Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Геноидентификация вируса бычьего лейкоза

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Геноидентификация вируса бычьего лейкоза"

На правах рукописи

ЗАКИРОВА ЗУХРА РУСТАМОВНА

ГЕНОИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА БЫЧЬЕГО ЛЕЙКОЗА

06.02.02 — Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

06.02.01 — Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

13 ПАЙ 2015

005568690

Казань-2015

005568690

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович

Научный консультант: доктор биологических наук,

Вафин Рамиль Ришадович

Официальные оппоненты: Васильев Дмитрий Аркадьевич - доктор

биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА»

Байматов Валерий Нурмухаметович, доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры общей патологии имени В.М. Коропова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Федеральный центр

токсикологической, радиационной и

биологической безопасности», г. Казань

Защита диссертации состоится «19» июня 2015 г. в «14.00» часов на

заседании диссертационного совета Д 220.034.01 при Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана по адресу: 420029, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://wvvvv.ksavm.senet.ru/ федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Автореферат разослан « ¿Г » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

4

Трофимова Елена Николаевна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота — хроническое инфекционное заболевание опухолевой природы, возбудителем которого является вид Bovine leukemia virus (аббр. BLV; вирус бычьего лейкоза, сокращ. ВБЛ) рода Deltaretrovirus семейства Retroviridae, согласно международной вирусной таксономии (A.M.Q. King et al., 2012).

Современная оценка генетического разнообразия ВБЛ на основе филогенетического анализа информативного маркерного локуса env-гена с интерпретацией генотипических кластеров построенных дендрограмм (S.M. Rodriguez et al., 2009; А.Ю. Шаева и др., 2012; М. Rola-Luszczak et al., 2013), является наиболее действенным подходом геноидентификации BLV, нежели предложенные ранее (пионерские) стратегии типизации (Н. Fechner et al., 1997D. Beier et al., 2001; M. Licursi et al., 2002) на основе полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, выстроенные исключительно на принципе интерпретации генерируемых ет'-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Нынешняя филогенетическая классификация ВБЛ предусматривает наличие восьми генотипов, семь из которых впервые были описаны в работе S.M. Rodriguez et al. (2009), а восьмой генотип - в ранней публикации 2011 г. нашей группы ученых (А.Ю. Шаева и др., 2011), с независимым подтверждением существования нового (8-го) генотипа BLV в чуть более поздних статьях других отечественных и зарубежных исследователей (D. Balic et al., 2012; М.М. Ababneh et al., 2012; M. Rola-Luszczak et al., 2013), чьи оригинальные работы по частичному секвенированию геномов ВБЛ и дальнейшему генотипированию этого вируса также являются актуальными.

Цель и задачи исследования. Цель исследования — создание научно-практических основ геноидентификации вируса бычьего лейкоза, интегрированных в систему молекулярного мониторинга инфицированности стад генотипами BLV.

Для реализации цели решались следующие задачи:

- уточнить эпизоотическую ситуацию в Республике Татарстан РФ в отношении лейкоза крупного рогатого скота.

- установить генотипическую принадлежность изолятов ВБЛ, циркулирующих в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан, в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя на основе анализа секвенированных последовательностей локуса ewv-rena провируса BLV;

- типировать депонированных в GenBank NCBI представителей BLV в зависимости от выбранных стратегий геноидентификации с ретроспективной оценкой степени согласованности генотипических подходов;

- разработать и апробировать стратегию ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ, согласующуюся с филогенетической классификацией возбудителя;

- систематизировать информационные данные о фактах выявления представителей нового (8-го) генотипа BLV в различных регионах мира.

Научная новизна.

- Впервые выявлены циркулирующие в популяциях крупного рогатого скота Республики Татарстан изоляты ВБЛ с уникальными нуклеотидными последовательностями локуса еит-гена, значительно повышающими уровень знаний о генетическом разнообразии изучаемого вирусного патогена.

- Впервые разработана и апробирована стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЬУ, согласующаяся с филогенетической классификацией возбудителя.

Научная новизна работы отражена в публикациях ведущих рецензируемых научных журналов перечня ВАК, а также в глобальной электронной базе данных СепВапк 1МСВ1.

Научн0-пра1сгическая значимость.

- Полученные данные результатов молекулярно-генетических исследований изолятов ВБЛ на предмет их генотипической принадлежности значительно повышают уровень знаний о генетическом разнообразии ВЬУ, с их последующим эффективным применением в научно-практической деятельности ветеринарной медицины.

- Стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ, разработанная с учетом новых знаний о генетическом разнообразии возбудителя, и согласующаяся с его филогенетической классификацией, позволяет проводить идентификацию всех восьми известных генотипов, и может быть внедрена в систему молекулярного мониторинга инфицированное™ стад генотипами ВЬУ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012).

- международном симпозиуме «Биохимия — основа наук о жизни», посвященного 150-летию образования кафедры биохимии Казанского университета (Казань, 2013).

- VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2014» (Москва, 2014).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 статей, в том числе 5 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, а также 43 депонированные в глобальную базу данных СепВапк >ГСВ1 публикации нуклеотидных последовательностей локуса елу-гена выявленных изолятов провируса ВЬУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан эндемическая, краткосрочный тренд по неблагополучию — нарастающий.

- В популяциях крупного рогатого скота Республики Татарстан циркулируют изоляты 4-го, 7-го и 8-го генотипов ВЬУ, генотипическая принадлежность которых была установлена на основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еиу-гена возбудителя.

- Типированием 422 депонированных в СепВапк МСВ1 представителей ВБЛ в зависимости от выбранных стратегий геноидентификации подтверждена несогласованность известных ранее способов ПЦР-ПДРФ-типизации ВЬУ с нынешней филогенетической классификацией возбудителя.

- Апробированная стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования 8-ми известных генотипов ВБЛ с 5 рестриктазами {Рхи\\, &р1, НрМ, НаеIII и разработана нами в согласованности с нынешней филогенетической классификацией возбудителя.

- Представители нового (8-го) генотипа ВЬУ регистрируются в различных регионах мира - Хорватии, Украине, России, Иордании; факт их существования впервые обоснован нашей группой исследователей, с независимым подтверждением зарубежными и отечественными учеными.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список сокращений и условных обозначений, список использованной литературы (всего 134 источника, из них 73 отечественных и 61 зарубежный источник) и приложения (43 депонированные в глобальную базу данных СепВапк МСВ1 публикации нуклеотидных последовательностей локуса ет-гена выявленных изолятов провируса ВЬУ) Диссертация иллюстрирована 8 рисунками и 22 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в 2011-2014 годы на кафедре биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ (г. Казань), ГБУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» РТ (г. Казань), в НПК «Синтол» (г. Москва), а также в сельхозпредприятиях районов Республики Татарстан Российской Федерации (РТ РФ).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При проведении эпизоотологических исследований анализировались статистические данные ветеринарной отчетности, результаты лабораторной диагностики на лейкоз крупного рогатого скота по РИД и гематологии.

Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 100 проб крови ВЬУ-позитивных коров сельхозпредприятий 16 районов РТ на предмет идентификации выявленных представителей вируса бычьего лейкоза (ВБЛ), как на основе филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еиу-гена возбудителя, так и ПЦР-ПДРФ-генотипирования (табл. 1).

Табл. 1. Происследованные образцы провнрусной ДНК ВБЛ

№ п.п. РАЙОН РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН ПРОИССЛЕДОВАНО

1 Азнакаевский район 10

2 Алькеевский район 13

3 Буинский район 7

4 Высокогорский район 4

5 Дрожжановский район 1

6 Заинский район 8

7 Лаишевский район 13

8 Лениногорский район 9

9 Муслюмовский район 1

10 Нижнекамский район 14

11 Пестречинский район 1

12 Сармановский район 2

13 Спасский район 1

14 Тукаевский район 9

15 Тюлячинский район 6

16 Чистопольский район 1

ВСЕГО ОБРАЗЦОВ 100

Экстракция тотальной ДНК из цельной крови крупного рогатого скота осуществлена с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б» согласно инструкции производителя (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением «внешних» («env5032» и «env5608») и «внутренних» («env5099» и «env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента ет'-гена ВБЛ длиной 444 bp [Н. Fechner et al., 1997D. Beier et al., 2001; M. Licursi et al., 2002].

Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII, Sspl, Hph\ (изошизомер AsuHPl), HaeIII, BstYl (изошизомер BstX2l).

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0 ((http://tools.neb.com/ NEBcutter2/).

Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Х=310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия).

Секвенирование продуктов амплификации локуса ет'-гена выявленных изолятов провируса ВБЛ выполнено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия) с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных.

Секвенированные последовательности локуса ет'-гена изолятов провируса BLV были выравнены по длине 400 нуклеотидов с соответствующими опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.

Номера доступа (Accession Number, A/N) депонированных в GenBank NCBI в 2013 г. нуклеотидных последовательностей локуса ет'-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан: КС867136-КС867150, КС886607-КС886634

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Эпизоотическая ситуация по Республике Татарстан в отношении лейкоза крупного рогатого скота

3.1.1. Сводные данные результатов серологических и гематологических исследований животных на лейкоз крупного рогатого скота за 2006-2014 гг

Результаты серологических и гематологических исследований на лейкоз крупного рогатого скота в динамике за 2006-2014 гг, были проанализированы при оценке эпизоотической ситуации в отношении данного заболевания, представлены в виде сводных данных (табл. 2).

Табл. 2. Серологические и гематологические исследования животных на лейкоз крупного рогатого скота в динамике за 2006-2014 гг.

Исследовано по РИД Исследовано по гематологии

выявлено выявлено

годы голов (тыс.) инфицированных животных голов (тыс.) гематологически больных животных

голов в % голов в %

(тыс.) (тыс.)

2006 510 83,4 16,4 296 7,8 2,6

2007 616 94,5 15,3 279 7,9 2,8

2008 688 117 17,0 279 7,8 2,8

2009 747 132,1 17,7 265 6,5 2,5

2010 750 119,9 16,0 277 6,5 2,3

2011 690 122 17,7 253 6,2 2,4

2012 713 123 17,2 245 6,2 2,5

2013 715 131 18,3 244 5,9 2,4

2014 811 151 18,7 242 5,1 2,1

Так, если в 2006 году, из 510 тыс. происследованных в РИД голов кр.рог.ск. было выявлено 83,8 тыс. инфицированных вирусом бычьего лейкоза животных (16,4%), то к 2014 году их процент увеличился на 1,9% и достиг 18,3% (151 тыс. голов), на фоне сравнительно большего количества исследованного поголовья (811 тыс. голов) (табл. 2).

Данные же по гематологии последних 9 лет, наоборот, свидетельствуют о тенденции к снижению от года в год как общего числа исследованных, так и выявленных гематологически больных животных (табл. 2). Например, если в 2006 году, было исследовано по гематологии 296 тыс. голов с долей гематологически больных в 7,8 тыс. голов (2,6%), то к 2014 году их процент уменьшился на 0,5% и достиг 2,1% (5,1 тыс. голов) на фоне сравнительно меньшего количества исследованного поголовья (242 тыс. голов) (табл. 2).

По результатам анализа данных серологических исследований (РИД) была установлена и степень инфицированности поголовья крупного рогатого скота вирусом бычьего лейкоза в разрезе всех районов Республики Татарстан за 20102014 г.

Так, если в 2010-2011 гг в группу наиболее высокой степени инфицированности ВБЛ (от 30,1% и выше) входило 5 районов Республики Татарстан (Пестречинский, Бугульминский, Лениногорский, Мамадышский, Альметьевский), а в период с 2012-2013 гг — 7 районов РТ, то в 2014 году (табл. 11) число районов с наиболее тяжелой ситуацией по лейкозу увеличилось до 12 (Мамадышский, Бугульминский, Кайбицкий, Камско-Устьинский, Алькеевский, Тетюшский, Рыбно-Слободский, Буинский, Заинский, Лениногорский, Альметьевский, Нурлатский).

Можно констатировать, что эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан эндемическая, остается по-прежнему напряженной, с определенной тенденцией к усугублению.

3.2. Генотипирование изолятов вируса бычьего лейкоза, выявленных

среди поголовья крупного рогатого скота в Республики Татарстан

Задачей данного раздела исследования являлось установление генотипической принадлежности изолятов ВБЛ, циркулирующих в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан, в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя на основе анализа секвенированных последовательностей локуса еиу-гена провируса BLV.

В результате сравнительного филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса ewv-гена изолятов провируса BLV, выявленных у кр.рог.ск. в животноводческих хозяйствах 16 районов Республики Татарстан, установлена их генотипическая принадлежность.

Так, из 100 идентифицированных изолятов 64 относились к 4-му генотипу BLV, 28 представителей ВБЛ принадлежали кластеру 7-го генотипа, а остальные 8 происследованных образцов провируса характеризовались признаком нового, недавно обоснованного нами 8-го генотипа возбудителя (табл. 3).

Табл. 3. Распределение 100 генотипнрованных образцов провирусной ДНК _ВЬУ по 16 исследованным районам Республики Татарстан_

Район Республик» Татарстан Исследовано секвепированием ГЕНОТИП ВЬУ

1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-н 8-й

1 Азнакаевский район 10 9 1

2 Алькеевский район 13 5 8

3 Буинский район 7 2 3 2

4 Высокогорский район 4 4

5 Дрожжановский район 1 1

6 Заинский район 8 7 1

7 Лаишевский район 13 12 1

8 Лениногорский район 9 9

9 Муслюмовский район 1 1

10 Нижнекамский район 14 8 5 1

11 Пестречинский район 1 1

12 Сармановский район 2 2

13 Спасский район 1 1

14 Тукаевский район 9 4 3 2

15 Тюлячинский район 6 6

16 Чистопольский район 1 1

ВСЕГО ОБРАЗЦОВ 100 64 28 8

Фактически, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что в популяциях крупного рогатого скота Республики Татарстан циркулируют изоляты трех из восьми известных генотипов ВБЛ, идентифицированных филогенетическим анализом секвенированных последовательностей локуса еиу-гена как представители 4-го, 7-го и 8-го генотипов ВЬУ.

Из 100 секвенированных образцов, в ОепВапк 1\ТСВ1 были депонированы только 43 уникальные последовательности локуса елг-гена ВЬУ, результат генотипической идентификации которых на основе филогенетической классификации был отражен на построенной филограмме (рис. 1).

Дополнительно, по результатам оценки гетерогенности типовых представителей ВЬУ по еиу-гену был проведен анализ внутри- и межгенотипической гетерогенности известных генотипов ВБЛ, информационные данные которого представлены в обобщенной табл. 4.

Табл. 4. Внутри- и межгенотипическая гетерогенность представителен _ВЬУ по епу-гену (%-ное отношение)_

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ВБЛ

ГЕНОТИП 1-й 2-й 3-й 4-н 5-й 6-й 7-й 8-й

1-й 0-5 3-6 3-7 3-7 3-7 3-6 3-8 2-6

2-й 3-6 0-1 3-4 2-4 4-5 3 3-5 2-4

3-й 3-7 3-4 0-2 3-5 4-5 3-4 3-6 3-4

4-й 3-7 2-4 3-5 0-3 3-5 2-4 2-5 2-4

5-й 3-7 4-5 4-5 3-5 0-2 4-5 3-5 4-5

6-й 3-6 3 3-4 2-4 4-5 0-2 3-5 2-4

7-п 3-8 3-5 3-6 2-5 3-5 3-5 0-4 2-5

8-й 2-6 2-4 3-4 2-4 4-5 2-4 2-5 0-2

Рис. 1. Фнлограмма типовых представителей известных генотипов BLV (env-ren) [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 89 seq.] Обозначения: черный круг - депонированные в GenBank NCBI в 2013 году нуклеотидные последовательности локуса env-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ; черный квадрат - ранее депонированные последовательности.

Анализ же внутри- и межгенотипической гетерогенности типовых изолятов ВЬУ показал несостоятельность использования «гетерогенного» критерия оценки генетического разнообразия представителей ВБЛ в определении их таксономической принадлежности. Причина установленной несостоятельности кроется в отсутствии четкого алгоритма идентификации, т.к. процентный диапазон значений внутригенотипической гетерогенности не разграничивает интервал значений межгенотипической гетерогенности (табл.

4).

3.3. Типизация депонированных в СепВапк N€81 представителей ВЬУ в зависимости от выбранных стратегий геноидентификации

Задачей данного раздела исследования являлась типизация депонированных в СепВапк >ГСВ1 422 представителей ВЬУ в зависимости от выбранных стратегий геноидентификации, основанных или на интерпретации результатов ПЦР-ПДРФ-анализа, или филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ет-гена возбудителя, с ретроспективной оценкой степени согласованности генотипических подходов.

Так, сравнительной оценкой нуклеотидных последовательностей локуса еиг-гена 422 представителей ВБЛ на предмет их типизации в зависимости от выбранных стратегий геноидентификаций подтверждено, что известные ранее способы типизации ВЬУ, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа, не согласуются с новым подходом к оценке генотипического разнообразия ВБЛ на основе филогенетического анализа епу-гена возбудителя.

Например, изоляты ВЬУ, идентифицированные по стратегии Э Ве1ег й а1. (2001) как представители Австралийской подгруппы, по филогенетической классификации могут принадлежать 1-му, 3-му, 6-му, 7-му или 8-му генотипам; а Японской подгруппы - 1-му, 6-му или 7-му генотипам ВБЛ. Кроме того, для данной стратегии типизации выявлено дополнительно 9 уникальных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей, тождественных 9 неклассифицированным подгруппам ВЬУ (табл. 5).

Табл. 5. £>гг-ПЦР-ПДРФ-профили ВЬУ (типизация по Р. Ве1ег е! а!., 2001)

ПЦР-ПДРФ-пирование BRI 11ЦР- ПДРФ-фрагменты (Ьр) Генотипы

ти продукт (Ьр) Ptull BamlU ВсП 1 2 3 4 5 6 7 8 N

Бельгийская 444 280/164 444 225/219 . - - 142 . . . 142

Австралийская 444 444 316/128 225/219 54 - 4 - - 9 70 21 158

Японская 444 444 316/128 219/121/104 8 - - - - 6 1 - 15

я 444 444 444 225/219 43 ■ 1 - - 2 - 46

В р| 444 444 316/128 444 1 2 - 3

>> 444 444 316/128 225/191/28 1 1

U у 444 280/164 316/128 225/219 - 36 - - 10 - 3 - 49

$ *> 444 280/164 316/128 444 - 1 1

с 444 280/164 316/128 219/189/36 - - - - 1 - - - 1

444 280/264 444 444 - 1 - - 1

9 444 208/164 253/191 225/219 - - - 1 - - - - 1

ч 444 280/164 444 219/121/104 - - - 4 - - - - 4

При этом, изоляты ВЬУ, идентифицированные по филогенетической классификации как представители 1-го и 7-го генотипов, по стратегии О Веюг е1 а1. (2001) могут принадлежать Австралийской, Японской и трем неклассифицированным подгруппам ВБЛ; 2-го и 5-го генотипов — двум неклассифицированным подгруппам; 3-го и 8-го генотипа — Австралийской подруппе; 4-го генотипа — Бельгийской и четырем неклассифицированным подгруппам; 5-го генотипа - двум неклассифицированным подгруппам; б-го генотипа — Австралийской и Японской подгруппам ВБЛ (табл. 5).

Изоляты ВЬУ, идентифицированные по стратегии М. 1лсига е1 а1. (2002) как представители 1-го генотипа, по филогенетической классификации могут относиться к 1-му, 4-му, 6-му или 7-му генотипам ВБЛ; 3-го генотипа — к 1-му, 6-му или 7-му генотипам; 5-го генотипа — к 1-му, 3-му, 6-му или 7-му генотипам; 6-го генотипа — по филогенетической классификации могут относиться ко 2-му, 4-му, 5-му или 7-му генотипам ВЬУ (табл. 6).

Табл. 6. £яу-ПЦР-ПДРФ-профнли ВЬУ (типизация по М. Цсига et а!., 2002)

ПЦР-ПДРФ- ПЦР- ПДРФ-фрагменты (Ьр) Генотипы

типирование ВБЛ продукт (Ьр> ВсП НаеШ Ли II 1 2 3 4 5 6 7 8 N

1-й 444 225/219 198/94/87/32/27/6 444 95 - - 1 - 8 68 - 172

2-й 444 219/121/104 312/94/32/6 444

3-Й 444 219/121/104 285/94/32/27/6 444 8 - - - - 6 1 - 15

4-Й 444 219/121/104 198/94/87/32/27/6 444 - - - - - - - - -

5-Й 444 225/219 285/94/32/27/6 444 1 - 3 - - 1 1 - 6

6-Й 444 225/219 198/94/87/32/27/6 280/164 - 35 - 139 9 - 3 - 186

9 444 444 198/94/87/32/27/6 444 1 1

444 225/191/28 198/119/94/27/6 444 1 1

444 225/219 312/94/32/6 444 1 1

С 444 444 198/94/87/32/27/6 280.164 - 1 - 1 - - - - 2

н 444 219/189/36 198/94/87/32/27/6 280/164 1 1

444 225/219 285/94/32/27/6 280/164 - - - 2 1 - - - 3

ы 444 444 198/87/49/45/32/27/6 444 1 - 1

444 225/219 225/94/87/32/6 444 21 21

444 225/219 285/94/32/21/6/6 444 - - 1 - - - - - 1

444 225/219 198/121/87/32/6 280/164 - - - 1 - - - - 1

444 225/219 198/119/94/27/6 280/164 - - - 1 - - - - 1

444 219/121/104 285/94/32/27/6 280/164 - - - 4 - - - - 4

444 225/219 198/87/49/45/32/27/6 444 2 - 2

444 225/219 198/119/94/27/6 444 1 - 1

444 444 198/121/87/32/6 444 1 - 1

444 225/219 198/87/49/45/32/27/6 280/164 - 1 1

Обозначения: N — количество проанализированных представителей ВЬУ с соответствующим ПЦР-ПДРФ-профилем; «?»- неклассифицированный таксон ВЬУ.

Причем, для данной стратегии типизации [М. Ьюига й а1., 2002] выявлено дополнительно 16 уникальных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей, тождественных 16 неклассифицированным генотипам ВЬУ (табл. 6).

При этом, изоляты ВЬУ, идентифицированные по филогенетической классификации как представители 1-го генотипа, по стратегии М. Усига е1 а1. (2002) могут относиться к 1-му, 3-му, 5-му и трем неклассифицированным генотипам ВБЛ, 2-го генотипа — к 6-му и двум неклассифицированным генотипам; 3-го генотипа — к 5-му и одному неклассифицированному генотипу;

4-го генотипа — к 1-му, 6-му и пяти неклассифицированным генотипам; 5-го генотипа — к 6-му и двум неклассифицированным генотипам; 6-го генотипа — к 1-му, 3-му и 5-му генотипам; 7-го генотипа - к 1-му, 3-му, 5-му, 6-му и четырем неклассифицированным генотипам; 8-го генотипа — к одному неклассифицированному генотипу ВБЛ.

Следует отметить, что при интерпретации ет'-ПЦР-ПДРФ-профилей 422 изолятов известных генотипов ВЬУ, нами не обнаружено ни одной депонированной в ОепВапк ЫСВ1 нуклеотидной последовательности, принадлежавшей бы по стратегии типизации М. Ыси^ е! а1. (2002) ко 2-му или 4-му генотипам ВБЛ (табл. 6). К сожалению, данное обстоятельство не позволяет в полном объеме обосновать физическое существовование заявленных для данных генотипов еяу-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Анализ интерпретации ену-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по стратегии Н. РесЬпег й а1. (1997) и оценки ее согласуемости с филогенетической классификацией отражен в табл. 7.

Так, изоляты ВЬУ, идентифицированные по стратегии Н. РесЬпег й а1. (1997) как представители вариантной группы «В», по филогенетической классификации могут характеризоваться признаком 1-го, 6-го или 7-го генотипов ВБЛ; вариантной группы «С» - 1-го, 3-го, 6-го или 7-го генотипов; вариантной группы «Э» — 1-го, 4-го или 7-го генотипов; вариантной группы «Р» — 2-го, 5-го или 7-го генотипов ВБЛ (табл. 7).

Табл. 7. /Гяу-ПЦР-ПДРФ-профили ВЬУ (типизация по Н. РесЬпег е! а!., 1997)

ПЦР-ПДРФ- ПЦР- пд РФ-фрагменты (Ьр) Генотипы

типировяние ВБЛ продукт (Ьр) ВатШ ВсП т Наг III РтП 1 2 3 4 5 6 7 8 N

328/116 198/94/87/32/27/6

А 444 444 225/219 198/121/87/32/6 280/164 142 142

444 198/119/94/27/6

285/94/32/27/6

в 444 316/128 219/121/104 328/116 285/94/32/27/6 444 6 1 15

444

198/94/87/32/27/6

328/116 285/94/32/21/6/6

< С С С 444 316/128 225/219 285/94/32/27/6 444 53 4 . - 9 70 - 136

444 198/87/49/45/32/27/6

>• 198/119/94/27/6

и О 444 444 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 444 42 - - 1 - - 2 - 45

к н я Е 444 316/128 225/219 328/116 225/94/8732/6 444 21 21

Р 444 316/128 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 - 36 - - 9 - 3 - 48

С 444 316/128 225/219 444 312/94/32/6 444 1 1

< •> 444 316/128 444 328/116 198/94/87/32/27/6 444 1 1

Ь 2 444 316/128 225/191/28 328/116 198/119/94/27/6 444 1 1

444 444 225/219 444 285/94/32/27/6 444 1 1

444 316/128 444 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 - 1 1

444 316/128 219/189/36 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 - - - - 1 - - - 1

444 316/128 225/219 444 285/94/32/27/6 280/164 - - - . 1 - - 1

444 316/128 444 328/116 198/87/49/45/32/27/6 444 1 - 1

444 444 444 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 - - - 1 - - - - 1

444 253/191 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 - - - 1 - - - - 1

444 444 219/121/104 328/116 285/94/32/27/6 280/164 - 4 - 4

9 444 316/128 444 328/116 198/121/87/32/6 444 1 - 1

Обозначения: N - количество проанализированных представителей ВЬУ с соответствующим ПЦР-ПДРФ-профилем; «?» - неклассифицированный таксон ВЬУ.

И для данной стратегии типизации [Н. РесЬпег й а!., 1997] установлено 11 уникальных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей, тождественных 11 неклассифицированным вариантным группам ВЬУ (табл. 7).

При этом, изоляты ВЬУ, идентифицированные по филогенетической классификации как представители 1-го генотипа, по стратегии Н. РесЬпег й а1. (1997) могут характеризоваться признаком вариантных групп В, С, Б, б и трех неклассифицированных групп; 2-го генотипа — вариантной группы Б и одной неклассифицированной; 3-го генотипа - вариантной группы С; 4-го генотипа -вариантных групп А, Э и трех неклассифицированных; 5-го генотипа -вариантной группы И и двух неклассифицированных; 6-го генотипа -вариантных групп В и С; 7-го генотипа - вариантных групп В, С, О, И и двух неклассифицированных; 8-го генотипа - вариантной группы Е (табл. 7).

3.4. Разработка и апробация стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ согласующейся с филогенетической классификацией возбудителя

Руководствуясь принципом совершенствования стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией ВБЛ, в ходе системного анализа рестрикционных картирований локуса епу-гена известных представителей ВЬУ, нами были предложены новые условия идентификации по 5 эндонуклеазам рестрикции (Руг/П, НрМ, НаеIII и

&/У I).

Информация с интерпретацией полученных ет'-ПЦР-ПДРФ-профилей 422 проанализированных представителей ВЬУ, фактически отражающей стратегию ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя, представлена в обобщенной табл. 8.

Так, 1-ый генотип ВЬУ характеризуется наличием семи комбинаций ет>-ПЦР-ПДРФ-профилей (К 1-7), 2-ой генотип - четырёх комбинаций (К8-11), 3-ий генотип - наличием трёх комбинаций (К12-14); 4-ый генотип - девяти комбинаций (К15-23); 5-ый генотип - трех комбинаций (К24-26); 6-ой генотип - двух комбинаций (К27-28), 7-ой генотип - четырнадцати комбинаций (К29-42) и 8-ой генотип ВБЛ - наличием пяти комбинаций (К43-47) еит-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ (табл. 8).

Следует подчеркнуть, что недавно обоснованный нами 8-ой генотип ВБЛ может быть успешно идентифицирован даже с использованием одной единственной рестриктазы Нае III, генерирующей ПДРФ-фрагменты (225/94/87/32/6 Ьр), характерные только для этих представителей. А с применением двух ферментов могут быть определены представители 2-го (Р-гаП и Вб1У1), 3-го (НрМ и НаеIII) и 5-го генотипов (Р\т\\ и НрМ) ВЬУ

Однако, для исчерпывающей идентификации генотипов ВЬУ целесообразно руководствоваться полной картиной еот-ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей ВБЛ по локусу епу-гена данного возбудителя.

Табл. 8. Стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЬУ, разработанная

в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя

г Шолят СепВапк АЛЧ ПЦР- ПР0ДУ1СТ (Ьр) ПДРФ-ф агменты (Ьр) К N

/Ч'нП Нрк1 НаеШ КПП

1 АЬ-63 М808571 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 1 53

1 От 527 АР007764 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 198/128/118 2 8

1 23 1)87873 444 444 399/45 224/220 312/94/32/6 198/128/118 3 1

1 АЬ-2106 РЛ808578 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 246/198 4 42

1 игиСОбН ГМ955558 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 246/198 5 1

1 УйМ М35239 444 444 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 6 1

1 КлпИкГял Еи266062 444 444 399/45 220/196/28 198/119/94/27/6 198/128/118 7 1

2 АИ64 Р3808574 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 8 34

2 РЫ1960 Р3808590 444 280/164 399/45 224/220 198/87/49/45/32/27/6 198/128/118 9 1

2 АЯСвРв АР485773 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/27/6 198/128/118 10 1

2 А1^1453 Р.1808577 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 198/128/118 И 1

1«СА-1 ЕР065647 444 444 399/45 444 285/94/32/21/6/6 198/128/96/22 12 1

3 иЯСА-2 ЕР065648 444 444 399/45 444 285/94/32/27/6 198/128/96/22 13 2

3 лрги ЕР065650 444 444 399/45 444 285/94/32/27/6 198/128/118 14 1

4 ВС ЕР065638 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 115

4 3 и87872 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 16 1

4 18-с16 30353652 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/27/6 444 17 16

4 N023 КС867149 444 280.164 399.45 224.220 198/94/87/32/27/6 253/191 18 1

4 1 ВУ НО902258 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 19 7

4 N034 КС886611 444 280/164 399/45 224/220 198/121/87/32/6 444 20 1

4 18-С9 Л(}353640 444 280/164 399/45 224/220 198/119/94/27/6 444 21 1

4 1ЧК11 Д>686117 444 280/164 399/45 224/220 285/94/32/27/6 444 22 6

4 15-с10 ЛО353650 444 280/164 399/45 220/145/79 198/94/87/32/27/6 444 23 1

5 СИАЯ ЕР065635 444 280/164 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 24 8

5 СИСС ЕР065639 444 280/164 399/45 224/181/39 285/94/32/27/6 316/128 25 1

5 С1«,С-1 ЕГ065655 444 280/164 444 224/181/39 198/94/87/32/27/6 316/128 26 2

6 РИ238 РЛ808582 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 316/128 27 7

6 151 АУ185360 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 316/128 28 8

7 N28 НМ102356 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 294/128/22 29 7

7 176 АУ515276 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 53

7 12 883530 444 444 444 224/220 285/94/32/27/6 316/128 31 1

7 14 АУ515274 444 444 444 145/137/83/79 198/94/87/32/27/6 316/128 32 1

7 30 00059417 444 444 444 444 198/87/49/45/32/27/6 316/128 33 1

7 Зв ЛР720351 444 280/164 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 34 3

7 4Т-С19 30353655 444 444 399/45 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 35 3

7 15-1:4 Л0353651 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/79/49 36 1

7 N^7 .10686120 444 444 444 224/137/83 198/87/49/45/32/27/6 316/128 37 2

7 48 ЛР720352 444 444 444 224/137/83 198/119/94/27/6 316/128 38 1

7 1Б-с6 .10353633 444 444 444 224/137/83 198/121/87/32/6 316/128 39 1

7 4Т-С11 Л0353656 444 444 444 224/137/83 285/94/32/27/6 316/128 40 1

7 N067 КС886618 444 444 444 224/137/44/39 198/94/87/32/27/6 316/128 41 1

7 1&-С1 Л(}353649 444 444 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 42 2

8 М1/ЕЬС Сго/08 С1Л24606 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43 13

8 N174 ЛР713455 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44 4

8 ЕЬС Сго/УКА/09 JN990072 444 444 444 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 45 2

8 4-6 НМ563764 444 444 399/45 224/137/83 225/94/87/32/6 198/128/118 46 1

8 МКС2137 .10675759 444 444 399/45 444 225/94/87/32/6 198/128/118 47 1

Обозначения: Г - генотип; К — комбинация; N — количество проанализированных изолятов ВЬУ с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей.

Достоверность т зШсо моделирования рестриктограмм по 5 эндонуклеазам рестрикции с характерными для определенного генотипа ВЬУ комбинациями ет'-ПЦР-ПДРФ-профилей обоснована анализом выравнивания и рестрикционного картирования. А согласованность разработанной стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ с филогенетической классификацией возбудителя подтверждена, в том числе, филогенетическим анализом локуса ет-тсна 47 типовых изолятов восьми известных генотипов ВЬУ (рис. 2), генерировавших 47 уникальных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей (табл. 8).

-N2 8/НМ102356/genotype 7

-14/AY515274/genotype 7

176/AY515276/genotype 7

-4S/JF720352/genotype 7

lS-c6/JQ353633/genotype 7

— 3S/JF720351/gerntype 7 1S-C4/JQ35365 l/genotype 7

— NK17/JQ686120/genotype 7

- 4T- с 19/JQ3 5 3 65 5/gcnotvpe 7 -4T-cll/JQ353656/genotype 7

-N067/KC886618/genotype T

3 0/DQ059417/genotype 7

• lS-cl/Ji — I2/S8!

_l/EF065655/genotype 5

CRAS- l/EF065635/genotype 5

-CRGC/EF065639/genotype 5

• PL-1238/FJ808582/genotype 6

■ 151/AY185360/genotype 6

-1 S-c 16/JQ3 53652/genotype 4

-1 S-c9/JQ3 53 640/genotype 4

NK11/JQ686117/ienotype 4 — lS-cl0/JQ353650/genotype 4

-N023/KC867149/genotype 4

N034/KC88661 l/genotype 4

•e 4

-1 BY/HQ902258/genotype 4

BG/EF065638/genotype 4

-3/U87872/genotypi

?0/genotype 2

-PL-

■4960/FJ808590/genotypi - AL-1453/FJ808577/genotype 2

AL-164/FJ808574/genotype 2

ARGSF8//»J485773/genotype 2

4- 6/HM563764/genotype i

NI74/JF713455/genotype 8

- MKC2137/JQ675759/genotype f

Ml/ELG Cro/08/GU7246Ö6/genotype 8

-ELG Cro/VRA/09/JN990072/genotype i

JPFU/EF065650/genotype 3

USCA-l/EF065647/genot\,pe 3 USCA-2/EF065648/genotype 3

Kurdistan/EU266062/genotype 1

AL-2106/FJ808578/genot\,pe 1

UruC06II/FM955558/genotype 1

E

— VdM/M35239/genotype 1

— Covv 527/AF007764/genotype 1 AL-63/FJ80857 l/genotype 1 -23/U87873/genotype 1

0.005

Рис. 2. Филограмма 47 типовых изолятов 8 известных генотипов ВБЛ, построенная на основании филогенетического анализа локуса «iv-гена [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 47 seq.]

При апробации разработанной стратегии генотипирования на 100 выявленных нами изолятах ВЬУ регистрировались 10 комбинаций сиу-ПЦР-ПДРФ-профилей из 47 существующих, из которых пять (К15, К17, К18, К19, К20) были свойственны 4-му генотипу, три (К29, КЗО, К41) — 7-му генотипу, и два (К43, К44) - 8-му-генотипу ВБЛ, соответственно.

Электрофореграммы пяти еиу-ПЦР-ПДРФ-профилей (К15, К17, К18, К19, К20) выявленных изолятов 4-го генотипа ВЬУ были запечатлены на соответствующих рисунках (рис. 3-4), представленных в качестве наглядных примеров реализации стратегии ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ, согласующейся с филогенетической классификацией данного возбудителя

2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1000 Ьр-700 Ьр-

100 Ьр-50 Ьр-

400 ^»Ж ■ ЕК ьр

зоо ьр

Ь 224/220 Ьр

^198/191

- 94/87 Ьр

-45 Ьр -32 Ьр -27 Ьр

Рис. 3. Электрофорсграмма ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируеа ВЬУ «N031», «N015» и «N023» (предложенная стратегия генотипирования ВЬУ) Обозначения: 1, 7, 13) ДНК-маркеры 100 Ьр + 50 Ьр (СибЭнзим). 2-6) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируеа ВЬУ «N031» (К15, 4-ый генотип): 2) Рук//-ПДРФ (280/164 Ьр); 3) Яхр/-ПДРФ (399/45 Ьр); 4) НрИ1-ПДРФ (224/220 Ьр); 5) Яае///-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 6) &/У/-ПДРФ (444 Ьр). 8-12) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируеа ВЬУ «N015» (К17, 4-ый генотип): 8) РмиП-ПДРФ (280/164 Ьр); 9) &р/-ПДРФ (399/45 Ьр): 10) НрЫ-ПДРФ (444 Ьр); 11) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 12) &/7/-ПДРФ (444 Ьр). 14-18) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируеа ВЬУ «N023» (К18. 4-ый генотип): 14) Л>г///-ПДРФ (280.164 Ьр); 15) &р/-ПДРФ (399/45 Ьр); 16) НрЫ-ПДРФ (224/220 Ьр); 17) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27.6 Ьр); 18) &/Г/-Г1ДРФ (253/191 Ьр).

ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируеа ВЬУ «N031», запечатленный на электрофореграмме рис. 3 (треки 2-6) позиционируется как 15-ая комбинация (К15) еяу-ПЦР-ПДРФ-профиля 4-го генотипа ВБЛ, в чей круг входят не менее 115 изолятов (табл. 8), 25 из которых, в части их нуклеотидной последовательности локуса еит-гена, депонированы в вепВапк ЫСВ1 нами.

ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируеа ВЬУ «N015» (рис. 3, треки 8-12) представляет собой 17-ую комбинацию (К 17) ет'-ПЦР-ПДРФ-профиля 4-го генотипа ВБЛ, насчитывая не менее 17 представителей (табл. 8), в том числе 2 депонированные нами в вепВапк N081 нуклеотидные последовательности локуса ет'-гена выявленных на территории Республики Татарстан изолятов возбудителя (изолят «N015», ОепВапк А/№ КС867143; изолят «N062», вепБапк А/№ КС886615).

ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируеа ВЬУ «N023» (рис. 3, треки 14-18) относится к 18-ой комбинации (К 18) ет'-ПЦР-ПДРФ-профиля 4-го генотипа, с пока единственно насчитываемой (для данной комбинации) и депонированной

нами в СепВапк ЫСВ1 нуклеотидной последовательностью локуса еиу-гена возбудителя (изолят «N023», СепВапк А/Ы: КС867149).

ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N029», запечатленный на электрофореграмме рис. 4 (треки 2-6) позиционируется как 19-ая комбинация (К 19) ет'-ПЦР-ПДРФ-профиля 4-го генотипа ВБЛ, в чей круг входят не менее 7 изолятов (табл. 8), 2 из которых, в части их нуклеотидной последовательности локуса ет'-гена, депонированы в СепВапк Ж]В1 нами.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

ЮООЬр—

700 "" ' • ■' I 1'

500 . Щ| м Г •

1 НН^Н ВВИК 1 Р'гГС1 ЩтШеШШшШ ■ ' "'ГГГШШ---'!Н—100 ш

г399 Ьр

о.-», 29-1 1)1)'

....... И^^^Д ЬШт^шик II ЫШ ^мА^ММИИИЯС .Им

400 Ьр-300 Ьр-

200 Ьр-

224/220 Ьр 198 Ьр 164 Ьр 137/128 Ьр

ш^^шшяш^,: - • 121 ьр

50 Ьр —»- 32 ь

Ш 27 ьр

Рис. 4. Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса ВЬУ «N029», «N034» и «N013» (предложенная стратегия генотипирования ВЬУ) Обозначения: 1, 7, 13) ДНК-маркеры 100 Ьр + 50 Ьр (СибЭнзим). 2-6) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N029» (К 19, 4-ый генотип): 2) РтП-ПДРФ (280/164 Ьр); 3) &/?/-ПДРФ (444 Ьр); 4) НрЫ-ПДРФ (224/220 Ьр); 5) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 6) &/Г/-ПДРФ (444 Ьр). 8-12) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N034» (К20, 4-ый генотип): 8) Рта//-ПДРФ (280/164 Ьр); 9) &/?/-ПДРФ (399/45 Ьр); 10) НрЫ-ПДРФ (224/220 Ьр); 11) НаеШ-ПДРФ (198/121/87/32/6 Ьр); 12) Вл/Г/-ПДРФ (444 Ьр). 14-18) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N013» (К29, 7-ой генотип): 14) Рт/7-ПДРФ (444 Ьр); 15) &р/-ПДРФ (444 Ьр); 16) Яр«-ПДРФ (224/137/83 Ьр); 17) #ае///-ПДРФ (198/94/87/32/27.6 Ьр); 18) В5/У/-ПДРФ (294/128/22 Ьр).

ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N034» (рис. 4, треки 8-12) относится к 20-ой комбинации (К20) ет'-ПЦР-ПДРФ-профиля 4-го генотипа, с пока единственно насчитываемой (для данной комбинации) и депонированной нами в СепВапк NCBI нуклеотидной последовательностью локуса еот-гена возбудителя (изолят «N034», СепВапк АЛЧ: КС886611).

ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N013» (рис. 4, треки 14-18) представляет собой 29-ую комбинацию (К) еиу-ПЦР-ПДРФ-профиля 7-го генотипа ВБЛ, насчитывая не менее 7 представителей (табл. 8), в том числе 2 депонированные нами в СепВапк NCB1 нуклеотидные последовательности локуса еит-гена выявленных на территории Республики Татарстан изолятов возбудителя (изолят «N28», СепВапк А/Ы: НМ102356; изолят «N013», СепВапк АЛМ: КС867142).

Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей выявленных нами изолятов провируса ВЬУ: «N067 (41-ая комбинация 7-го генотипа ВБЛ), «N006» и «N142» (43-ая и 44-ая комбинации 8-го генотипа) запечатлена на рис. 5.

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1000 Ьр-700 Ьр-500 Ьр-400 Ьр-300 Ьр-

200 Ьр-

100 Ьр-50 Ьр-

-444 Ьр - 399 Ьр -316 Ьр

-225/224/220 Ьр -198Ьр

-137/128 Ьр -118 Ьр -94/87 Ьр

-45/44/39 Ьр -32/27 Ьр

Рис. 5. Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса ВЬУ «N067», «N006» и «N142» (предложенная стратегия генотипирования ВЬУ) Обозначения: 1. 7, 13) ДНК-маркеры 100 Ьр + 50 Ьр (СибЭнзим). 2-6) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N067» (К41, 7-ой генотип): 2) Рш11-ПДРФ (444 Ьр); 3) &р/-ПДРФ (444 Ьр); 4) НрЫ-ПДРФ (224/137/44/39 Ьр); 5) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 6) ВиП-ПДРФ (316/128 Ьр). 8-12) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N006» (К43, 8-ой генотип): 8) /\м//-ПДРФ (444 Ьр); 9) %)/-ПДРФ (399/45 Ьр); 10) НрЫ-ПЦРФ (224/220 Ьр); 11) НаеШ-ПЦРФ (225/94/87/32/6 Ьр); 12) Вя1П-ПДРФ (198/128/118 Ьр). 14-18) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N142» (К44. 8-ой генотип): 14) РмиП-ПДРФ (444 Ьр); 15) &р/-ПДРФ (399/45 Ьр); 16) НрЫ-ПЦРФ (224/220 Ьр); 17) НаеШ-ПЦРФ (225/94/87/32/6 Ьр); 18) ВлУ7-ПДРФ (316/128 Ьр).

Изолят N067 (КС886618), генерирующий 41-ую комбинацию еит-ПЦР-ПДРФ-профиля (рис. 5, треки 2-6), был использован в качестве единственного типового представителя данной комбинации (К41) 7-го генотипа ВЬУ (табл. 8).

Изолят N006 (КС867140) 8-го генотипа ВБЛ, генерирующий 43-ую комбинацию еот-ПЦР-ПДРФ-профиля (рис. 5, треки 8-12) имел схожую рестриктограмму (К43) с остальными 4 выявленными изолятами. 2 из которых, в части уникальных нуклеотидных последовательностей локуса епу-гена депонированы в вепВапк N061 (N063 (КС886616), N089 (КС886624) (табл. 9).

А в качестве типового изолята ВЬУ, генерирующего 44-ую комбинацию еиу-ПЦР-ПДРФ-профиля 8-го генотипа (рис. 5, треки 14-18) использовался контрольный изолят N174 (.№713455), с чьей рестриктограммой (К44) были схожи 2 других изолята - N121 (КС886631) и N142 (КС886634), выявленные нами в 2013 г. (табл. 9).

Сводные данные результатов апробации разработанной стратегии генотипирования на 100 изолятах ВБЛ, выявленных у кр.рог.ск. в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ отражены в табл. 9.

Табл. 9. Генотипическая идентификация изолятов ВБЛ, выявленных у

кр.рог.ск. в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан РФ

г Пзолят В1Л' СепВапк A/N ПЦР- продукт (Ьр) ПДРФ-(Ьрагменты (Ьр) К Идентичные изолнты ВЬУ

/'¡■и и Л'.у>1 Нр1,1 НаАИ ЛчУ1

4 N097 КС886628 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N025 КС867150 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N026, N096

4 N069 КС886619 444 280.164 399.45 224.220 198/94/87/32/27/6 444 15 N072

4 N001 КС867136 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N002 КС867137 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N004

4 N007 КС867141 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N018 КС867145 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N019 КС867146 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N022 КС867148 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N027 КС886607 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N033

4 N031 КС886610 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N028

4 N050 КС886613 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N053, N056

4 N054 КС886614 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N074 КС886620 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N075

4 N078 КС886621 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N079, N080

4 N082 КС886622 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N084 КС886623 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N086, N087

4 N090 КС886625 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N110, N111, N113, N114, N124

4 N092 КС886626 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15 N095

4 N094 КС886627 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N100 КС886630 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N122 КС886632 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N123 КС886633 444 280/164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 444 15

4 N015 КС867143 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/26/6 444 17 N016

4 N062 КС886615 444 280/164 399/45 444 198/94/87/32/26/6 444 17 N127—N132, 14136-М 40, N134

4 N023 КС867149 444 280.164 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 253/191 18

4 N029 КС886608 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 19 N083, N085, N091

4 N030 КС886609 444 280/164 444 224/220 198/94/87/32/27/6 444 19

4 N034 КС886611 444 280/164 399/45 224/220 198/121/87/32/6 444 20

7 N013 КС867142 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 294/128/22 29 N014, N057, N058, N060, N061

7 N035 КС886612 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 N064, N081, N108, N116, N118, N120, N125, N133

7 N003 КС867138 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 N008

7 N005 КС867139 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30

7 N017 КС867144 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30

7 N021 КС867147 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30

7 N066 КС886617 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30

7 N099 КС886629 444 444 444 224/137/83 198/94/87/32/27/6 316/128 30 N101, N102, Ш04-№06

7 N067 КС886618 444 444 444 224/137/44/39 198/94/87/32/27/6 316/128 41

8 N063 КС886616 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43 N068

8 N006 КС867140 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43 N009

8 N089 КС886624 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 198/128/118 43

8 N121 КС886631 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44

8 N142 КС886634 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44

8 N174 ЛГ713455 444 444 399/45 224/220 225/94/87/32/6 316/128 44 N174

Обозначения: Г - генотип; К - комбинация ПЦР-ПДРФ-профилей.

ВЫВОДЫ

1. Эпизоотическая ситуация в Республике Татарстан в отношении лейкоза крупного рогатого скота, характеризуемая как эндемическая, остается по-прежнему напряженной, с определенной тенденцией к усугублению; краткосрочный тренд по неблагополучию — нарастающий.

2. В популяциях крупного рогатого скота Республики Татарстан циркулируют изоляты ВБЛ, идентифицированные на основе интерпретации результатов филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ет'-гена как представители 4-го, 7-го и нового, недавно обоснованного 8-го генотипов ВЬУ, соответственно.

3. Сравнительной оценкой 422 нуклеотидных последовательностей локуса ет-гена изолятов ВБЛ на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации подтверждено отсутствие согласованности известных ранее способов ПЦР-ПДРФ-типизации ВЬУ с современной филогенетической классификацией возбудителя.

4. Разработанная и апробированная нами стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ с подобранными условиями идентификации всех 8-ми генотипов по 5 эндонуклеазам рестрикции [Рт\\, Я.чр1, НрЪ\, НаеIII и &/УI) согласована с современным подходом к оценке его генотипического разнообразия на основе филогенетическо анализа ет'-гена возбудителя.

5. Систематизацией информационных данных о фактах выявления представителей нового (8-го) генотипа ВЬУ в различных регионах мира установлена регистрация его изолятов в Хорватии, Украине, России и Иордании, с независимым подтверждением существования данного генотипа зарубежными и отечественными учеными, но впервые обоснованного нашей группой исследователей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Внедрить в систему молекулярного мониторинга инфицированности стад генотипами ВЬУ разработанную нами стратегию ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующуюся с современной филогенетической классификацией данного возбудителя.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Шаева, А.Ю. Идентификация нового генотипа ВЛКРС / А.Ю. Шаева, З.Р. Гараева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, A.M. Алимов // Ученые записки КГАВМ. -Казань, 2012. - Т. 211. - С. 192-197.

2. Шаева, А.Ю. Новый генотип вируса лейкоза КРС / А.Ю. Шаева, З.Р. Гараева // Ветеринария и кормление. -2012. - № 5. — С. 51-52.

3. Закирова З.Р. Геноидентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в животноводческих хозяйствах республики Татарстан / З.Р. Закирова // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2013. - Т. 215. - С. 118-121.

4. Вафин, P.P. Выявление нового (8-го) генотипа ВЛКРС в различных регионах мира / P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, А.Ю. Шаева, З.Р. Закирова, Л.И. Зайнуллин, C.B. Тюлькин, И.Р. Абдулина, A.M. Алимов // Фундаментальные исследования.-2013.-№ 10 (часть 7). - С. 1467-1471.

5.1. Вафин, P.P. Генотипическая идентификация вируса бычьего лейкоза / P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, А.Ю. Шаева, З.Р. Закирова, Л.И. Зайнуллин, C.B. Тюлькин, И.Р. Абдулина, A.M. Алимов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2014. — № 4. - С. 34-40.

5.2. Vafin, R.R. Genotypic identification of the bovine leukemia virus / R.R. Vafin, N.Z. Khazipov, A.Y. Shaeva, Z.R. Zakirova, L.I. Zaynullin, S.V. Tyulkin, I.R. Abdulina, A.M. Alimov // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. -2014. - V. 29. -N. 4. -P. 195-203.

Публикации в материалах конференций, научных и научно-практических журналах и изданиях

6. Гараева, З.Р. Филогенетический анализ изолятов ВЛКРС, циркулирующих в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан / З.Р. Гараева, А.Ю. Шаева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, Л.И. Зайнуллин // Сборник трудов III Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». - Казань, 2012. - С. 94-95.

7. Хазипов, Н.З. Генотипирование изолятов Bovine Leukemia Virus, выявленных в Республике Татарстан / Н.З. Хазипов, З.Р. Закирова, А.Ю. Шаева, P.P. Вафин, Л.И. Зайнуллин // Сборник трудов международного симпозиума «Биохимия - основа наук о жизни», посвященного 150-летию образования кафедры биохимии Казанского университета. - Казань, 2013. -С. 128-129.

8. Вафин, P.P. Генотипирование вируса бычьего лейкоза (BLV) / P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, А.Ю. Шаева, З.Р. Закирова, Л.И. Зайнуллин, C.B. Тюлькин // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2014». — Москва, 2014. -T. 2.-С. 521.

Подписано в печать 20.04.2015 г. Заказ № 98 Тираж 100 экз. Бумага офсетная

Формат 60x84/16 Усл.- печ. л. 1,0

Индивидуальный предприниматель Газизуллин Вагиз Рашитович 423823, РТ., г. Набережные Челны, ул. Ш. Усманова, д.70-215