Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов"

РОССИЙСКИЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Д. И. МЕНДЕЛЕЕВА

ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ БИОМАССЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ .

(спец!1альность 03.00.23.- биотекнодогия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химическия

наук

На правах рукописи

Красноштанова Алла Альбертовна

МОСКВА-1995

Работа выполнена в Российском химико- технологическом университете им.Д.И.Менделеева.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Крылов Игорь Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, ведущий научный сотрудник РосНИИ культурного и природного наследия Мин-культуры и РАН Безруков Михаил Георгиевич, кандидат химических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией ИПВ РАН Латов Владимир Константинович.

Ведущая организация: Государственный Научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (г.Москва, Б. Коммунистическая, 27)

Защита состоится 3 и¡ОТж^Ь^С' 1995 г. в часов на заседании ИИОСй"Ci »Ц г сГУ-.2Д 053.З^/J, в Рос-, списком химико-технологическом университете щг. Д.И.Менделеева по адресу: Москва, Миусская пл., д.9.

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке РХТУ им. Д.И.Менделеева

Автореферат разослан Clfjbot 1395 г.

Ученый секретарь дшссертцционного совета Д 053.34.13, к.б.к.

Актуальность темы: Интенсивное развитие биотехнологии в России позволило создать крупнотоннажное производство кормового белка путем культивирования дрожжей и бактерий на различных субстратах. В современных условиях производство подобного рода продукции стало нерентабельным. Особенностью заводов по производству кормового белка является то, что технологии биосинтеза и последующего выделения микробной биомассы связаны с переработкой больших объемов водных суспензий. Поэтому, представляется целесообразным разработать схемы комплексной переработки микробного сырья с применением водных или водно-солевых экстрагентов. Получаемые при этом дополнительные продукты могут повысить рентабельность основного производства, а имеющиеся стоки стоки будут утилизированы в имеющемся технологическом процессе. Мы разработали один из вариантов технологии продуктов белково-пептидной и аминокислотной природы после предварительной денуклеивиэацип микробного сырья.

Дедьи настоящей работы явилось изучение и количественное описание процессов экстракции и гидролиза белковых веществ из биомассы промышленных микроорганизмов, создание математической модели и разработка научных основ технологий белковых гидролиэатов, имеющих - различную степень гид, олиза.

В задачи работы входило: 1. исследование количественных закономерностей процесса экстракции и гидролиза белковых веществ де-нуклеинизированной биомассы дрожяей и бактерий с применением растворов минеральных кислот и технических ферментов (протосубтилинэ и комплекса протеолитических ферментов поджелудочной железы); 2.построение на основе этих данных математической модели этих процессов;

2. разработка возможных схем получения белковых гидролиэатов и оценка качества получаемых белковых гидролиэатов как технических

продуктов.

Научная новизна, впервые проведено количественное . изучение процессов экстракции я гидролиза белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов под действием водных растворов минеральных кислот и технических ферментов (протосубтилина и комплекса протео- -

литических ферментов поджелудочной железы) и созданы их математические "одели.

Впервые показана возможность применения белковых гидролиэатов

для выделения драгоценных и полудрагоценных металлов (на примере золота и серебра) из низкоконцентрированного сырья и отходов.

• Практическая значимость : на основе разработанной математической модели предложен алгоритм управления процессами> экстракции и гидролиза белковых веществ, способный обеспечить их проведение в оптимальных условиях. Разработаны осноеы технологии получения очищенных белковых гидролигатов и их возможного применения'в процессе электрохимического выделения драгоценных и полудрагоценных металлов из низкосортного сырья.

Апробация работы: отдельные материалы работы были представлены на конференциях:

1. "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (24-25 сентября 1992 г.)

2."Химия и технология лекарственных веществ" (28-30 июня 1994г.) Публикации: по материалом работы опубликованы 4 статьи (3 - в печати) и подана одна авторская заявка на патент РФ.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на стр. машинописного текста, проиллюстирована io таблицами и VI рисунками. Библиография включает íbo наименований работ, из них ÍS на иностранных языках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Материалы и методы

В работе использовали: 1) стендовые кулмгуры парафинутилизи-рующих дрожжей p.Candida maltoza ВСБ-889 и метанутилизирущих бак-, терий Metylococcus capsulatus ВСВ-874; 2) аапрт Светлоярского и Кстовского заводов БЕК, отвечающий требованиям ГОСТ 2873-89; -3) промышленную' биомассу нативных клеток бактерий, выращенных на природном газе в условиях ОПУ Светлоярского еаьода ЕВК со степенью доминирования основного штамма Metylococcus capsulatus ВСБ-874 не ниже 70Х;

Есэ виды указанных биомасс на предварительном этале исследований обрабатывали горячими водными и водно-солеЕыми растворами в условиях, обеспечивающих 957.-нее извлечение РНК из клеток. Подготовленные таким образов микробные клетки являлись объектом исследования в данной работе и рассматривались как самостоятельный источник белковых веществ.

Общее количество азотсодержащих веществ определяли микрометодом Кьельдаля. Содержание белковых веществ определяли модифицированным методом Лоури с предварительным осаждением низкомолекулярных фракций 507.-ной трихлоруксусной кислотой. .Содержание шинного

азота определяли по реакции с ниягидриновым реагентом. Содержание нуклеиновых кислот определяли по методу А.С.Спирина. Определениз свободного аммиака проводили по методу Конвея. Количество углеводов оценивали- фенол-серным методом.

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки "Specord М-40". В работе использовали данные хроматографии низкого давления (гель-фильтрацию) на сефадексах G-10 - G-100, откалиброванных по белковым маркерам. Для определения аминокислотного состава Седковых препаратов использовали анализатор ыаркЯ "Classic" фирмы "Biotronic" (ФРГ).

Эксперименты по гидролигу и экстракции белкоЕых веществ проводили в лабораторном реакторе, изготовленном иэ нержавеющей стали со вставным цилиндрическим стеклянным вкладышем объемом до 1 л, снаб> нным рубашкой для обогрева из термостата, . гильзой для ртутного термометра,манометром, нижним и верхним пробоотборником, магнитной мешалкой.

Все экспериментальные данные по кинетике экстракции и гидролига белковых веществ обрабатывали по традиционной схеме, состоящей из дифференцирования кривых с определением начальных скоростей, их численного . тегрирования модифицированным методом Эйлера или Рунге-Кута 4-го порядка с' последующей оптимизацией параметров по стандартным программам для ЭВМ. 2. Результаты и их обсуддекие

Анализ литературных данных показывает, что технологии получения белковых веществ иг микроорганизмов могут быть основаны на одной из двух технологических схем переработки микробного сырья. Первая из них предусматривает химический или энзиматический гидролиз всех биополимеров клетки, в том числе и белковых веществ. Вторая - предварительное выделение относительно крупных белковых молекул. По первой схеме получают белковые гидролизаты, подвергаемые в дальнейшем различной степени очистки от сопутствующих примесей, например, очищенные смеси аминокислот автолизом дрожжей или их ферментоливом. Их характеризует относительно простое оформление стадии гидролиза белковых веществ и последующая многостадийная очистка от сопутствующих примесей различной природы. По второй схеме относительно простыми технологическими приема»,™ получают в качестве промежуточного продукта очищенный белковый изолят, который ь последующем легко переработать в ту же очищенную смесь аминокислот. В этом случае более просто реализуется схема комплексного использования микробного сырья, а образующиеся стоки со стадии

экстракции белковых веществ возможно утилизировать в производстве кормовой биомассы. Преимущество данного подхода становится еще более очевидным, если проведение процесса автолиза невозможно. Положительный эффект при реализации данного подхода сильно зависит от. условии, обеспечивавших максимальный выход гидролизованных микробных биополимеров. Поэтому важно знать оптимальные условия выделения последних из микробных клеток. Исследование этой стадии в работе было уделено основное внимание.- ■

Среди возможных способов обработки микробных клеток мы выбрали экстракцию белковых веществ водными растворами минеральных кислот и техническими ферментами, имеющими наибольшее практическое значение.'

1 2-1-Гидролиз белковых веществ биомассы проммдлеяних мик рооргаюя-мов водными растворами минеральны» кислот. Количественные закономерности процесса.

На рис.1 приведены типичные кривые экстракции белковых веществ из денуклеинизированных клеток дрожжей при-обработке их сернокислотным экстрагентом. С точки зрения выделения белковых веществ наибольший интерес представляет ход кривой накопления их высокомолекулярных фракций, имеющей экстремальный характер. Величину и положение максимума во времени в зависимости от • условий обработки клеток мы попытались найти в результате изучения кинетики процесса.

Поскольку учесть индивидуальные особенности поведения внут-. риклеточных белковых структур при экстракции очень сложно, то на первом этапе исследований была поставлена задача изучить кинетику гидролиза их различных фракций на примере изолированных "глобулинов " и альбуминов. Для разработки возможного подхода к решению этой задачи на предварительном этапе была исследована кинетика гидролиза "модельного" белка -■ бычьего сывороточного альбумина (БСА). Типичный вид соответствующей кривой приведен на рис.2. Более подробное исследование кинетики данного процесса показало, что скорость гидролиза БСА не зависит от его начальной концентрации в среде, что свидетельствует о наличии 1-го порядка по данному реагенту.

Полученные данные по влиянию температуры и концентрации кислоты на скорость процесса были, использованы для разработки математической модели. Количественный анализ возможных схем последовательно-параллельных превращений, соответствующих 1-му порядку, показал, что кинетика гидролиза БСА может быть - описана следующими

стадиями:

ка .

Р0 -- ¿1

¿кго 1кп (1), где:

РРо(ДАо) РР1(АА1)

Ро_ концентрация исходного белка, - концентрация частично гид-ролизованных высокомолекулярных полипептидов, РРо н РР1 - концентрация низкомолекулярных пептидов, ААо и ААг - концентрация аминно-го згохз. -

На предварительном этапе исследований для каждой кинетической кривой какодили численное гначение константы (каФ1,) в схеме преврати чий (1), которые в дальнейшем использовали для нахождения их свясл с концентрацией и температурой гидролизующего агента. Влияние концентрации минеральной кислоты на скорость процесса устанавливали по уравнениям специфического кислотно-основного катализа:

кэ<м>1 - кгод/(1+ Кьа! Ьо) (2), где: Кьа - константа равновесия образующегося протонированного ко)тлек-сз; као " константа скорости его раг.пада в продукты гидродаг^а бвл-ка; .,о _ кислотность среды, создаваемая гидролизувщим агентом. Температурную завист .сть копстаг" чг^гтти, используя широкоизвестное уравнение Аррениуса.

В результате обработки в координатах 1/к&ФФ - 1/Ьо были получены линейные зависимости, отсекающее положительны)! о^рер^к на оси ординат, что в дальнейшем позволило оценить численные значения констант Кьа и као в схеме превращений (1). Исследование температурной зависимости констант в координатах 1п к£01 -1/Т (где I .абсолютная темйература) показало, что она имеет линейный характер, что позволило оценить значения энергий активацш (£4) и предэкспо-ненциах" ного множителя (Аси) для каждой из стадий в вкпеприведен-кой схеме. Установленные ка данном этапе значения параметров были использованы в 'качестве первого лрпбллйенил для их последующего уточнения в ходе оптимизации и нахождения доверительного интервала.

Следующим этапом исследований явилась проверка возможности

использования данной модели для снсання кислотного гидролиза изолированных белковых фракций дрожжей и бактерий.

Из рис.2 видно, что кривые гидролиза ВСА и дродстевых белков совпадают между собой, а кривые гидролиза белков бактерий также совпадают друг с другом, но лежат выше. Полученные экспериментальные данные показали, что процесс гидролиза микробных белков может

___от

Рис.1. Кривые накопления белковых веществ в экстракте при обработке денклеинизированных клеток дрожжей сернокислотным экстрагентом.

Условия: температура - 140°С, концентрация серной кислоты в среде - 0.30 моль/л (рН 1.7), содержание воздушно-сухого вещества в суспензии - 10* мае.

Здесь и далее Хр - доля высокомолекулярных фракций белковых веществ в экстракте, Хрр - доля низкоыолекулярных фракций белковых веществ в экстракте, Хдд- доля аминного агота в экстракте от содержания общего азота в исходной бипиягое, Хх- Хр + Хсо + Хм

Рис.2. Кривые гидролиза высокомолекулярных фракций БСА, отвечао-щие различным начальным концентрациям б елка в среде гид-ролиэующего агента. Температура - 90°С, концентрация серной кислоты - 1.0 М.

Условные обозначения - начальная концентрация белка в среде: - 2.0,*- 3.0,о- 4.0 а- 5.0Т. мае.

- изолированные белковые фракции дрожжей (2.0 Тмао.) ■ ■[• • изолированные белковые фракции бактерий (2.0 "мае.)

быть описан тзкже схемой превращений (1), при совпадающих между собой кинетических параметрах гидролиза дрожжевых белков и БСА, и отличающихся - для бактериальных. Объяснение полученному факту мы попытались найти в данных аминокислотного состава белковых фракций, для'которых известно существование легко- и трудногидролизуе-мых пептидных связей. К первым иг них относятся связи, образованные аспарагиковой кислотой, треонином и цистеином, ко вторым - валяном. Результаты анализа состава аминокислот показали, что белки дрсдяей и ЕСД очень близки между собой, а бедки, из бактерии отличаются более высоким содержанием езлннз. Р этом отношении и выделенная из реакционной массы смесь полипептидов, отвечающая интер-медиату, также характеризуется более еысокш содержанием валика по сравнен™ с исходными субстанциями. Была установлена линейная корреляция между константами кГо и кГ1 и их энергиями активации и долей легкогидролизуемых пептидных связей, входящих в состав исследованных белков.

На заключительном этапе исследования была разработана математическая модель процесса экстракции белковых веществ из микробных клеток. Для его описания использовали Еышеустановленную схему превращений (1) и уравнения связи эффективных констант с кислотностью среды и температурой. При этом в качестве гипотезы было принято предположение об отсутствии влияния свойств индивидуальных внутриклеточных белковых структур на скорость их извлечения в объем экстрагента.

На рис.3 показан типичный вид кинетических кривых, обеспечивающих повышенный еыход высокомолекулярных фракций белковых веществ, которые'отличает, З-образный характер и наличие точки перегиба функции Хр(Г). Последнее свидетельствует о наличии промежуточных превращений белков внутри клетки. Линейный характер зависимости в координатах ХР(Т), Хрр(£) указывает на наличие 2-х параллельных путей в превращении внутриклеточных белков в более низкомолекулярные структуры. Это позволяет представить процесс экстракции в виде следующей схемы превращений: кр кхр ка Ры -- Рь —Ро-" Р1 (3), где:

РР1_(ААО РРо(ААо) РР1(АА1)

Рц - концентрация исходной белковой структуры; Рр - концентрация внутриклеточного интермедизта, Ро, Р1 - концентрация промежуточных высокомолекулярных продуктов гидролиза, РРь и РРо, РР1- концентра-

ция низкомолекулярных продуктов гидролиза, ААо и АА*- концентрация аминного азота в объеме экстрагента.

Порядок обработки экспериментальных данных по кинетике экстракции по схеме превращений (3) сохранили таким же,' как и в случае схемы (1). При ее проведении использовали вышеустановленные для первой схемы превращений значения параметров, дополнительно осуществляя подбор только величин констант кр, кьр и кьрр, которые также уточняли при последующей оптимизации. :

По аналогии о исследованием процесса гидролиза индивидуальных белков находили значения параметров к-го. Кьа» Е и Ао для стадий экстракции белковых веществ.

Установленные значения параметров приведены ниже в таблице 1. Последние определяют математическую модель процесса. Чтобы проверить ее возможности были поставлены отдельные эксперименты по экстракции белковых веществ из дрожжей и бактерий в присутствии других зкстрагентов, в условиях, обеспечивающих максимальный выход высокомолекулярных фракций. Результаты такой проверки показали, что предложенная математическая модель дает хорошее совпадение между расчетными и экспериментальными значениями точек кинетических кривых, при этом была установлена возможность кислых зкстрагентов в отношении максимума выхода высокомолекулярной фракции белковых веществ. Для солянокислых и сернокислых растворов он составляет. 39-402, а для фосфорнокислых - 452.

2.2.Гидролиз белковых веществ биомасс промышленных микроорганизмов . под действием технического фермента протосубтилина ГЗа. Количественные закономерности процесса.

Порядок исследования особенностей поведения технических ферментов (на примере протосубтилина ГЗх) в экстракции микробных белков был сохранев тем же самым, что и при изучении воздействия кислотных зкстрагентов на внутриклеточные белковые структуры. На предварительном этапе проводили "Ьнализ кинетических закономерностей гидролиза БСА и изолированных белковых фракций. Ка рис.4 приведены кривые, гидролиза вышеуказанных белков и накопления низкомолекулярных продуктов. Полученные данные свидетельствуют о том, что при ферментативном воздействии на белки относительное положение кривых сохраняется таким'же, как и при кислотном гидролизе. Это позволило нам отказаться от исследований кинетики гидролиза БСА и перейти непосредственно к изучению кинетики гидролиза белковых фракций. В ходе такого исследования было установлено, что скорость

- -

Рис. ■

аг •

»го по___

Кринзл экстракции белковых веществ иг денуклепнигпг---заннсй биомассы дрожжей Условия экстракции: I . Ьо=0.11 моль/л (Н'гБС^'1

з.о

гр

Рис.4.

С г"'А \ 1

1 1 ' ! ^^^ _Сор 1

к-СР I 1 " 1 "<'г !

^ 1 '¡.Л

Кривы? гидролиза высокомолекулярных фракций белка альбумина, изолированны;-: белксвьк фракций дрожжей и ме-

тэнутплиенрующш-: Ззктерий и накопления кигк.-м-лекуляр- ■ них продуктов под действием технического фермента про-тосубтилинз. Условия гидролиза: температура - бОиС, начальная концентрация фермента - 0.01 г N7 л, начальная концентарция белка - 4.0 гН/'л, рН 7.4. Условные обозначения - тип гидрслпгуемого С елка:

* - альбумин.о- изолированные белковые фракции л ролей;

* - изолированные белковые фракции бактерий.

гидролига имеет типичную для ферментативных реакций зависимость с наличием экстремумов вблизи температур 60°С и рН среды 7.4.

Анализ количественных закономерностей данного процесса показал, что он может быть описан той же схемой последовательно-парал-дельных превращении (1), но с учетом особенностей ферментативного катализа:

Кц ¡<а1 К21 кгц ?!+ Е1*=» СЕхРо! -- Р1 + Е1 а=* ¡^Р^ -» ЕА + РР1(АА1) •

I ¡<201 &

РРо(ААо) где:

Е-х, ЕРо и ЕРх - соответственно концентрации фермента и фермент-субстратных комплексов; кгоз, к»1; кг!г - константы скорости гидролиза пептидных связей; К* и Кг - константы равновесия образующихся фермент-субстратных комплексов. Остальные обозначения такие же как и в схеме (1).

При обработке экспериментальных данных в обратных координатах - начальная скорость , концентрация субстрата была получены линейная зависимость, которая позволила оценить численные значения констант кго1 и Кц.

Остальные параметры в предлагаемой схеме превращений (4) удалось установить только путем подбора, в ходе численного интегрирования соответствующих.дифференциальных уравнений для каждой кинетической кривой.

Однако, на предварительном этапе исследований результаты рас- ■ четов показали, что схемз (4) в состоянии описать только начальный участок кинетической кривой. В дальнейшем происходит завышение расчетных значений над экспериментальными. Причину наблюдаемой ситуации мы попытались найти в наличии ингибирования фермента конечным продуктом и его возможной инактивации в ходе ферментолиза. Поэтому, на первом этапе предварительных исследований была изучена кинетика гидролиза "глобулинов" ' дрожжей с различными добавками данных ферментолизатов, не содержащих высокомолекулярных продуктов. Анализ полученных данных показал, что различные концентрами возможного ингибитора (пептидов) _не влияют на скорость гидролиза белковых фракций протосубтшшном. Наблюдаемое ингибирование можно связать с инактивацией фермента. Для этого были исследованы две зависимости: первая в координатах 1п(Сроо/Сро)/аг - СРо (5), где Ссоо и СРо - соответственно, начальная и текущая концентрации белковой фракции Ро, а»г - разность между начальными скоростями рас-

Таблица 1-

Знзчения эффективных констант и энергии активации процессов гидролиза и экстракции белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов водными растворами минеральных кислот 1. Денуклеинизированные дрожжи

Наименование параметров Наименование зс рфективных констант

кр кьр кьрр ка кГ0 кгг

Е, кДж/моль (кказ/моль) к20Э° С, О"! х 104 Кьа,. л/моль 43.00 ±3.56 (10.26 ±0.16) 0.79 +0.03 13.10 +2.31 24.00 ±2.58 (5,73 +0.52) "0.23 +0.02 "0.12 +0.02 21.00 +1.05 С5.01 +0.25) "0.14 +0.02 69.14 +3.65 С16.50 '+1.87) 0.49 +0.04 "3.94 +0.48 120.92 +17.89 Г28.85 +1.83) "0.24 +0.01 "0.32 +0.06 11.44 +1.65 72.70 +0.39) "0.25 +0.02 "0.12 +0.01 .

2. Денуклеинизированные бактерии

Наименование параметров Наименование э< )фективных констант

кр кцр ки>р ка кго кп

Е, кДж/моль (ккал/моль) х 10 4 Кьа, л/моль 43. СО +3.56 (10.2 +0.16) 0.40 +0.04 13.10 +2.31 24.00 12.58 (5.73 +0.62) "0.17 +0.01 0.12 +0.02 21.00 + 1.05 (5.01 +0.251 "0.08* +0.02 69.14 +3.65 (16.50 +1.87) 0.27 +0.02 3.94 +0.48 120.92 +17.89 128.86 +1.88) 0.15 +0.01 +0.06 11.44 +1.65 12.70 +0.39) 0.23 +0.02 "0.12 +0.01

* - произведен;:;; Кьа к го

четной и экспериментальной кривой и вторая - (Сроо^Сро)/* г -(6). Их анализ показал, что соответствующие значения точек для функции (5) хорошо ложатся на прямую с коэффициентом корреляции 0.95, а для функции (б) наблюдаемая зависимость существенно нелинейна. Полученный результат свидетельствует о наличии псевдопервого порядка реакции инактивации фермента, который можно объяснить взаимодействием фермента с неконтролируемым ингибитором, количество которого в реакционной смеси существенно Еыше концентрации ;фер-мента, или необратимым превращением последнего в результате воздействия повышенной температуры.

Дополнение вышеуказанной схемы (4) уравнением инактивации фермента по 1-му порядку позволило в итоге достичь количественного описания всех экспериментально полученных кривых ферментативного гидролиза "глобулиновой" фракции дрожжей.

При обработке данных, отвечающих различным температурам и рН среды, использовали уравнение Аррениусз и уравнение связи эффективной константы скорости ферментативной реакции с концентрацией ионов водорода:

кЭфФ - к20/(1 + КвЛН*Э) (?), где:

К«, - константа равновесия протонированного фермент-субстрзтного комплекса, као - константа скорости реакции, не зависящая от рН среды и СН+3 - концентрация ионов водорода.

В результате такой обработки в координатах 1/кэфв - ■ [Н+3 и 1пкЭфг - 1/Т были получены линейные зависимости, позволившие оце- • нить численные значения предэкспоненциального множителя уравнения Аррениуса, энергии активащш и констант к ¿о и Ка для всех стадий дополненной схемы превращений (4). В ходе последующей оптимизации были уточнены установленные величины параметров, значения которых приведены в таблице 2.

Затем, как и в случае кислотной экстракции белков была предпринята попытка использовать полученные результаты при разработке математической модели процесса их ферментативной экстракции из микробных клеток. Однако, предварительная обработка экспериментальных данных показала, что скорость экстракции и гидролиза внутриклеточных белков существенно вше, че» одаорость гидролиза изолированных фракций. Это заставило нас сделать предположение о наличии возможного параллельного гидролиза белков под действием внутриклеточных протеаз, сохранивших свои активность в денуклеинизиро-ванных микробных клетках. Для подтверждения выдвинутой гипотезы были поставлены эксперимента по гидролизу "глобулиновой" фракции

дрожжей протосубтилином в среде бесклеточного ферментативного экстракта. Последние подтвердили наличие более высоких значений скоростей их гидролиза, что подтверждает присутствие в растворе других протеаз. Для нахождения вклада параллельного пути в скорость гидролиза белков было сделано предположение, что гидролиз микробных белков внутриклеточными протеазами может быть описан той же схемой последовательно-параллельных превращений, что их гидролиз протосубтшшном с учетом инактивации последнего. Осуществив обработку г?ктперим5нта^ьногз массива данных нам удалось подтвердить возможность применения схемы превращений (4) для описания процесса гидролиза белковых фракций. Итогом такой обработки явилось .нахождение величин произведений эффективных констант на неизвестную концентрацию внутриклеточных протеаз. Установить значение последней возможно только из экспериментов по экстракции белковых веществ.

На рис.5 приведен типичный вид кривых экстракции белковых веществ под воздействием протосубтилияа на клетки бактерий. Отсутствие точки перегиба на кинетических кривых свидетельствует о существенном различии в скоростях стадии образования внутриклеточного интермедиата и экстракции внутриклеточных белков, что позволило непосредственно применить вышеустаноЕленную схему превращений (4) к описанию процесса экстракции белковых веществ. Относительно скорости извлечения б экстракт внутриклеточных протеаз, ш предположен ее равной скорости извлечения высокомолекулярной фракции. При этом неизвестную концентрацию внутриклеточных ферментов можно выразить как долю высокомолекулярной в экстракте. При таком подходе все установленные для гидролиза белковых фракций .параметры могут быть использованы в описании кинетики процесса экстракции микробных белков, а в качестве подбираемого и оптимизируемого параметра будет только концентрация внутриклеточного фермента или доля от суммы всех внутриклеточных белков (у). Результаты расчетов подт-. вердили возможность применения такого подхода к описанию- экспериментальных данных по кинетике ферментативной экстракции микробных белков. Есе численные значения установленных параметров приведены в таблице 2. Анализ полученных данных показал, что параметр у зависит только от начальной концентрации клеток в среде и сказывается постоянным для дрожжей и бактерий на уровне 0.00010+0.00002. Значения последнего вполне согласуются с выиевыдвинутыми гипотезами. Выполненные на основе разработанной математической модели расчеты позволили оценить максимально возможные еыходы высокомолеку-

Табл:п:з 2.

Значения эффективных констант и энергии активации процессов гидролиза и экстракции белковых Еешеств биомассы промышленных, микроорганизмов техническим ферментом протосубтилином ГЗх. 1. Денуклеинизированные дрожжи

Наименование параметров Наименование эффективных констант

Протосубтшшн Гзх Внутриклеточные протеазы

Е, кДж/моль ккал/моль к20б0,с с'1 Ка, л/моль x 10® +2.16 Г7.49 +0.52) "0.35 +0.02 1.20± 0.24 » +0.97 74.13 +0.22] "0.51 ±0.04 1.40± 0.10 кин! ><202 к-212 к&2 кцн2

ГБ, 20 +0.86 (3.87 +0.21) "0.31 +0.02 2.931 р. 20 50. Ш +4.36 51.93 +1.04) 11.31 ±0-03) Х10 4 1.43±. 0.18 вали +2.26 (9.09 +0.54) 0.31 ■ +0.02 1.241 0.09 +1.94 Тб. 87 ±0.46) 0.45 ±0.04 С'.08± 0.008 вэ.ви +3.12 (8.54 ±0.75] 0.27 +0.02 5.зг± 0.43 ' + 1.33 1б. 44 ±0.33 (1.10 +0.07 Х10"1* 1.61+ 0.10

2.Денуклеинизированные бактерии

Наименование параметров Наименование эффективных констант

Пгю госубтилин Гзх Рнутоиклотпчнн^ пппте.чзы

К201 К211 ка1 кин! кгог к212 ка2 кин2

Е, кДж/моль (ккал/моль) к2060 С,с"1 Ка, £/моль 31.40 +2.16 . 49 +0.53 "0.17 +0.01 1.20+ 0.24 17.30 +0.97 <4.13 +0.22) "0.25 +0.02 1.40+ 0.10 16,20 +0.86 (3.87 +0.21) "0.15 ±0.01 2.93+ 0.20 50.00 +4.36 /11.93 +1.04) ТО. 90 ±0-05) х10 1.43± 0.18 38.10 +2.26 (9.09 +0.54) "0.16 +0.01 1.24+ 0.09" 28.80 +1.-94 (6.87 +0.46) "0.22 +0.02 0.08+ 0.008 35.80 +3.12 (8.54 +0.75' "0.10 +0.01 5.33± 0.43 27.00 +1-.33 (6.44 +0.32) ТО. 7+ 0.04) хЮ"4 1.61 + 0.10

Таблица 3

Значения аффективных констант и энергий активации процессов гидролиза изолированных белковых фракций комплексом протеолитлчес-ких ферментов поджелудочной железы

Наименование "Глобулиновал" фракция

дрожжей бактерии

параметров Наименование эффективных констант

кго к21 к22 кии кго к21 к22 кин

Е, ьДж/моль (ккал/моль) кго55Л с-1 х Ю3 Ка, л/моль х 10е 24.74 +1.47 (5.90 +0.39 1.28 +0.06 6.20 +0.52 39.59 +1.52 (9.45 +0.36] 1.97 +0.14 "5.30 +0.43 32.00 ±1.09 (7.64 +0.26) 1.50 +0.12 2.90 +0.3-3 21.53 ±1.37 (5.14 +0.33) 1.67 +0.10 "3.80 +0.28 24.74 ±1.47 (5.90 +0.351 "0.77 +0.04 "ЗЛО ±0.31 39.60 ±1.52 /9.45 +0.361 •1.18 +0.09 "2.60 +0.27 32.00 + 1.09 (7.64 +0.261 0.10 +0.01 ~2.90 +0.32 21.53 ±1.37 (5.14 +0.33) "0.10 +0.01 "3.00 +0.25

лирных белковых фракций из дрожжей и бактерий при их обработке прогосубтилином. Они составили 23-26^ при степени экстракции белков 72-80*. Наблюдаемые при этом важные для практики соотношения ам'шного и общего азота не превышают значения 0.2.

Как видно из рис.5 введение в гидролигат дополнительных количеств протосубтилина не приводит к saj.ieTHOi.fy росту данного показателя, что ограничивает возможности применения микробных ферментов в практике производства белковых гидролизатов. Чтобы достичь более гстепени гидролргяа 'микробных белков часто используют ферментные системы поджелудочной железы. Возможности применения последних для глубокого гидролиза микробных белков мы и попытались оценить в последующих исследованиях.

2.3. Гидролиз белковых веществ биомасс« промышленных микроорганизмов ферментными системами поджелудочной желез н. Количественные закономерности процесса.

На рис.б приведены типичный кинетические кривые гидролиза "глобулиновой" фракции белковых веществ дрожжей. Из данного рисунка видно, что гидрол.нз "глобулинов" по сравнению с протосубтилином

сопровождается накоплением в среде амннпого азота и при последовав тельном внесении фер».. _-нта через равные промежутки времени степень гидролиза белков приближается к единице.

Анализ соотношений концентраций высокомолекулярных фракций и образующихся в ходе гидролиза низкомолекулярных продуктов в сочетании с обработкой экспериментальных данных по начальным скоростям, показал, что № имеем дело с тишгчнкм ферментативным процессом. Это позволило использовать Еышеукззанную схему превращений (4) для непосредственной обработки экспериментальных данных после проведения дополнительных исследований относительно путей возможного икгибирования ферментных систем. В ходе их проведения была изучена заьнстлоеть начальных скоростей от различных начальных концентраций ампкчого агата в среде гидооаиэуеыого белка. По итогам этих исследований в обратных координатах - начальная скорость, концентрация возможного ингибитора была получена линейная зависимость, позволившая установить наличие ингибироЕания и оценпть значение константы Ки з уравнении: Ки

£ + ¡П£ „ ■ » неактивный комплекс (3), где:

1п£ - концентращи а).!Пнного азота. Однако, дополнение схемы превращений (4) уравнением (8) не позволило адекватно описать полученные экспериментальные данные, для которых расчетные значения су-

обработка денукяеинпгпровакных клеток дрожжей ъ условиях: температура - 50 "С. содержание Фермента протосубтилина ГЗх - 27., рН среды - 7.4. сэдерлани* воздушно-сухого вещества дрожжей в суспензии - 5*. Обозначение:

} - момент времени внесения ферментного пре-

Рис.б. Кривые накопления низкомолекулярных продуктов гидролиза "глобулнноБой" фракция белкоЕьк веществ -6актер>ш (иголята, полненного по методу С 3 в условиях С }: температура - 5и"С, рН среды 1 5.7, исходное количество подготовленного н внесенного Е среду комплекс-ного ферментного препарата поджелудочной железы свиньи по ее воздушно-сухой мзссе - 2.5Д;. Обс-зкаче-. ние:

* -. момент времени внесения ферментного препарата в среду.

щественно превышали экспериментальные. Последнее указывает на на-1; личие дополнительного источника ингибнрования ферментов. Как и в случае гидролиза белков протосубтшшном, было сделано предположен ние об инактивации ферментных систем поджелудочной железы, протекающей в'ходе гидролиза микробных белков. Для установления возмож-, ного пути инактивации были изучены зависимости (5) и (6). Анализ полученных данных показал, что для данной группы ферментов типично линейная функция с коэффициентом корреляции 0.95 наблюдается в ко-орд'гязтзх зависимости (6) '• Последнее свидетельствует о наличии инактивации фермент-субстратного комплекса и позволяет найти эфг фективную константу инактивации в исследуемом процессе. После дующие расчеты, выполненные с учетом превращений (4),(6) и (В) в схеме позволили адекватно описать все экспериментальные данные по кинетике гидролиза микробных белков. Тот же подход, что и при изучении кинетики гидролиза протосубтилиноы был сохранен в исследований температурной и рН зависимостей. Полученные в результате такой обработки экспериментальных данных значения констант приведены в таблице 3.

Таким образом, проведенные исследования позволили создать единую математически модель экстракции и гидролига микробных белков дрожжей к бактерии, которая позволяет прогнозировать величину выхода и степень гидролига белковых веществ в зависимости от условий получения гидроллзагов.

Все сделанные рекомендации для технологии на гзвероакицем этапе исследования были проверены путем сопоставления расчетных и зксперпментал!кых данных. Последнее показало, что для любнх возможных вариантов технологических схем переработки микробных белков предложенная математическая модель дает хороший прогноз относительно ожидаемого качества гидролизата.

На основе анализа данных кинетических исследований была предложена схема переработки микробных клеток с получением очищенной смеси аминокислот и низших пептидов.

2.4.Основы технологии очищенного препарата смеси аминокислот п низших пептидов.

По результатам собственных исследований и литературным данным выбранный подход позволил предложить следующую схему переработки дрожеен и бактерий.с получением очищенного препарата смеси аминокислот и низших пептидов, предусматривающую комплексное использование микробного сырья (рис.?):

1.экстракция компонентов нуклеиновых кислот водными или водно-ще-

лочными растворами и отделение микробных клеток сепарированием или фильтрованием (Ы90°С, рН 8.5, время - 60 мин); . 2.экстракция микробных белков с применением кислотных экстраген-тов иди растворов технического фермента (протосубтилинз ГЗх). (1=90°С, Сн 30 » 0.35-0.40 моль/л, время - 120 мин для кислотных экстрагентов, Ь»60°С, рН 7.2-7.6 - для растворов фермента, время - 240 мин);

3.отделение клеточных оболочек и испольвование их на производстве кормового белка;

4.осаждение "глобулинов" из бесклеточного экстракта в изоэлектри-

ческой точке (рН 4.2-4.7) - при переработке дрожжей; 5. гидролиз "глобулинов" или белковых веществ экстракта (при переработке бактерий) ферментзми поджелудочной железы (1>53о0, рН

среды 6.2-6.8, время - 480 мш); 6.осветление белкового гйдролизата;

7.очистка смеси аминокислот и низших пептидов ионным обменом;. 8.концентрирование элюата вакуум-выпариванием; . 3.распылительная сушка смеси аминокислот и низших пептидов.

Получаемые из дрожжей и бактерии препараты в пересчете на воздушно-сухое вещество содержат соответственно: общего азота - до 12.ОХ; аминного азота - до 5.7%; низших пептидов - до 35.ОХ; углеводов - до 0.40?.; свободного аммизка - до 1.0%; имеют оптическую плотность при 440 нм - до 0.15; рН (17.-ного раствора) - 6.5.Состав аминокислот: (в %-тах от суммы аминокислот) препарата из дрожжей и . препарата из бактерий соответственно: зспарагиновая 8.ОТ. и 9.4%,; треонин 13.3% и 9.62 ;глутаминовая 12.9л. и 16.67.; глицин 4.47. и 7.7%; аланин 3.97. И 1.02.; валин 4.9% и 5.97.; метионив 1.47. и 1.87.; изолейцин 5.6л к 4.77.; лейцин 7.9* и 8. IX; тирозин 7.0% и 6.67.; фенилаланин 8.77. и 6.47.; лизин 11.5% и 10.77.; гистидин 6.3% и 8.1% пролин 8.0% и 3.5% При реализации такой схемы образующийся побочный продукт - клеточные оболочки возможно перерабатывать в кормо-еой белковый препарат, имеющий на воздушно-сухое вещество следующие показатели: содержание общего азота до 3%, компонентов кукле:!-1 новых кислот до 2%, углеводов - до 15%, -липидов - до 20%.

Полученный препарат, очищенной смеси аминокислот и низших пептидов был испытан в лаборатории электрохимии неметаллических соединений - ИЭЛ РАН в процессе электрохимического растворения драгоценных и полудрагоценных металлов (на примере золота и серебра) из низкосортного сырья вместо индивидуальных аминокислот и низших пептидов. Установлено, что без электрохимической обработки растЕЭ-

Рис.7. Технологическая схема комплексной переработки микробной биомассы.

рения металлов не происходит. При изучении анодной поляризации золотосодержащего сырья в присутствии препарата в концентрации 10?. мае. в растворе 0.1М хлорида натрия было установлено, что скорость растворения золота в рззтворе исследуемого препарзта значительно выше, чем в среде, содержащей глицилглицин и метионин - 0.65 иг/л-мг-с и 0.10 мг/л-м2-с соответственно. Полученный результат позволя-

. ет рекомендовать данный препарат к применению без дальнейшей очистки в процессе извлечения золота из низкосортного сырья Бместо дорогостоящих аминокислот и индивидуальных пептидов.

При изучении растворения серебра ь тех же условиях было обнаружено, что начальная скорость процесса оказывается равной скорости его растворения в контрольной среде, " однако, во Еремени происходит некоторая пассивация электрода. Аналогичная ситуация имеет место и е контрольной среде, содержащей метионин. Отсутствие эффекта пассивации наблюдается только в среде, содержащей глицилгли-цин. По итогам предварительных опытов сделан вывод об отрицатель-, ном влиянии серы в аминокислотах, что требует проведения дополнительных исследований в части повышения качества гидролизата путем доочистки его от мешающих примесей или трансформации 5-содержащих аминокислот в составе препарата в соединен;^, не вызывающие пассивации электрода в рассматриваемом процессе.. Выводы . ~

1. проведено количественное исследование процесса'водно-кислотной экстракции микробных белков, сопровождающейся частичным гидролизом микробных белков. С использованием теории кислотно-основного катализа предложена математическая модель процесса, отвечающая схеме последовагельно-пзраллельных превращений. Рассчитаны значения эффективных констант и энергий активации, что позволило адекватно описать Бее экспериментальные данные.

2. Проведено количественное исследование процесса экстракции с одновременным гидролизом микг'-бных белков растворами технических ферментов (нз примере прото.убхилина ГЗх). Предложена математическая модель процесса, отвечающая схеме последовательно-параллельных ферментативных превращений с инактивацией-вносимого фермента при отсутствии его ингибирования продуктами гидролиза. Показано, что в сопоставимых условиях скорость гидролиза внутриклеточных белков

■существенно ььгше скорости их гидролига в составе белковых изоля-тов, что объясняется участием внутриклеточных протеаз. Определены параметры модели (эффективные константы и энергии активации), в целом адекватно описывающие эксперимент.

J. Проведено количественное исследование процесса глубокого гидро-_:ивз микробных белков протеазами поджелудочной железы. В соответствии с теорией ферментативного кзтализа построена математическая модель процесса, отвечавшая схеме последовательно-параллельны:'.- превращений с инактивацией фермент-субстратного комплекса'и'с пнгпбированием ферментных систем продуктами гидролиза.

4. На основании количественного описания процессов экстракции и гидролиза микробных белков предложены варианты управления этими процессами, что позволяет реализовать различные технологические схемы, в том числе, включающие выделение промежуточного продукта (при переработки белка дрожжей) и без его выделения.

5. Впервые показана возможность применения очищенных белковых гид-родизатов вместо индивидуальных аминокислот и -наших пептидов в электрохимическом восстановлении драгоценных и полудрагоценных металлов из растворов.

Список публикация по теме диссертации.

1.И.А.Крылов, Н.С.Маркина, А.А.Красноштанова, В.А.Гунин, М.Н.Мана-

ков - Выбор оптимальной схеш получения дрожжевой РНК в условиях современных биохимзаводов БЕК и лизина - Биотехнология, 1592, N3, с. 79-82.

2.И.А.Крылов, А.А.Красноштанова, М.Н.Малахов - Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. Сообщения 1-3. Биотехнология - в печати.