Генетическое разнообразие калицивирусов человека и особенности циркуляции норовирусов геногрупп I и II

Луковникова, Любовь Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое разнообразие калицивирусов человека и особенности циркуляции норовирусов геногрупп I и II
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие калицивирусов человека и особенности циркуляции норовирусов геногрупп I и II"

На правах рукописи

Луковникова Любовь Борисовна

Генетическое разнообразие калнцивирусов человека и особенности циркуляции норовирусов геногрупп I и II

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ии^4813В2

Москва-2009

003481362

Работа выполнена в ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор,

Новикова Надежда Алексеевна

Офнциальныеоппоненты:

доктор биологических наук, Королев Михаил Борисович

кандидат медицинских наук, Подколзин Александр Тихонович

Ведущая организация: ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им .М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан «А^» Д_2009 г.

Защита состоится ¿¿ОЛ* _2009 г. в часов30\

минут на

Ученый секретарь диссертационного < кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени известно, что калицивирусы человека (семейство Caliciviridae, род Noroviriis, род Sapoviriis) являются причиной острого гастроэнтерита у детей и взрослых, при этом норовирусы обусловливают возникновение эпидемий острого гастроэнтерита в различных странах [de Wit, 2001; Green, 1997]. По данным зарубежных исследователей до 90% вспышек ОКИ могут быть ассоциированы с норовирусами [Fankhauser, 2002]. В то же время роль представителей семейства калицивирусов в возникновении спорадических случаев острого гастроэнтерита требует дальнейшего изучения.

Ежегодно норовирусы вызывают 64 000 эпизодов диареи, требующих госпитализации, 900 000 посещений клиник детьми в развитых странах и до 200 000 смертельных случаев детей в возрасте до 5 лет в развивающихся странах [Patel, 2008]. Исследования последних лет показывают, что значение норовирусной инфекции в кишечной патологии детей первых лет жизни было недооценено во всем мире [Koopmans, 2008]. Все вышеизложенное определяет современное внимание к калицивирусам в плане изучения их разнообразия и значимости отдельных геновариантов в возникновении острого гастроэнтерита у детей, конечной целью которого является разработка норовирусной вакцины [Atreya, 2004; Duizer, 2004].

Геном калицивирусов характеризуется уникальной вариабельностью нуклеотндной последовательности. Так, среди представителей норовирусов отмечают низкую гомологию нуклеотидных последовательностей отдельных генов -36% по гену хеликазы и 53-64% по гену полимеразы [Matsuno, 1997; Vinje, 2000; Wang, 1994]. Несомненно, это затрудняет разработку универсальной тест-системы для обнаружения РНК калицивирусов человека. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома среди норовирусов выделяют семь геногрупп (GI-GVII), из которых только представители геногрупп I, II и IV патогенны для человека. При этом среди норовирусов наиболее распространенной второй геногруппы идентифицируют 23 генотипа [Phan, 2007]. Саповирусы классифицированы в пять геногрупп (GI-GV), из которых представители геногрупп I, II, IV и V инфицируют людей [Hansman, 2005].

Изучение капицивирусной инфекции в России носит фрагментарный характер. К началу наших исследований показана циркуляция калицивирусов на территории г. Москвы и г. Санкт-Петербурга, где частота обнаружения калицивирусов у детей, госпитализированных с ОКИ составила 6,4% и 12,6%, соответственно [Мухина, 2002; Сироткин, 2003]. Данные о молекулярно-биологической характеристике циркулирующих штаммов были представлены только для г. Москвы 2001-03 гт. [Мухина, 2002: Подколзин, 2004]. Недостаточно изучены распространенность отдельных генотипов калицивирусов на различных территориях России. Отсутствуют сведения о геновариантах норовирусов и временных особенностях их циркуляции. В связи с вышеизложенным представляло научно-практический интерес проведение

исследований по изучению молекулярно-биологических свойств калицивирусов (норовирусов, саповирусов) и особенностей их циркуляции среди детей Нижегородской области.

Цель исследования: изучение генетического разнообразия калицивирусов человека и анализ особенностей циркуляции их геновариантов среди детей Нижегородской области в 2003-08 гг. Задачи исследования:

1. Оптимизировать методику ПЦР для универсальной детекции калицивирусов человека (норовирусов и саповирусов различных генотипов).

2. Провести обнаружение калицивирусов у детей, госпитализированных с острой кишечной инфекцией, оценить распространенность калицивирусов на территориях Нижегородской области.

3. Провести генотипирование выявленных калицивирусов с использованием ПЦР NvGI/GII. Определить их относительное распределение и возрастную группу риска.

4. Установить первичную структуру фрагментов генома выделенных изолятов калицивирусов, идентифицировать геноварианты.

6. Изучить филогенетические отношения нижегородских вариантов калицивирусов и штаммов калицивирусов, выделенных на других территориях земного шара.

7. Провести анализ частоты обнаружения калицивирусов (норовирусов) в многолетней и годовой динамике.

Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан способ выделения РНК кишечных вирусов, в том числе калицивирусов, для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции, позволяющий избежать возможного ингибирования реакции. Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2313792 от 27.12.2007, приоритет от 10.04.2006.). Способ используется при проведении научно-исследовательской работы по изучению кишечных вирусов в ФГУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Акт внедрения от 05.02.09).

Оптимизирован метод ПЦР для универсальной детекции норо- и саповирусов, что позволило провести скрининговые исследования на большой выборке по обнаружению калицивирусов человека, циркулирующих на территории Нижегородской области. Методические разработки могут стать основой создания тест-системы на основе ПЦР для универсальной детекции РНК калицивирусов человека.

Впервые показана выраженная гетерогенность нижегородской популяции кшшцивирусов человека, которая в 2004-08 гг. была представлена как минимум норовирусами геногруппы I, норовирусами геногруппы II (генотипы Gll.b, G1I.2, GI1.6, GII.7, GII.4 - варианты 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногрупп I (GI.l, GI.2) и II (GI1.1).

Идентифицирован новый вариант норовирусов - NvGII.4-H.H.2008. Различия в нуклеотидной последовательности с другими вариантами NvGII.4 составили 4,7%-

8,4%, N/S регион данного варианта имеет аминокислотные замены в позициях (по вирусу Lordsdale): 1709-PnaQ, 1738-А на V, 1741 -М nal, 1771-LHaD.

Установленные нуклеотидные последовательности норовирусов депонированы в GenBank под номерами EU620235 - EU620247, FJ743692 - FJ743694, что расширяет международную базу иуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу и белок капсида калицивирусов человека.

В процессе работы была установлена этиологическая роль калицивирусов в возникновении 294 эпизодов острого гастроэнтерита. Результаты исследований оперативно сообщались лечащим врачам для выбора адекватной стратегии лечения детей (Акт внедрения от 30.01.09) и ежеквартально направлялись во ФГУЗ «Центр ГиЭ в Нижегородской области» и Управление Роспотребнадзора по Нижегородской области, где использовались для расчета доли ОКИ установленной этиологии в официальной статистике инфекционной заболеваемости в Нижегородской области (Акт внедрения от 11.02.09.).

Составлен аналитический обзор «Роль калицивирусов в кишечной патологии детей и взрослых», который может быть использован при подготовке нормативно-методических документов Роспотребнадзора (письмо ФС Роспотребнадзора от 14.11.06 №0100/12159-06-26).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Калицивирусы широко распространены на территории Нижегородской области.

2. Нижегородская популяция калицивирусов представлена как минимум норовирусами геногруппы I, геногруппы II генотипов Gll.b, GII.2, G1I.6, GII.7 и GII.4 (вариант 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногруппы I (GI.l, GI.2) и геногруппы II (GII.1).

3. Особенностью циркуляции норовирусов в г. Нижнем Новгороде в 2006-08 гг. явилось доминирование NvGII.4, последовательная смена его геновариантов.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на заседании Нижегородского отделения научного биохимического общества (г. Нижний Новгород, 2006 г.);

• на четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.)

• на заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Нижний Новгород, 2008 г.)

• на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск, Московской области, 2009 г.).

• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 214 источников литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 5 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Диссертационная работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной в качестве фрагмента «Этиология вирусных кишечных инфекций у детей» (№ 01.2.003 12243) к договору с Роспотребнадзором № 82-Д от 31 декабря 2005г «Разработка комплексных мероприятий по диагностике, профилактике, лечению и эпиднадзору за актуальными инфекциями».

На разных этапах в работе приняли участие Д.В. Новиков, О.В. Парфенова, Н.В. Епифанова - автор приносит им искреннюю благодарность. Автор выражает глубокую признательность за неоценимую помощь в выполнении работы научному руководителю д.б.н., профессору H.A. Новиковой.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследования.

Объектом исследования явились калицивирусы, обнаруженные у детей в возрасте до 14 лет, госпитализированных с ОКИ в инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода (ДИБ №8) и семи городов Нижегородской области в период 2003-2008 гг. (п=4174).

В работе использовали:

• Нуклеотидные последовательности генома калицивирусов человека и других кишечных вирусов, собранных в базе данных GenBank/EMBL/ DDBJ [http://wrww.ncbi.nlm.n¡h.gov/pubmed/]. Всего использовано 92 последовательности.

• Компьютерные программы: MEGA 3.1, 2004 [Kumar, 2004]; «Oligo 4,0», 198991 (США); BLAST [http://vvww.ncbi.film.nih.gov/BLAST/].

РНК калицивирусов выделяли методом высокосолевой очистки (патент №2313792) и с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению.

Обнаружение РНК калицивирусов проводили с использованием универсальных праймеров предложенных Jiang и соавт. (1999 г.), в собственной модификации. Типирование калицивирусов проводили с использованием лабораторных вариантов ОТ-ПЦР и комплекта реагентов для ПЦР «АмплиСенс Norovirus 1, 2 genotypes-333/322», производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции производителя. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Определение первичной структуры кДНК осуществляли в автоматическом режиме на приборе ABI Prism 3130, согласно рекомендациям производителя.

Филогенетический анализ штаммов осуществляли по алгоритму Neighbor-joining, модель эволюции Kimura, при помощи программы MEGA 3.1. В каждом случае было проанализировано по 100 псевдорепликатов. На филограммах указывали индексы поддержки более 60. Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности штаммов норовирусов геногруппы I, норовирусов геногруппы И и саповирусов, представленных в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ.

Статистическую обработку осуществляли общепринятым методом с использованием коэффициента Стьюдента [Гланц, 1999].

Результаты и их обсуждение.

Обнаружение калицивирусов у детей, госпитализированных с ОКИ.

На первом этапе исследования была проведена работа по оптимизации ПЦР для универсальной детекции норо- и саповирусов. Необходимость оптимизации была продиктована задачей проведения массовых исследований и результатами анализа научной литературы, в которой представлены праймеры для универсальной детекции норо- и саповирусов, подобраные более 10 лет назад, что требовало их анализа и модификации с целью адаптации к современным штаммам калицивирусов.

Как наиболее консервативная нами была отобрана пара универсальных для норо- и саповирусов праймеров, предложенная X. Jiang и соавт., при использовании которых продуктом ПЦР является фрагмент кДНК размером 319 п.н. для норовирусов и 331 п.н. - для саповирусов. Данная пара праймеров (р290/р289) была сконструирована авторами на основе компьютерного анализа 25 штаммов калицивирусов человека, представляющих 11 генетических кластеров.

С использованием программы MEGA 3.1 нами была проведена теоретическая оценка выбранных праймеров на основе сравнительного анализа с 18-ю выровненными нуклеотидными последовательностями норовирусов геногрупп I, II и саповирусов, представленными в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ к моменту начала исследований. Выбранные праймеры были модифицированы с учетом имеющихся у разных изолятов нуклеотидных замен. Прямой праймер был модифицирован незначительно путем введения вырожденных оснований. У анализируемых последовательностей 5'-конец, соответствующий обратному праймеру, характеризовался большой вариабельностью. Наша модификация заключалась в удалении пяти концевых нуклеотидов, в результате чего 5'-конец был стабилизирован консервативными нуклеотидами. Модифицированные праймеры фланкируют участок гена РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) размером 314 п.н. для норовирусов и 326 п.н. для саповирусов. Различия в размере фрагментов связаны с наличием вставки 12 п.н. в геноме саповирусов. Путем выравнивания 14-ти нуклеотидных последовательностей генома ротавирусов (ген RdRp), энтеровирусов.

астровирусов, аденовирусов, вируса гепатита А с последовательностями модифицированных праймеров установлено, что данные олигонуклеотиды специфичны в отношении гена Кс1Кр калицивирусов человека и не имеют существенной гомологии с нуклеотидными последовательностями других кишечных вирусов.

Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на пробах, содержащих РНК норовирусов, саповирусов и других кишечных вирусов. Показана специфическая амплификация фрагмета генома норовирусов геногрупп I, II и саповирусов и отсутствие амплификации кДНК генома ротавирусов и энтеровирусов. С целью экспериментального подтверждения целесообразности и эффективности модификации праймеров р289/р290 также проведен сравнительный анализ методик амплификации кДНК генома калицивирусов с использованием комплекта реагентов для ПЦР «АмплиСенс Копшгш 1,2 §епо1урез-333/322» и лабораторных методик с использованием праймеров р290/р289 и модифицированных праймеров ^РД^Л. Полученные результаты свидетельствовали о специфичности и большей чувствительности модифицированных универсачьных олигонуклеотидов в отношении современных штаммов норовирусов и обосновали применение оптимизированной методики для массовых исследований по обнаружению калицивирусов человека.

Было проведено исследование 4174 образцов копроматериала детей с ОКИ, госпитализированных в инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода и 7-ми районных центров Нижегородской области в разные периоды 2003-2008 гг. Калицивирусы были выявлены в 294 случаях, что составило 7,0±0,39% от числа обследованных (табл. 1).

Частота обнаружения калицивирусов на разных территориях Нижегородской области колебалась в широких пределах. Так в одном из районных центров Нижегородской области (г. Арзамас) калицивирусы не были найдены. Наименьшей частотой обнаружения калицивирусов характеризовался г. Кстово, где калицивирусы были выявлены у 1,3+1,26% обследованных детей с ОКИ. Наиболее часто калицивирусы выявлялись в г. Дзержинске - 10,3±1,26%.

Рассчитана частота обнаружения калицивирусов в разных возрастных группах детей. Калицивирусы были обнаружены в 7,6±0,48% у детей в возрасте до 3-х лет, в 6,7±0,96% - у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 4,2±0,92% - у детей от 6 до 14 лет. При этом частота обнаружения калицивирусов у детей с ОКИ в возрасте от 0 до 3-х лет оказалась достоверно выше, чем у детей в возрасте от 6 до 14 лет (р<0,001).

Проведенные массовые исследования по обнаружению калицивирусов у детей, госпитализированных с ОКИ, позволили сформировать выборку изолятов калицивирусов для изучения их генетического разнообразия.

Таблица 1.

Частота обнаружения калицивирусов человека у детей в возрасте до 14 лет, госпитализированных с острой кишечной инфекцией в Нижегородской области

и г. Нижнем Новгороде

№ Территория Годы наблюдения Обследовано Выявлено

Нижегородская область: абс. %±т

1 Дзержинск 2006-2008 583 60 10,3±1,26

2 Павлово 2004-2006 119 9 7,6 ±2,43

3 Бор 2004-2006 238 20 8,4±1,79

4 Балахна 2004-2006 136 7 5,1±1,88

5 Арзамас 2004-2006 НО 0 0,0

6 Кстово 2004-2006 80 I 1,3±1,26

7 Заволжье 2004-2006 105 7 6,7±2,44

Всего: 1371 104 7,6±0,71

Нижний Новгород 2003-2008 2803 190 6,8±0,47

Итого: 4174 294 7,0±0,39

Генопшпцровшше калицивирусов.

Типирование изолятов проводили с использованном комплекта реагентов для ПЦР «АмплиСенс Norovirus 1, 2 genotypes - 333/322», лабораторных вариантов ОТ-ПЦР, специфичных в отношении генома норовирусов геногруппы I, норовирусов геногруппы II (область VP1), саповирусов (область RdRp) и секвенирования фрагментов генома калицивирусов. При исследовании 294 образцов, положительных на калицивирусы, было типировано 209 изолятов. Наличие нетипируемых изолятов калицивирусов, на наш взгляд, может быть связано в ряде случаев с ретроспективностью проведения исследований по генотипированию, а также с присутствием в нижегородской популяции калицивирусов геновариантов норовирусов и саповирусов, характеризующихся уникальной нуклеотидной последовательностью генома. В связи с последим нами проведено исследование 9 положительных на калицивирусы нетипируемых образцов с использованием прямого секвенирования фрагментов кДНК размером 314 п.н. и 326 п.н. области, кодирующей RdRp. Путем сравнительного анализа в программе BLAST установлена их таксономическая принадлежность к кадицивирусам человека: 6 последовательностей фрагмента гена RdRp были идентичны нуклеотидным последовательностям генома NvGII (82-86% гомологии), 3 - геному Sv (88-95% гомологии). Различия в нуклеотидной последовательности фрагмента RdRp нижегородских изолятов калицивирусов, достигающие 18%, могут объяснить наличие нетипируемых изолятов калицивирусов, связанное с циркуляцией вариантов, различающихся уровнем гомологии нуклеотидных последовательностей.

Учитывая комплексные результаты генотипирования 209 изолятов было рассчитано относительное распределение основных представителей калицивирусов человека, циркулирующих среди населения Нижегородской области и на отдельных её территориях. Установлено, что на долю 1\Ч01 приходится 13,9±2,4%, на долю ЖОП - 84,2+2,5%, на долю Бу - 1,9±0,9%. Это соотношение, свидетельствующее о превалирующей доле норовирусов геногруппы II, сохранялось для г. Нижнего Новгорода, г. Дзержинска и районных центров Нижегородской области. Установленное нами соотношение представителей калицивирусов человека в нижегородской популяции соответсгвуег данным, полученным в мире на больших выборках для других территорий.

На следующем этапе работы нами был проведен анализ частоты обнаружения N¥01, М\ОП и Яу у детей с ОКИ разного возраста. Калицивирусы относительно часто обнаруживались у детей с ОКИ в г. Нижнем Новгороде и г. Дзержинске, где наблюдения проводили в течение длительного времени. Это позволило сформировать репрезентативную выборку для анализа частоты обнаружения норовирусов у детей разного возраста на данных территориях (п=3386).

Норовирусы были обнаружены в 5,9±0,46% случаев у детей в возрасте от 0 до 3-х лет, в 3,6+0,65% — у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 3,5±1,1% - у детей в возрасте от 6 до 14 лет. При этом выявлено статистически достоверно частое обнаружение норовирусов у детей в возрасте от 0 до 3-х лет по отношению к другим исследуемым группам детей (р<0,01; р<0,05). На следующем этапе рассчитано распределение детей, инфицированных норовирусами, по шести возрастным группам отдельно для двух территорий. Наиболее часто по отношению к другим возрастным группам детей с НВГЭ, госпитализировались дети в возрасте от 1 до 2-х лет (р<0,05) как в г. Нижнем Новгороде, так и в г. Дзержинске.

Анализ частоты обнаружения и К\ОП у детей с ОКИ в возрасте до 14 лет показал, чтоКуИ обнаруживались в 0,65±0,14% случаев, Т\Ч'ОП - в 4,7±0,36%. При этом Ыу01 были обнаружены в 0,5±0,14% случаев у детей в возрасте от 0 до 3-х лет, в 1,32+0,49% - у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 0,7+0,49% - у детей в возрасте от 6 до 14 лет. То есть, относительно часто ^в! выявлялись у детей старше 3-х лет. 1ЧуОН были обнаружены в 5,4+0,44% случаев у детей в возрасте от 0 до 3-х лет, в 2,3±0,64% - у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 2,8±0,98% - у детей в возрасте от 6 до 14 лет. Таким образом, 1ЧуСП наиболее часто инфицировали детей в возрастной группе до 3-х лет (р<0,001).

Результаты анализа частоты обнаружения Ыув! и МуСШ в разных возрастных группах детей с ОКИ были дополнены анализом распределения детей выделявших КуИ и 1\ЧОП на шесть возрастных групп. Ш'01 обнаруживались во всех возрастных группах детей. Наименее часто Куй1 инфицировали детей в возрасте от 1 г. до 2-х лет, наиболее часто - детей в возрасте от 2-х до 6 лет (63,6%; р<0,01). N¥011 также обнаружены во всех группах детей, однако наиболее часто эти вирусы инфицировали

% SO (%?.{>

"О

£>0 ■■ 50 ■*

41) 2-.J

30 ■ -?! '

0 -i-'-'..........

Д02-Х.ЛМГ ЗГ.-МЯГТ

Рис. I. Распределение детей, инфицированных NvGI и NvGII по возрастным группам

детей до 2-х лет и старше.

детей в возрасте от I г. до 2-х лет (38,1%; р<0,001). Данный анализ позволил нам обнаружить склонность к перераспределению NvGI и NvGII по возрастным группам. Расчет распределения детей, инфицированных NvGI и NvGII по двум возрастным группам (до 2-х лет и старше 2-х лет) показал, что NvGII достоверно чаще инфицируют детей в возрасте до 2-х лет, a NvGI детей более старшего возраста (р<0,001) (рис. 1). Саповирусы были найдены у детей с ОКИ в возрасте 1 год - 1 г. 8 мес.

Таким образом, нами установлено, что группой риска в отношении калицивирусов (норовирусов) являются дети в возрасте до 3-х лет (83,1 %—86,7%), при этом впервые показано, что NvGII наиболее часто инфицируют детей в возрасте до 2-х лет (65,6%), a NvGI - детей более старших возрастных групп (72,7%).

На следующем этапе работы проведено определение нуклеотидных последовательностей генома калицивирусов (норовирусов и саповирусов), обнаруженных у детей с ОГЭ в г. Нижнем Новгороде в 2004. 2005, 2006, 2007 и 2008 гг. Установлена первичная структура 39 фрагментов кДНК 35 изолятов калицивирусов в областях генома, кодирующих RdRp (15 последовательностей) и VP1 (24 последовательности). Четыре изолята охарактеризованы по 2-м областям генома. С использованием программы BLAST 36 последовательностей отнесены к норовирусам геногруппы II. три - к саповирусам. Шестнадцать установленных нуклеотидных последовательностей фрагментов генома калицивирусов депонированы в GenBank под номерами EU620235 - EU620247, FJ743692- FJ743694, что расширяет международную базу нуклеотидных последовательностей калицивирусов.

Установленные нуклеотидные последовательности использовали для проведения филогенетического анализа нижегородских изолятов калицивирусов с последовательностями норовирусов и саповирусов разных геногрупп и генотипов, представленными в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ.

На первом этапе исследования нами были проанализированы нуклеотидные последовательности фрагмента RdRp 12-ти нижегородских изолятов норовирусов геногруппы II и референтных штаммов NvGII генотипов NvGII.l-NvGII.12. Большинство изолятов норовирусов из г. Нижнего Новгорода кластеризовались со штаммами генотипа GII.4 и лишь один - со штаммом G1I.2 (рис. 2). Различия нуклеотидных последовательностей нижегородских изолятов, отнесенных к разным генотипам, составили 21 -28,7%.

Один из нижегородских изолятов норовируса (14995), проявивший филогенетическое родство с норовирусом, выделенным во Франции в 2004 г., отличался от NvGII.4. и NvGII.2. по RdRp на 20 - 22% и 20,3%, соответственно. При анализе в программе BLAST, этот нижегородский изолят показал высокую степень гомологии нуклеотидной последовательности со штаммами норовирусов генотипа GH.b, циркулировавшими в европейских странах в 2000 - 2001 гг. Норовирусы G11.4, обнаруженные в Нижнем Новгороде в 2006-07 гг., проявили генетическую гетерогенность и на филограмме группировались с образованием двух субкластеров (А и Б). В субкластер А входили штаммы NvGII.4, выделенные на территории Европейских стран, а в субкластер Б - выделенные в Японии, Китае, Австралии. Различия в нуклеотидных последовательностях гена RdRp норовирусов этих субкластеров составили 4,8%, а в пределах субкластеров не превышали 1,0%. Полученные результаты свидетельствуют, что среди населения Нижнего Новгорода циркулируют норовирусы NvGII.4., филогенетически родственные, как европейским штаммам, так и штаммам, выделенным в странах Тихоокеанского региона.

Проведен филогенетический анализ на основе фрагмента гена капсидного белка VP1 (размером 349 п.н.) 24 нижегородских изолятов норовирусов и штаммов норовирусов, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ, который подтвердил результаты генотипирования, полученные на основе анализа гена полимеразы для четырех изолятов. Большинство нижегородских изолятов (87,5%) кластеризовалось со штаммами NvGII.4, один изолят (14726) с NvGII.2, один изолят (13041) с NvGII.6 и один изолят (13957) с NvGII.7 (рис. 3). Идентичность нуклеотидных последовательностей нижегородских изолятов с референтными штаммами норовирусов генотипов NvGII.2, NvGII.4, NvGII.6, NvGII.7 составила 92,9-93,6%, 88,1-94,8%, 93,4-95%, и 94,8-98,5%, соответственно. Различия между нуклеотидными последовательностями фрагмента гена VP1 нижегородских изолятов норовирусов различных генотипов составили 23,1-36,3%. Различия между нуклеотидными последовательностями нижегородских изолятов и изолятов норовирусов GII, выделенных в Москве в 2001 г., составили 20,9-34,5%. Нижегородские изоляты NvGII.4 образовали два субкластера, которые формируются изолятами, выделенными

1430-1 Н-Новгеред, 2606

-14342 Н .Новгород, 2036

Kcbe054 Яяоаш, 2005 2530КЛовгорм,2Ш7 248? НЛовгсрад, 2887 255" Н.Новгород. 200? NSW696T Австрии*, 200« 2549 Н .Новгород, 2807 — 14780 Н .Новгород, 2097

_, Awa 040354 Япсшм, 2004

6?ER4424 Аряяшна, ®04

14072 НЯовгарод, 2007

> А

Moscmmgya.fC'adííM Венгрия, 2006 L g

_,2481 ¿.Новгород, 2087 Г

I-14253 Я-НоЕГород, 2007 J

-Snrai Mouataia США, 19S5

GJI.4

,Рий de Raiífc 673 Франта, 2004 114995Н-Новгорад, 2007

■ Ta<Jbítb:sdioíi'í)ám6245 Ггршяи, 2002'

}

Gll.b

- WaidihusTS?; Ггрз,53Я1и, 2002

GII.:

1472Í НЛоЕгсрод,2007

Рис. 2. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей фрагмента гена RdRp (314 п.н.) норовирусов геногруппы II.

Нижегородские изоляты калицивирусов отмечены жирным шрифтом.

до 2008 г. и изолятами, выделенными в 2008 г. Особый интерес представлялся в изучении изолятов норовирусов генотипа GII.4., который в последние годы выявлялся наиболее часто, причем в мире за период с 1995 по 2006 гг. наблюдалась последовательная смена эпидемических вариантов данного генотипа вируса.

Проведен филогенетический анализ нижегородских изолятов, выделенных в 2006-2007 гг. и весной 2008 г., с референтными представителями эпидемических вариантов норовируса GII.4 (рис. 4). В нашем случае один изолят (743) оказался родственен эпидемическому варианту NvGI1.4-2006a. Идентичность нуклеотидной последовательности этого изолята с референтными штаммами NvGII.4 2006а составила 96,2-98,6%. Один изолят (354Д) не примкнул ни к одному из вариантов, но наименьшее различие с соответствующими нуклеотидными последовательностями также проявил по отношению к штаммам варианта NvGII.4 2006а (2,5-5,2%). Идентичность с изолятом 743 составила 95,8%. Большинство исследуемых изолятов (85,7%) кластеризовались с представителями геноварианта NvGII.4 2006b (идентичность 94,7-99,7%). Различия в нуклеотидных последовательностях со штаммами NvGII.4 2006а достигали 8,9%. Следует отметить, что в 2006-07 гг. NvGII.4 вариант 2006b доминировал в большинстве стран мира. Нижегородские изоляты NvGJl.4, циркулировавшие до 2008 г., составили единый субкластер с NvGII.4 вариант 2006b, который был выделен на территории разных стран (Япония, Великобритания, Нидерланды, Австралия). В то же время изоляты NvGII.4,

да

Ш ННовтород. 101Й - TZ Н Новгород. 200S SS4 Н.Новгород. 2008 Н Новгород, 100в ■ »90 ННовгород. 2008 850 ННоагород. :oos ""4 ННомород. 200S Н.Новгород. I00S 643 ННовгород, 2008 т30 Н Новтород. 200S 400 НЛоегород, 2008 -14<Л2Н Новгород. 200:" : iIJOÍl Н.Новгород. 2004 114456 Н.Новгород. 200" Ш5?Н.НовгЧ>од. 2006 14526 Н.Новгор од, 2 00 7

14»2 Н Новгород, ;í.ni~

у до 200S г

>• в 2 OOS г.

100

Г*

Tsdl

г 2557 ННовгород. 2097

■JV 254'í Н.Новгород 200" )-К-Новгород. 2WS

— J54I) Н.Новгор од 2008 ■ LonlAifeGIU

IDO Б"-'*о1М1чя СИ 4 VA9720* GI1P Л i] i- f.-j iL un Gil 8

SúnimUIí GIIS

ULY Gil 5

-tvíi cas

Lwls GII.7 -MrlTClI: S»LIWS7 H. Новгород 1006 ■ Ь'амшШ: СП.« ■ toatiofl Gllö

TO '-13041 ННовгород 2004

- VA.34 СПИ

И»|—

-i-1

I г~ ь

i- Sajuxoal

J]_j- feati'

01 I- ИЛ,

313101 Мо1ыга.ЗШ1

-Hw .m ciu

J- >-1«1Ч ; i'UÍ;(llli Gil 2

-14?2« H Новгород 2007

- MdkdnmGIU ■Mcj'smo

- 40 /2001 Могш. M01

, S6aioiMo<M!.i. »ai

I 98 2001 Москва, Mil Ir mUtasloiiGIIf 'J1 112. SOOIMCHIB,1.2001

Рис. 3. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей фрагмента гена УР1 (349 п.н.) норовирусов геногруппы II.

циркулировавшие весной 2008 г., составили отдельный субкластер в пределах варианта 2006Ь (близкородственный изолят - 5ака!3/2006/Л>, идентичность нуклеотидных последовательностей 98%). Различия в нуклеотидных последовательностях между представителями этих субкластеров достигали 5,6%. Формирование на филограмме субкластеров и высокий уровень различий в нуклеотидных последовательностях УР1 нижегородских изолятов норовирусов, собранных до 2008 г. и весной 2008 г., свидетельствовали о появлении нового геноварианта'Му011.4.

T-iU'.'UII'II"О Нидерланды, 2006

-NZ52 ' Новая Зеландия. 2006

RIiytí40 Велнкоорнгшпы. 2005

-745.ННовгор(|Д,20О$

— Ysrsel^S Нпдер ланды. 2006 i¡Sl Huutei275C Австралия. 2004 ' НчШег5041) Австралия. 2004 } Donjcn-íí. Нидерланды, 2006 Ншиег 234Е Австралия, 2004 95 %-US sri) set США, 19% "I

I-< ■! uil.íjy ¡>1¡H. ("'¡'Ii I lfin i i1 ""'и I

S?- Вщи-asli США, 1995 J

FariíLiugtou Hüls С ША, 2002 Germ anton США, 2002 r

Orfm BNonipimrai. 2002 ->

?54D, H Нмггород2008

-DaiHa»s39 Ннд^лаиды. 2006

-14S"2 ННовгород. 2007

Juuaainoto2 Япония, 2006 SakaiS Япония. 2006

645 H Новгород. 2008

-'мнноегород, 200s

400 ННоЕгоред. 2008

_341 "9? Н Нокгор ад, 2008

1-"72 ННовгород. 2003

SJ0 II Новгород. 200S "1йННовгород, 2003 754 ННовгород, 2Ш S84 Н Новгород, 2003 8W Н Новгород, 2008 -390 Н.НовгЧ.од, 200S

— 2J57H. Новгород. 200' Г^те£еи115 Нидерланды. 2006

- KobeOjU Япония, 2006

Liufolil НоияеВе-ШШобрнтания, 2006 _113051 ННовгород, 2004

14456 Н Новгород. 2007

— 14253 ННовгород, 2006 NSW696T Австралия, 2006 14826 ННовгород, 200т ;549 НЛоы-ород, 2007

вариант

I.lj.ll.lH г

Hantel

вариант 1TS95:9«

вариант F.Ii muigton lililí

вариант ' 2006b

У СП.4-HH.2CCS

200»

■ 14792 Н.Новгород. 2007

Рис.4. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей фрагмента гена VP1 (349 п.н.) норовирусов геногруппы II генотипа 4 различных геновариантов.

В связи с этим мы провели более детальный сравнительный анализ нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностей в области N/S домена VP1 NvGII.4 2006b, циркулировавших в других странах, нижегородских NvGII.4. 2006b 2007 г. и NvGII.4-H.H.2008. Установлено, что в нуклеотидных последовательностях области VP1 генома нижегородских изолятов 2008 г. наблюдаются нуклеотидные замены, не приводящие и приводящие к замене аминокислот (рис. 5).

GrraH2i поящая аиааогэсдот'

Г0» 172 141

Lengde Ы О P Q P T RA N" К T A L

Kobern К Q M

NijmägenlH M M

DenHaagSS M

Lincoln Ноше M

Kumamotoi SaliaiJ M M

2549-' M M

IttiJ1 M

14456-

¡467« M

Ш1 . . Q . . V I . D

7!4> • ■ Q • . . . V I D

m- . . Q . V I . D

71«' . . Q • . V I . D

8ЛЙ . . Q . , . . V 1 . D

390' . . q . . V 1 . D

Рис. 5. Выравиеный участок аминокислотной последовательности N/S домена VP1 штаммов NvGII.4 2006b и нижегородских изолятов NvGII.4, выделенных до 2008 г. и весной 2008 г.

1 - позиции аминокислот отмечены по геному вируса Lordsdale

2 - NvGII.4, циркулировавшие до 2008 г.

3 - NvGII.4, циркулировавшие весной 2008 г.

Идентифицированы четыре аминокислотные замены в позициях 1709 (Р—>Q), 1738 (A->V), 1741 (М->1), 1771 (L-»D). Следует отметить, что подобных замен не выявлено у изолятов NvGII.4 2006b, циркулировавших в г. Нижнем Новгороде до 2008 г., они полностью соответствуют NvGII.4 2006b.

Таким образом, представленные результаты сравнительного анализа нуклеотидных и кодирующих аминокислотных последовательностей N/S домена VP1 норовирусов свидетельствуют, что к 2008 г. в г. Нижнем Новгороде сформировался новый геновариант норовирусов NvG11.4-H.H.2008, у которого различия в нуклеотидных последовательностях с нижегородскими изолятами норовирусов (20062007 гг.) и референтными штаммами NvGII.4 2006b составили 5,6%, аминокислотная последовательность характеризуется наличием четырех уникальных аминокислотных замен в позициях 1709, 1738, 1741, 1771. Позиции аминокислот указаны по геному вируса Lordsdale.

Проведено изучение филогенетических взаимоотношений нижегородских изолятов саповирусов со штаммами SvI-lV, нуклеотидные последовательности генома которых представлены в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ. Два нижегородских изолята саповирусов кластеризовались со штаммами Svl, один- с Sv геногруппы II. Различия в нуклеотидных последовательностях фрагмента гена RdRp саповирусов двух геногрупп составили 30,2-35,3%. В пределах SvGI обнаружены два

изолята, уровень различий между которыми составил 30%. Один из этих изолятов кластеризовался со штаммами SvGI.I (идентичность до 90,9%), а другой - со штаммами SvGI.2 (идентичность до 94,6%).

Таким образом, генотипирование с использованием ПЦР и секвенирования кДНК впервые показало выраженную гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов человека, которая в 2004-08 гг. была представлена как минимум норовирусами геногруппы I, норовирусами геногруппы II (генотипы Ь, 2, 6, 7, 4 -варианты 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и генетическими вариантами саповирусов, последовательности фрагментов RdRp которых идентичны саповирусам геногруппы I (генотипы 1, 2), саповирусам геногруппы II (генотип 1). Идентифицирован новый геновариант NvGII.4 (NvGlI.4 Н.Н.2008) отличающийся наличием четырех аминокислотных замен в регионе N/S домена VP1. Результаты филогенетического и молекулярно-генетического анализа изолятов норовирусов показали, что на территории г. Нижнего Новгорода до 2008 г. циркулировали варианты норовируса генетически родственные широко распространенному в мире варианту NvGII.4 2006b, а начиная с 2008 г. начал циркуляцию геновариант, ближайшим родственником которого явился штамм Sakai3, Япония.

Изучение ершенных особенностей циркуляции норовирусов различных генотипов.

Проведено изучение временных особенностей циркуляции норовирусов различных генотипов по материалам г. Нижнего Новгорода в период 2003-2008 гг. За данный период времени в г. Нижнем Новгороде было идентифицировано 129 случаев инфицирования норовирусами. Частота обнаружения норовирусов составила 4,6±0,39%.

Проанализирована частота обнаружения норовирусов у детей с ОКИ в течение пяти эпидемических сезонов. Установлено, что данный показатель в разные эпидемические годы колебался от 0,34+0,24% до 6,7±0,96%, при этом в пиковые месяцы частота обнаружения норовирусов достигала 12+4,0 - 16+4,2% (рис. 6). Относительно высокая частота госпитализации детей, инфицированных норовирусами, наблюдалась в сезон 2004-05 гг. и 2006-07 гг. - 5,7+1,1 и 6,7+0,96%, соответственно, что совпадает по времени с глобальными эпидемиями 2004 г. и 2006 г., зафиксированными в мире. Наличие на многолетней кривой двух пиков частоты обнаружения норовирусов, свидетельствующих о существовании двухлетних циклов активной циркуляции норовирусов, также согласуются с результатами многолетних исследований динамики заболеваемости НВГЭ в мире.

Учитывая накопленные знания о доминирующих генотипах норовирусов и существовании периодической смены их геновариаптов, влияющих на рост заболеваемости НВГЭ, мы провели анализ циркуляции геновариантов норовирусов на территории г. Нижнего Новгорода. При генотипировании случайной выборки изолятов норовирусов с использованием секвенирования (п=32) нами было

Рис. 6. Многолетняя динамика обнаружения норовирусов у детей с ОКИ в г. Нижнем Новгороде.

| -чнелоМ^'-положпгельныхлетей ....... -частотаобнаружения№■(%)

идентифицировано пять генотипов норовирусов геногруппы II. Абсолютно доминирующее положение занял генотип 011.4 (78,5%), который по данным многочисленных исследований является доминирующим вариантом ^011.4 во всем мире.

Нами идентифицировано три геноварианта N>011.4 - КуОП.Д 2006а, N¥011.4 2006Ь, N4011.4 НН2008, среди которых на долю N>011.4 2006а пришлось 6,1%, ОП.4 2006Ь 54,5%, 011.4 Н.Н.2008 - 24,2%. Комплексный анализ и использованием нуклеотидных последовательностей, установленных нами, показал, что в сезон 200607 гг. доминирующее положение занял геновариант 011.4 2006Ь, который продолжал циркулировать и в сезон 2007-08 гг. В 2007-08 гг. на фоне циркуляции Ш011.4 2006Ь появился новый генетический вариант, который весной 2008 г. занял доминирующее положение (61,5%), коциркулируя с >1уСН.4 2006а и NN'011.4 2006Ь. То есть, на территории Нижнего Новгорода нами зафиксирована смена доминирующего генетического варианта норовируса генотипа 011.4 2006Ь/Н.Н.2008, которая проявилась увеличением частоты обнаружения норовирусов у детей, госпитализированных с ОКИ, и явилась причиной увеличения числа госпитализаций детей с НВГЭ весной 2008 г.

калицивирусы обнаруживались практически круглогодично. Положительные находки отсутствовали только в сентябре месяце. Наиболее активная циркуляция калицивирусов отмечена в осенний, зимний и весенний периоды, что подтвердило данные о оеенне-зимне- весенней сезонности НВГЭ.

На следующем этапе по результатам генотипирования калицивирусов, позволившим дифференцировать норовирусы геногрупп I и II и саповирусы, был проведен анализ их сезонной циркуляции. Саповирусы были идентифицированы в единичных случаях. Все находки были сделаны в разные месяцы года - в июне, августе, октябре, декабре. Исходя из этого следует полагать, что помесячная динамика частоты обнаружения калицивирусов соответствует таковой для норовирусов. Установлено, что помесячная динамика частоты обнаружения ЫуИ и ИуСП имеет свои особенности (рис. 7).

Так в г. Нижнем Новгороде частота обнаружения увеличивалась в августе,

ноябре и декабре месяцах. Увеличение частоты обнаружения 1Чу01 в декабре месяце было отмечено также и в г. Дзержинске. В тоже время ИуСП обнаруживались у детей, госпитализированных с ОКИ в Нижегородской области с ноября по август, что наблюдалось и в г. Нижнем Новгороде и в г. Дзержинске. Увеличение частоты обнаружения >}уОН отмечено в декабре (11,4%), феврале (15,3%), апреле (16,5%), июне (8.5%) месяцах, то есть имела место зимне-весенняя сезонность их активной циркуляции. Среднемноголетние кривые годовой динамики обнаружения норовирусов у детей с ОГЭ, отражая общую картину сезонности, нивелируют особенности, характерные для отдельных эпидемических периодов, что особенно актуально для ЫуОП. Проведен сравнительный анализ кривых годовой динамики обнаружения Куй1 в г. Нижнем Новгороде в рамках пяти сезонов. Выявлены особенности отдельных лет по началу и продолжительности периодов активной циркуляции >М311. Установлено, что периоды активной циркуляции ЫуОИ являются кратковременными и занимают 2-4 месяца (рис. 8). В разные годы активная циркуляция ЫуОИ наблюдалась в разные месяцы. То есть мы зафиксировали последовательное смещение сезонного пика частоты обнаружения вируса в многолетней динамике. Эти результаты, полученные по г. Нижнему Новгороду, подтверждены данными по г. Дзержинску. Мы предполагаем, что последовательное смещение пика частоты обнаружения МуСТ1 имеет связь со сменой геновариантов КуОН.4.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что результате проведенной работы оптимизированы праймеры для универсального обнаружения норо- и саповирусов разных генотипов. Показана широкая распространенность калицивирусов на территории Нижегородской области, установлена частота обнаружения калицивирусов человека у детей, госпитализированных с ОКИ в Нижегородской области (7,0+0,39%). Впервые показана циркуляция на территории Нижегородской области норовирусов геногруппы I, норовирусов геногруппы И, саповирусов и наличие нетипируемых калицивирусов.

iit-..[íijH.. Г <|«;.)ы si.

»• i

H<Híí;]tb

; -uí^t'- u- «ь'ошрь

тп.Ийрь

t|wB|l,l t)>

..M'.tJU

.lílj>t!.ib

Ж1И МЮШ.

шли»

NvGI

|_j - NvCU

ШГШ - 2004-85 rr. (~n - 2965-06 rr. f i - 2006-07гг. I I -2007-OSrr.

Рис. 7. Среднемноголетние кривые помесячной частоты обнаружения норовирусов геногрупп I и II у детей до 14 лет в Нижегородской области в 2003-08 гг. (%)

Рис. 8. Динамика помесячной частоты обнаружения норовирусов геногруппы 11 в г. Нижнем Новгороде в разные сезоны (%).

Установлено, что группой риска в отношении норовирусов являются дети в возрасте до 3-х лет, где NvGII наиболее часто инфицируют детей до 2-х лет, a NvGI -детей более старших возрастных групп. Показана выраженная гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов человека, идентифицирован новый геновариант NvGÜ.4 — Н.Н.2008, отличающийся от широко распространенного варианта NvGII.4 2006b наличием четырех аминокислотных замен в регионе N/S домена VP1. Зафиксирована смена доминирующего генетического варианта норовируса генотипа G1I.4 2006b/II.l 1.2008, которая проявилась увеличением частоты обнаружения норовирусов у детей, госпитализированных с ОКИ, и явилась причиной увеличения числа госпитализаций детей с НВГЭ весной 2008 г. Показано, что калицивирусы могут обнаруживаться у детей с ОКИ в любое время года, преимущественно в осенне-зимне-веееннее время, где NvGI наиболее активно циркулировали в осенне-зимний период, a NvGIl - в зимне-весенние месяцы. Показана кратковременность периодов активной циркуляции NvGII (2-4 месяца) с последовательным смещением пика частоты обнаружения в многолетней динамике, что может быть связано со сменой геновариантов NvGII.4. Полученные результаты расширяют представление о широте циркуляции калицивирусов на территории Нижегородской области, их генетической вариабельности и особенностях

циркуляции геновариантов NvGII.4, и вносят вклад в мировую базу нуклеотидных

последовательностей генома калицивирусов.

вьшоды

1. С использованием оптимизированной методики ПЦР для универсального обнаружения РНК норо- и саповирусов различных генотипов показана широкая распространенность калицивирусов на территории Нижегородской области, частота обнаружения которых у детей с ОКИ составила 7% (1,2-12,6%).

2. Впервые установлено соотношение представителей семейства Caliciviridae в нижегородской популяции: NvGI:NvGII:Sv - 13,9%:84,2%:1,9%.

3. Показано, что группой риска в отношении норовирусов в Нижегородской области являются дети в возрасте до 3-х лет, где NvGII достоверно чаще инфицируют детей в возрасте до 2-х лет, aNvGI - детей более старшего возраста.

4. Впервые установлена выраженная гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов, которая была представлена как минимум восемью вариантами норовирусов: NvGI, NvGII.2, NvGII.6, NvGII.7, NvGll.b, NvGII.4-2006a, NvGII.4-2006b, NvGI1.4-H.H.2008 и тремя вариантами саповирусов: SvGI.l, SvGI.2, SvGII.l.

5. Идентифицирован новый геновариант NvGIl.4 (NvGII.4-H.H.2008), отличающийся от NvGII.4 2006b наличием четырех аминокислотных замен в регионе N/S домена VP1. Различия нуклеотидных последовательностей области VP1 NvGII.4-H.H.2008 и других геиовариантами NvGII.4 составили 4,7-8,4%.

6. Показано, что в период с 2006-08 гг. в нижегородской популяции калицивирусов доминирующее положение занимали варианты NvGII.4.

7. Установлено, что NvGI наиболее часто обнаруживались в осенне-зимние месяцы года, NvGII - в зимне-весенние. Впервые в многолетней динамике показано последовательное смещение сезонного пика частоты обнаружения NvGII с осенних на весенние месяцы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф., Новикова H.A. Обнаружение калицивирусов человека на территории Н.Новгорода. Сборник трудов V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», Москва, 19-21 октября 2004 г. Москва , 2004 , Т. II, С. 60-61.

2. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Новикова H.A. Калицивирусы человека -этиологический агент острого гастроэнтерита // Материалы научной конференция, посвященной 85-летию академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 30 мая 2006 г. Н.Новгород, 2006, С. 161-169.

3. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф., Новикова H.A. Выявление норовирусов у детей разного возраста с острой кишечной инфекцией // Материалы

VII Российского съезда врачей-инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», Нижний Новгород, 25-27 октября 2006 г., Н. Новгород, 2006 г., С. 127 - 127.

4. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Новикова H.A. Эпидемиологические аспекты в изучении норовирусной инфекции в Нижегородской области // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-27 апреля 2007 г., Москва, 2007, т. 1, с. 165-166.

5. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Новикова H.A. Необходимость разработки универсальной системы для изучения циркуляции калицивирусов человека и диагностики калицивирусных гастроэнетеритов // Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2007», Москва, 28-30 ноября 2007 г. Москва , 2007 , Т. III, С. 273-274.

6. Епифанова Н.В., Голицына Л.Н., Луковникова Л.Б., Новикова H.A. Спектр кишечных вирусов, выявляемых у детей с гастроэнтеритом // Вестник Российской Военно-медицинской Академии, 2008, приложение 2(22), (часть II), С. 550.

7. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Новикова H.A. Эпидемиологическая и клиническая характеристика норовирусной инфекции у детей Нижнего Новгорода и Нижегородской области // Вестник Российской Военно-медицинской Академии, 2008, приложение 2(22) (часть II), С. 553-554.

8. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Новиков Д.В., Новикова H.A. Генетическая гетерогенность калицивирусов человека, циркулирующих среди населения Нижегородской области // Материалы четвертой Международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», С.Петербург, 2-4 июня 2008 г., С.-Петербург, 2008, С. 130- 130.

9. Луковннкова Л.Б., Епифанова Н.В., Парфенова О.В., Новикова H.A. Особенности циркуляции норовирусов различных генотипов на территории Нижнего Новгорода в 2003-08 гг. // Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 21-22 апреля 2009 г., Оболенск, 2009, С. 62 - 64.

10. Новикова H.A., Голицына Л.Н., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф., Луковникова Л.Б. Способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2313792, приоритет от 10 апреля 2006 года.

Подписано в печать 25.09.2009 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Заказ № 191 .Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Луковникова, Любовь Борисовна

I ВВЕДЕНИЕ.

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Значимость калицивирусов в инфекционной кишечной патологии человека.

2 Открытие и таксономия семейства Caliciviridae.

3 Структурная и молекулярная организация калицивирусов.

3.1 Архитектура вириона.

3.2 Белки.

3.2 Геном.

4 Генетическое разнообразие калицивирусов.

5 Характеристика эпидемиологических и клинических проявлений калицивирусной инфекции.

5.1 Эпидемиологические аспекты калицивирусной инфекции

5.2 Клинические проявления калицивирусного гастроэнтерита

5.3 Диагностика калицивирусной инфекции.

5.4 Иммунитет и перспективы иммунопрофилактики.

III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1 Исследуемые объекты.

2 Обнаружение и типирование РНК калицивирусов методом ОТ-ПЦР.

3 Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК.

4 Объемы проведенных исследований.

5 Анализ особенностей циркуляции норовирусов.

6 Статистический анализ результатов.

7 Нормативно-методические материалы.

IV РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1 Обнаружение калицивирусов у детей, госпитализированных с

1.1 Оптимизация метода ОТ-ПЦР для выявления РНК калицивирусов.

1.2 Обнаружение калицивирусов с использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР.

2 Генотипирование калицивирусов.

2.1 Идентификация и анализ распределения норовирусов геногрупп I, II и саповирусов.

2.2 Анализ частоты обнаружения норовирусов геногрупп I, II и саповирусов у детей с ОКИ разного возраста.

2.3 Филогенетический анализ штаммов калицивирусов.

3 Изучение временных особенностей циркуляции норовирусов различных генотипов.

3.1 Особенности циркуляции норовирусов в Нижнем

Новгороде в многолетней динамике.

3.2 Анализ годовой динамики частоты обнаружения норовирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическое разнообразие калицивирусов человека и особенности циркуляции норовирусов геногрупп I и II"

Актуальность проблемы. К настоящему времени известно, что калицивирусы человека (семейство Caliciviridae, род Norovirus, род Sapovirns) являются причиной острого гастроэнтерита у детей и взрослых, при этом норовирусы обусловливают возникновение эпидемий острого гастроэнтерита в различных странах [53, 72]. По данным зарубежных исследователей до 90% вспышек ОКИ могут быть ассоциированы с норовирусами [60]. В то же время роль представителей семейства калицивирусов в возникновении спорадических случаев острого гастроэнтерита требует дальнейшего изучения.

Ежегодно норовирусы вызывают 64 ООО эпизодов диареи, требующих госпитализации, 900 ООО посещений клиник детьми в развитых странах и до 200 000 смертельных случаев детей в возрасте до 5 лет в развивающихся странах [175]. Исследования последних лет показывают, что значение норовирусной инфекции в кишечной патологии детей первых лет жизни было недооценено во всем мире [114]. Все вышеизложенное определяет современное внимание к калицивирусам в плане изучения их разнообразия и значимости отдельных геновариантов в возникновении острого гастроэнтерита у детей, конечной целью которого является разработка норовирусной вакцины [24, 58].

Геном калицивирусов характеризуется уникальной вариабельностью нуклеотидной последовательности. Так, среди представителей норовирусов отмечают низкую гомологию нуклеотидных последовательностей отдельных генов — 36% по гену хеликазы и 53-64% по гену полимеразы [144, 202, 205, 211]. Несомненно, это затрудняет разработку универсальной тест-системы для обнаружения РЕК калицивирусов человека. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома среди норовирусов выделяют семь геногрупп (GI—GVII), из которых только представители геногрупп I, II и IV патогенны для человека. При этом среди норовирусов наиболее распространенной второй геногруппы идентифицируют 23 генотипа [178].

Саповирусы классифицированы в пять геногрупп (GI-GV), из которых представители геногрупп I, II, IV и V инфицируют людей [83].

Изучение калицивирусной инфекции в России носит фрагментарный характер. К началу наших исследований показана циркуляция калицивирусов на территории г. Москвы и г. Санкт-Петербурга, где частота обнаружения калицивирусов у детей, госпитализированных с ОКИ, составила 6,4% и 12,6%, соответственно [8, 16]. Данные о молекулярно-биологической характеристике циркулирующих штаммов были представлены только для г. Москвы 2001-03 гг. [8, 10]. Недостаточно изучены распространенность отдельных генотипов калицивирусов на различных территориях России. Отсутствуют сведения о геновариантах норовирусов и временных особенностях их циркуляции. В связи с вышеизложенным представляло научно-практический интерес проведение исследований по изучению молекулярно-биологических свойств калицивирусов (норовирусов, саповирусов) и особенностей их циркуляции среди детей Нижегородской области.

7. Провести анализ частоты обнаружения калицивирусов (норовирусов) в многолетней и годовой динамике.

Впервые показана выраженная гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов человека, которая в 2004-08 гг. была представлена как минимум норовирусами геногруппы I, норовирусами геногруппы II (генотипы GILb, GII.2, GII.6, GII.7, GII.4 - варианты 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногрупп I (GI.l, GI.2) и II (GII.1).

Идентифицирован новый вариант норовирусов — NvGII.4-H.H.2008. Различия в нуклеотидной последовательности с другими вариантами NvGII.4 составили 4,7%-8,4%, N/S регион данного варианта имеет аминокислотные замены в позициях (по вирусу Lordsdale): 1709 - Р на Q, 1738 - А на V, 1741 -М на I, 1771 -LHaD.

Установленные нуклеотидные последовательности норовирусов депонированы в GenBank под номерами EU620235 — EU620247, FJ743692 — FJ743694, что расширяет международную базу нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу и белок капсида калицивирусов человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Калицивирусы широко распространены на территории Нижегородской области.

2. Нижегородская популяция калицивирусов представлена как минимум норовирусами геногруппы I, геногруппы II генотипов GILb, GII.2, GII.6, GII.7 и GII.4 (вариант 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногруппы I (GI.1, GI.2) и геногруппы II (GII.1).

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на заседании Нижегородского отделения научного биохимического общества (г. Нижний Новгород, 2006 г.);

• на четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.)

• на заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Нижний Новгород, 2008 г.)

Объем и структура диссертации:

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Луковникова, Любовь Борисовна

VI выводы

1. С использованием оптимизированной методики ПЦР для универсального обнаружения РЕЙС норо- и саповирусов различных генотипов показана широкая распространенность калицивирусов на территории Нижегородской области, частота обнаружения которых у детей с ОКИ составила 7% (1,212,6%).

3. Показано, что группой риска в отношении норовирусов в Нижегородской области являются дети в возрасте до 3-х лет, где NvGII достоверно чаще инфицируют детей в возрасте до 2-х лет, a NvGI — детей более старшего возраста.

4. Впервые установлена выраженная гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов, которая была представлена как минимум восемью вариантами норовирусов: NvGI, NvGII.2, NvGII.6, NvGII.7, NvGII.b, NvGII.4-2006a, NvGII.4-2006b, NvGII.4-H.H.2008 и тремя вариантами саповирусов: SvGI.l, SvGI.2, SvGII.l.

5. Идентифицирован новый геновариант NvGII.4 (NvGII.4-H.H.2008), отличающийся от NvGII.4 2006b наличием четырех аминокислотных замен в регионе N/S домена VP1. Различия нуклеотидных последовательностей области VP1 NvGII.4-H.H.2008 и других геновариантами NvGII.4 составили 4,7-8,4%.

6. Показано, что в период с 2003-08 гг. в нижегородской популяции калицивирусов доминирующее положение занимали варианты NvGII.4.

7. Установлено, что NvGI наиболее часто обнаруживались в осенне-зимние месяцы года, NvGII — в зимне-весенние. Впервые в многолетней динамике показано последовательное смещение сезонного пика частоты обнаружения NvGII с осенних на весенние месяцы.

V ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значимость калицивирусов в кишечной патологии детей раннего возраста и недостаток данных о молекулярно-биологической характеристике штаммов калицивирусов, циркулирующих на территории России, определили актуальность проведения настоящего исследования.

Работа посвящена изучению генетического разнообразия калицивирусов и особенностей циркуляции их геновариантов на территории Нижегородской области в период с 2003 по 2008 гг. В ходе работы решались задачи по оптимизации методики ПЦР для универсальной детекции калицивирусов человека; обнаружению калицивирусов у детей, госпитализированных с острой кишечной инфекцией; по генотипированию выявленных калицивирусов; определению возрастной группы риска в отношении калицивирусов; установлению первичной структуры фрагментов генома выделенных изолятов калицивирусов; по изучению филогенетических отношений нижегородских вариантов калицивирусов и штаммов калицивирусов, выделенных на других территориях земного шара; анализу частоты обнаружения калицивирусов (норовирусов) в многолетней и годовой динамике.

На первом этапе исследования была проведена работа по оптимизации ПЦР для универсальной детекции норо- и саповирусов. Необходимость такой оптимизации была продиктована задачей проведения массовых исследований и результатами анализа научной литературы, в которой представлены праймеры для универсальной детекции норо- и саповирусов, подобраные более 10 лет назад, что требовало их анализа и модификации с целью адаптации к современным штаммам калицивирусов.

Как наиболее консервативная нами была отобрана пара универсальных для норо- и саповирусов праймеров, предложенная X. Jiang и соавт., при использовании которых продуктом ПЦР является фрагмент кДНК размером 319 п.н. для норовирусов и 331 п.н. - для саповирусов. Данная пара праймеров р290/р289) была сконструирована авторами на основе компьютерного анализа 25 штаммов калицивирусов человека, представляющих 11 генетических кластеров. Праймеры были апробированы авторами на образцах стула от детей с диареей, в которых методом электронной микроскопии были найдены калицивирусы человека.

С использованием программы MEGA 3.1 нами была проведена теоретическая оценка выбранных праймеров на основе сравнительного анализа с 18-ю выровненными нуклеотидными последовательностями норовирусов геногрупп I, II и саповирусов, представленными в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ к моменту начала исследований. Выбранные праймеры были модифицированы с учетом имеющихся у разных изолятов нуклеотидных замен. Прямой праймер был модифицирован незначительно путем введения вырожденных оснований. У анализируемых последовательностей 5'-конец, соответствующий обратному праймеру, характеризовался большой вариабельностью. Наша модификация заключалась в удалении пяти концевых нуклеотидов, в результате чего 5'-конец был стабилизирован консервативными нуклеотидами. Модифицированные праймеры фланкируют участок гена РНК-зависимой РНК-полимеразы размером 314 п.н. для норовирусов и 326 п.н. для саповирусов. Различия в размере фрагментов связаны с наличием вставки 12 п.н. в геноме саповирусов. Путем выравнивания 14-ти нуклеотидных последовательностей генома ротавирусов (ген RdRp), энтеровирусов, астровирусов, аденовирусов, вируса гепатита А с последовательностями модифицированных праймеров установлено, что данные олигонуклеотиды специфичны в отношении гена RdRp калицивирусов человека и не имеют существенной гомологии с нуклеотидными последовательностями других кишечных вирусов.

Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на пробах, содержащих РНК норовирусов, саповирусов и других кишечных вирусов. Показана специфическая амплификация фрагмента генома норовирусов геногрупп I, II и саповирусов и отсутствие амплификации кДНК генома ротавирусов и энтеровирусов. С целью экспериментального подтверждения целесообразности и эффективности модификации праймеров р289/р290 также проведен сравнительный анализ методик амплификации кДНК генома калицивирусов с использованием комплекта реагентов для ПЦР «АмплиСенс Norovirus 1,2 genotypes-333/322» и лабораторных методик с использованием праймеров р290/р289 и модифицированных праймеров NSF/NSR. Полученные результаты свидетельствовали о специфичности и большей чувствительности модифицированных универсальных олигонуклеотидов в отношении современных штаммов норовирусов и обосновали применение оптимизированной методики для массовых исследований по обнаружению калицивирусов человека.

Следующим этапом работы явилось обнаружение калицивирусов человека с использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР. При проведении скрининга образцов на калицивирусы использовался авторский метод выделения РНК кишечных вирусов (Патент № 2313792 от 27.12.2007, приоритет от 10.04.2006.). Было проведено исследование 4174 образцов копроматериала детей с ОКИ, госпитализированных в инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода и 7-ми районных центров Нижегородской области в разные периоды 2003-2008 гг. Калицивирусы были выявлены в 294 случаях, что составило 7,0±0,39% от числа обследованных. Частота обнаружения калицивирусов на разных территориях Нижегородской области колебалась в широких пределах. Так в одном из районных центров Нижегородской области (г. Арзамас) калицивирусы не были найдены. Наименьшей частотой обнаружения калицивирусов характеризовался г. Кстово, где калицивирусы были выявлены у 1,3±1,26% обследованных детей с ОКИ. Наиболее часто калицивирусы выявлялись в г. Дзержинске — 10,3+1,26%. Рассчитана частота обнаружения калицивирусов в разных возрастных группах детей. Калицивирусы были обнаружены в 7,6±0,48% у детей в возрасте до 3-х лет, в 6,7±0,96% - у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 4,2±0,92% - у детей от 6 до 14 лет. При этом частота обнаружения калицивирусов у детей с ОКИ в возрасте от 0 до 3-х лет оказалась достоверно выше, чем у детей в возрасте от 6 до 14 лет (р<0,001). Результаты обнаружения калицивирусов оперативно сообщались лечащим врачам для выбора адекватной стратегии лечения детей (акт внедрения от 30.01.09) и ежеквартально направлялись во ФГУЗ «Центр ГиЭ в Нижегородской области» и Управление Роспотребнадзора по Нижегородской области, где использовались для расчета доли ОКИ установленной этиологии в официальной статистике по инфекционной заболеваемости в Нижегородской области (Акт внедрения от 11.02.09.). Проведенные массовые исследования по обнаружению калицивирусов у детей, госпитализированных с ОКИ, позволили сформировать выборку изолятов калицивирусов для изучения их генетического разнообразия.

На следующем этапе работы проведено изучение генетического разнообразия обнаруженных изолятов калицивирусов. Типирование изолятов проводили с использованием комплекта реагентов для ГТЦР «АмплиСенс Norovirus 1, 2 genotypes — 333/322», лабораторных вариантов ОТ-ПЦР, специфичных в отношении генома норовирусов геногруппы I, норовирусов геногруппы II (область VP1), саповирусов (область RdRp) и секвенирования фрагментов генома калицивирусов. При исследовании 294 образцов, положительных на калицивирусы, было типировано 209 изолятов. На наш взгляд, наличие нетипируемых, как в системе «АмплиСенс», так и в лабораторном варианте niJP-NI,II/S, калицивирусов может быть связано в ряде случаев с ретроспективностью проведения исследований по генотипированию, а также с присутствием в нижегородской популяции калицивирусов геновариантов норовирусов и саповирусов, характеризующихся уникальной нуклеотидной последовательностью генома. В связи с последим нами проведено исследование 9 положительных на калицивирусы нетипируемых образцов с использованием прямого секвенирования фрагментов кДНК размером 314 п.н. и 326 п.н. области, кодирующей RdRp. Путем сравнительного анализа в программе BLAST установлена их таксономическая принадлежность к калицивирусам человека: 6 последовательностей фрагмента гена RdRp были идентичны нуклеотидным последовательностям генома NvGII (82-86% гомологии), 3 - геному Sv (88-95% гомологии). Различия в нуклеотидной последовательности фрагмента RdRp нижегородских изолятов калицивирусов, достигающие 18%, могут объяснить наличие в нижегородской популяции нетипируемых изолятов калицивирусов, связанное с циркуляцией вариантов, различающихся уровнем гомологии нуклеотидных последовательностей.

Учитывая комплексные результаты генотипирования 209 изолятов было рассчитано относительное распределение основных представителей калицивирусов человека, циркулирующих среди населения Нижегородской области и на отдельных её территориях. Установлено, что на долю NvGI приходится 13,9±2,4%, на долю NvGII - 84,2±2,5%, на долю Sv - 1,9+0,9%. Это соотношение, свидетельствующее о превалирующей доле норовирусов геногруппы II, сохранялось для г. Нижнего Новгорода, г. Дзержинска и районных центров Нижегородской области. Установленное нами соотношение представителей калицивирусов человека в нижегородской популяции соответствует данным, полученным в мире на больших выборках для других территорий.

На следующем этапе работы нами был проведен анализ частоты обнаружения NvGI, NvGII и Sv у детей с ОКИ разного возраста. Калицивирусы относительно часто обнаруживались у детей с ОКИ в г. Нижнем Новгороде и г. Дзержинске, где наблюдения проводили в течение длительного времени. Это позволило сформировать репрезентативную выборку для анализа частоты обнаружения норовирусов у детей разного возраста на данных территориях (п=3386).

Норовирусы были обнаружены в 5,9±0,46% случаев у детей в возрасте от 0 до 3-х лет, в 3,6±0,65% - у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 3,5+1,1% - у детей в возрасте от 6 до 14 лет. При этом выявлено статистически достоверно частое обнаружение норовирусов у детей в возрасте от 0 до 3-х лет по отношению к другим исследуемым группам детей (р<0,01; р<0,05). На следующем этапе рассчитано распределение детей, инфицированных норовирусами, по шести возрастным группам отдельно для двух территорий. Наиболее часто по отношению к другим возрастным группам детей с НВГЭ, госпитализировались дети в возрасте от 1 до 2-х лет (р<0,05) как в г. Нижнем Новгороде, так и в г. Дзержинске.

Анализ частоты обнаружения NvGI и NvGII у детей с ОКИ в возрасте до 14 лет показал, что NvGI обнаруживались в 0,65±0,14% случаев, NvGII - в 4,7±0,36%. При этом NvGI были обнаружены в 0,5±0,14% случаев у детей в возрасте от 0 до 3-х лет, в 1,32+0,49% — у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 0,7±0,49% - у детей в возрасте от 6 до 14 лет. То есть, относительно часто NvGI выявлялись у детей старше 3-х лет. NvGII были обнаружены в 5,4±0,44% случаев у детей в возрасте от 0 до 3-х лет, в 2,3±0,64% — у детей в возрасте от 3-х до 6 лет, в 2,8±0,98% — у детей в возрасте от 6 до 14 лет. Таким образом, NvGII наиболее часто инфицировали детей в возрастной группе до 3-х лет (р<0,001). Результаты анализа частоты обнаружения NvGI и NvGII в разных возрастных группах детей с ОКИ были дополнены анализом распределения детей выделявших NvGI и NvGII на шесть возрастных групп (до 6 мес., до 1 г., 1 г., 2 г., 3-6 л., 6-14 л.). NvGI обнаруживались во всех возрастных группах детей. Наименее часто NvGI инфицировали детей в возрасте от 1 г. до 2-х лет, наиболее часто - детей в возрасте от 2-х до 6 лет (63,6%; р<0,01). NvGII также обнаружены во всех группах детей, однако наиболее часто эти вирусы инфицировали детей в возрасте от 1 г. до 2-х лет (38,1%; р<0,001). Данный анализ позволил нам обнаружить склонность к перераспределению NvGI и NvGII по возрастным группам. Расчет распределения детей, инфицированных NvGI и NvGII по двум возрастным группам (до 2-х лет и старше 2-х лет) показал, что NvGII достоверно чаще инфицируют детей в возрасте до 2-х лет, а NvGI детей более старшего возраста (р<0,001).

Саповирусы были найдены у детей с ОКИ в возрасте 1 год - 1 г. 8 мес. Таким образом, нами установлено, что группой риска в отношении калицивирусов (норовирусов) являются дети в возрасте до 3-х лет (83,1%-86,7%), при этом впервые показано, что NvGII наиболее часто инфицируют детей в возрасте до 2-х лет (65,6%), a NvGI — детей более старших возрастных групп (72,7%).

На следующем этапе работы проведено определение нуклеотидных последовательностей генома калицивирусов (норовирусов и саповирусов), обнаруженных у детей с ОГЭ в г. Нижнем Новгороде в 2004, 2005, 2006, 2007 и 2008 гг. Установлена первичная структура 39 фрагментов кДНК 35 изолятов калицивирусов в областях генома, кодирующих RdRp (15 последовательностей) и VP1 (24 последовательности). Четыре изолята охарактеризованы по 2-м областям генома. С использованием программы BLAST 36 последовательностей отнесены к норовирусам геногруппы II, три — к саповирусам. Шестнадцать установленных нуклеотидных последовательностей фрагментов генома калицивирусов депонированы в GenBank под номерами EU620235 - EU620247, FJ743692- FJ743694, что расширяет международную базу нуклеотидных последовательностей калицивирусов.

GenBank/EMBL/DDBJ.

Новгорода кластеризовались со штаммами генотипа GII.4 и лишь один — со штаммом GII.2. Различия нуклеотидных последовательностей нижегородских изолятов, отнесенных к разным генотипам, составили 21 —28,7%.

Один из нижегородских изолятов норовируса (14995), проявивший филогенетическое родство с норовирусом, выделенным во Франции в 2004 г., отличался от NvGII.4. и NvGII.2. по RdRp на 20 - 22% и 20,3%, соответственно. При анализе в программе BLAST, этот нижегородский изолят показал высокую степень гомологии нуклеотидной последовательности со штаммами норовирусов генотипа GILb, циркулировавшими в европейских странах в 2000 - 2001 гг. Нижегородские норовирусы GII.4, обнаруженные в Нижнем Новгороде в 2006-07 гг., проявили генетическую гетерогенность и на филограмме группировались с образованием двух субкластеров (А и Б). В субкластер А входили штаммы NvGII.4, выделенные на территории Европейских стран, а в субкластер Б — выделенные в Японии, Китае, Австралии. Различия в нуклеотидных последовательностях гена RdRp норовирусов этих субкластеров составили 4,8%, а в пределах субкластеров не превышали 1,0%. Полученные результаты свидетельствуют, что среди населения Нижнего Новгорода циркулируют норовирусы NvGII.4., филогенетически родственные, как европейским штаммам, так и штаммам, выделенным в странах Тихоокеанского региона.

NvGII.7 составила 92,9-93,6%, 88,1-94,8%, 93,4-95%, и 94,8-98,5%, соответственно. Различия между нуклеотидными последовательностями фрагмента гена VP1 нижегородских изолятов норовирусов различных генотипов составили 23,1-36,3%. Различия между нуклеотидными последовательностями нижегородских изолятов и изолятов норовирусов GII, выделенных в Москве в 2001 г., составили 20,9-34,5%. Нижегородские изоляты NvGII.4 образовали два субкластера, которые формируются изолятами выделенными до 2008 г. и изолятами выделенными в 2008 г.

Особый интерес представлялся в изучении изолятов норовирусов генотипа GII.4., который в последние годы выявлялся наиболее часто, причем в мире за период с 1995 по 2006 гг. наблюдалась последовательная смена эпидемических вариантов данного генотипа вируса. Проведен филогенетический анализ нижегородских изолятов, выделенных в 2006-2007 гг. и весной 2008 г., с референтными представителями эпидемических вариантов норовируса GII.4. В нашем случае один изолят (743) оказался родственен эпидемическому варианту NvGII.4-2006a. Идентичность нуклеотидной последовательности этого изолята с референтными штаммами NvGII.4 2006а составила 96,2-98,6%. Один изолят (354Д) не примкнул ни к одному из вариантов, но наименьшее различие с соответствующими нуклеотидными последовательностями также проявил по отношению к штаммам варианта NvGII.4 2006а (2,5-5,2%). Идентичность с изолятом 743 составила 95,8%.

Большинство исследуемых изолятов (85,7%) кластеризовались с представителями геноварианта NvGII.4 2006b (идентичность 94,7—99,7%). Различия в нуклеотидных последовательностях со штаммами NvGII.4 2006а достигали 8,9%. Следует отметить, что в 2006-07 гг. NvGII.4 вариант 2006b доминировал в большинстве стран мира. Нижегородские изоляты NvGII.4, циркулировавшие до 2008 г., составили единый субкластер с NvGII.4 вариант 2006b, который был выделен на территории разных стран (Япония, Великобритания, Нидерланды, Австралия). В то же время изоляты NvGII.4, циркулировавшие весной 2008 г., составили отдельный субкластер в пределах варианта 2006b (близкородственный изолят - Sakai3/2006/JP, идентичность нуклеотидных последовательностей 98%). Различия в нуклеотидных последовательностях между представителями этих субкластеров достигали 5,6%. Формирование на филограмме субкластеров и высокий уровень различий в нуклеотидных последовательностях VP1 нижегородских изолятов норовирусов, собранных до 2008 г. и весной 2008 г., свидетельствовали о появлении нового геноварианта NvGII.4. В связи с этим мы провели более детальный сравнительный анализ нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностей в области N/S домена VP1 NvGII.4 2006b, циркулировавших в других странах, нижегородских NvGII.4. 2006b 2007 г. и NvGII.4-H.H.2008. Установлено, что в нуклеотидных последовательностях области VP1 генома нижегородских изолятов 2008 г. наблюдаются нуклеотидные замены, не приводящие и приводящие к замене аминокислот. Идентифицированы четыре аминокислотные замены в позициях 1709 (P—»Q), 1738 (A—»V), 1741 (М—>1), 1771 (L—»D). Следует отметить, что подобных замен не выявлено у изолятов NvGII.4 2006b, циркулировавших в г. Нижнем Новгороде до 2008 г., они полностью соответствуют NvGII.4 2006b.

Таким образом, представленные результаты сравнительного анализа нуклеотидных и кодирующих аминокислотных последовательностей N/S домена VP1 норовирусов свидетельствуют, что к 2008 г. в г. Нижнем Новгороде сформировался новый геновариант норовирусов NvGII.4-H.H.2008, у которого различия в нуклеотидных последовательностях с нижегородскими изолятами норовирусов (2006-2007 гг.) и референтными штаммами NvGII.4 2006b составили 5,6%, аминокислотная последовательность характеризуется наличием четырех уникальных аминокислотных замен в позициях 1709, 1738, 1741, 1771. Позиции аминокислот указаны по геному вируса Lordsdale.

Проведено изучение филогенетических взаимоотношений нижегородских изолятов саповирусов со штаммами SvI-IV, нуклеотидные последовательности генома которых представлены в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ. Два нижегородских изолята саповирусов кластеризовались со штаммами Svl, один — с Sv геногруппы II. Различия в нуклеотидных последовательностях фрагмента гена RdRp саповирусов двух геногрупп составили 30,2—35,3%. В пределах SvGI обнаружены два изолята, уровень различий между которыми составил 30%. Один из этих изолятов кластеризовался со штаммами SvGI.l (идентичность до 90,9%), а другой - со штаммами SvGI.2 (идентичность до 94,6%).

Таким образом, генотипирование с использованием ПЦР и секвенирования кДНК впервые показало выраженную гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов человека, которая в 2004-08 гг. была представлена как минимум норовирусами геногруппы I, норовирусами геногруппы II (генотипы Ь, 2, 6, 7, 4 - варианты 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и генетическими вариантами саповирусов, последовательности фрагментов RdRp которых идентичны саповирусам геногруппы I (генотипы 1, 2), саповирусам геногруппы II (генотип 1). Идентифицирован новый геновариант NvGII.4 (NvGII.4 Н.Н.2008) отличающийся наличием четырех аминокислотных замен в регионе N/S домена VP1. Результаты филогенетического и молекулярно-генетического анализа изолятов норовирусов показали, что на территории г. Нижнего Новгорода до 2008 г. циркулировали варианты норовируса генетически родственные широко распространенному в мире варианту NvGII.4 2006b, а начиная с 2008 г. начал циркуляцию геновариант, ближайшим родственником которого явился штамм Sakai3, Япония.

Проанализирована частота обнаружения норовирусов у детей с ОКИ в течение пяти эпидемических сезонов. Установлено, что данный показатель в разные эпидемические годы колебался от 0,34±0,24% до 6,7±0,96%, при этом в пиковые месяцы частота обнаружения норовирусов достигала 12+4,0% — 16±4,2%. Относительно высокая частота госпитализации детей, инфицированных норовирусами, наблюдалась в сезон 2004-05 гг. и 2006-07 гг. - 5,7±1,1% и 6,7±0,96%, соответственно, что совпадает по времени с глобальными эпидемиями 2004 г. и 2006 г., зафиксированными в мире. Наличие на многолетней кривой двух пиков частоты обнаружения норовирусов, свидетельствующих о существовании двухлетних циклов активной циркуляции норовирусов, также согласуются с результатами многолетних исследований динамики заболеваемости НВГЭ в мире.

Учитывая накопленные знания о доминирующих генотипах норовирусов и существовании периодической смены их геновариантов влияющих на рост заболеваемости НВГЭ мы провели анализ циркуляции геновариантов норовирусов на территории г. Нижнего Новгорода. При генотипировании случайной выборки изолятов норовирусов с использованием секвенирования (п=32) нами было идентифицировано пять генотипов норовирусов геногруппы II. Абсолютно доминирующее положение занял генотип GII.4 (78,5%), который по данным многочисленных исследований является доминирующим вариантом NvGII.4 во всем мире.

Нами идентифицировано три геноварианта NvGII.4 - NvGII.4 2006а, NvGII.4 2006b, NvGII.4 HH2008, среди которых на долю NvGII.4. 2006а пришлось 6,1%, GII.4 2006b 54,5%, GII.4 Н.Н.2008 - 24,2%. Комплексный анализ и использованием нуклеотидных последовательностей установленных нами и депонированных в GenBank Подколзиным А.Т. с соавт. показал, что в сезон 2005-06 гг. в г. Нижнем Новгороде циркулировали норовирусы генотипов GII.3, GII.4 (варианты Hunter, Farmington Hills), GII.7, GII.8. В сезон 2006-07 гг. доминирующее положение занял геновариант GII.4 2006b, который продолжал циркулировать и в сезон 2007-08 гг. В 2007-08 гг. на фоне циркуляции NvGII.4 2006b появился новый генетический вариант, который весной 2008 г. занял доминирующее положение (61,5%), коциркулируя с NvGII.4 2006а и NvGII.4 2006b. То есть, на территории Нижнего Новгорода нами зафиксирована смена доминирующего генетического варианта норовируса генотипа GII.4 2006Ь/Н.Н.2008, которая проявилась увеличением частоты обнаружения норовирусов у детей, госпитализированных с ОКИ до 11,7%, и явилась причиной увеличения числа госпитализаций детей с НВГЭ весной 2008 г.

На следующем этапе работы с целью изучения сезонных особенностей циркуляции калицивирусов на территории Нижегородской области рассчитана среднемноголетняя помесячная частота их обнаружения у детей в возрасте до 14 лет, госпитализированных с ОКИ. Анализ показал, что в Нижегородской области калицивирусы обнаруживались практически круглогодично. Положительные находки отсутствовали только в сентябре месяце. Наиболее активная циркуляция калицивирусов отмечена в осенний, зимний и весенний периоды, что подтвердило данные о осенне-зимне-весенней сезонности НВГЭ.

По результатам генотипирования калицивирусов, позволившего дифференцировать норовирусы геногрупп I и II и саповирусы, был проведен анализ их сезонной циркуляции. Саповирусы были идентифицированы в единичных случаях. Все находки были сделаны в разные месяцы года — в июне, августе, октябре, декабре. Исходя из этого следует полагать, что годовая динамика помесячной частоты обнаружения калицивирусов соответствует таковой для норовирусов.

Установлено, что помесячная динамика частоты обнаружения NvGI и NvGII имеет свои особенности. NvGI наиболее часто обнаруживались в осенне-зимний период. Так в г. Нижнем Новгороде частота обнаружения NvGI увеличивалась в августе, ноябре и декабре месяцах. Увеличение частоты обнаружения NvGI в декабре месяце было отмечено также и в г. Дзержинске. В тоже время NvGII обнаруживались у детей, госпитализированных с ОКИ в Нижегородской области с ноября по август, что наблюдалось и в г. Нижнем Новгороде и в г. Дзержинске. Увеличение частоты обнаружения NvGII отмечено в декабре (11,4%), феврале (15,3%), апреле (16,5%), июне (8,5%) месяцах, то есть имела место зимне-весенняя сезонность их активной циркуляции.

Среднемноголетние кривые годовой динамики обнаружения норовирусов у детей с ОГЭ, отражая общую картину сезонности, нивелируют особенности, характерные для отдельных эпидемических периодов, что особенно актуально для NvGII. Проведен сравнительный анализ кривых годовой динамики обнаружения NvGII в г. Нижнем Новгороде в рамках пяти сезонов. Выявлены особенности отдельных лет по началу и продолжительности периодов активной циркуляции NvGII. Установлено, что периоды активной циркуляции NvGII являются кратковременными и занимают 2-4 месяца. В разные годы активная циркуляция NvGII наблюдалась в разные месяцы. То есть мы зафиксировали последовательное смещение сезонного пика частоты обнаружения вируса в многолетней динамике. Так в 2005-06 гг. наблюдалась кратковременная активность вируса с пиком в декабре 2005 г., в сезон 2006-07 гг. норовирусы обнаруживались с ноября по март, с пиком в феврале месяце 2007 г, а в сезон 2007-2008 гг. NvGII обнаруживались с февраля по июнь с пиками частоты обнаружения в апреле и июне 2008 г. Эти результаты, полученные по г. Нижнему Новгороду, подтверждены данными по г. Дзержинску. Мы предполагаем, что последовательное смещение пика частоты обнаружения NvGII имеет связь со сменой геновариантов NvGII.4.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы оптимизированы праймеры для универсального обнаружения норо- и саповирусов разных генотипов; показана широкая распространенность калицивирусов на территории Нижегородской области; установлена частота обнаружения калицивирусов человека у детей, госпитализированных с ОКИ в Нижегородской области (7,0±0,39%); впервые показана циркуляция на территории Нижегородской области норовирусов геногруппы I (13,9±2,4%), норовирусов геногруппы II (84,2±2,5%), саповирусов

1,9+0,9%) и наличие нетипируемых калицивирусов; установлено, что группой риска в отношении норовирусов являются дети в возрасте до 3-х лет, где NvGII наиболее часто инфицируют детей до 2-х лет, a NvGI - детей более старших возрастных групп; показана выраженная гетерогенность нижегородской популяции калицивирусов человека, которая в 2004-08 гг. была представлена как минимум норовирусами геногруппы I, норовирусами геногруппы II (генотипы Ь, 2, 6, 7, 4 - варианты 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногрупп I (GI.l, GI.2) и II (GII.1); идентифицирован новый геновариант NvGII.4 - Н.Н.2008, отличающийся от широко распространенного варианта NvGII.4 2006b наличием четырех аминокислотных замен в регионе N/S домена VP1; зафиксирована смена доминирующего генетического варианта норовируса генотипа GII.4 2006Ь/Н.Н.2008, которая явилась причиной увеличения частоты обнаружения норовирусов и числа госпитализированных детей с ОГЭ весной 2008 г.; показано, что калицивирусы могут обнаруживаться у детей с ОКИ в любое время года, преимущественно в осенне-зимне-весеннее время, где NvGI наиболее активно циркулировали в осенне-зимний период, a NvGII — в зимне-весенние месяцы; показана кратковременность периодов активной циркуляции NvGII (2-4 месяца) с последовательным смещением пика частоты обнаружения в многолетней динамике, что может быть связано со сменой геновариантов NvGII.4. Полученные результаты расширяют представление о широте циркуляции калицивирусов на территории Нижегородской области, их генетической вариабельности и особенностях циркуляции геновариантов NvGII.4, и вносят вклад в мировую базу нуклеотидных последовательностей генома калицивирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Луковникова, Любовь Борисовна, Нижний Новгород

1. Бишоп Р.Ф. Инфекционные возбудители острой диареи. Гастроэнтерология 2. Тонкая кишка. Пер. с англ./ под ред. B.C. Чадвина, С.Ф. Филлипса. М.: Медицина, 1985. - С. 350 - 351.

2. Буланова И.А., Титова JI.B., Самодова О.В. и др. Этиологическая структура вирусных диарей у детей в Архангельской области // Инфекционные болезни. 2008. - Т. 6, №1. - С. 58 - 60.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. - 4591. С.

4. Горелов А.В., Дорошина Е.А., Подколзин А.Т. Клинико-эпидемиологические особенности течения норовирусной инфекции у детей // Вестник Российской военно-медицинской академии. — 2008. — Приложение (часть II) 2(22). С. 554.

5. Калицивирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение. Методические рекомендации (№21). М. - 2006. - 19 С.

6. Малов В.А., Горобченко А.Н., Городнова Е.А. Вирусные гастроэнтериты // Лечащий врач. 2002. - №11. - С. 54 - 58.

7. Мухина А.А., Шипулин Г.А., Боковой А.Г. и др. Первый опыт изучения калицивирусной инфекции у детей в Москве // Вопросы вирусологии. 2002. -№6.-С. 33-37.

8. Подколзин А.Т., Мухина А.А., Шипулин Г.Г. и др. Изучение этиологии острых кишечных инфекций у детей, госпитализированных в инфекционные1.»отделения стационаров Москвы // Инфекционные болезни. — 2004. — Т.2, №4. — С. 85-91.

9. Подколзин А.Т., Мухина А.А., Шипулин Г.Г. и др. Выявление саповирусов у детей с острыми гастроэнтеритами в Москве в 2002-2003 гг. // Вопросы вирусологии. 2005. — № 2. — С. 27 - 31.

10. Потехина Н.Н., Давыдова Н.А., Разгулин С.А. и др. Основы ретроспективного анализа инфекционной заболеваемости / Под ред. В.В. Шкарина. — Н. Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2000. — 75 С.

11. Радчикова А.Н., Раздьяконова И.В., Сироткин А.К. Эпидемиология норовирусной инфекции у детей и взрослых в С-Петербурге // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. - Приложение (часть II) 2(22).-С. 552-553.

12. Сагалова О.И., Теплова С.Н., Подколзин А.Т. и др. Показатели секреторного иммунитета желудочно-кишечного тракта у взрослых, больных норовирусной инфекцией // Инфекционные болезни. — 2008. — Т. 6, №2. С. 29 -32.

13. Сироткин А.К., Сергеева Н.В., Тихомирова О.В. и др. Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге в 2001 — 2003 гг. //

14. Матер, науч. конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». СПб. — 2003. - С. 117-118.

15. Agus S.G., Dolin R., Wyatt R.G. et al. Acute infectious nonbacterial gastroenteritis: intestinal histopathology. Histologic end enzymatic alterations during illness produced by the Norwalk agent in man //Ann. Intern. Med. — 1973. — Vol. 79. -P. 18-25.

16. Agus S., Falchuk Z., Sessoms C. et al. Increased jejuna IgA synthesis in vitro during acute infectious non bacterial gastroenteritis // Am. J. Dig. Dis. 1977. - Vol. 19. — P. 127-131.

17. Ambert-Balay K., Bon F., Guyader F. et al. Characterization of New Recombinant Noroviruses // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, No. 10. - P. 5179 -5186.

18. Appleton H., Buckley M., Thom В. T. et al. Virus-like particles in winter vomiting disease // Lancet. 1977. - Vol. i. - P. 409 - 411.

19. Atmar R., Ester M. Diagnosis of noncultivatable gastroenteritis viruses, the human caliciviruses // Clin Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14, No. 1 - P. 15 - 37.

20. Atmar R.L., Estes M.K. The epidemiologic and clinical importance of Norovirus infection // Gasrtoenterol. Clin. N.Am. 2006. - Vol. 32. - P. 275 - 290.

21. Atreya C.D. Major foodborne illness causing viruses and current status of vaccines against the diseases // Foodborne. Pathog. Dis. 2004. - Vol. 1, No. 2. - P. 89-96.

22. Ball J.M., Estes M.K., Hardy M.E. et al. Recombinant Norwalk virus-like particles as an oral vaccine // Arch. Virol. 1996. - V. 12. - P. 243 - 249.

23. Ball J.M., Graham D.Y., Opekun A.R. et al. Recombinant Norwalk virus-like particles given orally to volunteers: phase I study // Gastroenterology. — 1999. — Vol. 117, No. l.-P. 255-257.

24. Baron R.C., Murphy F.D., Greenberg M.B. et al. Norwalk gastrointestinal illness: an outbreak associated with swimming in a recreational lake and secondary person-to-person transmission // Am. J. Epidemiol. 1982. - Vol. 115. - P. 163 — 172.

25. Becker K.M., Мое C.L., Southwick K.L. et al. Transmission of Norwalk virus during football game // N. Engl. J. Med. 2000. - Vol. 343. -P. 1223 - 1227.

26. Berg, D.E., Kohn M.A., Farley T.A. et al. Multi-state outbreaks of acute gastroenteritis traced to fecal-contaminated oysters harvested in Louisiana // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181.-P.381 -386.

27. Berke Т., Golding В., Jiang X. et al. Phylogenetic analysis of the Caliciviruses // J. Med. Virol. 1997. - Vol. 52. - P. 419 - 424.

28. Boga J.A., Melo'n S., Nicieza I. et al. Etiology of sporadic cases of pediatric acute gastroenteritis in Asturias, Spain, and genotyping and characterization of Norovirus strains involved // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42, No. 6. - P. 2668 -2674.

29. Bucardo F., Nordgren J., Carlsson B. et al. Pediatric Norovirus diarrhea in Nicaragua // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46, No. 8. - P. 2573 - 2580.

30. Buesa J., Collado В., Lopez-Andujar P. et al. Molecular Epidemiology of Caliciviruses Causing Outbreaks and Sporadic Cases of Acute Gastroenteritis in Spain // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40, No.8. - P. 2854 - 2859.

31. Bull R., Tu E., Mclver C. et al. Emergence of a New Norovirus Genotype II.4 Variant Associated with Global Outbreaks of Gastroenteritis // J. Clin. Microbiol. — 2006. Vol. 44. - P. 327 - 333.

32. Burroughs J.N., Brown F. Presence of a covalently linked protein on calicivirus RNA // J. Gen. Virol. 1978. - Vol. 4. - P. 443 - 446.

33. Campos G.S., Moreau V.H., Bandeira A. et al. Molecular detection and genetic diversity oh norovirus in hospitalized young adults with acute gastroenteritis in Bahia, Brazil // Arch. Virol. 2008. - Vol. 153, No. 6. - P. 1125 - 1129.

34. Cannon R.O., Poliner J.R., Hircshhorn R.B. et al. A multistate outbreak of Norwalk virus gastroenteritis associated with consumption of commercial ice // J. Infect. Dis.- 1991.-Vol. 164.-P. 860-863.

35. Caracciollo S., Minini C., Colombrita D. et al. Detection of sporadic cases of Norovirus infection in hospitalized children in Italy // New Microbiol. 2007. - Vol. 30, No. l.-P. 49-52.

36. Carter M.J., Milton I.D., Meanger J. et al. The complete nucleotide sequence of a feline calicivirus // Virology. 1992. - Vol. 190. - P. 443 - 448.

37. Caul E.O., Appleton H. The electron microscopical and physical characteristics of small round human viruses: An interim scheme classification // J. Med. Virol. -1982.-Vol. 9.-P. 257-265.

38. Chen M.F., Gao Y., Cong X. et al. Etiological study on sporadic viral gastroenteritis among adult in Beijing // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2008. - Vol. 88, No. 4.-P. 265-267.

39. Chharba P., Chitambar S.D. Norovirus genotype lib associated acute gastroenteritis in India // J. Clin. Virol. 2008. - Vol. 42, No. 4. - P. 429 - 432.

40. Chikhi-Brachet R., Bon F., Toubiana L. et al. Virus diversity in a winter epidemic of acute diarrhea in France // J. Clin. Microbiol. — 2002. Vol. 40. — P. 4266 - 4272.

41. Clarke I.N., Lambden P.R. The molecular biology of caliciviruses // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78. - P. 291-301.

42. Clarke I.N., Lambden P.R. Organization and expression of calicivirus genes // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 309 - 316.

43. Clarke I.N., Lambden P.R., Caul E.O. Human enteric RNA viruses: Caliciviruses and astroviruses // In: Mahy BWJ, Collier L, eds. Topley and Wilson's microbiology and microbial infections. London: Arnold. — 1998. — P. 511 - 535.

44. Cooper P.D., Agol V.I., Bachrach H.L. et al. Picornaviridae: second report // Intervirology. 1978. - Vol. 10. - P. 165 -180.

45. Daughenbaugh K., Fraser C.S.H.J.W., Hardy M.E. The genome linked protein VPg of the Norwalk virus binds eIF3, suggesting its role in translation initiation complex recruitment // EMBO J. 2003. - Vol. 22. - P. 2852-2859.

46. Dingle K.E., Lambden P.R., Caul E.O. et al. Human enteric Caliciviridae: the complete genome sequence and expression of virus-like particles from a genetic group II small round structured virus // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 2349 -2355.

47. Dingle K.E. Mutation in a Lordsdale norovirus epidemic strain as a potential indicator of transmission routes // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 3950 -3957.

48. Doane F. W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses // In A. Z. Kapikian (ed.) Viral infections of the gastrointestinal tract. — N.Y.: Marcel Dekker, Inc. 1994. - P. 101 - 130.

49. Duizer E., Schwab K.J., Neill F.H. et al. Laboratory efforts to cultivate noroviruses // J. Gen. Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 79 - 87.

50. Estes M.K., Ball J.M., Guerrero R.A. et al. Norwalk virus vaccines: challenges and progress // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 367 - 373.

51. Fankhauser R.L., Noel J.S., Monroe S.S. et al. Molecular epidemiology of "Norwalk-like viruses" in outbreaks of gastroenteritis in the United States // J. Infect. Dis. 1998. - Vol. 178. - P.1571 - 1578.

52. Fankhauser R.L., Monroe S.S., Noel J.S. et al. Epidemiologic and molecular trends of "Norwalk-like Viruses" associated with outbreaks of gastroenteritis in the United States // J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 186. - P. 1 - 7.

53. Farkas Т., Sestak K., Chao W. et al. Characterization of a rhesus monkey calicivirus representing a new genus of Caliciviridae // J. Virol. 2008. - Vol. 82, No. 11.-P. 5408-5416.

54. Fastier LB. A new feline virus isolated in tissue culture // Am. J. Vet. Res. — 1957.-Vol. 18.-P. 382-389.

55. Flewett Т.Н. Diagnosis of enteritis virus // Proc. R. Soc. Med. — 1976. Vol. 69.-P. 693-696.

56. Gallimore G.I., Iturriza-Gomara M., Xerry et al. Intersesonal diversity of norovirus genotypes: emergence and selection of virus variavts // Arch. Virol. 2007. -Vol. 152.-P. 1595- 1303.

57. Glass P.J., White L.J., Ball J.M. et al. The Norwalk virus ORF3 encodes a minor structural protein // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 6581 - 6591.

58. Glass R.I., Noel J., Ando T. et al. The epidemiology of enteric caliciviruses from humans: a reassessment using new diagnostics // J. Infect. Dis. — 2000. — Vol. 181.-P. 254-261.

59. Gotz H., Ekdahlk K., Lindback J. et al. Clinical spectrum and transmission characteristics of infection with Norwalk-like virus: findings from a large community outbreak in Sweden // Clin. Infect. Dis. 2001. - Vol. 33. - P. 622 - 628.

60. Graham D.Y., Jiang X., Tanaka T. et al. Norwalk virus infection of volunteers: new insights based on improved assays // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 34 — 43.

61. Green J., Gallimore C.I., Norcott J.P. et al. Broadly reactive reverse transcriptase polymerase chain reaction in the diagnosis of SRSV-associated gastroenteritis // J. Med. Virol. 1995. - Vol. 47. - P. 392 - 398.

62. Green J., Henshilwood K., Gallimore C.I. et al. A nested reverse transcriptase PCR assay for detection of small round-structured viruses in environmentally contaminated molluscan shellfish // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. — P. 858-863.

63. Green K. Y. The role of human caliciviruses in epidemic gastroenteritis // Arch. Virol. 1997. - Vol. 13. - P. 153 - 165.

64. Green K.Y. Summary of the First International workshop of human caliciviruses // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 252 - 253.

65. Green K.Y., Ando Т., Balayan M.S. et al. Taxonomy of the caliciviruses // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 322 - 329.

66. Green S.M., Dingle K.E., Lambden P.R. et al. Human enteric Caliciviridae: a new prevalent small round-structured virus group defined by RNA-dependent RNA polymerase and capsid diversity // J. Gen. Virol. 1994. - Vol. 75. - P. 1883 - 1888.

67. Green S. M., Lambden P. R., Caul E. O. et al. Capsid sequence diversity in small round structured viruses from recent UK outbreaks of gastroenteritis // J. Med. Virol.- 1997.-Vol. 52.-P. 14-19.

68. Grohman GS. Viral diarrhoea in children in Australia // In: Tzipori S. Infectious diarrhoea in the young. — Amsterdam: Elsevier Science. 1985. - P. 25 — 28.

69. Grohmann G., Glass R.I., Gold J. et al. Outbreak of human calicivirus gastroenteritis in a day-care center in Sydney, Australia // J. Clin. Microbiol. — 1991. -Vol. 29.-P. 544-550.

70. Guntapong R., Hansman G.S., Oka T. et al. Norovirus and Sapovirus infections in Thailand // Jpn. J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 57, No. 6. - P. 276 - 278.

71. Hale A., Mattick K., Lewis D. et al. Distinct epidemiological patterns of Norwalk-like virus infection // J. Med. Virol. 2000. - Vol. 62. - P. 99 - 103.

72. Hansman G.S., Oka Т., Katayama K. Human sapoviruses: genetic diversity, recombination, and classification // Rev. Med. Virol. 2007. - Vol. 17. - P. 133 — 141.

73. Hansman G.S., Oka Т., Sakon N. et al. Antigenic diversity of human sapoviruses//Emerg. Infect. Dis. 2007.-Vol. 13.-P. 1519- 1525.

74. Hansman G.S., Takeda N., Uka T. et al. Intergenogroup recombination in sapoviruses // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - P. 1916 - 1920.

75. Hardy M.E. Norovirus protein structure and function // FEMS Microbiology Letters. 2005. - Vol. 235. - P. 1 - 8.

76. Hardy M.E., White L.J., Ball J.M. et al. Specific proteolytic cleavage of recombinant Norwalk virus capsid protein // J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 1693 -1698.

77. Harrington P.R., Yount В., Johnston R.E. et al. Systemic, mucosal, and heterotypic immune induction in mice inoculated with Venezuelan equine encephalitis replicons expressing Norwalk virus-like particles // J. Virol. — 2002. -Vol. 76.-P. 730-742.

78. Hedlund K.O., Rubilar-Abreu E., Svensson L. Epidemiology of calicivirus infection in Sweden, 1994-1998 // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 275 - 280.

79. Huang P., Farkas Т., Marionneau S. et al. Noroviruses bind to human ABO, Lewis, and secretor Histo-blood group antigens: identification of 4 distinct strain-specific patterns // J. Infect. Dis. 2003. - Vol. 188. - P. 19 - 31.

80. Huang Z., Elkin G., Maloney B.J. et al. Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis В and Norwalk viruses // Vaccine. — 2005. — Vol. 23. — P.1851 1858.

81. Hutson A.M., Atmar R.L., Markus M.E. et al. Norwalk virus-like particle hemagglutination by binding to h histo-blood group antigens // J. Virol. 2003. -Vol. 77.-P. 405-415.

82. Hutson A.M., Atmar R.L., Estes M.K. Norovirus disease: changing epidemiology and host susceptibility factors // Trends in Microbiology. — 2004. — Vol. 12, No. 6. P. 279 - 286.

83. Ike A.C., Brochmann S.O., Hartelt K. et al. Molecular epidemiology of Norovirus in outbreaks of gastroenteritis in Southwest Germany from 2001 to 2004 // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44, No. 4. - P. 1262 - 1267.

84. Inouye S., Yamashita K., Yamadera S. et al. Surveillance of viral gastroenteritis in Japan: Pediatric cases and outbreak incidents // J. Infect. Dis. -2000. Vol. 181. - P. 270 - 274.

85. Iritani N., Kaida A., Kubo H. et al. Epidemic of genotype GII.2 noroviruses during spring 2004 in Osaka City, Japan // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46, No. 7.-P. 2406-2409.

86. Jiang, X., Wang J., Graham D. Y. et al. Detection of Norwalk virus in stool by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2529 - 2534.

87. Jiang X., Wang M., Graham D. Y. et al. Expression, self-assembly, and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein // J. Virol. — 1992. — Vol. 66. — P. 6527 6532.

88. Jiang X., Wang M., Wang K. et al. Sequence and genomic organization of Norwalk virus // Virology. 1993. - Vol. 195. - P. 51 - 61.

89. Jiang, X., Huang P.W., Zhong W. M. et al. Design and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk- and Sapporo-like Caliciviruses by RT-PCR // J. Virol. Methods. 1999. - Vol. 83. - P. 145 - 154.

90. Jiang X., Cubitt W.D., Berke T. et al. Sapporo-like human Caliciviruses aregenetically and antigenically diverse // Arch. Virol. 1997. — Vol. 142. - P.l 813 -1827.

91. Jin M., Xie H.P., Duan Z.J. et al. Emergence of the GII4/2006b variant and recombinant noroviruses in China // J. Med. Virol. 2008. - Vol. 80, No. 11. - P. 1997-2004.

92. Johnson P.C., Mathewson J.J., DuPont H.L. et al. Multiple-challenge study of host susceptibility to Norwalk gastroenteritis in US adults // J. Infect. Dis. — 1990. -Vol. 161.-P. 18-21.

93. Kageyama Т., Kojima S., Shinohara M. et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, No. 4. - P. 1548 - 1557.

94. Kapikian A.Z., Wyatt R.G., Dolin R. et al. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis // J. Virol. 1972. - Vol. 10. - P. 1075 - 1084.

95. Kaplan J.E., Gary G.W., Baron R.C. et al. Epidemiology of Norwalk gastroenteritis and the role of Norwalk virus in outbreaks of acute nonbacterial gastroenteritis // Ann. Intern. Med. 1982. - Vol. 96. - P. 756 - 761.

96. Katayama K., Miyoshi Т., Uchino K. et al. Novel recombinant Sapovirus // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 1874-1876.

97. Kaufman S.S., Chatterjee N.K., Fuschino M.E. et al. Calicivirus enteritis in an intestinal transplant recipient // Am. J. Transplant. 2003. - Vol. 3. - P. 764 — 768.

98. Kele В., Abrok M.P., Deak J. Sporadic Norovirus infections among hospitalized and non-hospitalized 0-3-year-old infants // Scand. J. Infect. Dis. — 2008. -Vol. 4.-P. 1-3.

99. Kojima S., Kageyama Т., Fukushi S. et al. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses // J. Virol. Methods. 2002. - Vol. 100. - P. 107-114.

100. Koopmans M., Vinje J., de Wit M. et al. Molecular epidemiology of human enteric caliciviruses in the Netherlands // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 262 -269.

101. Koopmans M., Vinje J., Duizer E. et al. Molecular epidemiology of human caliciviruses in the Netherlands // Novartis. Found. Symp. 2001. - Vol. 238. - P. 197-214.

102. Koopmans M. Progress in understanding Norovirus epidemiology // Curr. Opin. Infect. Dis. 2008. - Vol. 21, No. 5. - P. 544 - 552.

103. Kroneman A., Vennema H., Harris J. et al. Increase in norovirus activity reported in Europe // Euro Surveill. 2006. - Vol. 11. - E061214.1.

104. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. 2004. - Vol. 5. - P. 150 - 163.

105. Kuritsky J.N., Osterholm M.T., Greenberg H.B. et al. Norwalk gastroenteritis: a community outbreak associated with bakery product consumption // Ann. Intern. Med.-1984.-Vol. 100.-P. 519 521.

106. La Rosa G., Pourshaban M., Iaconelli M. et al. Detection of genogroup IV noroviruses in environmental and clinical samples and partial sequencing through rapid amplification of cDNA ends // Arch. Virol. 2008. - Vol. 153. - P. 2077 -2083.

107. Lambden P.R., Clarke I.N. Genome organization in the Caliciviridae // Trends Microbiol. 1995. - Vol. 3. - P. 261 - 265.

108. Lawson H.W., Lawson H.B., Braun M.M. et al. Waterborne outbreak of Norwalk virus gastroenteritis at a southwest US resort: role of geological formations in contamination of well water // Lancet. 1991. - Vol. 337. - P. 1200 - 1204.

109. Le Guyader F., Estes M. K., Hardy M. E. et al. Evaluation of a degenerate primer for the PCR detection of human Caliciviruses // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141.-P. 2225-2235.

110. Levett P.N., Gu M., Luan B. et al. Longitudinal study of molecular epidemiology of small round structured viruses in a pediatric population // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 1497 - 1501.

111. Levy A.G., Widerlite Т., Schwartz C.J. et al. Jejunal adenylate cyclase activity in human subjects during viral gastroenteritis // Gastroenterology. 1976. - Vol. 70. -P. 321-325.

112. Lew J.F., Kapikian A.Z., Valdesuso J. et al. Molecular characterization of Hawaii virus and other Norwalk-like viruses: evidence for genetic polymorphism among human Caliciviruses // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 535 - 542.

113. Lindell A.T., Grillner L., Svensson L. et al. Molecular Epidemiology of Norovirus Infections in Stockholm, Sweden, during the Years 2000 to 2003:

114. Association of the GGIIb Genetic Cluster with Infection in Children // J. Clin. Microbiol.-2005.-Vol. 43, No. 3.-P. 1086-1092.

115. Lindesmith L., Мое С., Marionneau S. et al. Human susceptibility and resistance to Norwalk virus infection // Nat. Med. 2003. - Vol. 9. - P. 548 - 553.

116. Lindesmith L.C., Eric F. Donaldson E.F., Anna D. LoBue A.D. et al. Mechanisms of GII.4 Norovirus Persistence in Human Populations // PLoS Medicine. 2008. - Vol. 5. - P. 269 - 290.

117. Liu B.L., Clarke I.N., Caul E.O. et al. Human enteric Caliciviruses have a unique genome structure and are distinct from the Norwalk-like viruses // Arch. Virol.-1995.-Vol. 140.-P. 1345- 1356.

118. Liu В., Clarke I.N., Caul O. et al. The genomic 5' terminus of Manchester calicivirus // Virus Genes. 1997. - Vol. 15. -P. 25 -28.

119. LoBue A.D., Lindesmith L., Yount B. et al. Multivalent norovirus vaccines induce strong mucosal and systemic blocking antibodies against multiple strains // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - P. 5220 - 5234.

120. Long S.M., Adak G.K., O'Brien S.J. et al. General outbreaks of infectious intestinal disease linked with salad vegetables and fruit, England and Wales, 19922000 // Commun. Dis. Public Health. 2002. - Vol. 5. - P. 101 - 105.

121. Lopman В., Vennema H., Kohli E. et al. Increase in viral gastroenteritis outbreaks in Europe and epidemic spread of new Norovirus variant // Lancet. 2004. -Vol. 363.-P. 682-688.

122. Madeley C.R., Cosgrove B.P. Caliciviruses in man // Lancet. 1976. - Vol. 1. -P. 199-200.

123. Madore H.P., Treanor J.J., Dolin R. Characterization of the Snow Mountain agent of viral gastroenteritis // J. Virol. 1986. - Vol. 58. - P. 487 - 492.

124. Malasao R., Maneekarn N., Khamrin P. et al. Genetic diversity of norovirus, sapovirus, and astrovirus isolated from hospitalized with acute gastroenteritis in Chiang Mai, Thailand // J. Med. Virol. 2008. - Vol. 80. - P. 1749 - 1755.

125. Marionneau S., Ruvoen N., Le Moullac-Vaidye B. et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals // Gastroenterology. 2002. - Vol. 122. - P. 1967 - 1977.

126. Marks P.J., Vipond I.B., Careisle D. et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant // Epidemiol. Infect. 2000. - Vol. 124.-P. 481 -487.

127. Martella V., Campolo M., Lorusso E. et al. Norovirus in captive lion cub (Panthera leo) II Emerg.Infect. Dis. 2007.- Vol. 13. - P. 1071 - 1073.

128. Martella V., Lorusso E., Decaro N. et al. Characterization of Canine Norovirus // Emerg.Infect. Dis. 2008. - Vol. 14, No. 8. - P. 1306 - 1308.

129. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93, No. 11. - P. 5335 - 5340.

130. Matson D.O., Zhong W.M., Nakata S. et al. Molecular characterization of a human calicivirus with loser sequence relatedness to animal Caliciviruses than other known human Caliciviruses // J. Med. Virol. 1995. - Vol. 45. - P. 215 - 222.

131. Matsui S.M., Kim J.P., Greenberg H.B. et al. The isolation and characterization of a Norwalk virus-specific cDNA // J. Clin. Investig. 1991. - Vol. 87. - P. 1456 -1461.

132. Matsui S.M., Greenberg H.B. Immunity to Calicivirus Infection // J. Infect. Dis.-2000.-Vol. 181.-P. 331 -335.

133. Matsuno S., Sawada R., Kimura K. et al. Sequence analysis of SRSV in fecal specimens from an epidemic of infantile gastroenteritis, October to December 1995, Japan//J. Med. Virol. 1997. - Vol. 52, No. 4. - P. 377-380.

134. Matthews R.E. Classification and nomenclature of viruses // Intervirology. -1979.-Vol. 12.-P. 129-296.

135. McCarthy M., Estes M.K., Hyams K.C. Norwalk-like virus infection in military forces: epidemic potential, sporadic disease, and the future direction of prevention and control efforts // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 387 - 391.

136. Meeroff G.C., Schreiber D.S., Trier J.S. et al. Abnormal gastric motor function in viral gastroenteritis // Ann. Intern. Med. 1980. - Vol. 92. - P. 370 - 373.

137. Melnick J.L., Agol V.I., Bachrach H.L. et al. Picornaviridae // Intervirology. -1974.-Vol. 4.-P. 303 -316.

138. Meyers G., Wirblich C., Thiel H.J. Genomic and subgenomic RNAs of rabbithemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles // Virology. 1991.-Vol. 184.-P. 677-686.

139. Meyers G., Wirblich C., Thiel H.J. Rabbit hemorrhagic disease virus-molecular cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome // Virology. — 1991. — Vol. 184.-P. 664-676.

140. Мое C.L., Gentsch J., Grohmann G. et al. Application of PCR to detect Norwalk virus in fecal specimens from oubreaks of gastroenteritis // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 642 - 648.

141. Monica В., Ramani S., Banerjee I. et al. Human caliciviruses in symptomatic infections in children in Vellore, South India // J. Med. Virol. 2007. - Vol. 79, No. 5. — P. 544-551.

142. Morotti R.A., Kaufman S.S., Fishbein T.M. et al. Calicivirus infection in pediatric small intestine transplant recipients: pathological considerations // Hum. Pathol. 2004. - Vol. 35. - P. 1236 - 1240.

143. Motomura К., Oka Т., Yokoyama M. et al. Identification of monomorphic and divergent haplotypes in the 2006-2007 norovirus GII/4 epidemic population by genomewide tracing of evolutionary history // J. Virol. 2008. - Vol. 82, No. 22. - P. 11247- 11262.

144. Mounts A.W., Ando Т., Koopmans M. et al. Cold weather seasonality of gastroenteritis associated with Norwalk-like viruses // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. -P. 284 - 287.

145. Murata Т., Katsushima N., Mizuta K. et al. Prolonged Norovirus shedding in infants < or = 6 months of age with gastroenteritis // Pediatr. Infect. Dis. — 2007. -Vol. 26, No. l.-P. 46-49.

146. Nakagomi Т., Correia J.B., Nakagomi О. et al. Norovirus infection among children with acute gastroenteritis in Recife, Brazil: disease severity is comparable to rotavirus gastroenteritis // Arch. Virol. 2008. - Vol. 153, No. 5. - P. 957 - 960.

147. Nakata S., Chiba S., Terashima H. et al. Humoral immunity in infants with gastroenteritis caused by human calicivirus // J. Infect. Dis. — 1985. — Vol. 152. 274 -279.

148. National Institute of Infectious Diseases and Infectious Diseases Control Division. Viral gastroenteritis, Japan, October to December 1995 // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1996. - Vol. 49. - P. 28 - 29.

149. Nayak M.K., Balasubramanian G., Sahoo G.C. et al. Detection of a novel intergenogroup recombinant norovirus from Kolkata, India // Virology. 2008. — Vol. 377,No. l.-P. 117—123.

150. Nguyen T.A., Hoang L., Pham le D. et al. Norovirus and Sapovirus infections among children with acute gastroenteritis in Ho Chi Minh City during 2005-2006 // J. Trop. Pediatr. 2008. - Vol. 54, No. 2. - P. 102 - 113.

151. Noel J.S., Liu B.L., Humphrey C.D. et al. Parkville virus: a novel genetic variant of human calicivirus in the Sapporo virus clade, associated with an outbreak of gastroenteritis in adults // J. Med. Virol. 1997. - Vol. 52. - P. 173 - 178.

152. Noel J.S., Fankhauser R.L., Ando T. et al. Identification of a distinct common strain of "Norwalk-like viruses" having a global distribution // J. Infect. Dis. — 1999. -Vol. 179.-P. 1334-1344.

153. Norovirus activity United States, 2002 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2003. -No. 52.-P. 41 -45.

154. Numata K., Hardy M.E., Nakata S. et al. Molecular characterization of morphologically typical human calicivirus Sapporo // Arch. Virol. — 1997. Vol. 142.-P. 1537-1552.

155. Okabayashi Т., Yokoto S., Ohkoshi Y. et al. Occurrence of norovirus infections unrelated to norovirus outbreaks in an asymptomatic food handler population // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46. - P. 1985 - 1988.

156. Okada S., Sekine S., Ando T. et al. Antigenic characterization of small, round-structured viruses by immune electron microscopy // J. Clin. Microbiol. — 1990. -Vol. 28.-P. 1244-1248.

157. Okada M., Shinozaki K., Ogawa T. et al. Molecular epidemiology and Phylogenetic analysis of Sapporp-like viruses// Arch.Virol. 2002. — Vol. 147. - P. 1445-1451.

158. Olesen В., Neimann J., Bottiger B. et al. Etiology of diarrhea in young children in Denmark: a Case-Control Study // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, No. 8. - P. 3636-3641.

159. Onishi N., Hosoya M., Matsymoto A. et al. Molecular epidemiology of Norovirus gastroenteritis in Soma, Japan, 2001-2003 // Pediatr. Int. 2008. - Vol. 50, No. l.-P. 65-69.

160. Outbreak of acute gastroenteritis associated with Norwalk-like viruses among British military personnel-Afghanistan, May 2002 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002. - No. 51. - P. 477 - 479.

161. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annual. Review of Microbiology. 1990. - Vol. 44. - P. 603 - 623.

162. Pang X., Honma S., Nakata S. et al. Human caliciviruses in acute gastroenteritis of young children in the community // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181.-P. 288-294.

163. Parrino T.A., Schreiber D.S., Trier J.S. et al. Clinical immunity in acute gastroenteritis caused by Norwalk agent // N. Engl. J. Med. 1977. - Vol. 297. - P. 86 - 89.

164. Patel M.M., Widdowson M.A., Glass R.I. et al. Systematic literature review of role of human noroviruses in sporadic gastroenteritis // Emerg. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 14, No. 8.-P. 1224-1231.

165. Patterson Т., Hutchings P., Palmer S. Outbreak of SRSV gastroenteritis at an international conference traced to food handled by a post-symptomatic caterer // Epidemiol. Infect. 1993.-Vol. 11 l.-P. 157-162.

166. Phan T.G., Nguyen Т.A., Yan H. et al. Development of a novel protocol for RT-multiplex PCR to detect diarrheal viruses among infants and children with acute gastroenteritis in Eastern Russia // Clin. Lab. 2005. - Vol. 51. - P. 429 - 435.

167. Phan T.G., Kaneshi K., Ueda Y. et al. Genetic heterogeneity, evolution, and recombination in noroviruses // J. Med. Virol. 2007. - Vol. 79, No. 9. - P. 1388 -1400.

168. Prasad B.V., Rothnagel R., Jiang, X. et al. Three-dimensional structure of baculovirus-expressed Norwalk virus capsids // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 5117-5125.

169. Rockx В., de Wit M., Vennema H. et al. Natural history of human calicivirus infection: a prospective cohort study // Clin. Infect. Dis. — 2002. Vol. 35. - P. 246 — 253.

170. Ryder R.W., Singh N., Reeves W. et al. Evidence of immunity induced by naturally acquired rotavirus and Norwalk virus infection on two remote Panamanian islands // J. Infect. Dis. 1985. - Vol. 151. - P. 99 - 105.

171. Sartorius В., Andersson Y., Velicko I. et al. Outbreak of norovirus in Vastra Gotaland associated with recreational activities at two lakes during August 2004 // Scand. J. Infect. Dis. 2007. - Vol. 39, No 4. - P. 323 -331.

172. Schreiber D.S., Blacklow N.R., Trier J.S. The mukosal lesion of the proximal small intestine in acute infectious nonbacterial gastroenteritis // N. Engl. J. Med. — 1973.-Vol. 288.-P. 1318- 1323.

173. Seah E.L., Gunesekere I.C., Marshall J.A. et al. Variation in ORF3 of genogroup 2 Norwalk-like viruses // Arch. Virol. 1999. - Vol. 144. - P. 1007-1014.

174. Seah EX., Marshall J.A., Wright P.J. Open reading frame 1 of the Norwalk-like virus Camberwell: completion of sequence and expression in mammalian cells // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 10531-10535.

175. Siebenga J., Vennema H., Renchens B. et al. Epochal evolution of GGII.4 norovirus capsid proteins from 1995 to 2006 // J. Virol. 2007. - Vol. 81, No. 18. -P. 9932-9941.

176. Smith A.W., Akers T.G., Madin S.H. et al. San Miguel sea lion virus isolation, preliminary characterization and relationship to vesicular exanthema of swine virus // Nature. 1973. - Vol. 244. - P. 108 - 110.

177. Subekti D., Lesmana M., Tjaniadi P. et al. Incidence of Norwalk-like viruses, rotavirus and adenovirus infection in patients with acute gastroenteritis in Jakarta, Indonesia // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2002. - Vol. 33. - P. 27-33.

178. Svraka S., Duizer E., Vennema H. et al. Etiological Role of Viruses in Outbreaks of Acute Gastroenteritis in The Netherlands from 1994 through 2005 // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45, No. 5. - P. 1389 - 1394.

179. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. 2000. -Vol. 182.-P. 302-305.

180. Tacket C.O., Sztein M.B., Losonsky G.A. et al. Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalk virus-like particles in volunteers // Clin Immunol. -2003.-Vol. 108.-P. 241-247.

181. Tacket C.O. Plant-derived vaccines against diarrheal diseases // Vaccine. -2005.-Vol. 23.-P. 1866-1869.

182. Tan M., Hegde R.S., Jiang X. et al. The P domain of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors // Virol. 2004. — No. 78.-P. 6233-6242.

183. Thornhill T. S., Wyatt R. G., Kalica A. R. et al. Detection by immune electron microscopy of 26-27 nm virus-like particles associated with two family outbreaks of gastroenteritis // Infect. Dis. 1977. - Vol. 135. - P. 20 - 27.

184. Thornton A.C., Jennings-Conklin K.S., Malkanthie I.M. Noroviruses: Agents in Outbreaks of Acute Gastroenteritis // Disaster Management & Response. 2004. -Vol. 2, No. 1.-P.4-9.

185. Tompkins D. S., Hudson M. J., Smith H. R. et al. A study of infectious intestinal disease in England: microbiological findings in cases and controls // Commun. Dis. Public Health. 1999. - Vol. 2. - P. 108 - 113.

186. Traum J. Vesicular exanthema of swine // J. Am.Vet. Med. Assoc. 1936. — Vol. 88.-P. 316-327.

187. Tu E.T., Nguyen Т., Lee P. et al. Norovirus GII.4 strains and outbreaks, Australia // Emerg. Infect. Dis. 2007. - Vol. 13. - P. 1128 - 1130.

188. Tu E., Bull R., Greening G. et al. Epidemics of gastroenteritis during 2006 were associated with the spread of norovirus GII.4 variants 2006a and 2006b // Clin. Infect. Dis. 2008. - Vol. 46. - P. 413 - 420.

189. Venkataram Prasad B.V., Hardy M.E., Estes M.K. Structural studies of rcombinant Norwalk capsids // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 317 - 321.

190. Vinje J., Green J., Lewis D. C. et al. Genetic polymorphism across regions of the three open reading frames of "Norwalk-like viruses." // Arch. Virol. 2000. -Vol. 145.-P. 223-241.

191. Vinje J., Dcyl H., van der Heide R. et al. Molecular detection and epidemiology of Sapporo-like viruses // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 530-536.

192. Vipond I.B., Pelosi E., Williams J.et al. A diagnostic EIA for detection of the prevalent SRSV strain in United Kingdom outbreaks of gastroenteritis // J. Med. Virol.-2000.-Vol. 61.-P. 132- 137.

193. Wang J., Jiang X., Madore H. P. et al. Sequence diversity of small round structured viruses // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 5982 - 5990.

194. Widdowson M.A., Cramer E.H., Hadley L. et al. Outbreaks of acute gastroenteritis on cruise ships and on land: identification of a predominant circulating strain of Norovirus United States, 2002 // J. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 190. - P. 27 -36.

195. Widerlite L., Trier J.S., Blacklow N.R. et al. Structure of the gastric mucosa in acute infectious nonbacterial gastroenteritis // Gastroenterology. — 1975. Vol. 38. — P. 425 - 430.

196. Wilhelmi I., Roman E., Sanchez-Fauquier A. Viruses causing gastroenteritis // Clin. Microbiol. Infect. 2003. - Vol. 9. - P. 247 - 262.

197. Wright P. J., Gunesekere I. C., Doultree J. C. et al. Small round-structured (Norwalk-like) viruses and classical human Caliciviruses in Southeastern Australia, 1980-1996 // J. Med. Virol. 1998. - Vol. 55. - P. 312 - 320.

198. Yoon J.S., Lee S.G., Hong S.K. et al. Molecular epidemiology of Norovirus infections in children with acute gastroenteritis in South Korea in November 2005 through November 2006 // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46, No. 4. - P. 1474 -1477.

199. Zahorsky J. Hyperemesis hiemis or the winter vomiting disease // Arch. Pediatr. 1929. - Vol. 46. - P. 391 - 395.

200. Zheng D.P., Ando Т., Fankhauser R.L. et al. Norovirus classification and proposed strain nomenclature // Virology. 2006. Vol. 346. - P. 312 - 323.

Информация о работе

Луковникова, Любовь Борисовна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Генетическое разнообразие калицивирусов человека и особенности циркуляции норовирусов геногрупп I и II - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы