Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ последовательностей ДНК в подходы к диагностике генетических заболеваний гебридизацией с матрицей иммобилизованных олигонуклеотидов: практическое применение метода секвенирования с помощью гибридизации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ последовательностей ДНК в подходы к диагностике генетических заболеваний гебридизацией с матрицей иммобилизованных олигонуклеотидов: практическое применение метода секвенирования с помощью гибридизации"

о» •

. Г-и •1

Российски Академия Наук Институт Молекулярной Биологии им. В.А.Энгепьгардта.

ва правах рукописи

УДЖ 577.323

Иванов Игорь Борисович

\

Анализ последовательностей ДНК в подходы к дг гностике генетических

заболеваний гибридизацией с матрицей иммобилизованных олигонуклеотидов: практическое применение метода секвенирования с понощью гибридизации

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной организации хромосом Иститута молекулярной биолога! им.В.А.Энгвльгардта Российской Академии Ваук, зав. д.х.н., проф., акад. А.Д.Ннрзабеков

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, академик А.Д.Мнрзабехов

оффнциальные оппоненты:

д.ф.-м.и., проф., В.Е.Ввавов д.б.в., проф., Н.К.Янковский

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Запита состоится часов иа заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Эгсльгардта РАВ оо адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д.32

С . диссертацией нохно ознакомиться в библиотеке Института молекулярное биологии им В.А.Эигельгардта

Автореферат разослан

л\>

Учений секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

А.М.Хрицнн

Введение

Актуальность проблемы. Мутации в несколько нуклеотпдов - один из факторов иолиморфизма человеческого генома. Для широкомасштабной идентификации таких мутаций необходимо иметь недорогой метод с большими возможностями, которым является гибридизация ДНК с олигонухлеотидами .

С момента цервах модельных экспериментов метод развивался как инструмент «ля диагностики. В 1988 году сразу несколько групп в Англии, Югославии и России предложили идею использования полного набора олигонуклеотндов фиксированной длина (это 4" п-мерных олигонуклеотидов), чтобы по характеру гибридизвционнкх сигналов -получить информацию о суммарной последовательности ДНК.

В одном из гибридизационвых подходов ДНК закрепляется на мембрану и затеи гибридизуется с короткими зондами. Другая методика иногда называется "обращенный дот-блат" и заключается в том, то закреплений -онд находится на матрице, а ДНК - в растворе. Вторая методика наиболее удобна для анализа последовательностей отдельных геномов (например, для диагностики генетических заболеваний). Большое число элементов такой олигонухэ;еэтидной натрицк (для "восьмерок" это 4®-65,53б охтануглеотидов) не должно являться ограничением, так как подобные технологии широко применяются в микрозлектронвой промышленности.

Н хотя модельные эксперименты (в том чисде и наши) доказали эффективность' гибридизационных подхода, "большинство* из результатов экспериментов оставались применимы только для ограниченного круга задач.

Поль рдбота. Целью настоящей работы является разработка новых методических подходов использования метода гибридизации с олигонуклеотидной матрицей для анализа реальных последовательностей ДНК. На примере ПЦР продуктов участка р-глобинового гена демонстрируется правомерность перенесения результатов нз недельных экспериментов с синтетическими олигонухлеотидами на длиннне последовательности ДНК." Для всех экспериментов предлагается использование флуоресцентных красителей.

Научнад -ровдзна работа. Разработан и прсмевея метод гибридизации флуоресцентных ДНК нчшеней, при этом регистрация в анализ сигнала осуществляется в режиме реального времени. Метод позволяет проводить кинетические измерения быстро протехающих процессов. Предлагается использовать интерхапврушцие красители для детектирования образования дуплексов между немеченой ДНК и закрепленными олигонухлеотидами.

]

Получена достоверная дискриминация правильных дуплексов ох дуплексов несущих замены оснований. Демонстрируется, возможность использования гибридизации "ветше" для уменьшения элементов матрицы олигонуклеотндэв. Приводятся . эксперименты по увеличению эффективности' гибридизации • с помощью фрагментации ДНК. Полученные ' в работе результата свидетельству»? о широких возможностях в использования гелетюй матриц» с закрепленным набором олнгонуклеотндов. 4

Научно-^гоактагекясое значаща работы. Работа посвящена развитию одного из ключевых направлений Международной программы "Геном .Человека" -развитие методов а технологий для. анализа последовательностей ДНК. Как один нз методов анализа предлагается диагностика генетических заболеваний, на примере заболевания ß-талассемии. В рассматриваемой работе используется флуоресцентные красители, анализ полностью автоматизирован а результате могут использоваться для клиник. Работа не ограничивается только диагностикой. Предложенные подхода позволяют проводить анализ геномного полиморфизма и в будущем может быть использован•для "секвенировавия.

ЙПТЧ?*Т1Ш1Т ГЧ^ТГЬ Результата работа представлена в тезисах Cold Spring Barbour Conference 1993, 1994 гг., докладавались на Sequencing by Hybridization Workshop (Houston) 1993 г.. Sequencing and Genome Happing Conference of DOS (Santa Fe) 1994 г.. International Biosensors r Summer School "(Puschino) " 1994 г. ' Работе' присуждена* премия'

! МЕЖВЕДОМСТВЕННОГО СОВЕТА ПО ПРИОРЙТЕТННМ НАПРАВЛЕНИЯМ НАУКИ О ЖИЗНИ И

БИОТЕХНОЛОГИИ за 1993.

Структура и pfi»««M работы. Диссертация изложена ва стр., включая | таблиц и расунков, и состоит из разделов: введение, обзор

! литература, материалы в метода, результата, обсуждение и вывода.

Библиография вкллшет наименований.

Основные результата работа получена автором самостоятельно. Приготовление матриц проводилось совместно с В.Чупеевой, с.Парвноваы, I Н.Мологивой, В.В.Солодихивкм, - Г.И.Ероовам; гибридизационные

эксперимента и компьютерный анализ изображения - совместно с Е.Кирилловым. Основной вклад в разработку флуоресцентного микроскопа внесли-В.Е.Барский и Э.Я.Ерейндлнн. .

Содержание работы:

Цряготоиледив я свойства оджгояуклеотидав шлт^итчшчшд в слое поягахрзэтагэадиаго геля.

'Для иммобилизации опитонуклеотидов ма использовали тонкий (20 (ш) слой полиакриламидного геля,.прикрепленнай к поверхвости. Сухой гель разрезался механически иа квадратики в которых иммобилизовались определенные олнгонуклеотиды. Приготовлеэиую таким образок матрицу с олигонуклеотиднкк ваборсм на называем олигоматрицей. В зависимости от размера квадрата олигоматрица кокет бить или микро- (с размером квадрата обычно 50x50 (ira) или -макро- (свыше lxl mm).

Нанесение маленьких объемов раствора - олнгонуклеотидов (1 al с 20 * точностью) достигается с помощью специально сконструированного робота. Главвай элемент робота - игла с диаметром 100 цш. Температура игла поддерживается вблизи точки росы в регулируется с помочь» термоэлемента Пелтье. Это позволяет переносить раствори олнговухлеотядов из плашки на гель. Диаметр иглы определяет переносимый объем (Вршов,1993). В настоящее время, робот работает со скоростью 200 точек в час.

Гель имеет ряд существенна свойств по сравнению с обычными материалам - поверхвости стекла или мембраны. Махно сказать, что гель объединил преимущества вайлововах мембран в стеклянная носителей. Во-первых, олиговуклеотида закрепляются внутри объема геля, а не на поверхности. Емкости иммобилизации в геле в 100 'раз превосходен плотность иммобилизации ва стекле (Kbrapko,1991; Southern, 1994). Физико-химические процесса протекающие' внутри геля во время гибридизации п откпвки похожи по ряду параметров на растворное плавление олиговухлеотвдов (Xvanov, 1991).

В настоящей работе показано, что другой важный параметр - емкость гибридизации (или доступность для связывания) - превосходит все имеющиеся оценки в пользу гелевого носителя. Около 70% (обычно исследователи сообщают об 1%) закреплениях олигояуклеотидов были способна образовывать дуплекса-

Высокая емкость гибридизации - параметр, которай часто опускается исследователями - обеспечивается . тем, что опитонуклеотиды не препятствуют друг другу образовывать дуплексы с ДНК. В представленных экспериментах ма закрепляем олиговуклеотида' в концентрации ' много меньшей чем верхний^ предел иммобилизации (1 nmol/20 ут х 1ша2). Надо отметить, что увеличение количества закрепленного олиговуклеотида мохет приводить, в конечном итоге, к уменьшению эффективности гибридизации.

Использование полиахриламидного геля удобно н с химической точка зрения: легко модифицируется. Активные группы вводятся в гель, например, во время полимеризации (Gllbam,1968) я могут быть использована для различных методов иммобилизации. (Хляал,1969). В настоящей работе применяется реакция взаимодействия полиакрилгидразида с окисленным рибозвеном на 3'-конце синтезированного олигонуклеотида (Khrapko,1991). В отличие от цитируемой работ», реакция окисления и хранение олигонуклеотидов ведется в многолуночных плашках* Такое изменение необходимо для автоматизации всех процедур в приготовлении матриц.

Гибридизация олигаиатрвцы с флуоресцентно печеваой ДПК.

Низкий флуоресцентный фон полиахриламидного геля обсуждался исследователями в связи с использованием гелей в автоматических секвенаторах с высокой чувствительностью {Brumbaugh,1988). Под чувствительностью в нашем случае понимают количество меченной по коицу ДНК, детектируемое после гибридизации с закрепленным олиговуклеотидом. Хорошо известно; что флуоресцентные метки по этому параметру уступают радиоактивным (Urdea,1988),однако миниатюризация флуоресцирующего объекта позволяет преодолеть недостаток. Уменьшение размера флуоресцентного источника увеличивает плотность излучения, а значит в чувствительность может, быть высокой (Ekios. .and Chu, 1994). Гелевые клетки могут быть легко уменьшены (в некоторых случаях использовались квадраты ЗОхЗОрш) и уровень детекции достигал 1 аттомоля меченного по концу олигонуклеотида на квадрат.

Для проведения анализа изображения мы использовали специально сконструированная флуоресцентный микроскоп, разработанный ЛОМО (Санкт-Петербург) . В настоящее время микроскоп позволяет "видеть" до 1000 хвадратов 50x50 pm одновременно. Объектив микроскопа (1.7х, аппертура-0.4) освещает поле диаметром 3 шт. Изображение регистрируется ПЗС (CCD) камерой, работающей под контролем программного обеспечения (оболочка MS Hindous 3.11). Программа позволяет проводить измерения флуоресцентного сигнала от каждого квадратика в режиме "реального времени", что удобно для регистрации протекания' всех кинетических процессов. При проведении компьютерного анализа изображения оказывается удобным фиксированное положение иммобилизованных . олигонуклеотидов: • гелевые хвадратихи ховалентно связаны со стеклом. К примеру, при работе с мембранами, которые часто деформируются в процессе эксперимента, для анализа изображения требуются дополнительные экспериментальные ухищрения, усложняющие протокол (Meier Evert, 1993).

В данной работе мы использовали тетраметнлродамин THF (^макс поглощения - 551 нм и испускания - 579 им) в качестве флуоресцентной метки для ДЕК мечепия. Гибридизацию олигоматрицн с флуоресцентно меченной ДЕК .мишенью проводила в капле объемом 1 ■ ц1. После, гибридизации, матраца быстро промывалась в картина "считывала«" в память компьютера. Светящиеся квадраты для гпбридизадионвого сигнала выделяются на темном фоне. Промывка удаляет с матрица свободные миоенн, которые вносят основной вклад в суммарный. фон. Несмотря на фон, предварительные результаты габиридизации, достаточные для обнаружения правильных дуплексов, можно было получить без промявхи. В принципе такой подход может оказаться полезным для изучения кинетики гибридизации ДНК с олигонуклеотндаыи, закрепленными на подложхе.

Прнивввввв опигтатрпцк для обварухаяяя точачшас мутпзщй 4

Для ноделгиых экспериментов мы выбрали заболевание р-талассемия (Фогель, 1990) и поставили перед собой задачу обнаружения всех возможных мутаций, которые могли бы возникать в близких положениях IVS 1/1 и IVS 1/6. Случаи близко расположенных мутаций обычно относят к сложно диагностируемом. В качестве зондов, выбрали 16.октануклеотидов вида 3'-""о-СуААССхТ-З ', где у и' X любые из оснований A,T,C,G.

Олигонуклеотиды иммобилизовали на матрицу 4x4 квадрата как показано на рис.1.

Матрицу гибридизовали с 1 рю флуоресцентно меченного олигонухлеотида (длиной 19 нт.) с фиксированными нуклеотидами в положениях X и Г (любые из оснований A,T,C,G). Эти положения являются горячими точками IVS 1/1 и IVS 1/6 для рассматриваемого заболевания. После 30 минут гибридизации, матрицу быстро отмывали при 0*С. Для наиболее стабильного мисматча ÏG {Х"Т, x=G), дискриминация (отношения сигнала правильного дуплекса к неправильному) достигала трех после гибридизации (Рис. 1А) и 10 после трех мазутной отмывки при 20°С. Отмывка уменьшает сигнал мисматча сильнее чем сигнал правильного дуплекса (Drmanac, 1990). В случае геля эта разница больше,' чём в случае плоского носителя (Лрвшвц, 1992). V .

5' -ССТССКСАСГГТСЭМСА-ТМЕ XX - СуААССжТ - 5'

Рве 1. Определенна мутации в фитгировликом положашн. Матрица с 16 иммобилизованными "восьмерками", со всевозможными заменами'в соложениях к и у. Эти замени соответствуют мутациям Ь-талассемив 1УБ1/1(Т) и ГУБ1/6(Г). Матрицу гибридизовали с флуоресцентно меченными 19-мерами [(А) (1,Х) - (0,1); (В) (А,Т) (С) (в,С)]. На схеме "+" соответствует правильному дуплексу; "-" единичному мнематчу; "." сигналу, который недетехтировался. й. Контрольная гибридизация для подтверждения качества приготовления матрица: гибридизация с вырожденной "восьмеркой" Гад-З'-ваТТТСпА

б

Важное свойство приготовленной матрицы в так, что правильней дуплекс может быть указав Без получения достоверной дискриминации. Рисунок ("pattern") гибридизации предоставляет достаточно информации, чтобв сделать подобный вывод. Предположим, ■ например,- что. мы способна регистрировать сигналы только от правильных дуплексом в дуплексов, содержащих один мисмазч. Как видно из рисунка - это вполне правомерно. Мы получим светящейся ряд (х изменяется, у" const) в колонку (x-const, у изменяется), а их пересечение - положение правильного дуплекса. На рисунках Рис. 1 В. С изображена подобная схема "-" для одиночнвх мисматчей, "+" - правильная точка. Для случая гетерозиготной мутации мы получим рисунок с двумя "крестами". Данный подход означает,- что нет необходимости искать условия наилучшей дискриминация при работе с подобиями матрицами.

Ва рис ID показана проверочная гибридизация.Эксперимент демонстрирует качество приготовления матрицы (16 охтануклеотидов светятся с приблизительно равной интенсивностью) и позволяет провести нормализацию измерений, подобно тому как это делалось в работе (Sontiern, 1992).

Другой подход к локализации и определению замен изображен на рис 2. Данная олигоматрица двойной набор октанухлеотидов, перекрывающихся Еа с^но основание. Попарно олнгонуклеотидн отличаются заменой Верхний ряд, правильно комплиментарный, перекрывает часть 19-мера, а нижний ряд перекрывает ту же часть, во содержит мутацию 5" АС3'. Как и в случае аллель специфичных олигоауклеотвдов идентификация мутации проводится путем сравнения пары олигонуклеотндов - контрольного • в неправильного - верхнего ряда и иихнего. Однако, такое сравнение проводится в натек случае 8 раз. То есть матрица содержит восьмикратный "rsбыток" информации о замене и нутация может быть аайдена с высокой точностью. В этом эксперименте мы не выравнивали стабильность дуплексов и ограничились проведением различных отмывок.

В терминах получаемой информации перекрывающийся набор подобен фрагменту матрицы дпя секвеннрования методом SBH (Sequencing By Hybridization) {Kbrapko,1989). Можно сказать, что данная матрица

позволяет сехвеввровать данный фрагмент с точность до одного 5 АС3 мвсматча.

Эффект пояхщяя ивсылтчл ал стабильность душшхса.

Для выбора олигоиухлеотидов прн создании диагностической олнгоматрнда надо принять во внимание влияние позиции мисматча на стабильность дуплекса (Wetmur, 1991). Такую зависимость для 5 АС3' мисматча оценили по Рис. 2.

Достоверная дискриминация АС мисматча достигается для sees его положений сразу поспе гибридизации или после серии отмывок. Отметин, что дискриминации для иммобилизованного олигонуклеотида-с 5'-концевсы и предконцеввм масматчем затруднена в представленном случае. Ваша данные (рнс 3.) о тон, что внутренние замены вносят больший вклад в дестабилизацию дуплекса, хорошо согласуются с ранее полученными, (Wetmur, 1991). Можно заключить, что при выборе олигонуклеотидов предполагаемая замена должна приходится ва 4-уу 5-у, 6-у в 7-у позиции от 5' ковца иммобилизованного олигонуклеотида. Нестабильность 3' концевого, и предконцевого мвематчей, по сравнению с аналогичными 5', может быть вызвана влняввек гелевого носителя. С другой стороны, иммобилизованные олпгрнуклеотнды, содержащие . замену ва 3', имеют. AT богатую последовательность. Нестабильность мисматча может объясняться низкой стабильностью самого дуплекса.

Обнаружение образ€звявпж дупдвхсоа окражвяаяяш броюсткм аявдвом.

Высокая емкость гибридизации может использоваться для регистрации образования дуплексов окрашиванием интерхалирующими красителями. В модельном эксперименте мн сравнили чувствительности при использовании флуоресцентно меченной ДНК и при гибридизация "холодной" ДНК с матрицей и последующим ' окрашиванием этидвй бромидом (Рис. 4). Этндвй бромид (EthBr) был выбрав потому,, что его характеристики (Хщ^е поглощения1 -510 нм в испускания - " 595 нм) не требуют изменения фильтров регистрирующей системы. _

A. НуЬпйоМюп

регГеО:

АС ГЛЬшКЬ:

B. 8« 2СС 1 пил

РсгГсП: ЛС МипЫСЬ:

C. ЖС 2 п>п РсЙесс

АС Мцо«1£1и

С С т

80 100 80 75 70 40 50 60

60 60 40 10 10 0 0 30

75 100 80 70 55 1 15 25 30

45 50 20 5 5 0 0 5

65 100 75 55 40 5 5 5

35 35 10 5 0' 0 0 0

6 6 С А в А Т ТбвТАГСА- 3 ^—

- _

ч/-

Рве. 2» Нагрвца дпч яохалвяяцая я овределеяня замены: ходахь евхз»внярсва инл. Олпгоматрица - (2x8) перехрываюяиеся на одно основание октануклеотидов, иммобилизованные в квадратиках геля ЮОхЮОцт. Попарно олигонухлеотиды отличаются замэной Т->С. Верхний ряд - правильно комплементарный - полностью перекрывает часть 19-чера. Нижний ряд перекрывает ту же часть, но содержат мутацию 5'асэ*. _ Стрелкам? указано _ соответствие между/. последовательностью "восьмерки" и ее положением на матрице. А. Матрица после гибридизации, В. Отмывка при 20°С. Цифры справа - это флуоресцентные сигналы из каждой точки.

1. • 2 3 4 5 6 7 8

Мвта1сЬ роэйкт (1епд1Ь о1 о(Ьопис1еоШе в 8 Ьаэез)

Рве 3. офабшавосфн 5<АС5' мнематча в эавнеямостя <уг «го

«•сг-сполоавкая. Флуоресцентно меченный олзгонухлетид (длиной 19 нт.) гибридизовался с матрицей'изображенной на Рис. 2. Отновение сигнала иисматча к правильному дуплехсу нанесена в зависимости от положения мисматча. Позиция 5'ас3' мутацан сдвигается па .графике от 3' к 5' концу иммобилизованного октануклеотида.

Незначительное ухудшение дискриминации мисматчей и оовшэвае флуорецентного фона наблюдается при использовании интерхалятора, что объясняется взаимодействием EthBr с одноценочечвой ДНК (иммобилизоваыышш -олягоь?хлеотидамл)■- Однако, .-как 'было показано' выше, ухудшение днгцшщццции не сильно уменьшает информативность матрицы н EthBr мохет исаокьзоваться наравне с флуоресцентно меченной ДНЕ.

Высокая- емкость гибридизации - важный параметр для получения достоверного сжгнала в следствие побочного взаимодействия с неспареннымя ояюцепочечиюш дуплексами (обычно 1 % от константы связывания с дупяексамн).

Чтобы сделать некоторые оценки, предположим, что взаимодействие EthBr с одвоцепочечыыми олигонужпеотндамн дает фон В, ас дуплексами полезный сигнал S, тогдас

В- Ki х {ssOIig},

S - К2 х {dsOlig} + Ki х ({ss01ig}-{ds01ig}) ,

где Ki, хоисхаата связывания для иммобилизованного олигонуклеотида концентрации {ssOlig}, Kj и {d&Olig} аналогичные параметры для дуплекса. •

Дискриминация D полезного сигнала над фоном выражается, как:

D « S/B - (K2/ti - li х ({ds01ig}/{ss01ig}) - 1

Обычно, К2/К1 около 100 и S/B должно быть порядка 10 »1.. Эти посылки позволяют упростить выражение

D - (K2/Ki) х {{ds0lig>/{ss01ig>).

Второе отвоявние характеризует емкость гибридизации, подобно параметру емкосп связывания вводимого в аффинной хроматографии. Нз вводимых ранее экспериментальных посылок D-10 (для анализирующей системы) и. Kj/Ij-100 (для ннтеркалятора), получаем, что при использование нысеркалятора емкость гибридизации должна быть больше 10 %. При малой емкости достоверную дискриминацию можно достичь путем использования ннтеркалятора с большей специфичностью к дуплексам или большим значением K2/Ki, таких хах ТО, ТОГО, 10Y0 (Glazer and Rye, 1992).

а. Е&Вг Бьш^

Ь. НуЬпдоаЗоп лукЬ а ргоЬе 1аЬеЫ Ьу ТШ'

. . .СЗСАСХТТССХАТСА. . . (Т,Х) таЪгхх-СуААССхТ~5'

ССТССССАССТТЭЗТАТСА (Т Д) = (в, Т)

Рис 4- Сравнение различиях методов дэтакции: а. охраякваяие ЕЪЬВг и гибридизация с флуоресцентной ыяяеяьх)«

фрлтмавтиропп няв ДШС.

Длинные фрагменты ДНК способны образовывать стабильные вторичные структуры. Исследователи предполагают, что именно они препятствуют гибридизации с короткими зондами ("false negative") (Draanac,1993). Легко представить, что внутримолекулярная реакция (образование шпильки) будет конкурировать с межмолехулярной (образование дуплекса) (Wetmur,1991)-'

В данной работе предлагается разрушать ДНК до фрагментов определенной длины, для которых влияние вторичной структуры на •образование дуплекса снижается. Кроме того, можно привести по крайней мере еще несколько причин применения фрагмеатировепия, например -ограниченная'пористость геля.

В работе использовали три метода фрагиентироваЕия ДНК: химическое модификацией (Пятят,1977), _ разрушение гвдроксил радикалами (Roklta,l992) и ферментативный - деградация ДЯК^зой (Rhodes,1980). Каждый из методов был опробован для создания фрагментов ДНК определенной длииы с последующей гибридизацией на олигонуклеотидной матрице. Мы показали, что для воспроизводимой гибридиэаца» с охтанухлеотвдама, размер ДНК мишени должен быть в пределах от 3 до 30 нт. Кинетика отмывхи совпадает для фрагментов длины которых находятся в этом диапазоне.

Стоит отметить, метод, который , наиболее полно удовлетворяет вышеизложенным требованиям - ДНКазный "перевар". Ранее это? подход Сыл, в частности, применен для определения периодичности ДНИ, закрепленной на положительно заряженном кристалле фосфата кальция. Если ДНК лежит на кристалле, то открытыми для ДНКазы остаются только участки, отражающие геометрии двойной спирали (Rhodes,13B0). Теоретически, при сильной деградации распределение фрагментов должно соответствовать длине витка, что эквивалентно выходу фрагментов длиной приблизительно 10 вуклеотидов.

Фракцвоннраваяпс*. глп обогащение ДЛК ва олхгох&тршц&.

Высокая емкость имнобнлигациз олнгонуклеотидов ва полиахрилакидном геле ваходит еще одно применение олигоматриды - фракционирование ДНК -эффективное вылавливание последовательностей, которые гибридигуются с матрицей.

Набор "десяток" (последовательности указаны ва рис. 5 в рамке) иммобилизовали на квадратик 1x1 мм. Затем, фрагментироваянвхй ПЦР продукт гибрздкзовали с такой матрицей и проводили серию отмывок.

Высокая емкость гибридизаций обеспечивает малые потери нухных нам фрагментов в процессе гибридизации. Серия отмнвок устраняет фрагменты с меньшей стабильностью, то есть дуплексы неполные или несущие мясматчи. .Отмывки позволяют различать центральные иисматчи относительно правильных до сотни раз {Храпко я др., 1991). После отмывок проводят элюцию оставшейся ДНК. В некотором смысле описанная процедура похожа на аффинную хроматографию: посадха, отмывка и элюция. Аффинность в данном примере - это степень комплинентарности. •

В модельных экспериментах с синтетическими олигонухлеотидами мы получили 20 кратное обогащение при ВО * выходе основного продукта. То есть ори 20 кратном избытке олигонухлеотида с мисматчем мы получаем, после обогащения, равное количество обоих олигонуклеотидов. При этом потеря правильного олигонухлеотида незначительна.

ГиСуыиювцяя с ПЦР продуттвмв.

Для диагностических экспериментов использовалась ДНК, полученная из образцов крови пациентов с диагнозом Р-талассемия. ДЕК амплифвцировали в две стадии. На первой - получали продукт длиной 421 пары оснований. На второй - продукт из первого раунда использовали как основу для амплификации ЦНК длиной 176 или 32 пар освованнй. Первый из них продукт фрагмеитировали, обогащали, метили н гибридизоваля с олигоматрицей "десяток" ■ (Рис 5). Амплификация, второго продукта проводилась с двумя короткими праймерами, один из праймеров был мечей флуоресцентно. Флуоресцентно меченный ПЦР после очистки на денатурирующем гель электрофорезе или на обогащающей матрице гибрндизовали как на Рис 5. Получение короткого продукта ПЦР - вид фрагментирования, так как позволяет уменьшить размер гибридизуемой ДНК.

Для определения замен оснований проводили гибридизацию с матрицей деканухлеотидов, закрепленных в гелевых Квадратах 40x40 |яп. Деханухлеотиды были выбраны из соображений уменьшения вероятности повтора похожей пробы, например содержащей стабильный мисматч. Такие повторы являются источником ошибок в гибрвдизационных экспериментах (Охтаоас ее а!., 1993). Хах видно из рис. 5, мы получили достоверную гибридизация ПЦР с матрицей деканухлеотидов. Похазана возможность детектировать гомо- (рнс. 5А, слева) , двойные гетеро- (рис.. 5А, центр), гетерозиготные мутации (рис. 5А справа). Между использованием ПЦР продухта, фрагментированиого химически, я "короткого" ПЦР разницы нет (рис. 5А слева в 5В). В первых экспериментах применялся короткий ПЦР, посхольху процедура удобна для работы одновременно с несколькими образцами. Недостатком тахой процедуры является то, что такой ПЦР

покрывает лишь незначительное число мутаций. И«пример, s наыем случае мв могли анализировать мутации только в трех положениях - ITSI/1, IVSX/5, IVSI/6.

TMR-.. .TGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTAT...-3'

mat'rix-TCCAACCATA-5' a Normal

natrix-TCTAACCATA-5' Ь IVS 1/1

matrix-TCCAACGATA-5' с IVS 1/5

matrix-TCCAACCGTA-5' d IVS 1/6

matrix -ACCACTCCGG-5' 5 e C26+

matrix -ACCATTCCGG-5' ' f C26"

- Рве 5. ДнаГЕосхиха мутаций",вызывающих р—талассшот. Шесть "десяток" иммобилизовали в квадратах 40x40 |im хак указано на схеме. Матрицу гибридизовали затем с флуоресцентно меченными ПЦР продуктами. А. ПЦР продукт длинной 32 вт. для анализа мутаций (слева на право) дикий тип, IVS 1/6 (Т->С) н TVS 1/5 (G-»C); гетерозигота IVS 1/6. (Т-»С). В. Мутации IVS 1/1 (G->A) подтвердили гибридизацией'ПЦР продухта длиной 176 нт.,' фрагмеитироваивого и'затем меченного флуоресцентно.

С помощью матрицы было мы проверили свыше-20 образцов. Все из них дали однозначное определение характеристики ДНК. Одинаковые мутации давали одинаковне рисунки гибридизации. Например, на рнс. 5А (слева) и 5В отношение сигналов- а/Ь одинаковое.

Исполвзопл тга гвбрвдязахгяи шстяас для'дкагяостякя:

В нашей предыдущей работе (Kbrapko et al., 1991) описывалось применение "гибридизации встык" для повешения эффективности метода секвеннрования с помощью гибридизации, а именно для разрешения точек ветвления при- реконструкции последовательности. В настоящей работе мы используем гибридизацию встык для диагностики мутаций.

Данная процедура состоит из нескольких последовательных стадий гибридизации-. Сначала флуоресцентно меченная ДНК мишень гибрндизуется частично перекрывающимся набором олигонуклеотидоа на матрице. Это процедура позволяет выявить место предполагаемой мутации с точностью до размера зонда минус длииа перекрытия. Второй шаг - идентификация мутации. Для этого матрица гибридизуется с немеченой ДНК. Вторая гибридизация проводится с набором меченных пентамеров (очевидно, что точность определения места должна быть <5 нт). Пентамерн - используются как дополнительный зонд, как например при "sandwich hybridizaitoc" (Вилл and Bassel1, 1977). Наш подход отличается тем, что гибридизация с пентамером должна не ' только " обладать' специфичностью . к последовательности анализируемой ДНК, во и образовывать продолжение дуплекса с иммобилизованным олигонухлеотидом. Как показано на рнс. 6 (яркие точки) мы получаем гибридизацвоиый сигнал только в том случае, когда "пятерка" образует правильный продолженный дуплекс, стабилизированный стэкинг взаимодействием. Гибридизация выявляет внутренние мисматча (Рис. 6В) и З'-концевне (Рис. 6В) "пятерки". Стабильность "длинных" дуплексов невелика, так что пятерка может быть отмыта н новый набор гибридизован ва матрицу.По крайней мере 10 таких гибридизаций можно проводить с матрицей иммобилизованных октамеров без заметной диссоциации основного дуплекса.

Подход гибридизации встык позволяет значительно упростить матрицу, уменьшив количество иммобилизованных олигонухлеотидов. На рис. 7 показана схема сравнения набора олигонухлеотидов для определения двух Любых мисматчей в положении X и X. ' В случае иммобилизованных ■ олигонухлеотидов (А) требуется гибридизация флуоресцентно меченной ДНК с матрицей из 16 октануклеотидов. В1 случае гибридизации встык (В) достаточно двух иммобилизованных октануклеотидов, гибридизации с

немеченой ДНК и ве более четырех гибридизаций с набором "пятерок"

меченнпх

5'-CCTGGGCAGGTTGGTATCA-3' matrix-GGACC.CGT-5 '

3 ' "-CCAAC-TMR З'-CGAAC-TMR 3'-CCAAC-TMR matrix-GACCCGTC-5 ' '

3'-CAACC-TMR 3'-CAACC-TMR - З'-AAACC-TMR

А.

В.

Рис 6. .Модельный эксперимент по применению гибридизацир тесхык диагностшси. Сначала немеченый 19-мер гнбриднзовали на матрицу с иммобилизованными "восьмерками" (размер квадратов 40x40 рш). Затем матрицу гибридизовали с с набором из двух флуоресцентно меченных "пятерок". Гвбридизованные "пятерки" составляли продолжение дуплехса с "восьмерками".

А.

5'____ССТ GGG CAG ОТ GG2 АТС AAG GTT--3' ДНК мгаень

matix 3' -С уАА ССх Т-5 ' 16 икмобшгозовавяых

"восьмерок" • • •■

в. ■

5'____ССТ GGG CAG ÏTT GGI АТС AAG GTT.-3'

3 ' - GGA ССС GT- 5 ' 1-я иммобилизованная

"восьмерка"

3' -С ВАА С-5' 4 мечесне пятерки

3 ' -СС GTC - САА-5 ' 2-я иммобилизованная

"восьмерка"

3'- ССЕ ТА- 5' 4 меченые пятерки

Рис 7. Различные подходы в создании матрицы для определения всевозможных мутаций в положениях 2 н 1«. Обычно используется матрица (А) из 16 олигонухлеотидов для определения двух близко расположенных замен оснований. Проводится гибридизация с меченной мишенью, после чего выявляется мутация. Мы предлагаем использование также дрогой подход (Б) Гибридизации встык, матрица из двух олигонухлеотидов гибридизуется с немеченой пробой н затем гибридизуется с набором "пятерок". Мутация определяется из гибридизации с флуоресцентно меченными "пытерками". 3 тексте ранее описвались приведенные эксперименты.

Обсуждение результатов ... Основной результат даввой работы. - это практическое использование метода гибридизации с набором олагонуклеотидов на матрице для анализа последовательностей ДНК."проведена диагностика образцов ДНК, полученных, из крови реальных больных с синдромом (1-таласеемия. Диагностика не требует использования радиоактивно меченных препаратов, поэтому мохет применяться для хлввнческих исследований. Кроме того создав целый исследовательский комплекс, включающий производство мшсроолигоматриц,

I

детектирующий прибор н систему для авализа изображения.

Использование гелевого носителя для создания олигоматрица имеет ряд преимуществ: высокая емкость иммобилизации в гибридизации; применение флуоресцентной детекции; физико-химические свойства, увеличивающие дискриминацию мисматчей и предлагающие выравнивание эффективной стабильности дуплексов разного состава.

В рабсте показана необходимость фрагиентировать ДНК для получения достоверной гибридизации с короткими олигонухлеотидами. Фрагментирование предотвращает образование вторичной структуры и увеличивает эффективность гибридвзации. Надо отметить, что этот вопрос плохо освещен в литературе. Во первнх, обычно для детектирования мутаций применяются длиннне олигонухлеотиды (около 20 нт). Во-вторнх, , работа с радиоактивными изотопами не требует повышения сигнала, который можно всегда "вытянуть" с помощью длинных экспозиций. В-третьих, подобие фрагментации используют не обращая на это внимание. Например, прн закреплении ДНК на фильтре и гибридизации с короткими олнговуклеотидамв. "Сшивка" ДНК с мембраной есть не что иное как разрушение оснований ДНК за счет "сшввхи" или фрагментация. В работе мы предлагаем несхолько методов фрагментирования.

Свойства полнахрвламвдвого носителя используют для процедуры обогащения смеси различных фрагментов последовательностями, способными гнбридизоваться с олигоматрицей. Этот процесс во многом напоминает аффинную хроматографию. Кроме того обогащение уменьшает уровень ошибок при гибридизации ("false positive signals"), вызванных повторами стабильных мисматчей.

Использование олигоматрица не требует обязательного мечения молекула ДНК перед гибридизацией. Окрашивание немеченых дуплексов бромистым этидием позволяет проводить регистрацию образования дуплексов дискриминацию дуплексов несущих одиночные замены от правильных

дуплексов. Увеличить чувствительность данного подхода может применение интеркалирующих красителей с большим сродством к дуплексам по сравнению с иммобилизованными олигонуклеотидакв. Более того можно использовать любые • другие лигандв, узнающие дуплекса.' Огромней спектр таких лиганд известеа из исследований лекарственных препаратов (Корка, 1992). Некоторые нз лигавдов могут быть флуорофорами (Boechst, DAP1) или легко модифицирована для присоединения флуорофора. Надо отметить весколько важных свойств этих реагентов. Во-первых, связывание возрастает при высокой ионной силе. У интеркаляторов наоборот, поэтому необходимо использовать высокие ковцеитрацаи интеркалирущего флуорофора, что приводит к неизбежному возрастание фона. Кроме того, наиболее известные лиганда имеют сродство к AT богатым участкам,' причем связывание часто усиливает стабильность этих участков. В любой случае такие лиганда могут выступать еще одной возможностью для выравнивания стабильности дуплексов разного состава.

Несмотря на большие преимущества интеркалируодих красителей при регистрации дуплексов, подавляющая часть экспериментов построена на использовании флуоресцентно меченной мишени. Гибридизация с флуоресцентно меченной ДНК позволяет проводить измерения в режиме j реального времени. Отмвьочвнй процесс можно проводить до тех пор пока

сигнал от дуплекса с мисматчем не достигнет уровня фона, что означает ' _ оптимальную дискриминацию (Споазас,1990).

Вместе с тем в работе демонстрируется подход к диагностике, когда ве требуется достижения васокой степени дискриминации. Внимательно ! проведенный анализ рисунка гибридизации дает достаточно информации о

ДНК. Принцип проведения такого анализа - это учет всех дуплексов имеющих не более одного кисматча. При этом олигематрица должна обеспечивать условия для такого анализа, то есть быть нетривиальной I (содержать весколько олигонуклеотвдов с похожими последовательностями).

I Asanas рисунка гибридизации - это еще один метод подтверждения мутации

уменьшающий вероятность неправильного днагваза: Как известно точность постановки правильного диагноза относится к важнейшим этическим задачам медицины.

Последовательности олигонухлеотидов для матрица могут бить выбрана на основе представленных экспериментов, о влиянии стабильности дуплекса от положения мисматча. В работе представлен эксперимент из которого следует, что замена должна находиться в центральной части или недалеко от 3' конца закрепленного олкгонуклеотнда. Для перекрывающихся мутаций

мохвоэссгда подобрать набор, который покроет'эти мутации, например, как на рас 1.

Набор слигонухлеотидов ва матрице мохет существенно быть уменьшен если кз воспользуемся методом гибридизации "встнх". Информацию о последовательности получают от иммобилизованных олиговухлеотидов, во главным.образом, из серии дополнительных гибридизации с флуоресцентными' "пятерками".

Метод гибридизации встык состоит ,из двух стадий гибридизации: с меченной ДНК и немеченой ДНК плюс набор "пятерок". Использование интеркалируюшего красителя устраняет мечение ДНК. Ннтеркалятор поможет. в регистрации образования. дуплекса с закрепленными олигонухлеотидаки. Ннтеркалятор мохет быть отмыт или вспопьзоваи для возбуждения IMF (Мвгдау,1994).

Ml' рассматриваем метод гибридизация "встык" как наиболее обнадеживающий при анализе генного полиморфизма. Для этого предлагается создать перекрывающийся набор олнгонуклеотидов, сокрывающий данный ген. Промежутки в перекрытии равны 5 нт и исследуются с помощью гибридизации встык. Например, для последовательности 1 кб требуется около 200 иммобилизованных олпгонуклеотндов и упрощенный набор всех "пятерок" (см ниже). Очевидно, что в набор можно добавлять пятерка с отличием в одно основание,, т.е. вида 5'- ЫШНИ,. где L - фиксированное основание, а N -любое из Л, 7, G, С. Причем, первые 4 раунда дают значение L. Чтобы определить всю последовательность требуется не более чем 20 (4 х 5) гибридизаций встык (правда для случая замены, а не делеций). Случай делеций также мохет быть разрешён с учетом гибридизации и поведения при отмывке дуплексов с иммобилизованными олигонуклеотидани. Низкая стабильность таких дуплексов мохет указать на возможность делеций и другой алгоритм гибридизации встых должен быть использован.

Выводы

1. Работа демонстрирует работоспособность комплекса, состоящего из олигоматрицы, флуоресцентной детектирующей системы и программы для анализа полученного изображения..

2. 'Изучены свойства гель-иммобилнзованных олигонуклеотсдов. Показано, что иммобилизация олигонухлеотидоэ в геле позволяет получить очевидные преимущества по сравнению с гибридизацией на поверхности. Гелевне квадраты могут быть уменьшены в размере, что открывает возможность использования флуоресцентных меток с очень высокой чувствительностью.

3. Гель-вммобшшзованные олиговуклеотнды имеют высокую доступность для гибридизации (емкость гибридизации около 70 %). Это свойство использовали для регистрации дуплексов окрашиванием интерк&пяторвди.

4. В работе применяются гибридизация и отмывка флуоресцентно меченных ДНК мишеней совместно с измерениями в режиме реального времени. Таким образок проводятся кьн&тические измерения всех бнстропротекающих процессов п достигаются оптимальные услог.ия для дискриминации правильных дуплехсов.

5 - Езученн свойства матрицы с иммобилизованными короткими олигонукЯеотЕД'ами' (до 10 вт.)'при гибридизации с длинными ^до 200 нт.) " ПЦ? продуктами. Предложен методический подход (фрагментирование длинных ДНК последовательностей) для получения достоверной гибридизации с иммобилизованными олвгонухлеотидами.

6. Демонстрируется использование гибридизации встык для диагностики и анализа генного полиморфизма. Гибридизация встык уменьшает число элементов олигоматрицы без снижения информативности.

7. Проведенные эксперименты демонстрируют возможности матрицы гель-смнобнлизованных олнгонуклеотидов для анализа последовательностей ДНК и диагностики генетических заболеваний.

Содеря&язха диссертации изложено в сяедужщях работах:

I. Храпко,К.Р., Хорлин.А.А., Ивавов,И.Б., Чернов, В. К.. Лисов,!).П., Василенко,С. . К., #>лорен?ьев,В. П., Мнрзабехов,А.Д. • "Гибридизация с олигонухлеотидамп, оагобияизованивми в геле: удобный метод регистрации одиночных замен оснований." Мол.бвол. 25(3) стр.718-730.

2'. Xhrapko,K.R., Lysov,Xu.P., . Chernov, В. К., Ivanov,I.B., '

Florentiev,V.L. & Mirzabekov,A.D. (1991) A method for DKA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. J. МЫ Sequencing. and Happing1, pp.375-388.

3. Ivanov,I.B., Khrapko,K-R., Chernov,B.K-, Lyeov,Yu.F., Florentiev,V.L. and Mirzabekov,A.D. (1991) Hybridization properties of gel-immobilized oligonucleotides. Unci. Acids Res., 24, H9-190.

4. Khorlin,A.A., Khrapko,K.R., Xvanov,I.B., Lysov,Iu.P., iershov,G.K., Vasilenko,S.X., Florentiev,V.L., Mirzabetaw,A-D. (1991) An oligonucleotide matrix hybridization approach to ЯП sequencing. Had. Acids Res., 24, 191-192.

5. Лпфпгац,И. A., Иванов, И.Б., Нврзабеков,А.Д. , Фпорентьвв,В.П. (1993) "Секвенпрование ДНК гибридизацией с олигонухлеотндиой матрицей (СГОМ). Теория отмывки ДНК после гибридвзации." Нол.бнол. 26(6) стр.1298-1313.

■6. Ivanov,L., Kirillov,E., Barsky,V.E., Xreindlin,£., Parinov,S.,-Timofeev,E., Yershov,G., Florentiev,V.L., Mirzabekov,A.D. Sequencing by Hybridization Workshop (Houston) 1993 r,

7. Ivanov,I., K£rillov,E., Barsky,V.E., Kreindlin.E., Parinov.S., - Timofoov,E., - Tershov,G., Florentiev,V.L., Hirzabekov,A.D.

"Oligonucleotide Microchip is a Versatile Tool for UNA Analysis: Diagnostics Applications" Cold Spring Barbour Conference »-15 May, 1994

8. I.lvanov and A.D. Mirzabekov DNA diagnostics by using an oligonucleotide matrix. Materials of International Scientific Summer School "Biosensing Materials" Pushchino, Russia, July 7-13, 1994.

9. Ivanov,I., Parinov,S-', Kirillov,E., Barsky,V.E., Kreindlin,E., Timofeov.E., Yershov.G., Florentiev,V.L-, Kirzabekov,A.D-"Oligonucleotide microchip on gel supportas an instrraent for DNA analysis" Sequencing and Genome Mapping Conference of ВОЕ (Santa' Fe) 1994

10. Xhrapko,К.R., Khorlin,A.A., Ivanov,I.B., yerehov,G.M. , Lysov,Y.P., Florentiev,V. L., Mirzabekov,A.D.(1991), pataat, Method and Device for Determining Nucleotide Sequence of DNA. SO. (FCT/RU92/00052).

II. Yersbov,G.M., Ivanov,I.B., Timofeev,E., Iirillov,E.V., Florentiev,V.L., Mirzabekov,A.D. (1994), patent, Russia. (93040901), A method for immobilizing water-soluble bioorganic compounds onto a capillary porous carrier

Подавсано к печати,^ X в 199 ^г. Отпечатано на ротапринте в Формат бумага 30x42/1 Производственном комбинате ■ Объем п. л. Литературного фокса Зак."^Р- 100