Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль процесса гомологичной рекомбинации у бактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль процесса гомологичной рекомбинации у бактерий"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАЮДОВ °

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ_ССР /У^

ИНСТИТУТ ФИЗЮЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

БАРАБАНЩИКОВ Борис Иванович

УДК 575. 24:576. 851. 5

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОЦЕССА ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ У БАКТЕРИЙ

ОЗ. 00. 15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КИЕВ - 1989

Работа выполнена на кафедре генетики Казанского государственного университета имени В.И.Ульянова-Ленина

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник

С.В.Каменева

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник

С.С.Малюта

Доктор биологических наук, профессор Б.П.Мацелюх

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится "_"__ 1990 г. в часов

на заседании специализированного совета Д 016.57.01 при Институте физиологии растений и генетики АН УССР по адресу: 252022 Киев, 127, ул» Васильковская, 31-17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан "_" _ 1990 г.

Ученый секретарь .

специализированного совета и

доктор биологических наук Силаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов и установление генетического контроля процесса гомологичной рекомбинации представляет одну из фундаментальных задач современной генетики. Конкретизация представлений о механизме гомологичной рекомбинации связана с использованием микроорганизмов как модельных генетических объектов. Это позволило дока -зать правильность механизма кроссинговера, предложенного Хол-лидеем (Holliday, 1964), КОТОРЫЙ 8ЭТем был уточнен (Meeel-аоп, Radding, 1975). Он объясняет такке образование рекомби-нантов при различных способах обмена генетической информацией у бактерий.

Излюбленным объектом для изучения молекулярных механизмов многих генетических процессов являются клетки е. coli, у данной бактерии описаны разнообразные Ree" мутанты, которые подробно охарактеризованы с генетической и биохимической точек зрения. Многие из гес генов е. coli были клонированы, что помогло выделению и очистке кодируемых ими белков.

Клетки вас. eubtiiie с этой точки зрения изучены менее подробно. Для вас. subtiiis описано несколько гес мутаций, но для большинства из них не известны кодируемые продукты.

В этой связи актуальным представлялось генетическое и биохимическое изучение процессов гомологичной рекомбинации у Вас. subtiiis, учитывая практическое значение бацилл как продуцентов ряда ферментов и белков, а такае перспективу использования клеток данного микроорганизма в качестве реципиентов {локированных генов.

Дели и задачи исследования.Цельа данного исследования являюсь изучение генетического контроля процесса гомологичной ре-сомбинации бактерий на примере трансформации и транедукции у гас. eubtiiie. взаимосвязи рекомбинации с процессами репара-ии и мутагенеза, выяснение роли отдельных ферментов в ука-анных процессах.

Конкретными задачами исследования явились следующие. ) Получение новых Ree" мутантов Вас» subtiiis и характерис-ика их рекомбинационной и репарационной способности, а такае зучеаие особенностей спонтанного и индуцированного мутагене- I -

за. 2) Проведение генетического картирования полученных гес мутаций и установление биохимической природы нарушений, вызываешь данными мутациями. 3) Получение и характеристика мутантов с измененной' активностью АТФ-зависиыой ДНКазы и экзо -нукяеазы I для выяснения роли этих ферментов, в процессах репарации и рекомбинации и возмонности супрессии этих мутаций по аналогии с соответствующими мутантами е. coli. 4) клони -рование генов, кодирующих структуру АТФ-зависимой ДНКазк, и проведение комплементационного анализа с описанными ранее нутациями Вас. subtilie гас Н342, гес Е5 и ЫуТЭЦИЯМИ гес ВС е. coli. 5) Выяснение роли ДНК-гиразы в процессах рекомбинации путем получения и изучения мутантов вас. eubtüie с нарушенной активностью данного ферызнта.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведен генетический и биохимический анализ 26 мутантов с нарушение! способностью к рекомбинации, который позволил выявить 6 новы: генов Вес. eubtili» и в .некоторых случаях установить природу кодируемых ими продуктов.

Впервые для вес. eubtiiie выявлен ген, получивший обозна чение гас и, мутации,в которой снижают активность новой эк зонуклеазы, специфичной к денатурированной ДНК и активируемо ионами Са++. Активность этой нуклеазы требуется для осуществ ления процессов репарации, рекомбинации и индуцированного му тагенеза»

Обнаружен новый ген, получивший обозначение гес т. Мутащ в этой гене повышают чувствительность к ыитомицину, снижая частоту трансформации и трансдукции.

Впервые для вас. subtiiis выявлены мутанты со сниженно! активностью экзонуклеазы I. Ген, кодирующий ее структуру, 61 обозначен как ехо а. Мутации в гене ехо а вызывают резк» повышение чувствительности к УФ-облучению и митомицину,незн: чительное снижение частоты трансформации и трансдукции.

Впервые получена большая коллекция мутантов вас. subtil со сниженной активностью АТФ-зависимой ДНКазы. Генетический комплементационный анализ позволил установить, что изученн мутации затрагивают два рядом расположенных гена, для котор предложено обозначение гес Q и reo R.

Гены гес Q и гес R, клонированные на плазыиде pKui, пс

- 2 -

ностыо восстанавливали экзонуклеазную активность АТФ-зависи -мой ДНКазы в клетках гее в21 гее егг мутанта е. coli и частично супреосировали повышенную чувствительность этого мутанта к УФ-облучению и митомицину. Последующее субклонирование этих генов позволило установить, что ген гее Q кодирует эк~ зонуклеазную субъединицу АТФ-зависимой ДНКазы Вас- subtilia и функционально аналогичен гену гее о е» coli. Продукт гена reo R не идентифицирован, но именно он вызывает супрессию репарационной недостаточности гес в гее с цутанта coli.

Получен инсерционный мутант по гену гес R. Показано, что нарушение процессов репарации и рекомбинации, вызываемое мутацией гес R, супрессируется введением дополнительной мутации ехо а, снижающей активность экзонуклеазы I, аналогично супрессии мутаций е. coli гес в гес с нутацией вЬс в. Таким образом, для клеток вас» subtilia впервые показано наличие множественных метаболических путей рекомбинации.

Обнаружен ыутант со сниженной активностью АКазы, стимулируемой одноцепочечной ДНК» Структурный ген данной АЗФазы по-тучил обозначение гес s. Снижение активности АТфазы приводи-ю к возрастанию экзонуклеазной активности АТФ-зависимой ДНК-)зы. Цутации гес s увеличивают чувствительность к УФ-облуче-[ию и ыитомицину, резко снижают частоту хромосомной трансфор-[ации и приблизительно в 3 раза - частоту транедукции.

Анализ мутантов с нарушенной активностью ДНК-гиразы пока-ал необходимость отрицательной суперспирализации для успеш-ого протекания процессов репарации и рекомбинации.

Впервые показано, что нарушение процессов рекомбинации у ¡уг в мутантов полностью супрессируется повышением активнос-и экзонуклеазы I. Клетки с повышенной активностью экзонукле-зы I обнаруживают гипер- Ree фенотип.

Проведенный анализ позволил составить более полную картину знетического контроля и взаимодействия продуктов разных гес шов в процессе гомологичной рекомбинации вас. subtilia. поденные результаты могут быть использованы при проведении шно-иняенерных и селекционных работ с Вас. subtilia Лодучен-re Ree- мутанты можно испольэовать для определения мутаген-|й активности химических соединений. Получено авторское сви-тельство te 1032766 от 15 декабря 1981 г.

- 3 -

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре генетики Казанского университета в курсах "Молекулярная генетика", "Генетика микроорганизмов", "Избранные главы генетики", на большой практикуме, при выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Х1У Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), на 1У, У и У1 Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1979, 1983, 1987), на 1У и У Всесоюзных съездах генетиков и селекционеров (Кишинев, 1982, Москва, 1987), на У1 рабочем совещании по программе "Плазмида" (Москва, 1981), на X теоретическом семинаре по молекулярной генетике (Пущино, 1981), на I и П Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986), на Всесоюзной итоговой конференции "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1985), на годовых отчетных конференциях сотрудников Казанского университета (1978, 1981, 1982, 1984, 1985, 1986, 1987, 1988).

Публикации.. Основные положения работы опубликованы в 24 печатных статьях, монографии "Механизмы репарации, рекомбинации и мутагенеза бактерий" и учебном пособии "Молекулярная генетика".

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены как лично автором, так и в соавторстве с сотрудниками кафедры генетики Казанского университета, работавшими по; руководством автора. Часть работы, связанная с клонированием генов, выполнена совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики АН СССР (Москва),

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 1 глав, заключения, выводов, раздела "Материалы и методы", приложения, Работа содержит 326 страниц машинописного текст< включая 66 таблиц, 27 рисунков. В списке литературы приведен! 380 наименований.

В первой главе, являющейся обзором литературы, приводите; данные о механизмах генетической трансформации и роли Ree белка в гомологичной рекомбинации. Основные экспериментальны данные изложены во второй - четвертой главах диссертации.

-А -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

i. rec" МУТАНТЫ вас. sijbtilis: ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ

После проверки 75940 колоний, выросших после обработки мутагеном диэтилсульфатом, нами было отобрано 67 различных мутантов с нарушенной способностью к рекомбинации, из которых юдробнее проанализировано 18 штаммов. Генетический и биохими-[еский анализ мутантов составляет основное содержание главы.На »сновании изучения фенотипических особенностей, результатов 'енетического анализа мутанты были разделены на ряд групп.

а) Мутанты с неизмененной чувствительностью к УФ-облучению

Эта группа мутантов оказалась самой многочисленной и вклю-

[ала штаммы КУ-701, КУ-709, КУ-708, КУ-710 и КУ-7П. Все они ^значительно отличались от штамма дикого типа по чувствительности к митоыицину. Чувствительность же к Уф-облучению не бы-ia изменена. У мутантов снижается частота трансформации и со-:раняется нормальный уровень трансдукции (табл. I).

Природа биохимических нарушений в клетках этих мутантов ос-■ается неизвестной. Мутанты вас. subtilis с аналогичными свой-:твами были описаны ранее (Прозоров и др.,1976; Poisineiii

>t al., 1973), но они также остались неохарактеризованными биохимической и генетической точек зрения.

б) Мутанты, аналогичные мутантам гее в

Данную группу составили штаммы КУ-529, КУ-602 и КУ-634, ко-орые по своим фенотипическим характеристикам напоминали ыута-тов по гену гес в. у них повышалась чувствительность к УФ-бяучени» и митомицину, снижалась частота трансформации и рансдукции (таб,я I). Выявленные мутации мы предлагаем обо-начить как гес в529, гес в602, гес в634.

в) Мутанты с нарушением рекомбинации в ограниченной

области хромосомы

Б эту группу вошли штаммы КУ-003, КУ-176 и КУ-413, у кото-ых значительно повышалась чувствительность к УФ-облучени» и итомицину, снижалась частота трансформации (табл. I), а сни-сние частоты трансдукции было неодинаковым по разным марке -ам: почти в 100 раз по локусу his н и только в 2-3 раза по [окусам trp.c и leu а. Последующий генетический анализ по- 5 -

Таблица I Частота рекомбинации по локусу tro с (в %) и чувствительность к УФ-облучению и митоыи-цину (ld37 ) у мутантов Bac.subtiñs с нарушенной способностью к рекомбинации

Частота Частота Доза УФ- Доза ми-Штамм Мутация трансфор- транс- облучения томицина мации дукции (Дж/м2) (нг/мл)

bd-25 гее* 100

КУ-701 Н. ,И. 3

КУ-708 н, • ио II

КУ-709 н.и. 6

КУ-710 н, ,и. 14

КУ-711 н. ,и. 25

КУ-529 re с В529 21

КУ-602 гес В 602 15

КУ-634 гес В634 2

КУ-003 гее гес F1003 В1006 38

КУ-176 гес гес F1004 В1005 32

КУ-413 гес F1007 2

КУ-1003 гес F1003 7

КУ-1004• гес F1C504 7

КУ-1005 гес В1005 17

КУ-1006 гес В1006 23

КУ-1007 гес F1007 2

КУ-421 гес U1 2

КУ-498 гес U2 14

КУ-609 гес из 39

КУ-509 гес Т1 13

КУ-606 гес Т2 12

КУ-645 ехо Al 34

КУ-647 ехо А2 18

100 34 33

100 34 30

100 34 31

ICO 34 . 30

IOQ 34 31

100 34 31

42 25 21

30 . 25 21

12 24 20

46 4 15

30 2,5 12

82 1,3 5

63 3,5 16

53 2 12

77 26 21

32 24 20

69 1,2 4,8

I 30,5 22

10 31 22

34 31 22

31 33 . 24

12 32 23

92 8,2 16

84 - 6,4 14,5

Примечание: н.и. - мутация не идентифицирована

зволил установить, что нарушение рекомбинации при транедукции связано с мутацией в гене гее f. Штаммы КУ-003 и КУ-176 содержали дополнительную мутацию в гене гее в. Чувствительность к УФ-облучению и митомицину у этих штаммов определялась мутацией rec F (табл. I).

Мутация roc F приводила к примерно одинаковому снижению частоты трансформации по всем изученным маркерам. В отношении транедукции картина оказалась иной. Она значительно подавлялась по маркерам met в+ и nic+, а по другим маркерам снижалась примерно в 2 раза (табл. 2).

Таблица 2 Частота транедукции штаммов, содержащих мутацию rec f, посредством фага ar-9

Частота транедукции (х 10"^) Штамм Мутация ---—-----

Pur А+ Lau А+ Met В + Nie*

BD-25 + гее 1,06 2,03 1,48 2,13

100% 100% 100% 100%

КУ-ЮОЗ гее F1003 1,03 1,28 0,32 0,5

62% 63% 22% 23%

КУ-1004 rec F1004 0,94 1,07 0,09 0,07

53% 53% 6% 3%

КУ-1007 rec F1O07 0,89 1.4 0,2 0,15

53% 69% 13% 1%

Для проверки нарушения сцепления близко расположенных гонов под влиянием мутации rec Ficrn ын сконструировали штамм, в котором содержалось 4 ауксотрофные мутации, расположенные в ограниченной области хромосомы. Оказалось, что в клетках этого штамма величина котранедукции сцепленных генов с -hl» н и leu а - nie оказалась значительно меньше и различалась в зависимости от того, по какому маркеру вели селекцию транедуктантов. Совместная передача более удаленных генов не происходила в этом случае совсем. Подобное нарушение рекомбинации объясняется тем, что в результате мутации rec f в хромосому реципиента встраиваются короткие фрагменты транедуциру-

ющего фага. Это ведет к нарушению частоты рекомбинации по отдельный иаркераы и изменению степени сцепления между ними.

Ген rec f Вас. subtiiis, как оказалось, аналогичен гену rec F Е. coli (Ogas'aware et el., 1985).

г) Мутанты со сниженной активностью экзонуклеазы, активируемой ионами Ca"1"1"

У мутантов КУ-421, КУ-498 и КУ-609 оказалась сниженной до 8—50% активность экзонуклеазы, активируемой ионами Са++. Наибольшее снижение активности нуклеазы отмечено у штамма КУ-421 - почти в 12 раз по сравнению с клетками дикого типа.

Данный фермент впервые был обнаружен на кафедре микробиологии Казанского университета в лизате компетентных клеток вас. subtiiis. Пик активности фермента проявлялся в начале экспоненциальной фазы роста в присутствии ионов Са++.

У мутантов данной группы снижается частота трансформации (табл. I). Сильнее всего этот процесс подавлен в клетках штамма КУ-4-21, обладающих наименьшей активностью нуклеазы. Такая же закономерность отмечается и в отношении транедукции.

Ыутанты обладали повышенной чувствительностью к митомицину и в несколько меньшей степени - к Уф-облучению (табл. I).

Таким образом, активность экзонуклеазы, активируемой ионами Са++, требуется для осуществления процессов репарации и рекомбинации. Эта нуклеаза входит в состав мембрано-нуклеопроте-идного комплекса (Белов, Белова, 1984), в который включены многие ферменты, контролирующие процесс репарации и рекомбинации в клетках вас. subtiiis. снижение активности этой нуклеазы может сказаться на функционировании всего комплекса ферментов, что приводит к незначительному нарушению репарации и более сильному - рекомбинации.

В табл. 3 и 4 приведены данные о частоте возникновения реверсий к лейцин- и гистидиннезависимости под действием УФ-об-лучения и митомицина. В клетках штамма КУ-421 как после УФ-облучения, так и после обработки митомицином ревертанты не возникают. Мутанты вас. subtiiis с полным подавлением индуцированного мутагенеза описаны нами впервые.

Тесная взаимосвязь процессов рекомбинации и индуцированного мутагенеза может быть связана с тем, что многие ферменты, необходимые для рекомбинации, индуцируются у вас.eubtiiie к

- 8 -

Таблица 3 Частота возникновения ревертантов в пересчете на ю' жизнеспособных клеток у штаммов КУ-421, КУ-498 и КУ-609 под действием митомицина

Резертанты «-еи+ Ревертанты Н1в

Штамм ---—■—----

20 мин 40 мин 20 мин « 40 мин

ВО-25 17,1

КУ-421 0

КУ-498 0

КУ-609 8,2

81,7 74,3 171

ООО О 0,5 2,7

25,4 35,1 48,8

Примечание. Клетки обрабатывали ыитомицином в концентрации 0,5 мкг/мл в течение указанного времени

Таблица 4 Частота возникновения ревертантов в пересчете на Ю7 жизнеспособных клеток у штаммов КУ-421, КУ-498 к КУ-609 под действием УФ-облучения

Ревер- Доза УФ-облучения, в Дж/иг

Штамм ---

такты 10 20 30 40

ВО-25 1-ои+ 6,3 17,9 42,3 115,5

Н1з + 24,0 74,9 137,2 221,5

КУ-421 0 0 0,4 0,8

Н1з+ 0 0 0 0,8

КУ-498 Ьви+ 0 0 0,3 0,9

Н1э + 0,9 1.2 1.5 1.9

КУ-609 + Ьеи 2,7 7,8 26,5 39,5

Н1з+ 11,2 40,3 51,3 82,9

моменту компетентности. Са++-зависимая экзонуклеаза относится к числу таких ферментов. Ее функция может заключаться в удалении и разрушении вытесняемой нити ДНК,либо в модификации дей~

Рис. I. Расположение генов, контролирующих процесс гомологичной рекомбинации, на генетической карте Вас. aubtilis. Подчеркнуты гены, выявленные в данной работе.

ствия ДНК-полимеразы, осуществляющей застраивание образующихся "брешей". Не исключено, что начавшийся гидролиз ДНК может служить' сигналом для инициации sos репарации, действие которой необходимо для фиксации предыутационных повреждений.

Картирование гее мутаций у штаммов КУ-4-21, КУ-498 и КУ-609 показало, что все они локализованы в одном участке хромосомы и сцеплены с локусоа pur а (рис. I). В участке генети -ческой карты вас. subtilis левее локуса pur а локализовано очень мало мутаций и среди них не известно ни одной, которая влияла бы на процесс рекомбинации. Обнаруженный ген мы предлагаем обозначить символом гее и. Мутации, содержащиеся б штаммах КУ-421, КУ-498 и КУ-609, мы обозначили Гес ui. гес иг, гес из, соответственно.

д) Новый класс гас мутантов

Проведенный генетический анализ позволил выязить еще один

- 10 -

новый rec ген, который мы обозначили как гее т. Мутацию в данном гене содержали клетки штаммов КУ-509 и КУ-606. У этих штаммов была повышена чувствительность к митомицину и практически не изменялась УФ-чувствительность (табл. I)..

У штаммов данной группы приблизительно в 10 раз снижается частота трансформации и транедукции. Практически одинаковое снижение частоты трансформации и транодукции позволяет заключить, что у данных мутантов нарушены процессы рекомбинации, . общие для этих двух способов обмена генетической информацией.

Биохимическая природа нарушений у данной группы мутантов осталась неизвестной, поэтому трудно обсуждать причину нару -шений процесса рекомбинации.

При картировании мутаций митомицинчувствительности у этой группы мутантов выявилось их сцепление с локусами leu a, nie и phe а (рис. I). В данном участке генетической карты вас. subtiiis не были ранее картированы гес мутации. Выявленный нами ген мы предлагаем обозначить символом гес т. а соответствующие мутации у штаммов КУ-509 и КУ-606 гес ti, гес тг. е) Мутанты со сниженной активностью экзонуклеазы I Данную группу составляют мутанты КУ-645 и КУ-647, феноти -пические особенности которых во многих отношениях отличны от большинства других мутантов. В клетках этого класса штаммов оказалась сниженной активность экзонуклеазы I, участие которой в процессах рекомбинации у е. coli было доказано достаточно строго (Kusinner et al.. 1971). АКТИВНОСТЬ ЭКЗОНуКЛва-

зы I снижалась до 12% у штамма КУ-645 и до 8% у штамма КУ-647.

Снижение активности этого фермента сказывалось прежде всего на репарационной способности (табл. I). частота хромосом -ной трансформации у данных мутантов снижалась до 45-18% (табл. I)» В компетентных клетках обнаруживалось примерно в 2 раза больше радиоактивной метки, что, видимо, связано с нарушением процесса превращения двунитевой ДНК в одноцепочечные фрагменты в ходе ее проникновения. Можно предположить, что экзонук-леаза I вас. subtiiia каким-то образом вовлечена в подготовку к рекомбинации донорного фрагмента. Не исключено действие этого фермента и на бактериальную хромосому, приводя к появ -ленив одноцепочечпых участков, что характерно для .клеток бацилл во время компетентного состояния.

- II -

Частота трансдукции в клетках штаммов КУ-645 и КУ-647 снижалась незначительно (табл. I), что характерно для мутаций

abc В И хол А Е. coll (Kushner et al., 1972).

Мутации, приводящие к снижению активности экзонуклеазы I, повышали частоту вознккновения реверсий под действием митоми-цина. Она возрастала примерно в 10 раз у штамма КУ-647. Можно предположить, что при снижении активности экзонуклеазы I большая часть повреждений ДНК устраняется системой репарации, допускающей ошибки, что приводит к возрастанию частоты индуци -рованного мутагенеза,,

Картирование мутаций, снижающих активность экзонуклеазы I, выявило их сцепление с генами leu a, nie и met в (рис. I). Для обнаруженного гена мы предлагаем символ ехо а, поскольку мутации не снижают существенно частоту рекомбинации. Мутации, содержащиеся в клетках штаммов КУ-645 и КУ-647, мы предлагаем обозначить как ехо ai и ехо А2, соответственно.

2. МУТАНТЫ вас. 5ubtxlis С ИЗМЕНЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ АТЬЗАВИСИМОЙ ДНКазы

Участие А№-зависимой ДНКазы Вас. subtiiis в процессе рекомбинации при трансформации ставилось под сомнение (oubnau, 1982). to предприняли попытку выделения новых мутантов ввс. eubtiiia со сниженной активностью АТФ-зависимой ДНКазы в надежде обнаружить среди них штаммы, напоминающие по своим свойствам аналогичные мутанты е. coli, и тем самым уточнить роль этого фермента в процессе рекомбинации у Вас. subtiiis. а) Выделение и фенотипическая характеристика мутантов

Bgc. eubtiiie со сниженной активностью экзонуклеазы "У Клетки штамма sb-25 обрабатывали нитрозогуанидином в концентрации 60 мкг/мл. Для дальнейшего анализа были взяты k штамма, у которых экзонуклеазная активность АЗФ-вавиоимой ДНКазы снижалась в наибольшей степени, и на их основе были сконструированы изогенные штаммы КУ-1701, КУ-1702, КУ~1703,КУ~1704.

Наибольшее снигение экзонуклеазной активности наблюдается з клетках штамаа КУ-1701 (до 5fs), у остальных штаммов это снижение достигало 10% (табл, 5). Коллекция из нескольких мутантов Вое. subtiiiG со сниженной активностью АТФ-зазисиыой ДНК-a¿au •йыла ьаг^чзна впервые, что давало воамоаность провести

• - 12 -

Таблица 5 Частота трансформации и трансдукции у мутантов со сниженной активность» экзонуклеазы у

Экзо У Трансформация Трансдукция

Штамм (ед/мг хромосом- плазмидная хромосом- плазмидная белка) ная(хЮ~4) (х Ю~5) ная(хЮ"5) (х Ю""6)

ВО-25 3,9 4,0 1,75 3,25 2,63

КУ-1701 0,21 1,3 1,62 0,043 . 0,07

КУ-1702 0,37 1,3 1,24 0,057 0,04

КУ-1703 0,44 1,1 1,76 0,015 0,15

КУ-1704 0,40 1,1 1,75 - 0,005 0,07

сравнительный анализ характера роста, репарационной и рекомби-национной способности мутантов.

Выделенные мутанты не отличались по чувствительности к Уф-облучению от клеток исходного штамма, но все они были более чувствительны к нитомицину.

Сниаение активности АТФ-зависимой ДНКазы приблизительно в 3 раза уменьшало частоту хромосомной трансформации, не нарушая процесс плазмидной трансформации (табл. 5). Это согласуется с литературными данными о том, что экзснуклеаза У ыоает использовать в качестве субстрата лишь линейную двуцепочечную ДНК. У всех мутантов со сниженной активностью АТФ-зависимой ДНКазы частота плазмидной трансформации не менялась в присутствии плазмиды-резидента. Следовательно, активность АТФ-зависимой ДНКазы необходима для осуществления рекомбинации между дзуце-почечной ДНК плазмиды-резидента и одноцепочечной донорной пла-змидой в ходе "спасения маркера".

Наши данные подтверждают, что экзонуклеаза У участвует в рекомбинации при трансформации и что активность фермента зависит от двуцепочечной ДНК.

У всех мутантных штампов частота трансдукции резко сниаа -лась (табл. 5), также как и плазмидная трансдукция. Более существенное влияние АТФ-зависимой ДНКазы на рекомбинацию при трансдукции связано с тем, что фермент монет осуществлять частичное расплетание двунитевого транслирующего фрагмента ДНК,

- 13 -

чтобы произошел дальнейший обмен нитей и встраивание фрагмента в реципиентную хромосому. При этом используется ДНК-распле-тающая активность фермента. Именно эта активность играет существенную роль при рекомбинации у Е. coli (Lloyd. Thomas,1984).

На основании изучения фенотипических особенностей можно заключить, что выделенные мутанты со сниженной активностью АТФ-аависимой ДНКазы отличаются от описанных ранее штаммов гес Ц342 и гес Es Вас. subtiiis, то есть представляют собой новый класс мутантов.

б) Клонирование генов вас. aubtiiis, контролирующих'

активность АНФ-зависимой ДНКазы Мы предприняли попытку клонирования генов Вас. subtiiis, контролирующих структуру АТФ-зависимой ДНКазы. Это давало возможность провести комплементационный анализ соответствующих мутаций у е. coli и описанных ранее у вас. subtiiis.

Хромосомную ДНК из прототрофного штамма вас. subtiiis обрабатывали рестриктазой Sau за с таким расчетом, чтобы образовывались фрагменты размером 2-4 млн дальтон. В качестве вектора была выбрана плазмида рвязгг. Встраивание ДНК осуществляли по сайту bam hi.что приводит к инактивации гена те-трациклинустойчивости. Клонирование вели в клетках е. coli, что позволяло выяснить, насколько эффективно ферменты разных бактерий способны функционально замещать друг друга.

Полученные после рестрикции препараты хромосомной и плаз -мидной ДНК смешивали, лигировали, а затем трансформировали клетки гес В21 гес С22 мутанта е» coli, отбирая клоны,устойчивые к ампициллину» Трансформанты перепечатывали ка среду, содержащую I мкг/мл штомицина. Такая концентрация полностью подавляла рост клеток мутанта гес вс и на этой среде могли вырасти клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду с генами вас. subtiiis, супрессирующими мутантный фенотип. После про-, верки 13000 рекомбинантов был отобран единственный клон, который рос на среде с митомицином и ампициллином, но был чувствителен к тетрациклину.

Рекомбинантная плазмида, приводящая к супрессии репарационной недостаточности гес вс мутанта, получила обозначение pKui. Гибридизация по Саузерну доказала, что плазмида pKui содержит вставку фрагмента хромосомы вас. subtiiis.

- 14 -

Биохимический анализ показал, что присутствие плазмиды ркщ приводило к возрастанию экзонуклеаз.чой активности А1Ф-зависимой ДНКазы в клетках штамма ос 5519. Уровень этой активности у них оказался несколько выше, чем в гвс+ клетках, что, видимо, связано с многокопийностью данной плазмиды. Активность АТФ-независимой ДНКазы была примерно одинаковой в клетках всех трех штаммов.

Клетки штамма ос 5519, несущие плазмиду pKUi, становятся более устойчивыми к УФ-облучению. Однако полного восстановления устойчивости, характерного для гес+ клеток,не происходит. Как отмечалось выше, клетки штамма ос 5519, содержащие плазмиду ркт, устойчивы к митомицину в концентрации I ыкг/ мл. При концентрации 1,5 мкг/мл они не росли, хотя на такой среде клетки гес+ вырастали.

В еще меньшей степени фермент вас. subtilis может восстанавливать способность клеток е. coli к рекомбинации. Присутствие плазмиды pKui, хотя и увеличивает число рекомбинантов при конъюгации, их количество достигает только 3% от уровня клеток дикого типа. Частичное восстановление рекомбинационной способности позволяет предполагать, что фермент из Вас. sub-tiiie лишь в незначительной степени замещает мутантный фермент е. coli в процессах рекомбинации. Это связано либо с неспособностью полностью замещать мутантную экзонуклеазу У в конъюгации, либо с тем, что на клонированном фрагменте содержатся не все структурные гены экзонуклеазы У вас. subtilis.

Для оценки приблизительного числа генов, клонированных на плазмиде pKUi, мы провели ее рестрикционный анализ. Он пока -зал, что клонированный фрагмент имеет размеры в 6,9 т.п.н,Размер клонированного фрагмента достаточен, чтобы содержать несколько генов.

в) Супрессия мутаций, снижающих активность

А1Ф-зависимой ДНКазы. плазмидой ркию Для проведения комплементационного анализа было решено в плазмиду ркт встроить дополнительно ген устойчивости к хло-рамфекиколу плазмиды рС194, который экспрессируется в клетках вас. subtilis. Встраивание проводили по сайту salGi плазмиды pKui. Функционирование бактериальных генов, находящихся на плазмиде, при таком встраивании не нарушалось. Получен- 15 -

ная плааиида получила название ркию. Данная плазмида является иктегративной, поскольку не может самостоятельно реплицироваться в клетках вес» «ubtiiis.

Трансформация клеток мутантов гес es и гее нз*2 в8с. sub -tille посредством ДНК плазииды ркию приводила к появлению рекоибинантов, устойчивых к хлораифениколу. Однако все они сохраняли повышенную чувствительность к ыитомицину. При трансформации штаммов КУ-1701, КУ-1702, КУ-1703 и КУ-1704 все трансформанты становились устойчивыми к митоиицину.

Введение плазииды ркию в клетки полученных мутантов полностью восстанавливало способность к трансформации и транедук-ции, что не наблюдалось в случае мутантов rec es и гес нз*г. Это показывает, что наи удалось выделить новый класс мутантов вое. subtille со сниженной активностью АТФ-зависииой ДНКазы.

На основе плазииды ркию были сконструированы еще 2 плазииды, которые несли отдельные участки клонированного фрагмента. Cxeua их конструирования представлена на рис. 2.

Плазмида ркии была получена путей рестрикции зндонукле-азой Pet г. Полученные рестрикты лигировали "саии на себя" и трансформировали ими клетки е. coli. Селекцию вели по устойчивости к хлорамфениколу и чувствительности к ампициллину»По-луяенная плазмида ркии несла фрагмент длиной в 4,3 г.п.н.

Другой фрагмент размером в 2,6 т.п.н. вырезали из ркию ресгрш:тазами Pet i и Ес° RI< захватывая небольшую часть плазмцды • pBR322. и вводили его вместо малого Pat i - EcoRi фрагмента в плазмиду pBR322. Полученная плазмида pxuz кроме фрагмента 2,6 т.п.н. несет ген устойчивости к тетрациклину.

Плазииду ркии можно было использовать в качестве интег-ративного вектора вас» eubtiiis. поскольку она сохранила ген устойчивости к хлорамфениколу«, Плазмида ркиг для этих целей не подходит.

Чувствительность к иитомицину клеток штамма ос 5519 е.coli супрессировалась плазмидой ptcuii, но не супрессировалась ркиг. Следовательно, ген вас. subtiiie, ответственный за частичную супрессию гес вс мутантов £« coli, находится на фрагиенте 4,3 т.п.н. Присутствие плазиид ркиг и ркии не приводит к восстановлению экзонуклеазной активности фермента. Следовательно, гек, контролирующий экзонуклеазную субьединицу

" - 16 -

Patl

2,6kb

4,3k Ъ

V +

ч

+ Patl, BcoHI,

2,6кЪ

JJA-

EooRI

Pstï

+ PstT, ligase

EcoRI

•4,3kB

Patl

Рис. Z. Схема конструирования плазыид р'кии иркиг

фермента,инактивируется при разрезании по сайту pst i. Тем не менее, инактивация этого гена не предотвращает частичную супрессию репарационной недостаточности гее вс мутантов е. coli плазмидой pKuii. Это показывает, что продукт гена, ответственный за подобную супрессию, не обладает экзонуклеазной активностью. Таким образом, клонированный фрагмент хромосомы вас. subtiiie содержит 2 структурных гена АТФ-зависимой ДНК-азы. Первый из них кодирует экзонуклеазную субъединицу и по своим функциям аналогичен гену гес р в. coli. Продукт другого гена не идентифицирован. Можно предполагать, что по' своим функциям он аналогичен гену гес в или гее с е. coli.

Плазмида ркии давала возможность изучить комплементацию мутантов КУ-1701, КУ-1702, КУ-1703 и КУ-1704. Оказалось, что устойчивость к митомицину приобретали первые 3 штамма. Клетки штамма КУ-1704 сохраняли исходную чувствительность.

Можно заключить, что мутации у штаммов КУ-1701, КУ-1702 и КУ-1703 образуют одну группу комплементации. У штамма КУ-1704 мутацией затронут ген, кодирующий экзонуклеазную субъединицу АТФ-зависимой ДНКазы.

г) Картирование мутаций, сникающих активность

АТО-зависимой ДНКазы Для предварительной локализации мутаций, снижающих актив -ность АН>-зависимой ДНКазы, мы определили сайт интеграции пла-змиды ркию. Ее встраивание происходит в районе гена gly в. Для точной локализации мутаций были использованы трансформа -ционные скрещивания со штаммом QB 934. мутации у штаммов КУ-1701, КУ-1702 и КУ-1703 располагались в одном участке хромосомы, а у штамма КУ-1704 приблизительно на равном расстоя -нии от гена gly в, с одной стороны, и мутациями 3 других мутантов - с противоположной. Полученные данные подтвердили,что изучаемые мутации располагаются в двух сцепленных генах (рис. I). Мутантный ген у штамма КУ-1704 мы предлагаем обозначить как гее Q. Этот ген контролирует экзонуклеазную субъединицу фермента. Ген, затронутый мутацией у 3 других штаммов,мы пре-. длагаем обозначить символом гес R. Данный ген был субклони -рован на плаэмиде ркии и вызывал частичную супрессию гес В21 гес с22 мутанта е. coli.

д) Супрессия мутации гес r мутацией ехо а Данные по комплементации показывали, что мутанты гес r функционально аналогичны гес в «ли гес с мутантам е, coli. Поскольку нами был выделен мутант со сниаенкой активностью эк-зонуклеазы I, представляло интерес выяснить возможность супрессии гес r мутаций мутацией ехо а.

Клетки штамма bd-25 были трансформированы ДНК плазмиды ркии и среди трансформантов, устойчивых к хлорамфениколу, . отбирали клоны, приобретшие чувствительность к митомвдину.После проверки активности А1Ф~зависимой ДНКазы был отобран клон, обозначенный КУ-1709. Клетки штамма КУ-1709 были более чувствительными к УФ-облучению и митомицину, образовывали 0,6-3,9% рекомбинантов при трансформации и траНсдукции и сниженной до ZQ% активностью АЗФ-зависимой ДНКазы (табл. 6).

Таблица 6 Активность (единиц/мг белка) экзонуклеазы I и АМ-зависимой ДНКазы и частота рекомбинации (х Ю-5) у штаммов bd-25, КУ-647, КУ-1709 и КУ-1715

Экзонук- Экзонук- Трансфор- Транс-

Штамм Цутация леаза У леаза I мация дукция

В 0-2 5 гес+ 4,3 16,6 66,4 2,28

КУ-647 ехо А 4,25 1,17 41,5 1,92

КУ-1709 гее R 1,12 16,8 0,4 0,09

КУ-1715 гес R ехо А 0,83 1,4 51,6 2,55

Фенотипические особенности штамма КУ-1709 позволяют заключить, что он содержит мутацию гес r, которая представляет собой делецию, согласно механизму интеграции плазмид, содержа -щих гомологичный хромосомной ДНК фрагмент (Башкиров, 1985). Данную мутацию объединили затем с мутацией ехо а, содержащуюся в штамме КУ-647. Полученный штамм был обозначен КУ-1715. Результаты, представленные в табл. 6, показывают, что у штамма КУ-1715 наблюдается одновременное снижение активности двух энзонуклеаз.

Клетки штамма КУ-1715 обладали устойчивостью к УФ-облуче -

- 19 -

нив и нитомицину, сходную с клетками дикого типа, тогда как штаммы, содержащие одиночные мутации гас R или ехо а, были более чувствительны к этим агентам. Таким образом, репарцион-ная недостаточность, вызываемая мутацией rec R. полностью су-прессировалась нутацией ехо а.

Клетки двойного мутанта восстановили способность к трансформации до 78^, что сравнимо с частотой трансформации у штамма КУ-647 (табл. б). Это может быть связано с тем, что активность экзонуклеазы I требуется для подготовки трансформирующей ДНК к рекомбинации и снижение этой активности не может быть вое -становлено полностью. Способность к трансдукции восстанавливалась полностью. Обнаруженная супрессия напоминает включение дополнительного пути рекомбинации в клетках е. coli при нутации вЬс В (Clark, 1971).

Полученные результаты показывают, что в клетках Bac.euhti-lie имеются разные метаболические пути рекомбинации, которые напоминают Кос ВС-И Ree F-пути'В КЛеТКЭХ Е. coli.

е) Мутации, повышающие зкзонуклеазную активность АТФ-зависимой ДНКазы

При отборе мутантов со сниженной активностью АТФ-зависимой ДНКазы было выявлено несколько клонов, у которых активность фермента оказалась повышенной. Для дальнейшего анализа был выбран штамм КУ—1705, который являлся изогенныы проанализированный выше мутантам. В клетках мутанта КУ-1705 повышалась активность АТФ-зависимой ДНКазы и одновременно снижалась приблизительно в 3 раза активность АТФазы, стимулируемой однонитевой ДНК (табл. 7). Это могло быть связано либо с нарушением субъединицы АТФ-зависииой ДНКазы, обладающей АТФазной активностью, либо с изменением одной из многочисленных АТФаз, стимулируемых одноцепочечной ДНК.

Клетки штамма КУ-1705 оказались более чувствительными к действию ыитомицина и Уф-облучения. У них значительно снижа -лась частота хромосомной трансформации и трансдукции (табл.7). Частота плазиидкой трансформации оставалась на уровне клеток < дикого типа.

Таким образом, мутация, приводящая к снижению активности АТФазы,вызывает нарушение процессов репарации и рекомбинации.

Проведенный генетический анализ показал, что мутация, сни-

' ч. 20 -

Таблица 7 Активность АТФ-зависиыой ДНКазы и АТФазы (ед/мг белка), частота рекомбинации (хЮ"5) у штамма КУ-1705

Штамм Экзонуклеаза У АТФаза Трансформация Трансдувдия

во-25 4,4 2,21 -66,4 100% 3,48 100%

КУ-1705 6,9 0,84 1,1 2% 1,26 36%

захкцая активность АТФазы у штамма КУ-1705, сцеплена с локуса-ми aro g и lau а (рис. I). Мы предлагаем обозначить обна -рукзиный ген символом гее s, а мутацию, содержащуюся в штамме КУ-1705 - reo si.

3. МУТАНТЫ вас. siBTiLis С НАРУШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДНК-ГИРАЗЫ

Протекание многих процессов в клетке зависит от топологии ДНК, в особенности от состояния суперспирализации ДНК. Сведений о непосредственном влиянии мутаций в генах, кодирующих структуру ДНК-гиразы у Вас. aubtiiis на процессы гоыологич -ной рекомбинации,мы не обнаружили. Это побудило нас к получению мутантов с нарушенной активностью ДНК-гиразы в целях изучения их способности к репарации й рекомбинации;

а) Мутанты, устойчивые к налидиксовой кислоте и новобиоцину

Было выделено 3 мутанта, устойчивых к налидиксовой кислоте, и 20 мутантов, устойчивых к новобиоцину. Среди последних подробнее изучены свойства 5 мутантов.

Мутанты, устойчивые к налидиксовой кислоте, характеризовались резким снивениеы жизнеспособности. Они были более чувствительны к УФ-облучению, у них в 100 раз снижалась частота трансформации.

Подробнее проанализированы мутанты, устойчивые к нозобио -цину* Были сконструированы изогенные штаммы КУ-1801, КУ-1802, КУ-1803 и КУ-1804. Клетки этих штаммов достигали пика коыпе -тенхности через разные промежутки времени: штамм КУ-1801 че -рез 6,5 часов, остальные - через 5,5 часов, против 4 часов у исходного штамма Fm-i. Следовательно, мутация дуг в приводит к замедлению скорости роста мутантных клеток.

Данные генетического картирования показали, что мутация устойчивости к новобиоцину у всех штаммов картируется в районе pur а - eye а. таи, где располагается ген дуг в (рис. I). Данный ген кодирует структуру Б-субъединицы ДНК-гиразы, которая обладает АЭДазной активностью. Мы проверили активность данной ¿ЗДазы, стимулируемой двуцепочечвой ДНК, что отличает ее от большинства других АТфаз в клетке. Оказалось, что активность АЭДааы, зависимой от двунитевой ДНК, спивалась у мутант-ных штаммов в 2-3 раза. Данные мутации,-следовательно, не приводят к полной инактивации В-субъединицы ДНК-гиразы.

Все мутанты, устойчивые к новобиоцину, обладали повышенной чувствительностью к УФ-облучению, что свидетельствует о том, что мутация дуг в приводит к нарушение процессов репарации.

Все проанализированные мутанты, устойчивые к новобиоцину, обладали сниженной частотой трансформации, хотя проницаемость клеточной стенки для трансформирующей ДНК у них не была изменена. Следовательно, снижение частоты трансформации у этих штаммов связано с нарушением процесса рекомбинации при встраивании донорного фрагмента. Ранее было показано, что падение степени суперслирализации хромосомной ДНК подавляет процессы гомологичной рекоибинации (Raina, Ravin, 1.979). Добавление новобиоцина в трансформационную систему значительно снижало число трансформантов у исходного штамма Fm-i с неповреж -денной ДНК-гиразой. У штамма КУ-1801 частота трансформации не менялась при добавлении к компетентным клеткаи новобиоцина. У остальных штаммов число трансформантов снижалось примерно на 10% в этих условиях. Это еще раз показывало, что устойчивость к новобиоцину у изучаемых штаыиов связана с мутацией дуг в.

Частота плазмидной трансформации снижалась приблизительно в такой же степени, как и хромосомная трансформация. Снижение частоты плазиидной трансформации, обнаруженное у данных мутантов, связано, скорее, с нарушением репликации плазиидной ДНК, поскольку, согласно существующим моделяи, при плазиидной тран-сфориации происходит внутримолекулярная рекомбинация одноце -,почечных ПЛаЗМИДНЫХ ДНК (Dubnàu, 1982).

Частота транедукции также оказалась сниженной у данной группы мутантов. Наибольшее снижение - до Ъ% - отмечалось для нташа КУ-1801, в клетках которого сильнее нарушена активность

- 22-

В-субъединицы ДНК-гиразы. Клетки штамма КУ-1804 образовывали в 10 раз меньше трансдуктантов, у остальных штаммов частота трансдукции снижалась приблизительно в 2-3 раза.

Снижение частоты трансформации и трансдукции свидетельст -вует о том, что эти нарушения связаны с изменением степени су-перспирализации хромосомы реципиентной клетки.

Таким образом, изучение мутантов Вас. subtiiis с нарушенной активностью ДНК-гиразы, вызываемой мутациями в генах дуг а и дуг в, позволило впервые для данного микроорганизма непосредственно продемонстрировать участие этого фермента в процессах рекомбинации при трансформации и трансдукции. Рекомби-национные процессы нарушаются в большей степени у мутантов, устойчивых к налидиксовой кислоте, то есть содержащих мутации в гене дуг а. Различные нутации в гене дуг в приводят к неодинаковому снижению частоты трансформации и трансдукции, что может быть объяснено различной степенью нарушения актив -ности В-субъединицы ДНК-гиразы. Чем сильнее нарушена эта активность в результате мутации, тем большим оказывается подавление частоты рекомбинации. Полученные данные еще раз подтвер-кдают, что эффективность рекомбинационных процессов в значи -тельной степени зависит от состояния супреспирализации ДНК. б) Супрессия мутаций дуг в повышением активности экзонуклеазы I

Среди выделенных нами мутантов, устойчивых к новобисцину, збращал на себя внимание штамм КУ-830, который по своим фено-гипическим характеристикам отличался от других подобных мутантов. Он был чувствителен к УФ-облучению, но обладал норма-1ьной способностью к рекомбинации.

Данная мутация устойчивости к новобиоцину была перенесена з клетки штамма Fm-i, что позволило сконструировать штамм СУ-1805. Клетки этого штамма обнаруживали снижение частоты рз-юмбинации, характерное для мутантов, устойчивых к но'вобиоци-jy (табл. 8). Так было установлено, что клетки штамма КУ-830 ¡одержат две мутации, одна из которых вызывает супрессию ре -;омбинационной недостаточности, вызываемой мутацией дуг в. !ту супрессорную мутацию удалось перенести "в клетки итаиыа гя-1, и полученный штамм получил обозначение КУ-1806» Ок казался чувствителен к новобиоцину.

- 23 -

Таблица 8 Активность АТФазы, зависимой от двунитевой ДНК, и экзонуклеазы I (ед/мг белка) и частота рекомбинации (х у штамма КУ-830 и его производных - штаммов КУ-1805 и КУ-1806

Штамм АТФаза Экзонувлеаза I Трансформация Трансдукция

Рт-1 2,84 2,70 92,2 1.91

КУ-830 0,87 5,П 83,9 1,72

КУ-1805 0,72 2,62 6,8 0,03

КУ-1806 2,76 5,91 118,9 2,91

В клетках штамма КУ-1805, устойчивого к новобиоцину, снижена активность АКазы, зависимой от двунитевой ДНК, что приводит к снижению частоты трансформации и трансдукции (табл. 8). В этом отношении он не отличается от описанных выше дуг в мутантов. В клетках штамма КУ-1806 примерно в 2 раза повышена активность экзонуклеазы 1« Это приводит к гипер-яес фенотипу: частота трансформации и трансдукции повышается примерно в 1,5 раза. Штамм КУ-830 характеризуется снижением активности АТ&азы и одновременно повышением активности экзонуклеазы I (табл. 8). В силу этого клетки штамма КУ-830 проявляют нормальную способность к рекомбинации. Таким образом, повышение активности экзонуклеазы I супрессирует рекомбинационную недостаточность, вызванную мутацией дуг0'.

Нарушение степени отрицательной суперспирализации ДНК в результате дуг в мутации приводит к тому, что число инициирующих комплексов типа Д-петель значительно уменьшается. Это вызывает снижение частоты гомологичной рекомбинации. Повышенная активность экзонуклеазы I в клетках таких мутантов будет как бы компенсировать эту недостаточность за счет появления дополнительных однонитевых разрывов и одноцепочечных участков в хромосоме реципиентной клетки, которые, в свою очередь, облегчают образование инициирующих комплексов рекомбинирующих молекул ДНК. Однако повышение активности экзонуклеазы I не супрзссировало повышенную чувствительность дуг в мутантов к УФ-обдучекию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы к II описанным ранее для Вас. subtilis гес генам было обнаружено б новых генов, мутации в которых нарушают процессы репарации и гомологичной рекомбинации (рис. I). Для 5 из этих новых генов установлена биохимическая природа кодируемых ими продуктов.

Впервые для s ас. subtilis доказано участие нового фермента - экзонуклеазы, актививруемой ионами Са++, в процессах репарации, рекомбинации и индуцированного мутагенеза. Доказана роль АТф-зависимой ДНКазы в процессах репарации и рекомбина -ции, выявлены 2 гена, кодирующих отдельные субъединицы этого фермента. Данные гены были клонированы на плазмиде ркт. что позволило выявить функциональную аналогию генов гес q и Гес R Вас. subtilis С генами гес В гес С гес D Е. coll. Впер -вые получен мутант со сниженной активностью экзонуклеазы I. Была показана супрессия репарационной и частично рекомбинаци-онной недостаточности гес R мутанта при снижении активности экзонуклеазы I и тем самым доказано наличие множественных путей гомологичной рекомбинации в клетках вес. subtilis. Повышенная активность экзонуклеазы I супрессирует рекомбинацион -ную недостаточность, вызываемую мутацией дуг в вас. eubtilie. Эффект подобной супрессии связан, по-видимому, с введением дополнительных разрывов и появлением одноцепочечных участков в бактериальной хромосоме. Таким образом, активность экзонуклеазы I необходима для подготовки к рекомбинации как донорного фрагмента, так и реципиентной хромосомы.

В работе было выявлено, что активность АТФ-зависиыой ДНК-азы изменяется при мутациях в целом ряде генов. Ложно предположить, что в клетках вас. subtilis этот фермент входит в комплекс с целым рядом других белков и ферментов, необходимых для осуществления рекомбинации. Так, например, комплекс фер -ментов, необходимых для рекомбинации фаговых хромосом, виде -лен из зараженных фагом Т4 клеток (Moeig et al., 1984.).

В состав предполагаемого комплекса ферментов вас. subtin», который можно назвать рекомбиносомой, исходя из данных биохимического анализа, входят продукты следующих генов: гес <э,

гес R, гес Е, гас H, гес F, дуг А, дуг В, гес S, ехо А.

Ключевую роль в этом комплексе играет Ree е белок, аналогичный Ree а белку е. coli. Наличие подобного комплекса ферментов может объяснить снижение активности ATJ-зависимой ДНК-азы в результате мутаций в генах, не имеющих непосредственного отношения к кодировании ее структуры» Продукты генов, входящих в этот комплекс, необходимы для осуществления подготовительных и ранних стадий процесса рекомбинации на уровне формирования инициирующих комплексов и последующих реакций обмена нитей, формирование инициирующих комплексов облегчается при отрицательной суперспирализации бактериальной хромосомы. Такое состояние хромосомы поддерживается активностью ДНК-ги-разы (продукт генов дуг а и дуг в).

Проведенный анализ позволил также выявить гены, контроли -рующие завершающие стадии процесса рекомбинации. К числу таких генов у Вес. gubtilio относится гек гес и, который контролирует структуру экзокуклеааы, активируемой ионами Са++ и специфичной к денатурированной ДНК. Активность этой нуклеазы вовлечена также в процесс возникновения индуцированных мутаций под действием Уф-облучения и митомицина. К этой же группе "поздних" генов принадлежит обнаруженный нами ген гес т и описанный ранее ген гес в, продукты которых не известны.

Наученные мутации можно разделить на ряд групп и по степени нерушения у них процессов репарации. Некоторые мутации повышали только чувствительность к иитомицину. К их числу относится группа из 5 мутантов: КУ-701, КУ-708, КУ-709, КУ-710, КУ-711. Повышенная чувствительность только к иитомицину характерна для мутаций гес Q и гес R. Вторую группу составляют мутации в генах гес т. гес и, гес s, гес в, reo f, ехо А,КОТОрые приВОДИЛИ к одновременному повышению чувствительности к УФ-облу-чению и митомицину. В наибольшей степени чувствительность к этим агентам повышалась в результате мутаций гес f и ехо а. Наконец, мутации дуг А и дуг в приводили только к повышен -ной Уф-чувствительнооти.

В отношении изменении скорости индуцированного мутагенеза . наученные мутанты также образуют 3 группы. Наибольшую по численности группу составляют мутации, не изменявшие частоту образования реверсий к проютрофности под действием митомицииа. Подобный вффзкт был характерен для штаммов, несущих мутации в

' - 26 -

генах гее Q, reo R. гес s, дуг А, дуг В, гес В. гее Т. Мутация гее и приводила к полному подавлению индуцированного мутагенеза под действием митомицина и УФ-облучения. Снижение частоты индуцированных реверсий было характерно для мутаций гес f. Наконец, к третьей группе следует отнести мутацию эхо А, которая приблизительно в 10 pas увеличивала частоту возникновения реверсий к прототрофности.

Проведенный анализ позволил выявить множественность путей гомологичной рекомбинации в клетках вас. subtili3. Один иэ основных путей рекомбинации контролируется продуктами генов гес Q, гес R и гас s, который мы предлагаем обозначить как Ree QR- путь. Отдельный путь рекомбинации контролируется продуктом гена гес F, который оказался аналогичным продукту гена гес F Е. coli (Ogasawera et al.. 1985). Экзонуклеаза I (продукт гена exo а ), как и в случае е. coli, осуществляет переключение с одного пути рекомбинации на другой.

Таким образом, можно заключить, что процесс гомологичной рекомбинации у вас. subtilis во многом напоминает аналогичный процесс у е. coli, что подчеркивает общность рекомби -национных процессов в клетках бактерий.

ВЫВОДЫ

I. Проанализирована коллекция из 18 мутантов Вое. subtiüs с нарушенной способностью к рекомбинации, которые были получены обработкой клеток диэтилсульфатом. Среди полученных мутантов выявлены три штамма, несущие мутации в уже известном гене гес в, и которые по своим фенотипическим характеристикам не отличались от описанных ранее Ree в~ мутантов. Были обнару -жены 3 штамма, которые несли мутации в гене гес F, но фено-типически отличные от известных в литературе мутантов гас fis и гес Fie » они в различной степени снижали частоту трансакции по разным маркерам в районе~leu а - his н хромосомы °ас. subtilis. Эти же мутации приводили к снижению экзонук -

левзной активности АТФ-завискмой ДНКазы. Описана группа из 5 мутантов со сниженной частотой трансформации, но неизмененной чувствительностью к УФ-облучениюв Кроме того, были выявлены новые гены Вас. subtilis, мутации в которых нарушали процессы репарации и рекомбинации.

! -

2, Впервые для вас. aubtilie доказано участие новой экзонуклеазы, специфичной к денатурированной ДНК и активируемой ионами Ca-1"1". Выявлен структурный ген данной экзонуклеазы» получивший обозначение гее и к локализованный на 350° генетической карты. Мутации гее и резко, сникали частоту трансформации и транедукцин, незначительно повышали чувствительность к Уф~облучению и митомицину и приводили к полному подавлению индуцированного мутагенеза.

3» Обнаружен новый ген, получивший обозначение гее т, который был локализован на 245° генетической карты. Мутации гее т повышали чувствительность к митомицину,'но практически не влияли на Уф-чувствительность, приблизительно в 10 раз снижали частоту трансформации и траксдукции, не изменяли скорость спонтанного и индуцированного мутагенеза.

Доказано участие экзонуклеазы I Qac. eubtiiis в процессах репарации и рекомбинации. Получен мутант со сниженной активностью экзонуклеазы I, у которого резко возрастала чувст вительность к УФ-облучению и митомицину, незначительно снижалась частота трансформации и транедукцин, приблизительно в 10 раз возрастала частота индуцированных мутаций под действием митомицина. Ген, контролирующий структуру экзонуклеазы I, был обозначен ехо а и локализован на 210° генетической карты. Повышение активности экзонуклеазы I в 2 раза приводит к гипер- Ree фенотипу, не влияя на способность к репарации,

5. Получена коллекция из 4 мутантов со сниженной активностью АТЗ>-зависимой ДНКазы, у которых повышалась чувотвитель -пооть к митомицину, резко снижалась частота транедукцин и в меньшей степени - частота трансформации. У мутантов отсутст -вовал эффект "спасения маркера" при плазмидной трансформации. Показано, что изученные мутации затрагивают 2 новых, рядом расположенных гена, получивших обозначение гее Q и rec R.3th гены отличаются от описанных ранее для Вес. eubtiiis генов гее н и rec es. мутации в которых также снижали активность АИ-зависимой ДНКазы. Гены rsc Q и гее R были локализованы

, на 75° генетической карты в районе локуса gly о.

6. Гены гее Q и roc R были клонированы на фрагменте размером в 6,9 т.п.и. в составе плаашгды ркт. Введение этой плазмиды в клетки гес В21 гее С22 мутанта Е- coli полнос-

- 28 -

тыо восстанавливало зкзонуклеазную активность Ай-зависиыой ДНКазы и приводило к частичному восстановлению устойчивости к уф-облучению и митомицину и незначительному повышению частоты рекомбинации. Показано, что ген rec Q кодирует экзонуклеазную субъединицу АЗФ-вависимой ДНКазы Вас. eubtilis и функционально аналогичен гену гее о е.coli. Частичная супрессия мутантного фенотипа Ree вс" мутанта е. coli обусловлена продуктом гена rec R.

7. Получен инсерционный мутант по гену rec R Bac.eubtilie, у которого в одинаковой степени снизалась частота трансформации и транедукции, повышалась чувствительность к Уф-облучению и митомицину. Показана супрессия репарационной и частично ре-комбинационной недостаточности rec R мутанта введением дополнительной мутации ехо а, снижающей активность экзонуклеа-зы I, что доказывает наличие множественных путей гомологичной рекомбинации у ввс. eubtilis.

8. Обнаружен мутант вас. eubtilis со сниженной активнос тью АМазы, стимулируемой однонитевой ДНК. Структурный ген данной АЗФазы был локализован на 260° генетической карты и получил обозначение гас s. Мутация в гене rec s приводила к снижению активности ДМазы и одновременному возрастанию эк-зонуклеазной активности АЗФ-зависимой ДНКазы, повышала чувствительность к Уф-облучению и митомицину, резко снизала часто- • ту хромосомной трансформации и приблизительно в 3 раза - частоту транедукции»

9« Показана необходимость отрицательно еуперспирализован -ного состояния хромосомной ДНК для успешного протекания процессов репарации и рекомбинации. У мутантов дуг а ц дуг в Вас. subtiiie повышалась чувствительность к УФ-облучению и митомицину, замедлялась скорость роста, резко снизалась частота трансформации и транедукции..Рекоыбинационная недостаточность, вызываемая мутацией дуг в, может быть супрассирова-на повышением активности экзонуклеазы I.

10. Показано, что процесс гомологичной рекомбинации у вас. eubtilis во многом напоминает аналогичный процесс у е. coli, что подчеркивает общность этих процессов в клетках бактерий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свойства мутантов вас. oubtilis с нарушенной способность» к генетической рекомбинации и повышенной чувствительностью к ыитоыицину / Прозоров A.A., Азизбекян P.P., Бзрабанщи -ков Б.И., Беляева H.H. // Генетика. 1968. - Т.4. №2. - С.97-105.

2. Прозоров A.A., Барабанщиков Б.И, Темп спонтанного мутагенеза и специфичность возникающих мутаций у штаммов Bac.sub-tilie с нарушенной способностью к генетической рекомбинации

_ // Генетика. 1968. - Т.4. te.5. - С. 80-87.

3. Чувствительные к митомицину мутанты вас. subtiiis с повышенной активностью А№-зависимой дезоксирибонуклеазы / Прозоров A.A., Наумов Л.С., Барабанщиков Б.И. и др. // Генетика. 1973. - Т.9. №.9. - С. II9-I24.

4. Барабанщиков Б.И., Хаыидуллина Р.Г., Харитонова Т. В. Спонтанный и индуцированный УФ-облучениеы мутагенез у митоми-цинчувствительных штаммов вас. subtiiis // Экологонморфоло -гические исследования. Казань: Изд. Казанского ун-та. 1976. С. I02-II8.

5. Спонтанный и индуцированный мутагенез у штамма вас. subtiiis со сниженной активностью зкзонуклеазы, активируемой ионами Ca** / Барабанщиков Б.И., Белов И.С., Белова М.М., Ха-мидуллина Р.Г. // Тезисы доклад. Х1У Междунар. Генетич. Конгресса. И.: Наука. 1978. Часть I. С. 197.

6.' Барабанщиков Б.И., Хамидуллина Р.Г. Некоторые особенности мутагенеза у штамма вас. subtiiis со сниженной активностью Са^-зависимой зкзонуклеазы // Тезисы доклад. 1У Всесоюз. симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов".

Ы. 1979. С. 103.

7* Попова Н.В., Барабанщиков Б.И. Выживаемость и мутагенез бактерий при обработке фосфанидом (Бй-58) // Защита растений в Татарской АССР. Казань: Татиздат. 1980. С. I2I-I23.

8. Барабанщиков Б.И., Карташев'а Н.И., Низамов А.Р. Спонтанный перенос плазмиды RP-1 и ее проявление в клетках вас.

subtiiis // Внехромосомные генетические элементы: значение ' для науки и практики. Ы.: Наука. 1981. С. 24-26.'

9. Барабанщиков Б.И., Карташева Н.И. Механизм спонтанного

- 30 -

переноса генетической информации от е. coli в клетки вас. subtilis // Тезисы доклад. 1У съезда ВОГиС. Кишинев. 1982. Часть I. С. 284-285.

10. Барабанщиков Б.И., Акберова Н.И., Чурбанов С.П. Мутанты вас. subtilis с нарушенной рекомбинацией в ограниченной области хромосомы // Тезисы доклад,, У Всесоюзн. симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". М»: Наука. 1983. С. 129-130.

11. Хасанов Ф.К., Забиров Н.Г., Барабанщиков Б.И.» Зимин М. Г. Гексаметилен-1,6-бис тиоуретаны, обладающие мутагенной активностью // Авторское свидетельство № 1032766 от I.04.I983.

12. Барабанщиков Б.И. Механизмы репарации, рекомбинации и мутагенеза бактерий. Казань: Изд. Казанского ун-та. 1984.

- II? с.

13. Барабанщиков Б.И., Гизатуллин Ф.Ш. Клонирование генов, кодирующих АТФ-зависиыую ДНКазу вас. subtilis, s клетках гее ВС мутанта е. coli // ТЬзисы доклад. I всесоюзн. конференции "Новые направления биотехнологии". Пущино. 1984. С. 67.

14. Барабанщиков Б.И. Молекулярная генетика (учебное пособие). Казань: Изд. Казанского ун-та. 1985. - 92 с.

15. Частичная супрессия мутаций гее в гее с е. coli пла-змидой pBR322, содержащей вставку хромосомы, вас. 3ubtiii3 / Барабанщиков Б.И., Башкиров В.И., Гизатуллин Ф.Ш., Гулита-швили В.Ш. // Цитология и генетика. 1985. - Т. 19. /й 2. -С. 128-132.

16. Барабанщиков Б.И., Гулиташвили В.Ш., Чурбанов С. П. Мутанты вас. subtilis с нарушением рекомбинации в ограниченной области хромосомы // Молекулярные механизмы генетических процессов. М.: Наука, IS85. - С. 324-330.

17. Барабанщиков Б.И., Тузанкина Н.Л., Гизатуллин Ф.Ш. Ре-комбинационная способность мутантов вас. subtilis со сниженной активностью АТФ-зависимой ДНКазы // Тезисы доклад. Всесоюзн. итоговой конференции "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование", Рига: Изд. Латвийского ун-та. 1985. С. 125-129.

18. Хасанов Ф.К., Барабанщиков Б.И. Различия в бактерицидной активности пестицидов 2,4-Д и симазина при воздействии на

клетки сенной палочки // Вопросы химизации сельского хозяйства в Татарской АССР. Казань: Татиздат. 1985. - С. 98-100«

19. Гиэатуллин Ф.Ш., Барабанщиков Б.И. Анализ фрагмента хромосомы Bec.eubtilie, частично супрессирующего гесВ гесС мутации е* coli // Тезисы доклад. II Всесоюзн. конференции "Новые направления биотехнологии". Пущино. 1986. С. НО.

20. Барабанщиков Б.И. Генетический и биохимический анализ мутантов вас. subtilia с нарушенной способностью к генети -ческой рекомбинации // Тезисы доклад. У съезда ВОГиС. Моек -ва: Наука. 1987. Т. У. С. II.

21. Гиэатуллин Ф.Ш., Барабанщиков Б.И. Новый класс мутантов вас. eubtilie со сниженной активностью АТФ-эависимой ДНК-азы Ц Тезисы доклад. У1 Всесоюзн. симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". M. 1987. С. 158.

22. Снижение частоты гомологичной рекомбинации у мутантов вас. subtilia, устойчивых к новобиоцину / Барабанщиков Б.И., Цалков C.B., Белов И.С., .Хабибуллина Г.Н. // Молекул, генетика микробиол. вирусол. 1988. -te 8. - С. 39-43.

23. Гиэатуллин ф.Шо, Барабанщиков Б.И. Рестрикционный анализ и локализация фрагмента хромосомы вес. subtiiie. частично супрессирующего мутации в генах гес в гас с е. coli // Биополимеры и клетка. 1989. - Т. 5. te I. - С. 72-77.

24. Барабанщиков Б.И. Генетический контроль процесса рекомбинации у вас. subtilis // Материалы итоговой научной кон -ференции- Казанского университета. Естественные и точные науки. Казань: Изд. Казанского ун-та. 1989. С. I08-II0.

Сдано в набор 8. 12. 89 г. Подписано в печать 8. 12. 89 г. ПФ 04257. Форм. бум. 60 х 84 1/16. Печ. л. 2, 1 . Тираж 100. Заказ 917. Бесплатна.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008, г. Казань, ул. Ленина, д. 4/5.