Диссертации » Физико-химическая биология » Молекулярная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей рода Ogataea
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей рода Ogataea"

На правах рукописи

005057063 С/

Фокина Анастасия Владимировна

ГЕНЕТИЧЕСКИМ КОНТРОЛЬ ГОМЕОСТАЗА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ У ДРОЖЖЕЙ РОДА ОЄАТАЕА

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005057063

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Агафонов Михаил Олегович

Официальные оппоненты:

Северин Федор Федорович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова", Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, заведующий лабораторией молекулярной биологии дрожжей.

Эльдаров Михаил Анатольевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, ведущий научный сотрудник, руководитель группы гетерологичной экспрессии.

Ведущая организация:

Кафедра генетики и биотехнологии Биолого-почвенного факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет».

Защита состоится «15» ноября 2012 в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234 Россия, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ауд 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «_/£}> октября 2012.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Кальций принимает участие и в координации работы клеточных систем, являясь вторичным мессенджером при прохождении сигнала, и в функционировании секреторных органелл. При этом нарушение функционирования секреторного пути может приводить как к нарушению гомеостаза ионов кальция, так и вызывать определенные клеточные ответы, зависящие от кальция-мессенджера

Дрожжи являются традиционным модельным объектом для изучения процессов, протекающих в эукариотической клетке. Однако поддержание гомеостаза кальция в клетках дрожжей имеет свои особенности. В частности, в отличие от животной клетки, в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) дрожжей нет помпы, осуществляющей транспорт Са2+ в этот компартмент. Основным депо Са2+ в дрожжевой клетке является вакуоль, куда кальций откачивается из цитоплазмы за счет функционирования АТФ-азы Ртс1р (рис. 1).

Рис. 1. Схема взаимодействия внутриклеточных компартментов, участвующих в поддержании баланса Са2+ у дрожжей. Черными стрелками показано направление прямого транспорта, осуществляемого с помощью везикул, розовыми стрелками — направление обратного транспорта. Белок а-СОР участвует в транспорте из аппарата Гольджи в ЭР, и в транспорте из эндосом (направление транспорта не известно), Ур1бр участвует в транспорте из эндосом в аппарат Гольджи и из аппарата Гольджи в ЭР. Синие стрелки отражают транспорт Са2+через мембраны: канал СсЫр/МсПр переносит Са2+ через плазматическую мембрану в цитоплазму, АТФ-аза Ртс1р — из цитоплазмы в вакуоль, а АТФ-аза Ртг1р — из цитоплазмы в полость аппарата Гольджи.

Мембраны аппарата Гольджи содержат другую АТФ-азу, Ртг1р, переносящую в люмен органеллы кальций и марганец — два иона, необходимые для процессов гликозилирования и сортинга белков, протекающих в этой органелле. Считается, что аппарат Гольджи является основным источником ионов кальция для ЭР дрожжей, однако при нарушении гена РМЮ полностью блокируются Са2+-зависимые процессы в аппарате Гольджи, но концентрация Са2+ в ЭР поддерживается на достаточном для жизни уровне. Это указывает на существование дополнительного источника Са2+ для ЭР. Однако ни этот источник, ни путь, по которому кальций попадает в ЭР, до сих пор не известны. Настоящая работа направлена на изучение механизма доставки и определение источников ионов кальция для эндоплазматического ретикулума дрожжей. Некоторые функции ионов кальция являются тесно связанными с гомеостазом ионов марганца. В этой связи часть работы посвящена изучению пересечений функций этих ионов в клетках дрожжей.

Среди дрожжей наиболее традиционным объектом для изучения гомеостаза ионов кальция являются дрожжи 5ассУю.готусез сеге\тае, однако для решения поставленных задач в качестве модели были выбраны дрожжи Ogataea ро1утогрка и О. рагаро1утогрНа, что было связано с наличием выраженных проявлений мутаций, нарушающих гомеостаз ионов кальция у этих видов. В частности, мутация ге(1-27, которая нарушает С-концевой домен белка а-СОР (компонента окаймляющего комплекса СОР1, участвующего в ретроградном везикулярном транспорте) приводит к нарушению гомеостаза Са2+, а инактивация гена РМЮ в штамме с делецией С-концевого домена а-СОР приводит к тому, что клетки способны расти только при увеличенной концентрации Са2+ в среде. Это указывает на участие, по крайней мере, некоторых компонентов комплекса СОР1 в транспорте Са2+ в ЭР из независимого от Ршг1р источника. И дрожжи рода О^Ыаеа, и 5. сеге\''тае при нарушении гена вакуолярной кальциевой АТФ-азы РМС1 не способны расти на среде с высокой концентрации Са2+, однако, в отличие от Я. сегехчзше, мутанты ртс1 Д дрожжей рода 0%а1аеа чувствительны к присутствию в среде додецилсульфата натрия (БЭЗ). О механизме действия БОБ ничего не известно. Изученные в работе мутанты проявляли чувствительность к БББ в концентрации 0,001-0,008%, что намного ниже критической концентрации мицеллообразования (ККМ = 8,2 мМ = 0,24%), а значит причина чувствительности дрожжей к ЭБЭ не должна быть связана со свойствами этого вещества как детергента. Поэтому возникал вопрос, связана ли чувствительность мутанта рте!А к 805 с повышением концентрации Са2+ в цитозоле, или у Ртс1р дрожжей рода О^аШеа существует еще какая-то неизвестная функция?

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма доставки ионов кальция в эндоплазматический ретикулум, а также роли кальция и марганца

в жизненно важных процессах у дрожжей рода Ogataea. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1). Провести поиск генов, мутации которых супрессируют чувствительность штамма pmclA к SDS.

2). Изучить влияние мутаций, нарушающих гомеостаз кальция {pmrlh, reíl-27 и pmclД), на жизнеспособность дрожжей рода Ogataea в разных условиях.

3). Исследовать взаимодействие мутаций, нарушающих гомеостаз Са2+ у дрожжей рода Ogataea.

4). Изучить влияние мутаций, вызывающих нарушения гомеостаза Са2+, на чувствительность дрожжей рода Ogataea к высокой и низкой концентрации Мп2+.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые были исследованы проявления нарушений генов РМС1 и PMR1 у дрожжей рода Ogataea. В частности, впервые было показано влияние нарушения гена PMR1 на жизнеспособность дрожжей в различных условиях, а также различие механизмов гибели клеток с нарушением генов PMR1, RETI и РМС1. Были идентифицированы гены, нарушение которых приводит к супрессии чувствительности к SDS у мутанта pmclД О. polymorpha. Впервые было показано, что у О. polymorpha нарушение гена РМС1 приводит к нарушению регуляции клеточного цикла при переходе от фазы G2 к М.

В работе изучены совместные проявления различных мутаций, нарушающих гомеостаз Са2+. При этом впервые было показано, что влияние мутации yptóA на проявления pmrlA сходно с влиянием мутации ret 1-27, и выражается в усилении зависимости мутанта от содержания ионов Са2+ в среде. Также впервые показано, что нарушение гена ССН1 усиливает проявления мутаций pmrlД и retl-27, а мутации pmclA и retl-27 проявляются независимо как в условиях нехватки, так и избытка Са2+. При этом нарушение гена РМС1 усиливает влияние мутации retl-27 на процессирование гетерологичного белка uPA-Q302, продуцируемого дрожжами О. polymorpha. Вместе эти результаты позволяют выдвинуть гипотезу, согласно которой везикулярный транспорт осуществляет доставку ионов кальция в эндоплазматический ретикулум дрожжей, а в качестве источника ионов кальция для ЭР, помимо аппарата Гольджи помимо аппарата Гольджи, могут выступать эндосомы.

В работе также изучено влияние содержания в среде ионов марганца на рост дрожжей с мутациями pmrl A, pmcl A, retl-27, yptóA и cchl Д, и впервые показано, что продукты генов RETI, YPT6, ССН1 и PMCI вовлечены в гомеостаз Мп2+ в клетке.

Дрожжи рода Ogataea используются в биотехнологии для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков. Одним из ограничений такого применения часто

оказывается неспособность дрожжей эффективно секретировать некоторые чужеродные белки. Поскольку Са2+ и Мп2+ необходимы для нормального функционирования секреторного пути, полученные в работе результаты могут быть использованы при разработке подходов для оптимизации процесса секреции рекомбинантных белков.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на межлабораторных семинарах Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (21.06.2012) и Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» (27.09.2012), а также были представлены на 4-ой международной конференции "Hansenula polymorpha worldwide network conference" (2006, Харен, Голландия), 12-ом международном конгрессе "International Congress on Yeasts" (2008, Киев, Украина) и V Съезде ВОГиС (2009, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 3 тезисных сообщений.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 139 страницах и включает в себя 39 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 298 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы О. polymorpha, О. parapolymorpha и Е. coli. Исследования проводили с использованием метилотрофных дрожжей, происходящих от двух независимых природных изолятов: АТСС 26012 (DL-1) и АТСС 34438 (CBS 4732), которые ранее на основе сходства физиологических и биохимических характеристик были отнесены к одному виду — Hansenula polymorpha или Pichia angusta. Недавно изоляты были ре-классифицированы и отнесены к разным видам рода Ogataea: АТСС 34438 назван О. polymorpha, а АТСС 26012 считается агамным мутантом О. parapolymorpha. Дрожжам О. parapolymorpha характерна высокая частота гомологичной рекомбинации, поэтому этот вид чаще использовали для направленного нарушения генов, а вид О. polymorpha использовали в различных экспериментах, особенно тех, где требовалось скрещивание и получение мейотического потомства.

Для молекулярного клонирования использовали штамм Е. coli. DH5a F' (FT/endAl hsdR17 (гк'тк) supE44 thi-1 recAl gyrA (NaT) relAl A(lacZYA-argF)U169 deoR (f80dlacA(lacZ)Ml5))

Методы. В работе использовали различные методы генетики дрожжей (скрещивание и анализ мейотического потомства, трансформация плазмидами, инактивация хромосомных генов и др.), микробиологические и биохимические методы (выделение ДНК из клеток Е. coli и дрожжей, электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле и выделение ДНК из геля, полимеразная цепная реакция, молекулярное клонирование, приготовление дрожжевых лизатов, измерение тотального клеточного белка, переосаждение белков из культуральной среды, тестирование ферментативной активности белка иРА и ß-галактозидазы, электрофорез денатурированных белков в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мутации в генах ССН1, HOG1 и WEE1 супрессируют проявления мутации pmcl А. У О.

polymorphe! и О. parapolymorpha нарушение гена PMCJ приводит к повышению концентрации кальция в цитозоле и чувствительности дрожжей к SDS. Мы провели поиск мутаций, спрессирующих чувствительность мутанта pmcl А к SDS. Мутации получали методом случайной интеграции трансформирующей ДНК, основанном на том, что при трансформации дрожжей О. polymorpha линейные фрагменты ДНК с высокой частотой интегрируют в геном по механизму негомологичной рекомбинации, в результате чего нарушаются различные локусы. Наличие известной последовательности в мутантном локусе позволяет быстро его идентифицировать. Таким образом, на основе штамма с делецией гена РМС1 была получена коллекция мутантов, менее чувствительных к SDS, и у трех из них определены нарушенные гены. Эти гены были обозначены ССН1, HOG1 и WEE1, поскольку их последующий анализ показал, что они являются ортологами генов ССН1, HOG1 и SWEIAVEEl S. cerevisiae. Нарушение WEE1 произошло в результате хромосомной перестройки, затронувшей не только этот ген, но и локус, находящийся на расстоянии около 45 т.п.н. от него. Продукт гена ССН1 — субъединица канала для ионов кальция в цитоплазматической мембране. Продукт гена HOGI — протеинкиназа, ответственная за реакцию клетки на гиперосмотический шок, а ген WEE1/SWE1 кодирует киназу, участвующую в регуляции клеточного цикла.

Участие генов ССН1 и HOG1 в контроле чувствительности дрожжей рода Ogataea к SDS, было подтверждено путем направленного нарушения этих генов в штамме с мутацией pmclД. Штаммы О. polymorpha, в которых были совмещены мутации рте]А cchlA и рте!А hoglA, росли на среде, содержащей 0,008% SDS. в то время как штамм с мутацией pmcl А был к такой концентрации SDS чувствителен (рис. 2). То, что нарушение гена ССН1

супрессирует чувствительность pmclA к SDS, доказывает связь этой чувствительности с нарушением гомеостаза ионов кальция.

В отличие от генов ССН1 и HOG1, направленное нарушение гена WEE1 в штамме с мутациейpmclА О. polymorpha не приводило к снижению чувствительности дрожжей к SDS. Однако, при введении плазмиды с геном WEE1 в штамм pmclA weelA, полученный путем интеграции в геном штамма pmclД плазмидной ДНК по механизму негомологичной рекомбинации, наблюдалась комплементация чувствительности к SDS: штамм pmclД weelA, содержащий плазмиду с геном WEE1, обладал большей чувствительностью к SDS, чем штамм pmclД weel А без плазмиды (рис. 3). Мы провели ряд экспериментов по изучению наследования супрессорного проявления мутации weelД. Полученные нами данные указывали на то, что мутация weelA супрессирует проявления pmclД только на фоне хромосомной перестройки. Такая перестройка могла привести к нарушению гена или генов, которые были задействованы в механизме, обуславливающем чувствительность к SDS самого мутанта weelA. Мы предполагаем, что чувствительность к SDS, наблюдаемая при

Рис. 2. Рост штаммов с мутациями

ртс1А, ртс1А сск1А и ртс1А hoglA на среде, содержащей 8Б8.

Суспензии клеток штаммов с двойной мутацией 867/р61Н (ртс1А ссЫА) и Э67/р63В (ртс1А hoglA), а также исходного штамма Э67 (ртс1 А) наносили на твердую среду УРБ (-) и УРЭ, содержащую 0,008% БЭЭ (ЗОБ), и инкубировали 2 суток при 37°С.

Рис. 3. Рост штаммов с мутациями pmclA и pmclA weel А на среде, содержащей SDS. Суспензии клеток штаммов 1В (РА/С/ WEE1), SDS116 (pmclA weel А) и SDS116/pKAF48 (pmclA weel А [WEE1]) наносили на твердую среду YPD (-) и YPD, содержащую 0,006% SDS (SDS), и инкубировали 2 суток при 37° С.

повышении концентрации ионов кальция в цитозоле в результате нарушения гена РМС1, опосредована одновременно и Weelp и другим неизвестным компонентом (X), который негативно регулируется Weelp. При этом по отдельности ни инактивация Weelp, ни инактивация гипотетического компонента X не снижают чувствительность к SDS.

Нарушение гена РМС1 приводит к паузе клеточного цикла в фазе G2. У S. cerevisiae нарушение гена РМС1 приводит к повышению концентрации Са2+ в цитозоле, и активации Са2+/кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы кальциневрина. Кальциневрин негативно регулирует активность киназы Weelp и на уровне транскрипции гена WEE1, и на уровне деградации белка Weelp. Для того, чтобы изучить влияние нарушения гена РМС1 на экспрессию гена WEE1, мы получили штамм, содержащий химерный ген WEE1 :lacZ, кодирующий N-концевой фрагмент Weelp и р-галактозидазу, под промотором WEE1. Нарушение гена РМС1 в таком штамме не оказывало существенного влияния на активность Р-галактозидазы, однако сильно снижало скорость роста дрожжей и приводило к существенным морфологическим изменениям делящихся клеток (рис. 4). Подобные морфологические изменения ранее были обнаружены у S. cerevisiae при нарушении перехода G2-M в клеточном цикле, например, вызванным сверхэкспрессией гена SWE1 /WEE 1.

Киназа Weelp негативно регулирует активность циклин-зависимой киназы Cdc28p. Негативно регулируемый кальциневрином комплекс Hsllp/Hsl7p взаимодействует с Weelp, усиливая его деградацию, что приводит к активации комплекса Cdc28p/Clb и переходу клеточного цикла от фазы G2 к фазе М. Мы предполагаем, что продукт химерного гена WEE1 :lacZ, спасал от деградации Weelp дикого типа, эффективно конкурируя с ним за взаимодействие с комплексом Hsllp/Hsl7p, таким образом, приводил к накоплению Weelp, и в результате происходила остановка клеточного цикла в фазе G2.

Протеинкиназа Hoglp также участвует в регуляции клеточного цикла. При определенных условиях, например, в условиях гиперосмотического шока, Hsllp подвергается фосфорилированию киназой Hoglp, что нарушает его взаимодействие

Рис. 4. Делящиеся клетки из ночных культур штаммов DL1-L/pCHLX (WT), DLl-Awee (weel), DLW/L (WEElslacZ PMC1) и DLW-Apmc (WEEl:lacZpmcl).

комплекса Ш1р/Ш7р с \Veelp, вызывает накопление \Veelp и остановку клеточного цикла в фазе 02. Поскольку нарушение генов НОй! и ЖЕЕ1 приводит к снижению чувствительности к БОЭ у мутанта рте!Д, можно заключить, что у дрожжей рода О^Маеа чувствительность мутанта ртс!А к ЭОв связана с паузой в фазе 02, происходящей по причине накопления \Veelp.

Влияние мутации геЙ-27 на процессирование белка иРА-С,)302 сходно с проявлениями мутаций, нарушающих вакуолярную сортировку. Мутация ш1-27 влияет на функционирование секреторного аппарата клетки. В частности, штаммы с этой мутацией, более эффективно секретируют гетерологичный белок иРА, что связано с улучшением его укладки и секрецией аберрантных форм. Мы сравнили влияние мутации Ш1-27 на секрецию дрожжами О. ро1утогрИа белка иРА и его мутантного варианта с нарушенным участком КГ-гликозилирования иРА-С)302. Для оценки эффективности секреции мы анализировали содержание белков иРА и иРА-О302 в культуральной среде и клеточных лизатах методом иммуноблоттинга. Оказалось, что количество белка иРА-О302 в культуральной среде у штамма с мутацией ге11-27 не увеличено по сравнению со штаммом дикого типа, но при этом большая часть иРА-О302, секретированного мутантным штаммом, мигрирует при электрофорезе на уровне ~30 кДа (рис. 5А). Количество внутриклеточного иРА-О302 также заметно не отличалось у мутантного штамма и штамма дикого типа (рис. 5Б). В то же время, мутация ге11-27 существенно увеличивала секрецию немутантного варианта иРА без существенного перераспределения продуктов его протеолиза, а также уменьшала внутриклеточное накопление этого белка, что совпадало с полученными ранее результатами.

uPA uPA-Q3'

кДа Г' А'* i-1

52 =5 «к

00 Ш

UPA uPA-Q*

$ -Л $ Л л- Л л /у

кДа 52 —

38 — 31 —

Рис. 5. Иммуноблоттинг с антителами против иРА культуральных сред (А), клеточных лизатов (Б) штаммов 64MA70UAL (retl-27, uPA), 64MA70UA-RET (RETI, uPA), 64MA70QAL (retl-27, uPA-Q302) и 64MA70QA-RET (RETI, uPA-Q302). A — Индукцию проводили в течение 70 часов. Б — Индукцию проводили в течение 30 часов.

Известно, что увеличение протеолитической активации иРА и иРА-<3302 характерно для мутантов с нарушением компонентов, участвующих в транспортировке белков из аппарата Гольджи в вакуоль. Эффект мутации №1-27 был специфичен для мутантного белка иРА-С>302. На данный момент мы затрудняемся предположить механизм этого явления, поскольку для мутации т-е//-27 не было обнаружено влияния на сортировку белков в вакуоль, а у мутантов с дефектом вакуолярной сортировки в существенной степени не нарушен гомеостаз кальция. Интересно, что увеличение протеолитической активации иРА-(2302 у штамма с мутацией Ш1-27 (общее свойство с мутациями, нарушающими вакуолярный сортинг) усиливалось при инактивации гена вакуолярной кальциевой АТФазы РМС1 (данные не приведены). Это наблюдение также свидетельствует о связи СОР1-зависимого транспорта с функционированием вакуоли. Известно, что комплекс СОР1-В, в состав которого входит белок а-СОР (ДеПр), участвует в транспорте из эндосом — промежуточных компартментов, через которые происходит транспорт в вакуоль эндоцитируемых белков и белков из аппарата Гольджи. Мы предполагаем, что влияние мутации гег/-27 на процессирование иРА-С2302, опосредовано ее влиянием на функционировние эндосом.

Нарушение гена РМШ приводит к снижению жизнеспособности у О. ро1утогрка. У О.

ро1утогрка, как иуХ сегеушае, нарушение гена РМК1, кодирующего Са2+/Мп2+ АТФ-азу аппарата Гольджи, приводит к чувствительности к нехватке в среде Са2+, к нарушению гликозилирования секретируемых белков в аппарате Гольджи и к увеличению эффективности секреции чужеродных белков. Кроме того, эта мутация приводила к снижению как скорости роста, так и плотности стационарной культуры. Это могло указывать на повышенную частоту гибели клеток. Изучение ночных культур штаммов О. ро1утогрка методом окрашивания метиленовым синим, показало, что в культуре штамма с мутацией ртг1 Д доля окрашенных, а значит мертвых, клеток составляла около 30%, тогда как в культуре штамма, содержащего плазмиду, несущую аллель гена РМШ дикого типа, доля мёртвых клеток составляла всего 6-7%.

Для того чтобы изучить влияние нарушения гена РМШ на жизнеспособность клеток при пониженной температуре, аликвоты ночной культуры штамма с мутацией ртг1 Д и штамма, содержащего плазмиду, несущую аллель гена РМШ дикого типа, инкубировали 0-6 дней при температуре +4°С, высевали в разведениях на чашки с УРЭ и выращивали при оптимальной для роста температуре (+37°С) до появления колоний. Через 6 суток хранения при +4°С в культуре штамма с мутантной аллелью ртг1А, доля клеток, способных дать колонии, составляла менее 1% относительно исходной культуры, тогда как в культуре

штамма с копией гена PMR1 дикого типа, доля жизнеспособных клеток за то же время фактически не изменилась.

В норме, выделенная га клеток геномная ДНК дрожжей мигрирует при электорфорезе в постоянном поле в агарозном геле как полоса выше уровня 10 т. п. н. с незначительным количеством более низкомолекулярных форм, дающих некоторую "смазанность" основной полосы (рис. 6А, левая дорожка). Однако в препарате геномной ДНК мутанта pmrlА мы обнаружили большое количество ДНК, мигрирующей при электрофорезе существенно быстрее основной полосы (рис. 6А, средняя дорожка) и количество таких форм ДНК сильно возрастало, если среда содержала аммоний-фосфатный буфер (рис. 6А, правая дорожка). В этих условиях большая часть клеток погибала, поэтому логично предполагать, что фрагментации ДНК связана с процессом гибели клеток, что характерно для апоптоза. Нарушение роста клеток штамма с мутацией pmrl А происходит по причине нехватки Са2+ в секреторном пути, гибель клеток штамма с мутацией pmcIA — из-за повышения концентрации Са2+ в цитозоле. При электрофоретическом анализе ДНК клеток штамма с мутацией pmcIA существенного усиления фрагментации выявлено не было ни в случае гибели клеток в присутствии 200 мМ СаС1г, ни в присутствии 0,006% SDS (рис. 6В). Это наблюдение указывает на то, что механизмы нарушения роста клеток штамма с мутацией pmrl А и штамма с мутацией pmcIA отличаются.

Мутации retl-27 и ypt6A нарушают доставку Са2+ в комиартмеиты секреторного пути.

Ген RETI кодирует белок а-СОР, являющийся компонентом окаймляющего комплекса COPI. Мутация retl-27, нарушающая ретроградный везикулярный транспорт, также приводит к чувствительности дрожжей рода Ogaíaea к нехватке в среде Са2+, а совмещение этой мутации с нарушением гена PMR1 летально. Рост дрожжей, у которых совмещены эти мутации, возможен только при повышенной концентрации Са2+ в среде. При переносе клеток с такой среды на стандартную клетки начинали гибнуть, что сопровождалось сильной фрагментацией ДНК (рис. 6Б).

Ген YPT6 кодирует ГТФ-азу, участвующую в слиянии с мембранами органелл везикул, осуществляющих транспорт между цистернами аппарата Гольджи, от эндосом к аппарату Гольджи и от аппарата Гольджи к ЭР. Взаимодействие мутации pmrl A cypí6A было похоже на взаимодействие с retl-27: совмещение мутаций pmrl А и ypí6A хотя и не было летальным, штамм pmrlA ypíóA был почти неспособен расти на стандартной среде, а добавление в среду СаСЬ в существенной степени восстанавливало рост (рис. 7).

^ А* ^ / / /

0,25 0,2

ртг1й геИ-27 инкубация в среде без добавки Саг*

0ч 1ч 2,5ч 6ч

^ ей ^ ^

Рис. 6. Фракции ДНК, выделенные из штаммов 1МА77/12-Р\Ш (РМШ), и 1МА77/12-А (ртг/А) (А); МС39 (ртг1 гсМ-27) (Б), или ОШ-Дртс (ртс1А) и ОН (РМС1) (В).

А — Трансформантов выращивали в индукционной среде в присутствии фосфата аммония (СМН4)зР04), или без него (-) при 37°С в течение 24 часов. Из клеток выделяли ДНК и разделяли электрофоретически в 2% агарозе.

Б — Клетки штамма МС39, потерявшего плазмиду рСАТ1 с геном РМШ (ртг1 Д гег1-27) выращивали в среде УРО, содержащей 10 мМ СаС12, а затем пересевали в среду УРЭ и инкубировали 0-6 часов. Из клеток выделяли ДНК и разделяли электрофоретически в 2% агарозе.

В — Штаммы выращивали в среде УРО в присутствии 100 мМ СаС12 (СаС12), 0,006% ЭВБ (БОв), или без добавок (-) при 37 С в течение 24 часов. Из клеток выделяли ДНК и разделяли электрофоретически в 1,8% агарозе.

В отсутствие АТФ-азы РгшТр концентрация Са2+ в ЭР поддерживается на достаточном для жизни уровне, что говорит о том, что помимо аппарата Гольджи в качестве источников Са2+ для ЭР могут выступать другие органеллы, или внешняя среда. Поскольку нарушение везикулярного транспорта усугубляет кальций-зависимый фенотип ртг1 Д, можно заключить, что в отсутствие РгшТр везикулярный транспорт осуществляет доставку ионов кальция из дополнительного источника в ЭР. Мы предполагаем, что таким источником могут быть эндосомы. Эти органеллы не имеют собственной кальциевой АТФ-азы, однако они

ртг1А УРТ6

РМЙ1 ургбл

ртг1 А >^6Д

Рис. 7. Рост штаммов с мутациями ртг1 Д и ур1бА.

Суспензии клеток штаммов 1МА77/120 {ртг1 Д УРТ6), 1МА77/120-ДурКрС АТ1 (РМШ ургбА), 1МА77/120-Дур1 (ртг1А ур1бА) с шагом разведения 10 раз наносили на среду УРО (-) и УРР, содержащую 10 мМ СаСЪ (СаС12), и инкубировали 2 суток при 37°С.

связаны везикулярным транспортом с плазматической мембраной (а значит и с внешней средой), а также с вакуолью, которая является основным депо Са2+ в дрожжевой клетке.

Нарушение гена ССН1 усиливает проявления мутаций ртг1А и ге11-27.

Нарушение гена ССН1, кодирующего субъединицу канала для Са2+ в цитоплазматической мембране, приводило к чувствительности клеток к недостатку кальция в среде. Аналогичные

проявления были у мутаций ртг1А и геИ-27. Поэтому можно было предполагать, что совмещение этих мутаций с нарушением ССН1 должно увеличивать зависимость клеток от содержания ионов кальция в среде. Действительно, при совмещении мутаций ртг1А и ссМА мы наблюдали комбинативный эффект: рост штамма с делецией ртг1А существенно замедлялся, а рост «двойного мутанта» ртг!А ссЫА полностью прекращался (рис. 8). Этот фенотип зависел от Са2+, поскольку при добавлении в среду 10

Рис. 8. Рост штаммов с мутациями ртг1А, ссЫА и ртг1А ссИ1А. Штаммы 1МА77/120А-Ь (ртг1А ССН1), 1МА77/120А-ДссЬ {ртг1А ссЫА), 1МА77/120А-ДссЬ<рАБ18 (РМШ ссМА) и 1МА77/12в А-Ь<р АБ18 (РМЯ1 ССН1) штрихом высевали на среду вС (вС) и 8С с 10 мМ СаСЪ (БС + СаС12), и инкубировали 2 суток при 37°С.

мМ СаС12 рост ртг1А ссЫА восстанавливался. Нарушение гена ССН1 должно снижать концентрацию кальция в цитоплазме, а значит и эффективность его транспорта оттуда в компартменты секреторного пути АТФ-азами Ршг1р и Ршс1р. В том случае, если дополнительным источником кальция для ЭР была бы только внешняя среда, и в отсутствие РгшТр в секреторный путь кальций попадал бы исключительно благодаря эндоцитозу, нарушение гена ССН1 не должно было бы оказывать влияние на проявления мутации ртг1 Д. Но поскольку при совмещении мутаций мы наблюдали комбинативный эффект, можно предположить, что вакуоль, в которую Са2+ попадает из цитоплазмы, является одним из источников этого иона для ЭР.

Аналогичным образом делеция ссЫА влияла на проявления мутации те/7-27 в условиях дефицита ионов кальция в среде. Штаммы с мутациями в одном из генов АЕ77, или ССН1 проявляли чувствительность при концентрации ЭГТА равной 15 мМ, а штамм, совмещающий мутацию ге11-27 с нарушением гена ССН1, рос заметно хуже остальных штаммов уже при 10 мМ ЭГТА (рис. 9). Мы полагаем, что это также связано с тем, что кальций, попадающий внутрь клетки благодаря СсЫр переносится в люмен аппарата Гольджи и вакуоли, а оттуда транспортируется в ЭР в везикулах СОР1.

Мутации геП-27 и ртс!& влияют на гомеостаз Са2+ независимо друг от друга. Для того, чтобы определить роль вакуоли в снабжении ЭР ионами кальция, мы изучили взаимное влияние мутаций геИ-27 и ртс1А. При концентрации СаСЬ равной 80 мМ штамм О. роЬутогрЬа с мутацией ртс1Л и двойной мутант ртс1А геИ-27 демонстрировали меньшую скорость роста по сравнению со штаммом, несущим аллели этих генов дикого типа, а при концентрации 160 мМ рост штаммов ртс1А и ртс1А ге1\-27 прекращался. При этом способность штамма с мутацией ге11-27 и аллелью гена РМС1 дикого типа расти на среде, содержащей ионы кальция, существенно не отличалась от способности штамма, несущего

_ 10 мМ ЭГТА 15 мМ ЭГТА

ret1-27 ССН1 □ □ ■

refí-27 cchlA □ ■

RET1 cchlA. □ □ «|5

RET1 CCH1 □ □ Q

Рис. 9. Рост штаммов с мутациями cchlA, retl-27 и cchlA retl-27 в условиях дефицита Саг+. Суспензии клеток штаммов 64МА70-ссЬД<р2СНА6-270PU (RETI cchlA), 64МА70-cch& {retl-27 cchlA), 64MA70 (retl-27 CCH1) и

64MA70A<p2CHA6-270PU (RETI CCH1) наносили на твердую SC* (-) и эту же среду, содержащую ЭГТА в концентрации 10 (10 мМ ЭГТА) и 15 мМ (15 мМ ЭГТА), и инкубировали 2 суток при 37°С.

аллели дикого типа обоих генов (рис. 10А). Таким образом, мутация геИ-27 не оказала существенного влияния на чувствительность к высокому содержанию кальция в среде, обусловленную мутацией рте 1а1. При выращивании на среде, содержащей 15 мМ ЭГТА, скорость роста всех штаммов была одинаково снижена. Концентрация ЭГТА в среде 20 мМ оказалась непермиссивной и для штамма с мутацией ге/7-27 и аллелью РМС1 дикого типа, и для двойного мутанта ртс1Л Ш1-27 (рис. 10Б). Таким образом, мутация ртс1А не оказала заметного влияния на чувствительность к ЭГТА в штамме О. ро1утогрка с мутацией ге11-27.

Нарушение везикулярного транспорта в штамме с мутацией гег1-27 должно ухудшать доставку ионов кальция в ЭР как из аппарата Гольджи, так и из дополнительного источника этих ионов. В том случае, если бы вакуоль играла существенную роль в качестве дополнительного источника ионов кальция для ЭР, можно было бы ожидать, что совмещение нарушения везикулярного транспорта, вызванное мутаций ге11-27, и снижение концентрации Са2+ в вакуоли, вызванное мутацией ртс1 А, будет иметь физиологические последствия. Однако оказалось, что мутации влияют на гомеостаз Са2+ независимо. Это указывает на то, что роль вакуоли как источника Са2+ для ЭР не столь существенна.

А 80 мМ CaCI2 160 мМ CaCI2 Б _ 15 мМ ЭГТА 20 мМ ЭГТА

pmclA RET1 и Q ■ pmdñ RET1 5

pmclA retí-27 □ # ■ pmclA ret1-27 ■

РМС1 ret1-27 # • W РМС1 retí-27 ® О ■

РМС1 RET1 $ т Ф РМС1 RET1 • о ©

Рис. 10. Рост штаммов с мутациями pmclA, retl-27 и pmclA retl-27 в условиях избытка (А) и дефицита (Б) в среде ионов кальция.

А — Суспензии клеток штаммов 64MA70Q-RET-Apmc (pmclA RETI), 64MA70QA-pmc (pmclA retl-27), 64MA70QAL (PMC1 retl-27) и 64MA70QL-RET (PMC1 RETI) наносили на твердую среду YPD (-) и YPD, содержащую СаС12 в концентрации 80 (80 мМ СаС12) и 160 мМ (160 мМ СаС12), и инкубировали 2 суток при 37°С. Б — Суспензии клеток штаммов 64MA70Q-RET-Apmc (pmclA RETI), 64MA70QA-Дртс (pmclA retl-27), 64MA70QAL (PMC1 retl-27) и 64MA70QL-RET (PMC1 RETI) наносили на твердую среду SC* (-) и эту же среду, содержащую ЭГТА в концентрации 15 (15 мМ ЭГТА) и 20 мМ (20 мМ ЭГТА), и инкубировали 2 суток при 37°С.

Мп2+ восстанавливает рост штамма с нарушенным геном P:\IR I при низкой концентрации Са2+в среде. Если среда не содержит достаточного количества Са2+ жизднедеятельность клеток дрожжей нарушается. Известно, что при нехватке Са2+ в среде добавление низких концентраций Мп2+ восстанавливает рост дрожжей сегеушае. Это означает, что ионы марганца могут заменять ионы кальция в каком-то жизненно важном процессе. АТФ-аза аппарата Гольджи Ртг1р участвует в транспорте Са2+ и Мп2+ в люмен органеллы, где эти ионы необходимы для процессов гликозилирования, укладки и сортировки белков. Поэтому клетки, лишенные Ртг1р, обладают повышенной чувствительностью к нехватке в среде Са2+. Для того, чтобы проверить, не связан ли положительный эффект Мп2+ на рост дрожжей с процессами, протекающими в секреторном пути, мы изучили влияние разных концентраций МпСЬ на рост ртг1 А в условиях дефицита кальция. Мутант ртг1А был чувствителен к нехватке в среде ионов кальция и избытку ионов марганца, а при добавлении в среду 0,5-1 мМ МпСЬ его рост значительно улучшался (рис. 11). Это означает, что процесс, в котором ионы кальция и марганца взаимозаменяемы, локализован в секреторном пути.

Увеличение концентрации Мн2+ в среде не спасает от гибели клетки О. ро1утогрка при одновременном нарушении генов РМС1 и РМШ. У дрожжей 8. сегеушае гибель двойного мутанта ртг1А ртс1А связана с повышением концентрации кальция в цитозоле. Мы показали, что совмещение этих мутаций у О. ро1утогрИа также летально (данные не приведены). Нарушение гена РМШ приводит к нехватке ионов кальция в люмене аппарата Гольджи и нарушению протекающих там процессов. У О. ро1утогрИа совмещение нарушения гена РМШ с мутациями, нарушающими везикулярный транспорт, было летально (ртг1 Д /-е/7-27), или приводило к синтетическому ингибированию роста (ртг1 Д ур1бА), связанному со снижением концентрации кальция в секреторном пути. В связи с тем, что вакуоль может играть роль дополнительного источника ионов кальция для ЭР, можно было

0,5 мМ 1 мМ 3 мМ МпС1г МпС12 МпС12

Рис. 11. Рост штамма с мутацией ртг1 А на среде вС* с низким содержанием Са2+ при различных концентрациях Мп Суспензии штаммов 1МА77/120А-Ь (ртг1А) и 1МА77/120А<рАП8 (ч>{) (-200 кл/мкл) по 3 мкл наносили на твердую среду ЭС* (-), и на эту же среду с добавкой МпСЬ в концентрации 0,5-3 мМ, и инкубировали при 37°С 2 суток.

предположить, что двойной мутант pmr¡\ pmclA О. polymorpha гибнет не по причине высокой концентрации Са2+ в цитозоле, а по причине низкой концентрации Са2+ в секреторном пути. Мп2+ способен улучшать рост pmrl А при низкой концентрации ионов кальция, заменяя Са2+ в процессах, которые, как мы полагаем, локализованы в секреторном пути. Мы изучили влияние Мп2+ на рост клеток pmrl A pmclA. Добавление в среду 1 мМ МпС12 не позволяло выживать клеткам pmrlA pmclA. Это указывало на то, что у О. polymorpha совмещение мутаций pmrlД и pmclA летально не из-за нехватки кальция в секреторном пути, а по причине высокой его концентрации в цитозоле, так же как и у 5. cerevisiae.

Са2+ снижает токсический эффект ионов марганца на клетки О. polymorpha. Несмотря на то, что низкие концентрации Мп2+ могут оказывать положительный эффект на рост некоторых мутантов, высокая концентрация этого иона в среде токсична для клеток. Причины токсичности Мп2+ не известны, а ее проявление в существенной степени зависит используемой среды. Для определения токсичных концентраций этого иона для О. polymorpha мы использовали специальную синтетическую среду с низким содержанием Са2+. На такой среде при концентрации МпС12 выше 3 мМ рост всех проверенных штаммов либо был сильно подавлен, либо совсем отсутствовал. Однако, при добавлении 5 мМ СаС12 ингибирование роста О. polymorpha, вызванное 3 мМ МпС12, ослаблялось (данные не приведены). Положительное влияние Са2+ на рост О. polymorpha в условиях токсической концентрации Мп2+ может происходить по двум причинам: (1) механизм токсичности Мп2+ связан непосредственно с конкурентным вытеснением Са2+, и/или (2) Са2+ конкурирует с Мп2+ при проникновении в клетку.

Мутации retl-27 и ypt6A повышают чувствительность О. polymorpha к Мп2+. У S.

cerevisiae известно два переносчика марганца, Smñp и Smf2p. В связи с тем, что потребность клетки в ионах марганца очень низкая, основная доля молекул переносчиков локализуется во внутриклеточных везикулах и эндосомах, а не на поверхности клетки, при этом большая часть молекул сразу направляется на деградацию после синтеза. При повышении концентрации марганца в среде реакция клетки включает в себя две стадии, на первой происходит быстрый эндоцитоз переносчиков с поверхности клетки и перенос их в вакуоль на деградацию, а во второй — направление на деградацию молекул, находящихся во внутриклеточных депо. Мутации retl-27 и yptóА нарушают везикулярный транспорт, и как следствие — гомеостаз Са2+ в секреторном пути. Мы изучили, как влияет нарушение генов RETI и YPT6 на зависимость роста О. polymorpha от концентрации Мп2+ при условии нехватки Са2+. Оказалось, что даже при концентрации 1 мМ МпС12 был токсичным для

мутанта ге11-27\ штамм с мутацией гег7-27 рос при этой концентрации МпС12 хуже, чем штамм дикого типа при концентрации 3 мМ (рис. 12). Известно, что белок а-СОР, кодируемый геном ЛЁТ/, в составе субкомплекса СОР1-В участвует в транспорте из эндосом, а нами было обнаружено, что мутация и мутации, нарушающие вакуолярную

сортировку, сходным образом влияют на процессирование гетерологичного белка иРА-С^302. Поэтому можно предполагать, что мутация ге11-27 вызывает нарушения функций эндосом и влияет на локализацию белков плазмалеммы, включая специфические транспортеры Мп2+.

В случае мутанта ур1бА эффект МпС12 был токсическим даже при концентрации 0,5 мМ (рис. 13). ГТФ-аза Ур1бр участвует в слиянии везикул с мембранами органелл секреторного пути при транспорте из эндосом в аппарат Гольджи, поэтому механизм чувствительности этого мутанта также может быть связан с функционированием эндосом и локализацией транспортеров Мп2+. Другими словами, мутации ге11-27 и ур1бА за счет нарушения везикулярного транспорта могут приводить к изменению распределения транспортеров марганца в клетке и/или снижать эффективность их деградации в вакуоли. Это должно увеличивать их количество на плазмолемме, и ухудшать способность клетки реагировать на повышение концентрации Мп2+ в среде.

— 1 мМ MnCI, 3 мМ MnCI,

retí-27

RET1

• * ШШ1

• »

0,5 мМ 1 мМ MnCI, MnCI,

ЗмМ MnCI,

5 мМ MnCI,

ypt6A

YPT6

□ □□□

Рис. 12. Рост штамма с мутацией retl-27 на среде SC* при различных концентрациях Мн2+. Суспензии штаммов 64MA70QAL {retl-27) к 64MA70QL-RET (RETI) в концентрации -200 и ~20 клеток/мкл по 3 мкл наносили на твердую среду SC* (-), и SC*, содержащую 1 мМ МпС12, 3 мМ МпСЬ, и инкубировали 2 суток при 37°С.

Рис. 13. Рост штамма с мутацией ур1бА на среде вС* при разных концентрациях Мп2+. Суспензии штаммов 1МА77/120-Дур1б<рСАТ1 (ургбА) и 1МА77/12<рСАТ1 (УРТб) в концентрации -200 клеток/мкл по 3 мкл наносили на твердую среду ЭС* (-), и на такую же среду, содержащую 0,5-5 мМ МпС12, и инкубировали 2 суток при 37°С.

Нарушение генов ССН1 и РМС1 приводит к снижению чувствительности к Мн2+ у О. ро1утогрИа. Добавление в среду ионов кальция частично защищало штамм дикого типа от токсического действия высокой концентрации марганца. Можно было предположить, что это связано с конкуренцией ионов кальция и марганца в каком-то жизненно важном процессе протекающем в цитоплазме. Мы решили проверить, как повлияет снижение и повышение

концентрации Са2+ в цитозоле при различных концентрациях Мп2+ в среде. СсЫр является субъединицей канала для ионов кальция в плазматической мембране, нарушение гена ССН1 приводит к снижению концентрации Са2+ в цитозоле и чувствительности клеток к нехватке Са2+ в среде. Нарушение гена РМС1, кодирующего вакуолярную кальциевую АТФ-азу, наоборот, приводит к повышению концентрации Са2+ в цитозоле. Мы изучили, как повлияет добавление МпС12 на рост штаммов О. ро1утогрИа, у которых нарушены гены ССН1 и РМС1.

Оказалось, что мутация ссй/Д повышает устойчивость О. ро1утогрИа к токсическому действию МпС12 (рис. 14). Поскольку нарушение гена ССН1 нарушает транспорт Са2+ через цитоплазматическую мембрану, и в то же время приводит к устойчивости дрожжей к Мп2+, можно сделать вывод о том, что описанное выше защитное действие Са2+ при токсической концентрации Мп2+ связано не с конкуренцией ионов в каком-то жизненно важном процессе в цитоплазме, а скорее с конкуренцией при проникновении в клетку. Мы предполагаем, что кальциевый канал СсЫр/М1с11р может пропускать ионы марганца, и, когда клетка отвечает на повышение концентрации этого иона эдоцитозом молекул специфических транспортеров Мп2+ с поверхности, СсЬ1р/М1сЛр становится основным транспортером марганца внутрь клетки. Поэтому, при делеции гена ССН1 клетки приобретают устойчивость к высокой концентрации марганца.

Штамм ртс1 Д также оказался устойчивым к негативному воздействию МпС12 (рис. 15). Повышение концентрации кальция в цитозоле, происходящее вследствие нарушения гена РМС1, активирует кальциневрин-зависимый сигнальный каскад, который регулирует активность множества генов, в том числе снижает экспрессию ССН1. Поскольку полученные

0,1 мМ 1 мМ 3 мМ МпС17 МпС1, МпС1,

0,5 мМ 1 мМ 3 мМ МпС1, МпС1, МпС12

0 • □ □

□ □ •

ссЫА ССН1

Рис. 14. Рост штамма с мутацией ссИ1А на среде БС* при разных концентрациях Мп2+. Суспензии штаммов 1МА77/120А-ссЬД<р АБ18 (ссЫ Д) и

1МА77/12и/рСНЬХс1Н8<рАР18 (ССН1) в концентрации -200 клеток/мкл по 3 мкл наносили на твердую среду БС* (-), и на такую же среду, но содержащую еще 0,1-3 мМ МпС12, и инкубировали 2 суток при 37°С.

ртс1А

М

# 01 т

ф □

Рис. 15. Рост штамма с мутацией ртс1А на среде 8С* при различных концентрациях Мп2+. Суспензии штаммов 1МА77/120А-ртсД<рАР 18 (ртс1А) и 1МА77/120А<рАР 18 (м) (-200 кл/мкл) по 3 мкл наносили на твердую среду ЭС* (-), и на эту же среду с добавкой МпС12 в концентрации 0,5-3 мМ, и инкубировали при 37°С 2 суток.

нами результаты указывают на то, что СсЫр/М1с11р при высокой концентрации марганца является основным каналом, переносящим ионы марганца через мембрану, делеция РМС1 может вызывать устойчивость клеток к высокой концентрации марганца за счет снижения экспрессии гена ССН1.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы мутации, супрессирующие у дрожжей О. ро1утогрка и О. рагаро1утогрИа чувствительность к БОБ, обусловленную нарушением вакуолярной кальциевой АТФазы Рте 1р. Анализ этих мутаций показал, что гиперчувствительность к ЗОБ мутанта ртс1 Д обусловлена увеличением концентрации Са2+ в цитозоле и связана с ингибированием перехода клеточного цикла от фазы 02 к М.

2. Снижение жизнеспособности у О. ро1утогрИа при инактивации гена РМК1 связано с уменьшением концентрации Са2+ и Мп2+ в секреторных органеллах. Этот эффект усиливается на фоне нарушений везикулярного транспорта, вызванных инактивацией Ур1бр и делецией С-концевого домена а-СОР.

3. Делеция С-концевого домена а-СОР приводит к усилению протеолитического процессинга модельного белка иРА-С?302, что указывает на участие а-СОР в формировании везикул, осуществляющих транспорт между аппаратом Гольджи и вакуолью.

4. Ионный канал СсЬ1р/М1с11р участвует в транспорте Мп2+ в клетку, а белки Ур1бр и а-СОР участвуют в контроле транспорта Мп2+ у О. ро1утогрИа.

5. На основе полученных данных выдвинута гипотеза, предполагающая, что в клетках дрожжей Са2+ в ЭР может доставляться из эндосом при участии везикулярного транспорта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Fokina A., Sokolov S., Ah Kang Н., Kalebina Т., Ter-Avanesyan М. D., Agaphonov M. Inactivation of Pmcl vacuolar Ca(2+) ATPase causes G 2 cell cycle delay in Hansenula polymorpha. // Cell Cycle. 2012. V. 11. №4. P. 778-784.

2. Agaphonov M.O., Plotnikova T.A., Fokina A.V., Romanova N.V., Packeizer A.N., Kang H.A. and Ter-Avanesyan M.D. Inactivation of the Hansenula polymorpha PMR1 gene affects cell viability and functioning of the secretory pathway. // FEMS Yeast Research. 2007. V. 7. №7. P. 1145-1152.

3. Агафонов M.O., Ильина A.B., Фокина A.B. Контроль укладки белков в секреторном пути Hansenula polymorpha. // Тезисы Съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и V Съезда ВОГиС. 21-28 июня 2009. Часть П. С. 59.

4. Agaphonov М.О., Fokina A., Chechenova М., Ter-Avanesyan М. Interrelationship between functioning of secretory organelles and Ca2+ homeostasis in Hansenula polymorpha. И Abstract Book of 12th International Congress on Yeasts. August 11-15 2008.

5. Agaphonov M.O., Chechenova M.B., Plotnikova T.A., Fokina A.V. Ter-Avanesyan M.D. Genetic analysis of Ca2+ trafficking in the secretory pathway of Hansenula polymorpha. II 4th Hansenula polymorpha worldwide network conference. Abstract Book. 3-5 September 2006.

Список сокращений

ЭГТА — этиленгликольтетраацетат ЭР — эндогиазматический ретикулум СОР — окаймляющий комплекс ЗОЭ — додецилсульфат натрия

Подписано в печать 12.10.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1597. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,1.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фокина, Анастасия Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы. Кальций в секреторном пути дрожжей: поддержание баланса в органеллах и участие в процессе секреции белка.

1. Этапы секреции белков.

1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоплазматический ретикулум (ЭР).

1.2. Гликозилирование.

1.2.1. N-гликозилирование.

1.2.2. О-гликозилирование.

1.2.3. Присоединение гликозилфосфатидилинозитольного якоря.

1.3. Укладка белков и сборка белковых комплексов в ЭР.

1.4. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков.

1.4.1. Комплексы окаймления СОРИ и СОРТ участвуют в транспорте белков между ЭР и аппаратом Гольджи.

1.4.2. Транспорт секретируемых белков через аппарат Гольджи.

1.4.3. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в лизосомы (вакуоль) и от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому (вакуоль).

1.5. Протеолитический процессинг.

1.6. Деградация белков в секреторных путях.

1.6.1. Контроль качества укладки белков в ЭР.

1.6.2. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков (UPR).

1.6.3. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом

ERAD).

1.6.4. Деградация белков в вакуоли.

2. Баланс ионов кальция и марганца в клетке и его влияние на физиологические процессы.

2.1. Гомеостаз ионов кальция.

2.1.1. Кальциевые АТФазы.

2.1.2. Кальциевые АТФазы дрожжей и проявления мутаций в генах, их кодирующих.

2.1.3. Каналы, проводящие ионы кальция, у дрожжей.

2.1.4. Роль ретроградного везикулярного СОРІ-транспорта в поддержании гомеостаза кальция в клетке.

2.1.5. Кальциневрин — ключевой эффектор кальций-зависимой регуляции различных физиологических процессов.

2.1.5.1. Роль кальциневрина в регуляции гомеостаза ионов кальция.

2.1.5.2. Роль сигнального пути кальциневрина в регуляции биогенеза клеточной стенки, формировании почки и клеточного цикла.

2.1.5.3. Роль кальциневрина в сигнальном пути запрограммированной смерти клетки.

2.2. Гомеостаз ионов марганца и его регуляция.

2.2.1. Общая характеристика транспортеров ионов металлов семейства Nramp.

2.2.2. Транспортеры Smflp и Smf2p ионов марганца у дрожжей S. cerevisiae.

2.2.2.1. Bsd2p контролирует транспортеры Smflp и Smf2p при физиологической концентрации ионов марганца.

2.2.2.2. Регуляция Smflp и Smf2p при дефиците ионов марганца.

2.2.2.3. Регуляция Smflp в условиях избытка ионов марганца.

2.2.2.4. Регуляция Smflp ионами кадмия.

2.2.3. Pmrlp как транспортер марганца.

2.2.4. Транспорт марганца в вакуоль.

2.3. Взаимозаменяемость ионов кальция и марганца.

Цели и задачи.

Материалы и методы.

1. Штаммы микроорганизмов.

1.1. Виды и штаммы дрожжей рода Ogataea.

1.1.1. Получение штамма 1В-Артс О. polymorpha.

1.1.2. Получение штамма lMA27/12GA<pAFl 8 О. polymorpha.

1.1.3. Получение шатаммов 64MA70Q и 64MA70U О. polymorpha.

1.1.4. Получение изогенных штаммов О. polymorpha, отличающихся аллелью гена RET1, и содержащих экспрессионные кассеты иРА и uPA-Q

1.1.5. Получение штаммов О. polymorpha для изучения совмещения мутацийpmcl-Л и г et 1-27.

1.1.6. Получение штаммов О. polymorpha с мутациями, супрессирующими рте J А.

1.2. Штаммы Escherichia coli.

2. Плазмиды.

3. Состав сред и условия для выращивания микроорганизмов.

3.1. Среды для выращивания Е. coli.

3.2. Среды для выращивания дрожжей.

3.3. Условия культивирования.

4. Методы.

4.1. Трансформация клеток Е. coli SEM (Inoue Н. et al., 1990) с модификациями.

4.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli методом щелочного лизиса (Sambrook J. et al., 1989) с модификациями.

4.3. Манипуляции с ДНК in vitro.

4.3.1. Проведение реакции ферментативного расщепления ДНК эндонуклеазами.

4.3.2. Переосаждение ДНК после рестрикции для очистки от эндонуклеаз и смены буфера.

4.3.3. Лигирование.

4.3.4. Электрофорез в агарозном геле.

4.3.5. Препаративный электрофорез и выделение ДНК из 1% агарозного геля.

4.3.6. Проведение полимеразной цепной реакции.

4.4. Выделение и анализ ДНК дрожжей рода Ogataea.

4.5. Трансформация дрожжей рода Ogataea.

4.6. Методы работы с белками.

4.6.1. Тестирование ферментативной активности иРА.

4.6.2. Индукция экспрессии иРА в штаммах дрожжей рода Ogataea.

4.6.3. Измерение суммарного клеточного белка.

4.6.4. Электрофорез и иммуноблоттинг.

4.6.5. Анализ иРА из культуральной среды.

4.6.6. Приготовление дрожжевых лизатов.

4.7. Анализ чувствительности дрожжей рода Ogataea к содержанию в среде ионов кальция, SDS, сорбитола и NaCl.

4.8. Изучение влияния Мп2+ на рост мутантов О. polymorpha с нарушением гомеостаза кальция.

4.9. Анализ чувствительности дрожжей рода Ogataea к содержанию в среде ЭТТА.

4.10. Измерение активности ß-галактозидазы.

4.11. Анализ механизма гибели двойного мутантаpmrlA ret 1-27 О. polymorpha.

4.12. Другие методы.

Результаты.

1. Проявление нарушений гена РМЯ1.

1.1. Нарушение гена РМШ приводит к снижению жизнеспособности у О. ро1утогрИа.

1.2. Секреция чужеродного белка иРА у мутантартг1 сильно снижена при наличии в индукционной среде аммоний-фосфатного буфера.

1.3. В клетках штаммартг1А в присутствии фосфата аммония происходит фрагментация

2. Проявление нарушений гена РМС1.

2.1. Нарушение генов ССН1 и #067, супрессирует чувствительность к БББ у рте]А.

2.1.1. Проявления мутации hoglA.

2.1.2. Проявления мутации ссЫА.

2.2. Нарушение гена \VEE1, супрессирует чувствительность к БОБ уртс1А на фоне хромосомной перестройки.

2.2.1. У мутанта 8Э8116 произошло нарушение гена, кодирующего гомолог киназы ее1/8ше1.

2.2.2. Идентифицированный ген является ортологом гена 8ЖЕ1^ЕЕ1 Б. сегеу(з1ае.

2.2.3. Супрессия ртс!А в штамме БОБ 116 определяется мутацией в гене \VEE1.

2.2.4. Направленное нарушение гена \VEE1 не супрессирует мутациюртс1А и приводит к чувствительности к 8Б8 в штамме с интактным геном РМС1.

2.2.5. Генетический детерминант, определяющий супрессию мутацииртс1А, сцеплен с аллелью \veel-l.

2.2.6. Аллели \veel-l не достаточно для супрессии ртс1А.

2.3. Экспрессия химерного гена, содержащего Ы-концевой участок гена 1УЕЕ1, в штамме с мутацией ртс1А вызывает изменения морфологии клеток.

3. Проявления взаимодействий между генами, вовлеченных в регуляцию гомеостаза ионов кальция.

3.1. Совмещение мутаций ге/7-27 иртг1А приводит к гибели клеток по механизму апоптоза.

3.2. Совмещение делеций в генах РМШ и УРТб приводит к кальций-зависимому синтетическому ухудшению роста.

3.3. Проявления совмещения мутацийртс1А и ге//-27.

3.3.1. Влияние мутаций ртс1 Д и геП-27 на секрецию иРА и иРА-О

3.3.1.1. Влияние нарушения гена РМС1 на секрецию урокиназы.

3.3.1.2. Влияние мутации геИ-27 на секрецию и процессинг иРА-С}

3.3.1.3. Влияние совмещения мутацийpmclA и ret 1-27 на секрецию uPA-Q

3.3.2. Мутация retl-27 не влияет на проявление нарушения гена РМС1 в условиях избытка ионов кальция в среде.

3.3.3. ДелецияpmclA не оказывает влияния на определяемую мутацией retlчувствительность клеток к ЭГТА.

3.4. Проявление совмещения делеции cchl А с мутацией retl-27 и делециейpmrl А.

3.4.1. Проявление совмещения делеций cchlА иpmrl А.

3.4.2. Проявление совмещения делеции cchl А с мутацией retl-27.

4. Влияние Мп2+ на жизнеспособность мутантов с нарушенным гомеостазом Са2+.

4.1. Добавление в среду МпСЬ положительно влияет на ростpmrlА условиях низкой концентрации ионов кальция.

4.2. Нарушение гена РМС1 вызывает устойчивость к высокой концентрации ионов марганца в среде.

2+ 2+

4.3. Добавление в среду Мп , или Са не восстанавливает рост двойного мутантаpmclА pmrl А.

4.4. Проявление совмещения мутаций cchl А и pmrl А при различных концентрациях ионов марганца в среде.

4.5. Влияние нарушения гена YPT6 на позитивный и негативный эффект Мп

4.6. Влияние ионов марганца на выживаемость штамма retl-27 в условиях низкой концентрации ионов кальция в среде.

4.7. Мутация retl-27 супрессирует устойчивость pmclA к Мп2+.

Обсуждение результатов.

1. Нарушение гена РМС1 приводит к паузе клеточного цикла в фазе G2.

2. Влияние мутации retl-27 на процессирование белка uPA-Q302 сходно с проявлениями мутаций, нарушающих вакуолярную сортировку.

3. Мутации, влияющие на чувствительность О. polymorpha к Мп

4. Роль везикулярного транспорта в поддержании гомеостаза кальция и источники этого иона для секреторного пути.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей рода Ogataea"

В живой клетке одновременно происходит огромное количество разнообразных реакций, обеспечивающих сбалансированность и согласованность клеточных процессов. И все эти реакции осуществляются ограниченным количеством белков. Например, в дрожжевой клетке синтезируется всего около 6000 белков. Возможность поддержания большого количества сложных процессов ограниченным количеством компонентов, по-видимому, объясняется их полифункциональностью. Более того, для идеальной согласованности всех клеточных процессов требуется их тесная взаимосвязь и взаимопроникновение. Как правило, исследователи изучают каждый из процессов отдельно, поскольку усложнение изучаемой системы приводит к невозможности ее анализа.

Данная работа была посвящена изучению проявлений нарушений гомеостаза ионов кальция. Кальций принимает участие и в координации работы клеточных систем, являясь вторичным мессенджером при прохождении сигнала, и в функционировании секреторных органелл. При этом нарушение функционирования секреторного пути само по себе может вызывать определенные клеточные ответы. В нашем исследовании мы предприняли попытку найти подходы для того, чтобы разделить функции кальция в секреции и в проведении сигналов, а также функции эндоплазматического ретикулума как секреторной органеллы и как органеллы, участвующей в кальций-зависимом сигналлинге.

Некоторые функции ионов кальция являются тесно связанными с гомеостазом ионов марганца. В этой связи часть данной работы посвящена изучению пересечений функций этих ионов.

В качестве модельного объекта в работе использовали дрожжи двух близкородственных видов: Ogataea ро1утогр1га и О. рагаро1утогрИа, которые до 2011 г. на основании гомологии геномов, сходств в морфологии, особенностях роста и условиях культиврования относились к одному виду — Натепи1а ро1утогрка. Для простоты изложения, в тех случаях, когда речь идет об общих для этих видов свойствах и закономерностях, оба вида объединены под родовым названием Ogataea.

Обзор литературы:

Кальций в секреторном пути дрожжей: поддержание баланса в органеллах и участие в процессе секреции белков

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Фокина, Анастасия Владимировна

Выводы

1. Идентифицированы мутации, супрессирующие у дрожжей О. ро1утогрЪа и О. рагаро1утогрка чувствительность к 808, обусловленную нарушением вакуолярной кальциевой АТФазы Рте 1р. Анализ этих мутаций показал, что гиперчувствительность к 808 мутанта ртс1& обусловлена увеличением концентрации

2+

Са в цитозоле и связана с ингибированием перехода клеточного цикла от фазы в2 к М.

2. Снижение жизнеспособности у О. ро1утогрка при инактивации гена РМШ связано с уменьшением концентрации Са2+ и Мп2+ в секреторных органеллах. Этот эффект усиливается на фоне нарушений везикулярного транспорта, вызванных инактивацией Ур1бр и делецией С-концевого домена а-СОР.

3. Делеция С-концевого домена а-СОР приводит к усилению протеолитического процессинга модельного белка иРА-С)302, что указывает на участие а-СОР в формировании везикул, осуществляющих транспорт между аппаратом Гольджи и вакуолью.

4. Ионный канал СсЫр/М1с11р участвует в транспорте Мп2+ в клетку, а белки Ур1бр и а-СОР участвуют в контроле транспорта Мп2+ у О. ро1утогрка.

5. На основе полученных данных выдвинута гипотеза, предполагающая, что в клетках дрожжей Са2+ в ЭР может доставляться из эндосом при участии везикулярного транспорта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фокина, Анастасия Владимировна, Москва

1. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике ддрожжей-сахаромицетов. // Ленинград. Наука. 1984.

2. Чеченова М.Б. а-субъединица комплекса СОР1 дрожжей Hansenula polymorpha: Структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция// Автореферат диссертации на соискание степени кандидата биологических наук, Минздрав РФ РКНПК ИЭК Москва. 2004.

3. Agaphonov М.О., Beburov. M.Y., Ter-Avanesyan M.D., Smirnov V.N. A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. II Yeast. 1995. V. 11.№3:P. 1241-1247.

4. Agostinho P., Oliveira C.R. Involvement of calcineurin in the neurotoxic effects induced by amyloid-beta and prion peptides. // European Journal of Neuroscience. 2003. V. 17 №6. P. 11891196.

5. Andrews N. C. Iron homeostasis: Insights from genetics and animal models. // Nature Reviews Genetics. 2000. V. 1. P. 208-217.

6. Antebi A. and Fink G.R. The yeast Ca(2+)-ATPase homologue, Pmrl, is required for normal Golgi function and localizes in a novel Golgi-like distribution. // Molecular Biology of the Cell. 1992. V. 3№6.P. 633-654.

7. Aragon T., van Anken E., Pincus D., Serafimova I.M., Korennykh A.V., Rubio C.A., and Walter P. mRNA targeting to ER stress signaling sites. //Nature. 2009. V. 457. №7230. P. 736740.

8. Aramburu J., Rao A., Klee C.B. Calcineurin: From structure to function. // Curr. Top. Cell. Regul. 2000. V. 36. P. 237-295.

9. Aridor M., Traub L.M. Cargo selection in vesicular transport: The making and breaking of a CoA. // Traffic. 2002. V. 3. №8. P. 537-546.

10. Asai A., Qiu J., Narita Y., Chi S., Saito N., Shinoura N., Hamada H., Kuchino Y., Kirino T. High level calcineurin activity predisposes neuronal cells to apoptosis. // The Journal of Biological Chemistry. 1999. V. 274. №48. P. 34450-34458.

11. Astrup T., Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. // Arch Biochem Biophys. 1952. V. 40. №2. P. 346-351.

12. Axelsen K.B., Palmgren M.G. Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily. //Journal of Molecular Evolution. 1998. V. 46. №1. P. 84-101.

13. Axelsen K.B., Palmgren M.G. Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis. II Plant Physiology. 2001. V. 126. №2. P. 696-706.

14. Baksh S., Burns K., Andrin C., Michalak M. Interaction of calreticulin with protein disulfide isomerase. // The Journal ofBiological Chemistry. 1995. V. 270 №52. P. 31344.

15. Balch W.E., McCaffery. J.M., Plutner H., Farquhar M.G. Vesicular stomatitis virus glycoprotein is sorted and concentrated during export from the endoplasmic reticulum. // Cell. 1994. V. 76. №5. P. 841-852.

16. Ballou C. E. Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects. // Methods Enzymol. 1990. V. 185. P. 440-470.

17. Bankaitis V.A., Johnson L.M., Emr S.D. Isolation of yeast mutants defective in protein targeting to the vacuole. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. №23. P. 9075-9079.

18. Bays N.W., Gardner R.G., Seelig L.P., Joazeiro C.A., Hampton R.Y. Hrdlp/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. // Nature Cell Biology. 2001. V. 3. №1. P. 24-29.

19. Beck R., Sun Z., Adolf F„ Rutz C., Bassler J, Wild K., Sinning I., Hurt E., BrUgger B., Bethune J., and Wieland F. Membrane curvature induced by Arfl-GTP is essential for vesicle formation. // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2008. V. 105. №33. P. 11731.

20. Belde P.J., Vossen J.H., Borst-Pauwels G.W., Theuvenet A.P. Inositol 1,4,5-trisphosphate releases Ca2+ from vacuolar membrane vesicles of Saccharomyces cerevisiae. II FEBS Letters. 1993. V. 323. №1-2. P. 113-118.

21. Bertolotti A., Zhang Y., Hendershot L.M., Harding H.P., Ron D. Dynamic interaction of Bip and ER stress transducers in the unfolded-protein response. // Nature Cell Biology. 2000. V. 2. №6. P. 326-332.

22. Bogdanova A.I., Agaphonov M.O., Ter-Avanesyan M.D. Plasmid reorganization during integrative transformation in Hansenulapolymorpha. II Yeast. 1995. V. 11. №4. P. 343-353.

23. Bogdanova A.I., Kustikova O.S., Agaphonov M.O., Ter-Avanesyan M.D. Sequences of Saccharomyces cerevisiae 1 microns DNA improving plasmid partitioning in Hansenula polymorpha. II Yeast. 1998. V. 14. №1. P. 1-9.

24. Bonifacino J.S., Wiessman A.M. Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways. // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 1998. V. 14. P. 19-57.

25. Bonilla M., Nastase K.K., Cunningham K.W. Essential role of calcineurin in response to endoplasmic reticulum stress. //The EMBO Journal. 2002. V. 21 №10. P. 2343-2353.

26. Booher R.N., Deshaies R.J., Kirschner M.W. Properties of Saccharomyces cerevisiae Weel and its differential regulation of p34CDC28 in response to G1 and G2 cyclins. // The EMBO Journal. 1993. V. 12 №9. P. 3417-3426.

27. Brewis I.A. Ferguson M.A., Mehlert A., Turner A.J., Hooper N.M. Structures of the glycosyl-phosphatidylinositol anchors of porcine and human renal membrane dipeptidase. // The Journal of Biological Chemistry. 1995. V. 270. P. 22946-22956.

28. Brodsky J.L., McCraccken A.A. ER protein quality control and proteasome-mediated protein degradation. // Seminars in Cell & Developmental Biology. 1999. V. 10. №5. P. 507-513.

29. Brown D.A. and London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 1998. V. 14. P. 111-136.

30. Bryant N.J., Stevens Т.Н. Vacuole biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: Protein transport pathways to the yeast vacuole. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. V. 62. № 1. P. 230-247.

31. Burk S.E., Lytton J., MacLennan D.H., Shull G.E. cDNA cloning, functional expression, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. // The Journal of Biological Chemistry. 1989. V. 264. №31. P. 18561-18568.

32. Button D., Eidsath A. Aequorin targeted to the endoplasmic reticulum reveals heterogeneity in luminal Ca++ concentration and reports agonist- or IP3-induced release of Ca++. // Molecular Biology of the Cell. 1996. V. 7. №3. P. 419-434.

33. Caldwell S.R., Hill K.J. and Cooper A.A. Degradation of endoplasmic reticulum (ER) quality control substrates requires transport between the ER and Golgi. // The Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. P. 23296-23303.

34. Carafoli E., Brini M. Calcium pumps: Structural basis for and mechanism of calcium transmembrane transport. // Current Opinion in Chemical Biology. 2000. V. 4. №2. P. 152-161.

35. Carvalho P., Stanley A.M., and Rapoport T.A. Retro-translocation of a misfolded luminal ER protein by the ubiquitin-ligase Hrdlp. //Cell. 2010. V. 143. №4. P. 579-591.

36. Casadaban M.J., Martinez-Arias A., Shapira S.K., Chou J. Beta-galactosidase gene fusions for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. // Methods Enzymol. 1983. V. 100. P. 293-308.

37. Ceccarelli B., Hurlbut W. P., Mauro A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. // The Journal of Cell Biology. 1972. V. 54. № l.P. 30-38.

38. Cellier M., Privé G., Belouchi A., Kwan T., Rodrigues V., Chia W., and Gros P. Nramp defines a family of membrane proteins. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. №22. P. 10089-10093.

39. Chen X.-Z., Peng J.-B., Cohen A., Nelson H., Nelson N. and Hediger M.A. Yeast SMF1 mediates H+-coupled iron uptake with concomitant uncoupled cation currents. // The Journal of Biological Chemistry. 1999. V. 274. №49. P. 35089-35094.

40. Christianson J.C., Shaler T.A., Tyler R.E., and Kopito R.R. OS-9 and GRP94 deliver mutant a 1-antitrypsin to the Hrdl-SELIL ubiquitin ligase complex for ERAD. // Nature Cell Biology. 2009. V. 10. №3. P. 272-282.

41. Clerc S., Hirsch C., Oggier D.M., Deprez P., Jakob C., Sommer T., and Aebi M. Html protein generates the N-glycan signal for glycoprotein degradation in the endoplasmic reticulum. //The Journal of Cell Biology. 2009. V. 184. № LP. 159-172.

42. Clotet J., Escoté X., Adrover M.À., Yaakov G., Gari E., Aldea M., de Nadal E., and Posas F. Phosphorylation of Hsll by Hogl leads to a G2 arrest essential for cell survival at high osmolarity. // The EMBO Journal. 2006. V. 25. №11. P. 2338-2346.

43. Clotet J., Posas F. Control of cell cycle in response to osmostress: Lessons from yeast. // Methods Enzymol. 2007. V. 428. P. 63-76.

44. Cohen A., Nelson H. and Nelson N. The family of SMF metal ion transporters in yeast cells. //The Journal of Biological Chemistry. 2000. V. 275. №43. P. 33388-33394.

45. Courville P., Chaloupka R., Cellier M.F.M. Recent progress in structure-function analyses of Nramp proton-dependent metal-ion transporters. // Biochemistry and Cell Biology. 2006. V. 84. №6. P. 960-978.

46. Cowles C.R., Snyder W.B., Burd C.G., Emr S.D. Novel Golgi to vacuole delivery pathway in yeast: Identification of a sorting determinant and required transport component. // The EMBO Journal. 1997. V. 16. №10. P. 2769-2782.

47. Crabtree G.R. Calcium, calcineurin, and the control of transcription. // The Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. №4. P. 2313-2316.

48. Cunningham K.W. and Fink G.R. Ca2+ transport in Saccharomyces cerevisiae. II The Journal of Experimental Biology. 1994a. V. 196. P. 157-166.

49. Cunningham K.W. and Fink G.R. Calcineurin-dependent growth control in Saccharomyces2+ cerevisiae mutants lacking PMC1, a homolog of plasma membrane Ca ATPases. // The Journalof Cell Biology. 1994b. V. 124. №3. P. 351-363.2+

50. Cunningham K.W. and Fink G.R. Calcineurin inhibits VCX1-dependent H /Ca exchange and induces Ca2+ ATPases in Saccharomyces cerevisiae. II Molecular Biology of the Cell. 1996. V. 16. №5. P. 2226-2237.

51. Cyert M.S., Kunisawa R., Kaim D., Thorner J. Yeast has homologs (CNA1 and CNA2 gene products) of mammalian calcineurin, a calmodulin-regulated phosphoprotein phosphatase. Proc Natl Acad Sci USA. 1991. V. 88. №16. P. 7376-7380.

52. Dedhar S. Novel functions for calreticulin: Interaction with integrins and modulation of gene expression?//Trends Biochem Sci. 1994. V. 19. №7. 2669-2671.

53. Devasahayam G., Burke D.J., and Sturgill T.W. Golgi manganese transport is required for rapamycin signaling in Saccharomyces cerevisiae. II Genetics. 2007. V. 177. № 1. P. 231-238.

54. Devasahayam G., Ritz D., Helliwell S.B., Burke D.J., and Sturgill T.W. Pmrl, a Golgi Ca2+/Mn2+-ATPase, is a regulator of the target of rapamycin (TOR) signaling pathway in yeast. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. №47. P. 17840-17845.

55. Dill K.A., Chan H.S. From levinthal to pathways to funnels. // Nat Struct Biol. 1997. V. 4. № 1. P. 10-19.

56. Duden R., Kajkawa L., Wuestehube L., Schekman R. Epsilon-COP is a structural component of coatomer that functions to stabilize alpha-COP. // The EMBO Journal. 1998. V. 17. №4. P.985.995.

57. Dunn T., Gable K., Beeler T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. // The Journal of Biological Chemistry. 1994. V. 269. №10. P. 7273-7278.

58. Eguez L., Chung Y.-S., Kuchibhatla A., Paidhungat M. and Garrett S. Yeast Mn2+ transporter, Smflp, is regulated by ubiquitin-dependent vacuolar protein sorting. // Genetics. 2004. V. 167. №1. P. 107-117.

59. Eide D.J., Bridgham J.T., Zhao Z., Mattoon J.R. The vacuolar H(+)-ATPase of Saccharomyces cerevisiae is required for efficient copper detoxification, mitochondrial function, and iron metabolism. // Mol Gen Genet. 1993. V. 241. №3-4. P. 447-456.

60. Farquhar R., Honey N., Murant S.J., Bossier P., Schultz L., Montgomery D., Ellis R.W., Freedman R.B., Tuite M.F. Protein disulfide isomerase is essential for viability in Saccharomyces cerevisiae. II Gene. 1991. V. 108. № 1. P. 81 -89.

61. Ferguson M.A., Homans S.W., DwekR.A., Rademacher T.W. Glycosyl-phosphatidylinositol moiety that anchors Trypanosoma brucei variant surface glycoprotein to the membrane. // Science. 1988. V. 239 №4841. Pt. 1. P. 753-759.

62. Fischer M., Schnell N., Chattaway J., Davies P., Dixon G., Sanders D. The Saccharomyces cerevisiae CCH1 gene is involved in calcium influx and mating. // FEBS Letters. 1997. V. 419. №2-3. P. 259-262.

63. Forbes J.R. and Gros P. Divalent-metal transport by Nramp proteins at the interface of host-pathogen interactions. // Trends in Microbiology. 2001. V. 9. №8. P. 397-403

64. Friedlander R., Jarosch E., Urban J., Volkwein C., Sommer T. A regulatory link between ER-associated protein degradation and the unfolded-protein response. // Nature Cell Biology. 2000. V. 2. №7. P. 379-384.

65. Gabriely G., Kama R., Gerst J.E. Involvement of specific COPI subunits in protein sorting from the late endosome to the vacuole in yeast. // Molecular and Cellular Biology. 2007. V. 27. №2. P. 526-540.

66. Gaynor E.C. and Emr S.D. COPI-independent anterograde transport: Cargo-selective ER to Golgi protein transport in yeast COPI mutants. // The Journal of Cell Biology. 1997. V. 136. JV»4 789-802.

67. Gentzsch M. and Tanner W. Protein-O-glycosylation in yeast: Protein-specific mannosyltransferases. //Glycobiology. 1997. V. 7. №4. P. 481-486.

68. Gething M.J. and Sambrook J. Protein folding in the cell. // Nature. 1992. V. 355. №6355. P. 33-45.

69. Graham L.A., Hill K.J., Stevens T.H. Assembly of the yeast vacuolar H+-ATPase occurs in the endoplasmic reticulum and requires a Vmal2p/Vma22p assembly complex. // The Journal of Cell Biology. 1998. V. 142. №1. P. 39-49.

70. Griffiths G. Gut thoughts on the Ggolgi complex. // Traffic. 2000. V. 1. №9. P. 738-745.

71. Groenendyk J., Lynch J., Michalak M. Calreticulin, Ca2+, and calcineurin signaling from the endoplasmic reticulum. //Molecular Cells. 2004. V. 17. №3. P. 383-389.

72. Gunshin H., Mackenzie B., Berger U.V., Gunshin Y., Romero M.F., Boron W.F., Nussberger S., Gollan J.L. & Hediger M.A. Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter. // Nature. 1997. V. 388. P. 482-488.

73. Gunteski-Hamblin A.M., Clarke D.M., Shull G.E. Molecular cloning and tissue distribution of alternatively spliced mRNAs encoding possible mammalian homologues of the yeast secretory pathway calcium pump. // Biochemistry. 1992. V. 31. №33. P. 7600-7608.

74. Haas I.G. and Wable M. Immunoglobulin heavy chain binding protein. // Nature. 1983. V. 306. №5941. P. 387-389.

75. Haynes C.M., Titus E.A., Cooper A.A. Degradation of misfolded proteins prevents ER-derived oxidative stress and cell death. //Molecular Cell. 2004. V. 15. №5. P. 767-776.

76. Hebert D. N., Foellmer B., Helenius A. Calnexin and calreticulin promote folding, delay oligomerization and suppress degradation of influenza hemagglutinin in microsomes. II The EMBO Journal. 1996. V. 15. JV»12. 2961-2968.

77. Herbert D. Phipps P.J., and Strange R.E. Chemical analysis of microbial cells. // Methods microbial. 1971. V. 5. P. 244-249.

78. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system. // Annual Review of Biochemistry. 1998. V. 67. P. 425-479.

79. Hicke L. A new ticket for entry into budding vesicles-ubiquitin. // Cell. 2001. V. 106. №5. P. 527-530.

80. Hille-Rehfeld A. Mannose 6-phosphate receptors in sorting and transport of lysosomal enzymes.//Biochim Biophys Acta. 1995. V. 1241. №2. P. 177-194.

81. Hiller M.M., Finger A., Schweiger M., Wolf D.H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. // Science. 1996. V. 273. №5282. P. 1725-1728.

82. Hirsch C., Blom D., and Ploegh. A role for N-glycanase in the cytosolic turnover of glycoproteins. //The EMBO Journal. 2003. V. 22. №5. P. 1036-1046.

83. Holkeri H., Makarow M. Different degradation pathways for heterologous glycoproteins in yeast. // FEBS Letters. 1998. V. 429. №2. P. 162-166.

84. Hollander I.J. Plasminogen activators and their potential in therapy. // Crit. Rev. Biotechnol. 1987. V. 6.№3.P. 253-271.

85. Homans S.W., Ferguson M.A.J., Dwek R.A., Rademacher T.W., Anand R. and Williams A.F. Complete structure of the glycosyl phosphatidylinositol membrane anchor of rat brain Thy-1 glycoprotein. //Nature. 1988. V. 333. P. 269-272.

86. Hong E., Davidson A.R., Kaiser C.A. A pathway for targeting soluble misfolded proteins to the yeast vacuole. // The Journal of Cell Biology. 1996. V. 135. №3. P. 623-633.

87. Hosokawa N., Wada I., Hasegawa K., Yorihuzi T., Tremblay L.O., Herscovics A., Nagata K. A novel ER alpha-mannosidase-like protein accelerates ER-associated degradation. // EMBO Reports. 2001. V. 2. №5. P. 415-422.

88. Huibregtse J.M., Scheffner M., Beaudenon S., Howley P.M. A family of proteins structurally and functionally related to the E6-AP ubiquitin-protein ligase. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. №7. P. 2563-2567.

89. Iida H., Nakamura H., Ono T., Okumura M.S., Anraku Y. MIDI, a novel Saccharomyces cerevisiae gene encoding a plasma membrane protein, is required for Ca2+ influx and mating. // Molecular and Cellular Biology. 1994. V 14. №12. P. 8259-8271.

90. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. // Gene. 1990. V. 96. №1. P. 23-28.

91. Iodice L., Sarnataro S., Bonatti S. The carboxyl-terminal valine is required for transport of glycoprotein CD8a from the endoplasmic reticulum to the intermediate compartment. // The Journal ofBiological Chemistry. 2001. V. 276. №31. P. 28920-28926.

92. Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. //Journal of Bacteriology. 1983. V. 153. №1. P. 163-168.

93. Jaiswal J.K., Rivera V.M., Simon S.M. Exocytosis of post-Golgi vesicles is regulated by components of the endocytic machinery. // Cell. 2009. V. 137. №7. P. 1308-1319.

94. Jakob C.A., Bodmer D., Spirig U., Battig P., Marcil A., Dignard D., Bergeron J.J., Thomas D.Y., Aebi M. Htmlp, a mannosidase-like protein, is involved in glycoprotein degradation in yeast. // EMBO Reports. 2001. V. 2. №5. P. 423-430.

95. Jakob C.A. Burda P., te Heesen S., Aebi M., Roth J. Genetic tailoring of N-linked oligosaccharides: The role of glucose residues in glycoprotein processing of Saccharomyces cerevisiae in vivo. II Glycobiology. 1998. V. 8. №2. P. 155-164.

96. Jensen L.T., Carroll M.C., Hall M.D., Harvey C.J., Beese S.E., and Culotta V.C. Down-regulation of a manganese transporter in the face of metal toxicity. // Molecular Biology of the Cell. 2009. V. 20. №12. P. 2810-2819.

97. Jiang B., Sheraton J., Ram A.F., Dijkgraaf G.J., Klis F.M., Bussey H. CWH41 encodes a novel endoplasmic reticulum membrane N-glycoprotein involved in beta 1,6-glucan assembly. // Journal of Bacteriology. 1996. V. 178. №4. P. 1162-1171.

98. Johnson L.M., Bankaitis V.A., Emr S.D. Distinct sequence determinants direct intracellular sorting and modification of a yeast vacuolar protease. // Cell. 1987. V. 48. №5. P. 875-885.

99. Jones E.W. Vacuolar proteases and proteolytic artifacts in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 2002. V. 351. P. 127-150.

100. Jones J.S. and Prakash L. Yeast Saccharomyces cerevisiae selectable markers in pUC18 polylinkers. // Yeast. 1990. V. 6. №5. P. 363-366.

101. Kang H.A., Kim J.Y., Ko S.M., Park C.S., Ryu D.D., Sohn J.H., Choi E.S., Rhee S.K. Cloning and characterization of the Hansenula polymorpha homologue of the Saccharomyces cerevisiae PMR1 gene. //Yeast. 1998. V. 14. №13. P. 1233-1240.

102. Kawaguchi S., Hsu C.-L., Ng D.T.W. Interplay of substrate retention and export signals in endoplasmic reticulum quality control. //PLoS ONE. 2010. V. 5. №11. P. 1-14.

103. Kawasaki H., Kurosu Y., Kasai H., Isobe T. and Okuyama T. Limited digestion of calmodulin with trypsin in the presence or absence of various metal ions. // The Journal of Biochemistry. 1986. V. 99. №5. P. 1409-1416.

104. Keller C.H., LaPorte D.C., Toscano W.A.Jr., Storm D.R., Westcott K.R. Ca2+ regulation of cyclic nucleotide metabolism. // Annals of the New York Academy of Sciences. 1980. V. 356. P. 205-219.

105. Kim M.W., Agaphonov M.O., Kim J.Y., Rhee S.K., Kang H.A. Sequencing and functional analysis of the Hansenula polymorpha genomic fragment containing the YPT1 and PMI40 genes. //Yeast. 2002. V. 19. №10. 863-871.

106. Kimata Y., Oikawa D., Shimizu Y., Ishiwata-Kimata Y., Kohno K. A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-sensing protein Irel. // The Journal of Cell Biology. 2004. V. 167. №3. P. 445-456.

107. Kirchhausen T. Clathrin. // Annual Review of Biochemistry. 2000. V. 69. P. 699-727.

108. Klionsky D.J., Erm S.D. A new class of lysosomal/vacuolar protein sorting signals. // The Journal of Biological Chemistry. 1990. V. 265. №10. P. 5349-5352.

109. Knop M., Finger A., Braun T., Hellmuth K., Wolf D.H. Deri, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. // The EMBO Journal. 1996. V. 15. №4. P. 753-763.

110. Knop M., Hauser N., Wolf D.H. N-glycosylation affects endoplasmic reticulum degradation of a mutated derivative of carboxypeptidase yscY in yeast. // Yeast. 1996. V. 12. №12. P. 12291238.

111. Korennykh A.V., Egea P.F., Korostelev A.A., Finer-Moore J., Zhang C., Shokat K.M., Stroud R.M., and Walter P. The unfolded protein response signals through high-order assembly of Irel. //Nature. 2009. V. 457. №7230. P. 687-693.

112. Kreis T.E., Lowe M., and Pepperkok R. COPs regulating membrane traffic. // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 1995. V. 11. P. 677-706.

113. Kuehn M.J., Herrmann J.M., Schekman R. COPII-cargo interactions direct protein sorting into ER-derived transport vesicles. //Nature. 1998. V. 391. №6663. P. 187-190.

114. Kurtzman C.P. A new methanol assimilating yeast, Ogataea parapolymorpha, the ascosporic state of Candida parapolymorpha. II Antonie Van Leeuwenhoek. 2011. V. 100. №3. P. 455-462.

115. Kusakawa G., Saito T., Onuki R., Ishiguro K., Kishimoto T., Hisanaga S. Calpain-dependent proteolytic cleavage of the p35 cyclin-dependent kinase 5 activator to p25. // The Journal of Biological Chemistry. 2000. V. 275. №22. P. 17166-17172.

116. Kushnirov V.V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. // Yeast. 2000. V. 16. №9. P. 857-860.

117. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. №5259. P. 680-685.

118. Lai M.M., Burnett P.E., Wolosker H., Blackshaw S., Snyder S.H. Cain, a novel physiologic protein inhibitor of calcineurin. // The Journal of Biological Chemistry. 1998. V. 273. №29. P. 18325-18331.

119. Lapinskas P.J., Cunningham K.W., Liu X.F., Fink G.R., and Culotta V.C. Mutations in PMR1 suppress oxidative damage in yeast cells lacking superoxide dismutase. // Molecular and Cellular Biology. 1995. V. 15. №3. 1382-1388.

120. Lee M.C.S., Orci L., Hamamoto S., Futai E., Ravazzola M. and Schekman R. Sarlp N-terminal helix initiates membrane curvature and completes the fission of a COPII vesicle. // Cell. 2005. V. 122. №4. P. 605-617.

121. Li L., Chen O.S., Ward D.M. and Kaplan J. CCC1 is a transporter that mediates vacuolar iron storage in yeast. //The Journal ofBiological Chemistry. 2001. V. 26. №31. P. 29515-29519.

122. Lijnen H. R. and Collen D. Strategies for the improvement of thrombolytic agents. // Thromb Haemost. 1991. V. 66. №1. 88-110.

123. Lilley B.N. and Ploegh H.L. A membrane protein required for dislocation of misfolded proteins from the ER. // Nature. 2004. V. 42. P. 834-840.

124. Lilley B.N. and Ploegh H.L. Multiprotein complexes that link dislocation, ubiquitination, and extraction of misfolded proteins from the endoplasmic reticulum membrane. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. №40. P. 14296-14301.

125. Lin S.J. and Culotta V.C. Suppression of oxidative damage by Saccharomyces cerevisiae ATX2, which encodes a manganese-trafficking protein that localizes to Golgi-like vesicles. // Molecular and Cellular Biology. 1996. V. 16. №11. P. 6303-6312.

126. Liu X.F., Supek F., Nelson N. and Culotta V.C. Negative control of heavy metal uptake by the Saccharomyces cerevisiae BSD2 gene. // The Journal ofBiological Chemistry. 1997. V. 272. №18. P. 11763-11769.

127. Liu X.F. and Culotta V.C. Mutational analysis of Saccharomyces cerevisiae Smflp, a member of the Nramp family of metal transporters. // Journal of Molecular Biology. 1999a. V. 289. №4. P. 885-891

128. Liu X.F. and Culotta V.C. Post-translation control of Nramp metal transport in yeast. Role of metal ions and the BSD2 gene. // The Journal ofBiological Chemistry. 1999b. V. 274 №8. P. 4863-4868.

129. Locke E.G., Bonilla M., Liang L., Takita Y., and Cunningham K.W. A homolog of voltage-gated cachannels stimulated by depletion of secretory Ca in yeast. // Molecular and Cellular Biology. 2000. V. 20. №18. P. 6686-6694.

130. Loukin S. and Kung C. Manganese effectively supports yeast cell-cycle progression in place of calcium. // The Journal of Cell Biology. 1995. V. 131. №4. P. 1025-1037.

131. Love H.D., Lin C.-C., Short C.S., and Ostermann J. Isolation of functional Golgi-derived vesicles with a possible role in retrograde transport. // The Journal of Cell Biology. 1998. V. 140. №3. P. 541-551.

132. Luk E.E. and Culotta V.C. Manganese superoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae acquires its metal co-factor through a pathway involving the Nramp metal transporter, Smf2p. The Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. №50. P. 47556-47562.

133. Luk E., Yang M., Jensen L. T., Bourbonnais Y. and Culotta V. C. Manganese activation of superoxide dismutase 2 in the mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. II The Journal of Biological Chemistry. 2005. V. 280. №24. P. 22715-22720.

134. Lundmark R., Doherty G.J., Vallis Y., Peter B. J., and McMahon H.T. Arf family GTP loading is activated by, and generates, positive membrane curvature. // Biochemical Journal. V. 414. Pt. 2. P. 189-194.

135. Luo Z. and Gallwitz D. Biochemical and genetic evidence for the involvement of yeast Ypt6-GTPase in protein retrieval to different Golgi compartments. The Journal of Biological Chemistry. V. 278. №2. P. 791-799.

136. Ma X.-J., Lu Q., and Grunstein M. A search for proteins that interact genetically with histone H3 and H4 amino termini uncovers novel regulators of the Swel kinase in Saccharomyces cerevisiae. Genes & Development. 1996. V. 10. №11. P. 1327-1340.

137. Marchi V., Sorin A., Wei Y., Rao R. Induction of vacuolar Ca2+-ATPase and H+/Ca2+ exchange activity in yeast mutants lacking Pmrl, the Golgi Ca2+-ATPase. // FEBS Letters. 1999. V. 454. №3. P. 181-183.

138. Marcusson E.G., Horazdovsky B.F., Cereghino J.L., Gharakhanian E., Emr S.D. The sorting receptor for yeast vacuolar carboxypeptidase Y is encoded by the VPS10 gene. // Cell. 1994. V. 77. №4. P. 579-586.

139. Marsh B.J., Volkmann N., Mcintosh J.R., and Howell K.E. Direct continuities between cisternae at different levels of the Golgi complex in glucose-stimulated mouse islet beta cells. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. №15. P. 5565-5570.

140. Matheos D.P., Kingsbury T.J., Ahsan U.S., and Cunningham K.W. Tcnlp/Crzlp, a calcineurin-dependent transcription factor that differentially regulates gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Genes & Development. 1997. V. 11. №24. P. 3445-3458.

141. McCracken A.A., Brodsky J.L. Assembly of ER-associated protein degradation in vitro: Dependence on cytosol, calnexin, and ATP. // The Journal of Cell Biology. 1996. V. 132. №3. P. 291-298.

142. Medicherla B., Kostova Z., Schaefer A., and Wolf D.H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. // The EMBO Journal. 2004. V. 5. №7. P. 692-697.

143. Meldolesi J. and Pozzan T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. //Trends in Biochemical Sciences. 1998. V. 23. №1. P. 10-14.

144. Meyer C., Zizioli D., Lausmann S., Eskelinen E.L., Hamann J., Safitig P., von Figura K., Schu P. mul A-adaptin-deficient mice: Lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19. №10. P. 2193-2203.

145. Micaroni M., Perinetti G., Di Giandomenico D., Bianchi, K., Spaar, A., Mironov, A. A. Synchronous intra-Golgi transport induces the release of Ca2+ from the Golgi apparatus. // Experimental Cell Research. 2010. V. 316. №13. P. 2071-2086.

146. Mironov A.A., Weidman P., and Luini A. Variations on the intracellular transport theme: Maturing cisternae and trafficking tubules. // The Journal of Cell Biology. 1997. V. 138. №3. P. 481-484.

147. Mironov A.Jr., Luinia A., and Mironov A. A synthetic model of intra-Golgi traffic. // The FASEB Journal. 1998. V. 12. P. 249-252.

148. Mironov A.A., Beznoussenko G.V, Polishchuk R.S., Trucco A. Intra-Golgi transport: A way to a new paradigm? // Biochimica et Biophysica Acta. 2005. V. 1744. №3. P. 340-350.

149. Mironov A.A., Beznoussenko G.V., Polishchuk R.S., Trucco A. The Kiss-and-Run Model of Intra-Golgi Transport // Internationa Journal of Molecular Sciences. 2012. V. 13. №6. P. 6800-6819.

150. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. // Nature. 1997. V. 388. №6645. P. 882-887.

151. Mizunuma M., Hirata D., Miyahara K., Tsuchiya E. and Miyakawa T. Role of calcineurin and Mpkl in regulating the onset of mitosis in budding yeast. //Nature. 1998. V. 392. №6673. P. 303-306.

152. Mizunuma M., Hirata D., Miyaoka R., and Miyakawa T. Gsk-3 kinase Mckl and calcineurin coordinately mediate Hsll down-regulation by Ca2+ in budding yeast. // The EMBO Journal. 2001. V. 20. №5. P. 1074 1085.

153. Mizunuma M., Miyamura K., Hirata D., Yokoyama H., and Miyakawa T. Involvement of S-adenosylmethionine in G1 cell-cycle regulation in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. №16. P. 6086-6091.

154. Mizunuma M., Hirata D., and Miyakawa T. Implication of Pkclp protein kinase C in sustaining Cln2p level and polarized bud growth in response to calcium signaling in Saccharomyces cerevisiae. II Journal of Cell Science. 2005. V. 118. №18. P. 4219-4229.

155. Mori K. Signalling pathways in the unfolded protein response: Development from yeast to mammals. // The Journal of Biochemistry. 2009. V. 46. №6. P. 743-750.

156. Munro S. and Pelham H.R. An Hsp70-like protein in the ER: Identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. // Cell. 1986. V. 46. №2.291-300.

157. Nelson N. Metal ion transporters and homeostasis. // The EMBO Journal. 1999. V. 18. №16. P. 4361 -4371.

158. Neufeld T.P. Tor regulation: Sorting out the answers. // Cell Metabolism. 2007. V. 5№1. P. 3-5.

159. Ng D.T., Brown J.D., Walter P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. // The Journal of Cell Biology. 1996. V. 134. №2. P. 269-278.

160. Nie Z., Hirsch D.S., and Randazzo P.A. Arf and its many interactors. // Current Opinion in Cell Biology. 2003. V. 15. №4. P. 396-404.

161. Nikko E., Sullivan J.A., Pelham H.R. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smfl. // EMBO Reports. 2008. V. 9. №12. P. 12161221.

162. Nufer O., Guldbrandsen S., Degen M., Kappeler F., Paccaud J.P., Tani K., Hauri H.P. Role of cytoplasmic C-terminal amino acids of membrane proteins in ER export. // Journal of Cell Science. 2002. V. 115. Pt. 3. P. 619-628.

163. O'Rourke S.M. and Herskowitz I. The Hogl MAPK prevents cross talk between the HOG and pheromone response MAPK pathways in Saccharomyces cerevisiae. Genes & Development. 1998. V. 12. №18. P. 2874-2886.

164. Oliver J.D. Roderick H.L., Llewellyn D.H., High S. ERp57 functions as a subunit of specific complexes formed with the ER lectins calreticulin and calnexin. // Molecular Biology of the Cell. 1999. V. 10. №8. P. 2573-2582.

165. Orci L., Glick B.S., Rothman J.E. A new type of coated vesicular carrier that appears not to contain clathrin: Its possible role in protein transport within the Golgi stack. // Cell. 1986. V. 46. №2. P. 171-184.

166. Orci L., Stamnes M., Ravazzola M., Amherdt M., Perrelet A., Sollner T.H., Rothman J.E. Bidirectional transport by distinct populations of COPI-coated vesicles. // Cell. 1997. V. 90. №2. P. 335-349.

167. Paidhungat M., and Garrett S. A homolog of mammalian, voltage-gated calcium channels mediates yeast pheromone-stimulated Ca2+ uptake and exacerbates the cdcl(ts) growth defect. // Molecular and Cellular Biology. V. 17. №11. P. 6339-6347.

168. Palade G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. // Science. V. 189. №4200. P. 347-358.

169. Palmer C.P., Zhou X.L., Lin J., Loukin S.H., Kung C., Saimi Y. A TRP homolog in Saccharomyces cerevisiae forms an intracellular Ca(2+)-permeable channel in the yeast vacuolar membrane. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 2001. V. 98. №14. P. 7801-7805.

170. Parodi A.J. Role of N-oligosaccharide endoplasmic reticulum processing reactions in glycoprotein folding and degradation. //Biochemical Journal. 2000. V. 348. №1. P. 1-13.

171. Pelham H.R. Insights from yeast endosomes. //Current Opinion in Cell Biology. 2002. V. 14. №4. P. 454-462.

172. Pilon M., Schekman R. and Römisch K. Secölp mediates export of a misfolded secretory protein from the endoplasmic reticulum to the cytosol for degradation. // The EMBO Journal. 1997. V. 16. №15. P. 4540 -4548.

173. Pincus D., Chevalier M.W., Aragon T., van Anken E., Vidal S.E., El-Samad H., and Walter P. BiP binding to the ER-stress sensor Irel tunes the homeostatic behavior of the unfolded protein response. // PLoS Biology. 2010. V. 8. №7. el000415.

174. Pinton P., Pozzan T., Rizzuto R. The Golgi apparatus is an inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2+ store, with functional properties distinct from those of the endoplasmic reticulum. //The EMBO Journal. 1998. V. 17№18. P. 5298-5308.

175. Piper R.C., Bryant N.J., Stevens T.H. The membrane protein alkaline phosphatase is delivered to the vacuole by a route that is distinct from the VPS-dependent pathway. // The Journal of Cell Biology. 1997. V. 138. №3. P. 531-545.

176. Plemper R. K., Böhmler S., Bordallo J., Sommer T. and Wolf D.H. Mutant analysis links the translocon and BiP to retrograde protein transport for ER degradation. // Nature. 1997. V. 388. P. 891-895.

177. Portnoy M.E., Jensen L.T., and Culotta V.C. The distinct methods by which manganese and iron regulate the Nramp transporters in yeast. // Biochemical Journal. 2002. V. 362. №1. P. 119124.

178. Portnoy M.E., Liu X.F., and Culotta V.C. Saccharomyces cerevisiae expresses three functionally distinct homologues of the Nramp family of metal transporters. // Molecular and Cellular Biology. 2000. V. 20. №21. P. 7893-7902.

179. Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F. Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. // The Journal of Cell Biology. V. 168. №2. P. 257-269.

180. Pozos T.C., Sekler I., Cyert M.S. The product of HUM1, a novel yeast gene, is required for vacuolar Ca2+/H+ exchange and is related to mammalian Na+/Ca2+ exchangers. // Molecular Biology of the Cell. 1996. V. 16. №7. P. 3730-3741.

181. Ramsay L.M. and Gadd G.M. Mutants of Sacchciromyces cerevisiae defective in vacuolar function confirm a role for the vacuole in toxic metal ion detoxification. // FEMS Microbiol Lett 1997. V. 152. №2. P. 293-298.

182. Ray M.K., Yang J., Sundaram S., Stanley P. A novel glycosylation phenotype expressed by Lec23, a Chinese hamster ovary mutant deficient in alpha-glucosidase I. // The Journal of Biological Chemistry. 1991. V. 266. №34. P. 22818-22825.

183. Reddi A.R., Jensen L.T., and Culotta V.C. Manganese homeostasis in Saccharomyces cerevisiae. II Chemical Reviews. 2009a. V. 109. №101. P. 4722-4732.

184. Reddi A.R. Jensen L.T., Naranuntarat A., Rosenfeld L., Leung E., Shah R., and Culotta V.C. The overlapping roles of manganese and Cu/Zn Sod in oxidative stress protection. // Free Radical Biology and Medicine. 2009b. V. 46. №2. P. 154-162.

185. Reitman M.L. Trowbridge I.S., Kornfeld S. A lectin-resistant mouse lymphoma cell line is deficient in glucosidase II, a glycoprotein-processing enzyme. // The Journal of Biological Chemistry. V. 257. №17. P. 10357-10363.

186. Rexach M.F., Latterich. M., Schekman R.W. Characteristics of endoplasmic reticulum-derived transport vesicles. // The Journal of Cell Biology. V. 126. №5. P. 1133-1148.

187. Roberts R.L., Barbieri M.A., Pryse K.M., Chua M., Morisaki J.H., Stahl P.D. Endosome fusion in living cells overexpressing GFP-rab5. // The Journal of Cell Science. 1999. V. 112. №21. P. 3667-3675.

188. Rohde J.R., Bastidas R., Puria R., and Cardenas M.E. Nutritional control via Tor signaling in Saccharomyces cerevisiae. II Current Opinion in Microbiology. 2008. V. 11. №2. P. 153-160.

189. Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.J. Foreign gene expression in yeast: A review. // Yeast. 1992. V. 8. №6. P. 423-488.

190. Romero P.A., Dijkgraaf G.J., Shahinian S., Herscovics A., Bussey H. The yeast CWH41 gene encodes glucosidase I. // Glycobiology. 1997. V. 7. №7. P. 997-1004.

191. Ron D. and Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. //Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007. V. 8. №7. P. 519-529.

192. Rose M.D., Misra. L.M., Vogel J.P. Kar2, a karyogamy gene, is the yeast homolog of the mammalian BiPIGRP78 gene. // Cell. 1989. V. 57. №7. P. 1211-1221.

193. Rothman J.H. and Stevens T.H. Protein sorting in yeast: Mutants defective in vacuole biogenesis mislocalize vacuolar proteins into the late secretory pathway. // Cell. 1986. V. 47. №6. P. 1041-1051.

194. Rothman J.H., Howald I., Stevens T.H. Characterization of genes required for protein sorting and vacuolar function in the yeast Saccharomyces cerevisiae. // The EMBO Journal. 1989. V. 8. №7. P. 2057-2065.

195. Rothman J.E. and Wieland F.T. Protein sorting by transport vesicles. // Science. 1996. V. 272. №5259. P. 227-234.

196. Rudolph H.K., Antebi A., Fink G.R., Buckley C.M., Dorman T.E., LeVitre J., Davidow L.S., Mao J. and Moir D.T. The yeast secretory pathway is perturbed by mutations in PMR1, a member of a Ca2+ATPase family. //Cell. 1989. V. 58. №1. P. 133-145.

197. Rutkowski D.T. and Hegde R.S. Regulation of basal cellular physiology by the homeostatic unfolded protein response. // The Journal of Cell Biology. 2010. V. 189. №5. P. 783-794.

198. Scarborough G. A. Structure and function of the P-type atpases. // Current Opinion in Cell Biology. 1999. V. 11 №4. P. 517-522.

199. Schekman R., Orci L. Coat proteins and vesicle budding. // Science. 1996. V. 271. №5255. P. 1526-1533.

200. Scott D.C. and Schekman R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of shortlived transmembrane proteins. // The Journal of Cell Biology. V. 181. №7. P. 1095-1105.

201. Seeger M. and Payne G.S. A role for clathrin in the sorting of vacuolar proteins in the Golgi complex of yeast.// The EMBO Journal. 1992. V. 11. №8. P. 2811-2818.

202. Simons K. and Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2000. V. 1. №1. P. 31-39.

203. Singh A., Kaur N. and Kosman D.J. The metalloreductase Fre6p in Fe-efflux from the yeast vacuole. //The Journal of Biological Chemistry. 2007. V. 282. №39. P. 28619-28626.

204. Sipos G., Puoti A., Conzelmann A. Glycosylphosphatidylinositol membrane anchors in Saccharomyces cerevisiae: Absence of ceramides from complete precursor glycolipids. // The EMBO Journal. V. 13. №12. P. 2789-2796.

205. Slepnev V.I. and De Camilli P. Accessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle endocytosis. // Nature Reviews Neuroscience. 2000. V. 1. P. 161-172.

206. Sohn J.H., Choi E.S., Kang H.A., Rhee J.S., Agaphonov M.O., Ter-Avanesyan M.D., Rhee S.K. A dominant selection system designed for copy-number-controlled gene integration in

207. Hansenula polymorpha DL-1. // Applied Microbiology and Biotechnology. 1999. V. 51. №6 P 800-807.

208. Spang A., Matsuoka K., Hamamoto S., Schekman R., and Orci L. Coatomer, Arflp, and nucleotide are required to bud coat protein complex I-coated vesicles from large synthetic liposomes. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. №19. P. 11199-11204.

209. Spang A. ARF1 regulatory factors and COPI vesicle formation. // Current Opinion in Cell Biology. 2002. V. 14. №4. P. 423-427.

210. Spear E.D. and Ng D.T.W. Stress tolerance of misfolded carboxypeptidase Y requires maintenance of protein trafficking and degradative pathways. // Molecular Biology of the Cell. 2003. V. 14. №7. P. 2756-2767.

211. Stathopoulos A.M. and Cyert M.S. Calcineurin acts through the CRZ1 /TCN1 -encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast. // Genes & Development. 1997. V. 11. №24. P. 3432-3444.

212. Stimpson H.E.M., Lewis M.J. and Pelham H.R.B. Transferrin receptor-like proteins control the degradation of a yeast metal transporter. // The EMBO Journal. 2006. V. 25. №4. P. 662 -672.

213. Strahl-Bolsinger S., Gentzsch M., Tanner W. Protein O-mannosylation. // Biochimica et Biophysica Acta. V. 1426. №2. P. 297-307.

214. Strayle J., Pozzan Т., Rudolph H.K. Steady-state free Ca(2+) in the yeast endoplasmic reticulum reaches only 10 microM and is mainly controlled by the secretory pathway pump Pmrl. The EMBO Journal. 1999. V. 18. №.17. P. 4733-4743.

215. Strom M., Vollmer P., Tan T.J, Gallwitz D. A yeast gtpase-activating protein that interacts specifically with a member ofthe Ypt/Rab family. //Nature. 1993. V. 361. №6414. P. 736-739.

216. Sullivan J.A., Lewis M.J., Nikko E., and Pelham H.R.B. Multiple interactions drive adaptor-mediated recruitment of the ubiquitin ligase Rsp5 to membrane proteins in vivo and in vitro. II Molecular Biology ofthe Cell. 2007. V. 18. №7. 2429-2440.

217. Suzuki Т., Park. H., Hollingsworth N.M., Sternglanz R., and Lennarz W.J. PNG1, a yeast gene encoding a highly conserved peptide:N-glycanase. // The Journal of Cell Biology. 2000. V. 149. №5. P. 1039-1052.

218. Swanson R., Locher M., Hochstrasser M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and matalpha2 repressor .

219. Tachibana C. and Stevens Т.Н. The yeast EUG1 gene encodes an endoplasmic reticulum protein that is functionally related to protein disulfide isomerase. // Molecular and Cellular Biology. 1992. V. 12. №10. P. 4601-4611.

220. Tachikawa H., Miura Т., Katakura Y., Mizunaga T. Molecular structure of a yeast gene, PDI1, encoding protein disulfide isomerase that is essential for cell growth. // The Journal of Biochemistry. 1991. V. 110. №2. P. 306-313.

221. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. №9. P. 4350-4354.

222. Trimble R.B. and Atkinson P.H. Structural heterogeneity in the Man8-13GlcNAc oligosaccharides from log-phase saccharomyces yeast: A one- and two-dimensional 1H NMR spectroscopic study. // Glycobiology. 1992. V. 2. №1. 57-75.

223. Urbanowski J.L. and Piper R.C. The iron transporter Fthlp forms a complex with the Fet5 iron oxidase and resides on the vacuolar membrane. // The Journal of Biological Chemistry. 1999. V. 274. №53. P. 38061-38070.

224. Vairo M.L.R. and Borzani W. Precise Adsorption Method for Measuring the Percentage of Dead Bacterial Cells. //Applied Microbiology. 1962. V. 10. №6. P. 500-503.

225. Vails L.A., Winther J.R., Stevens T.H. Yeast carboxypeptidase Y vacuolar targeting signal is defined by four propeptide amino acids. // The Journal of Cell Biology. 1990. V. 111. №2. P. 361-368.

226. Vashist S., Kim W., Belden W.J., Spear E.D., Barlowe C., and Ng D.T.W. Distinct retrieval and retention mechanisms are required for the quality control of endoplasmic reticulum protein folding. // The Journal of Cell Biology. V. 155. №3. P. 355-368.

227. Veale R.A., Giuseppin M.L., van Eijk H.M., Sudbery P.E., Verrips C.T. Development of a strain of Hansenula polymorpha for the efficient expression of guar alpha-galactosidase. // Yeast. 1992. V. 8. №5. P. 361-372.

228. Vidal S.M., Malo D., Vogan K., Skamene E. and Gros P. Natural resistance to infection with intracellular parasites: Isolation of a candidate for Beg. // Cell. 1993. V. 73. №3. P. 469485.

229. Walter P., Lingappa V.R. Mechanism of protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane. // Annual Review of Cell Biology. 1986. V. 2. P. 499-516.

230. Wang C., Eufemi M., Turano C., Giartosio A. Influence of the carbohydrate moiety on the stability of glycoproteins. // Biochemistry. 1996. V. 35. №23. P. 7299-7307.

231. Wei Y. M. V., Wang R., and Rao R. (1999). An n-terminal ef hand-like motif modulates ion transport by pmrl, the yeast golgi ca2+/mn2+-atpase. Biochemistry 38(44): 14534-14541.

232. Werner E.D., Brodsky J.L., McCracken A.A. Proteasome-dependent endoplasmic reticulum-associated protein degradation: An unconventional route to a familiar fate. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. V. 93. №24. P. 13797-13801.

233. Wiertz E., Tortorella D., Bogyo M., Yu J., Mothes W., Jones T.R., Rapoport T.A. & Ploegh H.L. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. //Nature. 1996. V. 384. P. 432 438.

234. Williams R.J.P. Free manganese(II) and iron(II) cations can act as intracellular cell controls. //FEBS Letters. 1982. V. 140. №1. P. 3-10.

235. Wilson S. P. and Kirshner N. Calcium-evoked secretion from digitonin-permeabilized adrenal medullary chromaffin cells. // The Journal of Biological Chemistry. 1983. V. 258. №8. P. 4994-5000.

236. YaDeau J.T., Klein C., Blobel G. Yeast signal peptidase contains a glycoprotein and the Seel 1 gene product. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. №2. P. 517-521.

237. Yamamoto K., Fujii R., Toyofuku Y., Saito T., Koseki H., Hsu V.W., and Aoe T. The KDEL receptor mediates a retrieval mechanism that contributes to quality control at the endoplasmic reticulum. //The EMBO Journal. 2001. V. 20. №.12. P. 3082-3091.

238. Yang M., Jensen L.T., Gardner A.J., and Culotta V.C. Manganese toxicity and Saccharomyces cerevisiae Mam3p, a member of the ACDP (ancient conserved domain protein) family. // Biochemical Journal. 2005. V. 386. P. 479^87.

239. Yokoyama H., Mizunuma M., Okamoto M., Yamamoto J., Hirata D., and Miyakawa T. Involvement of calcineurin-dependent degradation of Yaplp in Ca2+-induced G2 cell-cycle regulation in Saccharomyces cerevisiae. II EMBO Reports. V. 7. №5. P. 519-524.

240. Zhao C., Jung U.S., Garrett-Engele P., Roe T., Cyert M.S., and Levin D.E. Temperature-induced expression of yeast FKS2 is under the dual control of protein kinase C and calcineurin. // Molecular and Cellular Biology. 1998. V. 18. №2. P. 1013-1022.

241. Ziegler F.D., Gemmil T.R., Trimble R.B. Glycoprotein synthesis in yeast. Early events in N-linked oligosaccharide processing in Schizosaccharomyces pombe. II The Journal of Biological Chemistry. 1994. V. 269. №17. P. 12527-12535.1. Благодарности

242. Глубоко признательна заведующему лабораторией молекулярной генетики М.Д. Тер-Аванесяну за предоставленную возможность выполнения работы и советы.

243. Отдельная благодарность всем преподавателям Кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за бесценные знания и опыт. То, что мне довелось учиться у заведующего кафедрой Н.В. Гусева, является предметом моей большой гордости.

Информация о работе
  • Фокина, Анастасия Владимировна
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2012
  • ВАК 03.01.03
Диссертация
Генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей рода Ogataea - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей рода Ogataea - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы