Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ систем токсин-антитоксин суперсемейства RelBE у лактобацилл

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ систем токсин-антитоксин суперсемейства RelBE у лактобацилл"

V £ Л. с г с______/

На правах рукописи

Климина Ксения Михайловна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СИСТЕМ ТОКСИН-АНТИТОКСИН СУПЕРСЕМЕЙСТВА Ие1ВЕ У ЛАКТОБАЦИЛЛ

Специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 СЕН 2015

Москва 2015

005561900

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

ДАНИЛЕНКО Валерий Николаевич, Заведующий лабораторией генетики микроорганизмов ИОГен РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ЛИВШИЦ Виталий Аркадьевич

Ведущий научный сотрудник

НИИ Аджиномото-генетика (ЗАО «АГРИ»),

г. Москва

доктор медицинских наук, профессор СУВОРОВ Александр Николаевич Заведующий отделом молекулярной микробиологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г. Москва

Защита состоится «22» октября 2015 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.002.214.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, 3.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института wvvw.vigg.ru , тел. 8-499-135-14-31.

Автореферат разослан «<^»

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

2015 года.

С V .А. Синелыцикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мнкробиота кишечника трактуется в настоящее время как еателлитиый орган, играющий ключевую роль в становлении и поддержании иммунитета и общего гомеостаза человека. Видовое и штаммовое разнообразие бактерий в микробиоте носит индивидуальный (возраст, образ жизни, состояние здоровья), этно-социальный (традиции питания) и репюнальный (популяции) характер. Важнейшей проблемой при изучении микробиоты человека является отсутствие эффективных генов-биомаркеров видовой и штаммовой идентификации бактериальных компонентов. Разработка таких маркеров и технологий для диагностики состава микробиоты человека является актуальным вопросом как научных, так и прикладных исследований общей и персонализированой медицины.

Цель работы

Структурно-функциональная характеристика генов токсин-антитоксин (ТА) систем II типа суперсемейства RelBE у штаммов Lactobacillus для их дальнейшего использования в качестве биомаркеров для видовой и штаммовой идентификации лактобацилл.

Залам» исследования

1. Создание и характеристика коллекции лактобацилл, выделенных из микробиоты здоровых людей центральных областей России.

2. Анализ in silico ТА систем суперсемейства RelBE в секвенированных геномах лактобацилл и изучение полиморфизма и функционирования в клетках Е. со//ТА систем из штаммов лабораторной коллекции.

3. Изучение регуляции экспрессии ТА системы Yef-YoeB/.,y, у штаммов L.rhamnosus.

4. Поиск и характеристика новых ТА систем у L. helveticus.

5. Использование ТА систем в качестве биомаркеров для изучения штаммового разнообразия лактобацилл.

Научная новизна работы

Впервые исследовано наличие, разнообразие и полиморфизм ТА систем суперсемейства RelBE у лактобацилл, в частности у штаммов L. rhamnosus, L.casei, L. helveticus. Показана активность ряда ТА систем лактобацилл в клетках E.coli. Впервые показана сложная организация оперона ТА системы Yef-YoeBi,/, у L. rhamnosus, включающая 4 сайта инициации транскрипции. Впервые найдены и исследованы новые ТА системы в штаммах L. helveticus. Впервые показано, что ТА системы могут быть использованы в качестве биологических маркеров для характеристики штаммового разнообразия микробиоты человека.

Практическая значимость

Создание метода универсальной, дешевой и быстрой молекулярно-генетической идентификации видов и штаммов лактобацилл, основаннонного на применении нового генетического маркера - генов ТА систем II типа. Предложенный нами метод может быть использован как для характеристики отдельных штаммов, так и для характеристики сообщества микроорганизмов, например в микробиоте человека.

Личный вклад автора

Автор принимала личное участие на всех этапах выполнения работы: в планировании и осуществлении экспериментов, оценке и интерпретации их результатов. В процессе исследования непосредственно автором осуществлялось выделение ДНК и РНК; конструирование праймеров, проведение ПЦР и электрофореза в агарозиом геле; анализ нуклеотидных последовательностей (НП); клонирование генов ТА систем и промоторных областей в экспрессионные векторы; проведение обратной транскрипции и количественной ПЦР-РВ. Работа по поиску промоторов и изучению их активности была выполнена в университете Фридриха-Шиллера в г. Йена, Германия, под руководством Сабины Брантл. Автор лично проводила статистическую обработку полученных результатов, оформляла результаты для представления в виде тезисов и докладов на научных конференциях, а также принимала участие в написании статей по результатам работы.

Апробация результатов работы

Результаты проведенных исследований были представлены на международных и российских конференциях, в том числе: на 38-м конгрессе Федерации Европейских Биохимических Обществ (The 38th FEBS Congress, St. Petersburg, Russia 2013г.); на 5-ом конгрессе Европейских Микробиологов (The 5th Congress of European Microbiologists (FEMS) Leipzig, Germany 2013r.); na 5-om международном конгрессе по микробному человека (The 5th IHMC, Luxembourg, 2015г.); на V Международной конференции ФизгехБио по фармацевтике, биотехнологии и медицинскому приборостроению (г.Долгопрудный, 2015г.). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре отдела генетических основ биотехнологий ИОГен РАН 14 мая 2015г.

Публикации

Автором опубликованы 14 печатных работ, в том числе 6 статей по теме диссертационной работы в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки; в материалах международных конференций опубликовано 7 тезисов; получен один патент на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложении. Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц, 36 рисунков, 5 приложений. Список цитируемых литературных источников включает 177 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В разделе «Обзор литературы» изложены литературные данные о бактериях рода Lactobacillus', общей характеристике и классификации ТА систем; разнообразии ТА систем II типа; механизме действия и биомишенях токсинов ТА систем; функциях ТА систем; стратегии использования ТА систем.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и условия культнвирования

Штаммы бактерий рода Lactobacillus были выделены из фекалий, слюны и содержимого влагалища людей - жителей центральной области РФ - в медицинской академии г.Тверь. Штаммы Esherichia coli, используемые в данной работе: TG1, DH5«, BL21. Штамм Bacillus subtilis DB 104 использовался для получения в хромосоме конструкций с геном-репортером ß-галактозидазы и клонированными промоторами. В экспериментах по клонированию фрагментов ДНК и экспрессии генов использовали векторы рЕТ-32а, pACYCDuet-1 с IPTG-индуцируемым промотором. Для клонирования промоторов использовали плазмиду pMG16. Для культивирования лактобацилл использовалась среда MRS, Е. coli и В. subtilis - среда Лурия - Бертани (LB).

Работа с ДНК

Хромосомную ДНК выделяли из клеток лактобацилл с помощью набора DNeasy blood and tissue kit (Qiagen). Плазмидную ДНК из клеток Е. coli выделяли с помощью набора GeneJET™. Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, США). Электрофорез ДНК проводили в геле 1-1,5% агарозы в трис-боратном буфере. Фрагменты ДНК элюировалн из агарозы с помощью набора GeneJET™ (Thermo Scientific, США). Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили в НИИ ФХМ (г. Москва).

Конструирование праймеров и проведение ПЦР

Праймеры для обнаружения ТА систем сконструированы с помощью программы NCBI/Primer-BLAST и НИ аннотированных штаммов L. rhanmosus, L.hclveticus и L. casei. При необходимости к 5'-концам праймеров добавляли сайты узнавания эндоиуклеаз рестрикции. ПЦР проводили со смесью

высокоточных ДНК-полнмераз из набора Tersus PCR kit (Eurogen, Россия). При скрининге гибридных колоний использовали Taq-полимеразу и набор «PCR core kit» фирмы «Дпалат ЛТД», Россия.

Клонирование ТА генов

Рестрикцию и лигироваиие проводили с учетом рекомендаций фирм-изготовителей ферментов (Thermo Scientific, США; Promega). Полученной лигазной смесыо кальциевым методом трансформировали штамм Е. coli DH5a.

Создание 1ас&-транскрипщ1оннмх конструкций (fusions) и определение функционирования промоторов по активности ß-галактозидазы в клетках

В. suhtiUs

Предполагаемые промоторные области синтезировали в реакции ПЦР на матрице хромосомной ДНК штамма L. rhanmosus 24дст и клонировали в клетках E.coli TGI последовательно на плазмидах рЕТ32а и pMG16. Плазмиды с нужной вставкой линеализировали и переносили трансформацией в клетки В. subtilis DB 104. Отбирали Amy"SpR клоны со встроенными в хромосому плазмидамн и определяли у них активность ß-галактозидазы по формуле Миллера.

Определение активности ТА систем в клетках Е. coli

Активность белков токсинов в клетках Е. coli BL21 (DE3) определяли по характеру роста культур на твердой и в жидкой средах в присутствии индуктора 1PTG (0,5 шМ) и без него. В первом случае культуры клеток Е. coli, содержащие гибридные плазмиды с клонированными генами токсинов, высевали или раскапывали в разведениях на чашки LB-arapa с 1PTG или без; рост культур фиксировали через 18 часов при 37°С. Во втором случае дневные культуры, выращенные до 00(11ю=0,2, были разделены на две части. Одна часть продолжала расти при тех же условиях, а ко второй части добавляли IPTG. За ростом культур следили, измеряя OD(,oo- Для определения активности антитоксинов совмещали в клетках Е. coli BL21 (DE3) ген токсина, клонированный на плазмиде pACYCDuet-1, и соответствующий ему ген антитоксина на плазмиде рЕТ32а, далее определяли характер роста штамма в присутствии IPTG и без него.

Выделение РНК

РНК получали из стационарных культур (18 часов) и культур логарифмической стадии роста (8 часов) набором RNeasy Mini Kit («Qiagen») в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Концентрацию и качество РНК определяли на биоанализаторе Bioanalyzer 2100 («Agilent»). Для получения кДНК по матрице мРНК проводили реакцию обратной транскрипции с ферментом SuperScriptm (Invitrogen, Life technologies, США).

Количественная ПНР в режиме реального времен»

Для ПЦР-РВ использовали ДНК-полимеразу TaqF (Amplisens, Москва) и прибор Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies, США). Полученные данные анализировали с использованием контрольных генов и относительного количественного ДДО-метода. С учетом вариабельности контрольных генов значимыми считали изменения экспрессии в 2.0 и более раз.

Удлинение нраймера (Primer extention)

Матрицей служила ДНК штаммов L. rhamnosus 24дст, В51 и 50зв. Используя флюоресцентно меченный (IRD800) праймер, проводили синтез РНК; затем - синтез кДНК и гидролиз РНК 1М NaOH с последующей нейтрализацией 1М HEPES. Рсференсный ПЦР-фрагмент был секвеннрован по Сенгеру с помощью того же немеченного нраймера.

Определение точки начала транскрипции при помощи специфической амплификации коиневых фрагментов кДНК

Опыт проводили по протоколу к набору FirstChoice® RLM-RACE Kit (Ambion, Life Technologies, США).

Киоинформатическии анализ

Поиск и сравнение систем ТА суперсемейства RelBE в секвенированных геномах лактобацилл (имеющих статус «complete») производили с помощью нуклеотидных/аминокислотных последовательностей генов/белков, доступных в GenBank, NCBI. Выравнивание и анализ данных производили при помощи: BLASTn, BLASTp и ClustalX версия 2.0. Алгоритм поиска систем ТА в геномах:

1 вариант: поиск в секвенированных геномах систем ТА, гомологичных уже известным —> проверка найденных генов/белков с помощью программы InterPro;

2 вариант: предсказание открытых рамок считывания в исследуемых геномах (программа Genemarks) —► предсказание генов, принадлежащих системам ТА —► проверка найденных генов с помощью InterPro.

Если гомологичные последовательности и предсказанные гены перекрывались более чем на 80%, то данный ген считали возможным кандидатом на роль токсина/антитоксина.

Поиск новых систем ТА в геномах L. helveticus проводился при помощи разработанного алгоритма: он ищет в геноме два гена, расположенные на заданном расстоянии друг от друга (не более 70 нуклеотидов между генами, перекрывание - не более 30 нуклеотидов); размер первого гена меньше второго; весь оперой - не более 800 пар нуклеотидов.

На основе выровненных последовательностей генов ТА систем между собой было построено филогенетическое дерево с помощью программы MEGA 5.2, используя алгоритм «ближайших соседей».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Видовая идентификация штаммов лактобацилл

Первым этапом работы было формирование и характеристика коллекции штаммов лактобацилл. Совместно с Д.Х. Кясовой была проведена идентификация штаммов молекулярно-генетическим методом по НП гена 16S рибосомальной РНК.

Однозначно удалось идентифицировать родовую принадлежность всех штаммов, а также видовую принадлежность штаммов видов L. rhamnosus, L.brevis, L. salivarius и L. mucosa. Штаммы групп L. helveticus - L. acidophilus; L.plantarum - L. paraplantarum - L. pentosus; L. casei - L. paracasei, L. johnsonii — L. gasseri не могли быть однозначно разделены: НП исследуемого фрагмента 16S РНК у данных групп штаммов имели 99-100% идентичности.

Для разделения штаммов внутри группы L. helveticus - L. acidophilus мы использовали метод видовой идентификации лактобацилл, разработанный в лаборатории, по определению НП межгенного района, предшествующего оперону F0F1 АТФ-синтаз. Для разделения штаммов группы L. plantarum -L.paraplantarum - L.pentosas мы использовали ПЦР с праймерами, специфичными к гесА гену. В двух случаях - для близкородственных штаммов групп L. casei — L. paracasei и L. johnsonii - L. gasseri точная видовая принадлежность штаммов не былаустановлена. Определенная нами видовая принадлежность штаммов не всегда соответствовала установленной ранее. Это имеет особенно важное значение для производственных штаммов (таблица 1).

Таблица 1. Производственные штаммы лактобацилл, для которых была изменена видовая принадлежность.

№ (■/■• Штамм Родовая и пндо пан принадлежность

(по паспортным данным) (по данным молекулярно-rciici нчсскою анализа)

1. 90-ТС-4 L. jermentum L. plantarum

2. | КИМ 101 L. dclbrueckii L. plantarum

3. ЕгЗ 15/402 L. acidophilus L. helveticus

4. 100 um L. acidophilus L. helveticus

5. NK-1 L. acidophilus L. helveticus

6. NN1E L. acidophilus L. helveticus

7. гКИМ 23 л 1 L. brevis L. casei/paracasei

8. гЬСИМ 577 L. casei L. casei/paracasei

9. К3Ш24 L. acidophihis L. casei

10. 421-2 L. plantarum L. ramnosus

11. гКММ 526 L. delbrucckii L. fermentum

В коллекции из 62 штаммов лактобацилл было идентифицировано 9 видов лактобацилл: L. plantarum (16 штаммов), L. rhamnosus (16 штаммов), L.fermentum (10 штаммов), L. casei/paracasei (8 штаммов), L. helveticus (4 штамма), L. brevis (3 штамма), L. salivarius (3 штамма), L. mucosa (1 штамм), L. johnsonii/gasseri (1 штамм).

Бноинформатический поиск и структура модулей ТА систем

Вторым этапом работы был поиск ТА систем в геномах rex видов бактерий, которые наиболее часто встречаются в микробиоте здоровых люден центральной области России: L.casci, L. fcrmcntum, L. plantarum, L. rhamnosus и L. helveticus.

В ходе биоинформатического анализа было идентифицировано три различные ТА системы в штаммах L.rhamnosus (RelBE3/.w„ YefM-YoeB/.,/, и один токсин relEl;,/, соло); одна ТА система в штамме L. casei (RelBE 1 /„) и пять ТА систем в штаммах L. helveticus (RelBEl^v, RelE2/./„. - соло, ЯеШЕЗш, RelBB4i/„., RelBE5ifcv). В штаммах L. fermentum и L. plantarum ТА систем RelBE типа обнаружено не было. Во всех описанных ТА системах антитоксин принадлежал RelB суперссмейству, а токсин - к суперсемейству RelE (за исключением системы RelBE5i/n., где оба гена аннотируются как антитоксины, и RclBE5/j„).

Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE

С помощью ПЦР н последующего секвенирования мы определили наличие и полиморфизм идентифицированных ТА систем в 16 штаммах L. rhamnosus, в 8 штаммах L.casei и в 4 штаммах L. helveticus из охарактеризованной коллекции. Был также исследован полиморфизм ТА генов у полностью секвенированных на 2011 год штаммов, представленных в GenBank. Критерием геномного полиморфизма являлось наличие пли отсутствие генов в конкретных геномах, критерием генного полиморфизма - изменения в нуклеотидной последовательности генов.

Все девять идентифицированных ТА систем были обнаружены в геномах российских штаммов.

Геи токсина relЕЬ.м имеется у всех штаммов L. rhamnosus — как из GenBank, так и из коллекции. Он представлен соло, т.е. без гена антитоксина. Для трех штаммов из коллекции при разделении продуктов ПЦР в электрофорезе были получены фрагменты, превышавшие по молекулярном массе искомые фрагменты ДНК с ТА локусами (рисунок 1). При анализе таких фрагментов ДНК было обнаружено, что они содержали внутри гена ге/ЕЦ,/, IS-элемент группы IS3. 18 штаммов, не содержащих IS-элемепта, имеют одинаковые по величине гены и белки и отличаются друг от друга заменами пуклеотпдов в гене, 3 штамма отличаются от других заменами аминокислот в белке.

Система УеШЛ'оеЕк,/, обнаружена у части штаммов из ОепВапк и лабораторной коллекции, всего в 12 штаммах. Система отличается высоким консерватизмом - из 12 штаммов у 11 гены токсина и антитоксина идентичны; у одного штамма есть одна нуклеотндная замена в гене токсина, приводящая к аминокислотной замене.

1 2 3 4 5 6 ? 8 9 10 11 12 13 14 15 16

— амо ^—1000 500

__ -300

Рисунок 1 - Разделение в электрофорезе продуктов ПЦР е праймерамн для гена ге1Е\ш, п ДИК штаммов ¿. г/штпохиз в качестве матрицы:

1 - 421-2; 2 - 7дет; 3 - 24дет; 4 - К32; 5 - 38к; 6 - 50зв; 7 - 72зв; 8 - 40ет; 9 - 80ет;

10 — 2гн; 11-22гп; 12 — 51 гп; 13-45д; 14-26ск; 15-61ск; 16-маркер мол.веса.

Наличие полноценной системы Яе1ВЗ-ке1ЕЗ^,А можно предположить только у двух из 8-ми секвенированных штаммов гИатпозш из ОепВапк (110011 и АТСС21052) и 9 лабораторных штаммов, всего у 11 штаммов. У остальных штаммов данная ТА система также есть, однако в обоих генах есть множественные отличия в НП по сравнению со штаммами Ш)011 и АТСС210520 (замены нуклеотидов, сдвиги рамки считывания, делеции). Распределение ТА систем в штаммах гИаптоБия представлено в таблице 2. Таблица 2. Распределение генов ТА систем в штаммах Ь. г/киппохш;.

Л"» Штаммы Гены Гены

группы 1„г1ш1пги}\и*, токсинов аигнтокеннон

1 СС, ге1Е1

421-1; 26ск:61ск геШ

2 гс1Е1

24дсг ге/ЕЗ гсПЗЗ

уое В уе/М

3 АТСС 21052; Н0011; ге/Е1

72зв; 22гн; К32; 38к; 45д геГЕЗ гс-тз

4 1X705, АТСС8530, САвЬ; гс!Е1

40ст;80сг; 2гн;51гн ге/ЕЗ геШЗ

уоеВ уе]М

5 ПЧ001; ге/Е1

7дст; 50зв геШЗ

,1'оеВ ус)М

Жирным шрифтом выделены штаммы из вепВапк

ТА система RelBEli.es имеется у всех штаммов сазе! как из СепВапк (4 штамма) так и из лабораторной коллекции (8 штаммов). У 8 штаммов из 12 гены токсина и антитоксина идентичны, у трех штаммов в гене токсина имеются замены нуклеотидов, приводящие к аминокислотным заменам в белке. У штамма К3Ш24 есть нуклеотндные замены, приводящие к АК заменам в обоих генах ТА системы.

У Ь. ИсЬейст все идентифицированные ТА системы присутствовали во всех 4-х исследованных штаммах из лабораторной коллекции и 4-х из ОепВапк. Гены/белки каждой из ТА систем у разных штаммов отличались на 1-3 нуклеотида/аминокислоты; гены антитоксина были более консервативны, чем гены токсинов. Число аллелей ТА систем составляло от 2 до 6. Распределение ТА систем в штаммах Ь. НеЬейст представлено в таблице 3.

Таблица 3. Распределение генов ТА систем в штаммах Ь. ИеЬеНсш.

№ группы Штамм Гены токсинов Гены антитоксинов

1 ОРС 4571 ге/Е/ ге1Е2 ге1Е5 ге!В / ге/ВЗ геШ-1 ге/В5

2 ге!Е1 ге1В1

НЮ, МТСС5463, ЮОазЬ, NKl.NNIE.Er315/402 геГЕ2 ге/ЕЗ ге1Е5 геГВЗ геШ-1. геШ-2 ге!В5

3 геШ1 ге!Е2 геГВ1

Ш)052 ге/ЕЗ ге/Е5 геГВЗ геГВ4-2 ге/В5

Жирным шрифтом выделены штаммы из СепВапк.

Ген токсина ге1¥Лип- представлен соло, т.е. без гена антитоксина. В геномах штаммов Ь. гИатпоьш также были обнаружены единичные гены токсина геГЕУы,- Возможно, данные токсины имеют свои специфические антитоксины, однако они расположены в другом месте хромосомы. Возможно, что и одиночные гены токсинов могут участвовать, наряду с полноценными ТА системами, в регуляции клеточных процессов.

Обычно ТА системы состоят из гена токсина и антитоксина, которые расположены рядом и образуют оперон. Система КеШВ4//„, необычна тем, что состоит из двух генов, взаимное расположение и величина которых соответствуют таковым ТА систем, однако оба белка аннотируются как антитоксины. Возможно, один из белков этой системы является токсином с новым, еще не описанным, механизмом действия. При поиске новых ТА систем в штаммах Ь. ИеЬеНст мы обнаружили похожую по составу генов систему, для которой была показана токсическая активность одного из белков в клетках Е.соИ (см. следующий раздел).

Система ЛеШЕб/./.г необычна, так как она состоит из гена антитоксина, который относится к семейству Яе1В. и расположенного рядом предполагаемого гена токсина, величина которого больше обычной и составляет 882 пн.

Все идентифицированные нами ТА системы различны. Гены токсинов и антитоксинов одной ТА системы отличаются единичными заменами нуклеотидов и имеют более 99% идентичности (кроме Яе1ВЕЗы„ где наблюдаются многочисленные делецин и система «разваливается»). Для разных ТА систем идентичность аминокислотных последовательностей белков составляет менее 43%.

Белки токсинов и антитоксинов исследованных нами лактобацилл сходны с таковыми других лактобацилл и грам-положительных бактерий и, в меньшей степени, с белками Е. coli и других грам-отрицательных микроорганизмов. Однако некоторые белки (RelB3/.,/„ RelE3ir/„ RelBl/./„., RelB2/./n) свойственны только определенному виду лактобацилл-/.. rhamnosus пли L. helveticus.

Штаммы лактобацилл демонстрируют полиморфизм ТА систем, как геномный, так и генный. Генный полиморфизм штаммов может приводить к аминокислотным заменам и, в отдельных случаях, к потере активности белков (как у гена токсина уосВы, из штамма L. rhamnosus 40st - см. следующий раздел). Единичные нуклеотидные замены, возможно, могут приводить и к изменению регуляции активности генов и белков, влияя на эффективность транскрипции и трансляции. Геномный полиморфизм характеризуется тем, что штаммы имеют свой специфический набор генов токсинов и антитоксинов, что позволяет использовать данный полиморфизм ТА систем для характеристики отдельных штаммов. Нами была разработана система праймеров для видовой и штаммовой идентификации лактобацилл на основе ТА систем и получен патент на данное изобретение (патент № 2526576).

Изучение функционировании ТА систем лактобацилл в клетках E.coli

Чтобы выяснить, проявляют ли продукты идентифицированных генов токсинов из штаммов L. rhamnosus, L. casei и L. helveticus активность именно как токсины, мы определили влияние экспрессии данных генов на рост клеток на стандартной модели Е. coli.

Для каждой из трех ТА систем L. rhamnosus был выбран наиболее часто встречающийся вариант гена токсина. Для штаммов Е. coli BL21(DE3), содержащих плазмиды с клонированными генами токсинов уоеВи-и и ге/ЕЗм, эффективность роста на чашках с IPTG была значительно ниже, чем на чашке без индуктора (рисунок 2А). Для штамма Е. coli BL21(DE3) с клонированным геном reIE 1 Lih эффективность роста на чашках с IPTG была незначительно хуже, чем па чашках без индуктора (рисунок 2А), однако величина колоний на чашках с IPTG была значительно меньше (рисунок 2Б). Вероятно, действие токсина RelElirA проявляется таким необычным образом.

Белок YoeB из штамма L. rhamnosus 40ст, имеет одну АК замену, экспрессия данного белка не влияла на рост клеток E.coli по сравнению с

аналогичными белками из других штаммов L. rhamnosus (рисунок 2А). Вероятно, белок YoeBявляется активным токсином, а мутация подавляет активность белка.

»TG _ .u>TG fIPIÜ

А t I : з * s

■"& © 0ч© ЯГ -Ч

< е © о 9 е

^ О а с- © «

I«e0q# • •

< .Г- с " »

5 fei. -Шшь ы.

Рисунок 2 - Влияние экспрессии клонированных генов токсинов L. rhamnosus на рост штамма Е. coli BL21(DE3) на твердой среда,содержащей плазмиды: А: 1 - контроль р32а; 2 - p32voeB/r/,_24; 3 - р321'оеВы._40; 4 - p32re/F. 1/.,й_2; 5 -

p32re/E3tw,_45."

Ii: Рассев на твердой среде культуры, содержащей плазмиду р32ле/ЕI iwt_2. Разведение 10"'. Введение в клетки Е. coli, несущие плазмиду с клонированным геном токсина >'оеВы,_24, илазмиды p32ve/MiW/_24 с геном антитоксина yefiAuh делало характер роста штамма неизменным в присутствии IPTG и без него (рисунок 3). Следовательно, антитоксин YefM/.w,.v подавляет активность токсина YoeB/.,«•* в клетках E.coli, т.е., также как и токсин, проявляет функциональную активность.

Время, часы

Рисунок 3 - Характер роста штаммов Е. coli BL21(DE3), содержащих плазмиды с клонированными генами токсина уоеВ ¿,«4 и антитоксинаyefiAiM*. в жидкой среде LB. К части культур в указанный на рисунке момент времени был добавлен IPTG.

В штаммах L. helveticus были клонированы два варианта гена ге/Е !/./„. (pACre/E 1£;1V_NN, pACn?/El/j,,. NK), отличающиеся тремя нуклеотидными заменами; два варианта гена re/E2u,v (pACre/E2^/,v_NN, pAC/-<?/E2/j„._NK), отличающиеся двумя нуклеотидными заменами; ген геГЕЗш (р АСг<г/ЕЗ/j„,_NN); ген relE5thv (pAC/-e/E5£/,„_NN). На рисунке 4 показано влияние экспрессии одного варианта клонированных генов для каждой ТА системы на рост клеток E.coli на твердой среде. Нуклеотидные и аминокислотные замены в генах relElchv, relE2u,v и ге/ЕЗд/,,, и соответствующих им белках не приводили к изменению экспрессии гена токсина.

-IPTG 2 3 4 5

+IPTG 2 3 4 5

б/р

-1

-2

-3

-4

-5

Рисунок 4 - Влияние экспрессии клонированных генов токсинов L. helveticus на рост па твердой среде штамма Е. coli BL21(D3), содержащего плазмиды:

] - контроль, вектор pACYCDuet-1; 2 — pACre/Elur_NN; 3 - pAOe/E2o,v_NN; 4 - рАСге/ЕЗи,. NN; 5 - pACre/E5iM_NN.

Токсины ReIE2;./,v и RelE5i/n. не влияют на рост клеток Е. coli, как в присутствии IPTG, так и без индуктора. Ei то же время токсины RelE3w,v и RelEly./,,. при добавлении индуктора дают значительное уменьшение скорости роста культуры, что свидетельствует об активности соответствующих белков как токсинов.

Далее, мы выяснили, являются ли активными белки антитоксинов у ТА систем с функционально активными генами токсинов ге1Е1цп. и геГЕЪьь-Введение в клетки Е. coli, несущие плазмиду с клонированным геном токсина relE3u,,; плазмиды с геном антитоксина ге1ВЗш• делало характер роста штамма неизменным в присутствии IPTG и без него. Аналогичные результаты были получены для системы RelBEli/,,,. Следовательно, антитоксины RelB 1 u„ и RclB3/./,v подавляют активность соответствующих токсинов в клетках Е. coli, т.е., также как и токсины, проявляют функциональную активность. Для штамма Е.соП BL21(DE3), содержащего плазмиду с геном токсина L. casei (р32ге/ЕЦ„), эффективность роста на чашках с IP TG и без индуктора была одинаковой.

Таким образом, было показано, что белки 5-ти токсинов при экспрессии подавляют рост клеток Е. coli, т.е. проявляют в них функциональную активность. Совмещение в клетках Е. coli генов 4-х из этих токсинов с генами соответствующих антитоксинов устраняло токсический эффект. Следовательно, для данных ТА систем лактобацилл показана функциональная активность обоих белков.

Для штаммов Е. coli BL2KDE3), содержащих плазмиды с токсинами relElihv, relE5ihn и геГЕЛи* эффективность роста на чашках с IPTG и на чашках без индуктора не отличалась, однако это не значит, что данные белки не являются токсинами. Возможно, один из собственных антитоксинов, синтезируемых клетками Е. coli BL21(D3), способен подавлять активность токсинов лактобацилл.

Изучение регуляции экспрессии ТА системы УеЯУ1-УоеВ/.г/,

Для более детальных исследований нами была выбрана ТА система YefM-YoeB/,/,. Задачей данного раздела работы было изучение структурной организации оперона YefM-YoeB¿,/, и его транскрипции.

У всех штаммов, содержащих ТА систему YefM-YoeB¿,/,. как из лабораторной коллекции, так и из GenBank, НП проксимального (410 ни) и дистального (213 нп) районов оперона были идентичны. Мы подробно исследовали область, предшествующую оперону, и обнаружили, что она содержит так называемый ВОХ-элемент - последовательность длинной около 300 пн с GC-составом 54% (GC-состав геномов L. rhctmnosas в пределах 43,343,6%). Данный участок присутствует в некодирующих районах всех секвенированных геномов L. rhamnosus и представлен 12-13 неидентичными копиями на геном. В дистальной области оперона мы идентифицировали новую ORF, ORF27, расположенную за стоп-кодоиом гена токсина на другой, чем ТА оперон, цепи ДНК и имеющую размер 85 пн.

Предпринятые несколько раз попытки клонировать оперон yefíA-yoéBuh целиком были безуспешными. Мы предположили, что внутри данной системы имеется регуляторный элемент — возможно промотор, который стоит перед геном токсина, и попытались экспериментально подтвердить наше предположение. Для этого провели стандартный эксперимент по поиску промоторов по методу удлинения праймера у штаммов L. rhamnosus 24дст. B5I и 50зв. Мы обнаружили два участка инициации транскрипции перед геном токсина и в пределах последовательности гена антитоксина, каждый участок содержит 2 сайта инициации транскрипции (рисунок 5). Таким методом нам удалось найти два предполагаемых промотора (Р1/2 и Рзм), которые находятся внутри ТА системы.

tssT4 3 ы „ tssT2 1 ы tr

JN-i 31 Л - * г sí

\ sí ШЗиЙйБ О"! Ui

I s I s I s АС GT I s I s I s ACGT

24ДСТ 50ЭВ B51 50

24дсг 50зв B51 50

Рисунок 5 - Определение точек инициации транскрипции методом удлинения праймера для штаммов L. rhamnosus 24дст, В51 и 5Отв. s - стационарная фаза роста культур; Жирным шрифтом выделены нуклеотиды, е которых начинается транскрипция.

При анализе района, предшествующего оперону >'е/М-шеВ/,м, нам удалось обнаружить, исходя из литературных данных о строении ТА системы и используя поиск промоторов на сайте ВРЯОМ, кроме ВОХ-элемента, область, которая соответствует промотору. Наличие такого промотора не удалось показать методом удлинения праймера. Поэтому для поиска основного промотора (Рдт) перед опероном, мы использовали метод определения дефицитных мРНК. Нам удалось идентифицировать промотор оперона; кроме того, НП праймера, которая использовалась для выявления основного промотора (Рдт), оказалась еще и комплементарной к 3-концу гена уоеВщ,. Таким способом нам удалось найти еще один предполагаемый промот ор Рх, который находится в дистальной части оперона и инициирует транскрипцию в противоположном, по сравнению с 3-мя другими промоторами, направлении. Схематическое изображение исследуемой системы представлено на рисунке 6.

Для определения активности предполагаемых промоторов и района BOX встраивали плазмиды с клонированным районом предполагаемого промотора и геном-репортером [3-галактозидазы в хромосому грам-положителы-юй бактерии В. subtilis DB104. Определение экспрессии с промоторов показало, что активен только основной промотор, Рдт (рисунок 7). При этом ВОХ-элемент никак не влиял на активность данного промотора.

В локусе yefM-yoeBuh L. rhamnosns мы идентифицировали четыре сайта инициации транскрипции (tss); в трех из них транскрипция начиналась с двух близлежащих нуклеотидов. Один из сайтов располагался перед геном антитоксина, два других - внутри гена антитоксина, в середине его (tss 14) и конце (tss 4/3). РНК, синтезируемые с этих tss, соответствовали С-концевой части гена антитоксина и гену токсина. У ТА систем II типа белок антитоксина обычно имеет два активных домена: С-концевой взаимодействует с белком токсина и нейтрализует его активность, а N-концевой представлен ДНК-связывающим районом, он взаимодействуете промотором оперона и регулирует его транскрипцию [Smith J.A. et al., 2004]. Возможно, гипотетитческий пептид AYoeB, для которого РНК транскрибируется с tss 4/3, имеет только одну функцию - подавлять активность токсина, но не регулировать транскрипцию оперона.

Сайты связывания для а7о субъединицей РНК полимеразы и для рибосомы мы смогли идентифицировать только для tss, расположенного перед геном

BOX 'оеВ Т.

Pat РЗ/4 PI/2 РХ

Рисунок 6- Схема строения оперона yefM-yoeHut,.

антитоксина. Именно соответствующий участок ДНК показал активность как промотор при клонировании с геном-репортером. Для двух других участков, tss 1/2 и tss 4/3, а также для tssX, показать промоторную активность не удалось. Возможно, эти сайты узнаются сигма-факторами, специфичными для лактобацилл или активными в определенных стрессовых условиях. Перед этими

сайтами мы обнаружили последовательность TGG........TGG, сходную с

промотором, узнаваемым субъединицей <354 РНК полимеразы [Stevens M.J. et al., 2010]. Гипотетические РНК, которые образуются с этих промоторов, могут транслироваться по так называемому leaderless механизму; они могут быть и регуляторными нетранслируемыми РНК. Гипотетический транскрипт, получаемый с tssX, сходен по расположению с антитоксином I типа, характерным для В. subtilis (ТА системы TxpA/RatA, BsrG/SR4, YonT/AS-YonT). Эти РНК антитоксины взаимодействуют с 3' концом мРНК токсина и образуют двухцепочечную РНК, которая разрушается нуклеазами (Brantl S. et al., 2012).

m О

ч-

л.

oV

o"v

I Л часа

I6 4dCOB

Рисунок 7 - Измерение активности промоторов по уровню синтеза р-галактозидазы Р| — отрицательный контроль; Рк, - положительный контроль 2,4, 6 часов - инкубация с ОИФГ

Мы определили также экспрессию оперона уе/М-уоеВы, в различных стрессовых условиях. Для эксперимента были выбраны три штамма гЬатпоких 24дст, 50зв и В51, имеющие идентичную НП оперона. Была выполнена серия опытов количественной ПЦР в реальном времени с использованием прямого праймера, расположенного в гене антитоксина уе/Мы„ и обратного праймера, расположенного в гене токсина уоеВ/.г/,. Для всех 4-х исследованных штаммов были получены РНК, что говорит о транскрипции обоих генов в составе одной РНК, т.е. подтверждает оперонное строение ТА системы. Были выбраны следующие стрессовые условия для экспоненциально растущей культуры: 48°С; 0,8М ЫаС1; 48°С + 0,8М ЫаС1; рН 4.0, а также определена экспрессия генов в экспоненциальной культуре относительно экспрессии в стационарной культуре. Результаты представлены на рисунке 8.

е 24дст ЬО«

I Г I .

Рисунок- 8 Экспрессия оперона уе/М-унеШии в различных стрессовых условиях. Определялась экспрессия оперона в экспоненциальной фазе роста относительно экспрессии в стационарной фазе роста и при разных стрессовых условиях. В качестве контроля использован

ген ¡1е5.

Увеличение экспрессии ТА системы происходило для всех 3-х штаммов при 48°С, хотя и в разной степени. При кислотном и солевом стрессе экспрессия ТА системы не менялась. При сочетании обоих факторов стресса (температура и ЫаСЛ), были получены промежуточные значения.

Использованные в работе штаммы гЬатпо.чия имели идентичную НП как оперона, так и окружающих его участков ДНК. Однако изменение активности транскрипции у разных штаммов при одних и тех же условиях были различны. Вероятно, в регуляции активности ТА системы участвуют различные белки клетки.

Поиск и характеристика новых ТА сист ем у /_. \ielveticus_

В последние 10 лет происходит интенсивное изучение структуры, функций и распространения хромосомных ТА систем бактерий. Обнаруживаются новые типы и семейства ТА систем. Поиск новых ТА систем у лактобацилл обусловлен тем, что, с одной стороны, это важные элементы регуляторной системы клетки, а с другой - тем, что они могут быть использованы для штаммовой идентификации, в том числе при метагеномном анализе. Мы предприняли поиск новых ТА систем у Ь. Ие!уеИсш.

На основе литературных данных о строение ТА систем II типа с помощью написанного нами скрипта мы попытались найти новые ТА системы в геномах секвенированных и аннотированных штаммов Ь. ИеИ'еНсиз из ОепВапк. Таким образом, для штамма ИвЬеНсия ОРС4571 было найдено двадцать семь, для штаммов Ь. Ие1\еЧст НЮ - тридцать пять и для Ь. ЪеЬ/ейсш 110052 - шестьдесят две предполагаемые пары генов, удовлетворяющие заданным параметрам. Далее были удалены гены-кандидаты, для которых функции соответствующих белков явно не соответствовали свойствам ТА систем (например, гены 305 или 505 рибосомальных субъединиц).

Таким образом, в 3-х аннотированных геномах L. helvcticus из GenBank выявлено in silico 27 пары генов, предположительно относящихся к генам ТА систем. В четырех штаммах L. helvcticus (ЮОаш, NKI, NNIE, ЕгЗ 17) из лабораторной коллекции были идентифицированы только 18 из этих гипотетических ТА систем. Определены НП генов предполагаемых токсинов для этих ТА систем. Показано, что штаммы обладают геномным и практически не обладают генным полиморфизмом по данным локусам. Из 18 клонированных на плазмиде рЕТ32а генов предполагаемых токсинов, только три проявляют активность в клетках E.coli BL21 (DE3) как токсины, подавляя рост бактериальных клеток. По результатам аннотации программы BLASTp, все три гипотетических токсина не имеют рибонуклеазной активности, свойственной подавляющему большинству токсинов II типа, и являются новыми типами токсинов. Для одной из этих грех предполагаемых ТА систем - TA12/_,v, - оба белка, и токсин, и антитоксин, были аннотированы как транскрипционные регуляторы; подобная активность свойственна антитоксинам.

Полученные данные свидетельствуют о том, что число и разнообразие ТА систем крайне велики и только малая их часть описана.

Системы ТА как биомаркерм для идентификации штаммов лактобацилл

Штаммы L. rhamnosus, L. helvcticus, и L. casei, изучаемые в работе, обладают различным набором ТА систем RelBE типа. Мы предположили, что полиморфизм ТА систем как на генном, так и на геномном уровне, можно использовать для характеристики видов и штаммов лактобацилл. Для этого необходимо было выявить все варианты наборов систем суперсемейства RelBE, характерные для всех видов бактерий рода Lactobacillus, доступных в международной базе данных GenBank, NCBI. Системы ТА изучались в геномах, для которых была доступна полногеномная последовательность, что соответствует статусу "complete". Поиск генов ТА систем осуществлялся по гомологии. За основу был взят набор систем ТА суперсемейства RelBE из охарактеризованных нами ранее штаммов L. rhamnosus, L. hclvcticus, L. casei. Для каждого гена была охарактеризована встречаемость как на видовом, гак и на штаммовом уровне.

После расширенной аннотации по генам суперсемейства RelBE в бактериях рода Lactobacillus была построена диаграмма (рисунок 9), на которой видно, что распределение генов токсинов и антитоксинов видо- и штаммоспецифично. Наиболее отдаленные виды не имеют пересекающихся генов Т и А. Штаммы, относящиеся к одному виду бактерий, имеют сходный, но не всегда идентичный набор генов Т и А.

Штаммы

ТА I

НШШШ Виды лактобацилл

L tet&nnofaXUQnCt ± CHSP3TUS

Рисунок 9 - Распределение генов ТА систем суперсемейства Яе1ВЕ в штаммах ЬасюЬасИЫ.ч.Красным цветом показано наличие гена, серым - его отсутствие.

еэм

TOi

toскал »ICC«»:

U70!

tso

LJitlveHcus

I flfHIHIIIHI L buchnen L.plantamm Lease)

1./егтепгг;г71

i.. buchnen L.planmum

L.casei

L.sahvarius

Ltohnsonli

L.rutert

L.rhamnosus

Мы полагаем, что данные гены можно использовать для идентификации видов и штаммов бактерий рода Lactobacillus. Предложенный метод видовой и штаммовой идентификации может быть использован как для характеристики отдельных штаммов, так и для характеристики сообщества микроорганизмов, например, в микробиоте человека.

ВЫВОДЫ

В аннотированных геномах L. rhamnosus, L. helveticus и L. casei из GenBank in silico идентифицированы 6 ТА систем суперсемейства RelBE, два гена токсина relE соло и одна система ReIBB, состоящая из 2-х генов антитоксинов.

Установлено, что штаммы лактобацилл обладают генным и геномным полиморфизмом по ТА системам суперсемейсва RelBE. Распределение ТА систем у лактобацилл видо- и штаммоспецифично и может быть использовано для видовой и штаммовой характеристики.

Для ТА систем YefM-YoeBLrh. RelBf;.3Lrh. RelElLhv, RelBE3uw показана активность как токсинов, так и антитоксинов в клетках Е. coli.

2.

4. Показана сложная структурная организация ТА системы YefM-YoeBt,/,: обнаружен участок BOX, предшествующий гену антитоксина и 4 предполагаемых промотора в опероне ус^Л-уоеВии-

5. Экспрессия ТА системы YefM-YoeB/,/, в штаммах L.rhamnosus зависит от стадии роста культуры и температуры. Эта зависимость проявляется по-разному в разных штаммов лактобацилл.

6. В 3-х геномах L.helveticus из GenBank in silico выявлено 27 пар генов, относящихся к генам новых гппотетитеских ТА систем II типа. 18 из них были обнаружены в штаммах L. helveticus из лабораторной коллекции. Три гена предполагаемых токсинов проявили активность в клетках Е. coli.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных журналах списка ВАК:

1. Ботина С.Г., Червинец Ю.В., Клнмниа К.М., Коробан Н.В., Червинец В.М., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов АЛО. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей // Клиническая лабораторная диагностика. -2010. -№11.-с.43-46.

2. Ботина С.Г., Климкна К.М., Коробан Н.В., Зинчепко В.В., Даниленко В.Н. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus II Генетика. - 2010. - Т. 46. - № 11. - С.1306-1313.

3. Ботина С.Г., Коробан Н.В., К.тимнна К.М., Глазова А.А., Захаревич П.В., Зииченко В.В., Даниленко В.Н. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей // Генетика-2010.-Т.46.- №12. - С.1589-1597.

4. Klimina К.М., Kjasova D.Ch., Poluektova E.U., Leuschner Y., Kriigel H., Saluz H.P., Danilenko V.N. Identification and characterization of Toxin-Antitoxin systems in strains of Lactobacillus rhamnosus, isolated from humans // Anaerobe.-2013,-№ p. 1-8.

5. Kriigel H„ Klimina K. , Mrotzek G„ Tretyakov A., Schofl G„ Saluz H.-P., Poluektova E.U., Danilenko V.N. Structure and regulation of gene expression of a toxin-antitoxin gene cluster yefMuh, уоеВц-и under various physiological conditions in human Lactobacillus rhamnosus isolates / J. Basic Microbiol. - 2015.-№54.-pl-10.

6. Yunes RA, Klimina KM, Emelyanov KV, Zakharevich NV, Poluektova EU, Danilenko VN. 2015. Draft genome sequences of Lactobacillus plantarum strain 90sk and Lactobacillus brevis strain 15f: focusing on neurotransmitter genes // Genome Announcement. - 2015 - 3(2):e00261-15.

Публикации в сборниках конференции

1.Danilenko V.N., Averina O.V., Alekseeva M.G., Klimina K.M., Poluektova E.U. The Toxin-Antitoxin System Gene Polymorphism As A Marker for Species and Strain Identification of the Probiotic Component of Human Microbiome // Abstracts of International Human Microbiome Congress, Paris -2012 - p. 19-21.

2. K.niMiina K.M., Кясова Д.Х., Полуэктова Е.У., Данилемко B.H. Генетические системы токсии-аититоксии как маркеры полиморфизма штаммов лактобацилл из микробпоты человека // Международная конференция «Проблемы нопуляционной и обшей генетики», 2012.

3. V.N. Danilenko, E.U.Poluektova, К.М. Klimina, D.H. Kjasova, J.V.Chervinetz, D.B. Malko, V.J.Makeev, F. Gusev, T.V.Tyajelova, D.A. Reshetov and E.I.Rogaev. Sequence and annotation of the chromosome of probiotic strain Lactobacillus rhamnosus 24 II Abstracts of International conference of postgenomic texnology for biomedicine, Novosibirsk. - 2012. - р.31.

4. Klimina K.M., Kyasova D.H. , Poluektova E.U. , Danilenko V.N. Genetic sistems of toxin-antitoxin as modules responsible for stress // The 38th FEBS Congress: St Petersburg, Russia. - 2013. - p. 228-229.

5. H. Kruegel, K. Klimina, D. Kjasova, E. Poluektova, G. Schofl, A. Tretyakov, H.-P. Saluz, V. Danilenko. Identification of ТА systems in Lactobacilli: structure and regulation of gene expression of a toxin-antitoxin gene cluster under various physiological conditions in Lactobacillus rhamnosus И Abstracts The 5th Congress of European Microbiologists. - 2013

6. Ksenia Klimina, Siarhei Hladyshau, Natalia Zakharevich, Artem Kasianov, Elena Poluektova, Vsevolod Makeev, Valery Danilenko. Type II toxin-antitoxin systems as a functional marker for identification of Bifidobacterium and Lactobacillus strains suitable for metagenomic studies // Abstracts, 5th International Human Microbiome Congress - 2015. - p.7.

7. Ksenia Klimina, Kirill Emelyanov, Natalia Zakharevich, Artem Kasianov, Elena Poluektova, Vsevolod Makeev, Valery Danilenko. The comparative genomic analysis of Lactobacillus rhamnosus strains, isolated from human gut, saliva and vagina. Abstracts, 5th International Human Microbiome Congress-2015. - p.69.

Патенты.

Алексеева М.Г., Клнмина K.IN1., Даниленко B.H. Способ идентификации лактобацилл // Патент РФ № 2526576. Приоритет изобретения 23.12.11

БЛАГОДАРНОСТИ

д.б.н. Ботиной Светлане Геннадиевне

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Лабораториия генетики микроорганизмов д.б.н. Даниленко Валерий Николаевич д.б.н. Полуэктова Елена Ульриховна Захаревич Наталья Владимировна

Студенты лаборатории генетики микроорганизмов Гладышев Сергей Александрович (МФТИ, кафедра биоинформатики) Емельянов Кирилл Викторович (МФТИ, кафедра биоинформатики) Алиев Владислав Олегович (МГУ, кафедра генетики)

Лаборатория системной биологии и вычислительной генетики д.б.н. Макеев Всеволод Юрьевич к.б.н. Касьянов Артем Сергеевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Лаборатория постгеномных исследований

к.б.н. Кудрявцева Анна Викторовна к.б.н. Снежкина Анастасия Владимировна

Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans-Knöll-Institute, Beutenbergstr, Jena, Germany

Hans Krügel Friedrich-Schiller-University Jena, Germany

Sabine Brantl Natalie Jahn

Подписано в печать 19.08.2015 г.

Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ № 17

Типография «Формат» ИНН 7713659744 Москва, Ярославское шоссе 26 к.6 (495) 230-75-70 www.ks-format.ru