластинки апоптозом (ЛовкатБ, ОевтеЪ 2008). Наши же результаты скорее подтверждают данные Серджи с коллегами о низком уровне апоптоза в клетках протоковой пластинки (Бе^ е1 а1., 2000).

Поскольку было установлено, что и в процессе пренатального развития печени человека, и при регенерации печени человека и крысы образование новых внутрипечёночных желчных протоков происходило путём их ветвления, и этот процесс был связан с ветвлением кровеносных сосудов, было сделано предположение, что и в пренатальном гистогенезе печени человека развитие системы желчных протоков неразрывно связано с развитием портальных сосудов. Однако оставалось непонятным, как происходит развитие сосудистой, в первую очередь артериальной, системы печени, и что является первичным - развитие протоков или прорастание сосудов. В связи с этим мы исследовали процесс формирования сосудов печени в пренатальном онтогенезе человека в сопоставлении с формированием внутрипечёночной билиарной системы.

Первые СБ34-позитивные клетки (гемангиобласты) были обнаружены на сроке 3,5 НГ во внезародышевой части желточного мешка, дорзальной и вентральной аортах и в зародышевой мезодерме, то есть желточный мешок является не только первым кроветворным органом, но и служит некой ключевой точкой, от которой начинается формирование сердечно-сосудистой системы эмбриона К концу 4-й НГ все эндотелиальные клетки аорты также экспрессировали СБ34. Далее С034-позитивные клетки появлялись в вителиновых и пупочных венах, венозном протоке, нижней полой вене и синусоидах печени, а затем (4,5-7 НГ) - в клубочках мезонефроса, среди мезодермальных клеток, окружающих нервную трубку, кишку, лёгкие. При этом в почках и нервной системе были видны тяжи СП34+ клеток, идущие от аорты или артерий к органам, которые на 7-й НГ экспрессировали также Вс1-2. Таким образом, во многих органах формирование сосудов начинается с васкулогенеза, и первые капиллярные сети появляются в печени и почках. Только в некоторых случаях (почка, нервная трубка) одновременно можно видеть прорастание эндотелиоцитов от аорты или других артерий вглубь органов (ангиогенез). В основном же система магистральных внутриэмбриональных сосудов формируется за счёт последовательной смены васкулогенеза ангиогенезом, после которого начинается артериогенез, и на этой стадии вокруг эндотелиальных клеток появляются миогенные клетки. Гладкомышечные клетки в стенке сосудов сначала появляются в пупочной вене около плаценты и в области желудочков сердца и аорты (4-я НГ), которые таким образом являются вне- и внутриэмбриональными центрами, от которых начинается дифференцировка гладкомышечных клеток (ГМК) кровеносных сосудов. При этом в ГМК сначала начинается экспрессия десмина, затем - а-ГМА, и затем - кальпонина. По-видимому, только функционально активная клетка экспрессирует все три белка После установления экспрессии этих миогенных белков в пупочной вене, аорте, подвздошных и пупочных артериях (4-5 НГ) начинается приобретение дефинитивного фенотипа ГМК в других крупных ветвях аорты.

Развитие сосудов внутри печени имело схожие закономерности. На стадии печёночного дивертикула в печени человека не удавалось увидеть какие-либо полости, напоминающие сосуды - в это время она представляла собой плотную массу клеток. После окончания 4-й НГ в печени уже можно видеть мелкие полости, выстлшшые СБ34+ эндотелиальными клетками - будущие синусоидные капилляры. Наряду с синусоидами в это время на краю печени можно видеть одну большую полость - приносящую вителиновую вену. Уже на этих сроках эндотелиальные клетки в печени экспрессируют не только виментин, но и эндотелиальные маркёры СБ34 и С031, экспрессия которых резко снижается к окончанию эмбрионального периода развития. После 8-й НГ лишь единичные эндотелиоциты около кровеносных сосудов продолжают экспрессировать С034. Таким образом, эндотелиальные клетки являются одной из наиболее рано дифференцирующихся клеточных популяций в печени человека.

На начальных этапах развития печени человека единственным сосудом, содержащим в своей стенке ГМК, экспрессирующие десмин и а-ГМА, была

вителиновая вена Чуть позднее в единичных клетках этой вены появлялся кальпонин. На 6-й НГ в печени уже можно видеть выстланные эндотелием полости разного размера, но более крупные, чем синусоидные капилляры. В стенке некоторых из этих полостей присутствуют единичные ГМК, экспрессирующие а-ГМА, а затем и кальпонин. К концу 6-й НГ в печени довольно много таких сосудов, при этом в стенке приносящих (будущих воротных) вен экспрессия а-ГМА намного более выражена, чем в выносящих (будущих центральных) венах. Такая же закономерность отмечена и для эндотелиального маркёра CD34: его экспрессия также более выражена в приносящих внутрипечёночных сосудах. Контуры таких сосудов имеют округлую форму и ровный край, тогда как сосуды, у которых лишь единичные клетки экспрессируют а-ГМА и CD34, имеют, как правило, вытянутую форму и неровный, «изрезанный» край. Эти выносящие сосуды обычно расположены ближе к периферии печени и, по-видимому, представляют собой формирующиеся центральные вены. Таким образом, именно на этом этапе (7-8 НГ) можно впервые наблюдать дифференциацию внутрипечёночных вен на приносящие и выносящие. Исходя из существующей теории формирования сосудистой системы печени (Collardeau-Frachon, Scoazec, 2008), эти сосуды появляются в результате сложной перестройки пупочных и вителиновых вен, что приводит к образованию афферентной венозной портальной системы.

В дальнейшем именно вокруг приносящих CD34+/a-rMA+ сосудов концентрируются СК19+++ холангиобласты, формирующие протоковую пластинку. При этом нельзя не вспомнить, что усиление градиента экспрессии цитокератинов и ряда других эпителиальных маркёров на более ранних сроках было отмечено около всех сосудов, а также на периферии печени, где сосудов ещё не было. Формирование же истинной протоковой пластинки из имеющих характерную морфологию мелких веретенообразных клеток происходило уже только вокруг афферентных сосудов. Очевидно, что именно дифференцировка ветвей воротной вены является определяющим фактором для образования протоковой пластинки. Весьма вероятно, что триггером в данном процессе служит повышение концентрации кислорода в печени после формирования афферентной воротной системы. Известно также, что билиарная дифференцировка индуцируется в фетальной печени перипортальным градиентом активина/TGF-p, выраженность которого контролируется ингибирующим влиянием ядерного фактора гепатоцитов HNF6 и Onecut factor ОС-2 (Clotman et al., 2005), а сигналом к активации самого HNF6 служит сигнал из портальной мезенхимы (Crosnier et al., 2000; Nijjar et al., 2001; Loomes et al., 2002; Flynn et al., 2004; Tanimizu, Miyajima, 2004). Постепенно все внутрипечёночные ветви воротной вены окружаются кольцом мезенхимы, которая после 8-й НГ визуализируется достаточно чётко и должна стать основой для формирования портальных трактов, в которую позднее будут врастать ветви печёночной артерии (Collardeau-Frachon, Scoazec, 2008).

На сроке 5,5-6,5 НГ можно видеть отходящий от аорты чревный ствол, растущий в направлении поджелудочной железы и печени, клетки стенок которого экспрессируют один из маркёров стволовых клеток Вс1-2. В это же время можно

видеть первые С034+ клетки в мезенхиме, окружающей желчный пузырь, а затем и пузырную артерию. Данные факты подтверждают предположение о том, что печёночная артерия изначально развивается как артерия для желчного пузыря (Оевте^ 1992). По-видимому, развитие сосудов печени и желчного пузыря происходит путём ангиогенеза (прорастание артерий в орган) и васкулогенеза (образование сосудов из эндотелиальных клеток-предшественниц в самом органе). Немного позднее (8,5 НГ) в самой печени появляются сосуды, в стенках которых присутствуют клетки, экспрессирующие, так же как и клетки стенок чревного ствола, Вс1-2 вплоть до 14-й НГ. Поскольку в эмбриогенезе сосудистой системы экспрессия Вс1-2 была отмечена только в стенке артерий, по всей видимости, в данном случае мы наблюдаем первые признаки прорастания в печень ветвей собственной печёночной артерии. Нельзя исключить, что стимулировать этот рост могут факторы, вырабатываемые холангиобластами, в частности, транскрипционные факторы Ю№-6 и ШР-1Р (СЫтап е! а1., 2002, 2003; Сойииег ег а1., 2002), и сигнальные пути ^ес!-Ш^сЬ (Хие й а1., 1999; МсСНеЫ е[ а1., 2002; N¡¿31 е1 а1„ 2002; Пупп й а1., 2004; Ко<1ата е! а1., 2004), имеющие важное значение для развития как протоков, так и артерий.

К 8-й НГ в стенках крупных сосудов печени появляется второй слой а-ГМА+ гладкомышечных клеток и усиливается экспрессия кальпонина. Именно в эти сроки активно начинаются процессы ремоделирования протоковой пластинки (её удвоение и формирование просвета, миграция клеток в мезенхиму будущего портального тракта и в паренхиму печени), что позволяет связать этот факт с появлением в печени новых афферентных сосудов - ветвей печёночных артерий. У плода по воротной вене течёт главным образом артериальная кровь, поступающая из пупочной вены, а по печёночной артерии - смешанная кровь со значительной долей венозной крови. Возможно, именно возникающее при прорастании артерии изменение состава поступающей в печень крови имеет решающее значение для завершения формирования внутрипечёночного билиарного дерева. Кроме того, ветви воротной вены ещё до прорастания артерии окружены капиллярами, эндотелий которых позитивно окрашивается с антителами к С034, чего не наблюдается вокруг центральных вен. К 13-14-й НГ внутри печени можно дифференцировать портальные тракты, содержащие внутрипечёночные желчные протоки, артериальные и венозные сосуды. К этому времени капилляры становятся более крупными и располагаются главным образом внутри портального тракта вокруг его сосудов среди клеток мезенхимы. Таким образом, можно сделать вывод, что определяющим в формировании системы желчных протоков все-таки является наличие афферентных кровеносных сосудов, на первом этапе (образование протоковой пластинки) -портальных вен (7-8 НГ), а затем (ремоделирование протоковой пластинки и образование протоков) - капиллярной сети и печёночных артерий (8-9 НГ и позднее). В пользу такого вывода свидетельствует и тот факт, что на протяжении всего пренатального развития эпителий желчного пузыря и образующиеся желчные протоки окружены мелкими кровеносными сосудами, по-видимому, мелкими

артериолами и капиллярами, эндотелий которых экспрессирует CD34. Таким образом, прорастание артериальных ветвей предшествует формированию желчных протоков, что подтверждает гипотезу о том, что именно артерии индуцируют объединение периферических трубочек билиарных клеток в процессе ремоделирования протоковой пластинки (Terada, Nakamura, 1993).

При рассмотрении проблемы формирования сосудистой системы печени возникает ещё один вопрос, связанный с выполнением печенью в пренатальном периоде кроветворной функции. Многие вопросы печёночного этапа гемопозза, в частности, пути и сроки появления в печени разных типов клеток крови, популяции клеток, составляющих микроокружение кроветворных островков, изучены крайне недостаточно. На самом раннем изученном нами сроке (3,5 НГ) большинство клеток крови находилось в желточном мешке, просвете дорзальной и вентральной аорт. Часть этих клеток, имеющих по сравнению с другими относительно большие размеры и объём цитоплазмы, экспрессировала десмин и CD34. Позднее клетки такой морфологии мы наблюдали в сосудах печени и островках кроветворения, и они экспрессировали десмин и C-met. Мы предполагаем, что такие клетки могут представлять субпопуляцию кроветворных клеток, способных дифференцироваться в гепатоциты. Появление в них десмина, а затем C-met, вероятно указывает путь такой дифференцировки, поскольку одной из особенностей C-met является его появление в мезенхимных клетках, дифференцирующихся в эпителий (Tsarfaty et al., 1994). Кроме того, данный факт косвенно подтверждает возможность развития самих звёздчатых клеток из кроветворных стволовых клеток, которая была установлена ранее на мышах (Baba et al., 2004).

Первые единичные С034-позитивные гемангиобласты появляются в паренхиме печени человека на самых ранних этапах её развития (4,5 НГ), и далее их число постепенно увеличивается. ЕМА+ клетки эритроидного и лимфоцитарного рядов (Delsol et al., 1988; Brugger et al., 1999), по нашим данным, появляются в печени на 5-6-й НГ до начала печёночного кроветворения, возможно в результате дифференцировки CD34+ клеток. Начиная с 8-й НГ, ЕМА+ клетки образуют кластеры, максимально концентрируясь около сосудов и на периферии печени, а также в островках кроветворения и в просвете сосудов печени. Во второй половине гестации их число постепенно уменьшается, у новорождённых они присутствуют только в кроветворных островках. CD31+ клетки-предшественницы мегакариоцитов впервые появляются в паренхиме печени на сроке 4 НГ, а с середины 6-й НГ уже можно видеть CD31+ мегакариоциты, с 8-й НГ о™ появляются в островках кроветворения. Далее число CD31-позихивных мегакариоцитов нарастает, и их максимальное количество отмечено в период с 8-й по 20-ю НГ. По-видимому, заселение гемангиобластов и других клеток-предшесггвенниц происходит из желточного мешка по вителиновым венам, и до начала кроветворения они главным образом служат клетками-предшественницами эндотелиальных клеток печени, которые инициируют формирование внутриорганного сосудистого русла, а также формируют популяцию клеток-предшественниц кроветворения, которые дадут начало

кроветворным островкам на 8-й НГ (Гумерова и др., 2004; Kiyasova, Gumerova, 2004). С этого момента клетки кроветворных островков начинают активно экспрессировать Bcl-rambo, что подтверждает апоптоз «лишних» кроветворных клеток (Kataoka et al., 2001), которые затем удаляются звёздчатыми макрофагами, появляющимися в островках с началом кроветворения. В отличие от других клеток крови, макрофаги появляются сначала не в печени, а в мезенхиме вентральной брыжейки на 5,5-й НГ, что свидетельствуют о том, что именно эти мезенхимные клетки являются источником развития макрофагов печени. Через неделю (6 НГ) макрофаги появляются в синусоидах печени, число их нарастает, после 8-й НГ они присутствуют в кроветворных островках, а с 13-й НГ - в соедишггельной ткани портальных трактов.

По результатам нашего исследования, у человека основными клетками, образующими микроокружение кроветворных клеток в островках с 8-й по 14-ю НГ, являются десмин-позитивные звёздчатые клетки, расположенные внутри и вокруг островков. Весьма вероятно, что они и дальше продолжают выполнять эту функцию, однако проследить их локализацию в печени человека на более поздних стадиях, к сожалению, не представляется возможным из-за прекращения в них экспрессии десмина. Механизмами влияния звёздчатых клеток на кроветворение могут быть синтез необходимых для нормального кроветворения эритропоэтина (Maxwell et al., 1994; Eckardt, 1996), нейротрофина (Passino et al., 2007), ретиноидов (Tocci et al., 1996), экспрессия сосудистой молекулы клеточной адгезии VCAM-1 (Kubota et al., 2007), ключевой для поддержания адгезии гемопоэтических прогениторов к стромальным клеткам костного мозга (Miyake et al., 1991), и фактора стромальных клеток SDF-la - потенциального хемоаттрактанта для кроветворных стволовых клеток, стимулирующего их миграцию к месту гемопоэза за счёт взаимодействия! со специфическим рецептором CXR4 (Wright et al., 2002). Таким образом, звёздчатые клетки печени являются клетками «ниши» не только для эпителиальных клеток печени, но и для кроветворных клеток в период печёночного этапа кроветворения.

В процессе изучения пренатального развития и регенерации печени мы не раз сталкивались с экспрессией разнообразных маркёров стволовых клеток различными клетками печени и её окружения. Однако остается открытым вопрос, какие из этих клеток в наибольшей степени проявляют фенотипические признаки стволовых клеток. Результаты исследования позволили установить, что маркёры стволовых клеток печени в процессе пренатального онтогенеза печени человека экспрессируют: 1) клетки мезенхимы, окружающей печень: Вс1-2 на 4-8-й НГ, CD133 и C-kit на 5-6-й НГ; 2) мезотелиальные клетки капсулы печени: Вс1-2 на 5-7-й НГ; 3) звёздчатые клетки печени: Вс1-2 с 4-й до 14-й НГ, далее в течение всего пренатального периода и у новорожденных Bcl-2-позитивные клетки присутствуют в синусоидах печени; 4) синусоидные клетки: C-kit на 6-7-й НГ и CD133 с 4-й по 8-ю НГ; 5) гепатобласты: C-met с 4-й по 8-ю НГ и C-kit с 4-й НГ, после 8-й НГ интенсивность экспрессии C-kit снижается, но сохраняется до периода новорожденное™; 6) клетки протоковой пластинки: C-kit с 7-й НГ и далее в течение всего пренатального периода; 7) эндотелиальные клетки сосудов печени: Вс1-2 с 7-й по 14-ю НГ, а с 4-й НГ и в

течение всего пренатального периода - CD34, после 8-й НГ экспрессия CD34 сохраняется только в эндотелиоцитах перипортальных областей печени; 8) клетки стенки сосудов печени: Вс1-2 с 7-й по 14-ю НГ; 9) кроветворные стволовые клетки в просвете сосудов (с 4-й НГ) и позднее в островках кроветворения - CD34 и C-met. В регенерирующей печени больных хроническими гепатитами C-kit экспрессировали как гепатоциты, так и синусоидные клетки. Мелкие клетки в области перипортального воспаления экспрессировали C-met. В печени крысы в ходе регенерации после повреждения НС или ЧГ C-kit экспрессировали гепатоциты и звёздчатые клетки печени. Таким образом, наиболее устойчивая экспрессия маркёров стволовых клеток выявлена в развивающейся печени человека в синусоидных клетках (главным образом в звёздчатых клетках печени), в гепатобластах/гепатоцитах и клетках протоковой пластинки. Очевидно, что именно эти клеточные типы обладают свойствами прогениторных клеток в наибольшей степени. Изучение же экспрессии этих маркёров в регенерирующей печени человека и крысы ограничивает этот ряд клеток до двух клеточных популяций. Это - гепатобласты/гепатоциты и звёздчатые клетки печени. Интересно, что эти две клеточные популяции находятся друг с другом в весьма своеобразных и очень тесных взаимоотношениях. С одной стороны, каждая из них проявляет свойства стволовых клеток. С другой стороны, пространство Диссе (в образовании которого участвуют гепатоциты) является «нишей» стволовых клеток, в которой находятся звёздчатые клетки печени, а сами звёздчатые клетки, в свою очередь, являются клетками микроокружения дифференцирующихся гепатобластов. Наличие общих маркёров и переходных с гепатобластами форм клеток, экспрессия маркёров стволовых клеток, расположение в «нише» стволовых клеток указывают на исключительную роль звёздчатых клеток в развитии и регенерации печени. Именно этот клеточный тип может со всем основанием претендовать на роль региональной стволовой клетки печени. Для проверки этой гипотезы мы провели эксперимент по культивированию чистой популяции звёздчатых клеток..

Свежевыделенные и помещённые в культуру клетки имели типичную морфологию звёздчатых клеток — отростчатые клетки, содержащие в цитоплазме капли жира и экспрессирующие виментин и десмин. Культивируемым клеткам не создавали искусственное микроокружение и не добавляли в среду ростовые факторы, рассчитывая на то, что они, обладая синтетическими способностями, будут создавать себе микроокружение сами. К концу первой недели они окрашивались с антителами против коллагенов I, III и IV типов и ламинина. В течение первой недели культивирования возрастала плотность клеток и интенсивность окраски с антителами к десмину. В цитоплазме части клеток, лежащих в удалении от основной клеточной массы, появлялись стресс-волокна, и начиналась экспрессия а-ГМА, постепенно количество таких клеток увеличивалось. Мы не пересевали клетки в момент слияния, и к концу второй недели добились образования монослоя и ретракции цитоплазматических отростков. Уже на этом сроке были обнаружены отдельные кластеры клеток, в которых присутствовал специфический фермент гепатоцитов у-глутамилтранспептидаза (y-1'Ш). Процесс упаковки монослоя сопровождался

репрессией десмина и исчезновением миофибробластов. Через три недели культивирования, когда монослой морфологически был похож на монослой эпителиальных клеток, клетки обрабатывали трипсином и пересаживали на новые покровные стекла.

Пересаженные клетки после изменения микроокружения в течение первых суток вновь приобретали типичную морфологию звёздчатых клеток печени. Часть этих клеток была двухъядерной, что могло быть следствием их деления, но нельзя исключить, что какие-то из них в момент пересева были полиплоидными. В течение первой недели культивирования пересаженные клетки начинали экспрессировать десмин, а в их цитоплазме в течение первых двух недель начинался синтез макромолекул межклеточного матрикса. По мере увеличения плотности клеток происходила ретракция отростков и образование плотного пласта, напоминающего пласт эпителия. На 9-е сутки, несмотря на то, что уже начинал образовываться монослой, в цитоплазме лишь единичных клеток выявлялась у-ГТП, однако к концу третьей недели она присутствовала практически во всех клетках культуры. Более того, к концу третьей недели культивирования часть клеток экспрессировала а-ФП, a в цитоплазме более крупных клеток, напоминающих по своей морфологии гепатоциты, появлялись СК8 и СК18.

Таким образом, полученные нами данные позволили установить, что звёздчатые клетки печени крысы могут совершать мезенхимально-эпителиадьную трансформацию и экспрессировать гепатоцитарные маркёры - у-ГТП, СК8 и СК18, а-ФП. Последние годы появляется все больше фактов, подтверждающих такую возможность. Так, с началом печёночного этапа гемопоэза высокая плотность звёздчатых клеток имеет место как в печени в целом, так в области очагов кроветворения, причём эти клетки в очагах кроветворения имеют эпителиально-мезенхимальный фенотип (Kiassov et al., 1995; Chagraoui et al., 2003). В звёздчатых клетках печени человека была обнаружена одновременная экспрессия одного из маркёров кроветворных стволовых клеток CD34 (Suskind, Muench, 2004) и эпителиальных маркёров СК18, СК19 и Е-кадгерина (Lim, Lee , 2002; Lim et al., 2002). Позднее была показана возможность образования гепатоцитов из мезенхимных клеток in vitro и in vivo (Alison et al., 2004; Lee te al., 2004; Seo et al., 2005). Ha основании результатов нашего исследования динамики фенотипов клеточных популяций в пренатальном о!ггогенезе и при репаративной регенерации, мы считаем, что дифференцировка мезенхимных клеток имеет следующее направление: десмин-позитивные клетки мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки дают начало звёздчатым клеткам печени, которые, в свою очередь, формируют в эмбриогенезе региональный стволовой резерв для восстановления пула гепатоцитов. Помимо этого, десмин-позитивные звёздчатые клетки печени в пренатальном онтогенезе являются важнейшим фактором микроокружения для развивающихся гепатоцитов, холангиоцитов и кроветворных клеток. Обладая своеобразной двойственностью (стволовые клетки - клетки микроокружения), по всей вероятности, звёздчатые клетки печени могут выполнять одну из этих программ в зависимости от

потребностей органа в тот или иной момент времени, или же популяция этих клеток является функционально неоднородной. Таким образом, не вызывает сомнений, что звёздчатые клетки печени играют очень важную роль в развитии и регенерации этого органа. Установленные в настоящем исследовании факты позволяют рассматривать именно этот клеточный тип в качестве наиболее вероятного претендента на роль стволовой клетки печени человека и крысы.

ВЫВОДЫ

1. У человека в ходе первичной печёночной индукции процесс обособления эпителиальных клеток зачатка печени от кишки сопровождается изменением их фенотипа - прекращением экспрессии ЕМА. В период вторичной печёночной индукции, основные события которой у человека происходят с 4-й по 8-ю НГ, мезенхимные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, окружающие выселившиеся эпителиальные клетки, имеют фенотип виментин+/десмин+/СК18/СК19+, отличный от фенотипа мезенхимных клеток других локализаций (виментин+/десмин(-)/СК18(-)/СК19(-)). Мезенхимные и эпителиальные клетки, участвующие во вторичной печёночной индукции, имеют ряд общих фекотипических признаков — в их цитоплазме или на плазматической мембране присутствуют десмин, СК18, СК19 и C-kit

А) Звёздчатые клетки печени появляются в развивающейся печени на 4-й НГ и фенотипически не отличаются от основной массы окружающих её мезенхимных клеток: в цитоплазме звёздчатых клеток выявляются десмин, СК18, СК19 и Вс1-2. Десмин не является постоянным фенотипическим маркёром звёздчатых клеток печени человека и выявляется в них только до 14-й НГ включительно.

Б) Звёздчатые макрофаги печени, в которых присутствует макрофагальный антиген, обнаружены в синусоидах печени начиная с 7-й недели развития, а первые клетки, позитивные по макрофагальному антигену, появляются среди клеток мезенхимы на неделю раньше.

3. На сроке 4-6 НГ в десмин-позитивных звёздчатых клетках печени человека присутствуют маркёры гепатобластов СК18 и СК19, и одновременно в клетках с морфологией гепатобластов появляется десмин, что свидетельствует о возможности мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки десмин-позитивных звёздчатых клеток печени in vivo. Такая же трансдифференцировка происходит in vitro - в чистой культуре в звёздчатых клетках печени крысы при установлении межклеточных контактов и образовании монослоя появляются маркёры, специфические для гепатобластов и гепагоцитов - СК8, СК18, а-ФП и у-ГТП.

4. В процессе репаративной регенерации печени крысы и человека звёздчатые клетки печени, наряду с гепатоцитами, проявляют фенотипические признаки

прогениторных клеток, экспрессируя С-кк. Устойчивая экспрессия маркёров стволовых клеток также характерна для обоих указанных клеточных типов в пренатальном онтогенезе человека: гепатобласты экспрессируют С-кк, С-те^ СЭ133 (4-8-я НГ), а звёздчатые клетки печени - Вс1-2 (4-14-я НГ)-В пренатальной печени человека десмин-позитивные мезенхимные клетки и звёздчатые клетки печени окружают дифференцирующиеся гепатобласты и холангиобласты, а также кроветворные клетки в период печёночного этапа гемопоэза.

В печени человека с 5-й НГ можно выделить две популяции эпителиальных клеток, отличающихся формой, размерами и фенотипом: крупные округлые гепатобласты (Ев А+/СК18+/СК19+/С-кк+/десмин+/С-теС+/СОбба+Л1ЯА+) и мелкие вытянутые холангиобласты (Е8А+/СК18+/СК19+-н7С-кк+/ЕМА+/СК7+). Большинство гепатоцитов приобретают окончательный фенотип (СК18+/С066а+/ША+) к 15-16-й НГ, а холангиоцитов - к 13-14-й НГ (ЕЭА+/СК18+/СК19+++/ЕМА+++/СК7+++), в момент появления в печени первых сформированных желчных протоков.

В пренатальном онтогенезе человека формирование и ремоделирование протоковой пластинки, из клеток которой формируются внутрипечёночные желчные протоки, происходит путём дифференцировки холангиобластов в холангиоциты без существенного участия процессов пролиферации и апоптоза, однако в ходе восстановления протоков после повреждения печени у человека и крысы в пролиферации участвует до одной трети холангиоцитов. Формирование внутрипечёночных желчных протоков в пренатальном онтогенезе печени человека и их восстановление при репаративной регенерации печени человека и крысы осуществляется за счёт прорастания и ветвления протоков совместно с артериальными сосудами.

Эндотелиальные клетки, экспрессирующие специфические для эндотелия маркеры С034 и С031, появляются в развивающейся печени человека на сроке 4 НГ. Экспрессия СИ34 и СШ1 прекращается в большинстве эндотелиоцитов к концу 8-й НГ, и они приобретают фенотип С034(-)/С031(->, характерный для этих клеток в зрелой печени человека.

Дифференциация венозных сосудов печени человека начинается на 6-7-й НГ: ветви воротной вены имеют ровные контуры, выстланные СОЭ4+ эндотелиоцитами и развитую мышечную оболочку, для центральных вен характерны «изрезанный» контур, С034± эндотелиоциты и единичные ГМК в мышечной оболочке. Становление афферентных кровеносных сосудов предшествует и определяет формирование системы внутрипечёночных желчных протоков: после дифференциации ветвей воротной вены (6-7 НГ) образуется протоковая пластинка, а прорастание ветвей печёночной артерии (8-9 НГ) предшествует её ремоделированию и формированию протоков.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В морфологической диагностике опухолей печени и при изучении процессов дифференцировки гепатоцитов человека рекомендуется применять в качестве маркёров гепатобластов десмин, ESA, СК18, СК19, C-met, C-kit, гепатоцитов -CK 18, CD66a, HS А, учитывая тот факт, что CK 18 одинаково интенсивно экспрессируется в клетках разной степени дифференцированности.

2. В морфологической диагностике опухолей печени и при изучении процессов дифференцировки клеток внутрипечёночных желчных протоков человека рекомендуется применять в качестве маркёров холангиобласгов ESA, СК18, CK 19, C-kit, холангиоцитов - СК19, EMA, СК7.

3. Ввести в стандарт морфологической диагностики хронических заболеваний печени человека иммуногистохимическое вьивление экспрессии: 1) C-met и C-kit — для определения факта активации стволового компартмента; 2) CD34 и CD31 — для выявления фенотипа эндотелиальных клеток синусоидов печени и их возможной капилляризации.

4. При изучении пренаггального развития сосудистой системы человека целесообразно применять иммуногистохимическое выявление десмина, а-ГМА и кальпонина как маркёров, отражающих степень дифференцированности гладкомышечных клеток сосудистой стенки.

5. При выполнении иммуногистохимического окрашивания образца ткани с моноклональными антителами к двум различным антигенам после выявления активности ферментной метки в первом окрашивании применять кипячение в цитратном буфере в течение 15 минут для разрушения и удаления всех нанесённых на срезы иммуноглобулинов с целью минимизации неспецифического связывания антител во время второго окрашивания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Билалов М.М. Экспрессия цитокератинов №7 и №19 в пре- и постнатальном онтогенезе печени крыс / М.М. Билалов, A.A. Гумерова // Сборник докладов итоговой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 40-летию КГМА. - Кемерово, 1996. - С. 100-102.

2. Гумерова A.A. Улучшенный метод одновременного иммуногистохимического выявления двух белков промежуточных филаментов цитоскелета / A.A. Гумерова, М.М. Билалов, А.П. Киясов // Тезисы И Республиканской конференции молодых учёных и специалистов. - Казань, 1997. - С. 47.

3. Киясов А.П. Использование иммуногисгохимических методов для прогнозирования исходов хронических гепатитов / А.П. Киясов, Л.С. Фатхеева, A.A. Гумерова [и др.] // Тезисы докладов II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики». -Москва, 1997.-С. 94.

4. Гумерова A.A. Индуцированная пролиферация отдельных клеточных типов печени, поджелудочной и щитовидной желез / A.A. Гумерова, М.А. Титова, А.П. Киясов 1! Материалы научной конференции, посвящённой 190-летию кафедры анатомии человека КГМУ и 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР, проф. Н.Г. Колосова «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных: проблемы экологии в медицине». - Казань, 1997. - С. 37-38.

5. Киясов А.П. Экспрессия десмина клетками Ито эмбриональной печени человека / А.П.

Киясов, А.А. Гумерова // Тезисы докладов III Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов. - Казань, 1997. - С. 41.

6. Гумерова А.А. Нитрат свинца стимулирует пролиферацию и алоптоз клеток Ито в печени крысы / А.А. Гумерова, А .П. Киясов, А.Р. Минсафина // Тезисы докладов III Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов -Казань, 1997. - С. 83.

7. Гумерова А.А. Пролиферация клеток Ито печени не является триггером их трансформации в миофибробласты / А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Тезисы докладов 3-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока - Новосибирск, 1997. - С. 54.

8. Киясов А.П. Экспрессия цитокератинов в пре- и постнатальном онтогенезе / А.П. Киясов, АА. Гумерова, М.М. Билалов // Онтогенез. -1997. - Т. 28, № 5. - С. 389-393.

9. Гумерова А.А. Иммуногистохимическое выявление пролиферирующих клеток Ито в печени крыс / А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Материалы научной конференции, посвященной 35-летию ЦНИЛ КГМУ «Современные методы исследования в клинике и эксперименте». - Казань, 1997. - Ч. I. - С. 35-36.

10. Гумерова А.А. Альфа-гладкомышечный актин - фенотипический маркёр активированных клеток Ито печени человека / А А. Гумерова, А.С. Созинов, Л .С. Фатхеева [и др.] // Материалы конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвященной 240-летию ММА им. И.М. Сеченова. - Москва, 1998. - С. 94.

11. Киясов АЛ. Реэкенрессия цитокератина-19 в первичной культуре гепатоцитов человека / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, С.В. Петров [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1998. - Т. 126, JVs 7. - С. 118-120.

12. Kiassov A., Gumerova A. The influence of lead nitrate on intrahepatic bile duct cells in rat liver / A. Kiassov, A. Gumerova // Abstracts of International symposium «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry». - Bratislava, 1998, - P. 37.

13. Gumerova A. The expression of cholangiolar cytokeratins in cholestatic liver / A. Gumerova, A. Minsafina, A. Sozinov [et al.] // Abstracts of International symposium «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry». - Bratislava, 1998. - P. 38.

14. Nizamov R. Phenotype of cells in organ culture liver of rat embryons / R. Nizamov, A Kiassov, A. Gumerova [et al ] // Abstracts of International symposium «Progress in basic! applied and diagnostic histochemistry». - Bratislava, 1998. - P. 40.

15. Киясов А.П. Перисинусоидапьные клетки Ито в эмбриональном гистогенезе и регенерации печени человека / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, А.С. Созинов // Материалы 4-й Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 1999 - РЖГТК - 1999 -Т. 9, № 1.-С. 109.

16. Киясов А.П. Гистогенез и дифференцировка внутрипечбночных желчных протоков / А.П. Киясов, А.А. Гумерова, А.Р. Минсафина [и др.] // Материалы IV съезда ВРНОАГЭ. - Ижевск, 1999. - Российские морфологические ведомости. - 1999 - № 1-2 раздел 2 -С. 81.

17. Гумерова АЛ. «Прямой митоген» нитрат свинца вызывает усиление перекисного окисления лнпндов и активацию клеток Ито в печени крыс I АА. Гумерова, И.Х. Валеева, АЛ. Киясов // Онтогенез. -1999. - Т. 30, № 4. - С, 289-295.

18. Abdulchakov S. Perisinusoid^ cell proliferation and activation in liver regeneration / S. Abdulchakov, A. Gumerova, A. Kiassov [et al.] // Abstracts of XI International Congress of liver Disease «Liver Cirrhosis and its Development». - Basel, 1999. - P. 1.

19. Gumerova A. Desmin and a-Smooth-Muscle-Actin in normal and damaged human liver / A. Gumerova, A. Kiassov, A. Sozinov [et al.] //Abstracts of XI International Congress of liver Disease «Liver Cirrhosis and its Development». - Basel, 1999. - P. 16.

20. Созинов А.С. Иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики хронических заболеваний печени / А.С. Созинов, JI.C. Фатхеева, А.А. Гумерова [и др.] // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным

участием «Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики». — Москва, 1999.-С. 213.

21. Валеева ИЛ. О механизме пролиферации гепатоцитов, индуцированной нитратом свинца / ИЛС. Валеева, A.A. Гумерова, Л.П. Киксов // Казанский медицинский журнал. - 2000. - Т. LXXXI, № 3. - С. 195-197.

22. Gumerova A. Immunohistochemical investigations in diagnostic and forecasting of chronic hepatitis / A. Gumerova, A. Kiassov, A. Sozinov [et al.] // Abstracts of XI International Congress of Histochemistry and Cytochemistry «Understanding Biocomplexity: The PostGenome Challenge». - York, 2000. - P. 83.

23. Константинова И.С. Роль клеток Ито в посгнатальном периоде онтогенеза / И.С. Константинова, A.A. Гумерова // Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, 2001. - Ч. 1. -С. 151.

24. Бурыкин И.М. Экспрессия десмина и гладкомышечного актина в ходе онтогенеза сердца и скелетной мышцы / И.М. Бурыкин, A.A. Гумерова, В.А. Киясова // Тезисы докладов IV научно-практической Республиканской конференции молодых ученых и специалистов Республики Татарстан. - Казань, 2001. - СЛ.

25. Киясов А.П. Патогистологическая диагностика хронических вирусных гепатитов / А.П. Киясов, A.C. Созинов, A.A. Гумерова [и др.] // Методические рекомендации № 2001/124 МЗ РФ.-КГМУ,-Казань, 2001,- 16 с.

26. Киясов А.П. Мезенхимо-эпителиальные взаимодействия в печени / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, P.C. Низамов // Тезисы докладов XVIII Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Казань, 2001. - С. 353.

27. Gumerova A. Cell sources of liver development / A. Gumerova, A. Kiassov, V. Kiassova // Abstracts of 37th Annual Meeting of the EASL. - Madrid, 2002. - J. of Hepatol. - V. 36. - P. 269.

28. Киясов АЛ. Клетки Ито в онтогенезе и регенерации печени / А.П. Киясов, АЛ. Гумерова // Цитология. - 2002. - №4. - С. 342-349.

29. Анохип ВЛ. Вирусные гепатиты в структуре перинатальных инфекций /

B.А. Анохин, A.A. Гумерова // Российский педиатрический журнал. - 2002. - Л> 2. -

C. 32-34.

30. Низамов P.C. Одновременное выявление клеток, экспрессирующих десмин и A-актин из гладких мышц в органотипической культуре печени эмбрионов крыс / P.C. Низамов, АП. Киясов, A.A. Гумерова // Вятский медицинский вестник. - 2002. - № 1. - С. 62.

31. Киясов А.П. Клеточные источники соединительной ткани в печени и почках при хронических заболеваниях / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, A.C. Хайруллов // Тезисы докладов VI конгресса международной ассоциации морфологов. - Уфа, 2002. -Морфология. - 2002. -№ 2-3. - С. 44.

32. Киясов А.П. Закономерности активации клеток Ито / А.П. Киясов, A.A. Гумерова // Тезисы докладов VI конгресса международной ассоциации морфологов. - Уфа, 2002. -Морфология. - 2002. - № 2-3. - С. 71.

33. Киясов АЛ. Морфологические и иммуногисгохимические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии развития хронических вирусных гепатитов В и С / АЛ. Киясов, A.C. Созинов, АЛ. Гумерова [и др.] // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2002. - № 1-2. - С. 157-160.

34. Киясов А.П. Пренатальный гистогенез, аномалии развития и внутриутробное инфицирование печени человека Изучение пренатального гистогенеза печени человека / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, С.Р. Абдулхаков // Отчеты Фонда НИОКР РТ, конкурсы проектов 1998/99 г. / Казань: Физтехпресс, 2002. - С. 137-138.

35. Гумерова A.A. Анализ повреждения внутрипеченочных желчных протоков у больных хроническими вирусными гепатитами и первичным билиарным циррозом /

А.А. Гумерова, Л.С. Фатхеева, А.П. Киясов [и др.] // Материалы 8-й Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 2003. - РЖГГК. - 2003. - № 1. - С. 42.

36. Cheremina N.A. Expression of A-Smooth Muscle Actin in Chronic Lead Nitrate Liver Injury / N.A. Cheremina, A.A. Gumerova, A.P. Kiassov // Abstracts of International Congress «XII Falk Liver Week». - Freiburg, 2003. - P. 61.

37. Созинов A.C. Альтерация печени при экспериментальном дисбвозе у крыс / А.С. Созинов, С.Р. Абдулхаков, АЛ. Гумерова [и др.) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 136, № 7. - С. 23-26.

38. Киясов А.П. Пренатальный гистогенез, аномалии развития и внутриутробное инфицирование печени человека. Изучение межклеточных взаимодействий на ранних этапах онтогенеза человека при внутриутробном инфицировании / А.П. Киясов, А.А. Гумерова // Отчеты Фонда НИОКР РТ, конкурсы проектов 2001 г. - Казань' «Фэн» АН РТ, 2003. - С. 279-280.

39. Патент 2227298 Российская Федерация. Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах / А.С. Созинов, А.П. Киясов, А.А. Гумерова [и др.]; заявитель и патентообладатель Казан, гос. мед. ун-т. - № 2002116906/15; заявл. 24.06.02; опубл. 20.04.2004, Бюл. №11.

40. Фатхеева JI.C. Диагностическая значимость некоторых клинических, биохимических и морфологических показателей при хронических вирусных гепатитах В и С и первичном билиарном циррозе / JLC. Фатхеева, А.С. Созинов, АЛ. Гумерова [и др.] // Казанский медицинский журнал. - 2004. - Т. LXXXV, № 1. -С 20-23.

41. Фатхеева Л.С. Особенности активации миофибробластов при хронических вирусных гепатитах / JI.C. Фатхеева, А.А. Гумерова, А.П. Киясов [и др.] // Материалы 9-й Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 2004 - РЖГГК - 2004 - № 1.-С. 28.

42. Fatcheeva L. Myofibroblasts activation at chronic viral hepatitis / L. Fatcheeva, A. Gumerova,

A. Kiassov [et al.] // Abstracts of International symposium "Gastroenterology week». -Freiburg, 2004. - Part III. - P. 131. I

43. Киясова В.А. Экспрессия CD34 и CD31 в эмбриональной печени человека /

B.А. Киясова, А.А. Гумерова, А.П. Киясов // Тезисы V общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. - Казань, 2004. - Морфологические ведомости -2004.-Л» 1-2.-С. 29.

44. Киясова В.А. Развитие сосудов во внутренних органах эмбрионов человека / В.А. Киясова, П.Н. Резвяков, А.А. Гумерова [и др.] // Тезисы V общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. - Казань, 2004. - Морфологические ведомости -2004. - № 1-2.-С. 49.

45. Kiyasova V.A. Peculiarities in prenatal development of future endothelial and blood cells' progenitors / V.A. Kiyasova, A.A. Gumerova // Proceedings of 16Л international congress of the IFAA. - Kyoto, 2004. - P. 224.

46. Kiyasova V.A. CD34 expression in prenatal human development / V.A. Kiyasova, A.A. Gumerova // Abstracts of ICHC. - San Diego, 2004. - P10-13.

47. Созинов A.C. Информативность некоторых клинических, лабораторных и морфологических методов исследования для дифференциальной диагностики хронических вирусных гепатитов В и С / А.С. Созинов, Л.С. Фатхеева, А.А. Гумерова [и др.] // Нижегородский медицинский журнал. Здравоохранение ПФО. - 2005. - № 2. - С 146-149.

4S. Киясов А.П. Мезенхимально-эпителияльная трансформация клеток Ито in vitro / А.П. Киясов, АЛ Гумерова, МЛ. Титова // Клеточные технологии в биология и медицине. - 2006. - № 3. - С. 150-154.

49. Киясов Л.П. Овальные клетки - предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? / А.П. Киясов, А А. Гумерова, МЛ. Титова // Клеточная

трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - № 4. - С. 55-59.

50. Gumerova A. C-mei-positivc mesenchymal cells are possible source of hepatocytes during human liver development and regeneration / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Titova [et al.] // Abstracts of International symposium XIII Falk Liver Week. - Freiburg, 2006. - P. 72.

51. Gazizov I.M. Development of intrahepatic bile ducts by detection of cytokeratin 7 / I.M. Gazizov, A.P. Kiassov, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium XIII Falk Liver Week. - Freiburg, 2006. - P. 58.

52. Калигин M.C. Экспрессия мышечных маркеров в тканях сердца плодов человека / М.С. Калигин, А.А. Гумерова, М.А. Титова [и др.] // Всероссийская научная конференция с международным участием, посвященная 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ. - Белгород, 2006. - С. 68.

53. Гумерова А.А. Экспрессия маркЕров различных типов клеток печени на ранних этапах прснатального развития человека / АЛ. Гумерова, МЛ. Титова, A.II. Киясов // Цитология. - 2007. - № 2. - С. 133-141.

54. Kiassov A.P. Stem cells potencies of persinusoidal Ito cells / A.P. Kiassov, A.A. Gumerova, S.R. Abdulkhakov [et al.] // Материалы Британско-Российского совещания в сотрудничестве с Европейской комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества». — Москва, 2007.

55. Абдулхаков С.Р. Экспрессия C-kit в печени при хроническом вирусном гепатите С / С.Р. Абдулхаков, Т.С. Сметанникова, А.А. Гумерова // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина - Санкт-Петербург, 2007. - Морфология. - № 3. - С. 53.

56. Газизов И.М. Изучение реакции внутрипечбночных желчных протоков на частичную гепатэкгомию / И.М. Газизов, М.С. Калигин, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвящйнной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. - Санкт-Петербург, 2007. - Морфология. -№ 3. - С. 63.

57. Газизов И.М. Изучение экспрессии C-kit после частичной гепатэктомии у крыс / И.М. Газизов, М.С. Калигин, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летаю со дня рождения профессора Л.И. Фалина. - Санкт-Петербург, 2007. - Морфология. - № 3. - С. 63.

58. Зарипова Д.Н. Экспрессия билиарного гликопротеина CD66 в пренагальном гистогенезе печени человека / Д.Н. Зарипова, А.А. Гумерова, И.М. Газизов [и др.] // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина. - Санкт-Петербург, 2007. - Морфология. -№ 3. - С. 70-71.

59. Abdulkchakov S. Hepatic stellate cells and liver regeneration in chronic viral hepatitis С / S. Abdulkchakov, N. Cheremina, A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Conference. - Dresden, 2007. - Part III. - P. 11.

60. Gazizov I.M. Expression of C-kit in liver after partial hepatectomy in rats / I.M. Gazizov, A. Gumerova, M.S. Kaligin [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Conference. - Dresden, 2007. - Part III. - P. 14.

61. Gazizov I.M. Perisinusoidal cells after partial hepatectomy in rats / I.M. Gazizov, A.A. Gumerova, M.S. Kaligin [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Conference. - Dresden, 2007. - Part III. - P. 15.

62. Gumerova A. Stem cell properties of hepatic stellate cells / A. Gumerova, A. Kiassov, S. Abdulkchakov [et al.] // Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Conference. -Dresden, 2007. - Part III. - P. 20.

63. Гумерова АЛ Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени /

АЛ. Гумерова, А.П. Киясов, М.С. Калигив [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - № 4. - С. 39-46.

64. Газизов И..М. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей нечени после частичное гепатэктомии / И.М. Газнзов, АЛ. Гумерова, М.С. Калягин [и др.] // Морфологические ведомости. - 2008. - № 1-2. - С. 23-27.

65. Калягин М.С. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток (C-kit) в ходе развития внутренних органов человека / М.С. Калягин, АА. Гумерова, М.А. Титова {и др.] // Морфологические ведомости. - 2008. - № 1-2. - С. 63-66.

66. Gumerova A. The role of myofibroblasts in intrahepatic bile ducts changes during chronic viral hepatitis and primary biliary cirrhosis / A. Gumerova, L. Fatkheeva, S. Abdulkhakov [et al.] // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Conference. - Mainz, 2008. - Part III -P. 52.

67. Ilmaz T. Activation of stem cells compartment during liver regeneration in chronic viral hepatitis В and С / T. Ilmaz, D. Andreeva, A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Conference. - Mainz, 2008. - Part III. - P. 115.

68. Gazizov I.M. Perisinusoidai cells expressing stem cell properties after partial hepatectomy in rats / I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Conference. - Mainz, 2008. - Part III. - P. 35.

69. Киясов А.П. Трансплантация аутогенных гемопоэтнческнх стволовых клеток больным хроническими гепатитами / АЛ. Киясов, АХ. Одинцова, АЛ. Гумерова [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2008. - JVs 1. - С. 70-75.

70. Abdulkhakov S.R. The role of haematopoietic stem cells and hepatic stellate cells in liver regeneration in chronic viral hepatitis / S.R. Abdulkhakov, NA. Cheremina, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of 16th UEGW. - Vienna, 2008. - Gut. - V. 57 (S. II). - A157 (P0258).

71. Abdulkhakov S.R. C-kit expression in liver in chronic viral hepatitis С / S.R. Abdulkhakov, T.S. Yilmaz, A.A. Gumerova [et al.] // Abstracts of 16th UEGW. - Vienna, 2008. - Gut. - V. 57 (S. II).-A157 (P0259).

72. Gumerova A. Hepatic stellate cells can be liver stem cells and source of hepatocytes' regeneration / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Titova [et al.] //Abstracts of 44th annual meeting of the EASL. - Copenhagen, 2009. - J. of Hepatol. - V.50 (S.l). - P. S307.

73. Abdulkhakov S. Cellular reactions of hepatic stellate cells and hematopoietic stem cells in viral hepatitis С / S. Abdulkhakov, T. Yilmaz, A. Gumerova [et al.] II Abstracts of EASL monothematic conference «Portal hypertension: advances in knowledge, evaluation and management». - Budapest, 2009. - P. 65.

74. Калигин М.С. C-kit-позитивные клетки печени человека в ходе органогенеза / М.С. Калигин, Д.И. Андреева, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы 14-й Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 2009. - РЖГГК. - Т. 19, № 1. - С. 25.

75. Газизов И.М. Активация стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека / И.М. Газизов, Д.И. Андреева, А.А. Гумерова [и др.] // Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». -Москва, 2009. - С. 16.

76. Бурганова Г.Р. Экспрессия рецептора к фактору стволовых клеток C-kit при хронических вирусных гепатитах В и С / Г.Р. Бурганова, С.Р. Абдулхаков, А.А. Гумерова [и др.] // Материалы 10-го юбилейного съезда научного общества гастроэнтерологов России. -Москва, 2010. - С. 63-64.

77. Gumerova A. Hepatocytes and hepatic stellate cells have properties of stem/progenitor cells during prenatal development and liver regeneration / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Kaligin [et al.] //Abstracts of 45th annual meeting of EASL.-Vienna, 2010,-J. of Hepatol. - V. 52 (S.l). -P. S364.

78. Гумерова A.A. Гепатощггы и перисинусоидальные клетки печени обладают свойствами

стволовых/прогениторных клеток в ходе пренатального развития и репаративной регенерации печени / А.А. Гумерова, А.П. Киясов, М.С. Калигин [и др.] // Сборник тезисов IV Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». - Санкт-Петербург, 2010. - С. 59-60.

79. Гумерова А.А. Могут ли перисинуеоидальные клетки быть региональными стволовыми (прогениторными) клетками печени? / АЛ. Гумерова, А.П. Киясов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. — № 1. - С. 33-40.

80. Гумерова А.А. Перспективы использования различных популяций стволовых/прогениторных клеток в клеточной терапии заболеваний печени / А.А. Гумерова, А.К. Шафигуллина, С.Р. Абдулхаков [и др.] // Материалы III Международного симпозиума «Актуальные вопросы клеточных технологий». - Москва, 2010.-Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - Т. V,№3. -С. 25.

81. Gumerova A. Perspectives of different populations of stem/progenitor cells in treatment of alcoholic hepatitis / A. Gumerova, S. Abdulkhakov, A. Shafigullina [et al.] // Abstracts of IV Falk Gastro Conference. - Freiburg, 2010. - P. 66.

82. Gumerova A. Lead nitrate induces toxic liver damage and stem cell activation in rat liver // A. Gumerova, M. Kaligin, I. Gazizov [et al.] // Abstracts of IV Falk Gastro Conference. -Freiburg, 2010. - P. 47.

83. Гумерова А .А. Звёздчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мезеихимальных стволовых клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro / АА. Гумерова, А.К. Шафигуллина, А.А. Трои дин [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № 4. - С. 72-81.

84. Gumerova A. The cell sources and differentiation of intrahepatic bile ducts during human liver development / A. Gumerova, A. Kiassov, M. Titova [et al.] // Abstracts of 46th annual meeting of the EASL. - Berlin, 2011. - J. of Hepatol. - V. 54 (S. 1). - P. S278-S279.

85. Шафигуллина А.К. Трансплантированные звездчатые клетки печени восстанавливают популяцию гепатоцитов без риска развития фиброза печени / А.К. Шафигуллина, А.А. Гумерова, А.А. Трондин [и др.] // Сборник трудов II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий». -Екатеринбург, 2011. - С. 240-241.

86. Гумерова А.А. Гепатоцитарная дифференцировка звездчатых клеток печени in vitro / А.А. Гумерова, А.К. Шафигуллина, А.А. Трондин [и др.] // Сборник трудов международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». - Казань, 2011. - С. 214-218.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а-ГМА - альфа-гладкомышечный актин

а-ФП — альфа-фетопротеин

у-ГТП - гамма-глутамилтранспептидаза

ГМК — гладкомышечная клетка

НГ - неделя гестации

НС - нитрат свинца

ЧГ - частичная гепатэктомия

BMP — Bone Morphogenetic Protein, морфогенетический белок кости СК - Cytokeralin, цитокератин

EMA — Epithelial Membrane Antigen, эпителиальный мембранный антиген

ESA — Epithelial Specific Antigen, эпителиальный специфичный антиген

HGF — Hepatocyte Growth Factor, фактор роста гепатоцитов

HNF — Hepatocyte Nuclear Factor, ядерный фактор гепатоцитов

HSA — Hepatocyte Specific Antigen, специфический антиген гепатоцитов

PCNA — Proliferating Cell Nuclear Antigen, ядерный антиген пролиферирующих клеток

SDF (SDGF) - Stromal Derived Growth Factor, фактор стромальных клеток

TGF — Transforming Growth Factor, трансформирующий фактор роста

VCAM — Vascular Cell Adhesion Molecule, сосудистая молекула клеточной адгезии

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,5. Гарнитура Times New Roman. Тираж 110 экз. Заказ № 67. Подписано в печать 10.02.2012 г. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «АргПечатьСервис» ИП Мартынов 420061, г. Казань, ул. Космонавтов, 41. Тел. 295-10-19

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Гумерова, Аниса Азатовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Развитие печени.

2.1.1 Основные события в развитии печени.

2.1.2 Развитие сосудов печени.

2.1.3 Гемопоэз в печени.

2.1.4 Развитие клеток печени.

2.1.4.1 Развитие гепатоцитов.

2.1.4.2 Развитие холангиоцитов и внутрипечёночных желчных протоков.

2.1.4.2.1 Развитие холангиоцитов из гепатобластов (трансформационная теория).

2.1.4.2.2 Развитие холангиоцитов из кроветворной стволовой клетки.

2.1.4.2.3 Связь между развитием внутрипечёночных желчных протоков и сосудов печени.

2.1.4.3 Звёздчатые клетки печени и их развитие.

2.1.4.4 Звёздчатые клетки как компонент микроокружения для дифференцировки клеток печени.

2.1.4.5 Звёздчатые макрофаги печени и их развитие.

2.1.4.6 Эндотелиальные клетки синусоидов печени и их развитие.

2.1.5 Влияние мезенхимы и факторов роста на развитие печени

2.1.5.1 Первичная печёночная индукция.

2.1.5.2 Вторичная печёночная индукция.

2.1.5.3 Влияние мезенхимы, факторов роста и транскрипционных факторов на развитие внутрипечёночных желчных протоков.

2.2 Стволовая клетка печени.

2.2.1 Гепатоциты как стволовые клетки печени.

2.2.2 Внепечёночные стволовые клетки.

2.2.2.1 Кроветворные стволовые клетки как стволовые клетки печени.

2.2.2.2 Мезенхимные стволовые клетки как стволовые клетки печени.

2.2.3 Внутрипечёночные стволовые клетки.

2.2.3.1 Стволовые клетки фетальной печени.

2.2.3.2 Стволовые клетки взрослой печени.

2.2.3.2.1 Овальные клетки как стволовые клетки печени

2.2.3.2.2 Другие клетки печени, описываемые как региональные стволовые клетки.

2.2.3.2.3 Звёздчатые клетки печени как региональные стволовые клетки.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Объекты исследования.

3.1.1 Изучение пренатального и раннего постнатального онтогенеза человека.

3.1.2 Изучение пренатального и раннего постнатального онтогенеза крысы.

3.1.3 Изучение регенерации печени человека.

3.1.4 Изучение регенерации печени крысы.

3.1.4.1 Модель частичной гепатэктомии.

3.1.4.2 Модель токсического повреждения печени нитратом свинца.

3.1.5 Выделение и культивирование чистой популяции звёздчатых клеток печени крысы.

3.2 Методы исследования.

3.2.1 Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов

3.2.2 Окрашивание гематоксилин-эозином.

3.2.3 Гистохимическое выявление у-ГТП.

3.2.4 Иммуноцито- и гистохимические методы.

3.2.4.1 Непрямой иммунопероксидазный метод.

3.2.4.2 Стрептавидин-биотиновый метод.

3.2.4.3 Стрептавидин-биотиновый метод с демаскировкой антигенов в цитратном буфере.

3.2.4.4 Метод меченых полимеров с демаскировкой антигенов в цитратном буфере.

2.3.4.5 Стрептавидин-биотиновый метод с демаскировкой антигенов в цитратном буфере и использованием амплифицирующей системы CSA.

3.2.4.6 Двойное окрашивание криостатных срезов печени крысы.

3.2.4.7 Двойное окрашивание парафиновых, срезов печени крысы.

3.2.4.8 Двойное окрашивание парафиновых срезов печени эмбрионов и плодов человека.

3.3 Морфометрия.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Взаимодействие эпителия передней кишки и спланхномезодермы на ранних этапах эмбрионального развития печени человека.

4.2 Фенотип звёздчатых и мезотелиальных клеток печени в пренатальном онтогенезе человека и в ходе репаративной регенерации печени крысы.

4.2.1 Звёздчатые клетки в пренатальной печени человека.

4.2.2 Мезотелиальные и субмезотелиальные клетки в пренатальной печени человека.

4.2.3 Экспрессия C-kit звёздчатыми клетками печени крысы в процессе репаративной регенерации.

4.3 Становление дефинитивного фенотипа эпителиальных клеток в пренатальном онтогенезе печени человека и при репаративной регенерации печени человека и крысы.

4.3.1 Фенотип эпителия передней кишки и желчного пузыря в пренатальном онтогенезе человека.

4.3.2 Фенотипические характеристики гепатобластов/гепато-цитов в пренатальном онтогенезе печени человека и при регенерации печени человека и крысы.

4.3.2.1 Экспрессия ES А.

4.3.2.2 Экспрессия цитокератина 18.

4.3.2.3 Экспрессия цитокератина 19.

4.3.2.4 Экспрессия ЕМА.

4.3.2.5 Экспрессия десмина.

4.3.2.6 Экспрессия C-kit в гепатобластах/гепатоцитах развивающейся печени человека и регенерирующей печени человека и крысы.

4.3.2.7 Экспрессия C-met.

4.3.2.8 Экспрессия HSA.

4.3.2.9 Экспрессия CD66a.

4.3.3 Фенотипические характеристики холангиобластов /холангиоцитов в пренатальном онтогенезе печени человека и при регенерации печени человека и крысы.

4.3.3.1 Экспрессия СК18 клетками протоковой пластинки и холангиоцитами человека в пренатальном онтогенезе.

4.3.3.2 Экспрессия СК19 клетками протоковой пластинки и холангиоцитами человека в пренатальном онтогенезе.

4.3.3.3 Экспрессия ES А клетками протоковой пластинки и холангиоцитами человека в пренатальном онтогенезе.

4.3.3.4 Другие маркёры, экспрессируемые клетками протоковой пластинки и холангиоцитами в пренатальном онтогенезе человека.

4.3.3.4.1 Экспрессия HSA, CD66a, C-kit, C-met.

4.3.3.4.2 Экспрессия ЕМА и цитокератина 7.

4.3.3.5 Участие десмин-позитивных звёздчатых клеток печени в пренатальном развитии внутрипечёночных желчных протоков человека и крысы.

4.3.3.6 Пролиферация и апоптоз клеток протоковой пластинки и желчных протоков в пренатальном онтогенезе печени человека и при репаративной регенерации печени человека и крысы.

4.3.3.6.1 Пролиферативная активность клеток протоковой пластинки и желчных протоков в пренатальном онтогенезе человека и при регенерации печени человека и крысы.

4.3.3.6.2 Апоптоз клеток протоковой пластинки и желчных протоков в пренатальном онтогенезе печени человека.

4.3.3.7 Изменения внутрипечёночных желчных протоков в процессе регенерации печени человека и крысы.

4.3.3.7.1 Изменения внутрипечёночных желчных протоков у человека при хронических гепатитах различной этиологии.

4.3.3.7.2 Изменения внутрипечёночных желчных протоков в ходе регенерации печени крысы после повреждения нитратом свинца.

4.3.3.7.3 Изменения внутрипечёночных желчных протоков в ходе регенерации печени крысы после частичной гепатэктомии.

4.4 Становление сосудистой системы печени в пренатальном онтогенезе человека и крысы.

4.4.1 Развитие сосудистой системы в раннем эмбриогенезе человека.

4.4.1.1 Эндотелиальные клетки.

4.4.1.2 Гладкомышечные клетки сердца и сосудов.

4.4.2 Развитие синусоидных капилляров и вен в печени человека.

4.4.3 Развитие артерий в печени человека.

4.4.4 Становление сосудистой системы печени в пренатальном онтогенезе крысы.

4.5 Гемопоэз в печени человека в пренатальном онтогензе.

4.5.1 Экспрессия CD34, десмина и C-met.

4.5.2 Экспрессия CD34 (кроветворные стволовые клетки).

4.5.3 Экспрессия ЕМА (эритро- и лимфопоэз).

4.5.4 Экспрессия CD31 (мегакариоциты).

4.5.5 Экспрессия Bcl-rambo в пренатальном гистогенезе печени

4.5.6 Звёздчатые макрофаги печени.

4.5.7 Микроокружение клеток кроветворных островков.

4.6 Клетки печени, экспрессирующие фенотипические признаки стволовых/прогениторных клеток в процессе пренатального развития печени человека и регенерации печени человека и крысы.

4.7 Дифференцировка звёздчатых клеток печени крысы в гепатоциты in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гисто- и цитогенез печени человека и крысы в ходе пренатального развития и репаративной регенерации"

Актуальность. Центральной проблемой современной гепатологии является идентификация региональной стволовой клетки печени. Необходимость решения этой проблемы продиктована значительной распространённостью хронических диффузных заболеваний печени, недостаточной эффективностью существующих методов их лечения, и, как следствие, - высокой частотой развития фиброза и цирроза печени в исходе этих заболеваний. В этом случае единственным методом лечения становится трансплантация печени. Однако существующий дефицит донорских органов, большие листы ожидания, высокая стоимость трансплантации и необходимость последующей иммуносупрессивной терапии [312] диктуют необходимость поиска новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Идентификация стволовой клетки печени позволила бы перейти к разработке принципиально новых методов лечения хронических диффузных заболеваний печени, основанных на стимуляции собственных стволовых клеток в печени больного и применении клеточной терапии, в том числе и генетически модифицированными стволовыми клетками.

Изучению проблемы поиска региональной стволовой клетки печени посвящено значительное число исследований, выполняемых, как правило, на разнообразных моделях регенерации печени у животных [28, 29, 70, 78, 80, 107, 177, 181, 182, 411, 464] или путём культивирования различных популяций клеток, изолированных из печени животных и человека [112, 281]. При этом из печени выделяют клетки, несущие те или иные маркёрные признаки стволовых клеток, или подобные признаки были выявлены или индуцированы у каких-либо клеток печени в процессе культивирования [281, 373, 469]. Однако, как это ни странно, вопрос о принадлежности этих стволовых клеток к какой-либо из описанных ныне клеточных популяций печени практически не обсуждается, и причина этого кроется, по-видимому, в самом подходе - клетки изучаются сами по себе», вне связей с органом, из которого они были извлечены. Очевидно также, что если клетки были лишены своего привычного микроокружения, их свойства существенно отличаются от тех, которые они проявляют, находясь в естественной среде. Только исследования, проведённые in vivo, в условиях естественного микроокружения и взаимодействия клеток и межклеточного вещества, могут приблизить нас к идентификации региональной стволовой клетки печени. При этом основное внимание должно быть уделено, с одной стороны, изучению процессов внутриутробного развития органа, когда происходит первичная дифференцировка его клеток и закладка стволового компартмента, а с другой стороны - изучению фенотипа клеток во время репаративной регенерации органа, когда происходит активация его стволовых клеток.

Долгие годы одной из наиболее распространённых была теория, рассматривающая в качестве стволовых клеток печени так называемые овальные клетки, предположительно располагающиеся в начальных отделах желчевыводящих путей - канальцах Геринга [456]. Однако в последнее десятилетие опубликовано значительное количество работ, посвящённых идентификации и/или изоляции других популяций стволовых клеток из взрослой печени, которые, как и эмбриональные, способны к многократным делениям и являются бипотентными [469]. Особый интерес в этой связи вызывают данные, свидетельствующие о возможности развития как гепатобластов/гепатоцитов, так и холангиоцитов из кроветворных [111, 127, 304, 308, 344, 376] и мезенхимных [234, 240, 241, 257, 344] стволовых клеток, что также не укладывается в традиционные представления о развитии эпителиальных клеток печени исключительно из энтодермального эпителия передней кишки [501], а значит, оставляет открытым вопрос о клеточных источниках развития печени как органа, и, в первую очередь, её паренхиматозных клеток и клеток внутрипечёночных желчных протоков.

Самым интригующим, безусловно, является факт развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки, то есть клетки мезенхимной, а не энтодермальной. Также накапливается всё больше сведений о ключевом влиянии на развитие печени окружающей её мезенхимы [194, 278, 297]. В связи с этим возникает вопрос, могут ли постоянно присутствующие в печени мезенхимные синусоидные клетки быть источником образования гепатоцитов в ходе развития и регенерации, и какие именно клетки в составе окружающей печень мезенхимы являются главными для формирования её микроокружения. Для ответа на эти вопросы необходимы комплексные морфологические исследования эмбрионов и плодов человека и крысы различных сроков гестации с использованием иммуногистохимического выявления белков, специфических для определённых клеточных популяций печени и стволовых клеток. Особое внимание предполагается уделить изучению фенотипа мезенхимных синусоидных клеток печени и их взаимоотношений с эпителиальными клетками на ранних этапах развития печени человека, что позволит установить, какие из синусоидных клеток в наибольшей степени обладают признаками стволовых клеток и могут быть источником развития гепатоцитов. Наиболее перспективным кандидатом на эту роль может стать популяция звёздчатых клеток печени, поскольку именно они находятся в зрелой печени в непосредственном контакте с гепатоцитами, вырабатывают важнейшие факторы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку клеток [41, 141, 150, 166, 191, 236, 302, 318, 333, 369, 387], и могут быть получены из кроветворной стволовой клетки [96]. В этой связи исследования по изучению стволовых потенций данной клеточной популяции как в онтогенезе, так и при репаративной регенерации, а также в условиях in vitro, представляются весьма актуальными. Однако вопрос о клеточных источниках развития самих звёздчатых клеток до сих пор не решён. Помимо мезенхимного, в литературе обсуждается как энтодермальное [98, 440], так и нейральное [191, 198] происхождение этих клеток. Детальное изучение фенотипа звёздчатых клеток печени в пренатальном онтогенезе позволит прояснить накопившиеся противоречия.

Ещё один чрезвычайно важный вопрос, на который и сегодня нет однозначного ответа, - это вопрос о развитии внутрипечёночных желчных протоков. Причиной этого, по сути, является нерешённость проблемы, связанной с клеточными источниками развития холангиоцитов. Для её решения требуется детальный сравнительный анализ фенотипов предполагаемых клеток-предшественниц на разных этапах пренатального онтогенеза человека. Кроме того, поскольку желчные протоки являются важнейшим, но не единственным компонентом портальной системы печени, очевидно, что их развитие вряд ли может происходить независимо от развития кровеносных сосудов портальных трактов - воротной вены и печёночной артерии. Однако до сих пор взаимодействия портальных структур друг с другом в процессе развития исследованы крайне недостаточно [299, 396, 420, 458]. Поэтому весьма актуальным представляется изучение формирования внутрипечёночных желчных протоков во взаимосвязи с развитием кровеносных сосудов портальных трактов. Понимание источников и закономерностей формирования внутрипечёночного билиарного русла позволит прояснить механизмы развития врождённых атрезий и мальформаций желчных протоков, а изучение развития и регенерации печени с позиций поиска её стволовой клетки откроет наиболее перспективные направления разработки принципиально новых методов терапии хронических диффузных заболеваний печени с использованием клеточных технологий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтракт 16.512.11.2101), РФФИ (гранты 04-04-49164-а; 09-04-97013-рповолжьеа) и фонда НИОКР РТ (грант 03-3.1-6/2006 (Г)).

Цель исследования:

Задачи исследования:

3. На основании иммуногистохимического анализа экспрессии белков, специфичных для мезенхимных и эпителиальных клеточных типов печени человека, установить, проявляют ли какие-либо из мезенхимных клеток признаки дифференцировки в эпителий в пренатальном онтогенезе. Установить возможность дифференцировки выявленных клеточных популяций, изолированных из печени крысы, в гепатоциты in vitro.

8. Изучить с помощью специфических маркёров сроки появления эндотелиальных клеток в печени эмбрионов и плодов человека и проследить динамику изменений фенотипа данных клеток в пренатальном онтогенезе. 9. Установить этапы дифференцировки внутрипечёночных кровеносных сосудов (воротной и центральной вен, печёночной артерии) путём изучения экспрессии маркёров эндотелиальных и гладкомышечных клеток и провести анализ взаимодействий между развивающимися кровеносными сосудами и желчными протоками в пренатальном онтогенезе человека.

Впервые установлено, что эмбриональные гепатобласты человека имеют общие фенотипические признаки как с окружающими печень мезенхимными клетками и звёздчатыми клетками печени (десмин, цитокератины (cytokeratin, CK) 18 и 19), так и с энтодермальными эпителиальными клетками передней кишки (CK 18 и CK 19, эпителиальный специфический антиген (Epithelial Specific Antigen, ESA)), что может указывать на возможность развития эпителиальных клеток печени (гепатоцитов и холангиоцитов) из двух источников - энтодермы и мезодермы. Кроме того, было продемонстрировано, что клетки мезенхимы вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени имеют практически идентичный фенотип, что позволяет говорить о происхождении последних именно из мезенхимы, а не из других источников. Сами же звёздчатые клетки печени - единственный клеточный тип, имеющий сходные с эмбриональными гепатобластами фенотипические признаки (десмин, CK 18 и CK 19) и экспрессирующий маркёры стволовых/прогениторных клеток в пренатальном периоде (Вс1-2) и в процессе репаративной регенерации (C-kit).

В работе впервые показано, что популяция эпителиальных клеток печени человека с самых ранних этапов эмбрионального развития неоднородна по форме, размерам и способности экспрессировать CK 18 и CK 19, что свидетельствует о раннем разделении путей дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов. Установлены последовательность, основные этапы и сроки формирования дефинитивного фенотипа гепатоцитов и клеток внутрипечёночных желчных протоков. Критическим для развития гепатоцитов является период с 3-й до 8-й недели гестации, когда они, выселяясь из передней кишки, утрачивают способность экспрессировать характерный для кишечного эпителия эпителиальный мембранный антиген (Epithelial Membrane Antigen, ЕМА) и транзиторно экспрессируют ряд маркёров, которые отсутствуют в зрелых гепатоцитах (десмин, C-met, C-kit, ESA), После 8-й недели гестации экспрессия этих маркёров в большинстве гепатобластов существенно снижается, тогда как экспрессия специфических для гепатоцитов гепатоцитарного специфического антигена (Hepatocyte Specific Antigen, HSA) и CD66a интенсивно нарастает. Несомненно, к новым следует отнести данные о центрах дифференцировки гепатоцитов в течение различных периодов онтогенеза. Так, если на ранних этапах ключевым фактором для запуска дифференцировки гепатоцитов является взаимодействие между гепатобластами и десмин-позитивными клетками мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, а затем звёздчатыми клетками печени, и этот процесс наиболее активно происходит на периферии печени, то в последующем центры дифференцировки гепатоцитов смещаются к кровеносным сосудам.

Впервые показано, что критическим для дифференцировки холангиоцитов человека является период с 5-й по 13-ю неделю гестации, когда эти клетки, расположенные среди гепатобластов, впервые можно отличить от последних по морфологии и набору выявляемых маркёров. Так, для них, в отличие от гепатобластов, не характерно присутствие десмина, C-met, HSA и CD66a. Установлено, что первые дифференцированные холангиоциты, экспрессирующие ЕМА и СК7, появляются при образовании просвета протоков на 12-13-й неделях гестации, что на 2 месяца раньше, чем считалось ранее [459, 487]. Впервые показано, что микроокружение для дифференцирующихся холангиобластов у человека образуют десмин-позитивные звёздчатые клетки, а не миофибробласты портальных трактов. Становление системы внутрипечёночных желчных протоков связано с формированием кровеносных сосудов портального тракта. Так, формирование протоковой пластинки начинается сразу после появления фенотипических отличий между афферентными и эфферентными венами внутри печени на фоне формирования системы воротной вены, а ремоделирование протоковой пластинки и образование первых желчных протоков неразрывно связано с предшествующим этому появлением в печени артериальных сосудов и формированием портальных трактов.

В проведённом исследовании впервые установлено, какие клеточные типы в развивающейся печени человека проявляют признаки стволовых клеток. Оказалось, что на разных этапах развитиях такие свойства можно выявить у весьма широкого круга клеток. Однако только звёздчатые клетки печени и сами гепатоциты сохраняют такую способность практически на всём протяжении пренатального развития, и именно эти клетки проявляют свойства прогениторных в ходе репаративной регенерации печени у человека и у крысы, экспрессируя C-kit, что позволяет говорить о возможности существования в печени как минимум двух типов региональных стволовых клеток - гепатоцитов и звёздчатых клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Проведённые исследования позволили получить новые факты, которые раскрывают закономерности гистогенеза и межклеточных взаимодействий между эпителиальными и мезенхимными клетками печени в ходе пренатального развития печени человека. Фенотипическая характеристика дифференцирующихся и зрелых клеток развивающейся печени будет иметь несомненное значение для изучения процессов регенерации и канцерогенеза печени человека, а также при проведении экспериментов in vitro, поскольку позволит выявлять и отличать клетки, имеющие разную степень дифференцированности. Данные сведения имеют и практическое значение для диагностики заболеваний печени и прогнозирования возможности развития первичного рака печени и/или степени его злокачественности.

Полученные в ходе исследования факты, указывающие на возможность развития эпителиальных клеток печени человека как из эпителия передней кишки, так и из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки, позволяют внести коррективы в устоявшуюся теорию развития печени, рассматривающую в качестве клеточного источника развития гепатоцитов только эпителий кишки. Кроме того, наиболее распространённая теория развития внутрипечёночных желчных протоков - теория трансформации - также нуждается в коррекции. Сегодня, с учётом полученных фактов, вряд ли можно говорить о трансформации гепатобластов в холангиоциты. Более вероятным представляется другая последовательность событий: энтодермальная эпителиальная клетка-предшественница из передней кишки на самых ранних этапах развития печени (не позднее 4-5-й недели гестации) даёт начало двум популяциям: клеткам-предшественницам гепатоцитов (гепатобластам) и клеткам-предшественницам холангиоцитов (холангиобластам, сначала образующим протоковую пластинку, а затем -собственно желчные протоки). Кроме того, проведённый анализ развития внутрипечёночных желчных протоков и кровеносных сосудов свидетельствует о необходимости афферентного кровотока для формирования холангиоцитов и желчных протоков, что позволяет по-новому взглянуть на механизмы развития билиарной системы печени и приблизиться к пониманию причин развития атрезий внутрипечёночных желчных протоков.

Внедрение результатов исследования. Полученные данные о закономерностях экспрессии фенотипических и линейных маркёров различными клеточными типами печени человека используются в качестве диагностических и прогностических критериев в работе гастроэнтерологического отделения Республиканской клинической больницы МЗ РТ и отделения вирусных гепатитов Республиканской клинической инфекционной больницы МЗ РТ в морфологической диагностике хронических заболеваний печени. В ходе проведения данного исследования был модифицирован ряд методов иммуногистохимического выявления антигенов, и эти модификации внедрены в исследовательскую работу кафедры нормальной анатомии и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета, а также в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: итоговой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных, посвященной 40-летию КГМА (Кемерово, 1996); II-IV Республиканских конференциях молодых учёных и специалистов (Казань, 1996, 1997, 2001);

IV Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных» (Казань, 1997); II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1997, 1999); Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 1997); научной конференции, посвящённой 35-летию 1ЩИЛКГМУ (Казань, 1997); конференции молодых учёных России с международным участием, посвящённой 240-летию ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 1998); международных симпозиумах «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry» (Братислава, 1995, 1998); IV, VIII, IX, XIV, XVI Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 1999, 2003, 2004, 2009, 2011); IV Съезде Российских морфологов с международным участием (Ижевск, 1999); XI международном конгрессе по заболеваниям печени (Базель, 1999); XI и XIII международных конгрессах по гистохимии и цитохимии (Йорк, 2000; Сан-Диего, 2004); XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001); XXXVII, XXXXIV-XXXXVI встречах Европейской ассоциации по изучению печени (Мадрид, 2002; Копенгаген, 2009; Вена, 2010; Берлин, 2011); VI конгрессе международной ассоциации морфологов (Уфа, 2002);

V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); XII, XIII международных гепатологических неделях (Фрайбург, 2003, 2006); I-IV международных конгрессах по гастроэнтерологии (Фрайбург, 2004, 2010; Дрезден, 2007; Майнц, 2008); XVI конгрессе международной федерации анатомических обществ (Киото, 2004); Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящённой 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ (Белгород, 2006); Британско-Российском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией по стволовым клеткам (Москва, 2007); научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Санкт-Петербург, 2007); объединённой Европейской гастронеделе (Вена, 2008); международной конференции Европейской ассоциации по изучению печени (Будапешт, 2009); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); 10-м юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010); IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); III Международном симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий» (Москва, 2010); II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011), международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1.Гепатоциты человека развиваются из двух клеточных источников: энтодермального эпителия передней кишки и десмин-позитивных клеток мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки и их потомков - звёздчатых клеток печени, имеющих смешанный мезенхимально-эпителиальный фенотип и экспрессирующих маркёры стволовых клеток. Звёздчатые клетки печени крысы проявляют свойства прогениторных клеток печени также в процессе её репаративной регенерации, экспрессируя C-kit, и способны дифференцироваться в гепатоциты in vitro в чистой культуре при образовании монослоя.

2. Разделение путей дифференцировки потомков общей эпителиальной кишечной клетки-предшественницы на две клеточные линии - гепатоциты и холангиоциты - происходит в течение первой недели после закладки печени человека, когда в ней выделяются две популяции эпителиальных клеток, отличающихся размерами, формой и экспрессией фенотипических маркёров (СК19, десмин, С-ше1, СЭбба, ША, ЕМА, СК7). При этом основным клеточным типом, образующим микроокружение для дифференцирующихся гепатобластов и холангиобластов, а также кроветворных стволовых клеток, являются мезенхимные десмин-позитивные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени. 3. Формирование системы внутрипечёночных желчных протоков у человека связано с развитием афферентных кровеносных сосудов: дифференциация ветвей воротной вены и центральных вен предшествует формированию протоковой пластинки, затем в печень прорастают ветви печёночной артерии, после чего начинается перестройка протоковой пластинки, приобретение холангиобластами дефинитивного фенотипа и их миграция в мезенхиму портального тракта и вдоль афферентных кровеносных сосудов. У человека и у крысы основными механизмами восстановления внутрипечёночных желчных протоков после повреждения являются пролиферация холангиоцитов и ветвление протоков одновременно с ветвлением внутрипечёночных кровеносных сосудов.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 17 статей в ведущих российских научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов научных исследований. Общий объём публикаций - 12,16 условно печатных листа, в том числе авторский вклад -8,99 условно печатных листа.

Личное участие диссертанта. Приведённые в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, постановку задач, выбор методов исследования, проведение экспериментов, забор материала для исследования и его обработку, анализ экспериментальных данных. Автор провёл подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения экспериментов, методы, позволяющие . решить поставленные задачи.

Теоретическое обобщение результатов исследования, их анализ и оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Гумерова, Аниса Азатовна

6 ВЫВОДЫ

1. У человека в ходе первичной печёночной индукции процесс обособления эпителиальных клеток зачатка печени от кишки сопровождается изменением их фенотипа - прекращением экспрессии ЕМА. В период вторичной печёночной индукции, основные события которой у человека происходят с 4-й по 8-ю неделю гестации, мезенхимные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, окружающие выселившиеся эпителиальные клетки, имеют фенотип виментин+/десмин+/СК18/СК19+, отличный от фенотипа мезенхимных клеток других локализаций (виментин+/десмин(-)/СК 18(-)/СК19(-)). Мезенхимные и эпителиальные клетки, участвующие во вторичной печёночной индукции, имеют ряд общих фенотипических признаков - в их цитоплазме или на плазматической мембране присутствуют десмин, СК18, СК19 и С-кй.

2. У человека из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка образуются два типа синусоидных клеток - звёздчатые клетки печени и звёздчатые макрофаги печени: a. Звёздчатые клетки печени появляются в развивающейся печени на 4-й неделе гестации и фенотипически не отличаются от основной массы окружающих её мезенхимных клеток: в цитоплазме звёздчатых клеток выявляются десмин, СК18, СК19 и Вс1-2. Десмин не является линейным маркёром звёздчатых клеток печени человека и выявляется в них только до 14-й недели гестации включительно. b. Звёздчатые макрофаги печени, в которых присутствует макрофагальный антиген, обнаружены в синусоидах печени, начиная с 7-й недели развития, а первые клетки, позитивные по макрофагальному антигену, появляются среди клеток мезенхимы на неделю раньше.

3. На сроке 4-6 недель гестации в десмин-позитивных звёздчатых клетках печени человека присутствуют маркёры гепатобластов СК18 и СК19, и одновременно в клетках с морфологией гепатобластов появляется десмин, что свидетельствует о возможности мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки десмин-позитивных звёздчатых клеток печени in vivo. Такая же трансдифференцировка происходит in vitro - в чистой культуре в звёздчатых клетках печени крысы при установлении межклеточных контактов и образовании монослоя появляются маркёры, специфические для гепатобластов и гепатоцитов - СК8, СК18, а-ФП и у-ГТП.

4. В процессе репаративной регенерации печени крысы и человека звёздчатые клетки печени, наряду с гепатоцитами, проявляют фенотипические признаки прогениторных клеток, экспрессируя C-kit. Устойчивая экспрессия маркёров стволовых клеток также характерна для обоих указанных клеточных типов в пренатальном онтогенезе человека: гепатобласты экспрессируют C-kit, C-met, CD 133 (4-8 недели гестации), а звёздчатые клетки печени - Вс1-2 (4-14 недели гестации).

5. В пренатальной печени человека десмин-позитивные мезенхимные клетки и звёздчатые клетки печени окружают дифференцирующиеся гепатобласты и холангиобласты, а также кроветворные клетки в период печёночного этапа гемопоэза.

6. В печени человека с 5-й недели гестации можно выделить две популяции эпителиальных клеток, отличающихся формой, размерами и фенотипом: крупные округлые гепатобласты (ESA+/CK18+/CK19+/C-kit+/flecMHH+/C-met+/CD66a+/HSA+) и мелкие вытянутые холангиобласты (ESA+/CK18+/CK19+++/C-kit+/EMA+/CK7+). Большинство гепатоцитов приобретают окончательный фенотип (CK18+/CD66a+/HSA+) к 15-16-й неделям гестации, а холангиоциты - к 13-14-й неделям гестации (ESА+/СК18+/СК19+++/ЕМА+++/СК7+++), в момент появления в печени первых сформированных желчных протоков.

7. В пренатальном онтогенезе человека формирование и ремоделирование протоковой пластинки, из клеток которой формируются внутрипечёночные желчные протоки, происходит путём дифференцировки холангиобластов в холангиоциты без существенного участия процессов пролиферации и апоптоза, однако в процессе восстановления протоков после повреждения печени у человека и крысы в пролиферации участвует до одной трети холангиоцитов. Формирование внутрипечёночных желчных протоков в пренатальном онтогенезе печени человека и их восстановление при репаративной регенерации печени человека и крысы осуществляется за счёт прорастания и ветвления протоков совместно с артериальными сосудами.

8. Эндотелиальные клетки, экспрессирующие специфические для эндотелия маркеры СБ34 и СОЭ1, появляются в развивающейся печени человека на сроке 4 недели гестации. Экспрессия СБ34 и СБ31 прекращается в большинстве эндотелиоцитов к концу 8-й недели гестации, и они приобретают фенотип С034(-)/С031(-), характерный для этих клеток в зрелой печени человека.

9. Дифференциация венозных сосудов печени начинается на 6-7 неделях гестации: ветви воротной вены имеют ровные контуры, выстланные СиЗ 4+ эндотелиоцитами, и развитую мышечную оболочку, для центральных вен характерны «изрезанный» контур, СБ34± эндотелиоциты и единичные ГМК в мышечной оболочке. Становление афферентных кровеносных сосудов предшествует и определяет формирование системы внутрипечёночных желчных протоков: после дифференциации ветвей воротной вены (6-7 недель гестации) образуется протоковая пластинка, а прорастание ветвей печёночной артерии (8-9 недель гестации) предшествует её ремоделированию и формированию протоков.

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В морфологической диагностике опухолей печени и при изучении процессов дифференцировки гепатоцитов человека рекомендуется применять в качестве маркёров гепатобластов десмин, ESA, СК18, СК19, C-met, C-kit, гепатоцитов - СК18, CD66a, HSA, учитывая тот факт, что СК18 одинаково интенсивно экспрессируется в клетках разной степени дифференцированности.

2. В морфологической диагностике опухолей печени и при изучении процессов дифференцировки клеток внутрипечёночных желчных протоков человека рекомендуется применять в качестве маркёров холангиобластов ESA, СК18, СК19, C-kit, холангиоцитов - СК19, EMA, СК7.

3. Ввести в стандарт морфологической диагностики хронических заболеваний печени человека иммуногистохимическое выявление экспрессии: 1) C-met и C-kit - для определения факта активации стволового компартмента; 2) CD34 и CD31 - для выявления фенотипа эндотелиальных клеток синусоидов печени и их возможной капилляризации.

4. При изучении пренатального развития сосудистой системы человека целесообразно применять иммуногистохимическое выявление десмина, а-ГМА и кальпонина как маркёров, отражающих степень дифференцированности гладкомышечных клеток сосудистой стенки.

5. При выполнении иммуногистохимического окрашивания образца ткани моноклональными антителами к двум различным антигенам после выявления активности ферментной метки в первом окрашивании применять кипячение в цитратном буфере в течение 15 минут для разрушения и удаления всех нанесённых на срезы иммуноглобулинов с целью минимизации неспецифического связывания антител во время второго окрашивания.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Гумерова, Аниса Азатовна, Казань

1. Бекетова Т.П. Синусоидальные клетки печени и их роль в патологических процессах / Т.П. Бекетова, С.М. Секамова // Арх. патол. 1988. - № 10. - С. 83-88.

2. Беляева И.Д. Особенности пролиферации клеток регенерирующей печени крыс / И.Д. Беляева // Цитология. 1973. - Т. 15, № 10. - С. 1297-1301.

3. Бурыкин И.М. Становление дефинитивного кровотока в печени на различных этапах эмбрионального развития / И.М. Бурыкин, Р.Х. Хафизьянова, А.П. Киясов // Морфологические ведомости. 2004. - № 1-2. -С. 16-17.

4. Верин В.К. Гистогенез печени человека / В.К. Верин // Архив анат. 1967. -Т. 53,№8.-С. 90-95.

5. Верин В.К. Дифференцировка гепатоцитов и холангиоцитов в эмбриональном и постнатальном периодах онтогенеза крыс / В.К. Верин // Архив анат. гистол. эмбриолог. 1982. - № 2. - С. 106-114.

6. Вишневская Е.К. Дифференцировка клеток синусоидных сосудов печени в эмбриональном и постнатальном периодах онтогенеза крысы / Е.К. Вишневская // Арх. анат. гистол. эмбриол. 1989. - Т. 97, № 9. - С. 68-74.

7. Вишневская Е.К. Клетки синусоидных сосудов печени / Е.К. Вишневская // Морфология. 1993. - Т. 104, № 3-4. - С. 135-147.

8. Волкова О.В. Эмбриогенез и возрастная гистология внутренних органов человека / О.В. Волкова, М.И. Пекарский. М.: Медицина, 1976. - 415с.

9. Гумерова A.A. "Прямой митоген" нитрат свинца вызывает усиление перекисного окисления липидов и активацию клеток Ито в печени крыс / A.A. Гумерова, И.Х. Валеева, А.П. Киясов // Онтогенез. 1999. - Т. 30, № 4. -С. 289-295.

10. Ю.Гумерова A.A. Экспрессия CD34 и CD31 в эмбриональной печени человека /

11. A.A. Гумерова, В.А. Киясова, А.П. Киясов // Морфологические ведомости. -2004.-№1-2.-С. 29.

12. П.Зуфаров К.А. Ультраструктура стенки синусоидов печени / К.А. Зуфаров,

13. B.Б. Шнейвайс, Е.А. Шишова // Арх. анат. 1970. -№ 3. - С. 66-74.

14. Киясов А.П. межклеточные взаимодействия в ходе онтогенеза и репаративной регенерации печени: автореф. дис. . докт. мед. наук / А.П. Киясов; Казанский гос. Мед. унив. Казань, 1999. - 36 с.

15. Киясов А.П. Методы иммуногистохимии / А.П. Киясов //

16. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека. Руководство для врачей-морфологов / C.B. Петров, А.П. Киясов. Казань, 1998. - Гл. 1. - С. 9-34.

17. Киясов А.П. Овальные клетки предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, М.А. Титова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - № 4. - С. 55-59.

18. Киясов А.П. Экспрессия дитокератинов в пре- и постнатальном онтогенезе / А.П. Киясов, A.A. Гумерова, М.М. Билалов // Онтогенез. 1997. Т. 28, № 5. -С. 389-93.

19. Мансуров Х.Х. Кардинальные вопросы алкогольной болезни печени / Х.Х. Мансуров, Г.К. Мироджов // Тер. арх. 1988. - № 7. - С. 69-72.

20. Маянский Д.Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов / Д.Н. Маянский // Новосибирск, 1981. 172 с.

21. Маянский Д.Н. О происхождении Купферовских макрофагов в регенерирующей печени / Д.Н. Маянский, В.И. Щербаков, Ю.М. Мироханов // Бюл. эксперим. биол. мед. 1978. - № 5. - С. 598-600.

22. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А. Меркулов // Л.: Медгиз, 1961.-340 с.

23. Объекты биологии развития / Э.Д.Бакунина и др.; отв. ред. Т.А. Детлаф. -М.: Наука, 1975.-580 с.

24. Подымова С.Д. Болезни печени. Руководство для врачей / С.Д. Подымова // М.: Медицина, 1993. 544 с.

25. Полак Дж. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы / Дж. Полак, С. Ван Норден // М.: Мир, 1987. 74 с.

26. Развитие сосудов во внутренних органах эмбрионов человека / В.А. Киясова и др. // Морфологические ведомости. 2004. - № 1-2. - С. 49.

27. Реэкспрессия цитокератина-19 в первичной культуре гепатоцитов человека / А.П. Киясов и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1998.-Т. 126, №7.-С. 118-120.

28. Серов В.В. Морфологическая диагностика заболеваний печени / В.В. Серов, К. Лапиш// М.: Медицина, 1989. 336 с.

29. Стволовая кроветворная клетка: дифференцироввочный и пролиферативный потенциал / И.Л. Чертков и др. // Успехи совр. биол. 1991. - Т. 111, В. 6. -С. 905-922.

30. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии / М.В. Угрюмов // Итоги науки и техники ВИНИТИ, серия "Морфология". 1991. -Т. 15.-115 с.

31. Урываева И.В. Модель репопуляции печени, поврежденной дипином / И.В. Урываева // Бюлл. экспер. биол. мед. 1997. - Т. 124, № 10. - С. 364-368.

32. Фактор В.М. Стволовой резерв печени / В.М. Фактор, С.А. Радаева // Онтогенез. 1991. - Т. 22, № 2. - С.181-189.

33. Фалин Л.И. Эмбриология человека / Л.И. Фалин // Атлас. М., Медицина, 1976.- 543 с.

34. Фенотипические признаки стволовых клеток экспрессия мембранного транспортера Bcrpl/Abcg2 и экспорт красителя Hochst 33342 - у гепатоцитов при регенерации печени / И.В. Урываева и др. // Докл. Акад. наук. - 2004. -Т. 398, №3.-С. 422-425.

35. Щеголев А.И. Структурно-метаболическая характеристика синусоидных клеток печени / А.И. Щеголев, О.Д. Мишнев // Успехи совр. биол. 1991. -Т. 3, № 1.-С. 73-82.

36. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии / И.М. Газизов и др. // Морфологические ведомости. 2008. -№ 1-2. - С. 23-27.

37. А bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm / G. Deutsch et al. // Development. 2001. - V. 128. - P. 871-881.

38. A cytokeratin-immunohistochemical study of hepatoblastoma / P. Van Eyken et al. // Him. Pathol. 1990. - V. 21. - P. 302-308.

39. A matrix metalloproteinase-9 activation cascade by hepatic stellate cells in transdifferentiation in the three-dimensional extracellular matrix/ Y.P. Han et al. // J. Biol. Chem. 2007. - V. 282. - P. 12928-12939.

40. A population of c-Kit-(low)(CD45/TER119)- hepatic cell progenitors of 11-day postcoitus mouse embryo liver reconstitutes cell-depleted liver organoids / S. Minguet et al. // J. Clin. Invest. 2003. - V. 112. - P. 1152-1163.

41. A role for WNT signaling in self-reneval of haemotopoietic stem cell / T. Reya et al. // Nature. 2003. - V. 423. - P. 409-414.

42. A significant proportion of myofibroblasts are of the bone marrow orogin in human liver fibrosis / S.J. Forbes et al. // Gastroenterology. 2004. - V. 126. -P. 955-963.

43. A VCAM-like adhesion molecule on murine bone marrow stromal cells mediates binding of lymphocyte precursors in culture / K. Miyake et al. // J. Cell Biol. -1991.-V. 114.-P. 557-565.

44. Activation of rat liver perisinusoidal lipocytes by transforming growth factors derived from myofibroblastlike cells. A potential mechanism of self perpetuation in liver fibrogenesis / M.G. Bachem et al. // J. Clin. Invest. 1992. - V. 89. - P. 19-27.

45. Activation, isolation, identification and in vitro proliferation of oval cells from adult rat liver / Z.P. He et al. // Cell Prolif. 2004. - V. 37, № 2. - P. 177-187.

46. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes

47. A. Banas et al. // Hepatology. 2007. - V. 46, № 1. - P. 219-228.

48. Administration of fibroblast growth factor 2 in combination with bone marrow transplantation synergistically improves carbon-tetrachloride-induced liver fibrosis in mice / T. Ishikawa et al. // Cell Tissue Res. 2007. - V. 327, № 3. -P. 463-470.

49. Alison M.R. Update on hepatic stem cells / M.R. Alison, R. Poulsom, S.J. Forbes // Liver. 2001. - V. 21. - P. 367-373.

50. Altered Notch ligand expression in human liver disease: further evidence for a role of the Notch signaling pathway in hepatic neovascularization and biliary ductular defects / S.S. Nijjar et al. // Am. J. Pathol. 2002. - 160. - P. 16951703.

51. An immunohistochemical study of normal and neoplastic canine Sertoli cells / B. Banco et al. // J. Comp. Pathol. 2010. - V. 143, № 4. - P. 239-247.

52. Angiopoietin-l promotes LYVE-1 -positive lymphatic vessel formation / T. Morisada et al. // Blood. 2005. - V. 105. - P. 4649-4656.

53. Athary A. Prostaglandin F2a and D2 release from primary Ito cell cultures after stimulation with noradrenaline and ATP but not adenosine / A. Athary, K. Hanecke, K. Jungermann // Hepatology. 1994. - V. 20. - P. 142-148.

54. Bankston P.W. The development of the sinusoids of fetal rat liver: morphology of endothelial cells, Kupffer cells, and the transmural migration of blood cells into the sinusoids / P.W. Bankston, R.M. // Am. J. Anat. 1980. - V. 159, № 1. - P. 115.

55. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death / D. Hockenbeiy et al. // Nature. 1990. - V. 348, № 6299. - P. 334-336.

56. Bcl-rambo, a novel Bcl-2 homologue that induces apoptosis via its unique C-terminal extension / T. Kataoka et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276, № 22. -P. 19548-19554.

57. Ber-EP4: new monoclonal antybody which distinguishes epithelia from mesothelia / U. Latza et al. // J. Clin. Pathol. 1990. - V. 43. - P. 213-219.

58. Bernier P.J. Bcl-2 protein as a marker of neuronal immaturity in postnatal primate brain / P.J. Bernier, A. Parent // J. Neurosci. 1998. - V. 18, № 7. - P. 24862497.

59. Beta-catenin antisense studies in embryonic liver cultures: role in proliferation, apoptosis, and lineage specification / S.P. Monga et al. // Gastroenterology. -2003.-V. 124.-P. 202-216.

60. Bile system morphogenesis defects and liver dysfunction upon targeted deletion of HNFlbeta / C. Coffinier et al. // Development. 2002. - V. 129. - P. 18291838.

61. Biliary glycoprotein 1 expression during embryogenesis: correlation with eventsof epithelial differentiation, mesenchymal-epithelial interactions, absorption, and myogenesis / E. Daniels et al. // Dev. Dyn. 1996. - V. 206, № 3. - P. 272-290.

62. Birchmeier C. Developmental roles of HGF/SF and its receptor, the c-Met tyrosine kinase / C. Birchmeier, E. Gherardi // Trends Cell Biol. 1998. - V. 8. -P. 404—410.

63. Blankenberg T.A. Normal and abnormal development of human intrahepatic bile ducts. An immunohistochemical perspective / T.A. Blankenberg, J.K. Lund, B.H. Reubner // Perspect. Pediatr. Pathol. 1991. - V. 14. - P. 143-167.

64. Blomhoff R. Perisinusoidal stellate cells of the liver: important roles in retinol metabolism and fibrosis / R. Blomhoff, K. Wake // FASEB J. 1991. - V. 5. - P. 271-277.

65. Blouin A. Distribution of organelles and membranes between hepatocytes and non-hepatocytes in the rat liver parenchyma. A stereological study / A. Blouin, R.P. Bolender, E.R. Weibel // J. Cell Biol. 1977. - V. 72. - P. 441-455.

66. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury/ A.B. Carvalho et al. // Stem Cells. -2008. -V. 26, № 5. P. 1307-1314.

67. Bone marrow progenitors are not the source of expanding oval cells in injured liver / A. Menthena et al. // Stem Cells. 2004. - V. 22. - P. 1049-1061.

68. Bone marrow-derived fibrocytes participate in pathogenesis of liver fibrosis / T. Kisseleva et al. // J. Hepatol. 2006. - V. 45, № 3. - P. 429-438.

69. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats / D.C. Zhao et al. // World J. Gastroenterol. 2005. - V. 11, № 22.-P. 3431-3440.

70. Bossard P. GATA transcription factors as potentiators of gut endoderm differentiation / P. Bossard, K.S. Zaret // Development. 1998. - V. 125. - P. 4909-4917.

71. Bouwens L. Local proliferation and extrahepatic recruitment of liver macrophages (Kupffer cells) in partial-body irradiated rats / L. Bouwens, D.L. Knook, E. Wisse // J. Leukoc. Biol. 1986. - V. 39, № 6. - P. 687-697.

72. Braun K.M. Cellular Origin of Regenerating Parenchyma in a Mouse Model of Severe Hepatic Injury // K.M. Braun, E.P. Sandgren // Am. J. of Pathol. 2000. -V. 157.-P. 561-569.

73. Brill S. Maturation-dependent changes in the regulation of liver-specific gene expression in embryonal versus adult primary liver cultures / S. Brill, I. Zvibel,

74. M. Reid // Differentiation. 1995. - V. 59, № 2. - P. 95-102.

75. Burt A.D. Cellular and molecular aspects of hepatic fibrosis / A.D. Burt // J. Pathol.-1993.-V. 170, №2.-P. 105-114.

76. Capillarization of hepatic sinusoid by liver endothelial cell-reactive autoantibodies in patients with cirrhosis and chronic hepatitis / B. Xu et al. // Am. J. Pathol. -2003.-V. 163.-P. 1275-1289.

77. Cascio S. Hepatocyte differentiation initiates during endodermal-mesenchymal interactions prior to liver formation / S. Cascio, K.S. Zaret // Development.1991.-V. 113.-P. 217-225.

78. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells / C. Kordes et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - V. 352, № 2. - P. 410-417.

79. CD24 positive cells from normal adult mouse liver are hepatocyte progenitor cells / Q. Qiu et al. // Stem Cells Dev. 2011.

80. CD66a (BGP), an adhesion molecule of the carcinoembryonic antigen family, is expressed in epithelium, endothelium, and myeloid cells in a wide range of normal human tissues / F. Prall et al. // J. Histochem. Cytochem. 1996. - V. 44, № 1. -P. 35-41.

81. Cell behavior in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver / C. Sarraf et al. // Am. J. Pathol. 1994. - V. 145. - P. 1114-1126.

82. Cell types involved in collagen and fibronectin production in normal and fibrotic human liver / B. Clement et al. // Hepatology. 1984. - V. 4. - P. 225-234.

83. Cellular and molecular changes in the early stages of chemical hepatocarcinogenesis in the rat / R.P. Evarts et al. // Cancer Res. 1990. - V. 50. -P. 3439-3444.

84. Cellular origin of collagen and fibronectin in the liver / B. Clement et al. // Cell Mol. Biol. 1984. - V. 30. - P. 489-496.

85. Cellular origin of the hepatic extracellular matrix / B. Clement et al. // Molecular and cell biology of liver fibrogenesis / Dordrecht: Kluwer Academic Publishers,1992.-P. 85-98.

86. Changing potency by spontaneous fusion / Q.L. Ying et al. // Nature. 2002. -V.416.-P. 545-548.

87. Characterization and isolation of ductular cells coexpressing neural cell adhesion molecule and Bcl-2 from primary cholangiopathies and ductal plate malformations / L. Fabris et al. // Am. J. Pathol. 2000. - V. 156. - P. 1599-1612.

88. Characterization of cell types during rat liver development / H.C. Fiegel et al. // Hepatology. 2003. - V. 37. - P. 148-154.

89. Characterization of cells in the developing human liver / S. Nava et al. // Differentiation. 2005. - V. 73. - P. 249-260.

90. Characterization of hepatic progenitors from human fetal liver using CD34 as ahepatic progenitor marker / P. Nyamath et al. // World J. Gastroenterol. 2007. -V. 13, № 16.-P. 2319-2323.

91. Characterization of Notch receptor expression in the developing mammalian heart and liver / K.M. Loomes et al. // Am. J. Med. Genet. 2002. - V. 112, № 2. - P. 181-189.

92. Characterization of two distinct liver progenitor cell subpopulations of hematopoietic and hepatic origins / V. Corcelle et al. // Exp. Cell Res. 2006. -V. 312, № 15.-P. 2826-2836.

93. Chojkier M. Hepatocyte collagen production in vivo in normal rats / M. Chojkier // J. Clin. Invest. 1986. - V. 78. - P.333-339.

94. Chojkier M. Increased production of collagen in vivo by hepatocytes and non-parenchymal cells in rats with carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis / M. Chojkier, K.D. Lyche, M. Filip // Hepatology. 1988. - V. 8. - P. 866-874.

95. Chromatin remodeling agent trichostatin A: a key-factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow / S. Snykers et al. // BMC Developmental Biology. 2007. - V. 7. - P. 24.

96. Coexpression of epithelial membrane antigen (EMA), Ki-1 and interleukin-2 receptor by anaplastic large cell lymphomas: diagnostic value in so-called «malignant histiocytosis» / G. Delsol et al. // Am. J. Pathol. 1988. - V. 130. -P. 59-70.

97. Collardeau-Frachon S. Vascular development and differentiation during human liver organogenesis / S. Collardeau-Frachon, J.Y. Scoazec // Anat. Rec. (Hoboken). -2008. V. 291, № 6. - P. 614-627.

98. Colocalization of three types of intermediate filament proteins in perisinusoidal stellate cells: glial fibrillary acid protein as a new cellular marker / G. Bunlatian et al. // Eur. J. Cell Biol. 1996. - V. 70. - P. 23-32.

99. Commitment of bone marrow cells to hepatic stellate cells in mouse / S. Baba et al. // J. Hepatol. 2004. - V. 40, № 2. - P. 255-260.

100. Common antigen of oval and biliary epithelial cells (A6) is a differentiation marker of epithelial and erythroid cell lineages in early development of the mouse / N.V. Engelhardt et al. // Differentiation. 1993. - V. 55. - P. 19-26.

101. Confocal microscopy immunofluorescence localization of desmin and other intermediate filament proteins in fetal rat livers / J. Vassy et al. // Hepatology. -1993.-V. 17.-P. 293-300.

102. Connective tissue biology and hepatic fibrosis: report of a conference / D.M. Bissel et al. // Hepatology. 1990. - V. 11. - P. 488-498.

103. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF beta signaling modulated by Onecut transcription factors / F. Clotman et al. // Genes Dev. 2005. - V. 19. -P. 1849-1854.

104. Coordinated induction of VEGF receptors in mesenchymal cell types during rat hepatic wound healing / V. Ankoma-Sey et al. // Oncogene. 1998. V. 17. - P. 115-21.

105. Correlation between Ito cells and fibrogenesis in an experimental model of hepatic fibrosis. A sequential stereological study / G. Ballardini et al. // Liver. -1983.-V.3.-P. 58-63.

106. Costa R.H. Multiple hepatocyte-enriched nuclear factors function in the regulation of transthyretin and alpha 1-antitrypsin genes / R.H. Costa, D.R. Grayson, Jr.J.E. Darnell // Mol. Cell Biol. 1989. V. 9. - P. 1415-1425.

107. Couvelard A. Expression of cell-cell and cell-matrix adhesion proteins by sinusoidal endothelial cells in the normal and cirrhotic human liver / A. Couvelard, J.Y. Scoazec, G. Feldmann // Am. J. Pathol. 1993. - V. 143. - P. 738-752.

108. Crosby H.A. Human hepatic stem-like cells isolated using c-kit or CD34 can differentiate into biliary epithelium / H.A. Crosby, D.A. Kelly, A.J. Strain // J. Gastroenterology. 2001. - V. 120, № 2. - P. 534-544.

109. Culture and characterization of sinusoidal endothelial cells isolated from human liver / G.W. Daneker et al. // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 1998. - V. 34. - P. 370-377.

110. Dabeva M.D. Activation, proliferation, and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration / M.D. Dabeva, D.A. Shafritz // Am. J. Pathol. 1993. - V. 143, № 6. - P. 1606-1620.

111. DC-SIGNR, a DC-SIGN homologue expressed in endothelial cells, binds to human and simian immunodeficiency viruses and activates infection in trans / S. Pohlmann et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 2670-2675.

112. Demonstration of expression of hepatic stellate cell markers in cells from liver epithelial progenitor cells of rhesus monkey / L. Jin et al. // Liver Int. 2011. -V. 31, № 5. - P. 744-746.

113. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation induced myeloablation / N.D. Theise et al. // Hepatology. 2000. - V. 31. - P. 235-240.

114. Derivation, characterization, and phenotypic variation of hepatic progenitor cell lines isolated from adult rats / L. Yin et al. // Hepatology. 2002. - V. 35. - P. 315-324.

115. Derzso K. Thy-1 is expresse in hepatic myofibroblasts and not oval cells in stemcell-mediated liver regeneration / K. Derzso, P. Jelnes, V. Laszlo // Am. J. of Pathol.-2007.-V. 171, №5. -P. 1529-1537.

116. Desmet V.J. Congenital disease of intrahepatic bile ducts variations on the theme "ductal plate malformations" / V.J. Desmet // Hepatology. 1992. - V. 16. - P. 1069-1083.

117. Desmin and actin in the identification of Ito cells and in monitoring their evolution to myofibroblasts in experimental liver fibrosis / G. Ballardini et al. // Virchows Arch. B Cell Pathol. 1988. - V. 56. - P. 45-49.

118. Desmin distinguishes cultured fat storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in rat / S. Takase et al. // J. Hepatol. 1988. - V. 6. -P. 267-276.

119. Desmin expressing nonhematopoietic liver cells during rat liver development: an immunohistochemical and morphometric study / A.P. Kiassov et al. // Differentiation. 1995. -V. 59. - P. 253-258.

120. Desmin-containing stellate cells in rat liver. Distribution in normal animals and response to experimental acute liver injury / A.D. Burt et al. // J. Pathol. 1986. -V. 150.-P. 29-35.

121. Development of hepatic sinusoidal structute with special reference to the Ito cells / H. Enzan et al. // Microsc. Res. Tech. 1997. - V. 39, № 4. - P. 336-349.

122. Development of hepatocytes from ES cells after transfection with the HNF-3beta gene/S. Ishizaka et al. // FASEB J. 2002. - V. 16.-P. 1444-1446.

123. Development of Murine Hepatic Sinusoidal Endothelial Cells Characterized by the Expression of Hyaluronan Receptors / H. Nonaka et al. // Developmental Dynamics. 2007. - V. 236. - P. 2258-2267.

124. Development, differentiation, and maturation of fetal mouse yolk sac macrophages in cultures / M. Naito et al. // J. Leukoc. Biol. 1989. - V. 46. № l.-P. 1-10.

125. Different thresholds of fibroblast growth factors pattern the ventral foregut into liver and lung / A.E. Serls et al. // Development. 2005. - V. 132. - P. 35-47.

126. Differential expression of matrix-metalloproteinase-1 and -2 genes in normal and fibrotic human liver / S. Milani et al. // Am. J. Pathol. 1994. - V. 144. - P.528.537.

127. Differentiation of liver epithelial (stem-like) cells into hepatocytes induced by coculture with hepatic stellate cells / H. Nagai et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 293, № 5. p. 1420-1425.

128. Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm / J.M. Rossi et al. // Genes. Dev. 2001. - V. 15. - P. 1998-2009.

129. Distribution in TGFBETA1 peptide immunolocalization in biliary atresia: comparison with the normal pattern in the developing human intrahepatic bile duct system / C.E.L. Tan et al. // Pathol. Int. 1995. - V. 45. - P. 815-824.

130. Distribution of Ito cells in experimental hepatic fibrosis / Y. Yokoi et al. // Liver. 1988. - V. 8. - P. 48-52.

131. Doljanski L. Ueber die gestaltende Wechselwirkung zwischen dem Epithel und dem Mesenchym, zugleich ein Beitrag zur Histogenese der sogenannten "Gallengangswucherungen" / L. Doljanski, F. Roulet // Virchows Arch A. -1934.-V. 292.-P. 256-267.

132. Dual phenotypic expression of hepatocytes and bile ductular markers in developing and preneoplastic rat liver / L.B. Tee et al. // Carcinogenesis. 1996. -V. 17.-P. 251-259.

133. Dubois A.M. The embryonic liver / A.M. Dubois // The liver / New York-London: Academic Press, 1963. P. 1-39.

134. Ductular proliferation in liver tissues with severe chronic hepatitis B: An immunohistochemical study / Y.-K. Chen et al. // World J. Gastroenterol. -2006. V. 12, № 9. p. 1443-1446.

135. Ductular reaction after submassive necrosis in humans. Special emphasis on analysis of ductular hepatocytes / A.J. Demetris et al. // Am. J. Pathol. 1996. -V. 149, №2.-P. 439-448.

136. Duncan S.A. Mechanisms controlling early development of the liver / S.A. Duncan//Mech. Dev.-2003.-V. 120.-P. 19-33.

137. Dunsford H.A. Production of monoclonal antibodies to preneoplastic liver cellpopulations induced by chemical carcinogens in rats and to transplantable Morris Hepatomas Ii H.A. Dunsford, S. Sell // Cancer Res. 1989. - V. 49. - P. 48874893.

138. Eckardt K.U. Erythropoietin production in liver and kidneys / K.U. Eckardt // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 1996. - V. 5, № 1. - P. 28-34.

139. Effect of vitamin A deficiency on the integrity of hepatocytes after partial hepatectomy / R.P. Evarts et al. // Am. J. Pathol. 1995. - V. 147, № 3. p. 699-706.

140. Effects of antigen retrieval by microwave heating in formalin-fixed tissue sections on a broad panel of antibodies / R. Von Wasielewski et al. // Histochem.- 1994. -V. 102.-P. 165-172.

141. Elias H. Morphology of the liver / H. Elias, J.C. Sherrick // New York: Academic Press, 1969. P. 268-270.

142. Elias H. Origin and early development of the liver of various vertebrates // H. Elias // Acta Hepatologica. 1955. - № 3. - P. 1-56.

143. Embryoid-body cells derived from a mouse embryonic stem cell line show differentiation into functional hepatocytes / R. Chinzei et al. // Hepatology. -2002.-V. 36.-P. 22-29.

144. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged 1 / Y. Xue et al. // Hum. Mol. Genet. 1999. - V. 8. - P. 723-730.

145. Emura I. Four types of presumptive hemopoietic stem cells in the human fetal liver /1. Emura, M. Sekiya, Y. Ohnishi // Arch. Histol. Jpn. 1983. - V. 46. - P. 645-662.

146. Endotoxin down-regulates T cell activation by antigen-presenting liver sinusoidal endothelial cells / P.A. Knolle et al. // J. Immunol. 1999. - V. 162. -P. 1401-1407.

147. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury / R. Yoshino et al. // Hepatol. Res. 2006. - V. 34. - P. 238-249.

148. Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud / F. Bladt et al. // Nature. 1995. - V. 376. - P. 768-771.

149. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes / C.A. Lázaro et al. // Hepatology. 2003. - V. 38, № 5.-P. 1095-1106.

150. Evidence for a migratory capability of rat Kupffer cells to portal tracts and hepatic lymph nodes / M.J. Hardonk et al. // Virchws Arch. B Cell Pathol.1986.-V. 51.-P. 429-442.

151. Evidence for epithelial-mesenchymal transitions in adult liver cells / J.K. Sicklick et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006. - V. 291, №4.-P. G575-G583.

152. Evidence for hepatocyte differentiation from embryonic stem cells in vitro / H. Miyashita et al. // Cell Transplant. 2002. - V. 11. - P. 429-434.

153. Evidence for the identity of human scatter factor and human hepatocyte growth factor / K.M. Weidner et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88. - P. 7001-7005.

154. Evidence of angiogenesis in primary biliary cirrhosis: an immunohistochemical descriptive study / J. Medina et al. // J. Hepatol. 2005. - V. 42. - P. 124-131.

155. Ex vivo transduced liver progenitor cells as a platform for gene therapy in mice /

156. Song et al. // Hepatology. 2004. - V. 40. - P. 918-924.

157. Expansion of hepatic and hematopoietic stem cells utilizing mouse embryonic liver explants / S.P. Monga et al. // Cell Transplant. 2001. - V. 10. - P. 81-89.

158. Expression of acidic fibroblast growth factor in regenerating liver and during hepatic differentiation / E.R. Marsden et al. // Lab. Invest. 1992. - V. 67, № 4. -P. 427-433.

159. Expression of cellular prion protein in activated hepatic stellate cells / K. Ikeda et al. // Am. J. Pathol". 1998.-V. 153.-P. 1695-1700.

160. Expression of epithelial-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin during human intrahepatic bile duct development: a possible role in bile duct morphogenesis / T. Terada et al. // J. Hepatol. 1998. - V. 28. - P. 263-269.

161. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells / H. Do et al. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 19587-19592.

162. Expression of HGF, its receptor c-met, c-myc, and albumin in cirrhotic and neoplastic human liver tissue / J.Y. Ljubimova et al. // J. Histochem. Cytochem. 1997. - V. 45, № 1. - P. 79-87.

163. Expression of homologously recombined erythropoietin SV 40T antigen fusion gene in mouse liver: evidence for erythropoetin production by Ito cells / P.H. Maxwell et al. // Blood. 1994. - V. 84. - P. 1823-1830.

164. Expression of integrins during liver organogenesis in humans / A. Couvelard et al. // Hepatology. 1998. - V. 27. - P. 839-847.

165. Expression of MUC1 epitopes on normal bone marrow: implications for the detection of micrometastatic tumor cells / W. Brugger et al. // Clin. Oncol. -1999.-V. 17.-P. 1535-1544.

166. Expression of muscle-associated cytoskeletal proteins by human liver sinusoidal cells / Q. Ahmed et al. // Cells of the hepatic sinusoid. Leiden. - 1991. - V. 3. -P. 203-206.

167. Expression of neural cell adhesion molecule in human liver development and in congenital and acquired liver diseases / L. Libbrecht et al. // Histochem. Cell Biol.-2001.-V. 116.-P. 233-239.

168. Expression of stabilin-2, a novel fasciclin-like hyaluronan receptor protein, in murine sinusoidal endothelia, avascular tissues, and at solid/liquid interfaces / M. Falkowski et al. // Histochem. Cell Biol. 2003. - V. 120. - P. 361-369.

169. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat / K. Fujio // Lab. Invest. 1994. - V. 70. - P. 511-516.

170. Expression of the c-Met/HGF receptor in human melanocytic neoplasms: demonstration of the relationship to malignant melanoma tumour progression / P.G. Natali et al. // J. Cancer. 1993. - V. 68, № 4. - P. 746-750.

171. Expression of the gene of the alpha-smooth muscle-actin isoform in rat liver and in rat fat-storing (ITO) cells / G. Ramadori et al. // Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 1990. - V. 59. - P. 349-357.

172. Expression of the stem cell factor receptor c-kit in normal and diseased pediatric liver: identification of a human hepatic progenitor cell? / U. Baumann et al. // Hepatology. 1999. - V. 30. - P. 112-117.

173. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat / T.H. Kim et al. // Hepatology. 1997. - V. 26. - P. 896-904.

174. Factor V.M. Origin and fate of oval cells in dipin-induced hepatocarcinogenesis in the mouse /V.M. Factor, S.A. Radaeva, S.S. Thorgeirsson // Am. J. Pathol. -1994.-V. 145.-P. 409-422.

175. Faris R.A. Selective proliferation of chemically altered rat liver epithelial cells following hepatic transplantation / R.A. Faris, D.C. Hixson // Transplantation. -1989.-V. 48, №1.-P. 87-92.

176. Fat storing cells as liver-spesific pericytes / M. Pinzani et al. // J. Clin. Invest. -1992.-V. 90.-P. 642-646.

177. Fat storing cells of rat liver synthesize and secrete fibronectin. Comparison with hepatocytes / G. Ramadori et al. // J. Hepatol. 1987. - V. 4. - P. 190-197.

178. Fausto N. Hepatocyte differentiation and liver progenitor cells / N. Fausto // Curr. Opin. Cell Biol. 1990. -V. 2. - P. 1036-1041.

179. Fausto N. Oval cells and liver carcinogenesis: an analysis of cell lineages in hepatic tumors using oncogene transfection techniques / N. Fausto // Prog. Clin. Biol. Res. 1990. -V. 331. - P. 325-334.

180. Fetal liver stroma consists of cells in epithelial-to-mesenchimal transition / J. Chagraoui etal. //Blood.-2003.-V. 101.-P. 2973-2982.

181. Fibroblast growth factor enriches the embryonic liver cultures for hepatic progenitors / S.S. Sekhon et al. // Am. J. Pathol. 2004. - V. 164, № 6. - P.2229-2240.

182. Fibroblast growth factor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes / X.-Q. Kang et al. // World J. Gastroenterol. 2005. - V. 11, № 47. - P. 74617465.

183. Fibrogenic Potential of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells in Injured Liver / R.M. Baertschiger et al. // PLoS ONE. 2009. - V. 4, № 8. - P. e6657.

184. Fine structure of hepatic sinusoids and their development in human embryos and fetuses / H. Enzan et al. // Acta Pathol. Jpn. 1983. - V. 33. - P. 447-466.

185. Flow-cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver / A. Suzuki et al. // Hepatology. 2000. - V. 32. - P. 1230-1239.

186. Foxfl / mice exhibit defective stellate cell activation and abnormal liver regeneration following CC14 injury / V.V. Kalinichenko et al. // Hepatology. -2003.-V.37.-P. 107-117.

187. Friedman S.L. Cellular sources of collagen and regulation of collagen production in liver / S.L. Friedman // Semin. Liver Dis. 1990. - V. 10. - P. 20-29.

188. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver / S.L. Friedman // Physiol. Rev. 2008. - V. 88. - P. 125-172.

189. Friedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury / S.L. Friedman // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 2247-2250.

190. Fuchs E. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche / E. Fuchs, T. Tumbar, G. Guasch // Cell. 2004. - V. 116. - P. 769-778.

191. Fukuda-Taira S. Hepatic induction in the avian embryo: specificity of reactive endoderm and inductive mesoderm / S. Fukuda-Taira // J. Embryol. Exp. Morphol. 1981. - V. 63. - P. 111-125.

192. Gard A.L. Extraneural glial fibrillary acid protein (GFAP) immunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver / A.L. Gard, F.P. White, G.R. Dutton // J. Neurol. 1985. -V. 8. - P. 359-375.

193. GATA6 is essential for embryonic development of the liver but dispensable for early heart formation / R. Zhao et al. // Mol. Cell Biol. 2005. - V. 25. - P. 2622-2631.

194. GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo / E.E. Morrisey et al. // Genes. Dev. 1998. - V. 12. - P. 3579-3590.

195. Geerts A. History, heterogeneity, developmental biology, functions of quiescent hepatic stellate cells / A. Geerts // Semin. Liver Dis. 2001. - V. 21. - P. 311

196. Geerts A. On the origin of stellate cells: mesodermal, endodermal or neuroectodermal? / A. Geerts // J. Hepatol. 2004. - V. 40. - P. 331-334.

197. Gene expression pattern in hepatic stem/progenitor cells during rat fetal development using complementary DNA microarrays / P.M. Petkov et al. // Hepatology. 2004. - V. 39. - P. 617-627.

198. Generation of hepatocytes from cultured mouse embryonic stem cells / X.L. Kuai et al. // Liver Transpl. 2003. - V. 9. - P. 1094-1099.

199. Glial fibrillary acidic protein a cell type specific marker for Ito cells in vivo and in vitro / K. Neubauer et al. // J. Hepatol. - 1996. - V. 24, № 6. - P. 719730.

200. Godlewskyi G. Liver development in rats during the embryonic period (Carnegie stages 11-14) / G. Godlewskyi, R. Gauber-Cristol, S. Rouy // Acta Anat. 1992. -V. 144.-P. 45-50.

201. Gordon G.J. Temporal analysis of hepatocyte differentiation by small hepatocyte-like progenitor cells during liver regeneration in retrorsine-exposed rats / G.J. Gordon, W.B. Coleman, J.W. Grisham // Am. J. Pathol. 2000. - V. 157.-P. 771-786.

202. Gressner A.M. Comparison of sulphated glycosaminoglycan and hyaluronate synthesis and secretion in cultured hepatocytes, fat storing cells, and Kupffer cells / A.M. Gressner, S. Schafer // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1989. - V. 27. - P. 141-149.

203. Gressner A.M. Transdifferentiation of hepatic stellate cells (Ito cells) into myofibroblasts: a key event in hepatic fibrogenesis / A.M. Gressner // Kidney International. 1996. - V. 49. - P. S39-S45.

204. Grisham J.W. Isolation, culture, and transplantation of rat hepatocytic precursor (stem-like) cells / J.W. Grisham, W.B. Coleman, G.J. Smith // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1993. - V. - 204. - P. 270-279.

205. Grompe M. Adult liver stem cells / M. Grompe // Essentials of stem cell biology / Elsevier, 2009. Ch. 34. - P. 285-298.

206. Gupta S. Hepatic polyploidy and liver growth control / S. Gupta // Semin. Cancer Biol.-2000.-V. 10.-P. 161-171.

207. Hammar J. A. Über die erste Entstehung der nicht kapillaren intrahepatishenGallengánge beim Menschen / J.A.Z. Hammar // Microsk. Anat. Forsch. 1926. - V. 5. - P. 59-89.

208. Hardonk MJ. Immunohistochemical methods in the study of liver sinusoidal cells / MJ. Hardonk, S. Huitema, J. Koudstaal // Cells of the hepatic sinusoid. -Rijswijk, 1989. V. 2. - P. 483-487.

209. Harrison R.L. Human hepatic sinusoidal endothelial cells in culture produce von Willebrand factor and contain Weibel-Palade bodies / R.L. Harrison, R. Boudreau // Liver. 1989. - V. 9. - P. 242-249.

210. Hautekeete M.L. The hepatic stellate (Ito) cell: its role in human liver disease /M.L. Hautekeete, A. Geerts // Virchows Arch. 1997. - V. 430. - P. 195-207.

211. Heart and liver defects and reduced transforming growth factor beta2 sensitivity in transforming growth factor beta type III receptor-deficient embryos / K.L. Stenvers et al. // Mol. Cell. Biol. 2003. - V. 23. - P. 4371-4385.

212. Hedgehog signaling maintains resident hepatic progenitors throughout life / J.K. Sicklick et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006. - V. 290. -P. G859-G870.

213. Hematopoietic stem cell markers are expressed by ductal plate and bile duct cells in developing human liver / K. Blakolmer et al. // Hepatology. 1995. - V. 21, №6.-P. 1510-1516.

214. Hematopoietic stem cells are uniquely selective in their migratory response to chemokines / D.E. Wright et al. // J. Exp. Med. 2002. - V. 195. - P. 11451154.

215. Hendriks H.F.J. The role of hepatic fat storing (stellate) cells in retinoid metabolism / H.F J. Hendriks, A. Brouwer, D.L. Knook // Hepatology. 1987. -V. 7.-P. 1368-1371.

216. Hepatic "stem" cells: state of the art / M.G. Mancino et al. // It. J. Anat. Embryol. 2007. - V. 112, № 2. - P. 93-109.

217. Hepatic artery malformations associated with a primary defect in intrahepatic bile duct development / F. Clotman et al. // J. Hepatol. 2003. - V. 39. - P. 686692.

218. Hepatic expression of secondary lymphoid chemokine (CCL21) promotes the development of portal-associated lymphoid tissue in chronic infl ammatory liver disease / A.J. Grant et al. // Am. J. Pathol. 2002. - V. 160. - P. 1445-1455.

219. Hepatic jagged 1 expression studies / A. A. Louis et al. //Hepatology. 1999. -V.30.-P. 1269-1275.

220. Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat / B.E. Petersen et al. // Hepatology. 1998. - V. 27. - P. 433-445.

221. Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: cell signaling and transcriptional control / R. Gualdi et al. // Genes. Dev. 1996. - V. 10. - P. 1670-82.

222. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative past, present andfuture/H. Senoo et al.//Cell Biol. Int.-2010.-V. 34, № 12.-P. 1247-1272.

223. Hepatic stellate cells do not derive from the neural crest / D. Cassiman et al. // J. Hepatol. 2006. - V. 44. - P. 1098-1104.

224. Hepatic stellate cells' involvement in progenitor-mediated liver regeneration / D.G. Pintilie et al. // Lab. Invest. 2010. - V. 90, № 8. - P. 1199-1208.

225. Hepatic stellate cells modulate the differentiatin of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells / X. Deng et al. // J. of Cell. Physiol. 2008. -V.217.-P. 138-144.

226. Hepatic stellate cells reversibly express alpha-smooth muscle actin during acute hepatic ischemia / L. Rubbia-Brandt et al. // Transplant. Proc. 1997. - V. 29. -P.2390-2395.

227. Hepatic stem cells / S. Forbes et al. // J. Pathol. 2002. - V. 197. - P. 510-518.

228. Hepatic stem cells and liver's maturational lineages: implications for liver biology, gene expression, and cell therapies / E. Schmelzer et al. // Tissue stem cells / C.S. Potten et al. New York-London: Taylor and Francis Group, 2006. -P. 161-213.

229. Hepatic stem cells: from inside and outside the liver? / M.R. Alison et al. // Cell Prolif. 2004. - V. 37. - P. 1-21.

230. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from rat peritoneal adipose tissue in vitro and in vivo / M. Sgodda et al. // Exp. Cell Res. 2007. -V. 313, № 13.-P. 2875-2886.

231. Hepatocyte growth factorlc-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and repair / C.-G. Huh et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. -V. 101, №13.-P. 4477-4482.

232. Hepatocyte growth factor/hepatopoietin A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblast-like cells derived from fat-storing cells / P. Schumacher et al. // Hepatology. 1992. - V. 15. - P. 5-11.

233. Hepatocytes from nonhepatic adult stem cells / M.R. Alison et al. // Nature/ -2000/-V. 406.-P. 257.

234. Hepatocytes may produce laminin in fibrotic liver and in primary culture / B. Clement et al. // Hepatology. 1988. - V. 8. - P. 794-803.

235. Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells / P. Krause et al. // J. Hepatol. 2000. - V. 32. - P. 718-726.

236. Hepatocytic differentiation of mesenchymal stem cells in cocultures with fetal liver cells / C. Lange et al. // World J. Gastroenterol. 2006. - V. 12, № 15. - P. 2394-2397.

237. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells / R. Talens-Visconti et al. // World J. Gastroenterol. 2006. - V. 12, № 36. - P. 5834-5845.

238. Higgins G.M. Experimental pathology of the liver: I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal / G.M. Higgins, R.M. Anderson // Arch. Pathol.-193l.-V. 12.-P. 186-202.

239. Histochemical and ultrastructural demonstration of y-glutamil transpeptidase activity / A.M. Rutenberg et al. // J. Histochem. Cytochem. 1968. - V. 17. - P. 517.

240. Histochemical properties of vascular and sinusoidal endothelial cells in liver diseases / M. Hattori et al. // Gastroenterol. Jpn. 1991. V. - 26, № 3. p. 336343.

241. Hixson D.C. An antigenic portrrait of the liver during carcinogenesis / D.C. Hixson, R.A. Faris, N.L. Thompson // Pathobiology. 1990. - V. 58. - P. 65-77.

242. Hlx homeobox gene is essential for an inductive tissue interaction that drives expansion of embryonic liver and gut / B. Hentsch et al. // Genes. Dev. 1996. -V. 10.-P. 70-79.

243. HNF-3A, a hepatocyte-enriched transcription factor of novel structure is regulated transcriptionally / E. Lai et al. // Genes. Dev. 1990. - V. 4. - P. 1427-1436.

244. Hogarth C.A. The key role of vitamin A in spermatogenesis / C.A. Hogarth, M.D. Griswold // J. Clin. Invest. 2010. - V. 120, № 4. - P. 956-962.

245. Homeobox gene Hex is essential for onset of mouse embryonic liver development and differentiation of the monocyte lineage / V.W. Keng et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - V. 276. - P. 1155-1161.

246. Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo / P.F. Lalor et al. // World J. Gastroenterol. 2006. - V. 12, № 34. - P. 5429-5439.

247. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology / R. Turner et al. // Hepatology. 2011. - V. 53, № 3. - P. 1035-1045.

248. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors / E. Schmelzer et al. // J. Exp. Med. 2007. - V. 204, № 8. - P. 1973-1987.

249. Human hepatocyte growth factor in plasma from patients with fulminant hepatic failure / E. Gohda et al. // Exp. Cell Res. 1986. - V. 166. - P. 139-150.

250. Human liver Kupffer cells express CR1, CR3 and CR4 component receptor antigens. An immunohistochemical study / N. Hinglais et al. // Lab. Invest. -1989.-V. 61.-P. 509-514.

251. Human liver-derived stem cells / A.J. Strain et al. // Semin. Liver Dis. 2003. -V. 23. №4.-P. 373-384.

252. Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: Differentiation into hepatic lineage / R. Talens-Visconti et al. // Toxicol. In Vitro. 2007. - V. 21, № 2. - P. 324-329.

253. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion / Y. Sato et al. // Blood. -2005.-V. 106.-P. 756-763.

254. Identification of a novel high molecular weight protein preferentially expressed by sinusoidal endothelial cells in normal human tissues / S. Goerdt et al. // J. Cell Biol.-1991.-V. 113.-P. 1425-1437.

255. Identification of adult progenitor cells capable of repopulating injured rat liver / M.I. Yovchev et al. // Hepatology. 2008. - V. 47. - P. 636-647.

256. Identification of bipotential progenitor cells in human liver development / Y. Haruna et al. // // Hepatology. 1996. - V. 23. - P. 476-481.

257. Identification of bipotential progenitor cells in human liver regeneration / S. Haque et al. // Lab. Invest. 1996. - V. 75, № 5. - P. 699-705.

258. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product / D.P. Bottaro et al. // Science. 1991. - V. 251, № 4995. - P. 802-804.

259. Identification of the Hyaluronan Receptor for Endocytosis (HARE) / B. Zhou et al. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 37733-37741.

260. Immunocytochemical analysis of HLA class II (DR) antigens in liver disease in man / C. Barbatis et al. // J. Clin. Pathol. 1987. - V. 40. - P. 879-884.

261. Immunocytochemical detection of desmin in fat-storing cells (Ito cells) / Y. Yokoi et al. // Hepatology. 1984. - V. 4. - P. 709-714.

262. Immunocytochemical observations on macrophage populations in normal fetal and adult human liver / K.A. Bardadin et al. // J. Pathol. 1991. - V. 164. — P. 253-259.

263. Immunohistochemical analysis of atypical ductular reaction in the human liver, with special emphasis on the presence of growth factors and their receptors / A. Kiss et al. // Liver. 2001. - V. 21. P. 237-246.

264. Immunohistochemical analysis of cytokeratin 7 expression in resting and proliferating biliary structures of rat liver / S. Paku et al. // Hepatology. 2005. -V. 42, №4.-P. 863-870.

265. Immunohistochemical characterization of two new monoclonal antibodies (LN-4, LN-5) reactive with human macrophage subsets and derived malignancies in B5-fixed, paraffin-embedded tissues / L. Bhoopat et al. // Blood. 1988. - V. 71.-P. 1079-1085.

266. Immunohistochemical localization of TGF beta 1, TGF beta 2, and TGF beta 3 in the mouse embryo: expression patterns suggest multiple roles during embryonic development / R.W. Pelton et al. // J. Cell Biol. 1991. - V. 115. - P. 10911105.

267. Immunohistochemical studies on structural changes of the hepatic lobules inchronic liver diseases / Y. Fukuda // Am. J. Gastroenterol. 1986. - V. 81. - P. 1149-1155.

268. Immunolocalisation of laminin in normal rat liver and biosynthesis by hepatic lipocytes in primary culture / J.J. Maher et al. // Gastroenterology. 1988. - V. 94.-P. 163-169.

269. Immunoreactivity of Hep Par 1 in Hepatic and Extrahepatic Tumors and Its Correlation With Albumin In Situ Hybridization in Hepatocellular Carcinoma / S. Kakar et al. // Am. J. Clin. Pathol. 2003. - V. 119. - P. 361-366.

270. In situ hybridization for procollagen types I, III, and IV mRNA in normal and fibrotic rat liver: evidence for predominant expression in nonparenchymal liver cells / S. Milani et al. // Hepatology. 1989. - V. 10. - P. 84-92.

271. In vitro differentiation of fat-storing cells parallels marked increase of collagen increase and secretion / A. Geerts et al. // J. Hepatol. 1989. - V. 9. - P. 59-68.

272. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells / K.D. Lee et al. // Hepatology. 2004. - V. 40, № 6. - P. 1275-1284.

273. In vivo differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes / D. Choi et al. // Cell Transplant. 2002. - V. 11. - P. 359-368.

274. Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors / J. Jung et al. // Science. 1999. - V. 284. - P. 1998-2003.

275. Intrinsic inervation of the human liver / T. Ueno et al. // J. Clin. Electorn. Microsc. 1988. - V. 21. -P. 481-491.

276. Investigation into the origin of mouse liver sinusoidal cells / N. Freudenberg et al. // Virchows Arch. A Pathol. Anat. 1986. - V. 410. - P. 1-7.

277. Isolation and Characterization of a Stem Cell Population from Adult Human Liver / M.B. Herrera et al. // Stem Cells. 2006. - V. 24. - P. 2840-2850.

278. Isolation from human fetal liver of cells co-expressing CD34 haematopoietic stem cell and CAM 5.2 pancytokeratin markers / E.R. Lemmer et al. // J. Hepatol. 1998. - V. 29. - P. 450-454.

279. Isolation of hepatoblasts based on the expression of Dlk/Pref-1 / N. Tanimizu et al.//J. Cell Sci. -2003. V. 116.-P. 1775-1786.

280. Isolation of human progenitor liver epithelial cells with extensive replication capacity and differentiation into mature hepatocytes / H. Malhi et al. // J. Cell Sci.-2002.-V. 115.-P. 2679-2688.

281. Isolation of oval cells from Long-Evans Cinnamon rats and their transformation into hepatocytes in vivo in the rat liver / O. Yasui et al. // Hepatology. 1997. -V. 25.-P. 329-334.

282. JAGGED 1 gene expression during human embryogenesis elucidates the wide phenotypic spectrum of Alagille syndrome / C. Crosnier et al. // Hepatology. -2000.-V. 32.-P. 574-581.

283. Jaggedl signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-reneval / Y. Nyfeler et al. // EMBO J. 2005. - V. 24. - P. 3504-3515.

284. Kelly P.M. Kupffer cell number is normal, but their lysozyme content is reduced in alcoholic liver disease / P.M. Kelly, A.R. Heryet, J.O.'D. McGee / J. Hepatol. -1990.-V. 8.-P. 173-180.

285. Keratin immunohistochemistry in normal human liver. Cytokeratin pattern of hepatocytes, bile ducts and acinar gradient / P. Van Eyken et al. // Virchows Arch. A. 1987. - V. 412. - P. 63-72.

286. Kiyasova V.A. CD 34 expression in prenatal human development / V.A. Kiyasova, A.A. Gumerova // International congress of histochemistry and cytochemistry, 22-27 July 2004. San Diego, USA. - P. 10-13.

287. Knook D.L. Fat storing cells of rat liver. Their isolation and purification / D.L. Knook, A.M. Seffelaar, A.M. De Leeuw // Exp. Cell Res. 1982. - V. 139. - P. 468-471.

288. Kountouras J. Liver regeneration after hepatectomy / J. Kountouras, P. Boura, N.J. Lygidakis // Hepatogastroenterology. 2001. - V. 48. - P. 556-562.

289. Kubota H. Clonogenic hepatoblasts, common precursors for hepatocytic and biliary lineage, are lacking classical major histocompatibility complex class I antigen / H. Kubota, L.M. Reid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. -P. 12132-12137.

290. Lassau J.P. Organogenesis of the venous structures of the human liver: a hemodynamic theory / J.P. Lassau, D. Bastian // Anatomia Clinica. 1983. - V. 5. -P. 97-102.

291. Le Douarin N.M. An experimental analysis of liver development / N.M. Le Douarin // Med. Biol. 1975. - V. 53. - P. 427-55.

292. Lemaigre F. Liver development update: New embryo models, cell lineage control, and morphogenesis / F. Lemaigre, K.S. Zaret // Curr. Opin. Genet. Dev. -2004.-V. 14.-P. 582-590.

293. Liver expression of epidermal growth factor RNA. Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration / B. Mullhaupt et al. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 19667-19670.

294. Liver from bone marrow in humans / N.D. Theise et al. // Hepatology. 2000. -V. 32.-P. 11-16.

295. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function / K. Matsumoto et al. // Science. 2001. - V. 294. - P. 559-563.

296. Liver regeneration in rats with retrorsine-induced hepatocellular injury proceeds through a novel cellular response / G.J. Gordon et al. // Am. J. Pathol. 2000. -V. 156.-P. 607-619.

297. Liver sinusoidal endothelial cells are insuffi cient to activate T cells / S.C. Katz et al. // J. Immunol. 2004. - V. 173. - P. 230-235.

298. Liver-specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells / H.C. Fiegel et al. // Stem Cells. 2003. - V. 21. - P. 98-104.

299. Liver-specific gene expression in mesenchymal stem cells is induced by liver cells / C. Lange et al. // World J. Gastroenterol. 2005. - V. 11, № 29. - P. 4497-4504.

300. Long-term hematopoietic stem cells require stromal cell-deriver factor-1 colonizaing bone marrow during ontogeny / T. Ara et al. // Immunity. 2003. -V. 19.-P. 257-267.

301. Loo C.K. Origin of stellate cells from submesothelial cells in a developing human liver / C.K., X.J. Wu // Liver Int. 2008. - V. 28, № 10. - P. 1437-1445.

302. Lorenzini S. Stem Cell Therapy for Human Liver Cirrhosis: A Cautious Analysis of the Results / S. Lorenzini, P. Andreone // Stem Cells. 2007. - V. 25. -P. 2383-2384.

303. LYVE-1 is not restricted to the lymph vessels: expression in normal liver blood sinusoids and down-regulation in human liver cancer and cirrhosis / C.M. Carreira et al. // Cancer Res. 2001. - V. 61. - P. 8079-8084.

304. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan / S. Banerji et al. // J. Cell Biol. 1999. - V. 144. - P.789.801.

305. Machiarelli G. Scanning electron microscopy of adult and fetal liver sinusoids / G. Machiarelli, S. Makabe, P. Motta // Sinusoids in human health and disease / P. Bioulac-Sage, C. Balabaud editors. Rijswijk: Kupffer Cell Foundation, 1988. -P. 63-81.

306. Madri J.A. Extracellular matrix-cell interactions: dynamic modulation of cell, tissue and organism structure and function / J.A. Madri, M.D. Basson // Lab. Invest. 1992. - V. 66. - P. 519-521.

307. Magnetically labeled mesenchymal stem cells after autologous transplantation into acutely injured liver / X.-L. Shi et al. // World J. Gastroenterol. 2010. - V. 16, №29.-P. 3674-3679.

308. Maher J.J. Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver. Upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride / J.J. Maher // J. Clin. Invest. 1993. - V. 91, № 5. - P. 2244-2252.

309. Martinez-Hernandez A. The hepatic extracellular matrix. II. Ontogenesis, regeneration and cirrhosis / A. Martinez-Hernandez, P.S. Amenta // Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 1993. - V. 423. - P. 77-84.

310. Matrix metalloproteinases in early human liver development / F. Quondamatteo et al. // Histochem. Cell Biol. 1999. - V. 112. - P. 277-282.

311. Matsumoto K. Emerging multipotent aspects of hepatocyte growth factor / K. Matsumoto, T. Nakamura // J. Biochem. Tokyo. 1996. - V. 119, № 4. - P. 591600.

312. Mauro A. Satellite cell of the skeletal muscle fibers / A.J. Mauro // Biophys. Biochem. Cytol. 1961. -V. 9. - P. 493-495.

313. McCright B. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jagl haploinsufficiency / B. McCright, J. Lozier, T. Gridley // Development. -2002.-V. 129.-P. 1075-1082.

314. McGee J.O. The role of perisinusoidal cells in hepatic fibrogenesis. An electron microscopic study of acute carbon tetrachloride liver injury / J.O. McGee, R.S. Patrick // Lab. Invest. 1972. - V. 264. - P. 429-440.

315. McLin V. Developmental anatomy of the liver and biliary tree / V. McLin, N. Yazigi // Pediatric gastrointestinal and liver disease / R.H.J. Wyllie editor. 3rd edition. - Edinburgh: W.B. Saunders, 2006. - P. 839-847.

316. McLin V.A. Molecular control of liver development / V.A. McLin, A.M. Zorn // Clin. Liver Dis. 2006. - V. 10. - P. 1-25.

317. Mechanism of contraction and dilatation of sinusoidal endothelial fenestrae in the liver / M. Oda et al. // Hepatology. 1986. - V. 16. - P. 2469.

318. Mesenchymal origin of hepatic stellate cells, submesothelial cells, and perivascular mesenchymal cells during mouse liver development / K. Asahina etal. // Hepatology. 2009. - V. 49, № 3. - P. 998-1011.

319. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates / S.M. Devine et al. // Blood. 2003. - V. 101. -P. 2999-3001.

320. Mesoderm-specific expression of the divergent homeobox gene Hlx during murine embryogenesis / TJ. Lints et al. // Dev. Dyn. 1996. - V. 205. - P. 457470.

321. Met provides essential signals for liver regeneration / M. Borowiak et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2004. V. 101, №29.-P. 10608-10613.

322. Met, metastasis, motility and more / C. Birchmeier et al. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. -V. 4. - P. 915-925.

323. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply / Y. Nakanuma et al. // Microsc. Res. Tech. -1997.-V. 38.-P. 552-570.

324. Modulated differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells by coculture with hepatic stellate cells / M. Nishiofuku et al. // J. Biosci. Bioeng. -2011.-V. Ill,№ 1.-P. 71-77.

325. Modulation of alpha smooth muscle actin and desmin expression in perisinusoidal cells of normal and diseased human livers / A. Schmitt-Graff et al. //Am. J. Pathol.-1991.-V. 138.-P. 1233-1242.

326. Modulation of cytokeratin expression during in vitro cultivation of human hepatic stellate cells: evidence of transdifferentiation from epithelial to mesenchymal phenotype / Y.S. Lim et al. // Histochem. Cell Biol. 2002. - V. 118, №2.-P. 127-136.

327. Molecular identification of PAL-E, a widely used endothelialcell marker / H. Niemela et al. // Blood. 2005. - V. 106. - P. 3405-3409.

328. Moore K.L. The Developing Human / K.L. Moore, T.V.N. Persaud // Philadelphia: W.B. Saunders, 1993.-243 p.

329. Morphogenesis of chicken liver: identification of localized growth zones and the role of beta-catenin/Wnt in size regulation / S. Suksaweang et al. // Dev. Biol. -2004.-V. 266.-P. 109-122.

330. Morphologic investigation of sinusoidal cells / A.D. Burt et al. // Semin. Liver Dis. 1993. -V. 13.-P. 21-38.

331. Morphological, molecular, and functional heterogeneity of cholangiocytes from normal rat liver / G. Alpini et al. // Gastroenterology. 1996. - V. 110. - P.1636-1643.

332. Morphometric and immunohistochemical characterization of human liver regeneration / E.M. Rubin et al. // Am. J. Pathol. 1995. - V. 147, № 2. - P. 397-404.

333. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells / R.E. Schwartz et al. // J. Clin. Invest. 2002. - V. 109, № 10.-P. 1291-1302.

334. Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells / D. Campard et al. // Gastroenterology. 2008. - V. 134, №3.-P. 833-848.

335. Nerves and perisinusoidal cells in human liver / P. Bioulac-Sage et al. // J. Hepatol.-1990.-V. 10.-P.105-112.

336. Nitou M. Immunohistochemical analisys of development of desmin-positive hepatic stellate cells in mouse liver / M. Nitou, K. Ishikawa, N.J. Shiojiri // Anat. 2000. - V. 197. - P. 635-646.

337. No Contribution of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells to Liver Regeneration in a Rat Model of Prolonged Hepatic Injury / F.C. Popp et al. // Stem Cells. 2007. - V. 25. - P. 639-645.

338. Nonaka H. Serial analysis of gene expression in sinusoidal endothelial cells from normal and injured mouse liver / H. Nonaka, S. Sugano, A. Miyajima // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 324. - P. 15-24.

339. Notch receptor expression in adult human liver: a possible role in bile duct formation and hepatic neovascularization / S.S. Nijjar et al. // Hepatology. -2001.-V. 34.-P. 1184-1192.

340. Novel cellular markers advance insights into the identity of hepatic progenitor/oval cells / M.I. Yovchev et al. // Hepatology. 2006. - V. 44. - P. 475A.

341. Occurrence of oval cell in hepatitis B virus associated human hepatocarcinogenesis / C.C. Hsia et al. // Hepatology. 1992. - V. 67. - P. 427433.355.0ertel M. Stem cells, cell transplantation and liver repopulation / M. Oertel,

342. D.A. Shafritz // Biochim. Biophys. Acta. 2008. - V. 1782, № 2. - P. 61-74. 356. Origin and characterization of a human bipotent liver progenitor cell line / R. Parent et al. // Gastroenterology. - 2004. - V. 126, № 4. - P. 1147-1156.

343. Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity / K.N. Lowes et al. // Am. J. Pathol. 1999. - V. 154, № 2. - P. 537541.

344. Paracrine signals from mesenchymal cell populations govern the expansion and differentiation of human hepatic stem cells to adult liver fates / Y. Wang et al. // Hepatology. 2010. - V. 52, № 4. - P. 1443-1454.

345. Partial cloning of rat CD34 cDNA and expression during stem cell-dependent liver regeneration in the adult rat / N. Omori et al. // Hepatology. 1997. - V. 26.-P. 720-727.

346. Participation of small intraportal stem cells in the restitutive response of the liver to portal necrosis induced by allyl alcohol / L. Yavorkovsky et al. // Hepatology. 1995.-V. 21.-P. 1702-1712.

347. Pattern of serum protein gene expression in mouse visceral yolk sac and foetal liver / R.R. Meehan et al. // EMBO J. 1984. - V. 3. - P. 1881-1885.

348. Peault B. Ontogenic emergence of a quail leukocyte/endothelium cell surface antigen / B. Peault, M. Coltey, N.M. le Douarin // Cell Differ. 1988. - V. 23. -P. 165-174.

349. Peroxidase cytochemistry and ultrastructure of Kupffer cells in the orthotopically transplanted liver grafts of rats / K. Kaneda et al. // Cells of the hepatic sinusoid / Rijswijk, 1989. V. 2. - P. 415-416.

350. Petersen B.E. Hepatic stem cells: coming full circle / B.E. Petersen // Blood Cells, Molecules, Diseases. 2001. - V. 27. - P. 590-600.

351. Petersen M. Induction of bile ducts in embryonic liver by mesenchyme: a new perspective for the treatment of biliary atresia / M. Petersen, U. Drews, P. Schweizwr // Eur. J. Pediatr. Surg. 2001. - V. 11, № 6. - P. 382-390.

352. Petrovic L.M. Hepatic sinusoidal endothelium: Ulex lectin binding / L.M. Petrovic, A. Burroughs, P.J. Scheuer // Histopatology. 1989. - V. 14. - P. 233243.

353. Pino R.M. The development of the sinusoids of fetal rat liver: localization of endogenous peroxidase in fetal Kupffer cells / R.M. Pino, P.W. Bankston // J. Histochem. Cytochem. 1979. - V. 27, № 2. - P. 643-652.

354. Pleiotrophin/heparin-binding growth-associated molecule as a mitogen of rat hepatocytes and its role in regeneration and development of liver / K. Asahina et al. // Am. J. Pathol. 2002. - V. 160. - P. 2191-2205.

355. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow / Y. Jianget al. // Nature. 2002. - V. 418, № 6893. - P. 41-49.

356. Procollagen expression by nonparenchimal cells in experimental biliary fibrosis / S. Milani et al. // Gastroenterology. 1990. - V. 98. - P. 175-184.

357. Proliferation and differentiation of fetal liver epithelial progenitor cells after transplantation into adult rat liver / M.D. Dabeva et al. // Am. J. Pathol. 2000. -V. 156.-P. 2017-2031.

358. Proliferation and hepatic differentiation of adult-derived progenitor cells / J. Wang et al. // Cells Tissues Organs. 2003. - V. 173. - P. 193-203.

359. Purification and characterization of mouse fetal liver epithelial cells with high in vivo repopulation capacity / D. Nierhoff et al. // Hepatology. 2005. - V. 42. -P. 130-139.

360. Purification and partial characterization of hepatocyte growth factor from plasma of a patient with fulminant hepatic failure / E. Gohda et al. // J. Clin. Invest. -1988. -V. 81.-P. 414-419.

361. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo / E. Lagasse et al. //Nat. Med. -2000. V. 6, № 11.-P. 1229-1234.

362. Pusztaszeri M.P. Immunohistochemical Expression of Endothelial Markers CD31, CD34, von Willebrand Factor, and Fli-1 in Normal Human Tissues / M.P. Pusztaszeri, W. Seelentag, F.T. Bosman // J. Histochem. Cytochem. 2006. - V. 54,№4.-P. 385-395.

363. Quantitative analysis of the perisinusoidal cells and macrophage response to acetaminophen-induced liver inury / J. Mathew et al. // Molecular and cell biology of liver fibrogenesis. Lancaster: MTP Press, 1992. - P. 358-360.

364. Ramadori G. Mesenchymal cells in the liver one cell type or two? / G. Ramadori, B. Saile // Liver. - 2002. - V. 22. - P. 283-294.

365. Ramadori G. The stellate cell (Ito cell, fat-storing cell, lipocyte, perisinusoidal cell) of the liver / G. Ramadori // Virchows. Arch. B Cell Pathol. 1991. - V. 91. -P. 147-158.

366. Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes in vitro / X.-Q. Kang et al. // World J. Gastroenterol. 2005. - V. 11, № 22. - P. 34793484.

367. Rat hepatic lipocytes synthesize and secrete transin (stromelysin) in early primary culture / S.K. Vyas et al. // Gastroenterology. 1995. - V. 109. - P. 889-898.

368. Rat myofibroblasts and hepatic stellate cells: different cell population of the fibroblast lineage with fibrogenic potential / T. Knittel et al. // Gastroenterology. 1999. -V. 117.-P. 1205-1221.

369. Recent advances in the isolation of liver cells / G. Alpini et al. // Hepatology. -1994.-V. 20.-P. 494-514.

370. Reciprocal modulation of matrix metalloproteinase-13 and type I collagen genes in rat hepatic stellate cells / B. Schaefer et al. // Am. J. Pathol. 2003. - V. 162. -P. 1771-1780.

371. Regulated expression of the murine fit-1 gene during embryogenesis suggests a role in the establishment of vascular endothelium / G.H. Fong et al. // Dev. Dyn. 1996. - V. 207.-P. 1-10.

372. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR / M.A. Passino et al. // Science. 2007. - V. 315. - P. 1853-1856.

373. Relationship between vascular development and vascular differentiation during liver organogenesis in human / G. Gouysse et al. // J. of Hepatology. 2002. -V. 37. - P. 730-740.

374. Release of osmolytes from perfused rat liver on perivascular nerve stimulation: alpha-adrenergic control of osmolyte efflux from parenchymal and nonparenchymal liver cells / S. Vom Dahl et al. // Hepatology. 1999. - V. 1. -P. 195-204.

375. Remarkable heterogeneity displayed by oval cells in rat and mouse models of stem cell-mediated liver regeneration / P. Jelnes et al. // Hepatology. 2007. -V. 45, №6.-P. 1462-1470.

376. Repopulation of athymic mouse liver by cryopreserved early human fetal hepatoblasts / D. Mahieu-Caputo et al. // Hum. Gene Ther. 2004. - V. 15, № 12.-P. 1219-1228.

377. Risau W. Mechanisms of angiogenesis / W. Risau // Nature. 1997. - V. 386. -P. 671-674.

378. Role for integrin-linked kinase in mediating tubular epithelial to mesenchymal transition and renal interstitial fibrogenesis / Y. Li et al. // J. Clin. Invest. 2003. -V. 112.-P. 503-516.

379. Role of hepatic stellate cell/hepatocyte interaction and activation of hepatic stellate cells in the early phase of liver regeneration in the rat / A. Mabuchi et al. // J. Hepatol. 2004. - V. 40, № 6. - P. 910-916.

380. Roles of growth factors and of tumor necrosis factor-a on liver cell proliferation induced in rats by lead nitrate / H. Shinozuka et al. // Lab. Invest. 1994. - V. 71, № 1. - P. 35-41.

381. Roskams T. Embryology of Extra- and Intrahepatic Bile Ducts, the Ductal Plate / T. Roskams, V. Desmet // The Anatomical Record. 2008. - V. 291. - P. 628635.

382. Sasaki K. Haemopoietic cells of yolk sac and liver in the mouse embryo: a light and electron microscopical study / K. Sasaki, G. Matsumura // J. Anat. 1986. -V. 148.-P. 87-97.

383. Sasse D. Liver architecture / D. Sasse, U.M. Spornitz, I.P. Maly // Enzyme.1992.-V. 46.-P. 8-32.

384. Sawitza I. The niche of stellate cells within rat liver / I. Sawitza, C. Kordes, D. Hausinger // Hepatology. 2009. - V. 50. - P. 1617-1624.

385. Scatter factor and hepatocyte growth factor are indistinguishable ligands for the MET receptor / L. Naldini et al. // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 2867-2878.

386. Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development / C. Schmidt et al. // Nature. 1995. - V. 373. - P. 699-702.

387. Scavenger functions of the liver endothelial cell / B. Smedsrod et al. // Biochem. J. 1990. -V. 266. - P. 313-327.

388. Schafer S. The synthesis of proteoglicans in fat storing cells of rat liver / S. Schafer, O. Zerbe, A.M. Gressner // Hepatology. 1987. - V. 7. - P. 680-687.

389. Schmelzer E. The phenotypes of pluripotent human hepatic progenitors / E. Schmelzer, E. Wauthier, L.M. Reid // Stem Cells. 2006. - V. 24, № 8. - P. 1852-1858.

390. Scoazec J.-Y. Both macrophages and endothelial cells of the human hepatic sinusoid express the CD4 molecule, a receptor for the human immunodeficiency virus // J.-Y. Scoazec, G. Feldmann // Hepatology. 1990. - V. 12. - P. 505-510.

391. Scoazec J.-Y. In situ immunophenotyping study of endothelial cells of the human hepatic sinusoid: results and functional implications / J.-Y. Scoazec, G. Feldmann//Hepatology.- 1991.-V. 14.-P. 789-797.

392. Scoazec J.-Y. The cell adhesion molecules of hepatic sinusoidal endothelial cells / J.-Y. Scoazec, G. Feldmann // Hepatol. 1994. - V. 20. - P. 296-300.

393. Secretion of 72 kDa type IV collagenase/gelatinase by cultured human lipocytes. Analysis of gene expression, protein synthesis and proteinase activity / M.J. Arthur et al. // Biochem. J. 1992. - V. 287. - P. 701-707.

394. Sell S. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma / S. Sell, H.A. Dunsford // Am. J. Pathol. 1989. - V. 134, №6.-P. 1347-1363.

395. Sell S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells / S. Sell // Hepatology. 2001. - V. 33. - P. 738-750.

396. Sell S. Is there a liver stem cell? / S. Sell // Cancer Res. 1990. - V. 50. - P. 3811-3815.

397. Semba R. Digestive system / R. Semba, O. Tanaka, T. Tanimura // Atlas of Human Prenatal Histology / Tokio: Igaki-Shoin, 1983. P. 171-234.

398. Septum transversum-derived mesothelium gives rise to hepatic stellate cells and perivascular mesenchymal cells in developing mouse liver / K. Asahina et al. // Hepatology. 2011. - V. 53, № 3. - P. 983-995.

399. Sergi C. Contribution of apoptosis and apoptosis-related proteins to the malformation of the primitive intrahepatic biliary system in Meckel syndrome / C.

400. Sergi, P. Kahl, H.F. Otto // Am. J. Pathol. 2000. - V. 156. - P. 1589-1598.

401. Serial transplantation reveals the stem-cell-like regenerative potential of adult mouse hepatocytes / K. Overturf et al. // Am. J. Pathol. 1997. - V. 151. - P. 1273-1280.

402. Shah K.D. Development of intrahepatic bile ducts in humans / K.D. Shah, M.A. Gerber // Arch. Pathol. Lab. Med. 1989. - V. 113. - P. 1135-1138.

403. Shah K.D. Development of intrahepatic bile ducts in humans: possible role of laminin / K.D. Shah, M.A. Gerber // Arch. Pathol. Lab. Med. 1990. - V. 114. -P. 597-600.

404. Shiojiri N. Cell lineages and oval cell progenitors in rat liver development / N. Shiojiri, J.M. Lemire, N. Fausto // Cancer Res. 1991. - V. 51. - P. 2611-2620.

405. Shiojiri N. Preferential differentiation of the bile ducts along the portal vein in the development of mouse liver / N. Shiojiri, Y. Nagai // Anat. Embryol. (Berl.). -1992.-V. 185.-P. 17-24.

406. Shiojiri N. Secondary joining of the bile ducts during the hepatogenesis of the mouse embryo / N. Shiojiri, H. Katayama // Anat. Embryol. 1987. - V. 177. - P. 153-163.

407. Shiojiri N. Transient expression of bile-duct-specific cytokeratin in fetal mouse hepatocytes / N. Shiojiri // Cell Tissue. Res. 1994. - V. 278. - P. 117-123.

408. Shiojiry N. Enzyme immunocytochemical analyses of the differentiation of liver cells in prenatal mouse / N. Shiojiry // J. Embryol. Exp. Morphol. 1981. - V. 62. -P. 139-152.

409. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from the bone marrow / Y. Katayama et al. // Cell. 2006. - V. 124. - P. 407-421.

410. Sleyster E.C. Relation between localization and function of rat liver Kupffer cells / E.C. Sleyster, D.L. Knook // Lab. Invest. 1982. - V. 47. - P. 484-490.

411. Slott P.A. Origin, pattern, and mechanism of bile duct proliferation following biliary obstruction in the rat / P.A. Slott, M.H. Liu, N. Tavoloni // Gastroenterology. 1990. - V. 99, № 2. - P. 466-477.

412. Sosa-Pineda B. Hepatocyte migration during liver development requires Proxl / B. Sosa-Pineda, J.T. Wigle, G. Oliver // Nat. Genet. 2000. - V. 25. - P. 254-255.

413. Spatiotemporal expression of angiogenesis growth factor receptors during the revascularization of regenerating rat liver / M.A. Ross et al. // Hepatology. -2001.-V. 34.-P. 1135-1148.

414. Specialization switch in differentiating embryonic rat liver progenitor cells in responce to sodium butirate / M.J. Blouin et al. // Exp. Cell Res. 1995. - V. 217, № l.-P. 22-30.

415. Stabilin-1 and -2 constitute a novel family of fasciclin-like hyaluronan receptor homologues / O. Politz et al. // Biochem. J. 2002. - V. 362. - P. 155-164.

416. Stabilin-1 and stabilin-2 are both directed into the early endocytic pathway in hepatic sinusoidal endothelium via interactions with clathrin/AP-2, independent of ligand binding / B. Hansen et al. // Exp. Cell Res. 2005. - V. 303, № 1. - P. 160-173.

417. Stainier D.Y. A glimpse into the molecular entrails of endoderm formation / D.Y. Stainier // Genes. Dev. 2002. - V. 16. - P. 893-907.

418. Stan R.V. PV-1 is a component of the fenestral and stomatal diaphragms in fenestrated endothelia / R.V. Stan, M. Kubitza, G.E. Palade // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 13203-13207.

419. Stem cell properties and repopulation of the rat liver by fetal liver epithelial progenitor cells / J.S. Sandhu et al. // Am. J. Pathol. 2001. - V. 159. - P. 13231334.

420. Stosiec P. Expression of cytokeratin 19 during human liver organogenesis / P. Stosiec, M. Kasper, U. Karsten // Liver. 1990. - V. 10. - P. 59-63.

421. Strick-Marchand H. Inducible differentiation and morphogenesis of bipotential liver cell lines from wild-type mouse embryos / H. Strick-Marchand, M.C. Weiss // Hepatology. 2002. - V. 36. - P. 794-804.

422. Sundberg U. The cytoplasmic domain of CEACAM1-L controls its lateral localization and the organization of desmosomes in polarized epithelial cells / U. Sundberg, N. Beauchemin, B. Obrink // J. Cell Sci. 2004. - V. 117. - P. 10911104.

423. Suppression of C/EBP alpha expression in biliary cell differentiation from hepatoblasts during mouse liver development / N. Shiojiri et al. // J. Hepatol. -2004.-V. 41.-P. 790-798.

424. Suskind D.L. Searching for common stem cells of the hepatic and hematopoietic systems in the human fetal liver: CD34+ cytokeratin 7/8+ cells express markers for stellate cells / D.L. Suskind, M.O. Muench // J. Hepatol. 2004. - V. 40, № 2. -P. 261-268.

425. Systemic infusion of FLK1+ mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice / B. Fang et al. // Transplantation.2004.-V. 78.-P. 83-88.

426. Tam P.P. Early endoderm development in vertebrates: lineage differentiation and morphogenetic function / P.P. Tam, M. Kanai-Azuma, Y. Kanai // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. - V. 13. - P. 393-400.

427. Tan C.E. New clues for the developing human biliary system at the porta hepatic / C.E. Tan, V.J. Vijayan // Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2001. - V. 8, № 4. - P. 295-302.

428. Tanimizu N. Notch signaling controls hepatoblast differentiation by altering the expression of liver-enriched transcription factors / N. Tanimizu, A. Miyajima // J. Cell Sci. 2004. - V. 117. - P. 3165-7314.

429. Tavassoli M. Embryonic and fetal hemopoiesis: an overview / M. Tavassoli // Blood Cells.-1991.-V. 11.-P. 269-291.

430. Tenascin gene expression in rat liver and in rat liver cells: in vivo and in vitro studies / G. Ramadori et al. // Virchows Arch. B Cell Pathol. 1991. - V. 60. -P. 145-153.

431. Tenascin: an extracellulare matrix protein involved in tissue interactions during fetal development and oncogenesis / R. Chiquet-Ehrismann et al. // Cell. 1986. -V. 47.-P. 131-139.

432. Terada T. Development of human peribiliary capillary plexus: a lectin-histochemical and immunohistochemical study / T. Terada, Y. Nakanuma // Hepatology. 1993. - V. 18. - P. 529-536.

433. Terada T. Expression of transforming growth factor-a and its receptor in human liver deelopment and maturation / T. Terada, T. Ohta, Y. Nakamura // Virchows Archiv. 1994. - V. 424. - P. 669-675.

434. Terada T. Normal and abnormal development of the human intrahepatic biliary system: a review / T. Terada et al. . // J. Exp. Med. 1997. - V. 181. - P. 19-32.

435. Terada, T. Detection of apoptosis and expression of apoptosis-related proteins during human intrahepatic bile duct development / T. Terada, Y. Nakanuma // Am. J. Pathol. 1995. V. 146. - P. 67-74.

436. Terada, T. Expression of tenascin, type IV collagen and laminin during human intrahepatic bile duct development and in intrahepatic cholangiocarcinoma / T. Terada, Y. Nakanuma // Histopathology. 1994. - V. 25. - P. 143-150.

437. The antigen for Hep Par 1 antibody is the urea cycle enzyme carbamoyl phosphate synthetase 1 / S.L. Butler et al. // Lab. Invest. 2008. - V. 88, № 1. -P. 78-88.

438. The binding of thyroid transcription factor-1 and hepatocyte paraffin 1 to mitochondrial proteins in hepatocytes: a molecular and immunoelectron microscopic study / Y. Pang et al. // Am. J. Clin. Pathol. 2006. - V. 125, № 5. -P. 722-726.

439. The bone marrow functionally contributes to the liver fibrosis / F.P. Russo et al. // Gastroenterology. -2006. -V. 130. P. 1807-1821.

440. The canals of Hering and hepatic stem cells in humans / N.D. Theise et al. // Hepatology. 1999. -V. 30. - P. 1425-1433.

441. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood / A. Aiuti et al. // J. Exp. Med. 1997. -V. 185, № l.P. 111-120.

442. The correlation between portal myofibroblasts and development of intrahepatic bile ducts and arterial branches in human liver / L. Libbrecht et al. // Liver. -2002.-V. 22.-P. 252-258.

443. The development of the intrahepatic bile ducts in man: a keratin-immunohistochemical study / P. Van Eyken et al. // Hepatology. 1988. - V. 8. -P. 1586-1595.

444. The gene of hepatocyte growth factor is expressed in fat-storing cell of rat liver and is downregulated during cell growth and by transforming growth factor-J3 / G. Ramadori et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 183, № 2. - P. 739-742.

445. The homeobox gene Hex is required in definitive endodermal tissues for normal forebrain, liver and thyroid formation / J.P. Martinez Barbera et al. // Development. 2000. - V. 127. - P. 2433-2445.

446. The homeobox transcription factor Proxl is highly conserved in embryonic hepatoblasts and in adult and transformed hepatocytes, but is absent from bile duct epithelium / J. Dudas et al. // Anat. Embryol. (Berl.). 2004. - V. 208. - P. 359366.

447. The initiation of liver development is dependent on Foxa transcription factors / C.S. Lee et al. // Nature. 2005. - V. 435. - P. 944-947.

448. The liver as a stem cell and lineage system / S.H. Sigal et al. // Am. J. Physiol. 1992. -V. 263. - P. G139-G148.

449. The met proto-oncogene mesenchymal to epithelial cell conversion / I. Tsarfaty et al. // Science. 1994. -V. 263. -P. 98-101.

450. The molecular characterization of the fetal stem cell marker AA4 / O. Petrenko et al. // Immunity. 1999. - V. 10. - P. 691-700.

451. The mouse Forkhead Box ml transcription factor is essential for hepatoblast mitosis and development of intrahepatic bile ducts and vessels during liver morphogenesis / K. Krupczak-Hollis et al. // Dev. Biol. 2004. - V. 276. - P. 74-88.

452. The onecut transcription factor HNF6 is required for normal development of the biliary tract / F. Clotman et al. // Development. 2002. - V. 129, № 8. - P.1819-1828.

453. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells / X. Wang et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-V. 100 (suppl. 1).-P. 11881-11888.

454. The presence of hepatocyte growth factor in the developing rat / M.C. Defrances et al. // Development. 1992. - V. 116. - P. 387-95.

455. The role of bipotential progenitor cells in liver ontogenesis and neoplasia / N. Marceau et al. // The Role of Cell Types in Hepatocarcinogenesis / A.E. Sirica editor. Boca Raton, FL: CRC Press; 1992. - P. 121-149.

456. The role of Ito cells in the biosynthesis of HGF-SF in the liver / P. Schirmacher et al. // EXS. 1993. - V. 65. - P. 285-299.

457. The role of Notch receptor expression in bile duct development and disease / D.M. Flynn et al. // J. Pathol. 2004. - V. 204, № 1. - P. 55-64.

458. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts / Y. Kodama et al. // Gastroenterology. 2004. V. 127. - P. 1775-1786.

459. The sources of parenchymal regeneration after chronic hepatocellular liver injury in mice / P. Vig et al. // Hepatology. 2006. - V. 43. - P. 316-324.

460. The structural and functional differentiation of sinusoidal endothelial cells during liver organogenesis in humans / A. Couvelard et al. // Blood. 1996. - V. 87.-P. 4568-4580.

461. The transcription factor HNF3beta is required in visceral endoderm for normal primitive streak morphogenesis / D. Dufort et al. // Development. 1998. - V. 125.-P. 3015-3025.

462. Theaker J.M. Alpha-1-antitrypsin and the liver: a routine immunohistological screen / J.M. Theaker, K.A. Fleming // J. Clin. Pathol. 1986. - V. 39. - P. 58-62.

463. Theise N.D. Liver stem cells: prospects for treatment of inherited and acquired liver diseases / N.D. Theise // Expert. Opin. Biol. 2003. - V. 3. - P. 403-408.

464. Therapeutic effect of transplanting HGF-treated bone marrow mesenchymal cells into CC14-injured rats / S. Oyagi et al. // J. Hepatol. 2006. - V. 44, № 4. -P. 742-748.

465. Thorgeirsson S. Hematopoietic cells as liver epithelial stem cells: a critical review of all the evidence / S. Thorgeirsson, J. Grisham // Hepatology. 2006. -V. 43.-P. 2-11.

466. Thyl-positive mesenchymal cells promote the maturation of CD49f-positive hepatic progenitor cells in the mouse fetal liver / T. Hoppo et al. // Hepatology. -2004.-V. 39.-P. 1362-1370.

467. Transcription factors in liver development, differentiation, and regeneration / R.H. Costa et al. // Hepatology. 2003. - V. 38. - P. 1331-1347.

468. Transplantation of bone marrow cells reduces CC14-induced liver fibrosis in mice /1. Sakaida et al. // Hepatology. 2004. - V. 40. - P. 1304-1311.

469. Tsutsumi M. Characterization of desmin-positive rat liver sinusoidal cells / M. Tsutsumi, A. Takada, S. Takase // Hepatology. 1987. - V. 7. - P. 277-284.

470. Van Eyken P. Intrahepatic bile duct development in the rat / P. Van Eyken, R. Sciot, V. Desmet // Lab. Invest. 1988. - V. 59. - P. 52-59.

471. Van Eyken P. Cytokeratins and the liver / P. Van Eyken, V. Desmet // Liver. -1993.-V. 13.-P. 113-122.

472. Vascular endothelial growth factor increases fenestral permeability in hepatic sinusoidal endothelial cells / H. Yokomori et al. // Liver Int. 2003. - V. 23. -P. 467-475.

473. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells / J. Funyu et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. -V. 280. - P. 481-485.

474. Vessey C.J. Hepatic stem cells: a review / C.J. Vessey, P.M. de la Hall // Pathology. 2001. - V. 33. - P. 130-141.

475. Wagers A.J. Cell fate determination from stem cells / A.J. Wagers, J.L. Christensen, I.L. Weissman // Gene Ther. 2002. - V. 9. - P. 606-612.

476. Wake K. "Sternzellen" in the liver: perisinusoidal cells with special reference to storage of vitamin A / K. Wake // Am. J. Anat. 1971. - V. 132, № 4. - P. 429462.

477. Wake K. Intralobular heterogenety of perisinusoidal stellate cells in porcine liver / K. Wake, T. Sato // Cell Tissue Res. 1993. - V. 273. - P. 227-237.

478. Wake K. Postnatal development of the perisinusoidal stellate cells in the rat liver / K. Wake, K. Motomatsu, W. Ekataksin // Cells of the Hepatic Sinusoid / ed. E. Wisse, D.L. Knook, R.S. McCuskey. Leiden: Kupffer Cell Foundation, 1991. -P. 269-275.

479. Walkup M.H. Hepatic stem eels: in search of / M.H. Walkup, D.A. Gerber //

480. Stem cells. 2006. - V. 24. P. 1833-1840.

481. Watt F.M.Out of Eden: stem cells and their niches / F.M. Watt, B.L. Hogan // Science. 2000. - V. 287. - P. 1427-1430.

482. Wells J.M. Vertebrate endoderm development / J.M. Wells, D.A. Melton // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - V. 15. - P. 393-410.

483. Whetton A.D. Homing and mobilization in the stem cell niche / A.D. Whetton, G.J. Graham // Trends Cell Biol. 1999. - V. 9. - P. 233-238.

484. Willier H. Developmental relations of the heart and liver in chorioallantoic grafts of whole chick blastoderms / H. Willier, M.E. Rawles // Anat. Rec. 1931. - V. 48.-P. 277-301.

485. Wilson J.W. Role of cholangites in restoration of the liver of the mouse after dietary injury / J.W. Wilson, E.H. Leduc // J. Pathol. Bacteriol. 1958. - V. 76. - 1 P. 441-449.

486. Wisse E. Ultrastructure anf function of Kupffer cells and other sinusoidal cells in the liver / E. Wisse // Kupffer cells and other sinusoidal cells / Amsterdam, 1977. J -P. 33-60.

487. Wnt impacts growth and differentiation in ex vivo liver development / S.Z. Hussain et al. // Exp. Cell Res. 2004. - V. 292. - P. 157-169.

488. Zaret K.S. Liver specification and early morphogenesis / K.S. Zaret // Mech. Dev. 2000. - V. 92. - P. 83-88.

489. Zaret K.S. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis / K.S. Zaret // Nat. Rev. Genet. 2002. - V. 3. - P. 499-512.

490. Zhang Y. Hepatic stem cells: existence and origin / Y. Zhang, X.F. Bai, C.X. Huang // World J. Gastroenterol. 2003. - V. 9, № 2. - P. 201-204.

491. Zhao R. Embryonic development of the liver / R. Zhao, S.A. Duncan // Hepatology. 2005. - V. 41. - P. 956-967.

Информация о работе

Гумерова, Аниса Азатовна
доктора медицинских наук
Казань, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Гисто- и цитогенез печени человека и крысы в ходе пренатального развития и репаративной регенерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы