Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии биоконверсии бумажных упаковочных материалов в продукцию для агропромышленного комплекса

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии биоконверсии бумажных упаковочных материалов в продукцию для агропромышленного комплекса"

На правах рукописи

005537895

ГЛАЗОВА АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ БУМАЖНЫХ УПАКОВОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ В ПРОДУКЦИЮ ДЛЯ АГРОПРОМЫШЛЕННОГОКОМПЛЕКСА

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

1 - • и

Щелково - 2013

005537895

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна Официальные оппоненты: Воробьева Галина Ивановна

доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией сельскохозяйственной биотехнологии ОАО «ГосНИИсинтезбелок» Буреев Илья Артемьевич

доктор технических наук, профессор, Заслуженный изобретатель РФ, ведущий научный сотрудник лаборатории конструирования препаратов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии

Ведущая организация: Государственное научно-исследовательское учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится 29 ноября 2013 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности» Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 25.10.2013 г.

Автореферат 23 октября 2013 г. размещен на сайте ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии www.vnitibp.ru и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фролов Юрий Дмитриевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время во всем мире остро стоит проблема утилизации бытовых отходов. В Российской Федерации ежегодно образуется свыше 50 млн. т твердых бытовых отходов, из них 35% приходится на бумагу и картон. Комбинированная упаковка Тетра Пак представляет собой ценное вторичное сырье (75% картона, 21% полиэтилена, 4% алюминия), которое крайне нерационально, как с экономической, так и с экологической точек зрения, закапывать в землю и сжигать. Важным направлением современной биотехнологии является эффективное использование возобновляемых источников вторичного сырья (отходы целлюлозно-бумажной промышленности, сельского хозяйства и бытовые отходы) для получения ценных кормовых и пищевых продуктов и решения экологических проблем.

В то же время важнейшей проблемой современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами. Наряду с интенсификацией сельского хозяйства и освоением ресурсов Мирового океана, опыт показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза в рещении этой проблемы.

Настоящая работа посвящена разработке комплексной технологии переработки картонной упаковки, позволяющей получить ряд продуктов, таких как ферментные препараты (например, целлюлазы), белково-углеводные концентраты для применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве, препараты-стимуляторы роста растений для сельского хозяйства.

Степень разработанности проблемы. Важный вклад в развитие методов микробиологического синтеза для решения проблемы дефицита белковых веществ при использовании целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности внесли Л.К. Эрнст, Л.А. Иванова, М.В. Гернет, Е.Г. Борисенко.

Г.И. Воробьевой, И М. Грачевой, А.П. Синицыным, А.Г. Лобанком, Н.Б. Градовой разработаны способы эффективной переработки целлюлозосодержащего сырья, включающие комплексную переработку, получение ферментных препаратов, белоксодержащих продуктов кормового и пищевого назначения. Анализ имеющихся литературных данных выявил проблемы, существующие в данной области и позволил сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в разработке эффективной, научно обоснованной технологии комплексной переработки картонной составляющей упаковок Тетра Пак для получения кормовых белково-углеводных, пробиотических продуктов, пищевых белково-углеводных концентратов, ферментных препаратов и стимуляторов роста растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- оценка биохимического состава исходного сырья для определения его пригодности к переработке и определение эффективных условий его предобработки;

- разработка биотехнологии ферментного препарата целлюлазы, позволяющего осуществлять деградацию картона, на основе нового перспективного штамма микроорганизма, выделенного в результате скрининга;

- определение эфективных условий расщепления картона до легкоусваиваемых редуцирующих веществ с использованием полученного препарата целлюлазы;

- оптимизация режима глубинного культивирования богатых белком дрожжей с использованием полученных ферментолизатов картона в качестве источника углерода;

- разработка технологии белково-углеводного концентрата пищевого назначения на основе очистки дрожжевой биомассы, выращенной на гидролизатах картона, от липидов и нуклеиновых кислот;

- разработка режимов твердофазного культивирования микроскопических грибов на средах с картоном для получения кормового белково-углеводного концентрата;

- изучение возможности обогащения полученного ранее кормового белково-углеводного концентрата пробиотическими микроорганизмами;

- разработка технологии препарата - стимулятора роста растений на основе твердофазного культивирования микроорганизмов на средах с картоном.

Научная новизна работы. На основании исследования биохимического состава отходов картонной упаковки и проведенного скрининга микроорганизмов показана целесообразность утилизации картона методами биологической конверсии.

В результате направленного скрининга микроорганизмов отобран новый штамм-продуцент комплекса целлюлолитических ферментов. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик штамм идентифицирован как Aspergillus sp.4-2-10.

Впервые на основе лабораторных исследований и полученных зависимостей накопления новым штаммом Aspergillus sp.4-2-10 целлюлазной активности от условий культивирования этого штамма, параметров выделения и очистки ферментного препарата, дано научное обоснование технологии нового препарата целлюлазы.

Экспериментально обоснованы режимы предподготовки и ферментативного гидролиза отходов картонной упаковки с использованием полученного на основе культивирования Aspergillus sp.4-2-10 препарата целлюлазы.

Оптимизированы параметры глубинного культивирования дрожжей P. anomala 9а-48 на ферментолизате целлюлозосодержащего сырья. Экспериментально обоснованы эффективные условия экстракции липидов и нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей Р. anomala 9а-48 с

целью получения пищевого белково-углеводного концентрата.

На основе выявленных зависимостей накопления протеина консорциумом микроскопических грибов от условий культивирования и состава консорциума, разработана биотехнология обогащенного пробиотиками кормового белково-углеводного продукта.

Выявлено стимулирующее влияние консорциума микроскопических грибов, выращенных на картонсодержащих питательных средах, на рост и развитие растений.

Практическая значимость работы. Проведенные лабораторные исследования явились основой для создания новой комплексной технологии переработки отходов картонной упаковки с целью получения ряда препаратов биологически активных веществ. С использованием математических методов планирования экспериментов были оптимизированы основные значимые параметры процессов и разработаны технологии кормового и пищевого белково-углеводных концентратов, ферментного препарата целлюлазы и препарата стимулятора роста растений на основе биоконверсии картонной составляющей упаковок Тетра Пак.

Разработанная комплексная технология позволяет не только получить полезные продукты, но и решить экологическую проблему утилизации трудноразлагаемых отходов.

На готовые продукты разработана следующая нормативно-техническая документация: технические условия и лабораторные регламенты на изготовление кормового белково-углеводного продукта, пищевого белково-углеводного концентрата, ферментного препарата целлюлазы 4-2-10 Г10Х.

На основе наиболее продуктивного штамма Aspergillus sp.4-2-10, полученного в результате скрининга микроорганизмов-продуцентов целлюлаз, разработана биотехнология препарата целлюлаза 4-2-10 Г10Х и произведена наработка опытной партии в ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко». Результаты подтверждены актом о наработке (утверждены заместителем генерального директора ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» 05.04.2013).

Произведена наработка опытной партии пищевого белково-углеводного концентрата в ООО «Юнайтед Бевериджие Груп». Результаты подтверждены актом о наработке (утвержден генеральным директором ООО «Юнайтед Бевериджие Груп» 26.05.2013).

Подана заявка № 2013143716 от 30.09.2013 на выдачу патента РФ «Способ получения биомассы микроорганизмов».

По результатам лабораторных испытаний определены основные направления практического применения разработанных продуктов: создание обогащенных белком пищевых и кормовых продуктов, препаратов стимуляторов роста растений.

В производственных условиях ООО «ТД «Акатуй» осуществлено изготовление хлебобулочных изделий с введением в их рецептуру пищевого белково-углеводного концентрата. Показана возможность двукратного повышения содержания протеина в хлебе без

потери потребительских качеств. Результаты подтверждены актом испытаний (утвержден заведующим производством ООО «ТД «Акатуй»),

Методология и методы исследований. Исследования выполнены по стандартным методикам с использованием современных микробиологических, химических и физико-химических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология целлюлолитического ферментного препарата: новый перспективный целлюлазоактивный штамм гриба Aspergillus sp.4-2-10; оптимальный состав питательной среды для культивирования микроскопического гриба Aspergillus sp.4-2-10; эффективные условия получения препарата целлюлазы на основе культивирования микроскопического гриба Aspergillus sp.4-2-10; эффективные условия гидролиза упаковочного картона с использованием нового ферментного препарата целлюлазы.

2. Технология пищевого белково-углеводного концентрата из биомассы дрожжей, выращенных на ферментолизате картона: перспективный штамм дрожжей P. anomala 9а-48, способный накапливать биомассу с высоким содержанием белка на питательной среде с ферментолизатом картона; оптимизированный состав питательной среды для глубинного культивирования дрожжей P. anomala 9а-48; эффективные условия экстракции липидов и нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей; возможность применения пищевого белково-углеводного концентрата из биомассы дрожжей в рецептурах пищевых продуктов.

3. Технология кормового белково-углеводного концентрата: консорциум грибов, активно разрушающий целлюлозу и накапливающий белок в биомассе; состав питательной среды для культивирования консорциума грибов; обогащенный пробиотическими микроорганизмами кормовой белково-углеводный концентрат.

4. Технология препарата-стимулятора роста растений: консорциум грибов, стимулирующих рост растений; эффективность применения стимулятора роста растений при выращивании сельскохозяйственных культур.

Степень достоверности результатов. Все измерения проводились не менее чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований обработаны с помощью Microsoft Office Excel 2007. В диссертационной работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2011 г.); Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012 г.); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2012 г.); Международной конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Москва, 2012 г.); конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2013 г.); Международной конференции «Vietnam National Workshop on Biotechnology» (Ханой, 2013).

На международной выставке-конференции инновационных решений для воспроизводства, функционирования и целесообразного развития живых организмов и среды их обитания «БИОИНДУСТРИЯ 2012» результаты разработок отмечены золотой медалью.

За разработку «Стимулятор роста растений» на 1-й международной научно-практической конференции-выставке "Планирование и обеспечение подготовки и переподготовки кадров для отраслей пищевой промышленности и медицины" получен Диплом I степени.

На XIII Всероссийской выставке Научно-технического творчества молодежи результаты разработок отмечены Дипломом.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 186 источников (в том числе 65 зарубежных), и 6 приложений. Работа изложена на 230 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы и 54 рисунка.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрено современное состояние проблемы переработки вторичного целлюлозосодержащего сырья в России. Оценены объемы ежегодно образующихся отходов, и отражены основные пути их утилизации. Освещена роль микробиологических способов конверсии целлюлозосодержащего сырья, рассмотрены основные продуценты целлюлолитических ферментов. Приведены примеры способов эффективной переработки целлюлозосодержащего сырья, включающие комплексную переработку, получение ферментных препаратов, белоксодержащих продуктов кормового и пищевого назначения, а также стимуляторов роста растений.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явился картон, отделяемый от комбинированных упаковок Тетра Пак, ранее использованных для розлива жидких пищевых продуктов.

На рис. 1 приведена общая схема проведенного исследования. Комбинированная

препараты пробнотических пробиотик микроорганизмов

Рисунок 1 - Общая схема исследований Микроорганизмы. В работе использованы микроорганизмы из лабораторной коллекции кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (грибы родов Altemaria, Aspergillus, Beauveria, Fusarium, Penicillium, Trichoderma и др.; бактерии Bacillus subtilis B1640, Lactobacillus plantarum B1133 и др.; дрожжи Pichia anomala 9a), а также выделенные в результате скрининга из природных источников обитания.

Методы. Определение массовой доли влаги проводилось согласно ГОСТ Р 51479-99, золы - согласно ГОСТ 13979.6-69, сырой клетчатки - согласно ГОСТ Р 52839-2007, лигнина -согласно ГОСТ 26177-84, жира - согласно ГОСТ 13496.15-97. Определение редуцирующих веществ (РВ) проводилось по методу Шомоди-Нельсона; нуклеиновых кислот - путем их перевода в неорганический фосфат. Определение количества фосфора производилось фотоколорнметрически в соответствии с ГОСТ 9794-74. Массовую долю белковых веществ определяли по методу Кьельдапя согласно ГОСТ 13496.4-93, Несслера и Лоури. Определение аминокислотного состава осуществлялось в соответствии с ГОСТ 13496.21-87 и ГОСТ 13496.22-90. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных

микроорганизмов (КМАФАнМ) проводили по ГОСТ 10444.15-94; дрожжей и плесневых грибов - по ГОСТ 28805-90.

Скрининг целлюлазоактивных микроорганизмов из природного материала осуществляли согласно схеме, разработанной в соответствии с особенностями роста культур. Идентификация культуры проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 18S рРНК, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров.

Определение активности целлюлазы (ЦлА) проводилось модифицированным фотоколориметрическим методом согласно ГОСТ Р 53046-2008.

Осаждение ферментов осуществлялось органическими растворителями с последующим отделением осадка путем центрифугирования.

Острая токсичность определялась биотестированием на инфузориях-стилонихиях в соответствии с ГОСТ Р 52337-2005.

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ЗЛ Исследование биохимического состава и свойств упаковочного картона

В работе определен биохимический состав целлюлозосодержащей фракции упаковок Тетра Пак (табл.1).

Таблица 1 - Биохимический состав картонной фракции упаковок Тетра Пак.

Наименование показателя Содержание, %

Влага 6,00-7,12

Сырая клетчатка 91,41-91,83

Лигнин 0,078-0,09

Сырой протеин Не обнаружено

Липиды Не обнаружено

Редуцирующие вещества Не обнаружено

Зола 0,81-0,83

На основании представленных результатов сделан вывод о том, что исследуемое сырье (далее — картон) на 91,46 % состоит из целлюлозы, что обосновывает необходимость использования различных методов обработки для ее конверсии в глюкозу и возможность получения на ее основе ценных продуктов.

3.2 Разработка технологии грибной целлюлазы

Наиболее перспективным для гидролиза целлюлозосодержащего сырья является использование ферментных препаратов целлюлолитического действия, способных к глубокому разрушению субстрата и гидролизу целлюлозы до глюкозы. Замена известных химических способов обработки целлюлозосодержащих материалов на ферментативные уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде, и позволяет подойти к созданию безотходных технологий. В

связи с этим одной из задач диссертационного исследования явилось изучение возможности создания биотехнологии ферментного препарата целлюлазы.

3.2.1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов целлюлаз

В рамках диссертационной работы исследовано около 100 изолятов культур микроорганизмов. В результате скрининга установлено, что наибольшей целлюлазной активностью (7,68 ед/см3) обладает культуральная жидкость изолята 4-2, который был отобран для дальнейших исследований.

3.2.2 Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков грибного изолята 4-2

По результатам проведенных исследований морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков сделан вывод о принадлежности изучаемого изолята к роду Aspergillus.

Идентификация штамма Aspergillus sp. 4-2 с помощью анализа 18S рРНК осуществлялась в лаборатории ФГУП ГосНИИГенетика. Анализ филогенетического родства, построенный с использованием штаммов близкородственных микроорганизмов показал, что наиболее близкими к исследованному штамму являются виды Aspergillus flavus и Aspergillus oryzae.

3.2.3 Определение оптимальных условий культивирования Aspergillus sp. 4-2 с целью получения активного фермента целлюлазы

Планирование эксперимента осуществлялось методом Гаусса-Зейделя, предусматривающим последовательное изучение влияния факторов и использование каледого полученного предыдущего уровня в качестве фона для изучения последующего.

При глубинном культивировании штамма-продуцента последовательно варьировали следующие факторы: вид и концентрации источников азота, фосфора, углерода, микроэлементов, твин-80 и молочной сыворотки в питательной среде (ПС), pH ПС (2-11), возраст (1-5 сут) и дозу (1-10%) посевного материала (ПМ), длительность культивирования (110 сут).

Согласно полученным результатам, наиболее эффективным оказалось внесение в ПС в качестве источников азота и фосфора 3 г/дм3 мочевины и 2 г/дм3 КН2Р04, в качестве источника углерода - 15 г/дм3 картона.

Изучено влияние предварительного химического гидролиза картона, вносимого в ПС, на активность ферментов культуральной жидкости (КЖ) Aspergillus sp.4-2 (рис.2). Наиболее

10

эффективной оказалась

предобработка картона 0,2% раствором NaOH при 0,1 МПа в течение 60 мин, так как в этом случае ЦлА ферментов КЖ гриба Aspergillus sp. 4-2 повысилась до 8,61 ед/см3.

Экспериментально установлено, что при

культивировании Aspergillus sp.4-2 следует поддерживать рН ПС на уровне 6,0.

Показано, что такие микроэлементы как Zn, Со, Мо и В угнетают синтез целлюлаз исследуемым грибом. Напротив, добавление 0,2 г Mg2+/flM3, 0,02 г Мп2+/дм3, 0,0063 г Ni^/дм3 и 0,004 г Ре2+/дм3 благоприятно влияет на рост гриба и биосинтез целлюлаз, позволяя достичь ЦлА 17,94 ед/см3. Присутствие в ПС твина-80 в количестве 0,1 г/дм3 повысило ЦлА до 26,01 ед/см3, а 1% молочной сыворотки (лактозы 0,036%) - до 33,89 ед/см3.

Установлено, что засев эффективнее всего производить трехсуточным ПМ в количестве 5% к объему ПС. Оптимальное время культивирования Aspergillus sp. 4-2 составило 6 сут.

Путем УФ-индуцированного мутагенеза исследуемого гриба удалось получить мутант Aspergillus sp. 4-2-10, ЦлА в фугате КЖ которого составила 39,29 ед/см3.

3.2.4 Осаждение целлюлолитических ферментов Aspergillus sp. 4-2-10 из культуральной жидкости

Экспериментально установлено, что наиболее эффективно осаждение целлюлаз из фильтрата КЖ Aspergillus sp. 4-2-10 происходит изопропанолом в соотношении 3:1 и рН 4,0, при этом выход сухого ферментного препарата (ФП) составил 11,51 г/дм3. Активность целлюлазы в высушенном ФП составила 2375,13 ед/г.

3.2.5 Определение эффективных условий проведения ферментативного гидролиза картона полученным ФП

ФП имел рН-оптимум активности в области 5,0-6,0, температурный оптимум в диапазоне 35-45°С. Максимальная скорость накопления РВ (2,07 г/дм3 в час) наблюдалась при рН 5,5, температуре 40°С, концентрации субстрата 100 г/дм3, ЦлА 100 ед/г субстрата.

г 125 т"

ч 100

<

Гидроли-зующий агент

СЮС00Н+Н202 NaOH H2S04+H202

°.4 0,5

Концентрация гидролизующего агента, %

Рисунок 2 -Влияние предобработки картона на ЦлА ферментов КЖ Aspergillus sp.4-2.

3.3 Разработка технологии белково-углеводного концентрата пищевого назначения из биомассы дрожжей, выращенных на ферментолизатах картона

3.3.1 Скрининг культур дрожжей

В результате скрининга при культивировании на ПС, содержащей в качестве жидкой фазы и источника углерода ферментолизат картона, наивысшую продуктивность по биомассе показал штамм Pichia anómala 9а из лабораторной коллекции кафедры «Биотехнология» МГУПП.

С целью повышения продуктивности отобранного в процессе скрининга штамма проведен индуцированный УФ-мутагенез, и наивысшее накопление биомассы (3,28 г/дм3) получено при культивировании мутанта Pichia anómala 9а-48, облученного в течение 48 мин.

3.3.2 Оптимизация условии культивирования P.anomala 9а-48 с целью повышения выхода биомассы

При глубинном культивировании Р.апота1а 9а-48 последовательно варьировали следующие факторы: концентрация РВ в ферментолизате картона, вид и концентрации источников азота, фосфора, микроэлементов, твина-80 в ПС, рН ПС (2,5-7,5), дозу (1-10%) посевного материала (ПМ), длительность культивирования (1-10 сут).

Экспериментально установлено, что наиболее эффективно культивирование дрожжей на ПС с РВ 25 г/дм3, М^ЖЬ в количестве 7,5 г/дм3 и КН2Р04 в количестве 2,5 г/дм3.

Максимум накопления биомассы наблюдался в интервале рН 4,0-4,5.

Показано, что при внесении в ПС (г/дм3) КС1 - 0,75; гп804-7Н20 - 0,03; Г^504'7Н20 -0,5; РсЯО^УНгО - 0,1 продуктивность увеличилась на 31%.

Установлено, что в ПС дополнительно следует вносить отруби в количестве 9 г/дм3, накопление биомассы Р.апота1а 9а-48 при этом составило 11,95 г/дм3.

Отмечено, что при внесении в ПС 0,5 г/дм3 твина-80 биомасса дрожжей увеличилась на 6,2% относительно контроля и составила 12,74 г/дм3.

Показано, что ПМ целесообразно

о 14

Г| 12

0 ч

5.4 Ю

SE 8 ь I *

? S 4

1 & 2 Is 0

--

0 50 100 150

Длительность культивирования, ч

Рисунок 3 - Динамика накопления биомассы P.anomala 9а-48 в зависимости от длительности культивирования.

вводить в количестве 0,5% к объему ферментационной среды. Максимальное количество биомассы (12,85 г/дм3) в КЖ Р.апота1а 9а-48 накапливают при культивировании в течение 72 ч, а увеличение длительности культивирования приводит к автолизу клеток дрожжей (рис.3).

Для оптимизации состава ПС реализован полный факторный эксперимент (ПФЭ 23), при этом параметром оптимизации являлась накопленная абсолютно сухая биомасса, а в качестве факторов варьирования взяты отруби, КН2РО4 и NH4NO3. Расчет и результаты программы «крутого восхождения» позволили установить следующий оптимальный состав основных компонентов ПС (г/дм3): отруби - 8, КН2РО4 - 4,08, NH4NO3 - 9,70. Оптимизированная ПС позволила повысить выход АСБ в 1,32 раза, и он составил 16,95 г/дм3.

3.3.3 Исследование биохимического состава биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48

Определялся биохимический состав полученной биомассы дрожжей (табл.2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что дрожжевая биомасса содержит высокое количество белка (48,6% от АСБ), что позволяет использовать её в качестве потенциального источника полноценного протеина.

Таблица 2 - Биохимический состав биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48, %

Наименование показателя % % от АСБ

Влага 63,7 -

Протеины 17,7 48,6

Углеводы 7,4 20,4

Липиды 4,5 12,4

Нуклеиновые кислоты 3,4 9,3

Зола 2,1 5,8

3.3.4 Определение эффективных условий экстракции липидов из биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48

С целью увеличения сроков хранения и улучшения характеристик продуктов необходимо избавляться от легко окисляемых и реакционноспособных компонентов, таких как липиды. Для удаления липидов из биомассы дрожжей выбран дешевый и безопасный, разрешенный в пищевой промышленности экстрагент - этанол.

Для определения наиболее эффективных условий проведения экстракции липидов из биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48 последовательно варьировались следующие факторы: гидромодуль (1 - 7), концентрация этанола (40 - 96%), температура проведения экстракции (30 -60°С), длительность (15-90 мин).

Наиболее экономически обоснованными следует считать следующие параметры экстракции: гидромодуль 2,5, концентрация этанола 60%, температура 55°С, продолжительность 60 мин, при этом количество удаленных липидов составило 70,4 %. Проведение экстракции в две стадии по 30 мин с заменой экстрагента на свежий позволяет дополнительно извлечь 7,9% липидов. Остаточное количество липидов в биомассе составило 2,69% от АСБ.

3.3.5 Определение эффективных условий денуклеинизацни обезжиренной дрожжевой биомассы

В связи с особенностями метаболизма нуклеиновых кислот в организме человека при производстве очищенных белоксодержащих продуктов из дрожжей в технологическую схему включают стадию денуклеинизации. С целью подбора наиболее эффективных условий денуклеинизации, варьировались рН и длительность процесса (рис.4).

Согласно полученным результатам денуклеинизацию целесообразно

проводить при рН 8,0 в течение 60 мин. Остаточные нуклеиновые кислоты при этом составляли 3,22% от АСБ.

3.3.6 Получение и характеристика готового пищевого белково-углеводного концентрата

Освобожденную от основной массы липидов и нуклеиновых кислот дрожжевую биомассу высушивали конвективным методом. В готовом концентрате определялись содержание влаги, белка, золы, РВ, липидов, оценивалась общая микробная обсемененность (табл.3).

Таблица 3 - Характеристика ПБУК

Наименование показателя Нормируемое значение по ГОСТ 53861-2010 Значение показателя по результатам исследований

Массовая доля влаги,% не более 8,00 7,6

Массовая доля СП, % АСБ 40,0 - 75,0 63,7

Массовая доля сырой клетчатки, % АСБ не нормируется 17,4

Массовая доля жира, % АСБ не более 20,0 3,21

Массовая доля нуклеиновых кислот, % АСБ не нормируется 3,84

КМАФАнМ, КОЕ/г не более 2,5* 104 2,6* Ю"*

БГКП, КОЕ/О,1 г не допускаются не выявлены

Дрожжи и плесени, КОЕ/г дрожжи не более 90; плесени не более 10 не выявлены

Патогенная микрофлора, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ/25 г не допускается не выявлена

X

Рисунок 4- Влияние рН и длительности денуклеинизации на степень гидролиза нуклеиновых кислот дрожжей Р. anómala 9а-48.

Полученный пищевой белково-углеводный концентрат (ПБУК) соответствует требованиям существующей нормативной документации на белковые композитные сухие смеси, получаемые из молочной сыворотки.

Выход ПБУК при переработке 1 кг картона составил около 200 г (влажность 8%).

Определение аминокислотного состава белка ПБУК проводилось в аналитической лаборатории Института естественных наук Thai Nguyen University в Ханое (СРВ). Вьивлено, что содержание основных незаменимых аминокислот (кроме триптофана) в полученном ПБУК достигает 33%.

3.3.7 Оценка функциональных свойств белков ПБУК

С целью изучения возможности применения ПБУК из дрожжевой биомассы Р. anómala 9а-48 в пищевой промышленности определены функциональные свойства белков ПБУК. Максимум растворимости ПБУК наблюдался при 40°С и рН 11,0 и составил 63,3%. Набухаемость, водо- и жиросвязывающая способности ПБУК составили соответственно 4,0 см3/г, 2,89 и 0,74 г/г белка.

Высокая способность белков удерживать воду в пищевых продуктах повышает выход последних, удлиняет сроки хранения и улучшает текстуру. В связи с этим можно сделать вывод о возможности применения полученного ПБУК при введении в рецептуры пищевых продуктов.

3.3.8 Оценка сорбционной способности ПБУК по отношению к микроорганизмам

Исследование сорбционной способности ПБУК по отношению к микроорганизмам (в т.ч. патогенным и условно-патогенным) показало, что ПБУК обладает выраженной (свыше 80%) способностью адсорбировать палочко- и кокковидные бактерии различных форм патогенности, что позволяет вводить разработанную добавку в продукты питания с лечебно-профилактической целью.

3.3.9 Апнаратурно - технологическое оформление процесса получения ПБУК из биомассы дрожжей

На основании результатов исследований, представленных в разделе 3.3, разработана принципиальная технологическая блок-схема, а также предложена аппаратурно-технологическая схема получения ПБУК (рис.5).

£ Ш. А, Б

; ' ! * / ' : *

в су в с сб:. см н. Ск: вд и и

н Сб н Сб СЕ В Н См Н Сб СЕ Сб Н См Н Сб СЕ Сб Н Сбл У/1

Б - бункер, В - бесы. Вд - пыдержиЬатель. СУ - гидроустонобка. Q - дозатор. Ни - дезинтегратор; И - инокулятор. И - насос. С - сито. Сб - сборник. Сбл - сублимационная сушилка. СБ - сепаратор. Ск - стерилизаиионная колонка. См - смеситель. Cm - стерилизатор, Т - теплообменник, УС! - упжобочная линия. Ф - ферментер. Фр - фильтр тонкой очистки. Ш - шнек.

1.0 - Ыо, 1.1 - Конденсат. 1.2 - Вода оборотная прямая. 13 - подо оборотная обратная t =90 С. U- бода оборотная обратная, / = 30 С. 2.0 - пар насыщенный 3.0 - боздух очищенный, 3.1- Воздух стерильный. 32 - боздух отработанный. i.O - канализационные стоки, 5.0 - суспензия картона б bade. 5.1 - ферментализат картона 5.2 - непрогидролизобанный картон. 53 - питательная среда 5Л - стерильная питательная сред, 5.5 - охлажденная питательная среда. 6.0 - посебной материал из лаборатории. 6.1 - посебной материал из инокупятора. 62 - культуральная жидкость, 63 - фугат. 6Л - обезжиренная дрожжебая биомасса. 6.5 - блахныОбелкобо-углебодный концентрат. 6.6 - сухойбелкобо-углебодныйконцентрат, 6.7- упакобанный концентрат. 7.0- картоннаяупакобка. 7.1 - NaOH 10%. 72 - соли. 8.0- хладоагент. 9.0 - НС! 10%. 100 - ШОН10%. 11.0 - пеногаситель. 111- пеногаситель стерильный. 12.0 - пошлюминиебая смесь. 13.0 - этанол 60%. НО - ферментные/ препарат целлюлоза 4-2-Ю С10Х

Рисунок 5 — Аппаратурно-технологическая схема получения ПБУК.

3.4 Разработка технологии кормового белково-углеводного концентрата (КБУК) из биомассы грибов

Получение белка непосредственно на твёрдых растительных субстратах основано на способности ряда микроорганизмов, благодаря синтезу ими комплекса целлюлолитических и других ферментов, усваивать компоненты растительных материалов и накапливать белок.

3.4.1 Скрининг целлюлазоактивпых микроорганизмов - продуцентов белка

В рамках диссертационного исследования произведен скрининг грибов, способных накапливать протеин при выращивании на сыпучих ПС, в которых варьировалось соотношение картона и пшеничных отрубей. Результаты для пяти наиболее продуктивных по сырому протеину (СП) грибов приведены на рис. 6.

25

8 20

и Trichoderma polysporum A Trichodenna viride

□ Aspergillus oryzae

□ КЗ

40 60 70 80 90 100 Содержание картона в ПС, %

Рисунок 6 - Зависимость накопления СП в культурах грибов от состава ПС

Наивысшее накопление СП (24,33 %) отмечено в культуре гриба Trichoderma polysporum, выращенного на среде, состоящей из 100% отрубей. Принимая во внимание совокупность таких параметров, как скорость роста гриба, накопление культурой белка, количество утилизируемого картона, для дальнейшего культивирования выбрана среда с соотношением картон:отруби = 70:30.

Наивысшее содержание СП на выбранной ПС отмечено при культивировании штаммов Trichoderma polysporum (19,47%), Trichoderma viride (19,29%), Aspergillus oryzae (18,51%).

3.4.2 Подбор консорциума грибных культур

Для повышения выхода биомассы и степени конверсии субстрата используют смешанные культуры микроорганизмов. Произведено совместное культивирование отобранных штаммов. Наивысшее содержание СП (23,55 %) отмечено в смешанной культуре Trichodenna viride, Trichoderma polysporum, Aspergillus oryzae.

3.4.3 Использование предварительной обработки картона с целью интенсификации биосинтеза белковых веществ грибами

С целью повышения реакционноспособности целлюлозы производилась химическая и ферментативная предобработка картона, входящего в состав ПС при поверхностном культивировании грибов Т. viride, Т. polysporum, Asp. oryzae.

При предобработке картона 1% пероксомоносерной кислотой накопление СП в готовой культуре составило 24,16%. При обработке 0,4% NaOH с гидромодулем 20 в течение 60 мин при давлении 0,2 МПа содержание СП составило 25,65 %.

Отмечено, что накопление СП в культуре консорциума, выращенного на ферментативно предобработанном картоне, повышается незначительно относительно аналогичных сред с необработанным картоном (рис. 7), что свидетельствует о нецелесообразности проведения

ферментативной обработки. Однако, с целью создания безотходной технологии,

непрогидролизованный после получения сахарных растворов остаток

целлюлозосодержащего сырья может быть утилизирован путем твердофазного

культивирования грибов.

3.4.4 Интенсификация процесса накопления СП путем подбора наиболее эффективного состава ПС

Для повышения степени конверсии целлюлозы в белок производилась подпитка солевыми растворами, молочной сывороткой, в картонно-отрубевую сыпучую ПС вносились плодовоовощные отходы.

При добавлении дигидрофосфата аммония в сочетании с нитратом калия в ПС (70% ферментированного картона + 30% отрубей) при культивировании смеси культур грибов содержание СП составило 26,63%.

Сыворотка в количестве 1-100% смешивалась с водопроводной водой, и полученной смесью увлажнялась ПС при культивировании грибного консорциума (рис.8). Отмечено, что внесение 100% сыворотки для увлажнения ПС повышало СП в грибной

Содержание картона в ПС, %

■ Ферментированный картон □ Необработанный картон

Рисунок 7 - Зависимость содержания СП в готовых культурах от обработки картона и его содержания в ПС.

27,2 « 27

3 26,8 < 26,6 Ь 26,4

о ¿0,4 5? 26,2 26

5 25,8 25,6 25,4

О 50 100

% сыворотки в водопроводной воде для увлажнения ПС

Рисунок 8 - Зависимость накопления СП в смешанной культуре грибов от концентрации добавляемой молочной сыворотки.

Очистки мандариновые Капуста Очистки морковные Овсяные отруби Шлам чайный Шлам кофейный Очистки картофельные Шелуха луковая Щепа дубовая Щепа ольховая Мука гречневая Мука овсяная Жмых кукурузный Опилки лиственных Отруби пшеничные Сено

Солома рисовая

1

1

»«61

1 1

1 ' 1

1

1

I

ШчШ 1

!

•

1

' . '1

1

О 5 10 15 20 25 30

СП, % от АСЕ

Рисунок 9 - Накопление СП в препарате консорциумом грибов при внесении в ПС различных отходов.

биомассе до 27,09 %, что превосходит показатели, полученные при внесении неорганических солей.

Поскольку многие

молокоперерабатывающие предприятия сталкиваются с проблемой утилизации сыворотки, предложенная технология может быть рассмотрена в качестве одного из возможных путей переработки данного отхода.

В целях разработки

универсальной технологии исследована возможность замены отрубей, входящих в состав ПС для культивирования консорциума грибов, на альтернативные субстраты, такие как различные виды муки, опилок, жмыхов, отходов переработки овощей и др. (рис. 9).

Наилучшие результаты показаны при внесении в ПС мандариновых, картофельных и морковных очисток, капусты и различных видов муки и отрубей. Содержание СП в готовых культурах не уступало культурам, выращенным с использованием пшеничных отрубей.

3.4.5 Обогащение кормового препарата пробиотическими микроорганизмами

С целью обогащения кормового белкового препарата пробиотическими микроорганизмами проводилось их внесение в полученную культуру консорциума грибов. Экспериментально подобран состав ПС для культивирования В. эиЫШз и Ь. р1ап1агшп (г/дм3): (МН4)28С>4 - 5; КН2Р04 - 3; гидролизат рыбной муки - 5; ЫаС1 - 3; автолизат дрожжей - 1, ферментолизат картона с РВ 25 г/дм3 - до 1 дм3.Титры клеток бактерий при этом составили 6,1 * 109 и 5,6 * 109 соответственно.

Изготовление обогащенных кормовых препаратов включало в себя культивирование грибов на сыпучих ПС, убивку; культивирование, бактерий на жидких ПС, отделение биомассы бактерий от культуральной жидкости путем центрифугирования, смешивание влажных концентрированных бактериальных масс с культурой грибов.

Исследование антагонистической активности бесклеточных КЖ бактерий показало их выраженный антагонизм по отношению к распространенным патогенам, а следовательно возможность внесения в качестве питья или в качестве увлажнителя корма животных.

3.4.6 Исследование полученного белково-углеводного концентрата на токсичность

Исследование готового обогащенного пробиотическими микроорганизмами кормового белково-углеводного концентрата (КБУК) на острую токсичность производилось с использованием суточной культуры инфузорий стилонихий. Установлено, что разработанный продукт не обладает острой токсичностью.

3.4.7 Характеристика готового КБУК

В готовом КБУК определяли содержание влаги, белка, золы, РВ, липидов, клетчатки (табл. 4).

Таблица 4 - Характеристика КБУК

Наименование Нормируемое значение по Значение показателя по

показателя ГОСТ 51095-97 результатам исследований

Массовая доля влаги,% не более 10,00 8,1

Массовая СП, % не нормируется 27,1

Массовая доля сырой не нормируется 47,4

клетчатки, %

Массовая доля жира, не нормируется 3,2

%а.с.в.

Массовая доля РВ, % не нормируется 10,1

Представленные результаты свидетельствуют о том, что полученный КБУК содержит достаточно высокое количество белка (27,1%), что позволяет использовать его в качестве потенциального источника протеина для добавки в корм скоту.

Определение аминокислотного состава проводилось в аналитической лаборатории Института естественных наук Thai Nguyen University в Ханое (СРВ) (табл. 5). Суммарная доля семи незаменимых аминокислот (кроме триптофана) в полученном КБУК составляет 33,5% от СП. КБУК обладает повышенной биологической ценностью и может быть рекомендован к использованию в качестве кормовой добавки.

Таблица 5 - Аминокислотный состав КБУК

Наименование аминокислоты Содержание аминокислоты, % от АСБ Наименование аминокислоты Содержание аминокислоты, % от АСБ

Аспарагиновая кислота 1,52 Тирозин 1,38

Глутаминовая кислота 3,39 Валин 1,26

Серии 1,12 Метионин 0,81

Гистидин 0,63 Фенилаланин 1,43

Глицин 1,13 Изолейцин 1,31

Треонин 1,03 Лейцин 1,81

Алании 1,08 Лизин 1,43

Аргинин 1,07 Пролин 2,37

3.5 Разработка технологии стимулятора роста растений из биомассы грибов

Многие микроорганизмы способны стимулировать рост и развитие растений за счет образования фитогормонов, способности к азотфиксации, улучшения водного и минерального питания растений, а также предотвращения или уменьшения развития фитопатогенов [Цавкелова, 2006].

3.5.1 Скрининг микроорганизмов, стимулирующих рост растений

Производилось изучение влияния культур микроскопических грибов на рост и развитие сельскохозяйственных растений. Твердофазные культуры грибов (биомасса с остатками питательной среды), выращенные на картонно-отрубевых средах, смешивались с торфом в различных соотношениях, и на таких субстратах производилось проращивание семян пшеницы. Как видно из диаграммы на рис.10, внесение биомасс Trichoderma viride, Aspergillus sp. 4-2, Trichoderma polysporum и Trichoderma harzianum в почву положительно влияло на накопление СП в растениях пшеницы.

Рисунок 10 - Зависимость накопления СП в надземной части растений пшеницы от вида и количества вносимой в субстрат культуры грибов.

Наибольшее содержание СП в надземной части растений пшеницы на 10-е сутки (11,05 и 10,99 % от АСБ) отмечено при внесении в торфосубстрат 30% биомасс грибов Т. harzianum и Т. viride соответственно.

3.5.2 Составление консорциумов из нескольких микроорганизмов

Отобранные культуры были скомбинированы для получения консорциумов, выращены совместно на сыпучих картонно-отрубевых ПС и внесены в торф при проращивании пшеницы. Наибольшее действие на накопление пшеницей СП (11,47 % от АСБ) оказывало внесение в почву консорциума культур Т. viride, Т. polysporum, Т. harzianum в количестве 30%.

При увлажнении консорциума культур грибов Т. viride, Т. polysporum, Т. harzianum смесью культуральных жидкостей бактерий Azotobacter sp., L. acidophilus и L.plantarum, выращенных на синтетических ПС, содержащих в качестве жидкой фазы и единственного источника углерода фермеитолизат картона, удалось достичь содержания в надземной части растений пшеницы СП 13,29% от АСВ.

3.5.3 Получение сухого препарата-стимулятора роста растений

Влажная бактериально-грибная культура высушивалась конвективным методом до остаточной влажности 8-10%. Определялся биохимический состав и активности ферментов готового препарата-стимулятора роста растений (табл. 6).

Таблица 6 - Характеристика препарата-стимулятора роста растений

Показатель Значенне, % от АСБ

СП, % от АСБ 18,1

Клетчатка, % от АСБ 53,6

РВ, % от АСБ 12,5

Липиды, % от АСБ 3,7

Целлюлазная активность, ЦлА, ед/г 93,5

Карбоксиметилцеллюлазная активность, ед/г 27,4

Использование микробиологических препаратов, обладающих комплексом полезных свойств, представляет собой большой интерес для повышения почвенного плодородия и продуктивности культурных растений, защиты их от фитопатогенов, повышения качества урожая, снижения норм внесения минеральных удобрений и пестицидов.

В соответствии с проведенными расчетами экономической эффективности разработанных технологий, себестоимость готовых препаратов составила: ФП целлюлаза 4-210 Г10Х - 124,59 руб/кг, ПБУК - 69,30 руб/кг, КБУК - 24,49 руб/кг, что значительно ниже ми сопоставимо с ценой ближайших конкурентных аналогов.

выводы

1. Исследование биохимического состава картонной фракции отходов комбинированной упаковки Тетра Пак показало, что она на 91% состоит из целлюлозы, что обосновывает необходимость использования различных методов обработки для ее конверсии в глюкозу, усваиваемую всеми микроорганизмами.

2. Результаты скрининга микроорганизмов позволили выявить изолят, обладающий максимальной целлюлазной активностью, идентифицированный как Aspergillus sp. 4-2, на основе культивирования которого разработана биотехнология спиртоосаждснной целлюлазы Ч-2-10 Г10Х. Активность целлюлазы 4-2-10 Г10Х составила 2375,13 ед/г.

3. Разработана технология получения растворов редуцирующих веществ путем ферментативного гидролиза картона с использованием нового ферментного препарата целлюлазы 4-2-10 Г10Х.

4. Разработан режим глубинного культивирования дрожжей P.anomala 9а-48 на питательной среде, содержащей ферментолизат картона в качестве основного источника углерода.

5. На основе экспериментально установленных эффективных условий экстракции липидов и нуклеиновых кислот из дрожжевой биомассы разработана технология пищевого белково-углеводного концентрата. Показано, что ПБУК обладает хорошими функциональными качествами и может быть введен в рецептуры пищевых продуктов с целью повышения их биологической ценности (содержание незаменимых аминокислот превышает 30%).

6. Разработана малоотходная технология кормового белково-углеводного концентрата на основе твердофазного культивирования грибов на питательных средах, содержащих картон. Показано, что КБУК обладает повышенной биологической ценностью (содержание незаменимых аминокислот превышает 30%), что подтверждает возможность его применения в составе кормов.

7. Экспериментально установлена возможность обогащения КБУК пробиотическими микроорганизмами.

8. Разработана технология препарата-стимулятора роста растений на основе бактериально-грибного консорциума. Показано его выраженное положительное влияние на рост и развитие растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Иванова Л.А. Утилизация отходов картонной упаковки путем биоконверсии в препарат-стимулятор роста растений / Л.А.Иванова, Д.А.Глазона, Н.В. Здоровило // Естественные и технические науки. -2012. -№6. -С.105-106.

2. Иванова Л.А. Разработка комплексной технологии переработки комбинированной упаковки «Тетра-Пак» / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, В.А.Репник, Н.В.Здоровило, Ю.В. Шелудько // Экология и промышленность России. - 2012. - №12. - С.26-29

3. Глазова A.A. Оптимизация состава питательной среды при культивировании дрожжей на ферментолизатах упаковочного картона / A.A. Глазова, Л.А. Иванова // Естественные и технические науки. - 2013. -№. - С.306-308.

Статьи и материалы конференций:

4. Иванова Л.А. Технология комбинированного гидролиза бумажных упаковочных материалов / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, В.А.Репник, // Технология и производственный менеджмент/ МГУПП -М., 2011, -С.230-237.

5. Глазова A.A. Биоконверсия целлюлозосодержащих материалов - экологичный подход к переработке отходов комбинированной упаковки / A.A. Глазова, В.А.Репник, Л.А. Иванова // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы IX международной научной конференции студентов и молодых ученых / МГУПП - М., 2011, -С.З-5.

6. Иванова Л.А. Использование промышленных и бытовых отходов в качестве сырья для получения грибных целлюлаз / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, В.А.Репник, Ю.В.Шелудько, Н.В. Здоровило // Биология - наука XXI века: Материалы Международной конференции / Ред. Р.Г. Василов. - М.: МАКС Пресс, 2012. - 314-315.

7. Иванова Л.А. Разработка способа получения препарата-улучшителя почвы на основе твердофазной биоконверсии бумажных упаковочных материалов / Л.А.Иванова, А.А.Глаюва, Н.В. Здоровило // Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: материалы II Всероссийской научно-практической конференции (с международным участием) / ВСГУТУ. - Улан-Удэ, 2012. - С. 15-17.

8. Иванова Л.А. Разработка технологии переработки отходов картонной упаковки Тетра Пак в кормовые белковые препараты / Л.А.Иванова, А.А.Глазова, Ю.В. Шелудько // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: материалы международной научно-практической конференции / ВНИТИБП, Щелково, 2012. -С.473-477.

9. Глазова А.А. Комбинированная упаковка Тетра Пак - перспективное сырье для биоконверсии / А.А. Глазова, Л.А.Иванова, Н.В.Здоровило, Ю.В. Шелудько // Биотехнология -состояние и перспективы развития: материалы VII Московского Международного Конгресса, часть 2 / М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2013. - С.335-336

10. Glazova А.А. Selection of microorganism for cardboard package residue bioconversion / A.A.Glazova, L.A.Ivanova, Y.V.Sheludko, N.V.Zdorovilo, E.S. Sokolova // National Workshop on Biotechnology 2013: Workshop Proceedings, Hanoi, 2013. - P. 153-156.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

АСБ - абсолютно сухая биомасса; БГКП - бактерии группы кишечной палочки; КБУК - кормовой белково-углеводный концентрат; КЖ - культуральная жидкость;

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов;

КОЕ - колониеобразующая единица;

ПБУК - пищевой белково-углеводный концентрат;

ПМ - посевной материал;

ПС - питательная среда;

ПФЭ - полный факторный эксперимент;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РВ - редуцирующие вещества;

СП - сырой протеин;

ФП - ферментный препарат;

ЦлА - целлюлазная активность.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю д.т.н., профессору Ивановой Л.А. за всестороннее внимание, поддержку, руководство при выполнении и написании работы; заведующей кафедрой «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «МГУПП» д.б.н., профессору Бутовой С.Н., а также всем сотрудникам кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Подписано в печать 22.10.13. Формат 60x90 1/16 Печ. л. 1,5. Тираж 150 экз. Изд. X« 45. Заказ 133. Издательский комплекс МГУПП 125080, Москва, Волоколамское ш., 11

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Глазова, Александра Андреевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»

04201364676 На пРавах рукописи

ГЛАЗОВА АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ БУМАЖНЫХ УПАКОВОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ В ПРОДУКЦИЮ ДЛЯ АГРОПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор технических наук, профессор Л.А. Иванова

Москва-2013

Оглавление

Введение...........................................................................................................................9

Глава 1 Обзор литературы............................................................................................16

1.1 Комбинированная упаковка как перспективное сырье для переработки..........18

1.2 Характеристика картона как сырья для переработки: биохимический состав, свойства, способы повышения реакционной способности..........................20

1.3 Основные направления эффективной утилизации отходов картонной упаковки..........................................................................................................................22

1.3.1 Получение глюкозы из целлюлозы путем химического гидролиза................24

1.3.2 Применение методов ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья.....................................................................................25

1.3.2.1 Состав и свойства ферментов целлюлазного комплекса...............................27

1.3.2.2 Микроорганизмы-продуценты целлюлаз........................................................29

1.3.2.3 Культивирование микроорганизмов-продуцентов белковых веществ

на ферментолизатах растительного сырья..................................................................31

1.3.3 Прямая биоконверсия целлюлозосодержащего сырья путем поверхностного твердофазного культивирования микроорганизмов......................35

1.4 Комплексная переработка комбинированной упаковки......................................37

Глава 2 Материалы и методы.......................................................................................42

2.1 Приборы, расходные материалы и лабораторная посуда используемые в работе..............................................................................................................................42

2.2 Питательные среды, используемые в работе........................................................44

2.3 Источник углерода в питательных средах............................................................47

2.4 Биологические объекты, использованные в работе.............................................48

2.4.1 Источники выделения целлюлазоактивных микроорганизмов.......................48

2.4.2 Тест-объекты для определения токсичности.....................................................48

2.5 Методы......................................................................................................................48

2.5.1 Определение массовой доли влаги.....................................................................49

2.5.2 Определение массовой доли золы......................................................................49

2.5.3 Определение массовой доли «сырой клетчатки»..............................................49

2.5.4 Определение массовой доли лигнина.................................................................49

2.5.5 Определение массовой доли жира......................................................................49

2.5.6 Определение содержания редуцирующих веществ (РВ)..................................50

2.5.7 Определение количества нуклеиновых кислот.................................................50

2.5.8 Определение массовой доли белковых веществ...............................................50

2.5.8.1 Метод определения массовой доли белка по Кьельдалю..............................50

2.5.8.2 Метод определения массовой доли «сырого протеина» по Несслеру.........51

2.5.8.3 Определение массовой доли белка по методу Лоури....................................51

2.5.9 Определение величины рН..................................................................................52

2.5.10 Определение активностей ферментов..............................................................52

2.5.10.1 Метод определения активности целлюлазы по фильтровальной

бумаге..............................................................................................................................52

2.5.10.2 Метод определения активности целлюлазы по КМЦ..................................53

2.5.10.3 Метод определения амилолитической активности ферментов..................53

2.5.10.4 Метод определения протеолитической активности ферментов.................53

2.5.11 Скрининг целлюлазоактивных микроорганизмов из природного материала........................................................................................................................54

2.5.12 Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств продуцента целлюлолитических ферментов..............................................................55

2.5.12.1 Морфология клетки.........................................................................................56

2.5.12.2 Культуральные признаки................................................................................56

2.5.12.3 Физиолого-биохимические свойства.............................................................56

2.5.13 Изучение филогенетических особенностей культуры....................................57

2.5.14 Выращивание культур микроорганизмов........................................................58

2.5.14.1 Выращивание культур микроорганизмов в условиях глубинной ферментации...................................................................................................................58

2.5.14.2 Выращивание культур микроорганизмов поверхностным твердофазным способом...............................................................................................58

2.5.15 Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха)........................................................................................................59

2.5.16 Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), дрожжей и плесневых грибов........59

2.5.17 Проведение УФ-индуцированного мутагенеза...............................................59

2.5.18 Осаждение ферментов органическими растворителями................................60

2.5.19 Проведение предобработки картона.................................................................60

2.5.19.1 Химическая обработка картона......................................................................60

2.5.19.2 Проведение ферментативного гидролиза упаковочного картона..............61

2.5.20 Экстракция липидов из дрожжевой биомассы................................................61

2.5.20.1 Выбор условий экстракции липидов.............................................................61

2.5.21 Получение сухого белкового препарата...........................................................62

2.5.22 Определение аминокислотного состава белков полученных препаратов....62

2.5.23 Определение функциональных свойств белковых препаратов.....................62

2.5.23.1 Метод определения растворимости белковых препаратов.........................62

2.5.23.2 Метод определения набухаемости белковых препаратов...........................63

2.5.23.3 Метод определения жиросвязывающей способности.................................63

2.5.23.4 Метод определения водосвязывающей способности..................................63

2.5.24 Метод определения сорбционной способности..............................................64

2.5.25 Метод определения острой токсичности.........................................................64

2.5.26 Математические методы планирования эксперимента..................................65

2.5.26.1 Метод последовательных смещений.............................................................65

2.5.26.2 Метод полного факторного эксперимента (ПФЭ).......................................65

2.5.27 Методика изготовления овсяных печений с введением в рецептуру разработанного белково-углеводного концентрата...................................................66

2.5.28 Методика изготовления хлебобулочных изделий с введением в рецептуру разработанного белково-углеводного концентрата.................................67

2.5.29 Методика проращивания семян........................................................................67

2.5.30 Методика определения антагонистической активности микроорганизмов...........................................................................................................68

2.5.31 Методика определения массовой доли пищевых волокон.............................69

Глава 3 Экспериментальная часть...............................................................................70

3.1 Исследование биохимического состава и свойств упаковочного картона........70

3.2 Разработка технологии грибной целлюлазы.........................................................71

3.2.1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов целлюлаз.......................................71

3.2.2. Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков грибного изолята 4-2......................................................74

3.2.2.1 Морфология клетки...........................................................................................74

3.2.2.2 Культуральные признаки изолята 4-2.............................................................74

3.2.2.3 Определение физиолого-биохимических свойств Aspergillus sp. Ч -2........75

3.2.2.4 Видовая идентификация изолята 4-2 с применением анализа 18S

рРНК................................................................................................................................77

3.2.3 Изучение влияния вида добавляемых в ПС источников азота и фосфора, а также их количеств на ЦлА при глубинном культивировании Aspergillus sp.4-2...............................................................................................................................78

3.2.4 Влияние источников углерода в ПС на ЦлА ферментов фугата культуральной жидкости Aspergillus sp.4-2...............................................................81

3.2.5 Использование предобработки картона с целью интенсификации синтеза целлюлаз Aspergillus sp.4-2............................................................................82

3.2.6 Влияние pH исходной ПС на ЦлА ферментов, синтезируемых Aspergillus sp.4-2...........................................................................................................83

3.2.7 Влияние содержания микроэлементов в ПС на биосинтез целлюлаз грибом Aspergillus sp.4-2..............................................................................................84

3.2.8 Влияние внесения твин-80 в ПС на биосинтез ферментов Aspergillus sp.4-2...............................................................................................................................86

3.2.9 Влияние молочной сыворотки, добавляемой в ПС, на биосинтетическую способность Aspergillus sp.4-2.................................. ...................................................87

3.2.10 Влияние возраста и дозы посевного материала на синтез целлюлаз грибом Aspergillus sp. 4-2.............................................................................................89

3.2.11 Влияние длительности культивирования Aspergillus sp. 4-2 на активность целлюлаз в культуральной жидкости......................................................90

3.2.12 Применение УФ-индуцированного мутагенеза Aspergillus sp. 4-2 с целью улучшения биосинтетической способности....................................................91

3.2.13 Осаждение целлюлолитических ферментов органическими растворителями..............................................................................................................92

3.2.14 Изучение свойств полученного ферментного препарата...............................94

3.2.14.1 Определение эффективных условий проведения ферментативного

гидролиза картона полученным ФП............................................................................96

3.3 Разработка технологии белково-углеводного концентрата пищевого назначения из биомассы дрожжей, выращенных на ферментолизатах картона... 102

3.3.1 Получение ферментолизатов картона..............................................................102

3.3.2 Скрининг культур дрожжей..............................................................................102

3.3.3 Применение УФ-индуцированного мутагенеза P. anomala 9а.......................104

3.3.4 Влияние количества РВ в ферментолизате картона на выход биомассы дрожжей P.anomala 9а-48............................................................................................104

3.3.5 Влияние вида добавляемых в ПС источников азота и фосфора, а также

их количеств на накопление биомассы P. anomala 9а-48........................................105

3.3.6 Влияние рН питательной среды на рост дрожжей P. anomala 9а-48.............107

3.3.7 Влияние количества вносимых макро- и микроэлементов на накопление биомассы дрожжами P.anomala 9а-48........................................................................108

3.3.8 Влияние пептона, отрубей, кукурузного и дрожжевого экстрактов в ПС

на рост дрожжей P.anomala 9а-48..............................................................................109

3.3.9 Влияние твин-80 в ПС на продуктивность дрожжей P.anomala 9а-48..........110

3.3.10 Влияние количества посевного материала на прирост биомассы P.anomala 9а-48.............................................................................................................111

3.3.11 Влияние длительности культивирования на накопление биомассы дрожжами P.anomala 9а-48.........................................................................................112

3.3.12 Проведение оптимизации состава питательной среды с использованием математических методов планирования экспериментов............113

3.3.13 Исследование биохимического состава биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48..............................................................................................................................115

3.3.14 Определение эффективных условий экстракции липидов из биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48...........................................................................................115

3.3.15 Определение эффективных условий денуклеинизации обезжиренной дрожжевой биомассы..................................................................................................120

3.3.16 Дезинтеграция биомассы дрожжей Р. anómala 9а-48...................................122

3.3.17 Характеристика готового пищевого белково-углеводного концентрата.... 123

3.3.17.1 Оценка аминокислотного состава белков ПБУК.......................................124

3.3.17.2 Оценка функциональных свойств белков ПБУК.......................................125

3.3.17.3 Оценка сорбционной способности ПБУК по отношению к микроорганизмам.........................................................................................................127

3.3.18 Апробация полученного ПБУК в составе рецептур при изготовлении продуктов питания.......................................................................................................128

3.3.18.1 Введение ПБУК в рецептуру овсяного печенья.........................................128

3.3.18.2 Введение ПБУК в рецептуру хлебобулочных изделий.............................131

3.4 Разработка технологии кормового белково-углеводного концентрата (КБУК) из биомассы грибов.......................................................................................135

3.4.1 Скрининг целлюлазоактивных микроорганизмов - продуцентов белка......136

3.4.2 Подбор консорциума грибных культур............................................................138

3.4.3 Использование предварительной обработки картона с целью интенсификации биосинтеза белковых веществ грибами.......................................139

3.4.4 Внесение в ПС различных источников питательных веществ......................142

3.4.5 Обогащение кормового препарата пробиотическими микроорганизмами.. 145

3.4.6 Исследование полученного белково-углеводного концентрата на токсичность..................................................................................................................148

3.4.7 Получение сухой формы КБУК........................................................................148

3.4.8 Характеристика готового КБУК.......................................................................148

3.4.8.1 Анализ аминокислотного состава белков КБУК..........................................149

3.5 Разработка технологии стимулятора роста растений из биомассы грибов.....151

3.5.1. Скрининг микроорганизмов, стимулирующих рост растений.....................151

3.5.2 Составление консорциумов из нескольких микроорганизмов......................153

3.5.3 Создание бактериально-грибной ассоциации для стимуляции роста растений........................................................................................................................155

3.5.4 Получение сухого препарата-стимулятора роста растений...........................156

3.5.5 Испытания полученного стимулятора роста на злаковых, бобовых и

овощных культурах.....................................................................................................157

Выводы..........................................................................................................................159

Перечень использованных в тексте диссертации сокращений...............................161

Список использованной литературы.........................................................................162

Приложение А. Протоколы испытаний.....................................................................182

Приложение Б. Нормативно-техническая документация........................................184

Приложение В. Акты производственных испытаний..............................................191

Приложение Г. Технологическая часть.....................................................................200

Приложение Д. Расчет экономической эффективности..........................................218

Приложение Е. Дипломы............................................................................................226

Введение

Актуальность темы. В настоящее время во всем мире остро стоит проблема утилизации бытовых отходов. В Российской Федерации ежегодно образуется свыше 50 млн. т твердых бытовых отходов, из них 35% приходится на бумагу и картон. Комбинированная упаковка Тетра Пак представляет собой ценное вторичное сырье (75% картона, 21% полиэтилена, 4% алюминия), которое крайне нерационально, как с экономической, так и с экологической точек зрения, закапывать в землю и сжигать. Важным направлением современной биотехнологии является эффективное использование возобновляемых источников вторичного сырья (отходы целлюлозно-бумажной промышленности, сельского хозяйства и бытовые отходы) для получения ценных кормовых и пищевых продуктов и решения экологических проблем.

В то же время важнейшей проблемой современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами. Наряду с интенсификацией сельского хозяйства и освоением ресурсов Мирового океана, опыт показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза в решении этой проблемы.

Настоящая работа посвящена разработке комплексной технологии переработки картонной упаковки, позволяющей получить ряд продуктов, таких как ферментные препараты (например, целлюлазы), белково-углеводные концентраты для применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве, препараты-стимуляторы роста растений для сельского хозяйства.

Степень разработанности проблемы. Важный вклад в развитие методов микробиологического синтеза для решения проблемы дефицита белковых веществ при использовании целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности внесли Л.К. Эрнст, Л.А. Иванова, М.В. Гернет, Е.Г. Борисенко.

Г.И. Воробьевой, И.М. Грачевой, А.П. Синицыным, А.Г. Лобанком, Н.Б. Градовой разработаны способы эффективной переработки

целлюлозосодержащего сырья, включающие комплексную переработку,

получение ферментных препаратов, белоксодержащих продуктов кормового и пищевого назначения. Ан