Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ хлорофилл b-дефицитных мутантов Chlamydomonas reinhardtii

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ хлорофилл b-дефицитных мутантов Chlamydomonas reinhardtii"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи У.Д.К. 575.25 : 577.152

МИРНАЯ Ольга Николаевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ХЛОРОФИЛЛ ДЕФИЦИТНЫХ МУТАНТОВ СН1ЛМУООМО/УА5 КЕтНАЕИТП.

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

N

'Г1

Санкт-Петербург - 1992 / V'' \

и

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель -кандидат биологических наук, старший научный сотпрудник А.С.Чунаев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Б.В.Симаров доктор биологических наук Б.В.Громов

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова

Защита состоится ■■ М " «^У 41993. года в М часов на заседании специализированного совета Д 063-57.21 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук по специальности 03-00.15 - генетиха при Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, д.7/9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 41 ^ ^.1992 года.

/V

Учёный секретарь специализированного совета кандидат биологических наук:

Л.А.Мамон

иая

Обцая характеристика работа.

Актуальность проблемы.

Одноклеточная зеленая ВОДСрОСЛЬ СЫ. ЕщуйочюпАК roi.nJhnr.ltii широко используется как модель высших растений в исследованию, по генетике фотосинтеза. Изучение генетических коллекций смятуаопопа-; гв!Ыыаг<1111, полученных з результате прнглоЕэнгя оригинальных методов отбора мутантов, внесло существенный вклад в формирование современных представлений о структуре и функциях фотосинтетического пппчрата и иг. генетическом контроле ссьипл«*, 10005.

.Хлорофилл ь (ХЛЬ) - основной сэетособирвиций гтигмеьт фотосинтеза высших растений и зеленых водорослей стьогпьег, 10751. Генетическое изучение хлорофилл ь - дефицитных мутантов хламидомонады необходимо для выяснения механизмов биосинтеза хлорофилла ь и роли этого пигмента в формировании пигмент-белково-липидншг комплексов хлоропласта.

Одиночные хлорофилл ь - дефицитные мутанты были получены независимо в трех лабораториях и затем изучены биохимическими и биофизическим методами (Ладыгин и др. ,1979;»искл1 »I »1., ювз; саг-п!вг «ъ а1.,19ов). Генетический анализ одного из атиг мутантов (С-48) позволил установить Менделэвский характер наследования признака и рецессивность мутантиой аллели (Чукаев и др.,1981). К началу нашей работы вопросы о количестве и локализация генов, детерминирующих признак "хлорофилл ь - дефицитность" оставались нерешенными ввиду отсутствия способа качественной оценки гаутантного фенотипа и, как следствие, коллекции мутантов. Эти вопросы, о такта создание методических предпосылок для их решения стали предметом нашего исследования.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в получении и генетическом анализе ХЛЬ-дефицитных мутантов хламидомонады. В соответствии с целью были поставлены следущие задачи:

- разработка селективной системы для отбора ХЛЬ-дефицитклс мутантов

- соацгннэ коллекции ХЛЬ-дефицитных мутантов

- генетический анализ мутантов

Научная новизна.

Нами разработан аффективный метод отбора ХЛЬ-дефвцитных мутантов. Предложены качественный флуоресцентный метод на первом этапе отбора и использование светочувствительного мутанта по гену itsi-з в качестве селективной системы, повышающей чаототу выявления ХЛЪ-дефицитных мутантов на два порядка.

Получена коллекция ХЛЪ-дефицитных мутантов. Установлена аллельность 55 мутаций В гене Cbnl Cchlorophyll Ь *nd neoxanthin deficiency). Показано, что штамм pflioi несет мутантную аллель lorl-1, приводящую к блоку синтеза специфического ксантофилла водорослей - лороксантина. Мутантные аллели генов cbni и lori- рецессивны. Ген сьш картирован в первой хромосоме на расстоянии 40 сМ от центромеры. Сцепление гена lori со своей центромерой составило 12.4 сМ.

Провели изучение взаимодействия ядерных и хлоропластных генов, контролирующих биогенез фотосинтетического аппарата, проявление Мутинтная аллель хлоропластного гена c-u-i приводила к уменьшению соотношения ХЛа/ХЛЪ на фоне cbni~48 до 140-660 по сравнению с еегрегантами генотипа сЬпл -4а, c-<i-i +, у которых оно превышает 1000. Мутантная аллель cbni-*8 проявляла аллеле- и геноспецифичную супрессию признака светочувствительности.

Практическая значимость.

Разработка новых методов отбора мутантов хламидомонада, рассматриваемой в качестве модельного объекта растительной клетки, монет быть использовггла при планировании аналогичных работ на высших растениях. Флуоресцентные методы скрининга легко модифицировать для выделения форд с желательным изменением состава светособираших пигментов и высоким уровнем интенсивности фотосинтеза.

Качественный метод отбора ХЛь-дефицитных мутантов был использован при обучении студентов СПбУ на практических занятиях по генетике микроорганизмов.

Апробация работы.

Основные результаты диссертации были представлены на конференции "Экологическая генетика растений и животных", Кишинев, 1981; конференции "Проблемы и пути повышения устойчивости растений

- Б -

к шзлэзегу 2 гасгрбшльака усзгкгса срэда б сгягя с задачам« о-глзйдта", /Гбскптрад, 1081; козфзразцаг "Адзатшсгл и роког,;бвяогеназ ? к^луртах рпстбЕй", Кяягг>2, 19вЯ; 1-м био®азпчоском съезд», Мэгсгг:, 1932; сакпсзязт ЧЪлэкудярЕКэ ¡.»хйлтзяи рзпдзкацш:, я рэкоибшацая в вора я ура дсЗсть'лк радкацки у лпг^юг", г:^ V ^ездз ЯСГяС к:, К. ¡:.

Шоква, 1337; да 1-£ Вм>з. йлЕ^роицкр "лк-гуал^^о аусбго:.®. огпрвшнной альгологии", Чэрнасси, 1087; на мекд. конференции по

Г"Ч»ги*» ащъ^шл, ОМ» Но «»цц. ^СГ^^ТП^'

"Фотосинтез я фотобиотахнологля*, Цудани, ,

се'лшараг лаботаторня генетики г-ккроорганигнов ЕИНШ? СШУ.

Объем г структура работа.

Диссертация состоит из ввэдешя, обзора литературы, материалов а методов, результатов, обсузденяя, выводов и списка литературы. Работа излозкэна на 128 страницах мгншнописного текста, включая 14 таблац и 6 расунков. Список латератури содэртат 308 наименований.

Содаржпяэ робота.

Обзор литературы нклячает три раздела. В персом раздело дана сбз}вя характеристика структуры и функций ксмгдаксог; фэтосинтэтнчооксго аппарата, в состав которых входогг ХЛЬ. Во втором - пршзвдени результата исследований генетического контроля синтеза 7Л. В последнем - рассштрзэм конкретные примеры мутантов высших растений и зеленых водорослэй» частично или полностью утративших ХЧЬ я их првыдттоние для решения вопросов генетики фотосинтеза.

Материалы а метода.

В работе использованы штаммы зеленой водоросли смашу^опопвя reinbBrdt.ii из Петергофской генетической коллекции водорослей Бгологического ЯЯИ Санкт-Петербургского университета. Мутагенез для получения ХЛЬ-дефпдатннх мутантов проводали, облучая в течоы:,е 15 «инут УФ-светом (5 Бт/м2) суспензии гладок "даксгс" типр

137С+ и светочувствительного ?1утапта вза-гя с I - <-.! . На «утаатяой аллели 1».я1 -з хль-двфацитныэ мутанты отбирали гроди зветоустойчивых ревертантов. Состав сред и условия культивирования эшсаны в работе (Столбова ,1971). Отбор ХЛЬ-дефшштных мутантов проводили по уровню флуоресценции. Известно, что при комнатной

температуре уровень флуоресценции хлороштстов определяется главным образом флуоресценцией антенного ХЛ» ФСП. Энергию возбуждения «CII получает со светособирапцего ХЛа/ь-белкового комплекса, который содержат 80* всего ХЛь (Butler, J0875. в связи с 8тим отсутствие ХЛЬ снижает уровень флуоресценции клеток. Флуоресценцию ХЛь возбуждали широкой полосой фильтрованного света 469-640 нм. Свечение ХЛ в клетках наблюдали через светофильтр КС-2. Спектры поглощения водных, суспензий клеток записывали с помощью спектрофотометров СФ-10 и ОФ-18. Спектры поглощения пленок 5-суточных зигот регистрировали с помощью спектрофотометра СФ-14, микроспектрофотометров МУФ-5 (диаметр фотометрируемого участка препарата 5 мкм ) и sxs-оэ -opton- (ФРГ) (увеличение объекташа х16, зонд 16). Соотношение ХЛа/ХДь определяли флуоресцентным методом

(Bckardiun, Thorne, 10713 , при ТеСТИрОВЭНИИ признака РуКСОТрОфНОСТИ и

устойчивости к ингибиторам роста применяли стандартные метода селективных сред и отпечатков (Захаров.ЮТЗ)- Скрещивание штаммов проводили по методу Левина и Эберсольда íLevin», Еым-soide. ювоэ. Сцепление между генами рассчитывали по формуле: d^ - cfM * о, s гтз loo сt>»rktns, расстояние от гена до центромеры - по формуле :од - + dac - d^ (Инге-Вечтомов,1971). Диплоиды получали по методу Эберсольда сеъ»гко1<1, ювэ>. Статистическую обработку результатов проводили по программе kicrostat, v. з.г.

Результаты и обсуждение.

В ходе работы получена коллекция из 55 ХЛЪ-дафи;ц* .ных штаммов, 10 из них были подвергнуты более подробному изучению Для отбора мутантов использовали последовательно два метода, качественный флуоресцентный и спектрофотометрический. Основным критерием

Рис.1.Спектры поглощения штамма

"дикого" типа iЗ7с+ и полученных на его основе типичных Ш-му тентов:

1. J37C*

2. H&-I5

а. ®-18.

мутантного фенотипа считали отсутствие максимума характерного для ХЛЬ в спектрах поглощения водных суспензий клеток (рис.1). Правомерность использования этого критерия была подтверждена анализом соотношения ХЛ»/ХЛЬ у 15 мутантов и их свгрвгаытов.

После облучения УФ-свето'м штамма 137с+ выделили 65 колоний с шыим уровней флуоресценция. По спектрам поглощения среди них только В но содержали ХЛЬ (ряс.1.). Частота встречаемости мутантов баа ХЛЬ в опыте была 2.7хЮ~*. Из 3 полученных НГ-штанов у 7 соотношение ХЛа/ХЛь превышало 1000, у одного - составило 250-500 (табл.Г.К Рааличия в ооотнолении ХЛа/ХЛЬ у мутантов наследовались в потомстеэ.

Таблица Г.Соотнопэние ХЛа/ХЛЬ у штамма "дикого" типа иге* и полученных на его основе ХЛЬ-дефицитных мутантов.

Штамм Соотношение ХЛ»/ХЛЬ

1370 1.8 - 2.1

®-И •■ 1000

®-1Б > 1000

Ю-18 1000

Ш-38 . 1000

НФ-40 250 - 500

К5-43 :■ 1000

®-60 ' 1000

Ш-61 :• 1000

Штамм ззо-йл несет мутантную аллель 1151-3, проявлением которой является светочувствительность клеток. После облучения этого штамма УФ-светом выделили среди светоустойчивых ревертантов ь клонов с низким уровнем флуоресценции. Два из них - НФ-73 и НФ-75 -в спектрах поглощения не имели полосы, характерной для ХЛъ. Частота встречаемости мутантов без ХЛЬ в опыте составила 1.6x10"*. Таким образом, частота встречаемости ХЛь-дефицитных мутантов среди светоустойчивых ревертантов была на дв8 порядка выше, чем в случав птима "дикого" типа 1370.

Помимо ШМ<утантов, полученных нами, генетический анрлпз был проведен также с мутантом по гену еьп1-*в (Чунаев и др.,1981) и штазгмами - рдЮ1, рднз (Жсы.1 аь и1.,1ввз>. Мутанты по гену сЬп!~ «8, рдЮ1 и рднз имеют светло-зеленую окраску колоний и слабо флуоресцируют. Соотношение ХЛа/ХЛЬ у них выше, чем у штаммов

"дикого" типа (Чунаев и др.,1Э84;Чунаэв и др.,1987).

Генетический анализ ХЛь-дефицитных мутантов.

С помощью функционального и рекомбшационного тестов изучены аллельные отношения мутаций, приводящих к снижению уровня накопления ХЛь. Мы продемонстрировали различные подходы и их адекватность в решении этой задачи. Функциональный тест проводили на зиготах и диплоидах, рекомбинационный тест - методами случайной выборки и посемейственного анализа.

При скрещивании независимо полученных нами Шнатаммов с сЬп1-48-сегрегантами образуются зиготы мутантного фенотипа. Уровень флуоресценции пленок зигот при скрещивании мутантов значительно ниже, чем у штамма "дикого" типа. В спектрах поглощения не выявляются максимумы характерные для ХЛЬ (рис.2.). Значит мутации в

Рис.2. Типичные спектры поглощения пленок 6-суточных зигот:

1. "дикого" типа

2. сЬп1 -48хсЬп1 *

3. сЬп1-11/-сЬп1-4в

4. сЬп!-48УсЬп1-48 .

X, нм

штаммах ®-П - ®-60, Ш>-73 и НФ-75 затрагивают один ген - сЬп1. в соответствии с принятой номенклатурой (Цетегес а1.,10вв 5 Захаров и Мацелюх,1986> мутантные аллели в данных штаммах обозначены сьп1-

11, сЬп1-15, сЬп1-1в... И Т.Д.

Тест на аллелизм проводили также, определяя средние значения оптической плотности индивидуальных зигот: Ав80-Азво''Ав5о"А5во (табл.2.).

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм рдиз несет рецессивную мутацию в гене сЬп1, обозначенную сьп1- из. При скрещивании штамма раЮ1 и мутанта по гену сьп! среднее значение

оптической плотности а* зигот достоверно отличалось от +/+ и сьм--шхсЬп1-48 вариантов. Этот результат можно объяснить следупцим

Таблица 2.Значения показателей оптической плотности индивидуальных зигот:а- - Ае80-ЛБво'Ае5о-АБво-

Генотип зиготы Значение оптической плотности: А* ± т Количество измерений

"дакзй"та1 1.506Ю.036 15

сьп1 -1в 3.811±0.364 20

сЬп1 -4ЯхсЬп1 -113 3.856±а.2б1 20

сЬп1 -*8г1ог1 1.807±0.062 13

1.559+0.087 II

1ог1'1ог1 2.08б±0.127 23

Примечание:зиготы сьп!-<шхсьп1 -из получены из скрещивания рд113 X сЬп1-48~ сегрегант; ЗИГОТЫ сЬп1-4в/1ог1 - Рд101 х сЬп1-4в-

сегрегант .

образом. За 6 дней созревания зиготы не успевают накопить ХЛь до

уровня штаммов "дикого" типа, т.к. синтез идет в условиях дефицита азота. В пользу такого предположения говорит то,что диплоид, несущий в транс-положении исследуемую и сЬп1—*а мутантные аллели, не отличался по спектрам поглощения от гаплоида "дикого" типа. Однако, в ситуации, когда гены не сцеплены, а различия между признаками незначительные, наиболее адекватным методом для доказательства независимого наследования признаков является

Таблица 3. Рекомбинационный тест на аллелизм ХЛь-дефицитных мутантов.

Генотип Случайная выборка Посемейственный анализ

мутантные "нормальные" мутантные "нормальные"

сЬп1 -48хеЬп1 -11 . 485 0 462 0

сЬп1 -4Л/'сЬп1 -13 - - • 297 0

сЬп1-38 - - 310 0

сЬп1-48хсЬп1-60 844 0 - -

сЬп1 -48хсЬп1 -61 2Э6 0 - -

сЬп1 -4в'сЬп1 -113 1000 0 1586 0

еЬп! -4в^Хог1 791 из - -

Примечание ¡критерием мутантного фенотипа слукил низкий уровень флуоресценции колоний по сравнению с "диким" типом ("нормальные").

рекомбинационный тест на аллелизм. Выщепление рекомбинанто! "дикого" типа однозначно доказывало, что мутационные изменения : штамме рдЮ1 не затрагивают ген сЬп1 (табл.3.).

Посемейственный анализ зигот и случайная выборка зооспор ш скрещиваний рдиз сеьп1-изэ и Ю- штаммов с мутантом по гену сЬп! не выявили сегрегантов фенотипа "дикого" типа (табл.3.), чтс подтвердило данные функционального теста на аллелизм.

В потомстве скрещиваний мутантов НФ-73, Ю-75 и рвЮ1 признш "низкий уровень флуоресценции" наследовался моногенно (табл.4.).

Таблица 4. Анализ расщеплений по уровню флуоресценции I мейотическом потомстве мутантов ("м":"н" соответствуем "мутантные":"нормальные").

Ген Количество полных тетрад с расщеплением 2"м*:2"н" Случайная выборка зооспор

соотношение "М** * "ц" соответствие соотношения "м":"н"=1:1

2 * Р

lc.il 22 118:129 1.17 >0.05

сЬп1 -73 32 - - -

«_Ьп1 -75 71 —

Штамм рдЮ1 несет рецессивную мутацию в ядерном гене, которая блокирует синтез специфичного ксантофилла водорослей лороксантина. По этой причине соответствующий ген обозначили 1ом. Снижение уровня накопления ХЛЪ является плейотропным эффектом мутации в гене ic.ii.

Локализация генов сЬп! и 1ог1.

Данные тетрадного анализа свидетельствовали о сцеплении гена сьш с маркерами I хромосомы - лгд7,»гуз и «ем (табл.5.).

В скрещиваниях 575 , 585 и 607 распределение летальных спор по тетрадам и октадам указывало на то, что один из родителей несет реципрокную транслокацию сРвгк1п», Ю74»р»г1с1п«,Ю775. Тетради и на три класса - *.*» 01, г*» 21, о*» «1 и в*» 01, 4у« 41, в1, соответственно. Величины классов со всеми Хвзнеспособными су) и со

зсеми летальными ело спорами достоверно не различались. Изучен» сарактера наследования "неслучайной" летальности спор в потомстве юзволило предположить, что носителем реципрокной транслокации жтадн по числу жизнеспособных спор распределялись преимущественно

Таблица б. Результаты тетрадного анализа потомства скрещиваний мутантов по гену ct.ni.

Ший> скрещивания Родители Пары генов Соотношение P« Ni T Соответствие соотновэния P: N'lü

p

572. С.С-557 X 321 -7Л cbnl -ас2О0 5: 9: 9 1.14 •j.05

575 527-5а cbnl -arg7 73: 0:58 73.0 C.00I

X arg7-nt 19:20:53 0.03 0.05

535-1Л cbnl —mt 12:14:68 0.15 >0.05

585 575-1 71 а cbnl —arg7 63: 2:54 57.25 .0.001

X. arg7-mt. 10: 6:36 1.00 0.05

575-1 71 d cbnl -mt II: 8:34 0.47 0.05

605 527-5а cbnl —arg 7 50: 2:47 44.31 0.001

X ar g7-rat 19:24:59 0.60 0.05

601-40а cbnl —mt 14:20:59 1.06 0.05

arg7-pf 2 35:21:38 3.5 G.05

ac30-mt 28: 3:72 20.16 o.oo:

ac30-pf 2 34:40:20 0.49 0.05

ac30-arg7 27:26:42 0.02 , 0.05

mt -pf 2 20:18:62 O.II 0.05

cbnl —pf 2 12: 9:80 0.43 '0.05

cbnl-асЗО 12:13:77 0.04 >0.05

613 CC-7Ö X ARG—2 агдй-вгуЗ 27: 0:10 27.00 0.001

614 613-13f X 521-7d cbnl — егуЗ 53: 6:22 37.44 0.001

664 МЗ-1 X 618-7b cbnl -nerl 25: 0: 4 25.00 <0.001

656 С5*-37а cbnl -«srl 100: I: 4 98.03 <0.001

X cbnl -»ry3 65: 1:37 62.06 <0.001

CC-7Q вгуЗ-msrl 59: 2:39 53.26 <0.001

шляется штамм 527-5». Помимо "неслучайной" летальности в потомстве этих ав скрещиваний мы обнаружили отклонения от Менделевского расцепления по маркерам i - *rg7, ct>ni и vi - «t групп сцепления -1"н":0"м", 3"н":1"м" и 0"н":4"м", где "н" - "нормальная"' и "м" -

"мутантная" вллвш гона. По-щщшоцу, при ыейотичэскпх. деланиях зигот в скрещиваниях 575 , 585 и 607 нарушено расхоадэниэ i и vi хромосом. Причиной этого когла быть рецацрокная транслокация (K»fer,io77| Зимина,1Э83>. Поскольку транслокация ыеняет относительное полоеэниэ генов в хромосомах, ш рассчитали сцепление о центромерами для пяти маркеров, участвующих в скрещиваниях. Кяил результаты показали хорошее ооотватстваэ с литературными даннша

CEb*rsold ®t. Ml., 1 ООН; Hastings •t.al.,ieS3j Scsyth »t. el. , 107S; Davidson et. al., 1C7G; Evec, Oiibng, 10323 . ПОСКОЛЬКУ ТрШСЛОКаЦИЯ

нарушает конъюгацию хромосом в иейозе свлггу, юл?; сох, сш, 1сз7; Oainbridgo, 10703, ш сравнили теоретически ожидаемое количество тетрад неродительского дитшха с полученным в вксперименте. Положительная хромосомная интерференция на участке сьм-вгуз- не была выявлена "(**- 3.35;р > 0.05). На основании всей совокупности данных ген сьм картировали в i груше сцепления (рис.3.).

20

~1 Г

6.9—,

*rg2 *гд7

•гуЗ

cbnl

■srl

i—13.5-1

40

Рис.3. Локализация мутации cbni в х груше сцепления генов хламидомонады. Сцепление рассчитывали по формуле: X - CfM ♦ О. В 100 (СЫ).

ядерных

Тетрадный анализ мейотиче ского потомства скрещиваний хламидомонады не выявил сцепления гена 1ог1 с маркерами - «гд7С1э, рггоаз, и рггосхч> (табл.6.). В скрещиваниях с участием маркеров «го7 и р*г количество тетратипов было меньше 2/3. Сцепление гена 1ог1 со своей центромерой составило 12.4 сМ.

Таблица 6. Тетрадный анализ потомства скрещиваний мутантов по ену 1ог1.

шифр скроил— вания пары генов соотношение Р»М«Т соответствие соотношения Р| К«111

2 р

627,630,631* 660 661 1ог1-»гд7С15 ** 1ог1-рГ2 СXI) 1ог1-рГ20С1Ю 23:18:38 6: 5: 8 2: 5:24 0.31 0.05 0.58 0.83

* Результаты тетрадного анализа потомства скрещиваний: 627, 30 и 631 однородны (* = 2.867, р= 0.680).

»» В скобках указаны группы сцепления, в которых находятся оответствупцие гены.

Взаимодействие генов, контролирудщих биогенез хлоропласта.

Мы изучали взаимодействие хлоропластных и ядерных генов, юнтролирупцих биогенез фотосинтетического аппарата. Хлорошшстный ■ен с-и-1 отвечает за формирование ХБК1 свеппоип ^ »1., 10775, 1амостоятельный-эффект мутантной аллели заключается в уменьшении ¡оотношения ХЛа/ХЛЬ до 1.4-1.7 по сравнению с 1.8-2.1 у штаммов 'дикого" типа. Уменьшение соотношения ХЛа/ХЛъ является следствием крушения накопления апопротеина ХЛ»-белкового комплекса I свеппоип 1 ах.,1 0775. Двойные рекомбинанты с-и-1, сЬг»1-48 более низкое ^отношение ХЛа/ХЛь - 140-660 по сравнению с сегрегантами генотипа :-и-1сьп1 (табл.7.). Это можно объяснить тем, что

'новообразованные" молекулы ХЛа, которые в норме встраиваются в ¡труктуру ХЛа-белкового комплекса I, увеличивают фонд молекул [редшественников ХЛЬ у с-и-1, сЬп1-*а - сэгрегантов. Весь ХЛЪ при >том может встраиваться в структуру светособирапцэго "Ла/ь -белкового комплекса. Специфика действия гена с-и-1 подтверждается отсутствием супрессирущего эффэкта аллели другого :лоропластного гена зг-и-а-во, которая нарушает биогенез ¡лоропластных рибосом С6111Ьат еЬ а) ., 10703 . ВлИЯНИб гена 5г~ч-2-60 ш соотношение ХЛа/ХЛь не наблюдали на фоне "нормальной" и (утантной аллелей гена сьп1 (табл.7.).

У светочувствительных штаммов ы-135 и н-154, изменен

уровень накопления хлорофиллов и ^каротиноидов (Столбова,1971

Таблица 7. Влияние ядерных в хлоропластных генов на проявле мутантной аллели cbni-4e, регистрируемое по изменению соотношения ХЛ«/ХЛЬ.

Шифр штата Гены Соотношение ХДи/ХЛь на фоне аллели

cbnl* сЬп1-4в

1Э7С+ "ДИКИЙ"ТИП 1.8- 2.1 >1000

хлоропластные:

С-1 С-а-1 1.4- 1.7 140-660

SR ■r-u-2-вО 1.8- 2.2 >1000

ядерные: 12.0-30.0

404/30 ltsl-ЭО >1000

M-13S ltal-1 2.6- 3.0 >1000

М-184 ltsl-3 9.2-Н.Б >1000

Мутантные аллели гена it«i несколько увеличивают соотношеш ХЛ»/ХЛЬ, во не меняют его на фоне аллели cbni-4s (табл.7.). В то i время мы наблюдали аллеле- и геносотцифичную супрессию мутантнс аллелью cbni-48 признака светочувствительности. При скрещивал! 1ль-дефицитного штамма о мутантами аолузо citsi-эоэ, N-13S citai i)t м-194 citsi-зэ, и N-i3 cit«*-i3 только в одном случае -двойных рекомбинантов cbni-48,itsi-3 - обнаружили взаимодействх генов по типу супрессии. По спектрам поглощения хромотографическим методом определили, что у последних содержанв каротиноидов увеличено в два раза по сравнению х tmi-з-сегрегантами.

Возможны два объяснения роста двойных мутантов сьм-4в,îtsi-на свету. Первое - за счет увеличения уровня накоплена каротиноидов, которые, как известно защищают клетку о фотодеструкции с Кг lns к у, lÙOOj D»K*lr>0 »t al. , 1 Ов75 . ВТОрОЭ - 38 СЧв уменьшения размеров светособирающего комплекса фотосистемы II сci*

1 and. Hall s et al.,10873.

При повышенной температуре происходит диссоциацп "периферического" светособирапцего комплекса и фотосистемы II сот* en» et al., îoaa; Maanpaa et «1.10883 ЭТО фИЗИОЛОГИЧвСКИЙ меХВНОШ предотвращапций разрушение фотосистемы II на ярком свету csundy •

al. , 1080; Ovaska et а!.,100Ю. Для ПрОВврКИ ПрвДПОЛОЖвНИЯ О ТОЫ,ЧТ'

гация cbni супрессирует признак светочувствительности у двойных гантов за счет уменьиения размеров антенного комплекса, был зтавлен следующий опыт. Коллекцию светочувствительных мутантов, зличащихся по содержанию пигментов помещали на свет (1000 лк) i температуре 20° С и 34°С. При температуре 34°С два из II гантов - м-13 cits^-13 , не отличающийся по составу пигментов от эмма "дикого" типа, и n-is* cit®i-3j росли на свету. Таким разом, при повышенной температуре в двух случаях наблюдали зотипическую супрессию признака светочувствительности. Это служит утверждением того, что уровень накопления ХЛЬ влияет на этоустоЗчзвость. Тец не менее основной причиной роста на свету эйных мутантов chni-¿о, ítsi-з можно считать увеличение содержания ротиноидов.

Биводы.

1. Разработан эффективный метод отбора мутантов без ХЛЬ. у Lanydononas reinhardtii. Предложены качественный флуоресцентный год для первичного отбора .и использование светочувствительного

гапта по гону itsi-э для селективного повышения частоты выявления ^-дефицитных "мутантов.

2. Установлена аллельность 55 мутаций в штаммах хламидомонады, зтично или полностью утративших ХЛЬ. Соответствующие аллели эзначены cbni-ii, cbni-is, cbni-ie... и т.д. Мутянтнне аллели за cbni рецессивны. Ген cbni локализован в правом плече первой змосомы иа расстоянии 40 сМ от центромеры.

3. Штамм pgioi несет рецессивную мутацию в ядерном гене ion, аводящую к блоку синтеза специфичного ксантофилла водорослей -роксантина. Снижение уровня накопления ХЛЬ у штамма pgioi ляется плейотрошшм эффектом мутации в гене iori . Сцепление гена ri сцеплен со своей центромерой-1 составила 12.4сМ.

4. Выявлено взаимодействие по типу супрессии ядерных и эропластных генов, контролирующих биогенез фотосинтетического парата. Мутаптная аллель хлоропластного гена с-ч-i приводила к эныпению соотношения ХЛа/ХЛЬ на фоне аллели сьп!-4в до 140-660 по авыению с сегрегантами генотипа сьпх~ш, c-u-i , у которых оно льшэ I ООО. Мутантная аллель cbni-ла проявляла аллеле- и носпецифичнуп супрессию признака светочувствительности.

- 16 -

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Чунаев A.C., Мирная О.Н., Гаевский H.A. Изменчивое соотношения хлорофилл »/хлорофилл Ь У CHI »«ydomonas reinhardtii . Вестник ЛГУ, 1981, м 9, с.98-102.

2. Чунаев A.C., Мирная О.Н., Гаевский H.A. Качественная оцен признака "отсутствие хлорофилла Ь" У Chlaiaydoaonas reinhardtii. Генетика, 1982, т.18, м II, с.1906-1908.

3. Чунаев A.C., Ладыгин В.Г., Мирная OiH., и др. Множественш аллелизм в гене cbni, контролирующем накопление хлорофилла ь Chlamydononas reinhardtii. - ГеНёТИКЭ, 1984, Т.20, N 5, С.775-781,

4. Мирная О.Н. Реципрокная транслокация как возможная причш летальности и аномальных расщеплений по маркерам i и vi rpyi сцепления У Chlamydomonas reinhardtii. - ГвНвТИКа, 1987, Т.{ С.779-783. '

5. Chunaev A.C., Ladygln У. G., Hirnaya O.N. et al. Chlorophyl Ь-less mutants in Chlamydojaonas reinhardtii. - Photosynthetici 1087, N 3, p. 301-307.

6. Ладыгин В.Г., Чунаев.А.С., Мирная О.Н. и др. Особенной ультраструктурной организации хлоропластов при взаимодейств! генов, обуславливающих дефицит каротиноидов и отсутствие хлорофиш

Ь У Chiamydomonas reirihardii . - ЦИТОЛОГИЯ, 1988, Т.30, N I с.19-23.

7. Мирная О.Н., Фомина-йценко Ю.Г., Чунаев A.C. Локализация мутации cbnl в первой Группе СЦеПЛвНИЯ ЯДерНЫХ ГеНОВ Chlamydomona reinhardtii. - ГвНвТИКВ, 1990, Т.26, N Б, С.968-960.

8. Chunaev A. S., Mirnaya O.K., Boschetti A. Chiamydomonas re lnhardtll mutants deficient in light-harvesting chlorophyll *sb protein complexes but having normal apoproteins. - ' Poster sessio abstr., Florida Winter organelle meet., 1QOO, p. 15.

9. Chunaev A. S., Xlrnaya O. N.Maslov V. G., Boschetti A. Chi о rophyll b - and loroxanthln-deficient mutants of Chlaaydoaonas re lnhardtli. - Photosyntheti ca, lOOl, v.25, N 2, p. 2Ö1-301.

Кроме того опубликованы II тезисов.

Подписано в печать с оригинал макета 23.II.92г. Бумам писчая;

Печать офсетная. Язд.Ш., ТИраж 100 э:-сз. Бзсппатно. Заказ 4126.

иодраздетаМв (УЬрагЮМТЯГ noWpatfHH Л ТА. 19Ч01&Л7-ПегУрбург. !1нститутокяй тзр. д. 5.