Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья

Соболева, Анна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья"

На правах рукописи

СОБОЛЕВА АННА ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТАУРИНА ИЗ КЕРАТИНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

03.00.23.- биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент-

Красноштанова Алла Альбертовна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Коваленко Леонид Владимирович

кандидат технических наук, Кочетова Светлана Петровна

Ведущая организация:

ФГУП ГосНИИсинтез белок

Защита диссертации состоится ■ "¿Г" уСЫПлИ 2004 г в часов на

заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева по адресу 125047, Москва, Миусская пл., д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном Центре РХТУ имени Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан ЛмА/бЦ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук

Актуальность работы. Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) как продукт метаболизма серосодержащих аминокислот ( Ь-цистина и Ь-цистеина) играет важную роль в обеспечении различных функций человека, связанных со зрением, агрегацией тромбоцитов, активностью инсулина и др. Поэтому находит применение в медицине, а также имеет значение для кормовой и пищевой промышленности. Таурин - достаточно простое соединение, которое может быть синтезировано химически, а также путем трансформации вышеуказанных Ь-аминокислот под действием комплекса ферментов клеток печени. В последнем случае сырьевой базой может быть богатое Ь-цистином кератинсодержа-щее сырье, являющееся в настоящее время плохо утилизируемым отходом мясоперерабатывающих заводов. Те же предприятия располагают и источниками ферментных препаратов в виде клеток поджелудочной железы (для гидролиза белковых веществ) и печени убойных животных (для трансформации Ь-цистина и Ь-цистеина в таурин).

Целью работы явилась разработка основ малоотходной технологии получения очищенного препарата таурина из кератинсодержащего сырья.

В задачи работы входило: разработка основных стадий технологического процесса получения таурина из кератинсодержащего сырья с использованием химических реагентов и технических ферментов и определение оптимальных условий их проведения на основе разработанных математических моделей.

Научная новизна: показана возможность получения очищенного препарата таурина по малоотходной технологии, включающей в себя растворение ке-ратинсодержащего сырья в щелочном растворе с пониженным содержанием гидроксида натрия, гидролиз белоксодержащего раствора до Ь-цистина и Ь-цистеина комплексом ферментов клеток поджелудочной железы, трансформацию вышеуказанных аминокислот в составе белкового гидролизата в таурин комплексом ферментов печени животных, ионообменное выделение таурина и кристаллизацию препарата из водных и водно-спиртовых растворов.

Практическая значимость: разработаны основные стадии технологического процесса получения препарата таурина (с содержанием основного вещества не ниже 96%) из кератинсодержащего сырья. На основе разработанных математических моделей предложены алгоритмы управления стадиями химического растворения кератинов, их энзиматического гидролиза и трансформации свободных Ь-цистина и Ь-цистеина в таурин под действием ферментов.

Публикации: по материалам работы опубликованы 3 статьи, подана 1 авторская заявка на патент РФ "Способ получения таурина", 3 тезисов докладов на Международной конференции молодых ученых (г.Тверь, 25-28.09.01 г.), XVI Международной конференции молодых ученых (РХТУ имени Д.И.Менделеева, Москва, 27-29.11.02 г.), 2-ом Московском конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14.11.03 г.).

Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы (97 наименова-

ний) и 6 приложений. Работа изложена на 166 стр. машинописного текста и содержит 13 таблиц, 58 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы приводятся характеристика и области применения тау-рина, краткая характеристика метаболических путей образования таурина в клетках из серосодержащих аминокислот, способы выделения таурина из различного сырья, а также характеристика кератинсодержащего сырья и способы получения из него белковых гидролизатов с различной степенью гидролиза.

2. Материалы и методы

В работе использовали кератинсодержащее сырье (на примере рого-копытного) - отход ОАО Раменского мясокомбината, содержащего не менее 80% сырого протеина, индивидуальные аминокислоты L-цистин и L-цистеин производства фирмы "Merk", технические ферментные препараты: протосубти-лин ГЗх производства ОАО "Восток ", клетки поджелудочной железы и печени крупного рогатого скота (КРС), а также химические реактивы квалификации не ниже "чда", титранты и растворы для проведения анализов готовили на дистиллированной воде.

Содержание сырого протеина определяли микрометодом Кьельдаля, белковых веществ модифицированным методом Лоури, аминного азота и таурина определяли хроматографически по реакции с нингидриновым реагентом, количество цистина и цистеина - титриметрически с использованием бромата и ио-дида калия соответственно.

Эксперименты по растворению и гидролизу белковых веществ, трансформации цистина и цистеина проводили в лабораторном стеклянном реакторе, объемом до 1 литра, снабженным рубашкой для обогрева из термостата, горловинами для отбора проб и механической мешалкой.

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки "Specord - М40". Выделение таурина проводили методом статического ионного обмена с применением высокоосновного анионита АВ-17-2.

Экспериментальные данные обрабатывали, используя стандартные программы интегрирования дифференциальных уравнений и оптимизации их параметров с последующим сопоставлением результатов расчета с экспериментом по критерию Фишера при уровне значимости 0,05 для проверки адекватности разработанных математических моделей эксперименту.

3. Основные результаты работы отражены в следующих защищаемых положениях:

3.1. Растворение кератинсодержащего сырья в растворе гидроксида натрия

Переработке кератинсодержащего сырья должна предшествовать стадия его растворения. Как показали предварительные исследования, природные кератины практически не растворяются в аммиачной воде, но могут полностью рас-

творяться в растворе гидроксида натрия невысокой концентрации, образуя соответственно высоко- (ВМФ) и низкомолекулярные фракции (НМФ) белковых веществ.

Практически не изучен процесс растворения кератинов под действием гид-роксидов металлов при их ограниченной концентрации. Поэтому изучению этой стадии была посвящена данная глава работы. В качестве параметров данного процесса были выбраны: температура, начальное содержание кератинов и гидроксида натрия в суспензии, которые меняли в интервалах 70-90°С, 2-10%мас, 0,1-0,5 М соответственно.

На рис.1 приведены типичные кривые степени накопления белковых веществ в виде ВМФ и НМФ и расходования гидроксида натрия в среде при растворении кератинов в щелочном агенте. Анализ полученных белковых растворов на свободный аммиак, сероводород, цистеин и цистин показал, что все эти соединения в них присутствуют, причем в указанных на рис.1 условиях растворения их выход достигает уровня 2,9-6,7% мол. Данные факты свидетельствуют о том, что процесс растворения кератинов является гидролитическим, катализируемый гидроксидом натрия. Он обусловлен разрывом пептидных связей, частичным дезаминированием, скорее всего, аргинина и десульфированием цистина. При этом значительное количество образующихся в ходе растворения кислых продуктов приводит к расходу щелочи на их нейтрализацию. Сопоставление аналогичных зависимостей, полученных при различной температуре и концентрации гидроксида натрия, а также анализ литературных данных, показывает, что количественные закономерности исследуемого процесса растворения кератинов могут быть установлены, если воспользоваться следующей известной схемой последовательно-параллельных превращений:

кр (путь 1)

Рм --Ро

+ЫаОН

(путь 2) +ЫаОН крр,0 -ЖаОН

кРР1 (путь 3) (1),

РРо(ААо) РР^АА,)

где: - белок в твердой фазе, а соответственно ВМФ

и НМФ белковых веществ в растворе.

Ранее такая схема была успешно апробирована при изучении процесса гидролиза других белков, катализируемого минеральными кислотами. Для нее был установлен 1-ый порядок для всех стадий последовательно-параллельных превращений белковых веществ. Однако наблюдаемый в нашем случае расход щелочного агента также должен учитываться при изучении кинетики процесса растворения (1). Исходя из этого была выбрана следующая схема обработки экспериментальных данных.

Первоначально при одной и той же температуре (90°С) и исходной концентрации щелочи (0,25 моль/л) изучали зависимость начальной скорости (го)

растворения кератинов от исходного содержания растворяемого белка в суспензии. Как видно из рис.2, данную зависимость можно считать линейной (коэффициент корреляции Гк=0,95). В нашем случае наличие параллельного пути образования НМФ за счет легкогидролизуемых связей подтверждает линейный участок зависимости, приведенный на рис.3. Зависимости, представленные на рис.2 и 3, позволяют оценить численные значения эффективных констант кр и Константу находили подбором численных значений при интегрировании системы дифференциальных уравнений, отвечающих схеме превращений

(1). После оценки всех значений констант проводили их оптимизацию.

Тот же подход использовали при изучении влияния температуры и начальной концентрации гидроксида натрия в среде, обрабатывая соответствующие серии кинетических кривых. В ходе нее было установлено, что влияние на скорость растворения кератинов температуры описывается широкоизвестным уравнением Аррениуса, а содержания гидроксида натрия в среде - уравнением специфического кислотно-основного катализа:

к = (к*' Зон")/(Кь + аон). (2) где к* - эффективная константа скорости, не зависящая от активности гидро-ксид-иона в водном растворе, аон" - активность гидроксид-иона, Кь - константа равновесия образующегося интермедиата между гидролизуемыми пептидными связями в белках и гидроксид-ионами.

На основе установленных значений констант к^фф, уравнений Аррениуса и

(2) были рассчитаны параметры ко, Кь и Е (эффективной энергии активации) для каждой стадии в схеме превращений (1). Их значения приведены в табл. 1.

Как показали последующие расчеты, схема превращений (1) определяет математическую модель химического растворения кератинов в водном растворе гидроксида натрия. Она адекватно описывает экспериментальные данные в выбранных интервалах изменения температуры, содержания щелочи и растворяемого белоксодержащего сырья.

Таблица 1

Значения параметров процесса растворения кератинов в щелочном_ растворе

Путь Е, кДж/моль Кь, моль/л ко"0, с1 10'

1 36,8 ±2,9 0,10±0,01 110±10

2 26,6±2,1 0,08±0,01 59±1

3 91,7±4,6 1,88±0,15 25±2

В исследованных интервалах изменения параметров ВМФ и НМФ белковых веществ присутствуют в растворе в сопоставимых концентрациях. Однако для практики важно знать также условия проведения процесса, когда преимущественно Образуются ВМФ или НМФ белковых веществ. Для их нахождения были проведены соответствующие расчеты с последующей проверкой полученных результатов в эксперименте. Итогом такого исследования явилось нахождение условий полного растворения кератинов в щелочном растворе, обеспечивающих для ВМФ максимум выхода 70% при температуре 70-80°С, концентрации

гидроксида натрия 0,10 моль/л, исходном содержании кератинов в суспензии 10% масс. СВ и времени растворения 65-75 мин. Максимум выхода НМФ (95%) для той же суспензии должен наблюдаться при температуре 145-150°С, при-концентрации гидроксида натрия 0,10-0,15 моль/л за 60-90 мин. Предполагаемый высокотемпературный режим гидролиза белковых веществ был проверен экспериментально. В результате было установлено следующее: состав гидроли-зата соответствует расчетным значениям концентраций ВМФ и НМФ белковых веществ, что указывает на возможность использования математической модели в широком интервале изменения температуры, однако такому гидролизату присуща сильная окраска. Это указывает на значительное содержание в нем пигментов. Очистку белковых растворов от пигментов'проводят, как правило, по технологии ионного обмена, что ведет к образованию значительных объемов сточных вод. Чтобы избежать этого и не осложнять процесс выделения таури-на, мы выбрали в качестве оптимальных условий проведения процесса полного растворения кератинов: температура - 90°С, концентрация гидроксида натрия -0,25 моль/л, содержание кератинсодержащего сырья в суспензии - 10% мас. СВ, время растворения - 1ч. Полученный в этих условиях раствор белковых веществ содержит около 60% ВМФ и только 40% НМФ, что явно недостаточно. Поэтому следующей стадией технологического процесса должен быть догидро-лиз фракций белковых веществ, обеспечивающий технологически приемлемый выход предшественников таурина - L-цистина и L-цистеина. Для решения данной задачи был выбран наиболее дешевый и доступный технический ферментный препарат (ФП) микробного происхождения протосубтилин ГЗх.

3.2 Гидролиз белковых веществ протосубтилином В качестве субстрата был взят гидролизат, полученный в условиях опыта рис.1. Он содержал 60% ВМФ, 30% НМФ и 10% аминного азота. Результаты предварительных опытов показали, что протосубтилин способен гидролизовать практически с одной и той же скоростью ВМФ и НМФ кератиновых белков с преимущественным образованием пептидов. Для данного ФП известно, что количественные закономерности процесса гидролитического воздействия его протеаз на разные фракции белковых веществ подчиняются той же схеме последовательно-параллельных превращений (1), но с учегом особенностей ферментативных реакций. Такая схема превращений имеет вид:

(3),

где: Ро - ВМФ или НМФ белковых веществ, образующихся в результате растворения кератинов в щелочном растворе, Е, РоЕ, Р|Е - соответственно концентрации свободного фермента и фермент-субстратных комплексов КМ| и Кц2 -

константы Михаэлиса, кР|, крро и кРР| - константы скорости ферментативного гидролиза. ,

С учетом литературных данных схема превращений (3) должна быть дополнена уравнением термоинактивации свободного фермента:

где: Ец/а - инактивированная форма фермента, кн» - константа скорости термической инактивации свободного фермента (Е).

На рис.4 приведены кривые гидролиза ВМФ и накопления НМФ белковых веществ, образующихся в результате воздействия на раствор кератинов протеаз протосубтилина.

Для оценки перспективы использования вышеуказанной схемы превращений (3) и уравнения (4) в количественном описании данного процесса были проведены исследования по влиянию начальной концентрации субстрата, температуры и рН среды на скорость гидролиза фракций белковых веществ. В результате были получены соответствующие серии кинетических кривых, которые в дальнейшем были обработаны так же, как описано выше в разделе 3.1. При этом значение параметров процесса термической инактивации мы не устанавливали, а. взяли из литературы. Результаты такой обработки подтвердили справедливость принятой схемы превращений (3) для адекватного описания исследуемого процесса. Ниже в табл.2 приведены значения констант и энергий активации соответствующих стадий ферментативного гидролиза.

Таблица 2

Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий фер-

П\тъ Е, кДж/моль Ка, л/моль к",с1

1 21,8±2,2 (4,1 ±0,4)" Ю"' 0,40±0,04

2 18,5±1,2 (2,4±0,2) 10"° 0,52±0.05

3 18,3±1,1 (2,3*0,2)10-° 0,б4±0,06

Инактивация 50,0±4,8 (1,4±0,1)Ю"° (1,2±0,1)Ю-4

КМ|=0.58 л/моль, Км2=0.23 л/моль.

Далее были рассчитаны и экспериментально проверены оптимальные условия его проведения. Было установлено, что все фракции кератиновых белков могут быть гидролизованы не менее, чем на 70% в низкомолекулярные продукты за 4 ч при температуре 2-х кратной загрузке фермента через каждые 2 ч. При этом расход ФП не превышает 4% от массы субстрата. Однако выход аминного азота остается невысоким и составляет не более 15%.

Таким образом, применение протосубтилина повышает степень деполимеризации белковых веществ, причем выход свободных цистина и цистеина, необходимых для их трансформации в таурин не превышает 15% мол. Увеличить его возможно, если использовать на стадии гидролиза доступные пептида-зы. В качестве источника последних мы использовали клетки поджелудочной

время, мин

Рис I. Кривые расходования гизроксиза натрия (Хв) и накопления белковых веществ: ВМФ (Хр), НМФ (Хрр), аминного азота (Хаа) в процессе щелочного растворения кератинов.

Условия: 1=90 С, С(ЫаОН>=0.25 моль/л, СВ - 10%

Рис.2 Зависимость начальной скорости щелочного растворения кератинов от начального содержания белка в суспензии.

Условия: 1=90оС, С(КаОН)=0,25 моль/л, СВ -10%.

0,04 Хрр

0,08

Рис 3. Соотношение количества ВМФ и НМФ белковых веществ, образующихся в процессе щелочного растворения кератинов в различные моменты времени. Условия: 1=90 С, С(КаОН)=Ю.25 моль/л, СВ - 10%

60-,--

о----

О 60 120

время, мин

Рис 4. Кривые гидролиза белковых веществ кератинов протосубтилином.

Условия: 1=60* С, Се=0.007 мольЫ/л, С5 =0.50

\Ю.||>1\/.|

-----

железы (ПЖ) убойных животных на примере КРС. Наряду с пептидазами такие клетки содержат протеазы, способные снизить в ферментолизатах протосубти-лина долю ВМФ кератиновых белков.

3.3. Гидролиз белковых веществ кератинов ферментными системами клеток поджелудочной железы

Гидролиз белковых веществ под действием выбранной ферментной системы изучали при различных концентрациях субстрата, подготовленных по известной методике клеток ПЖ КРС с активностью не менее 2000 ед/г, температуре и рН среды, которые меняли соответственно в интервалах: 20-80 г/л, 4-16 г/л СВ, 40-70°С, 4,5-8,0.

На рис.5 приведены типичные кинетические кривые расходования ВМФ белковых веществ и накопления пептидного и аминного азота. Вид полученных зависимостей оказался таким же, как и ранее описанный в литературе при гидролизе клетками ПЖ КРС других белков. Это позволило нам использовать для количественного описания экспериментальных данных ту же схему превращений (3), но с учетом специфики возможного ингибирования:

где роль ингибитора играет аминный азот, и инактивации фермента в составе фермент-субстратного комплекса:

ГЕБ] -^ПЕБи (6),

а в качестве субстрата рассматриваются ВМФ белковых веществ.

Обработку экспериментальных данных проводили также как и в разделе 3.2. При этом константу Ки находили путем дифференциальной обработки отдельно полученной серии кинетических кривых в опытах с различной начальной концентрацией аминного азота. Рис.6 иллюстрирует результат такой обработки. Результаты последующих расчетов показали, что схема превращений (3) и уравнения (5) и (6) определяют математическую модель процесса, которая адекватно описывает экспериментальные данные. Оптимизированные значения констант приведены ниже в табл. 3.

Таблица 3

Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий ферментативного гидролиза фракций белковых веществ ферментными системами клеток ПЖ КРС.

Путь Е, кДж/моль Ка, л/моль к*, с'

1 40,3±4,0 (1,90±0,02) 10"° 0,45±0,03

2 15,7±1,3 (2,52±0,18) Ю4* 0,72±0,07

3 29,0±1,4 (4,80±0,38) 10* 0,16±0,02

Инактивации 18,6±1,8 (3,82±0,33) 10"6 0,020±0,002

Кщ=9.8 л/моль, С„2=11.2 л/моль, Кн =392 л/моль.

Для исследуемого случая гидролиза белковых вешеств необходимый выход аминного азота 70% мас. достигается путем дробной загрузки ферментного препарата (рис.5). При этом суммарный выход Ь-цистина и Ь-цистеина составляет 75-80% мол. от содержания Ь-иистина в сырье, а норма расхода ферментного препарата - 1,6 г СВ ПЖ КРС на 1 г образующихся серосодержащих аминокислот. Такой гидролизат, свободный от взвешенных частиц был использован нами в дальнейшем при изучении процесса трансформации Ь-цистина и Ь-цистенна в таурин.

3.4. Трансформация свободных Ь-цистеина и Ь-цистина и в составе белкового гидролизата в таурнн ферментными системами клеток печени КРС Гидролизат кератинов представляет собой сложную многокомпонентную смесь. Поэтому первый этап исследования состоял в нахождении условий трансформации индивидуальных аминокислот Ь-цистеина и Ь-цистина под действием ферментов клеток печени. При этом был сохранен тот же порядок проведения опытов, что и в разделе 3.3.

Процесс трансформации Ь-цистеина и Ь-цистина изучали при следующих из-

меняемых параметрах: температуру варьировали в интервале 30-60°С, рН 1,5-7,0, содержание подготовленных по известной методике клеток печени с активностью не ниже 2000 ед./г -1,3-3,2 г СВ л-1, концентрацию субстрата - 0,08 - 0,80 моль л-1. На рис.7 приведены типичные кинетиче ские кривые трансформации аминокислот в таурин, а на рис.8 - известная биохими-

Рис.7 Кривые расходования С-ц«сгеина(1) ч

ческая схема последовательно-параллель-трансформации этих субстратов в таурии ных превращений Ь-цистеина и Ь-цистина

в таурин под действием ферментов пече-начальная активность ФСКП КРС - 8 ед/мл. ни.

Анализ экспериментальных данных показал, что во всех исследованных интервалах изменяемых параметров процесса на кинетических кривых образования таурина отсутствует точка перегиба. Это позволило считать лимитирующей стадией процесса образование таурина из гипотаурина или цнетаминди-сульфоксида и рассматривать в дальнейшем данный процесс как одностадийную ферментативную реакцию. Наряду с этим, как следует из рис.7, процессу трансформации присуще ингибирование.

Чтобы уточнить возможные пути ингибирования были поставлены эксперименты, где в одной серии меняли начальную концентрацию таурина в интервале 0.02 - 0,10 моль л*1, а в другой - время прогрева суспензии биомассы печени от 10 до 30 мин при температуре 30-50°С с последующим определением активности.

Б -Б

I I

н2с сн,

I I

н2ш<: снмн2

I I

ноос соон

0 о

I! II Б - Б

► I I

НгС СН2

вдшс I

ноос

0 о

II и э - э

1 I Н2С сн,

СНЫН2 I

СООН

Н2ЫН2С СН2ЫН2

I и ш

БН БСЬН эсьн

| СН2 1 | 2 к . СН2 ' | | 3 ь СН2 4 | 1 ».СН» ' 1

снын2 СНШ2 СН2Ш2 СН2ЫН2

1 СООН 1 СООН

IV V VI ш

Рис. 8 Схема превращений L-цистина и L-цистеина в таурин под действием ферментных систем клеток печени. Обозначения: 1 - цистиноксидаза, 2 -НАДзависимая цистеиноксидаза, 3 - цистеинсульфинатдекарбоксилаза, 4 -пиридоксальфосфат, I - цистин, П - цистидинсульфоксид, Ш - цистаминдисуль-фоксид, IV - цистеин, V - цистеинсульфеновая кислота, VI - гипотаурин, VII -таурин.

На рис. 9 и 10 приведены линейные зависимости, которые подтверждают наличие 2-х путей ингибирования свободного фермента: за счет обратимого связывания его с продуктом реакции (таурином) и термоинактивации.

Последующую обработку экспериментальных данных проводили так же, как и в разделе 3.2. В ходе ее было установлено, что адекватное описание всех серий кинетических кривых достигается с учетом одностадийной схемы ферментативного превращения, дополненной уравнениями (4) и (5). Значения полученных констант и энергий активации, отвечающих превращениям L-цистеина и L-цистина в таурин приведены в табл. 4. Наличие и в данном случае термоинактивации свободного фермента позволяет достичь выхода таурина из L-цистина и L-цистеина не более 30 и 45 % соответственно. Для достижения более высокой степени превращения вышеуказанных аминокислот в таурин, как показали результаты расчетов и экспериментов, требуется дробная загрузка ферментного препарата равными долями. При этом в оптимальных для L-цистеина условиях процесс трансформации целесообразно проводить при температуре 35-40°С, рН 3,0, содержании клеток печени (2) 7,7 г СВ л-1, начальной концентрации субстрата 0,33 моль л-1 в суспензии в условиях 3-х кратной загрузки ФП через каждые 2 ч. Выход таурина должен составить 97%, а для L-цистина - при той же температуре, рН 1,5, начальной концентрации субстрата 0,17 моль л-1, содержании клеток печени в суспензии (Е) 12,8 г л-1 при 5-ти кратной загрузке ФП через 2 ч выход таурина- не менее 70%. Исходя из этого, был исследован процесс получения таурина из вышеуказанных аминокислот в

5 г л с о г

о"

200 300 время, мин

500

Рис. 5. Влияние дробной загрузки поджелудочной железы на степень гидролиза белков кератинов. Условия: I-55 С , рН 6.5. Обозначения: 1 - время внесения ферментного препарата.

80 ■

1/Ср2„ л/г

Рис. 6. Обработка экспериментальных данных по гидролизу кератинов ферментными системами пожелудочной железы в координатах Сро-Ср/Дг - 1/Сро, необходимое для расчета К,

Рис. 9. Зависимость начальной скорости трансформации Ь-цистеина (1) и Ь-цистина (2) в таурин от его начального содержания в исходной среде. Условия: 1-40 °С, рН 2.0, начальная активность ФСКП - 8 ед/мл.

время, мин

Рис. 10. Зависимость начальной скорости трансформации Ь-цистеина от времени прогрева суспензии биомассы печени. Условия: 1 - 30 - 50 °С, рН 3.0, I - 10-30 мин, начальная активность ФСКП - 8 едУмл.

составе белкового гидролизата, где мольное соотношение L-цистина к L-цистеину достигало 1,8. Поэтому при проведении процесса трансформации мы были вынуждены ориентироваться на оптимальные условия, установленные выше для L-цистина. Результатом таких опытов явилось полное совпадение экспериментальных данных с расчетом. Степень трансформации L-цистина в таурин составила 70%, а L-цистеина -100%, норма расхода ФП составила 1600 ед/ммоль L-цистина. Наблюдаемое совпадение экспериментальных и расчетных данных по трансформации L-цистина и L-цистеина в таурин, взятых как в индивидуальном виде, так и в составе белкового гидролизата указывает на то, что на кинетику образования таурина не влияют не только другие аминокислоты, но и возможные примеси в составе кератинсодержащего сырья.

Таблица 4.

Эффективные константы отдельных стадий ферментативного гидролиза фрак-

Субстрат Стадия трансформации субстрата Стадия инактивации

К«. моль/л к*, с'1 К., моль/л Энергия активации, кДж/моль К., моль/л К., моль/л Энергия активации, кДж/ моль

L- цис-тин 126,21 ± ±10,53 6,02± ±0,24 (4,84± ±0 29)10-3 62,4± ±2,.5 2,13± ±0,13 1,5± ±0,01 0,19± ±0,02 6,7±0,3

L-цис-теин 76,93± ±3,82 3,00± ±0,2 (1,49± ±0.07)10° 14,1± ±0,6 2,13± ±0,13 3,1± ±0,02 (5,29± ±0,3) 10-4 20,1+1,2

Однако образующийся в таком гидролизате таурин присутствует в концентрации 0,07 моль л-1 на фоне примесных аминокислот и низших пептидов порядка 0,40 моль л-1, минеральных соединений, преимущественно хлорида натрия 0,25 моль л-1 и взвешенных частиц в виде отработанных клеток ПЖ КРС и печени. Как показали экспериментальные исследования, твердую фазу достаточно просто удалить из суспензии центрифугированием при факторе разделения Fr=2900 или фильтрованием под давлением. Образующиеся при этом су-пернатанты (фильтраты) оказываются прозрачными растворами и могут быть направлены на выделение таурина. 3.5 Выделение и очистка таурина ионным обменом

Образовавшийся на предыдущей стадии таурин присутствует в составе многокомпонентной смеси. На основе предварительных исследований была выбрана схема ионообменного выделения и очистки таурина с применением анионитов. Были испытаны различные высоко- и низкоосновные атюниты, в результате чего был взят наиболее дешевый и доступный анионит марки АВ-17-2, обладающий наибольшей емкостью по таурину (0,17 г/г набухшей смолы в СГ форме). Для сокращения объемов сточных вод был выбран способ стати-

ческой сорбции и десорбции целевого продукта, а в качестве элюента - раствор хлорида натрия.

Па рис.11 приведены кривые сорбции таурина из водного раствора и из гидролизата при различном соотношении смолы к растворенному таурину. Из рис. 11 видно отсутствие влияния примесей в растворе гидролизата на механизм сорбции целевого продукта. Процесс сорбирования таурина на анионит можно представить следующей схемой превращений:

КЛСГ + МШЬСНзБСЬ" К80эСНгСН2Ш2 + СГ.

где К» - равновесная константа диссоциации таурина в воде (Ко 20оС=0.0316 моль/л), а к|, к.| - константы обратимой сорбции таурина на анионите.

Обработка экспериментальных данных по вышеприведенной схеме превращений показала, что кривые сорбции таурина адекватно описываются при значениях констант к|=0.089±0.002 моль л"1 с , к.[= 0.012±0.001 моль л"1 с"1,

Для сокращения объема сточных вод при работе с сорбентом, количество последнего должно быть минимальным. Проведенные расчеты, в дальнейшем подтвержденные экспериментом, показали, что при 5%-ном содержании набухшей смолы в суспензии гидролизата и времени сорбции 6 ч таурин на 93% сорбируется смолой. Целесообразность выбора именно такого значения времени сорбции подтверждается и графиком работы технологического оборудования.

Подобранные условия ионообменного выделения таурина практически не допускают сорбирования продуктов гидролиза белковых веществ. Образующийся при этом сток содержит аминокислоты и низшие пептиды 5,6 гМ/л, в том числе 2,2 г/л цистина, и 14,6 г/л хлорида натрия. После обессоливания его целесообразно перерабатывать в побочный продукт, прежде всего кормового назначения. Результаты испытаний образцов данной смеси аминокислот показали отсутствие в них токсичных Б-форм.

Тот же график работы оборудования позволил оценить время, необходимое для десорбции целевого продукта. На рис.12 приведены кривые десорбции таурина со смолы раствором хлорида натрия различной концентрации. При изучении кинетики десорбции использовали вышеприведенную схему превращений. Результаты последующих расчетов подтвердили возможность адекватного описания экспериментальных данных при тех же значениях констант. Дальнейшие расчеты, подтвержденные экспериментом по оптимизации хлорида натрия в элюенте показали, что таурин десорбируется 6%-ным раствором соли на 95% с анионита за 5 ч, а объем элюента снижается в 3 раза по сравнению с объемом, перерабатываемым на стадии сорбции. При этом на стадии ионообменной очистки удается достичь эффекта концентрирования таурина до 30 г/л. Однако, как показали результаты исследования стадии кристаллизации целевого продукта из водного раствора,-такой концентрации недостаточно. Она

должна быть в 4 раза выше. Чтобы исключить энергозатраты на стадию ваку-умвыпаривания тауринсодержащего элюата, было принято решение использовать элюат еще трижды при проведении процесса десорбции. Экспериментальная проверка полностью подтвердила возможность решить задачу концентрирования таким способом. В дальнейшем на стадии подготовки смолы к следующему технологическому циклу оставшийся на смоле таурин удается снять с нее 5-ти кратной промывкой водой или 2-мя объемами 4%-ного раствора соли.

З.б Кристаллизация таурина из водных и водно-спиртовых растворов

Олюат, полученный на стадии ионного обмена, содержит таурин, хлорид натрия и следы аминокислот в концентрациях 100,60 г/л соответственно.

На рис.13 приведены зависимости степени осаждения (Хб) таурина го водных растворов при различной его начальной концентрации. Как следует из рис. 14, показатель Хб монотонно растет с увеличением начальной концентрации таурина в растворе, однако во всех случаях он не достигает 100%. Вид полученных зависимостей позволил предположить следующую схему образова-

2(ЫН2СН2СН2803Н) (Ш2СН2СН250зН)2 (8),

для которой в условиях стационара имеет место равенство Х8/(1-Х$)2= (к^Лс! ) С0, где С0 - начальная концентрация таурина в растворе. Его проверка показала, что в координатах Хв/О-Хв)2 - Со действительно наблюдается линейная зависимость (г* =0,96), позволившая рассчитать найти соотношение констант к |/к.|. В дальнейшем значения каждой константы находили при обработке кривых образования осадка: к1*=0,23±0,02 моль л"' с"', к.1=0,018±0,002 с"1. На основе значений полученных констант была рассчитана технологически приемлемая концентрация таурина в растворе, передаваемого на стадию кристаллизации. Она должна быть не менее 97 г/л. Достигаемая при этом степень осаждения через 3 ч составляет 90%. Экспериментальная проверка подтвердила рассчитанные значения Хб и время образования осадка. Образующийся при этом осадок окрашен в желтый или бежевый цвет, что требует проведения стадии его перекристаллизации.

Чтобы повысить степень осаждения таурина и решить проблему его очистки от окрашенных соединений, было изучено осаждение таурина из водно-спиртовых растворов. На рис.14 приведена соответствующая серия кривых, показывающая, что степень осаждения таурина может быть увеличена до 98%, а образующийся при этом осадок не является окрашенным. Для обработки экспериментальных данных использовали ту же схему превращений (8). Однако, рассчитанные в этом случае константы к| и к.|, как и следовало ожидать, не остаются постоянными, а линейно изменяются в зависимости от концентраций спирта и воды. Наличие линейных зависимостей значительно упростило проведение соответствующих расчетов по выбору условий очистки осадка таурина перекристаллизацией. При этом мы были вынуждены учиты-

Рис. 11 Зависимость степени сорбции туарина из водного раствора и из гидролизата (•) на анионит АВ-17 - 2 от содержания анионита в суспензии. Условия сорбции: 1-24°С, концентрация таурина - 8.9 г/л. Обозначения-, содержание анионита в суспензнн*-5%, 4-10%; ■ -15%, ♦ - 20% * - 25%

Рис. 12 Зависимость степени десорбции та\рина с акионита АВ-17 от концентрации хлорида натрия в элюэнте. Условия десорбции: 1-24°С, концентрация таурина - 87 г/л. Обозначения: концентрация хлорида нэтркм* 1 %, ♦•2%, • - 4%, 8%, • - 12%, а 16%.

время, мин

Рис. 13 Кривые осаждения таурина из водного раствора. Условия осаждения: I - 4-6°С. Обозначения: исходная концентрация Турина в растворе: ф - 60 г/л, 1-80 г/л , а-100 г/л, * -120 г/л.

время, мин

Рис. 14 Кривые осаждения та\рина из водно-спиртового раствора. Условия осаждения: I - 24°С, . Обозначения объемных соотношений раствора таурина к этилововму спирту: 4 -1:1, в- 1:5, *-1:10в *-1:13.

вать, что, помимо окрашенных соединений, в осадок может перейти и хлорид натрия. Как показали предварительные опыты, исходная концентрация таурина на стадии перекристаллизации не должна быть выше 100 г/л. Тогда после добавления 10-ти кратного объема этанола к такому раствору степень осаждения таурина достигает 95%. Как показали результаты соответствующих экспериментов, чтобы увеличить степень очистки таурина с 62% содержания основного вещества до 96% необходимо стадию спиртовой перекристаллизации целевого продукта проводить не менее 2-х раз. Полученный таким образом осадок хорошо высушивается в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 70°С.

По результатам работы была разработана технологическая схема получения таурина из кератинсодержащего сырья применительно к мясоперерабатывающему заводу. При мощности ОПП 1 т таурина в год ожидаемая себестоимость 1 кг кристаллического препарата составляет 3338 руб (117 у. е.), что в 1,6 раза ниже цены синтетического аналога соответствующего препарата и в 3,8 раза ниже биотехнологического.

Выводы

1 .Разработаны основные стадии технологического процесса получения таурина из кератинсодержащего сырья, включающие в себя его измельчение и растворение в щелочном растворе, последующий гидролиз белковых веществ до аминокислот, трансформацию Ь-цистина и Ь-цистеина в таурин техническими ферментами, выделение и очистку целевого продукта ионным обменом, его кристаллизацию из водного раствора и перекристаллизацию из 90%-ного этанола, сушку готового продукта. Выход кристаллического препарата с содержанием основного вещества 96% составляет 70%.

2. Проведено количественное исследование процессов щелочного растворения кератинов, подчиняющегося законам специфического кислотно-основного катализа, ферментативного гидролиза белковых веществ протосуб-тилином и комплексом ферментов поджелудочной железы, трансформации Ь-цистина и Ь-цистеина в таурин под действием ферментов клеток печени. Для каждого из процессов на основе схем последовательно-параллельных превращений разработаны математические модели, адекватно описывающие экспериментальные данные. Рассчитаны соответствующие значения эффективных констант и энергий активации.

3. Изучены процессы выделения и очистки таурина ионным обменом на сорбенте АВ-17-2 в СГ форме с использованием в качестве элюента 6%-ого раствора хлорида натрия, кристаллизации таурина из водного и водно-спиртовых растворов. Показана возможность концентрирования очищенного от органических примесей раствора таурина путем многократного (не менее 4-х раз) использования элюата на стадии десорбции целевого продукта. Разработаны математические модели стадий сорбции, десорбции и кристаллизации тау-рина из водного и водно-спиртовых растворов, позволяющие выбрать оптимальные условия их проведения.

4. Разработанные для всех основных стадий технологического процесса получения таурина математические модели создают предпосылки для выбора различных вариантов управления соответствующими процессами, что обеспечивает получение целевого продукта различного качества и назначения.

Список публикаций по теме диссертации:

1. А.В. Соболева, А.А. Красноштанова, И.А Крылов - Трансформация L-цистина и L-цистеина в таурин под действием ферментных систем клеток печени - Прикладная биохимия и микробиология, 2004, №3, с.282-287.

2. AJB. Соболева, А.А. Красноштанова, И.А. Крылов Получение таурина из ке-ратинсодержащего сырья: Материалы 2-ого Московского конгресса. «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2003, с. 298.

3. А.В.Соболева, Е.Ю. Исаева, ЕА Клеманова Е.А Красноштанова Исследование количественных закономерностей и способов интенсификации процесса трансформации цистина в таурин ферментными системами печени: тезисы докл//Успехи в химии и химической технологии. Москва, 2002, т. 16, №5, с. 114.

4. А.А. Красноштанова, А.В. Соболева, И.А. Крылов Разработка основ получения таурина: тезисы доклУ/Успехи в химии и химической технологии. Москва, 2001, т. 16, №5, с. 111.

5. И.А. Крылов А.В. Соболева, А.А. Красноштанова,- Количественные закономерности процесса растворения природных кератинов - Химическая технология, 2004 - в печати

6. А.А. Красноштанова, А.В. Соболева, И.А. Крылов - Трансформация -L-цистина и L-цистеина в в составе белкового гидролизата кератинов в таурин под действием ферментных систем клеток печени -Химическая технология, 2004 в печати.

П - 8 0 2 8

Издательство ЦПИ при механико-математическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. Подписано в печать 2Х>0^ ■>

Лицензия на издательскую деятельность ИД В 04059, от 20.02.2001 г.

Отпечатано с оригинал-макета на типографском оборудовании механико-математического факультета и Франко-русского центра им. A.M. Ляпунова.

Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз.

Усл. печ. л. i,2S

Заказ

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Соболева, Анна Викторовна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Общая характеристика таурина и области его применения.

1.2. Биохимические аспекты синтеза и механизма действия таурина.

1.3. Лабораторные и промышленные способы получения таурина.

1.4. Характеристика кератинсодержащего сырья и способы его переработки.

Глава 2 Материалы и методы исследования.

2.1. Объект исследования.

2.2 Методы анализа.

2.3. Методы исследования.

2.3.1 Методика щелочного растворения кератинсодержащего сырья.

2.2.2 Методика проведения процесса ферментативного гидролиза белковых веществ из кератинсодержащего сырья.

2.2.3. Методика проведения процесса трансформации цистина и цистеина под действием ферментных систем клеток печени.

2.2.4. Методика выделения таурина методом ионного обмена.

Глава 3. Основные экспериментальные данные и обсуждение результатов.

3.1. Растворение кератинсодержащего сырья в растворе гидроксида натрия.

3.2. Гидролиз белковых веществ протосубтилином.

3.3. Гидролиз белковых веществ кератинов ферментными системами клеток поджелудочной железы.

3.4. Трансформация свободных Ь-цистина и Ь-цистеина и в составе белкового гидролизата в таурин ферментными системами клеток печени КРС.

3.5. Выделение и очистка таурина ионным обменом.

3.6. Кристаллизация таурина из водных и водно-спиртовых растворов. 104 Выводы.

Список сокращений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья"

Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) как продукт метаболизма серосодержащих аминокислот (Ь-цистина и Ь-цистеина) играет важную роль в обеспечении различных функций человека, связанных со зрением, агрегацией тромбоцитов, активностью инсулина и др. Поэтому находит применение в медицине, а также имеет значение для кормовой и пищевой промышленности. Таурин - достаточно простое соединение, которое может быть синтезировано химически, а также путем трансформации вышеуказанных Ь-аминокислот под действием комплекса ферментов клеток печени. В последнем случае сырьевой базой может быть богатое Ь-цистином кератинсодержащее сырье, являющееся в настоящее время плохо утилизируемым отходом мясоперерабатывающих заводов. Те же предприятия располагают и источниками ферментных препаратов в виде клеток поджелудочной железы (для гидролиза белковых веществ) и печени убойных животных (для трансформации Ь-цистина и Ь-цистеина в таурин).

Практическая значимость: разработаны основные стадии технологического процесса получения препарата таурина (с содержанием основного вещества не ниже 96%) из кератинсодержащего сырья. Ка основе разработанных математических моделей предложены алгоритмы управления стадиями химического растворения кератинов, их энзиматического гидролиза и трансформации свободных Ь-цистина и Ь-цистеина в таурин под действием ферментов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Соболева, Анна Викторовна

ВЫВОДЫ

3. Изучены процессы выделения и очистки таурина ионным обменом на сорбенте АВ-17-2 в СГ форме с использованием в качестве элюента 6%-ого раствора хлорида натрия, кристаллизации таурина из водного и водно-спиртовых растворов. Показана возможность концентрирования очищенного от органических примесей раствора таурина путем многократного (не менее 4-х раз) использования элюата на стадии десорбции целевого продукта. Разработаны математические модели стадий сорбции, десорбции и кристаллизации таурина из водного и водно-спиртовых растворов, позволяющие выбрать оптимальные условия их проведения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Соболева, Анна Викторовна, Москва

1. Е.П.Елизарова, Б.Г.Ходжакулиев, Л.И.Заволовская, Е.П.Черногубова. Фармакинетика таурина // Кардиология, 1995, 4:69 70.

2. И.М.Кахновский, Т.В.Королева, В.Н.Захаренко, С.М.Ларионов. ММА им. И.М.Сеченова. Таурин в лечении сахарного диабета // Клиническая фармакология и терапия, 1997, 6,3.

3. Н.С.Сапронов, А.В.Самойленко, П.А.Торкунов, А.Ю.Юров // Российский физиологический журнал, 1998. Т.84, № 1 2. С.39 - 44.

4. Ц.Р.Орлова, Е.П.Елизарова, И.М.Рыфф, Н.И.Фетисова, Л.И.Митькина. Использование таурина для лечения застойной сердечной недостаточности в эксперименте // Кардиология, 1991,6:77 80.

5. B.C. Гуревич. Таурин и функция возбудимых клеток. 1986.

6. А.Майстер. Биохимия аминокислот. 1961.

7. Фармакология и клиническое применение нейроактивных аминокислот и их аналогов// под ред. Г.В.Ковалева. Труды ВГМИ: Волгоград, 1986.

8. L.A. Marques, Dunford H.B. // J.Biol.Chem. 1994. Vol.269, № 22. P.7950 -7956.

9. W.Vogt, D.Hess // Immunobiology. 1994.Vol.192, № 1 2. P. 1 - 9.

10. G.Schuller-Levis, M.R.Qvinn, C.Wright et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1994. Vol.359. P.31-39.13. .Azuoma, B.Halliwel, B.M.Haey. The antioxidant action of taurin, hipotaurin and their precursors // Biochem.J. Vol.256, № 1.

11. Е.И.Ярцев, Е.Д.Гольдберг, Ю.А.Коменников. Таурин (фармакологические ипротиволучевые свойства) // Медицина, М., 1975.

12. Практикум по биохимии // под ред. С.Е.Северина и Г.А.Соловьевой, издательство Московского университета, 1989.

13. Л.И.Нефедов. Известия АН Беларуси. Серия биологических наук, № 3 -4, 1992.

14. Н.С.Сапронов, П.А.Торкунов, В.В.Елисеев и др. // Пат. Физиол. 1999. № 4. С. 19-20.

15. W. G. Martin, and Patrick, 1974. The incorporation of S3504 into bile of chick/ Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 121:414-417.

16. H. Finney, K.C. Hayes, 1978. A review on the biological function of taurine. Nutr.1. Rev. 34:161-165.

17. G. Mandel, L. Pasantes-Morales 1989. J. Anim Sci. 69:609-612.

18. C.S. Marvel, C.F. Bailey 1992. Poult Sci. 71:608-612.22.Патент РФ № 1370948.23.Патент РФ № 2059614.24. Патент РФ № 2009124.25. Патент СССР № 1657491.26. " Фармакологический справочник

19. Патентообладатель ГГМИ. Л.Н.Шейбак, М.П.Шейбак, Л.И.Нефедов, В.М.Шейбак. Тема: " Дисахаридная недостаточность у детей при различной патологии ".28. Патент РФ № 2001616.29. Патент РФ № 2024256.

20. Хроматография на бумаге // под редакцией И.М.Хайса и К.Мацека, перевод с чешского, 1962.

21. Сассон А., Биотехнология: свершения и надежды; пер. с англ./ под ред., с предисл. и дополн. В. Г. Дебабова. М.; Мир, 1987, стр.-411.

22. Шестаков С. С., Муляргук М. В., Комплексное производство природных аминокислот из белкового сырья М.; ЦНИИТИПтицепром, 1979 г.

23. Гауровиц Ф., Химия и функции белков; пер. с ал г. В. В. Борисова, М. И. Верховцевой, под ред. В. О. Шпикитера.- М.; Мир, 1965 г., стр.- 252-257.

24. Деникина Е. К, Неклюдов А. Д., Герасимова Е. В. О количественномсоотношении аминокислот и пептидов в белковых гидролизатах для парентерального питания/ Прикладная биохимия и микробиология, 1983 г., т. XIX, №4, стр.- 503-506.

25. Неклюдов А. Д., Навашин С. М., Получение белковых гидролизатов с заданы ми свойствами/ Прикладная биохимия и микробиология, 1995 г., т. XXI, №1, стр.-3-17.

26. Васильев П. С., Суздалев В. В., Неклюдов А. Д. и др. Препараты для парентерального питания. - в кн. : Современные кровезаменители. - М., ВНИИМИ, 1980г., стр.-28-43.

27. Савченко И. Л., Благодатский В. Н. Способ получения белкового гидролизата из сухих белоксодержащих отходов животного происхождения. - авт. свид. № 1214061, СССР, 1986г.

28. А. с. 1161064, СССР, МКИ А231/10. Способ получения белкового гидролизата из кератинсодержащего сырья (к.р.с.)/ Крылова В. Б., Попов В. П., (СССР), № 3701630/28-13; заявлено 08.12.83., опубл. 15.06.85., Бюл. №9, стр.-14.

29. А. с. 1151236, СССР, МКИ А231/10. Способ получения кормовой добавки из отходов мехового сырья/ Таранич А. В., Анохина В. И., Кононенко А. В. (СССР),-№3671661/28-13; заявлено 08.12.83, опубл. 23.04.85., бюл. № 7, с. 7.

30. Либерман С. Г., Шевкунов К. Ф., Щербаков А. Р. Переработка кератинсодержащего сырья. Обзорная информация, серия «Мясная промышленность», М., ЦНИИТЭИмясомолпром, 1979, стр.- 30.

31. Файвишевский М. Л., Либерман С. Г. Производство животных кормов., М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984., стр.- 307.

32. Бердутина А. В., Неклюдов А. Д., Иванкин А. Н., Карпо Б. С., Осока А. В.

33. Березин И. В., Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М., Наука, 1979 г., стр.- 100-185.

34. Неклюдов А. Дг, Иванкин А. Н., Баер Н, А„ Бертутина А. В., Дубина В, И, Источники резервного белка для получения пншевых гидролизатов из животного сырья/ Хранение и переработка сельхозсырья, № 3, 1998 г., cip. 24-25.

35. Патент СССР № 1028236. Способ получения кормовых средств из протеинсодержаших отходов переработки животного сырья.

36. Патент ФРГ№ 284. 047. Способ получения белкового продукта.

37. Кудрявцев Р. М„ Степаненко Е. С„ Волков Е. Н. Использование бисульфита натрия для кислотного гидролиза. - Труды ВНИИконсервной и овощной промышленности, 1980 г.>№ 16, стр.- 38-41.

38. Патент США №3578461, Способ приготовления белкового продукта.

39. Пивненко Т. Н., Жданюк В. М., Энштейн JT. М. Способ получения протеолитического комплекса. Патент РФ 2034028, бюл. Изобретений РФ,- 1995 г.,№12.

40. Кочетов Г, А, Практическое руководство по энзимологии.-М, 1989.

41. Неклюдов А. Д., Федорова Н. В., Илюхина В, П„ Лишца Е. П./ Прикладная биохимия и микробиология, 1993 г., т. 29, вып. 5, стр.- 734-743.

42. Фершт Э. Структура и механизм дейстня ферментов,- M,f Мир, 1980 г., стр.-373-388,

43. Березин И. В., Мартинек К. Введение в прикладную этимологию. M,f МГУ, 1982 г.,стр,-Э82,

44. Webster J. D., Levward D. A., Lawrie R. A. Protein hydrlysates from meat byproducts. -Meat Sci,19&2, p.-147-157,

45. Баер R A„ Неклюдов А. Д., Иванкин A. H., Дубина В. И„ Бердутина А. В. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья. Патент РФ К5ЙЗЛ 11QC12N9/64, бюл. Изобретений РФ 1997 г„ №12,

46. Cheryan M., Deeslic W. D, Production of protein hydrolysatein ultrafiltration ensyme reactors. Polym, Sci. Technol., 1980, v.13, h, 59Б601

47. Патент США № 4232123, Способ получения водорастворимых гидролизатов кератинсодержащих материалов

48. Патент США № 357В460. Способ приготовления белкового продукта.

49. Неклюдов А. Д., Илюхин В. П., Мосина Г. И. и др./ Прикладная биохимия и микробиология, 1996г., т. 32, вып. 2, стр, 231-236,

50. Федорова Н. В., Неклюдов А, Д. Влияние концентрации дрожжевой биомассы и экзогенных протеолитических ферментов на интенсивность процесса автолиза пекарских дрожжей. Прикладная биохимия и микробиология. АН СССР, г. XXI, вып. 6,1985 г„ стр. 714-718.

51. Попова В. А., Езерская Н, Ф-, Петрейкова M. Н., Шилова С. А. Получение смеси аминокислот из дрожжей. в сб,: Труды ВНИИгидр. Растительных материалов, 19Slr.,№31,стр. 97-104.

52. Kilara А. Emyme-modified protein food ingredients.- Process Biochem., 20, N 3,1985, p. 146-157/

53. Антонов В. К. Химия протеолиза М., Наука, 1984 г., стр. 113-161.

54. Alder-Nisson J. Enzymic hydrolysis of food proteins.- Dan. Kemi., 1986, IV.67, p. 19-25, VD.67,p. 36-43.

55. Богатков С. В., Фролова Т. Т., Грачева И. М. и др. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеиназой Вас. subtilis- Прикладная биохимия и микробиология, 1982 г., т. 18, №1,стр. 71-75.

56. Сиймер Э. X., Паппель К. Э., Кестнер А. И. Метод описания кинетики ферментативных реакций. Труды Таллинского политехнического института, 1979, №424, стр. 13-17.

57. Визбуле А. Д., Беликов В. М., Арен А. К.- Сложный вид ингибирования при гидролизе белков микробными протеолитическими ферментами. Известия АН Лаге. ССР, 1982, № 7, стр. 110-114.

58. Крылов И. А., Красноигганова А. А., Манаков М. Н./ Биотехнология, 1998 г., № 6, стр.63-68

59. Горская Н. А. Адсорбционная хроматография на активированных углях при получении белковых гидролизатов. в кн.: Лечебные препараты из крови тканей, Л., Медицина, 1974, стр. 171-173.

60. Патент Швейцарии № 636248. Процесс изготовления очищенных белковых гидролизатов.

61. Патент США № 3692538 Способ приготовления белковых гидролизатов, имеющихаромат мяса.

62. Патент Японии № 48л10543 Получение белковых щцролизатов.

63. Васильев П. С., Суздалева В. В., Неклюдов А. Д. и др. Препараты для парентерального питания: Современные кровезаменители. М., ВНИИмедицинской информации, 1980, стр. 29-43.

64. Неклюдов А. Д., Иванкин А. Н., Бердутина А. В. и др. Получение пищевых гидролизатов из отходов мясопереработки в присутствии ферментов поджелудочной железы/ в сб. научных трудов ВНИИМП, М., ВНИИМП, 1998, стр. 70-78.

65. Калмыков П. Е., Голубев Т. И. Белковый препарат для парентерального питания аминопептид/ Советская медицина, 1956, №3, стр. 66-69.

66. Патент США № 578832. Способ получения белкового продукта из кератинсодержащего сырья.

67. Критчфилд Ф. Анализ основных функциональных групп в органических соединениях. М., Изд-во «Мир», 1965. С. 197-201

68. А. с. 829084 СССР МКИ А23К1/10. Способ получения пептона из кератинсодержащего сырья/ Горяев М. И., Быкова JI. Н. и др. (СССР) № 2808824128-13; заявлено 31.07.79.; опубл. 15.05.81. бюл. №8, с. 20-25.

69. Патент ФРГ №1208168. Способ переработки измельченных отходов мяса птицы для получения корма и продуктов питания.

70. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. 2. Кинетика экстракции белковых веществ из клеток дрожжей. //Биотехнология, 1998. №6. с. 57-62.

71. Патент Франции № 2412263. Способ обработки отходов.89. "Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов"диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук доц. Красноштанова A.A., 1995.

72. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. в 2-х частях. ч.2. М.: Мир, 1989. - 590 с.

73. Патент ГДР № 2008493. Способ получения частичного гидролизованных белков.

74. Остапец Н. Г. Качество кормового белкового концентрата, получаемого из кератинсодержащего сырья/Мясная индустрия СССР, 1981 г., №8, стр. 33-38.

75. Патент США № 578923. Способ получения белкового продукта.

76. Патент США № 298848. Производство пенообразователя из кератинсодержащего сырья.

77. Папков Н. Ф., Комлев А. П., Чеховский А. А. и др. Способ изготовления белковой колбасной оболочки. авт. свид. № 686710 СССР, 1979 г.

78. Крешков А.П. Основы аналитической химии М., Изд-во «Химия». 1965. 498с.

79. Худсон Д. Статистика для физиков. М., Изд-во «Мир», 1970. С. 254-270.

Информация о работе

Соболева, Анна Викторовна
кандидата химических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья"

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Соболева, Анна Викторовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья"

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Соболева, Анна Викторовна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Соболева, Анна Викторовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка основ технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология