Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гибридизация ДНК с олигонуклеотидами, иммобилизованными в геле

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гибридизация ДНК с олигонуклеотидами, иммобилизованными в геле"

Академия наук СССР Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

УДК 577.323 На правах рукописи

Храпко Константин Радйевич

Гибридизация ДНК с олигонуклеотидами, иммобилизованными в геле

03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель академик А. Д. Мирзабеков

Москва 1991

///

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Академии наук СССР, зав. лаб. академик А. Д. Мирзабеков.

Научный руководитель: - академик А. Д. Мирзабеков.

Официальные оппоненты: - к.б.н. А. С.Краев

академик Д. Г.Кнорре.

Ведущая организация: Межфакультетская ПНИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии имени А. Н. Белозерского Московского Государственного Университет им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится Лм^^Л^ ¡991 г в 1-С цдсоа на заседашш

Специализированного совета Д 092.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и.и. В.А.Энгельгардта АН СССР

Автореферат разослан "Ж" 1991

Ученый секретарь ^ педализированного совета, кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Анализ нуклеотидной последовательности ДН К •>■ бенно распознавание одиночных замен оснований при помощи гибридизации с ол>. гонуклеотидами - распространенная процедура в молекулярной биологии. Обшепри нятой является методика, согласно которой тестируемый фрагмент ДНК закрепляют на мембране и гибридизуют с меченными олигонуклеотидами. Однако, существует ряд задач, например, типирование генов гистосовместимости, диагностика наследственных болезней и маркеров роста опухолей, картирование генома, секиениронание ДНК и т. д., которые могут быть решены путем гибридизации тестируемой ДНК с большим числом олигонуклеотндных проб из некоторого стандартного набора. В таком случае было бы предпочтительным использование "обращенной процедуры, при которой меченную тестируемую ДНК гибридизуют одновременно со всем набором олигонуклеотидов, например, иммобилизованных на одной пластинке.

Для того, чтобы использование "обращенной" процедуры гибридизации стало практически возможным, необходимо решить несколько проблем. Во-первых, необходимо разработать метод иммобилизации олигонуклеотидов, который позволял бы располагать большое число проб на небольшой площади, обеспечивал бы удобство проведения гибридизации и обработки результатов .экспериментов. Во-вторых, необходимо найти условия, в которых каждый из полностью комплементарных дуплексов, образованных иммобилизованными олигонуклеотидами, намного устойчивее, чем дуплексы хотя бы с одной некомплементарной парой оснований. В-третьих, из-за того, что устойчивость дуплексов сильно зависят от ОС-состава, то полностью комплементарный АТ-богатый дуплекс может оказаться менее устойчивым, чем дефектный ОС-богатый, что с очевидностью приводит к проблемам гибридизации с олигонуклеотидами разного ОС-состава , иммобшшзорвлнными "па одной пластинке".

Цель работы. Для решения указанной задачи - разработки метода "обращенной" гибридизации ДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами - в настоящей работе предложена методика иммобилизации олигонуклеотидов и проведены мож-дельные эксперименты по гибридизации с иммобилизованными олигонуклеотидами. показавшие принципиальную возможность решения отмеченных проблем. Кроме того, разработан подход, позволяющий проводить гибридизации в микромасштабе, на "гибридизационпых чипах".

Научная новизна и практическое значение работы. В настоящее время в мире работает ряд научных 1рупп, активно исследующих возможность использованя гибридизации с иммобилизованными олигонуклеотидами для исследования последовательности ДНК. Данная работа проводится независимо и содержит ряд оригинальных идей и подходов. Предполагается, что результаты работы могут быть использованы

в диагностике наследственных заболеваний, для тилирования, картирования и фин-■ ерпрннтирования а также, возможно, и для сиквенироваиия ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались «а Молодежном конкурсе ИМБ АН СССР в 1989 г., на конкурсе научных работ ИМБ АН СССР о 1990 г., а также на нескольких научных конференциях.

Публикации- По теме диссертации опубликовано 3 статьи, доклад и тезисы двух стендовых сообщений.

Объем работы. Работа содержит 90 страниц машинописного текста, I таблицу, Ю рисунков. Библиография включает 85 названий.

Основные результаты работы

*

Полученные результаты обсуждак>тся в пяти разделах:

1. Иммобилизация олигонуклеотидов.

2. Гибридизация с иммобилизованными олигонуклеотидами и дискриминация дуплексов с мисматчами.

3. Физико-химия процесса отмывши пригибридизованной ДНК.

4. Дискриминация мисматчей в дуплексах разного GC-состава, иммобилизованных на одной пластинке.

5. Флуоресцентная гибридизация и миниатюризация олигонуклеотидноп матрицы.

1. Иммобилизация олигонуклеотидов.

Выбор носителя и отработка собственно методики иммобилизации оказалась решающим этапом в данной работе и в большой степени определила все ее дальнейшее развитие.

После серии экспериментов в качестве носителя был выбран сверхтонкий слой (около 10 мкм) полиакриламидного геля, закрепленный ня поверхности стекла и подвергнутый частичному гидразииолиау (идея принадлежит С.К.Василенко). Сверхтонкие гели заливаются аналогично обыкновенным плоским волиакриламнд-ным гелям и закрепляются на стекле, обработанном Bind Silane (у-метакрилоксип-ропилтриметоксисиланом). Полиакриламидный гель как твердый носитель обладает уникальным сочетанием свойств, которое делает его исключительно подходящим для решения задач, поставленных в данной работе. Он обладает весьма высокой емкостью, но низкой неспецифической сорбцией ДИК, прозрачен в видимом свете, его собственная флуоресценция чрезвычайно низка и, наконец, тонкий слой геля, закрепленный на поверхности утекла, достаточно прочен физически, причем оказалось

возможным разработать технологию, позволяющую изготавливать "микромагрнцы г.е. разделять сплошной слой геля на квадратные ячейки размером 100x100 мкм^ в каждой из которых возможно иммобилизовать индивидуальный олигонуклеотид.

Химия иммобилизации представлена на рис. 1. Иммобилизуемый олигонуклеотид (1) должен нести на З'-кснце рнбонуклеозид, который активируется путем окисления периодатом натрия до диальдегида (2). В качестве З'-концевого рибонук-леознда использовался З-метилуридин, который пс может участвовать в спаривании оснований и, таким образом, выполнет только роль линкера. С другой стороны, при обработке полиаг.рнлэмидного геля пиразином ампдные группы (3) частично заменяются па гидразидные (4), которые взаимодействуют с диальдегидами с образовании относ1ггельно стабильных производных морфолина (5).

Процесс иммобилизации контролировался по [32Р] -радиоактивной метке, введенной в 5'-положение олигоиуклеотида полинуклеотидкиназой. Путем электрофореза в полнакриламндном геле было показано, что окисление периодатом натрия проходило количественно н специфично (продукт окисления имеет несколько меньшую электрофоретическуго подвижность, Ч£м исходный олигонуклеотид). Эффек-

- Л

о-РЮ у

НО ОН

СНз

мн, / 2

т

I

К'аЮ.

ын -мн _2_2_

Р Л . / гГ^-ен, О-РО Ь

"К7

НОС сно

V

_I

мн-мн

о

о-р=о Ч >

I , ИХ'

Л Л

но Гч| 01 Л ын

V

I ,

■Ы-Сч

Рис. I. Схема химических реакций при иммобилизации олигоиуклеотида в ПААГ

3

4

гивность иммобилизации (т.е. доля иммобилизованного олигоиуклеотида по отпо-лснню к общему его количеству, введенному в реакцию) составляла, как правило, 1коло 80%, специфичность иммобилизации (т.е. доля олигоиуклеотида, иммобили-юванного за З'-конец, по отнеошению к общему количеству иммобилизоплииого

«лигонуклеотида) - не менее 98%. Емкость полиакриламидного геля толщиной 10

■к м, подверженного обработке 50% гидразингндратом при комнатной температуре

2

• течение 1 ч, составляет около 1 нмоль на мм .

Как правило, олигонуклеотиды иммобилизовали в пятнах, расположенных в узлах квадратной матрицы, поэтому в дальнейшем пластинки с иммобилизованными на них олигонуклеотидами будут называться "матрицами олигонуклеотидов".

I. Гибридизация с иммобилизованными олигонуклеотидами и дискриминация дуплексов с мисматчами

Основной задачей данной работы было выяснение степени специфичности гибридизации, которая может быть достигнута в используемой системе иммобилизации гибридизации. Для ее решения была проведена гибридизация гибридизация четырех гептадекануклеотидов - сиквенсового праймера фага М13:

5'-<НОТААААССАСССССАСТ) и трех его производных, отличающихся от исходного олигонуклеотида одним основанием (подчеркнуто):

5'-<)(ОТААААСОА1СС|ССАОТ) 5'-(1 ШТАЛААСОАДСОССАОТ) 5'-<1(СТАА.ААССАС£СССАСТ) иммобилизованными в геле олигонуклеотидами (длиной 7, 8,9, 12 и 15 мономерных шеньев), полностью или частично комплементарными различным участкам гептаде- ■ камеров.

Гибридзцию проводили при 0"С в каплях, полностью покрывающих индивидуальные точки иммобилизованных олигонуклеотидов, причем радиоактивно меченный гептадекамер находился более чем в 100-кратном недостатке по отношению к иммобилизованному олигонуклеотиду. Благодаря малому объему гибридизационнон смеси и большому количеству иммобилизованного олигонуклеотида почти полная гибридизация проходила менее чем за 15 мин. Низкая температура гибридизации необходима для того, чтобы могли образоваться все дуплексы, включая наименее стабильные (дефектные). ,

После гибридизации матрицу отмывали буфером (серия из 10 отмывок по 1 мин, причем каждую последующую отмывку проводили при температуре на 5'С выше предыдущей). После каждой отмывки измеряли остаточную радиоактивность в каждой точке гибридизации и отношение остаточной радиоактивности к исходной о данной точке откладывали на графике в логарифмическом масштабе в зависимости

от температуры. Соответствующую сглаженную кривую мы будем называть в даль нейшем "кривей отмывки" дуплекса (примеры кривых приведены на рис. 2).

В качестве меры стабильности дуплексов мы выбрали температуру отмывки (7V). которую определили как температуру, при которой гнбрндизационный сигнал в соответствующей точке уменьшается в !0 раз по отношению к исходному уровню. Тч: является удобной характеристикой стабильности дуплекса, но необходимо иметь в виду, что это - относительная величина, применимая только к условиям, использовавшимся в конкретном эксперименте.

Па рис. 2 пргдетаплепы кривые отмывки дуплексов, образованных праймером М13 или его аналогами с GC- (рис. 2,а) и ЛТ-богатыми (рис. 2,6) иммобилизованными октануклеотидами, комплементарными двум различным участкам праймера М13, но образующими дефектные дуплексы с его производными О'.се дуплексы представлены на рис. 2). Кроме гибридизаций с иммобилизованными октануклеотн-дами, показанными на рис. 2, были проведены гибридизации со значительным числом 7-, 8-, 9-, 12- и 15-членииков, полностью или частично комплементарных праймеру М13. Данные по отмивке дуплексов гептадекануклеотидов с иммобилизованными октануклеотндами приведены з. таблице. 1

Как видно пз рис. 2 и таблицы, почти всегда существует такая температура, при которой отношение гибридизационных сигналов полностью комплементарного и соответствующего дефектного дуплекса (дискриминация дефектного дуплекса) достаточно кслпко (не менее 10 раз), чтобы надежно различить их. Исключение составляют некоторые краевые мисматчи, стабильность которых аномально высока. Однако этот факт ни в коей мере не ограничивает применимость предлагаемого метода. Действительно, при исследовании известных последовательностей (например, выявление мутаций) всегда можно выбрать такой олигонуклеотид, чтобы ожидаемая замена оснований оказалась внутри дуплекса. С другой стороны, при анализе неизвестной нуклеотидной последовательности (снквенс ДНК) проблема храепых мнематчей может быть решена при обработке на ЭВМ результатов гибридизации фрагмента ДНК с "полной" олигонуклеотидной матрицей. Метод обладает большой устойчивостью за счет избытка информации (в случае гибридизации с октануклео-тидами любой нухлеотид фрагмента ДНК фактически "прочитывается 8 раз, причем в шести случаях образует внутреннюю пару и лить в двух случаях -. краевую).

Итак, сравнение кривых отмывки позволяет различать полностью комплементарные и дефектные дуплексы я таким образом обнаруживать одиночные замены оснований в ДНК.

^ 100

п и

0) <

с

СО

10

а I

• »•»«» А \ 2:

: Ч \ \

Тт | V 3:

\м

10 20 30 40 50

0 10 20 30 40 50

Температура отмыбки, "С

ОТСОТТТТ

стссптт

■м

®ТССГЕТТ

ссссвтсс

1: З'-ТОАСССОСАОСААААТС |-М

осссстсо

2: 3' -TGACCGGiA.GCAAAA.TG рМ

ССССсТСО 3: 3'—ТСАСССО дАОС А АААТС

с

ссссстсо У-ТС\ССОсСАССККААТС

Рис. 2. Кривые отмывки АТ-богатых (о) и ОС-богатых (б) дуплексов (мисматчи выделены жирным шрифтом; М - матрица.

Таблиц.1

Тепловая диссоциация совершенных дуплексов и дуплексов, содержащих одиночные

мисматчи*

Прапильяый дуплекс Мисматч СГ (А7**, -с) Мисматч ОЛ (ЛТ^.'С) Мисматч СС (АС- 'О

р/ отсвт-гст 3'--ОСЛОСАААЛТ- <28 ±0,5) О гм тсстттт 3'--ОтАССАЛЛАТ- (-7±1) ("М °тсстттт 3'- -СдАССААААТ-(-1б±2)

ГА/ сстссттт 3'—СОСАОСАААА-(28+0,5) . г Р' с тсоттт 3'--ОСтАССЛЛЛА~ (-13 ±2) о Р' с тссттт 3'—СОдАССАААА-(-21 ± 1) С Г" отссттт 3'--ОсСАССАААА- (-3±0,5)

Р' ссстсатт 3'—ССССАОСААА- (33 ±0,5) с Г" сс тсотт 3'--СССТЛССААА- (-12±1) с Г" СС ТСОТТ 3'--СССдАССЛАА— (-24±1) С Р' с втсотт 3'--ССГСАССААА- (-30+1)

ССССТССТ 3'--СССОСАССАА- (41 ±0,5) о Г" ссс тсст 3'--ССССтАОСАА~ (-11±1,5) 0 Гм всс тсст 3'*- -СССОдАССАА-(-25±1) С Р' ее стсвт 3'--СССсСАОСАА-(-Зб±2)

р/ ссссотсо 3'--АССС-ССАССА- <50±0,5) ГМ с-осс°тсс 3'-~АСССОтАССА~ (-14±1,5) с Г" вссс тсв 3'--АСССОдАССА- (-23 ±1) С ги ССС^СТСО 3'--АСССсСАОСА- (-33±1)

ГЛ1 тссссатс 3'---ОАСССОСАСС- (41 ±0,5) г [М тсссс ТС 3,--САССООтАСС- (-12 ±0,5) 0 ги тазсс тс 3'—САССССдАСС- (-17±0,5) С Г? ТвйС вте 3'--САССОсСАСС- (-37+3)

р сгссссст 3'--ТСАССОаСАО- (Зб±0,5) о Г* ствссс т 3'--ТОАСССОтАС-(-10±1,5) СР< стсс.сст 3'--ТСАСССОдАО- (-6+1) С Р' стсвс вт 3'—ТСАСССрСАО-(-35 ±0,5)

рг АСТССССО З'-ТСАССОССЛ-(39±1)' 1'" АСТСвСС 3'-ТРАССС0ТА~ (-5±1) Гм \стсссс° 3'—ТСАСССОдЛ-(-2±0,5) р./ АСТССССС 3,-ТСАССОсСА- (-30±0,5)

♦Данные усреднены по трем измерениям. I

•♦Понижение температуры отмывки дефектного дуплекса по сравнению с совершенным.

Примечание: Мисматчи выделены жирным шрифтом, М - матрица, символ "с)" для удобства опущен.

3. Фшнко-хнмия процесса отмывки пригибридизо ванной ДНК

Как видно из рис. 3, температура отмывки (7V) дуплекса сильно записит от количества иммобилизованного олнгонуклеотида. Для исследованного интервала концентраций в пределах экспериментальной ошибки температура отмывки дуплекса повышается на определенное число градусов при увеличении концентрации имоби-лизованного олнгонуклеотида в определенное число раз. Данное правило выполняется для всех исследованных дуплексов (на рис. 3 приведен один из многочисленных примеров).

На первый взгляд зависимость скорости отмывки фрагмента (и, естественно, 7V) от концентрации иммобилизованного олнгонуклеотида в геле представляется неожиданной, весьма распространенным является мнение, что "температура плавления" дуплексов при гибридизации на твердом носителе не зависит от концентраций. Действительно, процесс практически необратим, поскольку концентрация фрагмента в отмывающем буфере пренебрежимо мала (объем буфера превышает объем пятна олигонуклеотида в 104 раз). Таким образом, диссоциация дуплексов при отмывке избытком буфера должна бьпь необратимым мономолекулярным процессом, скорость которого не зависит от концентрации продуктов реакции.

Однако, впоследствии мы пришли к выводу, что отмывку пригибридизованной ДНК нельзя рассматривать просто как необратимую реакцию диссоциации дуплексов. Необходимо различать два отдельных процесса: выход свободного фрагмента ДНК из слоя геля в окружающий буфер и плавление иммобилизованных дуплексов в объеме геля. Если выход фрагмента ДНК из геля необратим, то плавление дуплексов в геле скорее всего обратимо, поскольку в толще геля достаточно высока концентрата иммобилизованных олигонуклеотидив, с которыми фрагмент может реассоциировать в процессе диффузии через гель.

Рассмотрим объем геля, содержащий иммобилизованные дуплексы олигонуклеотида с фрагментом ДНК, в процессе отмывки при постоянной температуре. После диссоциации одного из иммобилизованных дуплексов свободный фрагмент начинает диффундировать из гелевого слоя. Предположим, что диффузия фрагмента в геле замедляется вследствие реассоциаций с окружающими его иммобилизованными оли-гонуклеогидами, находящимися в большом (примерно 100-кратном) избытке, т.е. вследствие процесса, родственного хроматографии. Качественная модель, включающая такую реассоциацию, позволяет объяснить сдвиг по температуре кривых отмывки при изменении концентрации иммобилизованного олигонуклеотида, а также необычно высокие температуры, отмывки, полученные нами для весьма коротких дуплексов.

\м

GTCGTTTT 3' -TGACCGGCAGCAAAA T G

И

3 О 1¿

О) <

с

>N

СО

а: ■U

аз

Z3

3

сО

о

£ о О

100

10

0 10 20 30 40

Температура оггшыбки, 'С

Pise. 3. Зависимость температуры отмывки дуплекса (показан вверху; М - матрица) от концентрации иммобилизованного олигонуклеотида. В пятне объемом 0,03 мм3 5 U), 1,5 (2), 0,5 (3) 0,15 (4) пмоль олигшухлеотада.

4. Дискриминации мисматчей в дуплексах разноги йС-состава на одной

пластинке

Как видно из рис. 2, два олнгонуклеотида могут настолько различаться по ОС-состапу, что полностью комлемеитарный дуплекс А.Т-богатого олнгонуклеотида . (рис. 2,а, кривая I) менее устойчив, чем дуплексы ОС-богатого, содержащие мис-матчи (рис. 2,6, кривые 2 и 3). Очевидно, что в такой ситуации гибридизация фрагмента ДНК с пластинкой, на которой иммобилизованы оба олнгонуклеотида, при любой фиксированной температуре не позволяет узнать с точностью до одного основания, имеются ли в данном фрагменте комплементарные км последовательности, или нет. Конечно, если получены кривые отмывки фрагмента, то проблема может быть решена путем сравнения их со стандартными кривыми соответствующих -совершенных дуплексов, полученными заранее. Однако, необходимость использования библиотеки стандартных кривых отмывки может сильно усложнить процедуру исследования последовательности ДНК. Более простой и удобный подход заключается в уравнивании температур отмывки дуплексов различного СС-состапа. В настоящее время для этой цели используются соли те1раалкиламмония. Однако этот метод работает тем хуже, чем короче олигонуклеотид. Это естественно, так как на самом деле на устойчивость дуплекса влияет не только его ОС-состав, но в то, какие пары оснований находятся в непосредственном контакте друг с другом. Влияние контактов, однако, может усредняться, причем с большей вероятностью па более длннных дуплексах.

Обнаруженная нами зависимость температуры отмывки (7\у) от концентрации иммобилизованного олнгонуклеотида позволяет решить проблему уравнивания температур диссоциации дуплексов различного ОС- состава весьма простым и изящным способом. Как показано на рис. 4, кривые отмывки АТ- и ОС-богатого дуплексов (ДТиг =* ЗО'С при равных концентрациях) М01ут быть полностью совмещены путем подбора концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов в соответствующих точках.

По-видимому, можно совместить кривые отмывки для любого набора олигонуклеотидов и таким образом получить "нормированную" матрицу олигонуклеотидов, в отличие от матрицы "равных концентраций", о которой шла речь выше. Температуры отмывки полностью комплементарных (совершенных) дуплексов для всех точек такой матрицы близки между собой, что позволяет с помощью всего одной отмывки при оптимальной температуре однозначно определить те точки матрицы, с которыми анализируемый фрагмент ДНК образовал совершенные дуплексы. Дополнительное достоинство "нормированной" матрицы заключается в том, что все ее

100

2

о ^

О <

с

>ч

(о

г

У

о а

<о

о

£ о О

Г"

оосссгсо

; и З'-ТОАССООСАССЛАААТО

7-5 пмоль 3 - 0,3 пмоль

["Л/

отссптт

2 и 4: 3' -ТОАССООСАОСАААА Т О

2-5 пмоль 4-90 пмоль

10 20 30 40 50

Температура отмыбки, *С

Рис. 4. Уравнивание температур отмывки АТ- и ОС-богатых дуплексов путем подбора концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов (структура дуплексов и концентрация иммобилизованных олигонуклеотдов приведены на рисунке справа; М - матрица)

точки можно ле только отмывать, но и гибридизовать при некоторой оптимальной температуре, так. что дискриминация мисматчей будет иметь кесто уже на стадии гибридизации, а не только на стадии отмывки. Действительно, матрица "равных концентраций" не предоставляет тнкой возможности, поскольку гибридизацию с нею необходимо проводить при пониженной температуре, когда стабильны наименее стабильные (наиболее АТ -богатые) из полностью комплементарных дуплексов. Фактически ото означает, что гибридизацию с матрицей "равкых концентраций" приходится вести в неравновесных условиях, когда дуплексы образуются не в соответствии со сиоей относительной стабильностью, а просто по мере диффузии фрагмента ДНК в гель (здесь речь не идет, конечно, о весьма дефектных дуплексах). Естественно, что при таких условиях гибридизации не может бить речи о дискриминации мисматчей в более стабильных (ОС - богатых) дуплексах.

Использование "нормированной" матрицы позволяет вести шбридизацкю в равновесных условиях. Это, с одной стороны, позволяет надежнее детектировать мие-матчг. потому что дискриминация, достигнутая на стадия гибридизации перемножается на дискриминацию на стадии отмывки. С другой стороны, поскольку гибридизация г. равновесных условиях имеет место почти исключительно в точках полной комплемеитариости, то может быть существент» снижено общее количество метки, загружаемой на матрицу. Это особенно важно для пр!шенений типа сиквенса путем гибридизации, в которых подавляющее большинство точек матрицы не должно в идеальном случае гибридозовагься с меченным фрагментом ДНК. Наконец, гибридизация в равновесных условиях обеспечивает "чистоту дуплексов" в каждом пэтне иммобилизованных олигонуклеотидов. Иными словами, в каждом пятне проходит образование почти исключительно полностью комплементарных дуплексов. Это существенно, поскольку в противном случае соответствующие кривые отмывки представляли бы собою суперпозицию многих различных кривых и были бы трудно интерпретируемыми.

Возможность обеспечить дискриминацию дефектных дуплексов путем гибридизации и отмывки "нормированной" матрицы, содержащей олнгоиуклеотидн релного ОС-состава при единственной температуре был? проиллюстрирована в модельном эксперименте (рис. 5). "Нормированную" матрицу олигопуклеотидов (нормирующие концентрации были определены я" результатам эксперимента, представленного на рис 4), по три точки каждого из двух, гибрнгизовали н отмывали при 35*С. Соотношение остаточных сигналов однозначно показывает, в каких точках дуплексы были полностью комплементарными, несмотря на то, что один из мисматчей -краевой вТ - вссьма устойчив.

gtcgtttt-aí з'-tgaccggcagcaaaatg

Gtcgtttt-aí з'-tgaccggaAGCAAAATG

gtcgtttt~aí З'-tgaccggtAGCAAAATG

1

ggccgtcg~m з'-tgaccggcagcaaaatg

1 ggccgtcg-^

3' -tgaccgg aagca a aatg

ggccgtcg-m З'-tgaccggtagcaaaatg

20 40 60 80 Ocmabuuueca дуплексы, %

100

. Pise. 5. Обнаружение мисматчей в дуплексах разного GC-ccстава на матрицес "нормализованными" концентрациями иммобилизованных олигонук-леотидов. Гибридизацию и отмывку проводили при 35" С. Остаточная радиоактивность приведена в процентах к уцровню радиоактивности фрагмента ДНК, взятого для гибридизации.

5. Флуоресцентная гибридизации " миниатюризация олипшуклеотндной матрицы

Наряду с радиоактивно меченными фрагментами ДНК для гибридизации были использованы фрагменты, меченные по З'-концу флуоресцентной меткой тетраме-тнлродлмином. Использование флуоресцентной метки позволило проводить гибридизацию в мнкромасштабе. На рис. 6 представлены микрофотографии фрагмента микроматрицы, на которой октануклеотид 5'-<1(ООССОТСО) иммобилизован в ячейках геля со стороной 100 мкм. Такие ыикроматрицы мы будем называть "гиб-ридизационными чипами"; они получены путем срезания части слоя геля на "схрай-бере", устройстве с точно позиционируемым резцом, предназначенном для обработки микросхем. Олигонухлеотцды наносились на "чип" при помощи капилляра, закрепленного в микроманипуляторе. Как видно из рисунка, гибридизация с таким "чипом" позволяет весьма надежно детектировать замены отдельных оснований в последовательности (сравните на рис. 6,а ячейку I (правильный дуплекс) с ячейками 2, 3 и 4 (дуплексы с мисматчами ОЛ, С Г и СС, соответственно).

Поскольку распределение флуоресцентной метки может быть измерено с очень высокой чувствительностью и пространственным разрешением, например, при помощи микроскопа, то предел обнаружения гибр.;дизационого сигнала определяется только отношением сипит/фон и не зависит от размеров объекта, интенсивность флуоресценции которого измеряется. Следовательно, чувствительность измеряющей системы обратно пропорциональна площади объекта, т.е. пятна олнгонуклеотндной матрицы в нашем случае.

Действительно, миниатюризация матрицы позволила очень сильно повысить чувствительность измерения. Для определения предела обнаружения ячейки "чипа" размером 100*100 мкм были загружены различным количеством тераиетилродами-на, причем ячейка с наименьшей интенсивностью флуоресценции содержала всего 10 амоль красителя. Микрофотографии, представленные на рис. б,г, показывают,' что интенсивность свечения даже в этой точке существенно выше фоновой ч может быть надежно детектирована. Таким обрьлом, чувствительность, которой удалось достичь в данной работе благодаря миниатюризации матрицы, по порядку величины совпадает с чувствительностью по радиоактивней и ферментной метке и на несколько порядков ниже, чем чувствительность по флуоресценции, которая может быть достигнута в эксперименте, проводимом по стандартной "макро" методике. Огромная разница в чувствительности, видимо, объясняется не только миниатюризацией, но и удачным выбором носителя: полиахрилам'-дный гель обладает исключительно низкими собственной флюоресценцией и неспсцифическим связыванием флюоресцентно меченной пробы. Заметим, что, по-видимому, из всех используемых в настоящее

а

в

Рис. 6. а-в - Специфичность гибридизации на микроматрицах: ячейки 1-4 содержат дуплексы, показанные на рис. 2,6 (1-4). а - Гибридизация при 0"С; б а в - тоже после дополнительных отмывок. г - Демонстрация чувствительности метода: ячейки /, 2 и 3 содержат, соответственно 1 фмоль, 100 амоль и 10 амоль тетрамет—тродаминового производного дезоксиуридина.

время меток именно флуоресцентная позволяет в наибольшей степени использовать преимущества миниатюризации для повышения отношения сигнал/фон и, следовательно, чувствительности.

ВЫВОДЫ

♦ 1. Разработан метод иммобилизации коротких олигонуклеотидов в тонком слое полиакриламидного геля, закрепленного на поверхности стекла.

О 2. Найдены условия для проведения гибридизации иммобилизованных олигонуклеотидов, обеспечивающие надежное распознавание замен оснований.

♦ 3. Обнаружена концентрационная зависимость температуры отмывки иммобилизованных дуплексов и построен^ адекватная модель процесса отмывки.

Ф 4. Проведены модельные эксперименты по созданию "нормированных" матриц иммобилизованных олигонуклеотидов, которые позволяют проводить параллельные гибридизации с сишгонуклеотидами различного GC-состава.

Ф 5. Разработана методика иммобилизации олигонуклеотидов и гибридизации флуоресцентно меченных ДНК на гибриднзациоиных "чинах".

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Лысов Ю. П., Хорлнк А.А., Храпко К. Р., Шик В.В., Флорсптьсв В Л. и Мирзабеков А.Д. (1988) Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод. Доклады АН СССР, 303, 15081511. '

2. Храпко К. Р., Флорентьев В. Л., Х„рлин А. А., Лысов Ю. II., Шик В. В. и Мирзабеков А. Д. (1989) Гибридизация олигонуклеотидов как способ определения первичной структуры ДНК. восьмой двусторонний симпозиум СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов", Иркутск, нюнь 1989.

. 3. Khrapko К. R., Khorlin A. A., Lysov Yu. P., Shick V. V., Florentiev V. L. ond Mirzabekov A. D. (1949) A mçthod of DNA s^quencing by hybridization. Second bilatéral symposium l/SSR-USA "Structuie of eucarioiic génome and régulation о/ ils expression", Tbilisi, October 1989.

4. Khrapko K.R., Lysov Yu.P., Khorlin A.A., Shick V.V.,FIorentie. v i an. Mirzabekov A.D. (1989) An oligonucleotide hybridization approach to ONA sequencing FEBS Letters, 256, 116-122.

5. Lysov Yu. P., Khrapko K. R., Chernyl, A. A., Khorlin A. A., Florentiev V. I., unu Mirzabekov A. D. (1990) DNA sequencing by oligonucleotide hybridization. Flm Internat. Con/. on Electrophoresis, Supercomputlng and the Human Genome Tallahassee, March, 1990.

6. Храпко К. P., Хорлян А. А., Иванов И. В., Чернов Б. К., Лысов Ю. П. Василенко С. К., Флорентьев В. Л., Мирзабеков А. Д. (1991) Гибридизация с олигопуклеотидами, иммобилизованными в геле: удобный метод регистрации одиночных замен оснований. Молекулярная биология 25(3) (в печати).

7. Khrapko К. R., Lysov Yu. P., Khorlin A. A., Chernov В. K., Ivanov I. В., Florentiev V.L4 Mirzabekov A. D. (1991) A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA Sequencing, (submitted).

Подписано в печать: 7.03.91. '

Бумага офсетная, формат 60X84 1/16 доля. Печать офсетная Усл. печ. л. 1,16. Уч.-изд л. 1,25. Тираж 100.

Зак. »2310 . Бесплатно^ _

АП Шанс, 127412, Москва, ул. Ижорская, д. 13/19