Гидрокортизоновые производные в качестве векторов доставки генетических конструкций в животные клетки

Савищенко, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидрокортизоновые производные в качестве векторов доставки генетических конструкций в животные клетки
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гидрокортизоновые производные в качестве векторов доставки генетических конструкций в животные клетки"

На правах рукописи 003433Б58

САВИЩЕНКО Елена Анатольевна

ГИДРОКОРТИЗОНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРОВ ДОСТАВКИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ В ЖИВОТНЫЕ КЛЕТКИ

03.01.04 -Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 4 мдр ?д1д

Санкт-Петербург 2010г.

003493658

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург и ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Михаил Михайлович Шавловский

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Анатолий Иосифович Гинак

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков

доктор биологических наук, профессор Надеиода Васильевна Кириллова

Ведущее научное учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН

Защита состоится 2010 года в // Часов на заседании

Диссертационного совета Д ^ 001.022.03 в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский проспект, дом 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН.

Автореферат разослан «¿¿О» ¿-^^/<42010 ]

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Нучкова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Идея коррекции различных дефектов путем введения в клетки организма недостающей или исправляющей генетической информации была выдвинута в начале 1970 годов, но получила свое развитие значительно позж е (Wolff and Lederberg, 1994; Горбунова и Баранов, 1997; Anderson W.F., 1998). Основанный на этой идее способ лечения получил название «генная терапия». Однако, несмотря на впечатляющие успехи генной инженерии, достижения клеточного трансгеноза и успешное развитие представлений о молекулярных механизмах патогенеза многих заболеваний, методы доставки чужеродной генетической информации в клетки целого организма все еще крайне несовершенны. Наиболее эффективными по уровню трансфекции до сих пор остаются вирусные методы, суть которых заключается в создании абортированных несущих целевые гены вирусов, которые, не вызывая инфекции, обеспечивают внедрение этих генов в ядра клеток организма in vivo. К сожалению, целый ряд сопутствующих осложнений (Hacein-Bey-Abina et al., 2003. Baum et al., 2006. McElvaney et al., 1995. Raperet al., 2003. Muruve, 2004) все в большей степени подтверждают мнение о необходимости изыскания более совершенных и безвредных способов для генной терапии. Одной из главных альтернатив вирусным способам доставки генетического материала является использование плазмид, содержащих в своей структуре экспрессируемые целевые гены. Плазмиды имеют целый ряд преимуществ перед вирусами и, кроме того, могут представлять собою очищенные препараты ДНК. Основные трудности использования плазмид заключаются в необходимости их комплексирования с целым рядом дополнительных соединений, которые обеспечивают устойчивость, целевую доставку, способность проникать через клеточные мембраны и через ядерные барьеры. Несмотря на многочисленные попытки создания оптимальных конструкций, применение плазмидного материала все еще недостаточно эффективно, число трансфецированных клеток обычно не превышает 10%, что недостаточно для устранения большинства генетических дефектов и крайне низко для терапии злокачественных новообразований. В настоящее время испытаны разные плазмидные комплексы, но в целом проблема использования плазмидной ДНК in vivo остается нерешенной. Поэтому изыскание новых путей доставки в клетки генетического материала представляется весьма актуальным. Цель работы заключается в получении гидрокортизоновых производных на основе катионных полимеров, которые могли бы быть использованы в качестве векторов для генной терапии in vivo. Задачи исследования.

1. Разработать методики синтеза конъюгатов гидрокортизона (ГК) и катионных полимеров.

2. Получить в очищенном состоянии ГК производные полилизина (ПЛ), полиэтиленимина (ПЭИ) и белка протамина (ПТ).

3. Определить степень модификации полимеров лигандом.

4. Изучить способность конъюгатов взаимодействовать с плазмидными ДНК (пл ДНК).

5. Получить комплексы конъюгатов с ДНК (наночастицы), оптимально подходящие по размерам для трансфекции эукариотических клеток.

6. Определить способность наиболее перспективных наночастиц осуществлять транспорт пл ДНК в клетки экспериментальных животных. Научная новизна полученных результатов. Впервые синтезированы производные ПЛ, ПЭИ и ПТ, содержащие в качестве лиганда ГК, который способен путем рецепторного эндоцитоза проникать в эукариотические клетки и далее транспортироваться через мембранные барьеры в ядра. Охарактеризованы физико-химические свойства полученных конъюгатов. Показано их эффективное связывание с пл ДНК. Разработаны методики формирования комплексов векторный конъюгат - ДНК. Найдено, что оптимальные по размерам комплексы (наночастицы) могут быть получены при взаимодействии ДНК, конъюгатов и белка лактоферрина (ЛФ). Выявлена трансфецирующая активность наночастиц при введении в организм экспериментальных животных.

Практическое значение результатов исследования заключается в организации дополнительных исследований, направленных на разработку протоколов использования векторных конструкций (наночастиц) для генной коррекции патологических состояний. Полученные результаты могут быть использованы для образовательных целей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основе катионных полимеров, как синтетических, так и природных, карбодиимидным методом могут быть получены конъюгаты с функциональным лигандом - ГК.

2. Степень модификации полученных производных катионных полимеров легко оценивается спектрофотометрически.

3. ГК-производные полимеров эффективно связываются с пл ДНК. Взаимодействие модифицированных полимеров с ДНК в определенных пределах зависит от строения плазмиды (нуклеотидного состава, размеров и конформации).

4. Комплексирование ГК-производных полилизина, полиэтиленимина и протамина с ДНК сопровождается формированием частиц, размеры которых превышают необходимые для трансфекции.

5. Введение дополнительного компонента - белка ЛФ способствует образованию наночастиц (пл ДНК - ГК-производное - ЛФ), размеры которых (около 30 нм) соответствуют требованиям для эффективной трансфекции.

6. В опытах на лабораторных животных показана трансфецирующая активность комплексов пл ДНК - ГК-ПТ - ЛФ на уровне целого организма при парентеральном введении.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих конференциях: III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ (ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г.; Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, Санкт-Петербургский государственный университет, 2002 г.; - Научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования, 2002 г.; - Научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и

экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования, 2008 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, из них одна в рецензируемом журнале по списку ВАК РФ.

Личный вклад автора в проведение исследования. Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статьи и подготовка докладов на конференциях. Синтез ГК-производных катионных полимеров, используемых в работе, анализ взаимодействия ГК-производных катионных полимеров с пл ДНК, определение относительного размера наночастиц по связыванию бромистого этидия, а также хроматографический анализ коныогатов и трансфекция полученными векторами in vivo лабораторных животных, клеточных линий были выполнены соискателем. Гидродинамические размеры наночастиц определены по светорассеянию на лазерном корреляционном спектрометре ЛКС-03 научным сотрудником Института гриппа РАМН П.А. Некрасовым.

Внедрение результатов работы. Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процессы Отдела молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН (Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул.Ак.Павлова, 12), кафедры «Молекулярная биотехнология» ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)» (Россия, 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26); кафедры «Медицинская биология и генетика» ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский Университет имени академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).

Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 197 наименований, из них 7 источников на русском языке и 190 на иностранном языке. Диссертация изложена на 127 страницах. Результаты представлены в 4 таблицах и иллюстрированы 18 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. В работе были использованы: гемисукцинат ГК (lip, 17а, 21-тригидрокси-4-прегнен-3,20-дион-21-гемисукцинат) «Sigma» (мол.м. 462,5), полиэтиленимин (мол.м. 12000), полилизин (мол.м. 30000 ), протамин-сульфат (мол.м. 4000), Ы^-дициклогексилкарбодиимид (мол.м. 206,33), все неорганические соли, реагенты и материалы для электрофорезов и хроматографии фирм «Sigma» и «Serva»; белые беспородные мыши (из питомника Рапполово, С-Пб) в возрасте до 3-х месяцев и весом до 25 грамм; E.coli штамм DH5a генотипа supE44 Д1ас U169 (фВО lacZ ДМ 15) hsd R17 rec Al end Al gyr A96 thi-1 rel Al, который был использован для клонирования рекомбинантных плазмид. В качестве модельного генетического материала для трансфекции клеточных культур и для доставки целевых генов в соматические клетки животных использовали следующие плазмиды (Clontech): pCMVLacZ, содержащую под эукариотическим промотором ген бактериальной бета-галактозидазы, pEGFP-N3, содержащую под эукариотическим промотором ген зеленого флуоресцентного белка и

pDsRedl-1, содержащую под эукариотическим промотором ген красного флуоресцентного белка. Выделение и анализ плазмидных ДНК осуществляли по общепринятым методикам.

Экспериментальная часть. Получение конъюгатов гидрокортизон-полилизин, гидрокортизон-полизтиленимин, и гидрокортизон-протамин. Исходными веществами для получения конъюгата являлись гемисукцинат ГК, ПЛ, ПЭИ, ПТ и дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД). Модификацию полимеров осуществляли, основываясь на методике синтеза стероидных производных бычьего сывороточного альбумина (Erlanger et al., 1957) под влиянием ДЦКД. В качестве растворителей использовали метанол, этанол, хлороформ и дистиллированную воду. Реакции осуществляли в смесях этих растворителей. Для перевода солей в свободные состояния использовали триэтиламин. В ряде случаев для ускорения реакции вводили катализатор - парадиметиламинопиридин. После завершения реакции продукты очищали от дициклогексилмочевины центрифугированием и от не прореагировавшего гемисукцината ГК - экстракцией хлороформом. Модифицированные полимеры переводили в водный раствор. Для определения выхода конечных продуктов реакции применяли хроматографию в тонком слое с последующим обнаружением остатков ГК по гашению флуоресценции носителя и окрашиванием на органические соединения парами иода. Хроматографию осуществляли в системе ацетон/бензол (1:1). Расчет молярного соотношения ГК и полимера определяли на основании анализа поглощения при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения ГК и модифицируемых полимеров. Из величин удельного поглощения носителя и ГК при помощи уравнений оценивали число остатков ГК, приходящееся на усредненную молекулу носителя.

Электрофоретический анализ комплексов плазмидной ДНК с конъюгатами. Анализ взаимодействия плазмидной ДНК конъюгатами осуществляли при помощи электрофореза (ЭФ) в 0,8%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий (Маниатис Т. и др., 1984).

Трансфекция комплексами клеток в культурах. Эксперименты по трансфекции осуществлялись на следующих клеточных линиях: мышиные скелетные миобласты (С2С12), эмбриональные фибробласты мыши (NIH ЗТЗ) и клетки крысиной гепатомы (Hep G2) (коллекция клеточных культур Института цитологии РАН). Культивирование проводили по стандартной методике на среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики пенициллин и стрептомицин в концентрации 100 ед/мл. В качестве модельной использовали плазмиду с геном бета-галактозидазы. Окраску осуществляли как описано ниже и оценивали уровень трансфекции по числу клеток с сине-зеленой окраской.

Определение размеров наночастиц. Оценка размеров комплексов в различных растворителях проводили по (Izumrudov et al., 2002). Для определения зависимости размера и стабильности комплекса от состава растворителя проводили формирование комплексов с ДНК, предварительно окрашенной бромистым этидием. В нашем случае для приблизительной оценки размера комплексов использовали флуоресцентную микроскопию. Истинные размеры наночастиц определяли также по светорассеянию на лазерном корреляционном спектрометре ЛКС-03.

Формирование тройных комплексов ДНК-носитель-лактоферрин. Анализ влияния ЛФ на компактизацию комплексов осуществляли следующим образом. Первоначально получали смесь носителя (конъюгат ГК-ПТ) и ЛФ в определенном соотношении и концентрациях, а затем медленно добавляли смесь к раствору ДНК с концентрацией ОД мкг/ мкл. Соотношение носитель/ЛФ выбирали, исходя из результатов предварительного регардационного теста. Определив количество носителя, необходимое для полного связывания 1 мкг пл ДНК, принимали его за единицу связывающей активности. Аналогично определяли связывающую активность ЛФ.

Далее использовали величину а, которая определяется единицами связывающих активностей ГК-носителя и ЛФ (единицы связывающей активности варьируют от 0 до 1). Величина а также варьирует от 0 до 1 и выбирается произвольно. Например, при а = 0,9 в состав смеси входит 0,9 единиц связывающей активности ГК-носителя и 0,1 единиц связывающей активности ЛФ.

В опытах по ретардации ДНК в присутствии ГК-носителя и ЛФ величину а изменяли от 0 до 1 и при каждом значении а добавляли соответствующее суммарное количество ГК-носителя и ЛФ в мкг на мкг ДНК. Соотношение смеси ГК-носителя и ЛФ в мкг на мкг ДНК выражали как к - коэффициент соотношения смеси носитель + ЛФ к ДНК. Оценивали влияние к на электрофоретичеекую подвижность комплекса при заданном значении а.

Таким образом, можно было по величинам an к определить истинное количество ГК-носителя и ЛФ в комплексе, вызывающее определенную ретардацию ДНК. Определив значения а и к для оптимальной ретардации комплекса (минимальное перемещение в агарозном геле), использовали такой комплекс для трансфскций.

Трансфекция лабораторных животных наночастицами, на основе модифицированных полимерных носителей. Опыты ставились на белых беспородных мышах в возрасте 3 месяцев и весом около 25 г. Д ля каждого эксперимента использовались 5 животных в опытной группе и 2 контрольных животных. Каждому животному вводилось количество материала, соответствующее чаще всего 30 мкг плазмидной ДНК в чистом виде или в виде комплексов с коньюгатами. Животным вводилась доза препарата в физиологическом растворе внутрибрюшинно или в хвостовую вену. Объем вводимого материала составлял от 0,4 до 1,0 мл. Через 3 суток животных усыпляли наркотизированном и забирали ткани на гистохимический анализ.

В зависимости от использованной плазмиды (различие по маркерному гену) детекция продукта маркерного гена оценивалась при микроскопировании прямо визуально (по флуоресценции зеленого или красного флуоресцентного бежа) или после соответствующей окраски (обнаружение галактозидазы хромогенным субстратом). В ряде случаев продукт выявляли при помощи специфических антител после ЭФ белков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В качестве новой пары лиганд-рецептор нами была выбрана система интернализации стероидных гормонов. Из литературных источников (Mayer et al., 1975; Gadson et al., 1984, Gorski and Gannon, 1976, Rao et al., 1977) известно, что кортикостероиды, в частности ГК, проникают через клеточные мембраны, как путем неспецифической диффузии, так и при помощи активного рецепторного транспорта. ГК, кроме того, казался привлекательным, так как этот гормон перемещается в цитоплазме в виде комплекса со специальными цитоплазматическими транспортными белками и в итоге проникает через ядерную мембрану, оказывая влияние непосредственно на генетический аппарат клетки. Мы предполагали, что комплексы (наночастицы), содержащие целевые ДНК, ДНК-компактизирующие соединения и ГК, будут являться эффективными векторами доставки чужеродной ДНК с последующей экспрессией вводимых генов.

В связи с тем, что ГК непосредственно с препаратами ДНК не взаимодействует, требовалась модификация этим гормоном поликатионных носителей, прочно связывающих ДНК за счет электростатических взаимодействий. Как известно, такими носителями могут выступать ПЛ, ПЭИ и ПТ. Для модификации этих носителей использовали гемисукцинат ГК, содержащий карбоксильную группу, которая может взаимодействовать с аминогруппами после активации ДЦКД.

Перечисленные полимерные носители являются гидрофильными соединениями, легко растворяющимися в воде, в то время как гемисукцинат ГК и ДЦКД гидрофобны. Поэтому в каждом случае подбиралась смесь растворителей для получения однофазной системы. Водные растворы спиртов оказались в этом плане наиболее удобными. Модификацию катионных полимеров осуществляли, основываясь на методике синтеза стероидных производных бычьего сывороточного альбумина (Erlanger et al., 1957).

1. Синтез конъюгата гидрокортизон-полилизин.

Для синтеза использовали препарат ПЛ с мол.м. 30 кД (220 остатков лизина). Определенное количество ПЛ растворяли в метаноле (10 мг в 1мл). Гемисукцинат ГК и ДЦКД растворяли в дихлорметане (10мг в 1мл). Для синтеза производного на 1 моль ПЛ добавляли 100 молей ГК и 50 молей ДЦКД. Для перевода аминогрупп ПЛ (бромистая соль) в свободное состояние в реакционную смесь вводили триэтиламин из соотношения 220 моль триэтиламина на 1 моль ПЛ. Для ускорения реакции использовали катализатор парадиметиламинопиридин из расчета 1 моль на 50 молей ДЦКД. Конечный продукт очищали и переводили в водную фазу.

2. Синтез конъюгата гидрокортизон-полиэтиленимин.

Для получения производного к 1 моль ПЭИ в метаноле добавляли 5-10 моль гемисукцината ГК в метаноле, парадиметиламинопиридин 1/50 в молярном соотношении от количества ДЦКД (катализатор реакции) и раствор ДЦКД в хлороформе из расчета 1 моль ДЦКД на 2 моль гемисукцината ГК. Смесь инкубировали в течение 5 часов, и затем осадок дициклогексилмочевины удаляли центрифугированием. Раствор упаривали, низкомолекулярные не прореагировавшие соединения удаляли экстракцией хлороформом. Полученный продукт диализовали против физиологического раствора.

3. Синтез гидрокортизонового производного протамина.

Для перевода ПТ и ГК в одну фазу опытным путем была подобрана реакционная смесь - этанол-вода в соотношении 2:5 по объемам. В качестве примера приведена схема синтеза производного ПТ. Среда объемом 1 мл содержала 1,5 мг сульфата ПТ, 0,17 мг гемисукцината ГК и 0,1 мг ДЦКД. Реакция проводилась в течение 5 часов при температуре 37°С. Выпадающую в осадок дициклогексилмочевину удаляли центрифугированием. Раствор лиофилизировали после удаления избытка этанола, и осадок экстрагировали хлороформом. Полученное производное диализовали против физиологического раствора.

4. Хроматографический анализ полученных коиыогатов.

При тонкослойной хроматографии полученных конъюгатов до очистки путем экстракции выявлялись 2 зоны, одна из которых соответствовала свободному гемисукцинату ГК и мигрировала на некоторое расстояние от старта, а другая не перемещалась в применяемой системе растворителей. Обе зоны при ультрафиолетовым облучении выявлялись в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне. Не перемещаемая со стартовой точки зона окрашивалась парами йода и соответствовала по этим показателям используемому катионному полимеру. После экстракции зона свободного гемисукцината ГК не определялась. На рисунках 1 и 2 в качестве примера приведены хроматограммы производного ПТ. Видно, что в реакционной смеси помимо поглощающего ультрафиолет конъюгата присутствует остаточное количество свободного гемисукцината ГК, от которого освобождались методом экстракции. После окрашивания хроматограммы парами йода,

ПТ и коньюгат ПТ выявляются на старте в виде коричневых пятен на желтом фоне (см. рис 2).

Рисунок 1. Хроматография исходных соединений и производного протамина в тонком слое силикагеля. Визуализация под ультрафиолетовым светом. На рисунке синей стрелкой, направленной вверх, указано движение подвижной фазы; стрелками А и В - темные пятна, соответствующие свободному гемисукцинату ГК и модифицированному ПТ соответственно; 1-30 мкл раствора гемисукцината ГК (концентрация 40 мкг / мл), 2-30 мкл реакционной смеси, 3-30 мкл раствора ПТ (концентрация 0,4 мг/мл).

] Рисунок 2. Хроматограмма исходных соединений и коньюгата ! после окрашивания парами йода. Синей стрелкой, направленной ] вверх, указано движение подвижной фазы; точки нанесения 1 проб как на рис.1: 1 - 30 мкл раствора гемисукцината ГК (концентрация 40 мкг / мл), 2-30 мкл реакционной смеси, 3-30 | мкл раствора ПТ (концентрация 0,4 мг / мл).

| Для удаления непрореагировавшего гемисукцината ГК

| реакционную смесь двукратно экстрагировали

хлороформом в соотношении объем реакционной ! смеси/объем хлороформа 1:1. Разделение фаз осуществляли

путем центрифугирования при 150СХ^ в течение 10 минут при

[_;_'________________температуре 18°С. По данным повторного

хроматографического анализа (хроматограммы не представлены) после экстракции свободного гемисукцината ГК в препаратах конъюгата не оставалось.

5. Стехиометрия связывания гидрокортизона с носителем. Соотношение связанного ГК с полимерами определяли, исходя из оптического поглощения отдельных составляющих и конечного продукта при двух значениях длин волн. Удельные коэффициенты поглощения 0242гк, 0225™ > ®242т", Е>22зпэи» 0242™ и В225пл при концентрации 1 мг/мл в кювете с толщиной слоя 1 см соответственно при "к 242 и 225 нм составляли:

П242гк = 30,24; 0225,к = 14,04; Б242пэи = 0,282; 0225пэи = 1,333. Поглощение полученного препарата конъюгата (КТ) ПЭИ составила 02^2КТ и 0225"-

= 0,427; 0225кт = 0,36

Для того чтобы вычислить относительное содержание ГК и ПЭИ или других полймеров в полученных препаратах приведенные значения оптического поглощения вводили в систему уравнений:

Б К1 1-. ГК * /^[К , ГЛ ПЛ.ПЭИ.ПТ * /-1 пл.пэи.пт

242 - и242 * С + и242 С]

ОКТ _ т\ Ш * ✓чГК , т-\ 11Л.ПЭИ * Г1 ПЛ.ПЭИ

225 - ¡->225 Ь + и225 "-1

о25би = о256гк * с,к + о256пт * С,пт

где Сгк - концентрация ГК в мг/мл; С1ПЛ,ГОИ,ПТ - концентрация ПЛ, ПЭИ, ПТ в мг/мл; вкгкпл'пэи'пт',ст - удельный коэффициент поглощения ГК, ПЛ, ПЭИ, ПТ, КТ при концентрации 1 мг/мл в кювете с толщиной слоя 1 см при X, нм; X - длина волны, нм.

Числовое решение уравнений показало, что концентрация ПЭИ в полученном растворе конъюгата составила 0,137 мг/мл, а концентрация ГК -0,0115 мг/мл. Таким образом, молярная концентрация ГК соответствовала 2,4 х 10"8 М и концентрация ПЭИ 1,1 х 10"8 М. В полученном препарате на молекулу ПЭИ приходится 2 молекулы ГК.

Для определения соотношения ГК/полимер в ПЛ-конъюгатах уравнение модифицировали следующим образом:

Удельные поглощения (1 мг/мл, толщина кюветы 1см ) составляли : 0242гк = 30,24; Г>225,к = 14,04; 0242пл = 0,098; 0225пл = 1,271 Поглощение полученных конъюгатов при указанных длинах волн составляло В^г*1 (02 и"):

0242ьт = 1,08; Ог^ = ОД Указанные значения были введены в систему уравнений:

Т>Ш™ = 0242га * С™ + 0242™ * С"Л Виз" = 0225гк * Сгк + В225ш * Спл

где С™ - концентрация ГК (мг/мл); С™1 - концентрация ПЛ (мг/мл).

Решение уравнений при данных значениях поглощения синтезированного конъюгата после перевода в молярные концентрации показало, что на 1 моль ПЛ приходится 10 молей ГК. Данный препарат в дальнейшем был использован для анализа взаимодействия с ДНК. Для определения стехиометрии стероида и белка в конъюгате использовали уравнение (как и в случае производных ПЛ и ПЭИ), основанное на удельном поглощении ПТ при 256 нм (0256"г) и 242 нм (В242"т) и ГК при 256 нм (0256гк). Очищенные препараты конъюгата спектрофотометрировали при этих длинах волн (0242т , 0256КТ).

Предварительно были измерены коэффициент экстинкции ПТ (0242'") на длине волны, соответствующей максимуму поглощения ГК (242 нм), и коэффициент экстинкции ГК (В256гк) на длине волны, соответствующей максимуму поглощения ПТ (256 нм). ПТ и ГК растворяли в 27% этаноле. Зная коэффициенты экстинкции ПТ и ГК в их максимумах поглощения и, измерив поглощение раствора конъюгата на этих двух длинах волн, получали систему уравнений, которая в общем случае имеет вид (как и в случае других производных):

п кт _ п ГК * рГК , р. ПТ * р ПТ

1>242 ~~ и242 + "242

0КТ _ п гк * ргк , р> пт # р пт 256 _ ¿-»256 ^ + и256

где Сгк - концентрация ГК (мг/мл); Спт - концентрация ПТ (мг/мл); 0242кт -поглощение исследуемого раствора при длине волны 242 нм; Бгзб" - поглощение исследуемого раствора при длине волны 256 нм.

Удельные коэффициенты поглощения ПТ и ГК при концентрации 1 мг/мл в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 256 и 242 нм соответственно составляли (В256пт, В256'к 0242"т):

0256"т = 0,117; 0256гк' = 22,5; В242пт = 0,17

Исходя из числового решения уравнений и определения концентраций ГК и ПТ, в полученном очищенном конъюгате было найдено, что на 1 моль ПТ приходится 0,89 - 0,92 моль ГК. Таким образом, полученные величины хорошо согласуются с теоретическими предпосылками, согласно которым только концевая иминогруппа ПТ модифицируется стероидом. По этим результатам выход конечного продукта -модифицированного ПТ составлял около 90%.

6. Формирование комплекса плазмидная ДНК-носитель и оценка его свойств.

Все использованные в работе полимеры представляют собою полиэлектролиты. С одной стороны, это ДНК, несущая повторяющиеся остатки фосфорной кислоты, с другой стороны, это ПЛ, ПЭИ и ПТ, содержащие большое число положительно заряженных амино-, имино- и гунидиновых группировок. Взаимодействие противоположно заряженных полиэлектролитов при соответствующих значениях рН сопровождается образованием большого числа ионных связей, которые в силу кооперативности прочно удерживают полиэлектролиты в составе комплекса. Такие комплексы принято называть интерполиэлектролитными.

Простейший способ получения интерполиэлектролитов - прямое смешение растворов, один из которых содержит полианионный, а другой — поликатионный компонент. Степень превращения, т.е. степень завершенности реакции образования комплекса определяется как соотношение равновесного числа солевых связей между полиионами к их максимально возможному расчетному числу. Стоит отметить, что степень превращения зависит от ионной силы и рН раствора, в котором протекает реакция. При различных отношениях ионогенных групп исходных компонентов могут быть получены как нерастворимые, так и растворимые интерполиэлектролитные комплексы. Нерастворимые ассоциаты образуют сравнительно мало сольватированные осадки.

Взаимодействие полученных конъюгатов с ДНК определяли при помощи ЭФ в агарозном геле. Определенное фиксированное количество ДНК смешивали с переменным количеством конъюгатов и после короткой инкубации оценивали изменение электрофоретической подвижности ДНК. На рисунке 3 представлены результаты анализа комплексов на основе ПТ. Из данных титрования получали оптимальные соотношения полиэлектролитов для формирования комплексов. Принципиально результаты электрофоретического анализа комплексов на основе всех испытанных полимеров не отличались, поэтому представлены только результаты ЭФ комплексов ДНК с производными ПТ. Сравнительный ретардационный анализ показал, что существенное значение для нахождения оптимального соотношения ДНК/конъюгат имеет природа плазмиды. Различные плазмидные ДНК различаются по стехиометрии связывания с одним и тем же конъюгатом, что, скорее всего, объясняется отличиями нуклеотидного состава, конформации и степени нативности.

7. Трансфекция эукариотических клеток в культурах. Первоначально нами были получены производные ПЛ и ПЭИ. Комплексы этих производных с плазмидными ДНК оценивались на способность к трансфекции эукариотических клеток в культурах. Были использованы 3 вида клеток. К сожалению, комплексы, содержащие производные ПЛ данные клеточные линии не трансфецировали. Производные ПЭИ обладали слабым трансфецирующим

действием (см. рис. 4) только в отношении клеточных линий С2С12 и Нер й2. При этом удавалось обнаружить единичные клетки в поле зрения, окрашиваемые на

Рисунок 3. Электрофорез в агарозном геле комплексов плазмидной ДНК (pEGFP-N3 -плазмида, содержащая под эукариотическим промотором ген зеленого флуоресцентного белка) с коньюгатом ПТ-ГК.

Окраска бромистым этидием. Сверху указано количество конъюгата в пересчете на 1 мкг ДНК; К (контроль) - чистая плазмида; 0 - лунки, в которые вносился материал; А -суперскрученная форма плазмиды, Б - кольцевая форма плазмиды.

активность бета-галактозидазы. Иммунологическими методами также не удавалось обнаружить синтезированных белков, гены которых были в составе плазмид, после культивирования клеток в присутствии соответствующих плазмидных комплексов. Полученные комплексы были также использованы для трансфекции в условиях in vivo. В опытах на мышах нам не удалось в тканях обнаружить синтезируемые белки, кодируемые генами в составе использованных плазмид. Таким образом, предварительные результаты показали, что полученные нами производные полимеров по каким-то причинам обладают лишь весьма слабым трансфецирующим действием. Для выяснения причины неудачи было решено в первую очередь определить размеры получаемых комплексов, так как хорошо известно, что этот параметр может оказывать существенное влияние на проникновение комплексов в клетки.

Рисунок 4. Трансфекция мышиных миобластов С2С12 конъюгатом ПЭИ-ГК в комплексе с плазмидой рСМУЬас Ъ. Стрелкой в центре рисунка 4 указана клетка, окрашенная на галактозидазную активность. Большинство клеток не окрашено.

8. Определение размеров комплексов.

Из литературных источников известно, что оптимальные размеры наночастиц для трансфекции должны составлять около 30 нм. Поэтому в задачи настоящего исследования входила оценка размеров получаемых комплексов. Одним из качественных подходов для этих целей служит флуоресцентная микроскопия получаемых комплексов. В связи с тем, что величина комплексов может оказывать существенное влияние на проникновение материала через клеточные барьеры, а значит, и на результаты трансфекции, необходимо было оценить размеры получаемых в разных условиях комплексов.

Грубую оценку размера получаемых комплексов осуществляли при помощи окрашивания ДНК бромистым этидием. Было выяснено, что в 0,15 М №С1 комплексы образуют крупные агрегаты различной величины; размер самых крупных агрегатов сопоставим с размером метафазных хромосом человека, т.е. измеряется сотнями нм. Крупные размеры комплексов характерны для всех изученных конъюгатов в независимости от степени их модификации ГК. На рисунке 5 приведены результаты определения размеров комплексов флуоресцентным методом. Более точную оценку размеров получаемых комплексов осуществляли при помощи светорассеяния.

Рисунок 5. Агрегаты комплексов, полученных в 0,15 М ИаС1 при соотношении ДНК/носитель (ПТ-ГК) 1/0,6 (ув. 300). Окраска бромистым этидием. В правом верхнем углу рисунка 5 расположена фотография метафазных хромосом человека.

9. Влияние лактоферрина на размеры комплексов модифицированного протамина с ДНК.

Как видно из предыдущих разделов, несмотря на достаточно прочное комплексирование ГК-производных с плазмидными ДНК, размеры комплексов превышают необходимые для трансфекции. Предварительный анализ трансфецирующей эффективности комплексов пл ДНК с полученными ГК-производными катионных полимеров показал, что на клеточном уровне только производные ПЭИ обладают слабой активностью, и то в отношении только одной клеточной линии. На целом животном не удалось получить трансфекции органов при использовании разных полимеров и различных плазмид. Целевых белков в органах не было достоверно обнаружено ни по специфической флуоресценции, ни при помощи иммунохимического анализа. Варьирование условий формирования комплексов не позволяло добиться оптимальных моноДНК-наночастиц. Эти эксперименты, скорее всего, были неудачными в связи с крупными размерами получаемых комплексов, что следует из результатов определения этих размеров флуоресцентным методом. Поэтому было решено исследовать влияние дополнительных компонентов на размеры наночастиц. В качестве такого

соединения был выбран ЛФ, который, как ранее было показано (Синогеева и др., 2000), является удобным комплексообразователем для ДНК. При этом мы исходили из предположения, что замена части катионного полимера на ЛФ будет способствовать снижению степени ассоциации, характерной для комплексов с участием сильных поликатионов.

При связывании ДНК с ЛФ наблюдается истинная ретардация: по мере увеличении количества ЛФ, приходящегося на 1 мкг ДНК, продвижение комплексов замедляется вследствие снижения поверхностного заряда комплексов и, возможно, увеличения их размера. Одновременно происходит размывание зон вследствие возникновения некоторой дисперсии комплексов по размерам и заряду. Кроме того, можно наблюдать эффект насыщения: начиная с определенной точки дальнейшее увеличение количества ЛФ в комплексе (даже до очень больших значений) не приводит к изменению электрофоретической подвижности ДНК; комплексы ДНК-ЛФ выходят из лунок в гель, что свидетельствует о сохранении комплексами слабоотрицательного поверхностного заряда и размеров, не превышающих размера пор геля.

Формирование тройных комплексов проводили при следующих соотношениях а: 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2. Найденные коэффициенты к для указанных а лежат в пределах 0,1 - 1,6. При проведении электрофореза было обнаружено, что уже при а = 0,9 (т.е. при замещении 0,1 единицы связывающей активности полимерного носителя (ПЛ, ПЭИ, ПТ на ЛФ) наблюдается истинная ретардация (рис. 6), что свидетельствует о смене кооперативного механизма образования комплексов на статистический. При этом образующиеся трехкомпонентные комплексы скорее всего носят мономолекулярный в отношении ДНК характер, так как проникают в поры агарозного геля и перемещаются в нем. Флуоресцентный микроскопический анализ не позволяет увидеть образующиеся комплексы.

0-— К 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1.6

Б — А —

Рисунок 6. Электрофорез тройных комплексов ДНК-конъюгат (ПТ-ГК) -ЛФ, полученных в 0,15 М №С1 при а- 0,9 в агарозном геле. Вверху указаны коэффициенты к; К (контроль) - чистая плазмида; 0 - лунки, в которые вносился материал; А - суперскрученная форма плазмиды; Б - кольцевая форма плазмиды

Эффекта удержания комплекса в лунке, как и в случае связывания ДНК с чистым ЛФ, не наблюдали; при к = 1,2 имеет место максимальная ретардация ДНК. Потеря надмолекулярной ассоциации ДНК при образовании комплексов, очевидно, связана с конкурентными отношениями ГК носителя и ЛФ во взаимодействиях с ДНК. Образование же комплексов малого размера происходит, предположительно, из-за того, что молекулы ЛФ служат своеобразными солюбилизирующими факторами вследствие своих больших размеров и строгой локализации участка,

взаимодействующего с ДНК. В случае взаимодействия ДНК с ПТ (а, следовательно, и конъюгатом ГК-ПТ) заряды гуанидиновых групп и остатков фосфорной кислоты взаимно экранируют друг друга, что приводит к сильному снижению поверхностного заряда, потере гидратной оболочки и агрегации комплексов. А после связывания ДНК с ЛФ большая часть молекулы белка оказывается обращенной в раствор и благодаря экспонированным на се поверхности полярными группам взаимодействует с молекулами воды, что обеспечивает сохранение растворимости. Таким образом, замещение части ПТ в комплексе на ЛФ приводит к повышению растворимости комплексов и предотвращению их агрегации.

10. Определение размеров комплексов при помощи светорассеяния на лазерном корреляционном спектрометре.

Данный метод позволяет оценить истинный размер частиц и определить относительный вклад частиц разного размера в светорассеяние. Предварительные опыты при помощи световой микроскопии показали, что комплексы ПЛ, ПЭИ, ПТ и их ГК-производных с пл ДНК представляют собою крупные агрегаты. В то же время ГК-производные полимеров в присутствии ЛФ формируют комплексы, которые не обнаруживаются при обычной микроскопии. Поэтому для анализа с помощью лазерного светорассеяния были использованы трехкомпонентные комплексы, которые включали помимо ГК производных полимеров и ДНК, также и ЛФ. В качестве наиболее перспективного был выбран модифицированный ПТ. Эксперимент осуществляли на препаратах с оптимальным соотношением компонентов. Более точно размеры наночастиц определяли по светорассеянию на лазерном корреляционном спектрометре ЛКС-03 (ООО «Интокс», Россия). Результаты приведены на рисунке 7.

Как следует из приведенных результатов, тройные комплексы представлены наночастицами с размерами около 30 нм и более крупными частицами с размерами, превышающими 100 нм. Вклад наночастиц с размерами около 30 нм достаточно высок. Кроме того, по количеству материала, составляющего эти наночаетицы, они преобладают, так как вклад более крупных частиц в светорассеяние более значителен. Таким образом, трехкомпонентные комплексы, содержащие модифицированный ПТ, ЛФ и пл ДНК, по размеру наночастиц являются наиболее перспективными для переноса генетического материала.

Рисунок 7. Диаграмма зависимости интенсивности рассеяния от размера частиц ПТ-ГК - ЛФ - пл ДНК. По оси абсцисс - логарифм диаметра частиц в нм, по оси ординат - % светорассеяния; а = 0,9; А = 1,2

11. Трансфекция полученными векторами эукариотических клеток.

Анализ ДНК-содержащих наночастиц, получаемых из конъюгатов ГК-производных ГШ, ПЭИ и ПТ показал, что наиболее приемлемыми для трансфекции

являются наночастицы на основе ПТ с добавлением ЛФ. Размер этих наночастиц по всем критериям соответствует оптимальным и для внедрения в цитоплазму и для проникновения через ядерную мембрану. Поэтому эти наночастицы были испытаны для трансфекции in vivo. С целью контроля первоначально были испытаны комплексы без добавления ЛФ.

Схема опыта описана в разделе «материалы и методы». Животным вводили плазмидный материал в виде очищенной ДНК или в виде наночастиц с соответствующим конъюгатом. Предварительные опыты показали, что наночастицы на основе ПЛ, ПЭИ и ПТ обладают весьма низкой трансфецирующей активностью на уровне целого организма. Флуоресцентные белки - продукты экспрессии маркерных генов при микроскопии в тканях не обнаруживались. Только специальные методы иммунохимического анализа позволяли обнаружить незначительные количества иммуногенного материала в некоторых тканях животных, которым вводились наночастицы на основе указанных конъюгатов. В тканях контрольных животных, которым вводились некомплексированные плазмидные ДНК, обнаружить продукты экспрессии маркерных генов не удавалось.

Поэтому нами представлены результаты анализа тканей животных, которым вводили производные ПТ с добавлением ЛФ. Эти наночастицы формировали в 0.15 М NaCl. Выбор среды для формирования комплексов обусловлен необходимостью введения животным изотонического раствора, так как объем вводимых проб был значителен (в среднем 0,6 мл). Выбранное для формирования комплексов значение а = 0,9; к = 1,2. В качестве типичного примера комплекс (наночастицы) содержал 30 мкг ДНК + 19,5 мкг конъюгата ГК-ПТ + 10,8 мкг ЛФ. Объем раствора ДНК составлял 20 мкл. Конечный объем - 0,6 мл изотонического раствора. В качестве маркерной была использована плазмида, содержащая ген бета-галактозидазы. Выявление продукта экспрессии маркерного гена осуществляли при помощи субстрата X-Gal. Исследованию подвергались ткани сердца, печени и почек.

В ткани сердца маркерного белка обнаружено не было. При окрашивании срезов печени была обнаружена бета-галактозидазная активность (рис. 8). Окрашенные в синий цвет клетки расположены диффузно; плотность окрашенных клеток выше на участках, прилегающих к сосудам. Срезы печени интактных и контрольных (введение комплексов без ЛФ) животных не окрашивались.

Рисунок 8. Окраска среза печени на бета-галактозидазную активность. Микроскопия среза печени мыши после трансфекции и окраски с X-Gal (Ув.80*). Синие пятна - участки проявления активности бета-галактозидазы.

Окрашенные клетки подсчитывали, анализируя по 10 случайно выбранных полей зрения на каждом срезе; число срезов на каждый орган равнялось 6. Среднее число окрашенных клеток в поле зрения составило 23.

Аналогичные результаты были получены при окрашивании срезов почек экспериментальных животных. Активность бета-галактозидазы выявлялась по периферии органа (рис.9). Окрашенные клетки образуют тяжи, предположительно соответствующие почечным канальцам. Срезы почек интактных животных не окрашивались.

Рисунок 9. Окраска ткани почки на бета-галактозидазную активность. Микроскопия среза почки мыши после трансфекции и окраски с X-Gal. (Ув.80*). Синие пятна - участки проявления активности бета-галактозидазы.

В данном случае подсчет числа клеток, содержащих бета-галактозидазную активность, затруднен. Однако уровень трансфекции можно оценивать как высокий.

Таким образом, синтезированные ГК-производные использованных полимеров в комплексе с ЛФ и с целевыми ДНК могут быть применены для экспериментов по трансфекции на целом организме.

Обсуждение

В соответствие с поставленной целью в представленном исследовании сделана попытка создать новый класс векторных соединений для рецептор-опосредованного транспорта чужеродной пл ДНК в эукариотические клетки in vivo. В качестве векторного лиганда нами был выбран до сих пор не применяемый стероидный гормон - ГК. Как указывалось ранее ГК проникает в клетки-мишени как путем пассивной диффузии, так и путем рецепторного транспорта (Mayer et al., 1975; Gadson et al., ¡984). Кроме того, ГК способен проникать через ядерный барьер и взаимодействовать с геномной ДНК. Все эти свойства гормона казались нам привлекательными в плане его использования для внедрения молекул ДНК в эукариотические клетки.

Нам удалось синтезировать производные поликатионных носителей (ПЛ, ПЭИ и ПТ). Было показано, что эти производные содержат ковалентно связанные остатки гемисукцината ГК. Число остатков на молекулу носителя можно варьировать, изменяя соотношения исходных соединений. Естественно, что большинство производных с разным соотношением лиганд - носитель проанализировать мы были не в состоянии и поэтому ограничились только теми, которые на наш взгляд отвечали поставленным требованиям. Было установлено, что производные всех трех катионных полимеров эффективно взаимодействуют с пл ДНК. При этом по характеру взаимодействия исходные полимеры и их производные не различались. Интересная особенность модифицированных полимеров, по-видимому, не связанная с модификацией, заключается в различии их взаимодействия (по данным электрофоретической ретардации) с разными плазмидами при равных соотношениях полимер/ДНК. Эти результаты требуют дополнительных исследований для подбора необходимых соотношений

носитель/ДНК в каждом конкретном случае использования плазмид с целевыми генами. Сходные результаты были получены нами ранее (Синогеева и др., 2000). Было показано, что связывание ДНК с ЛФ зависит от определенных олигонуклеотидных звеньев, консенсусных для этого белка.

К сожалению, наночастицы на основе модифицированных ГК полимеров (ПЛ, ПЭИ и ПТ) в экспериментах на клеточных культурах и при парентеральном введении лабораторным животным обладали весьма низкими трансформирующими активностями. Экспрессия модельных генов во всех случаях могла быть выявлена только чувствительными иммунохимическими методами. Такие результаты, скорее всего, были связаны с крупными размерами получаемых комплексов. Действительно, флуоресцентный микроскопический анализ получаемых комплексов ГК полимеров с пл ДНК, а также данные по ретардации комплексов в агарозном геле показали, что формируемые наночастицы имеют слишком большие размеры. Поэтому были предприняты попытки уменьшить гидродинамические размеры комплексов путем введения в систему дополнительного компонента. Ранее в качестве ДНК-связывающего соединения был использован белок ЛФ, который способствует образованию комплексов, проникающих в поры агарозного геля. По данным ретардационного теста трехкомпонентные комплексы ДНК-конъюгаты ГК-ЛФ также мигрируют в агарозном геле, при этом их подвижность отличается от подвижности исходной ДНК и двойных комплексов ДНК-конъюгат и ДНК-ЛФ. Микроскопический анализ также указывает на формирование частиц меньшего размера по сравнению с частицами на основе ДНК и катионных полимеров. По данным светорассеяния размер эти частиц составляет 30 нм. Таким образом, наночастицы, содержащие ДНК, ПТ, модифицированный ГК, и ЛФ в определенных соотношениях (см. п. 11) характеризуются размерами, которые позволяют им проникать в клетки при помощи механизма рецепторного эндоцитоза и далее внедряться в ядерные структуры.

Получение наночастиц, подходящих по гидродинамическим размерам для прохождения через мембранные барьеры по рецепторному механизму, позволило приступить к изучению доставки целевых генов в составе плазмид при помощи комплексов, состоящих из плазмидной ДНК с маркерным геном, ГК производного ПТ и ЛФ. Как указывалось выше результаты трансфекции клеток в культуре и на уровне целого организма не всегда совпадают. Кроме того, разные клеточные культуры по разному трансфецируются различными комплексами ДНК. Поэтому мы не проверяли комплексы, содержащие ЛФ на уровне культур, а непосредственно испытали их in vivo. Как показано в п. 11 парентеральное введение таких комплексов (наночастиц) лабораторным животным - мышам сопровождалось экспрессией маркерного гена - гена бета-галактозидазьг в тканях печени и почек. Таким образом, было продемонстрировано, что трехкомпонентные комплексы (ДНК, ПТ-ГК, ЛФ), в отличие от двойных (ДНК и ПТ-ГК или ДНК и ЛФ), обладают существенно большей эффективностью трансфекции. В связи с этим такие наночастицы могут быть рекомендованы для дальнейших исследований по генной терапии конкретных видов патологии.

ВЫВОДЫ

1. Карбодиимидным способом синтезированы производные полилизина, полиэтиленимина и протамина, содержащие в качестве лигацда остатки гемисукцината гидрокортизона.

2. Установлено, что гидрокортизоновые производные растворимы в водной среде и по способности комплексироваться с плазмидной ДНК не отличаются от исходных катионных полимеров.

3. Оптимальные соотношения гидрокортизоновых производных й ДНК в составе комплексов зависят от строения плазмиды (нуклеотидный состав, размеры, конформация).

4. Комплексы на основании гидрокортизоновых производных и ДНК, представляют собой крупные агрегаты, которые характеризуются существенно большими размерами, чем необходимо для эффективной трансфекции.

5. НаночастиЦы, сформированные из плазмидной ДНК, гидрокортизоновых производных протамина и добавочного компонента - лактоферрина, характеризуются размерами (20 - 40 нм), наиболее приемлемыми для трансфекции.

6. Парентеральное введение мышам комплексов (наночастиц) на основе плазмидной ДНК с маркерным геном, гидрокортизонового производного протамина и лактоферрина сопровождается трансфекцией по крайней мере клеток печени и почек с экспрессией маркерного гена (бета-галактозидазы).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Савищенко Е.А., Илисавский С. С., Гинак А.И., Алейникова ТД., Шавловский М.М. Наночастицы на основе производных гидрокортизона в качестве векторов доставки генетического материала в эукариотические клетки ш у1уо.//Биотехнология (Москва), 2009,1,31-38.

2. Савищенко ЕЛ.(Замиралова), Шавловский М.М., Гинак А.И. Получение ковалентных белковых комплексов на основе фикола. Сборник тезисов докладов III научно-технической конференции аспирантов СПбГТИ (ТУ), Санкт-Петербург, Изд-во СПбГТИ (ТУ).-2000. С.108.

3. Савищенко Е.Л.(Замиралова), Шавловский М.М., Гинак А.И. Молекулярные коньюгаты. Сборник тезисов докладов 1П научно-технической конференции аспирантов СПбГТИ (ТУ), Санкт-Петербург, Изд-во СПбГТИ (ТУ). - 2000. С. 109.

4. Савищенко Е.А.(Замиралова), Жаринова Н.И. Лиганды мембранных рецепторов в качестве инструмента для трансфекции соматических клеток. Тезисы пятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, НИИ химии СПбГУ. - 2002. - С.88-89.

5. Савищенко Е.А. (Замиралова), Жаринова Н.И. Оптимизация способов доставки генетического материала в клетки млекопитающих. Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, СПбМАПО. - 2002. С. 199.

6. Савищенко Е.А., Илисавский С.С. Гидрокортизоновые производные катионных полимеров в качестве векторов для генной терапии. Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и. экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, СПбМАПО. - 2008. - С.31-33.

Подписано в печать «12» февраля 2010 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ № 32

Типография «Восстания - 1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савищенко, Елена Анатольевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Современные представления о возможности коррекции 13 патологических состояний путем введения в организм генетической информации - генная терапия

1.1 Вирусные способы доставки целевых генов

1.1.1 Векторы на основе ретровирусов

1.1.2 Аденовирусные векторы

1.1.3 Аденоассоциированные вирусы

1.1.4 Вирус простого герпеса

1.1.5 Практическое применение вирусных конструкций

1.2 Невирусные способы доставки генетического материала

1.2.1 Липосомы как векторы доставки ДНК

1.2.2 Рецепторно-опосредованный способ доставки 26 ДНК-конструкций

1.2.3 Принципы конструирования систем для трансфекции 33 плазмидными ДНК по механизму рецепторного эндоцитоза

1.3 Гидрокортизон в качестве лиганда - вектора для трансфекции 39 1.3.1 Рецепторы гидрокортизона

1.4 Наночастицы на основе поликатионов и специфических 43 лигандов

1.4.1 Химические методы синтеза конъюгатов на основе лигандов 43 специфических рецепторов и ДНК-связывающих соединений

1.4.2 Характеристика наночастиц, содержащих лоликатионы и 50 специфические лиганды

1.4.3 Физико-химические свойства наночастиц для трансфекции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидрокортизоновые производные в качестве векторов доставки генетических конструкций в животные клетки"

Актуальность исследования

Идея коррекции различных дефектов путем введения в клетки организма недостающей или исправляющей генетической информации была выдвинута в начале 1970 годов, но получила свое развитие значительно позже (Wolff and Lederberg, 1994; Горбунова и Баранов, 1997; Anderson, 1998). Основанный на этой идее способ лечения получил название «генная терапия». Однако, несмотря на впечатляющие успехи генной инженерии, достижения клеточного трансгеноза и успешное развитие представлений о молекулярных механизмах патогенеза многих заболеваний, методы доставки чужеродной генетической информации в клетки целого организма все еще крайне несовершенны. В настоящее время существует несколько подходов для исправления генетических дефектов организма, основанных на введении различных генетических конструкций. Наиболее эффективными по уровню трансфекции до сих пор остаются вирусные методы, суть которых заключается в создании абортированных несущих целевые гены вирусов, которые, не вызывая инфекции, обеспечивают внедрение этих генов в ядра клеток целого организма. К сожалению, целый ряд сопутствующих осложнений (Hacein-Bey-Abina et al., 2003; Baum et al., 2006; McElvaney and Crystal, 1995; Raper et al., 2003; Muruve, 2004) все в большей степени подтверждает мнение о необходимости изыскания более совершенных и безвредных способов для генной терапии. Одной из главных альтернатив вирусным способам доставки генетического материала является использование плазмид, содержащих в своей структуре экспрессируемые целевые гены. Плазм иды имеют целый ряд преимуществ перед вирусами и, кроме того, могут быть получены в виде очищенных препаратов ДНК. Основные трудности использования плазмид заключаются в необходимости их комплексирования с целым рядом дополнительных соединений, которые обеспечивают устойчивость, целевую доставку, способность проникать через клеточные мембраны и через ядерные барьеры. Несмотря на многочисленные попытки создания оптимальных конструкций, применение плазмидного материала все еще недостаточно эффективно, число трансфецированных клеток обычно не превышает 10%, что недостаточно для устранения большинства генетических дефектов и крайне низко для терапии злокачественных новообразований. В настоящее время испытаны разные плазмидные комплексы, но в целом проблема использования плазмидной ДНК (пл ДНК) остается нерешенной. Поэтому изыскание новых путей доставки в клетки генетического материала представляется весьма актуальным. В качестве основного пути предполагается использовать механизмы доставки генетического материала при помощи системы: специфический интернализующий клеточный мембранный рецептор -лиганд, комплексированный с целевой плазмидой. Исследованию ранее не изученной векторной пары и посвящена настоящая работа. В качестве лиганда нами использован стероидный гормон - гидрокортизон (ГК), который, по крайней мере, частично поступает в клетки путем связывания со специфическим мембранным рецептором и далее достигает внутриядерного пространства.

На июль 2007 года имелись сведения о 1340 законченных, продолжающихся и одобренных клинических испытаниях «генной терапии» в различных областях медицины (Edelstein et al., 2007). Следует сразу же оговориться, что большинство протоколов, основано на использовании вирусных конструкций, которые, как будет показано ниже, не лишены существенных недостатков. Однако, несмотря на достаточно большое число проектов, до сих пор крупных успехов в области генной терапии не достигнуто. В этом отношении наиболее существенные результаты могут быть получены в области терапии заболеваний крови, точнее клеток крови. Связано это в первую очередь с тем, что клетки крови или их предшественники могут быть легко изолированы и модифицированы вне организма. При этом сразу появляется возможность их клонирования и отбора клонов с необходимыми свойствами. Последующее введение таких клеток пациенту может устранить дефект. В частности, такой подход приемлем для исправления наследственных иммунодефицитов (Garcia et al., 2007). Единственным ограничением является возможность образования антител к продуктам генов, которые не функционируют у пациента. Плазмидные конструкции применять при лечении заболеваний крови выгоднее, так как вирусные пути доставки целевых генов могут приводить к активации протоонкогенов. Так, например, описаны осложнения при лечении ретровирусными конструкциями тяжелых комбинированных иммунодефицитов (Pike-Overzet et al., 2007). Отмечено несколько случаев возникновения острой Т-клеточной лимфобластной лейкемии. Несмотря на то, что в последнее время внимание исследователей все больше уделяется стволовым клеткам в качестве перспективных инструментов коррекции различных патологических состояний, в том числе и наследственных дефектов, интерес к классическим принципам генной терапии достаточно велик. Дело доходит до курьезов. Например, появились сообщения о создании генетического допинга (Gaffney and Parisotto, 2007).

Цель исследования

Цель исследования заключается в получении гидрокортизоновых производных на основе катионных полимеров, которые могли бы быть использованы в качестве векторов для генной терапии in vivo.

Задачи исследования

1. Разработать методики синтеза конъюгатов гидрокортизона (ГК) и катионных полимеров.

2. Получить в очищенном состоянии ГК производные полилизина (ПЛ), полиэтиленимина (ПЭИ) и белка протамина (ПТ).

3. Определить степень модификации полимеров лигандом.

4. Изучить способность конъюгатов взаимодействовать с плазмидными ДНК (пл ДНК).

6. Определить способность наиболее перспективных наночастиц осуществлять транспорт пл ДНК в клетки экспериментальных животных.

Научная новизна полученных результатов

Впервые синтезированы производные ПЛ, ПЭИ и ПТ, содержащие в качестве лиганда ГК, который способен путем рецепторного эндоцитоза проникать в эукариотические клетки и далее транспортироваться через мембранные барьеры в ядра. Охарактеризованы физико-химические свойства полученных конъюгатов. Показано их эффективное связывание с пл ДНК. Разработаны методики формирования комплексов векторный конъюгат -ДНК. Найдено, что оптимальные по размерам комплексы (наночастицы) могут быть получены при взаимодействии ДНК, конъюгатов и белка лактоферрина (ЛФ). Выявлена трансфецирующая активность наночастиц при введении в организм экспериментальных животных.

Практическая значимость результатов исследования

Практическая значимость работы заключается в обосновании проведения дополнительных исследований, направленных на разработку протоколов использования векторных конструкций (наночастиц) для генной коррекции патологических состояний. Полученные результаты могут быть использованы для образовательных целей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе катионных полимеров, как синтетических, так и природных, карбодиимидным методом могут быть получены конъюгаты с функциональным лигандом - гидрокортизоном (ГК).

2. Степень модификации полученных производных катионных полимеров легко оценивается спектрофотометрически

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих конференциях:

- III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ (ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г.;

- Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, Санкт-Петербургский государственный университет, 2002 г.;

- Научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования, 2002 г.;

Публикации

По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, включающих одну полнотекстовую статью в журнале «Биотехнология», а также четверо тезисов устных и стендовых докладов.

Внедрение результатов работы

Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процессы кафедры молекулярной биотехнологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)» (Россия, 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26); отдела молекулярной генетики ГУ Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул.Ак.Павлова, 12); кафедры медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).

Личный вклад автора в проведение исследования

Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статьи и подготовка докладов на конференциях. Синтез ГК-производных катионных полимеров, используемых в работе, анализ взаимодействия ГК-производных катионных полимеров с пл ДНК, определение относительного размера наночастиц по связыванию бромистого этидия, а также хроматографический анализ конъюгатов и трансфекция полученными векторами in vivo лабораторных животных, клеточных линий были выполнены соискателем. Гидродинамические размеры наночастиц определены по светорассеянию на лазерном корреляционном спектрометре JTKC-03 научным сотрудником Института гриппа РАМН П.А.Некрасовым.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из Введения, четырех глав, выводов и списка литературы, в котором приведены 197 источника, в том числе 7 работ на русском языке и 190 - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 18 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Савищенко, Елена Анатольевна

Выводы

1. Карбодиимидным способом синтезированы производные полилизина, полиэтимленимина и протамина, содержащие в качестве лиганда остатки гемисукцината гидрокортизона.

3. Оптимальные соотношения гидрокортизоновых производных и ДНК в составе комплексов зависят от строения плазмиды (нуклеотидный состав, размеры, конформация).

5. Наночастицы, сформированные из плазмидной ДНК, гидрокортизоновых производных протамина и добавочного компонента -лактоферрина, характеризуются размерами (20 - 40 нм), наиболее приемлемыми для трансфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савищенко, Елена Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Akinc A., Thomas М., Klibanov A.M., Laiiger R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.//.!.Gene Med., 2005, 7: 657-663

2. Allera A., Rao G.S. Characteristics and specificity of the glucocorticoid "carrier" of rat liver plasma membrane.//Advances in Experimental Medicine & Biology, 1986, 196: 53-65

3. Alton E.W., Middletton P.G., Caplen N.G. Noninvasive liposome-mediated gene delivery can correct the transport defect in cystic fibrosis mutant mice.//Nat. Genetic, 1993, 5: 135-142

4. Anderson R.G.W., Vasile R.J., Mello M.S. Immunocytochemical visualization of coated pits and vesicles in human fibroblasts: relation to low density lipoprotein receptor distribution.//Cell, 1978, 15:919-933

5. Anderson W.F. Humane gene therapy.//Nature, 1998, 392: 25-30

6. Baatz J.E., Bruno M.D., Ciraolo P.J., Glasser S.W., Stripp B.R., Smyth K.L., Korfhagen T.R. Utilization of modified surfactant-associated protein В for delivery of DNA lo airway cells in culture.//Ptoc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 25472551

7. Balra R.K., Wang-Johanning F., Wagner В., Carver R.I., Curiel D.T. Receptor-mediated gene delivery employing letctin-binding specificity .//Gene Ther., 1994, 1:255-260

8. Baum C., Kustikova O., Modlich U., Li Z., Fehse B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.//Hum. Gene Ther., 2006, 17: 253-263

9. Behr J.-P. Synthethic gene transfer vectors.//Pure & Appl. Chem., 1994, 66 (4): 827-835

10. Behr J.-P. The proton sponge, a means to enter cells viruses never thought of.//M/S-Med. Sci. 1996, 12: 546-558

11. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 7297-7301.

12. Brown M.S., Anderson R.G.W., Goldstein J.L. Recicling receptors: the round-trip itinerary of migrant membrane proteins.//Cell, 1983, 32: 663-667.

13. Brown V.I., Greene M.I. Molecular and cellular mechanisms of receptor-mediated endocytosis.//DNA and Cell Biology, 1991, 10 (6): 399-409

14. Buchner A.M., Wallace M.B. New frontiers in therapeutic EUS: dreams, style exercises or actual possibilities.//Minerva Med., 2007, 98 (4): 287-298

15. Caroline E.L., Robert S.C. Construction of Multiply Disabled Herpes Simplex Viral Vectors for Gene Delivery to the Nervous System. In «Viral Vectors for

16. Gene Therapy. Methods and protocols» Ed by Curtis A. Machida, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2003: 33 49

17. Carpenter G., Cohen S. Epidermal growth factor.//Annu. Rev. Biochem. 1979, 48: 193-216

18. Chen J., Gamou S., Takayanagi A., Shimizu N. A novel gene delivery system using EGF receptor-mediated endocytosis.//FEBS Lett., 1994, 338: 167-169 (a)

19. Chen J., Stickles R.J, Daichendent K.A. Galactosylated histone-mediated gene transfer and expression.// Hum. Gene Ther., 1994, 5: 429-435 (b)

20. Chen X., Davis P.B. Compacted DNA nanoparticles transfect cells by binding to cell surface nucleolin. Mol. Ther., 2006, 13:152

21. Cheng P.W. Receptor ligand-facilitated gene transfer; Enhancement of liposome-mediated gene transfer and expression by transfen"in.//Hum. Gene Ther., 1996, 7: 275-282

22. Cheng S.Y., Merlino G.T., Pastan I.H. A method for coupling of proteins to DNA: synthesis of alpha2-macroglobulin-DNA conjugates.//Nucleic Acids Res., 1983, 11:659-669

23. Chiou H.C., Tangco M.V., Lcvine St. M., Robertson D., Kormis K., Wu C.H., Wu G.Y. Enhanced resistance to nuclease degradation of nucleic acids complexed to asialoglycoprotein-polylysine carriers.//Nucleic Acids Res., 1994, 22: 54395446

24. Cockrell A.S., Kafri Т. Gene delivery by lentivirus vectors.//Mol. Biotechnol., 2007, 36(3): 184-204

25. Coll J.L., Wagner E., Combaret V., Mechtler K., Amstutz H., Iacono-Di-Cacito L, Simon N., Favrot M.C. In vitro targeting and specific transfection of human neuroblastoma cells by chCE7 antibody-mediated gene transfer .//Gene Ther., 1997, 4: 156-161

26. Conen M., Wagner F., Birnstiel M.L. Receptor-mediated transport of DNA into eukaryotic cells.//Methods Enzymol., 1993; 217:618-644

27. Cotlen M., Wagner E., Zalloukal K., Birnstiel M.L. Chicken adenovirus (CEIX) virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants.//J. Virol., 1993, 67: 3777-3785

28. Cristiano P., lovene M.R., Simioli F. Clinical evaluation of the imipenem/cilastatin combination in the therapy of severe infections in patients with malignant diseases.//Drugs Exp.Clin.Res., 1990, 16, (6): 293-297

29. Cristiano R.J., Roth J.A. Epidermal growth factor mediated DNA delivery into lung cancer cells via the epidermal growth factor receptor.//Cancer Gene Ther., 1996,3: 4-10

30. Cristiano R.J., Roth J.A. Molecular conjugates: a targeted gene delivery vector for molecular medicine.//J. Mol. Med., 1995, 73 (10): 479-486

31. Cristiano R.J., Smith L.C., Kay M.A., Brinkley B.R., Woo S.L.C. Hepatic gene therapy: Efficient gene delivery and expression in primary hepatocytes utilizing a conjugated adenovirus-DNA complex.Z/Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1993, 90: 1154811552 (a)

32. Cristiano R.J., Smith L.C., Woo S.L.C. Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primary hepatocytes.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1993, 90: 2122-2126 (b)

33. Curiel T.J., Cook D.R., Bogedain C., Jitg W., Harrison G.S., Cotten M., Curiel D.T., Wagner E. Foreign gene expression in Epstein-Barr virus transformed human В cells.//Virology, 1994, 198: 577-585

34. Damke H. Dynamin and receptor-mediated endocytosis.//FEBS Letters, 1996, 389: 48-51

35. Dautry-Varsat A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin.//Biochimie, 1986, 68:375-381

36. Davis P.B., Cooper M.J. Vectors for Airway Gene Delivery.//AAPS Journal., 2007, 9(1): El 1-E17

37. Deshmukh H.M., Huang L. Liposome and polylysine mediated gene transfer.//New J.Chem., 1997,21: 113-124

38. Ding Z.M., Crisiiano R.J., Roth J.A., Takacs В., Kuo M.T. Malarial circumsporozite protein in a novel gene delivery vehicle to primary hepatocyte cultures and cultured cells.//J.Biol.Chem., 1995, 270: 3667-3676

39. Douglas J.T. Adenoviral vectors for gene therapy.//Mol.Biotechnol., 2007, 36(1): 71-80

40. Drude I., Dombos V., Vauleon S., Muller S. Drugs made of RNA: development and application of engineered RNAs for gene therapy.//Mini Rev. Med. Chem., 2007, 7(9): 912-931

41. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery.//Nucleic Acids Research, 1997, 25(15): 3095-3101

42. Dworetzky S.I., Feldherr C.M. Translocation of RNA-coated gold particles through the nuclear pores of oocytes.//J.Cell Biol., 1988, 106: 575-584

43. Edelstein M.L., Abedi M.R., Wixon J.J. Gene therapy clinical trials worldwide to 2007-an update.//Gene Med., 2007, 9(10): 833-842

44. Erbacher P., Bousscr M.T. Raimond J. Monsigny M. Midoux P. Roche A.C.

45. Gene transfer by DNA/glycosylated polylysine complexes into human blood monocyte-derived macrophages.//Hum.Cene Ther., 1996, 7: 721-729

46. Erbacher P., Remy J.-S., Behr J.-P. Gene transfer with synthetic virus-like particles via the integrin-mediated endocytosis pathway .//Gene Ther., 1999, 6: 138-145

47. Erbacher P., Roche A.C., Monsigny M. Midoux P. Putative role of chloroquine in gene transfer into human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes.//Exp.Cell Res., 1996, 225: 186-194

48. Erlanger B.F., Borek F., Beiser S.M., Lieberman S. Steroid-protein conjugates. I. Preparatation and characterizsation of conjugates of bovine serum albumin with testosterone and with cortisone.//J.Biol.Chem., 1957, 228, (2): 713-727

49. Eto Y, Yoshioka Y., Mukai Y., Okada N., Nakagawa S. Development of PEGylated adenovirus vector with targeting ligand.//Int.J.Pharm., 2007, 354(1-2): 3-8

50. Fasbender A., Zabner J., Zeiher B.G., Welsh M.J. A low rate of cell proliferation and reduced DNA uptake limit cationic lipid-mediated gene transfer to primary cultures of ciliated human airway epithelia.//Gene Ther., 1997, 4: 11731180

51. Feldherr C.M., Akin D. Signal-mediated nuclear transport in proliferating and growth-arrested BALB/c 3T3 cells. J.Cell Biol., 1991, 115: 933-939

52. Ferkol Т., Kaetzel C.S., Davis P.B. Gene transfer into respiratory epithelial cells by targeting the polymeric immunoglobulin receptor.//J.Clin.Tnvest., 1993, 92: 2394-2400

53. Ferkol Т., Pellicena-Palle A., Eckman E., Perales J.C., Trzaska Т., Tosi M., Redline R., Davis P.B. Immunologic responses to gene transfer into mice via thepolymeric immunoglobulin receptor.//Gene Ther., 1996, 3: 669-678

54. Ferkol Т., Perales J.C., Eckman E., Kaetzel C.S., Hanson R.W., Davis P.B. Gene transfer into the airway epithelium of animals by targeting the polymeric immunoglobulin receptor.//J.Clin.lnvest., 1995; 95:493-502

55. Ferkol Т., Perales J.C., Mularo F., Hanson R.W. Receptor-mediated gene transfer into macrophages.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1996, 93: 101-105

56. Fischer U., Janssen K., Schulze-Osthoff K. Cutting-edge apoptosis-based therapeutics: a panacea for cancer?//BioDrugs, 2007, 21(5): 273-297

57. Foster B.J., Kern J.A. HER2-targeted gene transfer.//Hum.Gene Ther., 1997, 8: 719-727

58. Fraley R., Subramani S., Berg P. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells.//J.Biol.Chem., 1980, 255: 10431-10435

59. Gadson P.F., Russell J.D., Russell S.B. Glucocorticoid receptors in human fibroblasts derived from normal dermis and keloid tissue.//J.Biol.Chem., 1984, 259(18): 11236-11241

60. Gaffney G.R., Parisotto R. Gene doping: a review of performance-enhancing genetics.//Pediatr.Clin.North.Am., 2007, 54(4): 807-822

61. Gao X., Huang L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells.//Biochem.Biophys.Res.Commun., 1991, 179: 280-285

62. Garcia J.M., Espanol Т., Gurbindo M.D., Casas C.C. Update on the treatment of primary immunodeficiencies.//Allergol.Immunopathol. (Madr), 2007, 35(5): 184-192

63. Geuze H.J., Slot J.W., Strous G.J.A.M. Intracellular site of asialoglycoprotein receptor-ligand uncoupIing.//Cell, 1983, 32: 277-287

64. Ginobbi P., Geiser T.A., Ombres D., Citro G. Folic acid-polylysine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotides on human melanoma (Ml4) cells.//Anticancer Res., 1997, 17: 29-36

65. Goldman M.J., Lee P.S., Yang J.S., Wilson J.M. Lentiviral vectors for gene therapy of cystic fibrosis.//Hum.Gene Ther., 1997, 8: 2261-2268

66. Goldstein J.L., Anderson R.G., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis and the cellular uptake of low density lipoprotein.//Ciba Foundation Symposium., 1982, (92): 77-95

67. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson R.G.W. Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system.//Ann.Rev.Cell Biol., 1985, 1: 31-39

68. Gorski J., Gannon F. Current models of steroid hormone action: a critique.//Annual Review of Physiology, 1976, 38: 425-450

69. Gottschalk S., Cristiano R.J., Smith L., Woo S.L.C. Folate-mediated gene delivery and expression in vitro.//Gene Ther., 1994, 1: 185-191

70. Gottschatk S., Sparrow J.Т., Hauer J. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells.//Gene Ther., 1996, 3, (5): 48-51

71. Hacein-Bey-Abina S., Von Kalle C., Schmidt M. LM02-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.//Science, 2003, 302:415-419

72. Haensler J., Szoka F.C. Synthesis and characterization of a trigalactosylated bisacridine compound to target DNA to hepatocytes.//Bioconjugate Chem., 1993, 4: 85-93

73. Нага Т., Aramaki Y., Takada Sh. Receptor-mediated transfer of pSV2CAT DNA to a human hepatoblastoma cell line HepG2 using asialofetuin-labeled cationic liposomes.//Gene,.1995, 159: 167-174

74. Hart S.L., Harbottle R.P., Cooper R., Miller A., Williamson R., Coutelle C. Gene delivery and expression mediated by an integrin-binding peptide.//Gene Ther 1995,2: 552-554.

75. Heldin C.-H., Wasteson A., Westermark B. Interaction of platelet-derived growth factor with its fibroblast receptor.//J.Biol.Chem., 1982, 257: 4216-4221

76. Hopkins C.R. The appearance and internalization of transferrin receptors at the margins of spreading tumor cells.//Cell, 1985, 40: 199-208

77. Hopkins C.R., Trowbridge I.S. Internalisation and processing of transferrin and the transferrin receptor in human carcinoma A431 cells.//J.Cell Biol., 1983, 97: 508-521

78. Huckett В., Ariatti M., Hawtrey A.O. Evidence for targeted gene transfer by receptor-mediated endocytosis. Stable expression following insulin-directed entry ofNEO into HepG2 cells.//Biochem.Pharmacol., 1990, 15, 40(2): 253-263

79. Huckett В., Ariatti M., Hawtrey A.O. Increased affinity of insulin for its receptor following conjugation to a second protein.//Med.Hypotheses, 1991, 36 (2): 135-139

80. Hyde S., Gill D., Higgins C.F. Correction of the ion transport defect in cystic fibrosis mice by gene therapy.//Nature, 1993, 362: 250-255

81. Ibarrola Г., Alejandro A., Marino A., Sancho M.J., Macarulla J.M. Trueba M. Characterization by photoaffinity labeling of a steroid binding protein in rat liver plasma membrane.//J.Membrane Biology, 1992, 125(2): 185-191

82. Ibarrola I., Andres M., Marino A., Macarulla J.M., Trueba M. Purification of a Cortisol binding protein from hepatic plasma membrane.//Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1284(1): 41-46

83. Isaka Y, Imai E. Electroporation-mediated gene therapy.//Expert.Opin.Drug Deli v., 2007, 4(5): 561-571

84. Izumrudov V. A., Zhiiyakova, M. V., Goulko A. A.//Langmuir; 2002, 18(26): 10348-10356

85. Jager L., Ehrhardt A. Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.//Curr.Gene Ther., 2007, 7(4): 272-283

86. Jiang С., O'Connor S.P., Fang S.L. et ai. Efficiency of cationic lipid-mediated transfection of polarized and differentiated airway epithelial cells in vitro and in vivo .//Hum. Gene Ther., 1998, 9: 1531 -1542

87. Kabanov V.A., Kabanov A.V. Supramolecular devices for tergeting DNA into cells: fundamentals and perspectives.//Macromol. Symp., 1995, 98: 601-613

88. Kichler A., Zaimer W., Morrison C., Wagner E. Ligand-polylisine mediated gene transfer. In Feigner P.L. (eds). Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery.//American Chemical Society: Washington, DC, 1996: 120-128

89. Kircheis R., Kichler A., Wallner G., Kursa M., Ogris M., Felzmann Т., Buchberger M., Wagner E. Coupling of cell-binding ligand to polyethylenimine for targeted gene delivery.//Gene Ther., 1997, 4: 409-418

90. Kollen W.J., Midoux P., Erbacher P., Yip A., Roche A.C., Monsigny M., Glick M.C., Scanlin T.F. Gluconoylated and glycosylated polylysines as vectors for gene transfer into cystic fibrosis airway epithelial cells.//Hum.Gene Ther., 1996, 7(13): 1577-1586

91. Kren B.T., Bandyopadhyay P., Steer C. In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX gene by chimeric RNA/DNA oligonucleotides./ZNature Med., 1998, 4: 285-290

92. Laemmli V.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4.//Nature, 1970, 227: 680-685

93. Lai Y., Drobinskaya I., Kolossov E., Chen C., Linn T.Genetic modification of cells for transplantation.//Adv.Drug Deli v.Rev., 2008, 60(2): 146-159

94. Ledley F.D. Non-viral gene therapy.//Curr.Opin.Biotechnol., 1994, 5: 626636

95. Legendre J.-Y., Szoka F.C.J. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells.//Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 1993, 90: 893-897

96. Li S., Huang L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.//Gene Therapy, 1997, 4: 891-900

97. Liu G., Li D., Pasumarthy M.K. Nanoparticles of compacted DNA transfect post-mitotic cells.//J.Biol.Chem., 2003, 278: 32578-32586

98. Lukacs G.L., Haggie P., Seksek O., Lechardeur D., Freedman N., Verkman A.S. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus.//J.Biol.Chem., 2000, 275: 1625-1629

99. Lutz W., Salisbury Jeffrey L., Kumar R. Vasopressin receptor-mediated endocytosis: current view.//Am.Physiol.Soc., 1991: F3-F13

100. Ly H., Kawase Y., Yoneyama R., Hajjar R.J. Gene therapy in the treatment of heart failure.//Physiology (Bethesda), 2007, 22: 81-96

101. Mayer M., Kaiser N., Milholland R.J., Rosen F. Cortisol binding in rat skeletal muscle.//J.Biol.Chem., 1975,250(4): 1207-1211

102. McElvaney N.G., Crystal R.G. IL-6 release and airway administration of human CFTR cDNA adenovirus vector.//Nat.Med., 1995, 1: 182-184

103. Merwin J.R., Carmichael E.P., Noell G.S., DeRome M.E., Thomas W.L., Robert N., Spitalny G., Chiou H.C. CD5-mediated specific delivery of DNA to T lymphocytes: coin-partmentalization augmented by adenovirus.//J.Immunol. Methods, 1995, 186: 257-266

104. Midoux P., Mendes C., Legrand A., Raimond J., Mayer R., Monsigny M., Roche A.C. Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells.//Nucleic Acids Res., 1993, 21 (4): 871-878

105. Mislick K.A., Baldeschwieler J.D., Kayyem J.F., Meade T.J. Transfection of folate-polylysine DNA complexes: evidence for lysosomal delivery.//Bioconjugate Chem., 1995, 6(5): 512-515

106. Mortimer J., Tam P., MacLachlan I., Graham R.W., Saravolac E.G., Joshi P.B. Cationic lipid-mediated transfection of cells in culture requires mitotic activity. Gene Ther., 1999, 6: 403-411

107. Muruve D.A. The innate immune response to adenovirus vectors .//Hum. Gene Ther., 2004, 15: 1157-1166

108. Neschadim A., McCart J.A., Keating A., Medin J.A. A roadmap to safe, efficient, and stable lentivirus-mediated gene therapy with hematopoietic cell transplantation.//Biol.Blood Marrow Transplant., 2007, 12: 1407-1416

109. Okada T, Ozawa K. Vector-producing tumor-tracking multipotent mesenchymal stromal cells for suicide cancer gene therapy.//Front Biosci. 2008, 13: 1887-1891

110. Park K., Kim W.J., Cho Y.H., Lee Y.I., Lee H., Jeong S., Cho E.S., Chang S.I., Moon S.K., Kang B.S., Kim Y.J., Cho S.H. Cancer gene therapy using adeno-associated virus vectors.//Front.Biosci., 2008, 13: 2653-2659

111. Paul R.W., Weisser K.E., Loomis A., Sloane D.L., LaFoe D., Atkinson M.B., Overall R.W. Gene transfer using a novel fusion protein, GAL4/lnvasin.//Hum.Gene Ther. 1997, 8(10): 1253-1262.

112. Pearse B.M.F. Receptors compete for adaptors found in plasma membrane coated pits.//EMBO J., 1988, 7: 3331-3336

113. Pendaries C., Watson S.P., Spalton J.C. Methods for genetic modification of megakaryocytes and platelets.//Platelets, 2007, 18(6): 393-408

114. Perales J.C., Ferkol T, Beegen H., Ratnoff O.D., Hanson R.W. Gene transfer in vivo: sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake.//Proc.Nat.Acad. Sci .USA, 1994, 91:4086-4090 (a)

115. Perales J.C., Ferkol Т., Molas M., Hanson R.W. An evaluation of receptor-mediated gene transfer using synthetic DNA-ligand complexes.//Eur.J.Biochem., 1994, 226: 255-266 (b)

116. Perales J.C., Gmssmann G.A., Molas M., Biochemical and functional charactericalion of DNA complexes capable of targeting genes to hepatocytes via the asialoglycoprotein receptor.//J.Biol.Chem., 1997, 272(11): 7398-7407

117. Philpott N.J., Thrasher A.J. Use of nonintegrating lentiviral vectors for gene therapy.//Hum.Gene Ther., 2007, 18(6): 483-489

118. Pike-Overzet K., van der Burg M., Wagemaker G., van Dongen J.J., Staal F.J. New insights and unresolved issues regarding insertional mutagenesis in X-1 inked SCID gene therapy.//Mol. Ther., 2007, 15(11): 1910-1916

119. Plank C., Mechtler K., Szoka Jr.F.C. Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: a potentional barrier for intravenous gene delivery.//Hum.Gene Ther, 1996,7: 1437-1446

120. Poncet P, Panczak A., Goupy C, Gustafsson K, Blanpied C, Chavancl G, Hirsch R, Hirsch F. Antifection: an antibody-mediated method to introduce genes into lymphoid cells in vitro and in vivo.//Gene Ther, 1996, 3: 731-738

121. Ponder K.P, Haskins M.E. Gene therapy for mucopolysaccharidosis. //Expert.Opin.Biol.Ther, 2007, 7(9): 1333-1345

122. Qasim W, Gaspar H.B. Update on clinical gene therapy in childhood. //Thrasher AJ.Arch.Dis.Child, 2007, 92(11): 1028-1031

123. Rao M.L., Rao G.S., Eckel J., Breuer H. Factors involved in the uptake of corticosterone by rat liver cells.//Biochimica et Biophysica Acta, 1977, 500(2): 322-332

124. Raper S.E., Chirmule N., Lee F.S. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer.//Mol.Genet.Metab., 2003, 80: 148-158

125. Rex T.S. Rescue of sight by gene therapy closer than it may appear.//Ophthalmic.Genet., 2007, 28(3): 127-133

126. Rojanasakul Y., Wang L.Y., Malanga C.J., Ma J.K., Lutw J. Targeted gene delivery to alveolar macrophages via Fc receptor-mediated endocytosis. //Pharm. Res., 1994: 11(12): 1731-1736.

127. Rose J.K., Buanocore L, Whitt M.A. A new cationic liposome reagent mediating nearly qualitative transfection of anumal cells.//Biotechniques, 1991, 10: 520-525

128. Rosenkranz A.A., Yachmenev S.V. Receptor-mediated endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA construct. //Exp.Cell Res., 1992, 199: 323329

129. Ross G.F., Morris R.F., Ciraolo G., Huelsman K., Bruno M., Whitsett J.A., Baatz J.E., Korfhagen T.R. Surfactant protein A-polylysine conjugates for delivery of DNA to airway cells in culture.//Hum.Gene Ther., 1995, 6: 31-40

130. Roth T.F., Porter K.R. Yolk protein uptake in the oocyte of the mosquito Aedes Aegypti. L.// J.cell Biol. 1964, 20: 313-332

131. Sakurai F., Kawabata K., Mizuguchi H. Adenovirus vectors composed of subgroup В adenoviruses.//Curr.Gene Ther., 2007, 7(4): 229-38

132. Sanders S.L., Schekman R. Polypeptide translocation across the endoplasmic reticulum membrane.//J.Biol.Chem., 1992, 267: 13791-13794

133. Sbraccia P., Wong K.-Y., Brunetti A. Insulin down-regulates insulin receptor number and up-regulates insulin receptor affinity in cells expressing a tyrosine-defective insulin receptor.//J.Biol.Chem., 1990, 265: 4902-4907

134. Schachtschabel U., Pavlinkova G., Lou D., Kohler H. Anti-body-mediated gene delivery for B-cell lymphoma in vitro.//Cancer Gene Ther., 1996, 3: 365-372

135. Schneider H., Huse K., Birkenmeier G., Otto A., Scholz G.H. Gene transfer mediated by alpha2-macroglobulin.//Nucleic Acids Res., 1996, 24: 3873-3874

136. Schwarzenberger P., Spence S.E., Goova I.M., Miehiel D., Curiel D.T., Ruscetti F.W., Keller J.R. Targeted gene transfer to human hematopoietic progenitor cell lines through the c-kit receptor.//Blood, 1996, 87: 472-478

137. Seiler M.P., Cerullo V., Lee B. Immune response to helper dependent adenoviral mediated liver gene therapy: hallenges and prospects.//Curr.Gene Ther., 2007, 7(5): 297-305

138. Shepherd V.L. Intracellular pathways and mechanisms of sorting in receptor-mediated cndocytosis.//TIPS, 1989, 10: 458-462

139. Smythe E., Warren G. The mechanism of receptor-mediated endocytosis.//Eur.J.Biochem., 1991, 202: 689-699

140. Sosnowski B.A., Gonzalez A.M., Chandler L.A., Buechler Y.J., Pierce G.F., Baird A. Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor (FGF2).//J.Biol.Chem., 1996, 271: 33647-33653

141. Strel'chyonok O.A., Avvakumov G.V. Interaction of human CBG with cell membranes.//J.Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 1991, 40(4-6): 795-803

142. Suda Т., Liu D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.//Mol.Ther, 2007, 15(12): 2063-2069

143. Tai C.K., Kasahara N. Replication-competent retrovirus vectors for cancer gene herapy.//Front.Biosci., 2008, 13: 3083-3095

144. Tarn P., Monck M., Lee D., Ludkovski O., Leng E.C., Clow K., Stark H., Scherrer P., Graham R.W., Cullis P.R. Stabilized plasmid-lipid particles for systemic gene therapy .//Gene Ther., 2000, 7 (21): 1867-1874

145. Tanaka Т., Kuroki M., Hamada H., Kato K., Kinugasa Т., Shibaguchi H., Zhao J., Kuroki M. Cancer-targeting gene therapy using tropism-modified adenovirus.//Anticancer Res., 2007, 27(6A): 3679-3684

146. Taxman D.J., Lee E.S., Wojchowski D.M. Receptor-targeted transfection using stable maleimido-transferrin/thio-poly-L-lysine conjugates.//Anal.Biochem., 1993,213: 97-103

147. Thurner M., Wagner E., Clausen H., Mechtler K., Rusconi S., Dinter A., Birnstiel M.L., Berger E.G., Cotten M. Carbohydrate receptor-mediated gene transfer to human T leukaemic cells.//Glycobiology, 1994, 4: 429-435

148. Trueba M., Ibarrola I., Vallejo A.I., Sancho M.J., Marino A., Macarulla J.M. Characterization of specific binding sites for corticosterone in mouse liver plasma membraneJ/Membrane Biochemistry, 1989, 8(4): 229-239(a)

149. Trueba M., Vallejo A.I., Rodriguez I., Ibarrola I., Sancho M.J., Marino A., Macarulla J.M. Evidence for the presence of specific binding sites for corticoids in mouse liver plasma membranes.//J.Membrane Biology, 1989, 108(2): 115-124 (b)

150. Tseng W.C., Haselton F.R., Giorgio T.D. Mitosis enhances transgene expression of plasmid delivered by cationic liposomes.//Biochim.Biophys.Acta, 1999, 1445: 53-64

151. Wadhwa M.S., Knoell D.L., Young A.P., Rice K.G. Targeted gene delivery with a low molecular weight glycopeptide carrier.//Bioconjugate Chem., 1995, 6: 283-291

152. Wagner E., Cotton M., Foisner R, Birnstiel M.L. Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery lo celIs.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1991, 88: 4255-4259 (b)

153. Wagner E., Zatloucal K., Cotton M. Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes. //Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1992., 89: 6099-6103 (b)

154. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H., Birnstiel M.L. Transferrin-polycation conjugate as carriers for DNA uptake into cells.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1990, 87: 3410-3414

155. Warren G.B., Woodman P., Pypaert M., Smythe E. Cell-free assays and the mechanism of receptor-mediated endocytosis.//TIBS, 1988, 13: 462-465

156. Wattiaux R., Laurent N., Wattiaux-De Coninck S., Jadot M. Endosomes, lysosomes: their implication in gene transfer.//Adv.Drug Deliv.Rev., 2000, 41: 201-208

157. White K., Nicklin S.A., Baker A.H. Novel vectors for in vivo gene delivery to vascular tissue.//Expert.Opin.Biol.Ther., 2007, 7(6): 809-821

158. Wileman Т., Harding С., Stahl P. Receptor-mediated endocytosis.//Biochem. J., 1985,232: 1-14

159. Wilke M., Fortunati E., van den Broek M., Hoogeveen A.T., Scholte B.J. Efficacy of a peptide-based gene delivery system depends on mitotic activity .//Gene Ther. 1996,3: 1133-1142

160. Wolff J.A., Lederberg J. An early history of gene iransfer and therapy.//Hum.Gene Ther., 1994, 5: 469-480

161. Wu C.H , Wilson J M , Wu G Y. Targeting genes: delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo.//J.Biol.Chem., 1989, 264: 16985-16987

162. Wu G.Y., Wilson J.M., Shalaby F., Grossman M., Shafritz D.A., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery in vivo. Partial correction of genetic analbuminemia in Nagase rats.//J.Biol.Chem., 1991, 266: 14338-14342

163. Wu G.Y., Wu C.H. Evidence for targeted gene delivery to HepG2 hepatoma cells in vitro.//Biochemistry, 1988, 27: 887-892 (a)

164. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo.//J.Biol.Chem., 1988, 263: 14621-14624 (b)

165. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system.//J.Biol.Chem., 1987, 262: 4429-4432

166. Xu В., Wiehle S., Roth J.A., Cristiano R.J. The contribution of poly-L-lysine, epidermal growth factor and streptavidin to EGF/PLL/DNA polyplex fornation.//Gene Ther., 1998,5: 1235-1243

167. Yin W., Cheng P.W. Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells.//Biochem.Biophys.Res.Commun., 1994, 205: 826-833

168. Zabner J, Fasbender A.J, Moninger T, Poellinger D.A, Welsh M.J. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid.//J.Biol.Chem, 1995,270: 18997-19007

169. Zaia J.A. The status of gene vectors for the treatment of diabetes.//Cell Вiochem.Biophys. 2007, 48 (2-3): 183-190

170. Zaitsev S.V, Haberland A, Otto A, et al. HI and HMG17 extracted from calf thymus nuclei are efficient DNA carriers in gene transfer.//Gene Ther, 1997,.4: 586-592

171. Zanta M.A, Boussif O, Adib A, Behr J.P. In vivo gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine.//Bioconjugate Chem, 1997, 8: 839-844

172. Zauner W, Ogris M, Wagner E. Polylysine-based transfection systems utilizing receptor-mediated delivery.//Adv.Drug Deliv.Rev, 1998, 30:,97-114

173. Zenke M, Stcinlcin P, Wagner E, Gotten M, Beug H, Birnstiel M.L. Receptor-mediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates: an efficient way to introduce DNA into hematopoietic cells.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1990, 87: 3655-3659

174. Горбунова В.Н, Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: «Специальная литература», 1997:287

175. Зеленин А.В., Тарасенко О.В., Колесников В.М. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции./ЛПенетика, 1998, 34 (6): 730-736

176. Маниатис Т., Фрих Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование.- М.: Мир, 1984

177. Платэ Н.А., Васильев А.Е., Физиологически активные полимеры. М: Химия, 1986: 296

Информация о работе

Савищенко, Елена Анатольевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Гидрокортизоновые производные в качестве векторов доставки генетических конструкций в животные клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы