Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность и полиморфизм белков облепихи (HIPPOPHAE RHAMNOIDES L. )

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность и полиморфизм белков облепихи (HIPPOPHAE RHAMNOIDES L. )"

РГО од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

РАСТЕНИЕВОДСТВА имснм Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

ТОКАРЕВА Инесса Васильевна

УДК 634.743:581.19:547.96

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ ОБЛЕПИХИ (Н1РРОРНАЁ КНАЛ\|\010Е$ 1.)

Специальность: 03.00.04 — Биохимия

АВТО Р Г. Ф Е Р А Т

; диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1993

Работа выполнена в отделе молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства имени Н, И. Вавилова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И. П. Гаврилюк.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. П. Комов; кандидат биологических наук С. А. Стрельцина.

Ведущее учреждение — Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН.

Защита диссертации состоится «У/» мая 1993 г. в часов на

заседании Специализированного совета Д 020.18.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском . институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, г. Санкт-Петербург,1 Большая Мор-с;<ая, 44.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке Всероссийского на-учно-исследов&тельского института растеииеводства им. Н. И. Вавилова.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

' Э. А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Облепиха - ценное витаминное, лекарственное и пищевое растение. Для успешной селекции ее необходимо разрешение ряда проблем: выявление генетической изменчивости и отбор ценных генотипов, а также определение пола на ранних стадиях развития растений, подбор исходных родительских форм. В связи с широким распространением облепихи актуальна идентификация, регистрация и паспортизация тлеющегося генофонда культуры, установление его подлинности и оригинальности.

Для решения подобного 'рода проблем в настоящее время широко используются полиморфные белковые системы в качестве генетических маркеров (Конарев Б.Г., 1983). Сведения о белках облепихи, их составе, свойствах и полиморфизме практически отсутствуют.

Пёль и задачи исследований. Целью данной работы явилось изу-ченйе гетерогенности и полиморфизма белков семян и вегетативных органов облепихи и оценка возможности использования их как маркеров в сортовой идентификации и регистрации генетических ресурсов культуры, отборе и анализе генотипов на ранних этапах развития растений. В связи с этим в задачи работы входило:

- изучение состава и гетерогенности белков семян облепихи;

- выявление 'изменчивости субъединиц и полипептидов запасных глобулинов семйн;

- оценка степени полиморфизма белков семян и перспективы использования их в сортовой идентификации культуры;

- изучение компонентного состава и изменчивости гистона Н1 почек облепихи;

- выделение и исследование запасных белков лиотьев;

- изучение изоферментного состава пяти ферментов почек 'облепихи: лейцинаминопептидазы, пероксидазы, эстеразы, аопартат-амикотрансфврази, супероксиддисмутазы;

■ - оценка возможности использования изофер;лентных систем в сортовой идентификации и анализе генотипов на ранних стадиях развития растений.

Научная новизна работы. Впервые изучены гетерогенность и полиморфизм белков семян, листьев и почек облепихи в связи с поиском белков, перспективных в качестве маркеров. Исследованы состав и свойства оубъедишщ и полипептидов глобулиновой фракции

I

белков семян. Установлена сортовая специфичность спектров кислых полипептидов 113 глобулина. Впервые выделены и исследованы белки вегетативных органов облепихи: гистон Н1 почек и запасные белки листьев. Показана мономорфность компонентного состава этих белков. Установлен полиморфизм„изоферментных систем лейцинамино-пептидазы, эстеразы, супероксвддис^тазы и катодной пероксидазы почек облепихи, обнаружена специфичность их состава для 17 сортов культуры. Установлено, что анодная пероксидаза и аспартат-аминотрансфераза почек характеризуются мономорфностью по составу изоферментов. ■ • ;

Практическая значимость работы. Установлена возможность использования запасных белков семян и ферментов лейцинаминопепти-дазы, эстеразы, супероксцвдисцутазы и катодной лероксццазы почек для характеристики, идентификации, регистрации и различения сортов облепихи. Указанные изоферментныэ системы рекомендованы для сортовой идентификации и оценки генотипов на ранних стадиях развития растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на заседании Ученого совета НИИ садоводства Сибири им.М.А.Лисавенко (г.Барнаул, 1990), на .конференциях аспирантов и молодых ученых ВИР им.Н.И.Вавилова (г.Санкт-Петербург, 1991, 1992). [__.

Публикации. Материалы исследований опубликованы в 3 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста й состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературу. Работа иллюстрирована 29 рисунками, включает 13 таблиц. Список литературы содержит 189 источников, в том уисле II? на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследований послужили семена,, почки и листья 30 сортов облепихи селекции НИИ садоводства Сибири им.М.А. •Лисавенко (г.Барнаул) и коллекции Павловской опытной станции ВИР им.Н.И.Вавилова.

Экстракцию белков семян осуществляли трис-глициновым буфе-' ром (рН 8,3), содержащим 0,1% додецилсульфата натрия (ДСН), со-глНсно методическим указаниям (1990). Для вьщеления глобулинов

использовали метод криопреципитации. При этом к суммарному- белковому экстракту добавляли пять'объемов охлажденной дистиллированной воды, сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием и.растворяли в минимальном объеме трис-глнцинового буфера •(рН 8,3). При изучении полипептидного состава использовали восстанавливающий агент - меркаптоэтанол. ДСН-элзктрофорез проводили в 12,5Й-ном полиакриламкцном геле (ПААГ) по U.K.Laenimli (1970). Электрофореграммк окрашивали 0,2£-ннм раствором Кумасси Н-250.

Вегетативные запасные белки экстрагировали из листьев 20 мМ трис-HCI буфером (рН 7,6), содержащим I М этилендиаминтетраук-сусную кислоту и 4 tli дитиотреэтола (v/ittenbach. V.A. , 1932), с последующим высаливанием сернокислым аммонием в пределах концентраций 2 М - 2,8 М. Электрофоретическое разделение проводили в 15^-ном ДСН-ПААГ', а также в градиенте ПААГ от 9 до 18$. После электрофореза гели фиксировали в 20%-ном растворе трихлоруксус-ной.кислоты (Т/У), для окрашивания использовали 0,2^-ный раствор Кумасси R-250 , 0,1л™ный раствор нитрата серебра (Heukeshoven I., Derniok R. , 1983), реактив Шиффа (Kapitany R.A., Zebrowski E.J., 1973).

Для выделения гистона Н1 почки облепихи гомогенизировали в 0,15 М растворе NaCl . Из осадка, отделенного центрифугированием, гистон экстрагировали 5£-ной хлорной кислотой. Осаждение белка проводили', добавляя к экстракту серную кислоту до концентрации О,о И и б объемов ацетона (Беляев А.И., Бердников В.А., 1981). Электрофорез гистона Н1 проводили в 15Й-ном ПААГ, содержащем 0,9 М уксусную кислоту и 6,25 М мочевины (PanyimS., Shalkley R., 1969). Гели окрашивали O.OaS-hkm раствором Кумасси R-250 в 0,9 М уксусной кислоте.

Извлечений ферментов из почек облепихи осуществляли в соответствии с методикой, описанной D.E.Pai-fitt с соавторами (1985). Почки, предварительно обработанные яидким азотом, растирали в 0,0о М трис-цдаратном буферз (рН 7,5), содержащем аскорбиновой кислоты, б,84Й сахарозы. 1% гюлиэтиленгликоля (¿1.Ы.3000), 10% поливинилпирролидона, 0,1% цистеин-HCI. Полученный после центрифугирования супернатант использовали непосредственно для нанесения на гелевую пластину. Для разделения изоферментов использовали гель-электродные буферные системы по В.Э.Яаска (1974), R.A.Reiafeld (1962) и В.J.Davie (1961) и 7,5^-ный ПААР. Гисто-

химическое'выявление ферментов осуществляли с помощью реакционнее .смесей, состав которых определялся в соответствии с методическими указаниями по электрофоретическому изучению изофермен-тов, разработанными в отделе молекулярной биологии ВИР (1991), и методами, описанными З.ЛоЙда.с соавторами (1982).

Достоверность различий между сортами определяли с использованием стандартного критерия \ ^ (Плохинскнй Н.А., Ыаркелова И.О., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Запасные белки, семян облепихи

Субъединичний и полипептидный состав. Электрофорезом выявлена высокая степень гетерогенности восстановленных белков семян. В зависимости от сорта электрофоретические спектры (ЭФС) этих белков могут содержать от 18. до 32 компонентов с молекулярными массами от 10 до 80 кС . Они пронумерованы нами в порядке увеличения их подвижности и условно разделены на 4 зоны. Первая представлена компонентами с массой более 65 ко , вторая - от 45 до 65 кБ . Третья включает белки с молекулярной массой 25-45 ко и четвертая - менее 25 № . Первая и вторая зоны характеризуются стабильностью. Они содержат, как правило, до- восьми компонентов, дьа из них, располагающиеся на границе с третьей зоной, минор-низ. Четвертая группа включает до 10 позиций, для нее также установлено постоянство состава. Лишь у одного сорта - Дар Катуни - отмечена изменчивость данной зоны, затрагивающая первые два белковых компонента с номерами позиций 75 и 77. Третьд зона является преобладающей в количественном отношении. Она-может содержать разное количество компонентов, общее число которых в ЗХ не превышает тринадцати. Эта зона является наиболее вариабельной.

Сравнительный анализ компонентного состава глобулиновой.и суммарной фракций белков семян показал, что' ЭФС последней представлены в основном глобулинами. Альбуминовой фракции в спектрах принадлежат минорные компоненты первой зоны и компоненты четвертой зоны с молекулярными массами менее 17 кБ .

При электрофорезе в присутствии ДСН фракция глобулинов, полученная методом криопреципитации, дает 4-7 типов субъединиц с молекулярными массами более 65 кВ (рис.1).

Рис.1. Субъедкнкчный (А) й полипептидный (Б) состав глобулинов 65kD суммарной навески семян сорта Дгр 45kD Катуни. 12,53 ДСН-ПААГ, pH 8,8. 25kD ® ~ в1^11тюп°Лобте, Л - легуми-ноподобные глобулины; КП - кислые 17кЕ • полипептиды, ОН - основные гтолг-

пелтедн 11S глобулина; М - метчи-А Б М ки молекулярных масс.

!

Основная часть субъединиц в восстанавливающих условиях диссоциирует на две группы полкпептидов с массами 17-25 kD и . 35т45 kD (ркс.1). Две субъединицы при добавлении восстанавливающего агента - меркаптозтанола'- не меняют своего положения в ЭК. Одна, преобладающая в количественном отношении, имеет массу более '70 kD , вторая - менее интенсивная - около 65 kD . Кроме того, зарегистрированы три белковых компонента в области молекулярных масс менее 17 kD , которые также не изменяются при действии восстановителя. На основании этих данных глобулины семян облепихи были идентифицированы как вицилино- и легуминопо-добные. Вицилиноподобными являются 2 компонента с молекулярными массами 65 и более 70 kD . Две группы полипептидов с массами 17-25 kD и 35-45 kD относятся соответственно к основным и кислым полипептидам 11S глобулина. Низк омолекулярные компоненты предположительно являются белками глобулиновой 'природы, аналогичными 2S-33 белкам других культур ( Scholz G., Schlesier Б., 1975). ■ .

В связи с тем, что изменчивость связана в основном с кислыми полипептидами' 11S глобулина и их можно легко идентифицировать в спектрах, мы- посчитали целесообразным акалгаирорать альбуми-но-гл'обулиновую фракция белков саган, не прибегая к ее фракционировании.

Полимор{кзм запасных белков семчн. Для изучения внутри- и межсортового полиморфизма запасных белков бтгап взяты семена 5 сортов облепихи, различающиеся меиду собой происхождением и комплексом мор^олого-биохимичееккх признаков: Дар Латуни, Чуй-ская, Превосходная, Великан, Щербинка. Проводился посемянной анализ и анализ суммарной навески семян, взятых как с одного

"1 1 == -в- д SBЕЗ -

кп[ = —

оп[ = ш

+ — — =

растения сорта, так и с разных.

Электрофорезом белков индивидуальных семян выявлен значительный внутрисортовой полиморфизм полипептидов запасных глобулинов у всех изученных сортов. Изменчивость установлена и для субъедгаичного состава, однако..полиморфизм полипептидов значительно выше. При этом первая, вторая и четвертая зоны ЭФС белков консервативны. Изменчивость Э£С связана с областью кислых полипептедов 11S глобулина. Основные полипептццы демонстрируют слабую степень полиморфизма, зарегистрированную, главным образом, у сорта Дар Кату ни. ■ .

У пяти сортов выявлено 70 различных типов ЭФС, лишь 9 из них представлены у большинства сортов. Каждый сорт характеризуется общим числом типов спектров, определенным их сочетанием и частотой встречаемости в данной выборке (100 семян), а также редкими и уникальными типами.Э5С. Типы спектров определяли по наличию или отсутствию компонентов кислых полипептедов, принимая во внимание и изменчивость двух белковых компонентов группы основных полипептидов 11S глобулина. Интенсивность компонентов в анализе не учитывалась. Для сорта Дар Катуни установлено 17 типов ЭОС, 4 являются .основными, 3 из которых сортоспецифичны (рис.2). Зарегистрирована изменчивость двух из основных полипептедов с номерами позиций 75 и 77. Наличие данной пары характерно только для этого сорта. Сорт Великан представлен 19 типами ЭХ, основными являются 3, 2 из которых характерны только для данного сорта (рис.2). Всего 9 йз 19¿типов &£С сортоспецифичны. Для сорта Превосходная зарегистрировано 20 типов спектров, наиболее часто встречаются 5 (рис.2). 8 из 20 типов встречены только у данного сорта. 21 тип 3$С установлен для сорта Цуйская. В . основном представлен он 5 типами (рис.2). Всего 10 из 21-го типа Э$С_сортоспецифичны. Самыми полиморфными оказались белки сорта Щербинка. Отмечено 26 типов ЭФС, из которых наиболее раслро- , странены 3 (рис.2). 15 из 26 типов спектров не встречены у других сортов.

Попарное сравнение сортов по показателю частоты встречаемости типов спектров белков с использованием критерия Ц * показало, что установленные сортовые различия являются статистически достоверными (таблД).

*'v Важным моментом в анализе сортовой популяции по полиморфным

—I—

.55-58-60

6

-75 -77-

68^

.35 9 а 31

26 18 12 9 9

22. 19 13

55 58

. 68 77

— 58— ^60

25 17 16 9 9

-77—(—

17 13 12 12 10

—59

Рис.2. Основные типы ЭФС полипептидов 11S глобулина сенян облепихи сортов Дар Латуни (I), Чуйскал (2), Щербинка (3), Великан (4), Превосходная (5). Цифрами по вертикали обозначены номера позиций компонентов, по горизонтали частота встречаемости типов спектров {%). 12,5 ДСН-ПААГ, pH 8,8.

5

Таблица I

о

Значения критерия ^ при попарном сравнении сортов облепихи по показателю частоты встречаемости типов спектров*белков семян*

Сорта Дар Кату ни Чуйская Превосходная Вэлгеан Щэрбпта

Дар Кату ни 57,3 58,6 52,2 61,2

Шуйская. 192,7 50,6 62,1

Превосходная 189,3 138,1 57,3 62,4

Великан 176,3 160,3 125,7 58,6

Щер.бинка 197,8 135,4 104,9 149,4"

2

* Выше диагонали - теоретические значения X » ниже диагонали - фактические; Р = 0,01.

белковым системам семян, как и по другим признакам, является определение- минимального размера выборки, гарантирующего генетическую целостность сорта или популяции. Анализом партий из 20, 50, 100 семян и четырех случайных выборок по 100 семян каждая установлено, что для характеристики сортовой популяции облепихи по основным типам спектра запасного глобулина достаточна выборка в 50 семян. Для нее отмечены все типы ЭФС, характеризующихся высокой частотой встречаемости в пределах сорта. В выборке из 20 семян они представлены не полностью. Увеличение объема выборки до 100 семян сохраняет соотношение преобладающих типов Э$С, приводя к появлению большего числа типов спектров, встретившихся один или чуть более раз. Для четырех выборок по 100 семян каждая установлено приблизительно одинаковое соотношение основных типов ЭФС и появление редких и уникальных типов. Для детальной характеристики сортов облепихи целесообразнее проводить анализ белков не менее 100 семян, что позволяет регистрировать как основные, так и редкие и уникальные типы Э*С.

Исследованием белков, полученных из навесок муки 100 семян одного сорта, выявлено суммирование полилептедных компонентов, составляющих спектры индивидуальных семян. При этом ОФС белков суммарных навесок семян каждого из нескольких растений оказались полностью идентичными.

На уровне суммарных навесок хорошо проявляются межсортовые различия (рцс.З). Они наблюдаются и по субъединичному составу, но в меньшей степени, чем по полипептидному, в связи с более высокой степенью гетерогенности последнего. У сорта Дар Катуни ЭФС белков суммарных навесок представлены компонентами с номерами позиций 55,58,60,75,77. Аналогичные зоны ЭФС сортов Щербинка и Великан включают компоненты, соответственно, 55,58,59,68,77 и 55,58^0,64,77. Сорта Чуйская и Превосходная имеют сходные спектры, однако компонент 59 у первого сорта выражен очень слабр, а _ в некоторых случаях отсутствует, что может служить для различения данных сортов.

Сравнительный анализ спектров белков из суммарных навесок . семян проводили с привлечением других сортов культуры: Сибирская, Янтарная, Обская, Любимая, Лучезарная, Масличная, Пантеле-евская. Спектры первых четырех сортов не отличаются друг от друга'' по- составу компонентов, однако у них отмечены существенные

Рис.3. Элеятрофоретические спектры восстановленных 11S глобулинов суммарных навесок семян сортов Дар Катуни (I), Чуйская (2), Щербинка (3), Превосходная (4), Великан (5). 12,5% ДСН-ПААГ, pH 8,8.

различия по их интенсивности. Подобные различия можно оценивать как визуально, так И'с помощью метода денситометрии. ЭФС остальных сортов характеризуются сортоспеци{ичностью. Анализ- родословной показал, что первая группа сортов имеет общее происхождение, все они получены в результате скрещивания сорта Щербинка с катунской формой, и, следовательно, имеют сходный генотип, что нашо отражение в белчовых спектрах. Лучезарная, Масличная, Пантелеевская различны по происхождению, поэтому и по ЭХ они отличаются от упомянутой группы и между соЗой. Очевидно, что компонентный состав белков, полученных из суммарных навесок семян, позволяет различать сорта, имеющие, разное происхождение. Для выявления внутрисортового полиморфизма и различения сортов, характеризующихся общностью происхождения, необходим анализ белков индивидуальных семян.

Влияние опылителей на состав и свойства запасных белков семян. В связи' с тем, что непосредственно определить принадлежность белковых компонентов одному из родителей не представляется возможным (мужские растения облепихи не плодоносят), мы исследовали белки семян специально созданных моделей.

Для опыления одного женского растения сорта Дар Катуни1использовались разные опылители: сорт Алей, формы 9-66-1333, 35-61-2244 , 7-70-1317. В каждом варианте анализировали 100 индивидуальных семян. Выявлен 21 тип ЭХ, из них 10 являются общими для всех четырех выборок, причем частота их встречаемости в каждой выборке практически одинакова.,II биотипов являются редкими и встречаются один-два раза в той или иной выборке. 4 из 10 указанных типов доминируют во всех четырех выборках. Сравнительным анализом белков из навесок муки 100 семян кавдого образца установлена полная идентичность спектров. Попарное сравнение образ-

Н-

3 4

цов по показателю частоты встречаемости типов ЭФС белков с использованием критерия X ** укалывает на отсутствие статистически достоверных различий (табл.2).

Таблица 2

Значения критерия X ^ при -попарном сравнении образцов-•-моделей сорта Дар Катуни по показателю частоты ветре- ' чаемости типов &БС запасных белков »

Дар Катуни Дар Катуни Дар Катуни Дар Катуни Образцы х х х х ____________35^61-2244_____!__Алей______?-66=1338____7-70=1347__

Дар Катуни

35-61-2244

36,2

Дар Катуни х

____Алей__

Дар Катуни _916б;1338_ Дар Катуни 7-70-1347

23,2

11,68

17,2

30,6

34,8

22,8

24,84

29,1

33,4

26,2

14,92

2

* Выше диагонали - теоретические значения \ ,

ниже диагонали - фактические; Р = 0,01. »

При опъшении материнских растений сортов Дар Катуни, Чуй-ская и Превосходная одним опылителем сорта Алей мы обнаружили различия по типам спектров глобулинов и частоте их встречаемости уже 'при посемянном анализе. Ни один из 21-го типа ЭФС белков семян сорта Дар Катуни не встречен у сортов Чуйская и Превосходная. Из 25 типов ЭФС белков семян сорта Чуйская 12 отмечено у сорта Превосходная. Однако, в этом случае частота встречаемости общих для двух сортов типов ЭФС существенно различает-' ся. По критерию \ гибридные потомства данных сортов достовер-. но различаются между собой ( Л ^ теоретическое «= 24,7; Ц ^ фа-1 ктичоское * 81,0),

Сравнительный анализ белков суммарных навесок семян также позволяет оцонить эти различия. Характерным является то, что 'ейектры белков семян растений-моделей абсолютно едентшны такс*

вым, представленным на рисунке 3. Он иллюстрирует различия между этими же сортами, однако в данном случае опылители у женских растений были разные.

Таким образом, не выявлено какого-либо существенного влияния опылителей на полиморфную зону ЭК запасных белков семян облепихи, на формирование суммарного типа спектра, что позволяет использовать полипептвдные спектры глобулинов для идентификации и регистрации сортов культуры.

Вегетативные запасные белки облепихи

Данные, касающиеся структуры и функций вегетативных запасных белков ( узр ), в литературе представлены лишь для одной культуры - сои. Методика, предложенная У.А.УМ.иепЪасЬ (1982) для УЗ? сои, позволила осуществить экстракцию У5Р из листьев облепихи. Из различных вариантов электрофореза Ои^епЬасЪ У.А. , 1982; йарр 41.1), et а1. , 1990) для УЗР облепихи наиболее приемлемым является электрофорез в 15%-ном ДСН-ПААГ. Выявление УЗР облепихи красителем Кумзсси К-250 требует обязательной предварительной фиксации белков ИУ. УЭР культуры легко идентифицируются на электрофореграммах при окрашивании их нитратом серебра (Неи-кевЬоуеп I,, Бегп3.ск И. , 1983).

Фракция, полученная из суммарного белкового экстракта листьев облепихи осаждением сернокислым аммонием в пределах концентраций 2-2,8 М, при ДСН-электрофорезе в ПШ1 дает три группы компонентов, различающихся по молекулярным массам (рис.4). Первая представлена одним высокомолекулярным компонентом, масса -более 65 кв , Вторую составляют два компонента с молекулярными массами около 30 ко . При этом компонент с большей массой преобладает в количественном отношении. Третья группа, подобно первой,' включает одну позицию, масса - ниже 17 и . Характер распределения полипептццов уэр облепихи соответствует таковоцу, установленному для сои (\¥1-иепЬасЬ У.А. , 1982,1983; Парр «.Б.

а1» , 1990). Белки листьев сои представлены тремя главными полипептедами: два - с молекулярными массами 27 и 29 кй и один - около 80 кБ , В связи с этим полипептиды белковой фракции листьев облепихи, составляющие первые две группы компонентов в ЭФС, идентифицированы нами как УЗР , На электрофореграммах'УЗР сои У.А,И1иепЬасЬ (1983), помимо указанных белков., в некото-

Рис.4. Электрофоретичаские спектры белков, выделенных из листьев облепихи трехлетнего (3) и плодоносящего (I) женских и мужского (2) растений. 15$ ДСН-ПААГ, рН 8,8. 4 - метчики молекулярных масс.

рых случаях идентифицировал малые и большие субъединицы Рубис-ко с молекулярными массами соответственно 13 кБ и 53 кП , .которые в небольшом количестве остаются в частично очищенной фракции у5р . Низкомолекулярный компонент в спектрах узр облепихи предположительно представляет собой малую субъединицу- Ру-биско.

При воздействии черкаптоэтанола положение полипептидов узр облепихи в. ЭФС не меняется. Белки дают характерное окрашивание на сахара с реактивом Шиффа, то есть являются гликопротеинами.

• Эти данные хорошо согласуются с литературными. Установлено, что

* УЗР у сои представлены как гомодимеры (£7 кБ /27 кБ , 29кО/29кО) и гетеродимеры (27кБ /29 кЬ), в образовании которых дисульфид-ныа связи не участвуют. Эти полипептидн содержат один гликози-лированный участок (staзwiok Р.Е. , 1988; Иарр вt а1. , 1990).

С целью выявления изменчивости данных белков, мы исследовали соответствующие белковые экстракты из листьев, взятых с растений разных сортов облепихи, листьев мужских, а также трехлетних неплодоносящих женских растений. Сравнительный анализ пока-.эал полное отсутствие полиморфизма уэр (рис.4). Можно предположить, что вегетативные запасные белки эволюционно более консервативны, чем запасные белки семян, для которых характерны высокая частота мутирования и быстрая 'фиксация аллелей в геноме, что приводит к специфичности состава полипептидов, у линий и сортов (Конарев В.Г.* 1983). Интересно то обстоятельство, что узр были выделены и из листьев мужских растений, которые не плодоносят. В ЭФС они значительно интенсивнее, чем в спектрах женских растений. Известно, что уэр используются в процессе созревания семян, когда идет их интенсивный отток из запасающей тккни листа. Зрелые листья облепихи были собраны после цветения растений, в период начала формирования семян, чем и объясняется

65 М> 30 кР

17 кР

незначительное содержание белков в листьях женских растений.. Можно предположить, что у многолетнего растения узр могут накапливаться не только перед формированием семян, но и в период закладки зимующих почек, что могло бы послужить критерием отбора на готовность растения к перезимовке. Возможны различия в динамике накопления этих белков в листьях мужских и женских растений в связи с необходимостью большего количества запасных • веществ для формирования пыльцы мужскими растениями. Такие различия могли бы быть использованы в разрешении проблемы дифференциации пола у облепихи. Однако, для этого требуются дополнительные исследования.

Тот факт, что вегетативные запасные белки, изученные, ранее только у сои, впервые выделены у многолетней культуры, является одним из первых свидетельств универсальности узр у растений. Насколько универсален выявленный у облепихи мономорфизм этих белков можно выяснить только после исследования других видов растений.

Гистсн Н1 почек облепихи

Для выделения и анализа гистона Н1 использовались зияющие вегетативные почки облепихи, взятые с разных растений нескольких сортов, как различающихся, так и близких по происхождению, а также почки мужских растений. Вегетативные почки облепихи формируются уже на второй год развития растения, в связи с чем появляется возможность отбора и оценки генотипов на ранних этапах онтогенеза. К тому же почки, находящиеся в состоянии физиологического покоя, представляйт собой стабильный в функциональном отношении орган, что является необходимым для сведения к минимуму эффекта подобного рода изменчивости.

' Электрофоретическим анализом установлена незначительная гетерогенность фракции гистона (рис.5). В Э5С он представлен тремя компонентами, различающимися по электрофоретической подвижности. Они были пронумерованы нами в порядке возрастания последней. Компонент I - самый медленный и самый интенсивный. Меньшей интенсивностью, но большей подвижностью характеризуется белковый компонент 3. Данные субфракции являютей основными в ЭФС. Компонент 2 - минорный. Он очень близок по. подвижности субфракции I, в связи с чем его не всегда удается идентифицировать в спектрах. В таких случаях происходит слияние данных суб-

Рис.5. Компонентный состав гистона Н1 почек облепихи двухлетнего, и плодоносящего женских и мужского растения. 15$-ныЙ ПААГ.

фракций, поэтому ЭФС гистона Н1 облепихи, как правило, выглядят двухкомпонентными. В настоящее время гетерогенность гистона Н1 является установленным фактом. В основе ее лежат как аллель-НЫЙ ПОЛИМОрфИЗМ ГИСТОНОВЫХ ГеНОВ (Stout J.Т., Phillips P.L. , 1973), так и посттрансляционные модификации, в первую очередь -фосфорилирование (Hohman Р. , 1978).

Сравнительным анализом сортового материала установлено отсутствие полиморфизма гистона Н1 (рис.5). У всех исследованных сортов он представлен двумя основными субфракциями. Различия .между сортами выражаются лишь в интенсивности компонентов. Инвариантен гистон Н1 ив случае мужских'и двухлетних растений.

Из всех типов гистоновых белков гистон Н1 эволюционно более лабилен. Видовой и внутривидовой полиморфизм установлен для гистона Н1 злаков и бобовых (Stout J.Т., Phillips P.L. , 1973; Жебентяева Т.Н., 1984; Богданова B.C., 1989). Изменчивость белка, обнаруженная у однолетних растений, обсуждается в связи с адаптивным характером аллельных замещений в локусах гистона Н1. Выявленный нами мономорфизм гистона у облепихи может сввдетель-, ствовать о том, что у многолетних растений механизмы адаптации отличаются от тех, в которых принимает участие гистон Н1 .

Изоферментные системы почек облепихи

Изучение ферментных систем вегетативных органов облепихи осуществлено впервые, в связи'с чем для работы отбирались ферменты, достаточно хорошо охарактеризованные биохимически и генетически у других ввдов растений.

При изучении изменчивости зинограмм ферментов у 17 сортов облепихи установлен полиморфизм EST, lap, катодной prx и SOD. Спектры изозимов различаются числом дискретных компонентов (рис.6).

Алт-г^— — — — ААТ-1 С— — — —

+

В

,, рих-гЩ— — — — =. == = = — = —

1 2 з 4 5 6 7 8 9 Ю 11 г

ЕЗТ-4С= '_ = = — — — —

Езт-г[3— =Е ^ Ш — — ~~; =

ЕЭТ-^— = — ■ ЕЕ ЕЕ- = — = = =

1 2 3 4' 5 б 7 8 '9.Ю

д

+

ЬАР-тС— —

1 2 3..4 5

Бои-гС — — . — .

1 2 3 .4 5 6 7 8 ' 9 Ю 1-1 12

Рис.6. Типы изозимных спектров аспартатаминотрансферазы (1), анодной (Б) и катодной (В) пероксидаэы, эстеразы (Г), лейцинам инопептццазы (Д), супероксиддисмутазы СВ) почек 17 сортов облепихи. 1, .

Аспартатаминотрансфераза (К.$.2.6.1.1). Зимограммы фермента образованы двумя зонами: AAT-I, расположенной в центральной ча- . сти спектров, и зо^ой катодной части ЭФС - ААТ-2 (рис.б). AAT-I включает 2 компонента: медленный - минорный и бытрый - основной. ААТ-2 представлена быстрым, медленным и средним по подвижности компонентами. Обе зоны'мономорфны у всех исследованных сортов.

Дероксидаза (K.i.I.II.1.7). При электрофорезе в щелочном геле PRX разделяется на 3 зоны. Более подвижная содержит 3 ми-. норных компонента, средняя и медленная по подвижности - 2 и I, соответственно (рис.6). Анодная PRX мономорфна. Катодная PRX представлена четырьмя зонами ферментативной активности, г зоны - РНХ-1 и PRX-4 - инвариантны и включают только минорные'компоненты. Полиморфизм характерен для PRX-2 и FRX-3 (рис.6), локализованных в цеуТ.'>льной части спектров. PRX-2 состоит из двух основных изоформ, PRX-3 включает 3-4 изофермента. Типы ■ спектров катодной PRX специфичны как для отдельных, так и для групп сортов. Для 17 исследованных образцов установлено II типов ЭФС (рис.6). 4 изоферментных фенотипа объединили 10 сортов, по 2-3 сорта - каждый. Идентичность спектров в пределах групп хорошо согласуется с родословной сортов. 7 типов ЭФС рнх специфичны для каждого отдельного сорта.

Эстераэа. Спектры эстеразы насчитывают 4 зоны активности: EST-1, EST-2, EST-з, EST-4 . Зона EST-3 представлена минорными компонентами, которые в большинстве своем мономорфны. Хорошая активность отличает анодную зону EST-1 , которая включает 3 изо-' формы, 2 из них мономорфны. Высокую степень полиморфизма демон-cTpiq?yx>T EST-2 и зона катодной части спектров - EST-4 , содержащие 3 и 2 молекулярные формы соответственно. Для EST установлено 10 типов, спектров, идентифицированных по EST-1, ЕЗГ-2 и EST-4 ( (рис.6). Лишь 5 из них специфичны для одного из 17 сортов . облепихи. Остальные 5 встречаются с одинаковой частотой, объединяя группы по 2 сорта каждая.

.Лейцинайинопептидаза (К.$.3.4.II.I). В почках облепихи эк. спрессируются две'зоны lap - lap- 1 и lap-2 (рис.6), локализованные в центральной части спектров зимограмм. lap-1 представлена тремя различающимися по подвижности изоформами. Спектры LAP-1 образованы одной или двумя из них. В зоне lap-2 .присутствуют медленный и быстрый компоненты, которые могут быть пред-

ставлены в спектрах совместно или отдельно один от другого. Для lap установлена незначительная степень сортовой изменчивости. 17 сортов характеризуются лишь пятью изоферментными фенотипами lap . Основными являются 3, встречающиеся с одинаковой 'частотой.

Схшрок^и^^исму.таза (К.4.1.15.1.1). Наиболее гетерогенна из всех ферментов. Спектры содержат значительное количество компонентов, как основных, так и минорных. Они насчитывают' 3 зоны активности: sod-i, sod-2 и sod-з Срие.б). Большая часть компонентов средней по подвижности зоны sod-2 инвариантна. Изменчивость зарегистрирована для одной изоформы, в связи с чем она представляла зону sod-2 при учете типов спектров. Значительная вариабельность установлена для sod-1 , составляющей анодную-часть спектров, и sod-3 . sod-1 включает 3 изоформы, самая быстрая из них мономорфна. sod-з из четырех содержит I инвариантный компонент. sod - самый полиморфный из всех изученных ферментов. Изменчивость ее изучали на 15 сортах облепихи. Изофер-ментные спектры SOD .специфичны практически для каждого сорта. Из 15 исследованных установлено 12 типов SSC. Л:пь один тип является общим для трех сортов. Объединение двух из них - сортов Алей и Новость Алтая - характерно с точки зрения родословной. Первый является сеянцем второго. Такое близкое родство -нашло свое отражение в изозимнюс спектрах SOD.

Сравнительный анализ сортов по исследованным ферментным системам позволяет объединить их в группы на основании степени сходства по большинству ферментов (табл.Э). sod при анализе не учитывалась в связи с высокой сортоспецифичностью спектров. Две самке многочисленные группы объединили по четыре сорта. В первую вошли сорта ВИЛ-4, Т-4, Москвичка, Трофимовская, сходные по , изозимным спектрам lap и рнх . Сорт Трофимовская отличается от указанной группы по PRX, однако он близок сорту Москвичка по est , тогда как ВИЛ-4 и Т-4 по эстёразе 'отличаются. Вторую группу составили сорта Новость Алтая, Сибирская, Превосходная, Дар Ка-туни, близкие по lap и езт . Сорт Новость Алтая имеет отличный от данной группы тип спектра по est , однако'он идентичен по типу спектра пероксвдазы сорту Дар Катуни. В следующую группу вошли сорта ВИЛ-3, Самородс; и Приокская. Они близки по спектрам LAP , а также по спектрам ни - ВИЛ-3 и Самородок, EST - Самородок и Приокская. Отдельную группу образовали сорта Талицкая и

Таблица 3

Изоферментные фенотипы четырех полиморфных ферментов у 17 сортов облепихи

№ Сорт Изоферменты

• EST LAP SOD FftX

I ВИЛ-4 I I I - I

2 ВИЛ-3 , ' 2 2 2 2

3 Самородок 3 .2 3 2

4 Т-4 4 I 4 • I

5 Москвичка .5 1 II I .

б Новость Алтая 6 3 II 3

7 Трофимовская .5 I 5 4

8 Талицкая 7 2 4' 5

•9 Сибирская 8 3 б 6 '

10 Превосходная 8 3 7 . 7

II Лучезарная . 9 2 . 8 • 8

12 Щедрая 7 3 9 5

13 Пантелеевская 6 4 10 9

14 АлаЙ (о" ) , 10 ' 5 11 10

15 ' Дар Катуни 8 3 12 3

16 Гордость ЦГД 8 I 5

17 Приокская 3 2 II

■Щедрая, близкие по EST и гах . Сорта Лучезарная, Пантелеев-ская и Алей составили самостоятельные группы. Для мужского сорта Алей установлены индивидуальные типы спектров в случае всех изученных ферментных систем. Характерным является тот. факт, что сорта, объединенные в указанные группы, имеют близкое происхождение.

Генетический полиморфизм, присущий четырем ферментным системам почек облепихи, надежно дифференц4фует большинство сортов, в связи с чем их можно использовать для биохимической паспортизации сортов культуры^ при этом оценку генотипов можно осуществлять на ранних стадиях развития растений.

выводы

1. Солерастворимые белки семян облепихи при электрофорезе в ЛААГ образуют 4 группы полипептидов с молекулярными массами: первая - более 65 к,Р , вторая - от 45 до 65 кБ , третья - 25-45 ко , четвертая - менее 25 кС . Альбуминам принадлежат минорные компоненты первой и четвертой групп. Глобулины представлены ин-^ тенсиьными компонентами всех четырех групп.

2. Глобулины семян облепихи аналогичны вицилино- и легумино-подобным белкам других двудольных. Они обладают способностью к криопреципотации; при разрушении водородных связей дают 4-7 типов субъединиц с молекулярными массами более 65 , большая часть из которых в восстанавливающих условиях диссоциирует на две группы полипептидов, соответствующих кислым (35-45 кВ ) и основным (17-25 кБ ) полипептидам 11Э глобулина. Вицилинопо-добннми являются 2. субъединицы с молекулярными массами 65 кБ

и более 70 кБ .

3. Глобулины облепихи характеризуются высокой степенью внутри- и межсортового полиморфизма. Наиболее .изменчивы кислые полипептиды из глобулина. У исследованных сортов выявлено 70 типов полипептццных спектров.

4. Сорта облепихи отличаются числом типов электрофоретиче-ских спектров глобулинов семян, определенным их сочетанием, частотой встречаемости, редкими и уникальными типами спектров.

5. В листьях облепихи обнаружен гликопротеин, который при электрофорезе в ПААГ проявляет свойства, характерные вегетативным запасным белкам бобовых, в соответствии с чем он идентифицирован как запасной'. Белок представлен тремя полилептадами с молекулярными массами 27, 29 и 80 ко . Дисульфидныэ связи в молекуле белка отсутствуют.. Он характеризуется мономорфностью состава.

6. Гистон Н1 почек облепихи представлен тремя электрофоре-тическими компонентами. Сортовые различия по составу компонентов отсутствуют.

7. Изоферментные системы эстеразы, лейцинаминопептидазы, катодной пероксидазы и супероксиддисмутазы почек облепихи характеризуется значительным полиморфизмом. Электрофоретические спектры изозимов специфичны как для групп, так и для отдельных

сортов. Наибольшой изменчивостью зимограмм обладает супероксид-дис^таза, спектры которой специфичны практически для каждого изученного сорта. Сходством по изоферментным спектрам обладают сорта, характеризующиеся общностью происхождения.

8. Анодная пероксвдаза и аспартатаминотрансфераза у семнад-. цати изученных сортов облепихи мономорфны по изоферментному составу.

практические; рекомендации

1. Запасные белки семян облепихи могут бьтть использованы для характеристики, идентификации, регистрации и различения сортов культуры. Для оценки различий между сортами разного-происхождения пригодны электрофоретические спектры белков суммарной навески из 50 сейш одного растения сорта. Для детальной характеристики сортов, выявления внутрисортового-полиморфизма, а также для различения сортов, характеризующихся общностью про, исхождения, необходим анализ индивидуальных семян. Оптимальный

объем выборки - 100 семян.

2. Изоферментные системы эстеразы, лейцинаминопептидазы, катодной пероксцдазы, супероксидцисмутазы рекомендуется использовать для идентификации, регистрации и различения сортов облепихи. При этом сортовая адентификация и оценка генотипов могут быть осуществлены на ранних стадиях развития растений.

По-материалам диссертации опубликованы следующие работы:

. I, Солоненко Л.П., Токарева И.В., Архипова Т.Н., Шишкина Е.Е., Контарева Н.И. Электрофоретический анализ белков облепихи алтайской селекции// Исследования облепихи и облепихового масла: Тез.докл.- Новосибирск, 1987,- С.12-13.

2. Токарева И.В. Гетерогенность и полиморфизм белков семян облепихи ( тррорЬа'е г11атпо1с1ев Ь.) // Науч.-техн.бюл.ВИР.-1992.- Вып.223.- С.77-78.

• 3. Токарева И.В. Гистон Н1 и легкорастворимне белки листьев и почек облепихи ( ЩррарЪаё гЬолтсааев ь.) // Науч.-техн. бюл.ВИР.- 1992.- Вып.230.