Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий

Андрющенко, Сергей Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий"

00500°°""

На правах рукописи

Апдрющенко Сергей Валерьевич

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИНГИБИТОРОВ ЛИЗОЦИМА В АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

03.02.03 - «Микробиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

6 ДЕК 2012

Оренбург - 2012

005056668

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждени науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Перунова Наталья Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия»

Минздрава России Чайникова Ирина Николаевна

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»

Минздрава России . Туйгунов Марсель Маратович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «¿£» fret&Spft 20 fZ_ г. вР^'часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, в конференц-зале (аудитория №205), телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-2459, E-mail: orgma_dsl@esoo.ru, Официальный сайт: http://orgma.ru/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА

Автореферат разослан « /7 » tiozfv? 201_L г., автореферат и текст объявления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь .

диссертационного совета _ j f

доктор медицинских наук, профессор Л^' Немцева Наталия Вячеславовна

1 W

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время у бактерий различных таксономических групп выявлены как специфические, так и неспецифические механизмы, обеспечивающие либо пассивную устойчивость к лизоциму, либо активное ингибирование его гидролитического эффекта (Callewaert L. et al., 2008). Антилизоцимная активность, являясь одним из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий, отражает главным образом способность клетки к продукции экскретируемых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Бухарин О.В., 1999). В ходе работ по выявлению механизмов антилизоцимной активности на примере как грамполо-жительных бактерий рода Bacillus (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004), так и энтеробактерий (Бондаренко В.М. и др., 1994) было установлено, что генетические детерминанты данного признака имеют плазмидную локализацию.

Вместе с тем, в зарубежной литературе рассматривается феномен устойчивости к лизоциму штаммов-продуцентов, кодирующийся у энтеробактерий двумя семействами генов: ivyC и pliC/mliC (Deckers D. et al., 2008). Функционально-полноценные гомологи гена ivyC среди гамма-протеобактерий распространены достаточно широко и встречаются в хромосомах ряда условно-патогенных представителей родов Escherichia/Shigella, Erwinia, Klebsiella, Yersinia и Pseudomonas. Однако у бактерий рода Salmonella гомологи данного гена не выявлены (Abergel, С., V. Monchois et al., 2007). Второе семейство белков-ингибиторов, существующее у микроорганизмов рода Salmonella было обнаружено несколько позже: PliC/MliC, периплазматический вариант которого кодируется также в хромосомах представителей родов Salmonella и Pseudomonas (Callewaert L. et al., 2008).

Известно, что продукт гена mliC является мембраносвязанным белком, тогда как у белков PliC и IvyC показана периплазматическая локализация (Callewaert L. et al., 2008). Не смотря на то, что не исключена возможность выхода молекул двух последних типов белков за пределы наружной мембраны грамотрицательной клетки-продуцента, где их ингибирующий эффект и может

быть реализован в виде антилизоцимной активности, в существующих исследо-

ваниях данных белков дистантный аспект их ингибирующего эффекта не анализируется.

После завершения проектов по секвенированию геномов патогенных вариантов К. pneumoniae (Wu К.М. et al., 2011), одна из открытых рамок считывания в нуклеотидных последовательностях плазмид вирулентности была аннотирована как гомолог pliC. Этот факт открыл новый путь к объединению существующих подходов по исследованию механизмов как лизоцимрезистентности, так и антилизоцимной активности микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - определение связи генетических детерминант ингибиторов лизоцима с фенотипическим проявлением антилизоцимной активности энтеробактерий.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов энтеробактерий, кодирующих секретируемые ингибиторы лизоцима.

2. Оценить распространенность известных генетических детерминант секрети-руемых ингибиторов лизоцима у микроорганизмов видов Е. coli, К. pneumoniae, S. enterica и определить плазмидный профиль исследуемых штаммов энтеробактерий.

3. Изучить антилизоцимную активность микроорганизмов видов Е. coli, К. pneumoniae, S. enterica с разным профилем генов ингибиторов лизоцима.

4. Выявить изменение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий, различающихся по плазмидному профилю под воздействием неспецифических модификаторов антилизоцимной активности.

Новизна исследования. Проведенный филогенетический анализ внутри-и межвидового распространения генов секретируемых ингибиторов лизоцима pliC и ivyC среди условно-патогенных и патогенных энтеробактерий показал высокую частоту случаев горизонтального пути переноса данных генов среди известных геномов различных сероваров Е. coli, S. enterica и К. pneumoniae.

Выявлено наличие хромосомных генетических детерминант исследуемых секретируемых ингибиторов лизоцима среди большинства исследованных

штаммов Е. coli и S. enterica, а также вариабельность встречаемости хромосомного гена ivyC и плазмидного гомолога гена рЧС у К. pneumoniae.

Наличие генов, кодирующих ингибиторы лизоцима семейств ivyC и pliC, коррелировало с уровнем антилизоцимной активности исследуемых штаммов энтеробактерий. Выявлены различия во вкладе данных генов в общий уровень антилизоцимной активности бактерий, проявляющиеся в преобладающем влиянии гена pliC на уровень секреторной антилизоцимной активности микроорганизмов.

Определено, что уровень лизоцимрезистентности энтеробактерий является преимущественно видовой характеристикой и определяется главным образом несекретируемыми механизмами.

Суббактериостатические концентрации хлорамфеникола вызывают повышение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий при наличии генетических детерминант ингибиторов лизоцима семейства pliC, и, в меньшей степени, ivyC, как плазмидной, так и хромосомной локализации. Напротив, культивирование исследуемых штаммов энтеробактерий в присутствии акри-доновых соединений акридинового оранжевого и акридонуксусной кислоты в субингибиторных концентрациях приводит к снижению антилизоцимной активности.

Установлено, что наличие в среде культивирования акридонуксусной кислоты не оказывало влияния на копийность плазмидной ДНК энтеробактерий при выраженном подавлении антилизоцимной активности по сравнению с акридиновым оранжевым.

Культивирование энтеробактерий в условиях пептидогликанового стресса субингибиторными концентрациями ß-лактамного антибиотика не приводило к повышению антилизоцимной активности микроорганизмов, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния регуляторной системы Res на стенотипическое проявление данного признака.

Практическая ценность работы. Выявленные консервативные фрагменты нуклеотидных последовательностей генов ингибиторов лизоцима позволили

создать олигонуклеотидные зонды и праймеры широкой специфичности, на основе которых разработана экспериментальная ПЦР тест-система для скрининга генов секретируемых ингибиторов лизоцима с учетом возможной функциональной полноценности и вариабельности выявляемых последовательностей.

Предложена методика неспецифической стимуляции экспрессии данных генетических детерминант при помощи хлорамфеникола для определения функционального резерва антилизоцимной активности микроорганизмов, что может быть использовано для выявления потенциала антилизоцимной активности у бактерий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антилизоцимная активность энтеробактерий - часть общего механизма ли-зоцимрезистентности микроорганизмов, обусловленная генами экскрети-руемых ингибиторов лизоцима.

2. Молекулярно-генетический подход в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР выявляет гены секретируемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.

3. Высокий уровень антилизоцимной активности энтеробактерий сопряжен с наличием гена pliC, тогда как у носителей гена ivyC выявляются низкие значения данного признака.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); VII Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 30 отечественных и 90 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 4 таблицами и 30 рисунками.

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКВС УрО РАН «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах» (№ гос. регистрации 0120.02 600145); фрагменты диссертационной работы выполнены и включены в отчеты по теме «Лекарственная регуляция персистентного потенциала микроорганизмов» (№ гос. регистрации 0120.0 853339); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект № 09-П-4-1007).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужили 150 штаммов энтеробактерий: по 50 культур негемолитических Е. coli, К. pneumoniae, изолированных из испражнений пациентов с I - II степенью дисбиоза кишечника и S. enterica, выделенных от больных острой кишечной инфекцией и реконвалесцентных сальмо-неллезных бактерионосителей. Полученные штаммы были идентифицированы по морфологическим, тинкториапьным и биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем «ЭНТЕРО-тест24» («LaChema», Чехия). Антибиотикорезистентность исследуемых штаммов бактерий определялась методом серийных разведений согласно стандарту CLSI в отношении ампициллина, канамицина, стрептомицина, тетрациклина и хлорамфеникола.

У всех исследуемых штаммов был определен уровень антилизоцимной активности чашечным и фотометрическим методом (Бухарин О.В., 1999). Сорбционный компонент данного признака выявлялся по методу В.Ю. Соколова и А.П. Луда в модификации (Черкасов C.B., 2011). Конечная концентрация раствора лизоцима для обоих методов составила 5 мкг/мл.

Устойчивость энтеробактерий к лизоциму (0,2 мг/мл) определялась в комбинированной среде на основе LB-бульона с добавлением 10 шМ трилона Б, использованным для повышения проницаемости наружной мембраны грам-отрицательных бактерий в отношении лизоцима (Deckers D. et al., 2004).

С целью создания экспериментальной тест-системы скринингового выявления генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима мето-

дом ПЦР был произведен поиск наиболее консервативных участков нуклеотид-ных последовательностей из базы данных «GenBank» («National Library of Medicine», США) и осуществлен подбор праймеров видоспецифичного диапазона для выявления генов pliC и ivyC. Верификация секретируемого характера предполагаемого продукта трансляции плазмидного гомолога pliC была произведена с применением сервиса «SignalIP 4.0» («Center for Biological Sequence Analysis at Technical University of Denmark», Дания). Филогенетический анализ распространения изучаемых генов выполнен с использованием пакета программного обеспечения «Lasergene 7.1» («DNASTAR, Inc.», США). Верификация специфичности полученных олигонуклеотидов производилась с помощью сервиса Standard Nucleotide BLAST («National Library of Medicine», США).

Выделение матричной ДНК каждого исследуемого штамма для ПЦР проводилось с использованием 0,1 мл смеси реагентов «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Россия). Полученный супернатант вносился в подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл.

Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл приготовлялась из набора праймеров и реагентов ООО «Синтол». Реакция проводилась в ДНК-амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия).

Получаемые ампликоны подвергались агарозному гель-электрофорезу (Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж., 1984). Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводилась в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм на установке гель-документирования «Vilber Lourmat».

Для оценки размера и количества плазмид использовался линейный маркер «100 Ьр» (ООО «Лаборатория Медиген», Россия) в количестве 1,5 мкг.

С целью контроля специфичности ПЦР-анализа были использованы модельные штаммы Е. coli К-12 MG1655 и Е. coli XLl-Blue, имеющие ген ivyC и с отсутствием генов pliC, eatA и espP.

Для изучения различий в динамике фенотипических проявлений генов секретируемых ингибиторов лизоцима, имеющих различную локализацию, было проведено исследование влияния хлорамфеникола и акридоновых соединений на число копий пДНК и уровень АЛА плазмидосодержащих штаммов, и бесплазмидных вариантов клебсиелл и сальмонелл в качестве контроля.

В работе был использован акридиновый оранжевый («Диа-М», ч.д.а., Россия), водный раствор 25 мг/мл, применявшийся в 0,5 и 1-кратной начальной ин-

гибирующей концентрации (37,5 и 75 мкг/мл соответственно) по T.J. Tomas с соавт. и акридонуксусная кислота в виде препарата «Циклоферон» («Полисан», Россия), раствор для инъекций 125 мг/мл, взятый в конечной концентрации 5 мг/мл LB-бульона, так как антимикробный эффект препарата не был выявлен. Для амплификации числа копий плазмид и стимуляции антилизоцимной активности применялся хлорамфеникол («Рапгеас», pharm grade, Испания).

Культивирование и инкубация исследуемых штаммов в среде с указанными соединениями проводились по методике неспецифической амплификации плазмидной ДНК в богатой среде с хлорамфениколом (Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж., 1984) В качестве контроля использовалась среда LB без добавления антибиотика.

Выделение плазмидной ДНК проводилось с помощью стандартных наборов Pias/mini Isolation Kit XL («AppliChem», Германия).

Полученные растворы плазмидной ДНК анализировались с помощью ага-розного гель-электрофореза по вышеприведенной методике.

Определение числа копий плазмид, выделенных из клеток нормированных бактериальных культур исследуемых штаммов осуществлялось путем сравнения интенсивности полос люминесценции маркерных и опытных проб ДНК с использованием программного обеспечения TotalLab 2.01 (Nonlinear Dynamics, Ltd, Великобритания).

Выявление случаев возможной полной утраты плазмид проведено путем рассева микробиологической петлей бульонной культуры микроорганизмов в поздней логарифмической фазе на 1,5% LB-arap с последующим анализом получаемых клонов на наличие выделяемых плазмид.

С целью выявления роли стресс-регуляторной системы Res в экспрессии антилизоцимной активности производилось культивирование энтеробактерий в условиях пептидогликанового стресса, вызываемого ß-лактамным антибиотиком (Laubacher, М. Е., and S. Е. Ades. 2008).

Результаты исследования и их обсуждение

Для проведения филогенетического анализа и конструирования прайме-ров для выявления рассматриваемых в работе генов методом ПЦР, в базах данных «GenBank» нами был отобран 31 гомолог гена ivyC у разных подвидов и сероваров Echerichia coli, 4 гомолога гена ivyC среди секвенированных штаммов К. pneumoniae и 1 последовательность ivyC у К. variicola. Аналогичный по-

иск в отношении гомологов гена pliC позволил отобрать 12 записей искомых последовательностей среди представителей вида S. enterica, все выявленные последовательности имели хромосомную локализацию.

Вместе с тем, были найдены две идентичные последовательности, аннотированные как гомологи pliC, но локализованные в мегаплазмидах вирулентности у бактерий вида К. pneumoniae, экспериментальной верификации функции белкового продукта которых до настоящего времени не проводилось.

Аминокислотная последовательность гена pliC плазмидной локализации была представлена для автоматического анализа с помощью сервиса «SignalP 4.0». В результате анализа было установлено наличие сигнального пептида, отщепляющегося между 21 и 22 аминокислотными остатками, что свидетельствовало о секретируемом характере синтезируемого белка.

Филогенетический анализ в виде дендрограмм выровненных по методу ClustalW нуклеотидных последовательностей известных гомологов гена pliC, распространенных среди подвидов и сероваров S. enterica (рис. 1В), и гена ivyC, выявляемого в геномах сероваров Е. coli (рис. 2D) показал существенно отличающийся вариант ветвления по сравнению с полногеномными дендрограмма-ми данных штаммов (рис. 1А, рис. 2С), причем в геноме серовариантов Paratyphi С гомолог гена pliC отсутствовал. Это указывает на высокую частоту случаев невертикального пути переноса данного гена между сероварами данных видов. Аналогичная картина, демонстрирующая высокую частоту случаев горизонтального обмена геном ivy С, была выявлена между видами К. pneumoniae и К. variicola.

Проведенный нами ПЦР-скрининг генов секретируемых ингибиторов ли-зоцима, отдельные результаты которого представлены в виде фореграмм на рис. 3, позволил выявить /iyC-негативные штаммы Е. coli 243, 251 и 254 (рис. ЗА), варианты К. pneumoniae, демонстрирующие негативный результат при выявлении обоих генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоци-ма (штаммы №№ 261, 270, 271) и гЧуС-р/г'С-позитивные варианты (штаммы №№ 275, 276, 277, 278) (рис. 3D). Критерием присутствия у штамма искомых генов явилось наличие специфических ампликонов соответствующего размера, детектируемых на приведенных фореграммах в виде полос люминесценции соответствующей массы.

г« subsp enferica serovar Enteritis str P125109 U subsp, ййш serovar GaJlirrarum str 28J/91 —-5 subsp enterica serovar Dublin str СШ2ШЗ

irica serovar Paratyphi С strain RKS4594 -q subsp. enterica sero\*ar Newport str SL254

i subsp. enterica serovar Typhimurium str LT2 -9 subsp. enterica serovar Paratyphi В str SFB? rfl subsp enterica serovar Typiii str CT13 щ subsp enterica serovar Typhi str Ifi j) subsp. enterica serovar Paratyphi A str. AKUJ26Q1 щ subsp enterica serovar Paratyphi A str ATCC 9150

--j subsp anzonae serovar Ш ül~ str RSK2980

—9 subsp enterica serovar Schwarzengrund str CVM19633 -9 subsp enterica serovar Agona str SL483

• pliC-SeJypIiimurium LT2.seq

• pliC-Se Jyphi CT18.seq

pliC-Se_Heide!berg SL476.seq pl iC-Se~Ente ritid i s P125109.seq - pliC-Se~Paratyphi_C RKS4594 seq

• pliC-Se_Choleraesuis SC-BSJ.seq

• pliC-Se_Agona SL483.seq

■ pliC-Se_Schwarzen§rund CVM19633.seq

0.7.

Nucleotide Substitutions (x100i

Рис. 1. Полногеномная дендрограмма сероваров 5. enterica (А) и филогенетическое дерево гомологов гена pliC (В).

—nöfflislf ЕШ —U015?:H?$tr.lWii359 j—4>01S7 H7 str Е01ЭЗЭ T—sOKMäi.Ssö «(ШШСШ

—e 0111H-Sff-11128 -) 026 KU slr 111

-«011» 115

—«те oi

—«Uli

-a CFT073

-«ОШй.ЕШ

-s№3

-•Ш -4 Ullis

-зЕ24377А

—»SE11

I—«И slr. REL606 T-BL21 -<3o ki(DE 3)pL^sS AG

«IHM» HG« —«str K-12substf. DH1QB

-»ÄiCCi?;S

—«HS

Üli

йС-Ес K12 DHUB.ssq i^UßmisiH №c втщ

Wie 61Щ31Ш(! fivC-:t BL2Woll|CE3^,ssS AG.SiO

Ш В Rastet! SEH.seq

wWc KÄsss irjC-Ec HS.SBi wCtcJls«! fiVC-tC.E2i377A.seq HCic"oiO}H2J»si| К**С-Ес_02Е-Н11_1136ä.seq

W-Et.KCOlaii liC-Et.SiSK)

_j i^C-Ec 536.S8Q

—— Wie 0127-H5 EÖWSSÜ

- NjCic.UHWSfissq

rrtC-€c_£Dl3 ssq

jii)№J3S.S!l|

1—1—t,№JHS-3-5.sei!

-«C-Ec_CFraset|

—iitC-€c_015i-H?_EC4115.seq J Ä-Ec.oisiffiJMtseq J'irtCic Ö157-H7 lDL933.$eq -fwC-ec 0157« Säkalssq 1 MC-Ec 055-H7 CBäSlsiäü

NadisidsSübitifffliSülOC)

Рис. 2. Полногеномная дендрограмма E. coli (С), и филогенетическое дерево гомологов гена ivyC (D).

Рис. 3. Фореграммы результатов ПЦР-анализа наличия генов ivyC Е. coli (А), pliC S.enterica (В), ivyC К. pneumoniae (С), pliC К. pneumoniae (D) у ряда иссле-

дуемых штаммов. Наличие полос люминесценции - положительный результат ПЦР с препаратом ДНК исследуемого штамма, индекс которого указан в верхней части дорожек. Подчеркнуты индексы штаммов, использованных в качестве контролей. Указатель «100 Ьр» соответствует маркеру молекулярных масс.

В результате анализа полученных в эксперименте фореграмм установлено различие в распространенности генов ivyC и pliC (табл. 1) и показано, что встречаемость хромосомных генов: как ivyC у негемолитических Е. coli, выделенных у обследуемых с I-II степенью дисбиоза кишечника, так и pliC у 5. enterica - возбудителей сальмонеллеза превышает 90% (94±3% у Е. coli и 92±3,5% у S. enterica).

Представители условно-патогенных бактерий, выявляемых при дисбиозе кишечника - К. pneumoniae - характеризовались наличием гена ivyC только в 81±5,5% случаев и гена pliC в 19±5,5% случаев.

В целях сопоставления получаемых данных с работами других авторов (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004) нами было проведено сравнение наличия генов ингибиторов лизоцима с плазмидным профилем и исследуемыми фено-типическими параметрами: профилем антибиотикорезистентности и уровнем АЛА. Среди исследуемых штаммов энтеробактерий плазмиды в диапазоне до 30 тысяч н.п. чаще выделялись у полиантибиотикорезистентных штаммов Е. coli, которые показали наибольшее разнообразие резистоваров, тогда как все исследуемые штаммы клебсиелл имели устойчивость только к ампициллину, а сальмонеллы наличия антибиотикорезистентности не демонстрировали. В то же время корреляция наличия искомых генов с наличием малых плазмид и устойчивостью к антибиотикам не отмечена.

Табл. 1. Профиль распределения генетических детерминант ингибиторов лизоцима, эписом, антибиотикорезистентности и антилизоциманой активности среди исследуемых видов энтеробактерий._

Виды Гены секретируемых ингибиторов лизоцима Плазмидный профиль Фенотипические показатели

Семейство и локализация Частота выделения,% Диапазон длин, т.п.н. Частота выделения,% Резисто-профиль АЛА, мкг/мл*ОП

Е. coli ivyC, хромосома 96±3 10-30 32±6,6 Нерезистентные 1,9±0,2

93±6 5,5-10 24±6 Ампицил-линрезис-тентные

80±9 1,7-8 97±3 Полирезис -тентные

К. pneumoniae ivyC, хромосома 81±5,5 1,5-3 25±8 Ампицил-линрезис-тентные 3,4±0,1

ivy С, хромосома; pliC, плазмида 19±5,5 -200 (pliC*-мега-плазмида) 19±5,5 3,8±0,2

S. enterica pliC, хромосома 92±3,5 1,5-2,5 30±6,5 Нерезистентные 4,0±0,3

С целью выявления вклада секретируемых ингибиторов в общий уровень антилизоцимной активности, было проведено определение выраженности АЛА у групп штаммов энтеробактерий с различным профилем генов как стандартным чашечным так и фотометрическим методом, и осуществлен анализ сорб-ционного компонента АЛА.

Так, при использовании чашечного метода (рис. 4А) оказалось, что ivyC-негативные штаммы Е. coli показали наиболее низкий уровень антилизоцимной активности (0,3±0,25 мкг/мл), который достоверно не отличался от уровня АЛА у /vyC-положительных штаммов Е. coli (1±0,7 мкг/мл). В случае оппозитных по наличию гена ivyC клебсиелл наблюдалась обратная картина, также не выявляющая достоверных отличий между группой /vyC-негативных К. pneumoniae (2,7±0,9 мкг/мл) и /vyC-позитивных штаммов (1,4±0,6 мкг/мл).

Напротив, штаммы К. pneumoniae, несущие плазмидный гомолог гена pliC, а также сальмонеллы, обладающие геном pliC хромосомной локализации продемонстрировали более высокий уровень исследуемого признака: 5,6±0,9 мкг/мл.

При использовании фотометрического метода определения антилизоцимной активности в супернатанте исследуемых культур (рис. 4В) выявлена сходная картина, однако разница значений определяемого признака была несколько ниже: антилизоцимная активность изученных штаммов Е. coli не зависимо от наличия гена ivyC не превышала значения 2 мкг/мл*ОП, тогда как средние значения данного показателя в случае штаммов клебсиелл и сальмонелл колебался в пределах от 3,4 до 4,5 мкг/мл*ОП, что может свидетельствовать о наличии в супернатанте культур исследуемых видов энтеробактерий ряда неспецифических факторов, влияющих на ферментативную активность лизоцима (Петровский A.C., 2009). Тем не менее, наиболее высокий уровень АЛА также наблюдался у S. enterica (4±0,35 мкг/мл*ОП).

Таким образом, наличие гена ivyC у исследованных штаммов не было сопряжено с высокими значениями АЛА, тогда как наличие плазмидного гена pliC у клебсиелл и сальмонелл соотносилось с высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.

Выявленные различия в уровне антилизоцимной активности штаммов, отличающихся по наличию гена pliC плазмидной локализации и отсутствие существенного снижения данного фенотипического признака среди ivyC- отрицательных штаммов Е. coli и К. pneumoniae подтверждает предположение о ведущей роли гена pliC в дистантном ингибировании лизоцима, особенно если

7 6 5 4

3 -2 -1 О

J±L

Е. coli ivyC- Е. coli ivyC+ К. К. К. S. enterica S. enterica

pneumoniae pneumoniae pneumoniae pliC- pliC+

ivyC- pliC- ivyC+ pliC- pliC+ ivyC+

4,5

3,5

с; 2,5

1,5

0,5

E. coli ivyC- E. coli ivyC+

К. К. K. S. enterica S. enterica

pneumoniae pneumoniae pneumoniae pliC- pliC+

ivyC- pliC- ivyC+ pliC- pliC+ ivyC+

Рис. 4. Уровни антилизоцимной активности исследуемых вариантов энтеро-бактерий, измеренные чашечным (А) и фотометрическим (В) методом. По оси ординат: уровень антилизоцимной активности. По оси абсцисс, справа налево:

/VyC-негативные штаммы Е. coli, ¿vyC-позитивные штаммы Е. coli, /vyC-негативные штаммы К. pneumoniae (без плазмидного гена pliC), /vyC-позитивные штаммы К. pneumoniae (без плазмидного гена pliC), ivyC и р/г'С-позитивные штаммы К. pneumoniae, р//С-позитивные штаммы S. enterica

* - достоверное отличие значений АЛА у штаммов-носителей генов ivyC или от значений, полученных для ¡'vyC/p/гС-негативных вариантов того же вида (р<0,05).

принять во внимание тот факт, что молекулярная масса белка РИС, кодируемого плазмидой вирулентности К. pneumoniae, более чем в 1,5 раза меньше (9,5 кДа), чем у IvyC а, следовательно, увеличивается возможность к выходу белка РИС в межклеточную среду из периплазматического пространства и более свободной диффузии в ней, где его наличие и фиксируется существующими методами как антилизоцимная активность.

Анализ сорбционного компонента антилизоцимной активности был осуществлен с целью верификации того факта, что значения АЛА, определенные чашечным методом обнаруживают секретируемый компонент данного признака. Существенных изменений активности лизоцима после соинкубирования его с бактериальной массой исследуемых штаммов с помощью данного метода не выявлено.

В результате скрининга лизоцимрезистентности в комбинированной среде установлено, что МПК лизоцима у исследуемых штаммов энтеробактерий не зависела от наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима и наблюдалась только у штаммов, принадлежащих к виду Klebsiella pneumoniae.

Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемых видов энтеробактерий с различным профилем генов секретируемых ингибиторов лизоцима (рис. 5А) выявило наиболее существенное изменение признака под воздействием данных препаратов у штаммов S. enterica и К. pneumoniae, содержащих гомологи генаpliC и менее выраженную динамику исходных значений антилизоцимной активности энтеробактерий, содержащих в генотипе только гомологи гена ivyC.

Проведенное на заключительном этапе работы исследование динамики копийности плазмид и антилизоцимной активности в присутствии вышеуказанных плазмид-ассоциированных регуляторных факторов у штаммов Е. coli 252 и К. pneumoniae 278 и 275 (рис. 5В) показало нарастание числа копий пДНК с увеличением концентрации хлорамфеникола до бактериостатической в 1,3 раза.

Исследование динамики показателя у указанных штаммов под воздействием акридинового оранжевого выявило снижение копийности плазмид вплоть до полного отсутствия регистрируемых количеств пДНК уже при достижении начальной ингибиторной концентрации препарата.

Рис. 5. Влияние субингибиторных конценттраций акридинового оранжевого и (АО) хлорамфеникола (ХФ) на уровень антилизоцимной активности исследуемых энтеробактерий(А) и копийность плазмид штаммов К. pneumoniae 275 и 278 (В).

По оси ординат: удельное количество плазмид на бактериальную клетку (А) и уровень антилизоцимной активности (В); По оси абсцисс, справа налево значения параметров после культивирования в среде с добавлением: 1 -кратной НИК акридинового оранжевого (1 х НИК АО) 0,5-кратной НИК акридинового оранжевого (0,5х НИК АО) без добавления препаратов (контроль) 0,5-кратной МПК хлорамфеникола (0,5х МПК ХФ) 1-кратной МПК хлорамфеникола (1х МПК ХФ)

Однако вторичное исследование получаемых клонов показывало сохранность плазмид в бактериальных клетках, что свидетельствовало об адаптиро-ванности штамма бактерии-хозяина к наличию плазмид с ослабленным контролем репликации (Bouma J.E., Lenski R.E., 1988).

Внесение в среду культивирования акридонуксусной кислоты в виде препарата «Циклоферон» в концентрации до 5 мг/мл не вызывало значимого изменения количества плазмид.

Определение динамики антилизоцимной активности исследуемого штамма при действии акридинового оранжевого выявило сходную картину: при повышении концентрации акридинового оранжевого до уровня начальной инги-бирующей концентрации происходило уменьшение уровня антилизоцимной активности до нулевых значений. Под действием препарата «Циклоферон» также наблюдалось снижение значений антилизоцимного признака вплоть до полного его отсутствия.

Ингибирование числа копий плазмидной ДНК и уровня антилизоцимной активности под действием акридинового оранжевого и повышение данных показателей после воздействия хлорамфеникола у исследованных штаммов не зависимо от видовой принадлежности и плазмидного профиля, а также при наличии генов секретируемых ингибиторов лизоцима любого из двух известных типов подводит к выводу о комплексном характере действия исследуемых препаратов на различные анаболические системы бактериальной клетки, которое реализуется, возможно, через неспецифическое изменение интенсивности синтеза и деградации нуклеиновых кислот трансляционной машины (J Midgley., W.Gray, 1971; V. Shen, Н. Bremer, 1977).

Уменьшение уровня антилизоцимной активности под действием «Цикло-ферона» при отсутствии влияния его на копийность плазмид показывает, что механизм регуляции персистентных свойств препаратом «Циклоферон» находится не на уровне генотипа и не может быть обусловлен уменьшением «дозы генов», локализующихся в плазмидах с нестрогим контролем репликации.

зрения характеристики конкретных секретируемых ингибиторов семейства ivyC, основной пул которого локализуется в периплазматическом пространстве энтеробактерии, и семейства pliC, зависимость продукции которого от стресс-регуляторной системы Res до настоящего момента не показана.

Таким образом, результаты проведённой работы позволили выделить три основных момента:

Антилизоцимная активность энтеробактерий является частью общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов и определяется наличием генов секретируемых ингибиторов лизоцима.

Применение молекулярно-генетического подхода в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР позволяет выявлять гены секретируемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.

Проведенный анализ демонстрирует, что наличие гена ivyC у исследованных штаммов энтеробактерий не сопряжено с высоким уровнем АЛА, тогда как наличие гена pliC (как хромосомной, так и плазмидной локализации) соотносилось с высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.

ВЫВОДЫ:

1. Филогенетический анализ генов ivyC и pliC среди известных геномов проте-обактерий указывает на высокую долю горизонтального пути распространения его гомологов на субвидовом уровне.

2. Выявлены консервативные фрагменты последовательностей генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима и осуществлен подбор праймеров видоспецифичного диапазона для выявления генов pliC и ivy С.

3.Хромосомные гены ivyC E.coli и pliC S.enterica имеют высокую пенетрант-ность (св. 90%). Распространенность данных генов среди вида К. pneumoniae высоковариабельна.

4. Исходно высокий уровень АЛА стабильно проявляется у штаммов, имеющих ген pliC как хромосомной, так и плазмидной локализации.

5.р//С-позитивные штаммы показали более выраженное изменение антилизо-цимного признака под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого.

6.Лизоцимрезистентность энтеробактерий является преимущественно видовым признаком и определяется несекретируемыми механизмами.

Список публикаций:

1. Андрющенко C.B. Увеличение копийности плазмидной ДНК как возможный механизм усиления антилизоцимного признака бактерий под действием хло-рамфеникола / C.B. Андрющенко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011. №6. -С. 8-13.

2. Андрющенко C.B. Действие неспецифических модификаторов копийности плазмидной ДНК на антилизоцимную активность Е. coli / C.B. Андрющенко // Вестник уральской медицинской академической науки, 2011. №4/1 - С. 18

3. Андрющенко C.B. Действие соединений акридонового ряда на уровень ан-тилизоцимной активности и копийность плазмидной ДНК штамма Е. coli 252. / C.B. Андрющенко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, О.В. Бухарин // Медицинская наука и образование Урала, 2012. №1. - С. 45-47.

4. Перунова Н.Б. Генетические детерминанты секретируемых ингибиторов ли-зоцима и антилизоцимный фенотип энтеробактерий / Н.Б. Перунова, C.B. Андрющенко, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №6. - С. 8-13.

Список сокращений:

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute (Институт клинической и лабораторной стандартизации)

ivyC - inhibitor of vertebrate lysozyme type С (ингибитор лизоцима позвоночных типа С)

pliC - periplasmic inhibitor of c-type lysozyme (периплазматический ингибитор лизоцима типа С)

mliC - membrane bound inhibitor of c-type lysozyme (мембраносвязанный ингибитор лизоцима типа С) АЛА — антилизоцимная активность АЛфА - антилактоферриновая активность МПК - минимальная подавляющая концентрация НИК - начальная ингибирующая концентрация пДНК - плазмидная ДНК ПМО — показатель микробной обсеменённости УПМ — условно-патогенные микроорганизмы

Андрющенко Сергей Валерьевич

Генетические детерминанты специфических

секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оригинал-макет подготовлен в программе Microsoft Office Word 2003 Подписано в печать 15.11.2012 Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Андрющенко, Сергей Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЛИЗОЦИМ-РЕЗИСТЕНТНОСТИ И АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Неспецифические механизмы лизоцимрезистентности бактерий

1.1.1. Экранирование пептидогликана

1.1.2. Модификация пептидогликана

1.1.3. Секреция неспецифических ингибиторов

1.2. Специфические ингибиторы лизоцима белковой природы

1.2.1. Анионный термостабильный ингибитор

1.2.2. Ингибитор лизоцима позвоночных

1.2.3. Периплазматический и мембраносвязанный ингибиторы лизоцима

1.3. Регуляция продукции специфических ингибиторов лизоцима

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе

2.2. Методы исследования профиля генетических детерминант ингибиторов лизоцима у исследуемых энтеробактерий

2.2.1. Методы и средства, использованные для филогенетического анализа и конструирования специфичных праймеров генетических детерминант ингибиторов лизоцима

2.2.2. Метод ПЦР-скрининга генетических детерминант ингибиторов лизоцима

2.2.3. Методики анализа плазмидной ДНК

2.3. Методы изучения ряда биологических свойств энтеробактерий

2.3.1. Определение профиля антибиотикорезистентности

2.3.2. Метод выявления лизоцимрезистентности энтеробактерий

2.3.3. Определение уровня антилизоцимной активности

2.3.3.1. Чашечный метод

2.3.3.2. Фотометрический метод

2.3.3.3. Метод определения сорбционного компонента АЛА

2.4. Способы регуляции антилизоцимной активности бактерий

2.4.1. Методы стимуляции антилизоцимной активности

2.4.2. Методы ингибирования антилизоцимной активности

2.5. Методы статистической обработки полученных результатов

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИНГИБИТОРОВ ЛИЗОЦИМА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

3.1. Анализ последовательностей гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима

3.2. Филогенетический анализ геноврИС и /ууС энтеробактерий

3.3. Конструирование ПЦР тест-систем для выявления генов секретируемых ингибиторов лизоцима

3.4. Анализ распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима

3.5. Анализ плазмидного профиля исследуемых штаммов энтеробактерий

ГЛАВА 4. ЛИЗОЦИМРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И АНТИЛИЗО-ЦИМНАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ

ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ 65 4.1. Общая антилизоцимная активность энтеробактерий, чашечный метод)

4.2. Характеристика экскретируемого компонента антилизоцимной активности энтеробактерий (фотометрический метод)

4.3. Характеристика сорбционного компонента антилизоцимной активности энтеробактерий, (фотометрический метод)

4.4. Скрининг лизоцимрезистентности энтеробактерий в комбинированной среде

ГЛАВА 5. РЕГУЛЯЦИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИМ ПРОФИЛЕМ

5.1. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. coli, отличающихся по плазмидному профилю под действием хлорамфеникола

5.2. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. coli, отличающихся по плазмидному профилю под действием акридоновых соединений

5.3. Изменение антилизоцимной активности у энтеробактерий, отличающихся по присутствию pliC-мегаплазмид под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого

5.4. Влияние пептидогликанового стресса на уровень антилизоцимной активности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий"

Актуальность работы. В настоящее время у бактерий различных таксономических групп выявлены как специфические, так и неспецифические механизмы, обеспечивающие либо пассивную устойчивость к лизо-циму, либо активное ингибирование его гидролитического эффекта (Callewaert L. et al., 2008). Антилизоцимная активность, являясь одним из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий, отражает главным образом способность клетки к продукции экскретируе-мых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Бухарин О.В., 1999). В ходе работ по выявлению механизмов анти-лизоцимной активности на примере как грамположительных бактерий рода Bacillus (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004), так и грамотрицатель-ных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (Бондаренко В.М. и др., 1994) было установлено, что генетические детерминанты данного признака имеют плазмидную локализацию.

Вместе с тем, в зарубежной литературе рассматривается феномен устойчивости к лизоциму штаммов-продуцентов, кодирующийся у энтеро-бактерий двумя семействами генов: ivyC и pliChnliC (Deckers D. et al., 2008). Функционально-полноценные гомологи гена ivyC среди гамма-протеобактерий распространены достаточно широко и встречаются в хромосомах ряда условно-патогенных микроорганизмов родов Escherichia/ Shigella, Erwinia, Klebsiella, Yersinia и Pseudomonas. Однако у бактерий рода Salmonella гомологи данного гена не выявлены (Abergel С., Monchois V.et al., 2007). Второе семейство белков-ингибиторов, существующее у микроорганизмов рода Salmonella было обнаружено несколько позже: РИС/МПС, периплазматический вариант которого кодируется также в хромосомах представителей родов Salmonella и Pseudomonas (Callewaert L. et al., 2008).

Известно, что продукт гена mliC является мембраносвязанным белком, тогда как у белков РИС и IvyC показана периплазматическая локализация (Callewaert L. et al., 2008). Не смотря на то, что не исключена возможность выхода молекул двух последних типов белков за пределы наружной мембраны грамотрицательной клетки-продуцента, где их ингиби-рующий эффект и может быть реализован в виде антилизоцимной активности, в существующих исследованиях данных белков дистантный аспект их ингибирующего эффекта не анализируется.

После завершения проектов по секвенированию геномов патогенных вариантов К. pneumoniae (Wu К.М. et al., 2011), одна из открытых рамок считывания в нуклеотидных последовательностях плазмид вирулентности была аннотирована как гомолог pliC. Этот факт открыл новый путь к объединению существующих подходов по исследованию механизмов как лизо-цимрезистентности, так и антилизоцимной активности микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

2. Оценить распространенность известных генетических детерминант сек-ретируемых ингибиторов лизоцима у микроорганизмов видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica и определить плазмидный профиль исследуемых штаммов энтеробактерий.

4. Выявить изменение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий, различающихся по плазмидному профилю под воздействием неспецифических модификаторов копийности плазмидной ДНК.

Новизна исследования. Проведенный филогенетический анализ внутри- и межвидового распространения генов секретируемых ингибиторов лизоцима pliC и ivyC среди условно-патогенных и патогенных энтеро-бактерий показал высокую частоту случаев горизонтального пути переноса данных генов среди известных геномов различных сероваров Е. coli, S. enterica и К. pneumoniae.

Выявлено наличие хромосомных генетических детерминант исследуемых секретируемых ингибиторов лизоцима среди большинства исследованных штаммов Е. coli и S. enterica, а также вариабельность встречаемости хромосомного гена ivyC и плазмидного гомолога гена pliC у К. pneumoniae.

Суббактериостатические концентрации хлорамфеникола вызывают повышение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий при наличии генетических детерминант ингибиторов лизоцима семейства pliC, и, в меньшей степени, ivyC, как плазмидной, так и хромосомной локализации. Напротив, культивирование исследуемых штаммов энтеробактерий в присутствии акридоновых соединений (акридинового оранжевого и акридонуксусной кислоты) в субингибиторных концентрациях приводит к снижению антилизоцимной активности.

Установлено, что наличие в среде культивирования акридонуксусной кислоты не оказывает влияния на копийность плазмидной ДНК энтеробак-терий при выраженном подавлении антилизоцимной активности по сравнению с акридиновым оранжевым.

Культивирование энтеробактерий в условиях пептидогликанового стресса субингибиторными концентрациями ß-лактамного антибиотика не приводило к повышению антилизоцимной активности микроорганизмов, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния регуляторной системы Res на фенотипическое проявление данного признака.

Практическая ценность работы. Выявленные консервативные фрагменты нуклеотидных последовательностей генов ингибиторов лизо-цима позволили создать олигонуклеотидные зонды и праймеры широкой специфичности, на основе которых разработана экспериментальная ПЦР тест-система для скрининга генов секретируемых ингибиторов лизоцима с учетом возможной функциональной полноценности и вариабельности выявляемых последовательностей.

Положения, выносимые на защиту: 1. Антилизоцимная активность энтеробактерий - часть общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов, обусловленная генами экс-кретируемых ингибиторов лизоцима.

2. Молекулярно-генетический подход в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР выявляет гены секрети-руемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); VII Всероссийской конференции «Перси-стенция микроорганизмов» (Оренбург, 2012).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Андрющенко, Сергей Валерьевич

ВЫВОДЫ:

1. Филогенетический анализ генов ivy С и pliC среди известных геномов протеобактерий указывает на высокую долю горизонтального пути распространения его гомологов на субвидовом уровне.

3. Хромосомные гены ivy С E.coli и pliC S. enter ica имеют высокую пенет-рантность (св. 90%). Распространенность данных генов среди вида К. pneumoniae высоковариабельна.

4. Исходно высокий уровень антилизоцимной активности стабильно проявляется у штаммов, имеющих ген pliC как хромосомной, так и плазмид-ной локализации.

5.Установлено, что /?/г'С-позитивные штаммы показали более выраженное изменение антилизоцимного признака под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лизоцим был открыт в 1921 году Александром Флемингом и в течение последующих 80 лет этот белок играл важнейшую роль как модельный фермент во многих разделах современной биологии, включая химию белка, кристаллографию, ядерный магнитный резонанс, энзимологию и иммунологию. Вместе с тем, важнейшим условием выживания бактерий во многих биотопах тела человека является устойчивость к лизоциму С-типа.

Антилизоцимная активность, как один из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий, отражает главным образом способность клетки к продукции экскретируемых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Бухарин, О.В., 1999). В ходе работ по выявлению наиболее общих механизмов антилизоцимной активности на примере как грамположительных бактерий рода Bacillus (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004), так и энтеробактерий (Бондаренко В.М. и др., 1994) было установлено, что генетические детерминанты данного признака имеют плазмидную локализацию.

Старт детализированного изучения молекулярно-генетических механизмов проблемы устойчивости бактерий к действию лизоцима отмечается только с 2001 года, когда был открыт первый специфичный белок-ингибитор лизоцима позвоночных, названный Ivy (Monchois, V., 2001) и кодируемый соответствующим хромосомным геном, выявленным у Е. coli и ряда других протеобактерий за исключением рода Salmonella (Abergel, С. 2007).

Второе семейство белков-ингибиторов - PliC/MliC - было выявлено несколько позже; периплазматический вариант которого - РИС -кодируется также в хромосомах протеобактерий, но выявляется главным образом у представителей родов Salmonella и Pseudomonas (Callewaert, L., 2008).

Вместе с тем, следует отметить, что в зарубежной литературе изучение данных генетических детерминант рассматривается только в контексте устойчивости к лизоциму самих штаммов-продуцентов. (Deckers D. et al., 2004)

К настоящему времени детально изучены механизмы, детерминируемые хромосомными генами: известно два семейства специфических и один неспецифический ингибитор лизоцима (Callewaert, L., 2008), выявлен механизм сочетанной индукции специфических ингибиторов обоих семейств через бактериальную внутриклеточную регуляторную систему Res в ответ на пептидогликановый стресс не зависимо от его природы (Callewaert L. et al, 2009). Изучены и другие механизмы лизоцимрезистентности: экранирование (Nikaido, H., 2003) и модификация (Pfeffer J.M., 2006; Hébert L., 2007) пептидогликана.

Таким образом, у бактерий различных таксономических групп выявлены как специфические, так и неспецифические механизмы, обеспечивающие либо пассивную устойчивость к лизоциму, либо активное ингибирование его гидролитического эффекта (Callewaert, L., 2008), однако все их генетические детерминанты имеют хромосомную локализаI цию.

Тем не менее, после завершения проектов по секвенированию геномов патогенных вариантов К. pneumoniae (Wu K.M. et al., 2011), одна из открытых рамок считывания в нуклеотидных последовательностях плазмид вирулентности была аннотирована как гомолог pliC. Этот факт открыл новый путь к объединению существующих подходов по исследованию механизмов как лизоцимрезистентности, так и антилизоцимной активности микроорганизмов.

В настоящей работе предпринята попытка определить взаимосвязь генетических детерминант ингибиторов лизоцима с антилизоцимным фенотипом энтеробактерий. Для достижения данной цели мы провели анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов энтеробактерий, кодирующих секретируемые ингибиторы лизоцима, оценили распространенность известных генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима у микроорганизмов видов Е. coli, К. pneumoniae, S. enterica и определили плазмидный профиль исследуемых штаммов энтеробактерий; изучили антилизоцимную активность исследуемых микроорганизмов с разным профилем наличия генов ингибиторов лизоцима и выявили изменение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий, различающихся по наличию генетических детерминант ингибиторов лизоцима под воздействием неспецифических модификаторов копийности плаз-мидной ДНК.

На первом этапе, при первичном сопоставлении известных последовательностей генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима нами было обнаружено, что новооткрытый плазмидный гомолог гена pliC клебсиелл имеет большое число расхождений в последовательности нуклеотидов с уже изученным хромомсомным гомологом гена pliC сальмонелл. Тем не менее, сопоставление производных аминокислотных последовательностей и их последующий анализ показал, что ключевые параметры полипептида, кодируемого плазмидой вирулентности К. pneumoniae: наличие функционально-критичных аминокислот в активном центре и отщепляемого сигнального пептида, обеспечивающего секретируемый характер белка, оказались сохранными. Что дало нам основания включить данную плазмидную детерминанту в цикл экспериментальных работ наряду с хромосомными детерминантами.

Выполненный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей показал преобладание невертикального пути переноса генов pliC и ivyC между подвидами и сероварами внутри рассматриваемых видов и в ряде случаев - между близкородственными видами К. pneumoniae и К. variicola. Этот факт свидетельствует в пользу положения о том, что исследуемые генетические детерминанты входят во внутривидовые и надви-довые пулы генов, имеющих важное адаптивное значение для их носителей.

Для достижения данной цели мы использовали 150 штаммов энтеро-бактерий: по 50 культур негемолитических Е. coli, 50 штаммов К. pneumoniae, изолированных из испражнений пациентов с I - II степенью дисбиоза кишечника и 50 вариантов S. enterica, выделенных от больных острой кишечной инфекцией и реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей. Все полученные штаммы были идентифицированы по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам.

ПЦР-скрининг хромосомных генов секретируемых ингибиторов лизо-цима показал высокую распространенность как гена ivyC у штаммов Е. coli, являющихся представителями нормофлоры кишечника человека, так и pliC у вариантов S. enterica - возбудителей сальмонеллеза.

В то же время распространенность как хромосомного гена ivyC, так и гена рНС плазмидной локализации у исследуемых штаммов К. pneumoniae, показал значительную вариабельность наличия данных генетических детерминант, что позволило выделить как /ууС-/?//С-позитивные варианты, так и демонстрирующие негативный результат при выявлении обоих генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима. Этот факт, вероятно, может быть объяснен как наличием дополнительных механизмов лизоцимрезистентности, так и широкой вариабельностью патогенного потенциала данного вида. Кроме того, плазмидный вариант гена pliC также был выявлен у штамма К. pneumoniae 278, описанного ранее как продуцент ингибитора лизоцима (Бухарин О.В. с соавт., 2008), демонстрирующего высокий уровень АЛА.

Таким образом, на первом этапе работы, с одной стороны, было обнаружено широкое распространение хромосомных генов ivyC и pliC, что подтвердило их конститутивность для видов Е. coli и S. enterica, с другой, были выявлены и ivyC- и /?//С-негативные штаммы, ставшие материалом для групп сравнения на последующих этапах работы.

Принимая во внимание существующие данные литературы о существенно более высоком уровне антилизоцимной активности у сальмонелл, продуцирующих только ингибитор РИС по сравнению с Е. coli, способными секретировать только белок-ингибитор IvyC, а также обнаружение плазмидного варианта гена pliC у штамма К. pneumoniae 278, проявляющего высокий уровень антилизоцимной активности позволил предположить более существенный вклад белка РИС в уровень антилизоцимной активности как комплексного фенотипического признака.

Данное предположение было подтверждено в результате проведенного на следующем этапе исследования антилизоцимного фенотипа у штаммов с различным профилем наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима. Так, было показано, что присутствие в геноме гомологов гена ivyC у исследованных штаммов Е. coli соответствует уровню антилизоцимной активности, не превышавшему 2 мкг/мл, тогда как присутствие гомологов данного гена в геноме К. pneumoniae не было сопряжено с уровнем АЛА и выявленные ivyC-негативные штаммы

К. pneumoniae демонстрировали такой же уровень признака как и ivyC-позитивные варианты. Штаммы Е. coli и S. enterica, не содержащие известных гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима показали минимальный уровень данного параметра, измеряемого как стандартным чашечным так и фотометрическим методом, тогда как наличие плазмидного гена pliC как у сальмонелл, так и у клебсиелл соотносилось с существенно более высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.

Анализ сорбционного компонента АЛА показал, что у энтеробактерий всех исследованных видов, не зависимо от наличия в их геноме гомологов одного либо другого известного гена секретируемого ингибитора лизоцима, данный фенотипический признак не различался и составлял в среднем 1,2±0,4 мкг/мл инактивированного лизоцима. Максимальные значения, демонстрируемые отдельным штаммами не превысили 2 мкг/мл инактивированного лизоцима.

Полученные данные подтверждают экскреторный характер различий исследуемого фенотипического признака, выявленных с использованием предыдущих методов и указывают на тот факт, что определение антилизоцимной активности у энтеробактерий исследуемых видов чашечным методом также отражает преимущественно экскреторный его компонент.

Попытка определения степени устойчивости к лизоциму штаммов, отличающихся по присутствию в геноме гомологов различных генов секретируемых ингибиторов лизоцима, выявила только межвидовые различия, продемонстрировав существенно более высокий уровень резистентности к комбинации «хелатор+лизоцим» у представителей вида К. pneumoniae не зависимо от наличия генов того или иного семейства ингибиторов лизоцима, что, возможно, связано со способностью к активной продукции секретируемых экзополисахаридов, характерной для большинства представителей этого вида. Это наблюдение подтверждает преимущество неспецифических механизмов для выживания энтеробактерий в лизоцимнасыщенной среде. С другой стороны, положительный результат по применению три-лона Б в качестве хелатора, повышающего проницаемость наружной мембраны энтеробактерий, подводит к возможности создания комбинированных сред для количественного определения лизоцимрезистентности и многих других соединений как биогенного, так и абиогенного происхождения, оказывающих повреждающее действие на наружную мембрану, но не вызывающих при этом денатурацию лизоцима.

Выявленные различия в уровне антилизоцимной активности штаммов, отличающихся по наличию гена pliC и отсутствие существенной разницы в данном фенотипическом признаке между zvyC-позитивными и ivyC-негативными штаммами Е. coli и К. pneumoniae подтверждает предположение о ведущей роли гена pliC в дистантном ингибировании лизоцима, особенно если принять во внимание тот факт, что молекулярная масса белка РИС, в 1,5 раза меньше (менее 10 кДа), чем у IvyC (15 кДа) а, следовательно, увеличивается возможность выхода белка РИС в межклеточную среду из периплазматического пространства и более свободного диффундирования в ней, где его наличие и фиксируется существующими методами как антилизоцимная активность.

Проведенное на заключительном этапе исследование динамики ко-пийности плазмид и антилизоцимной активности в присутствии вышеуказанных плазмид-ассоциированных регуляторных факторов у штаммов Е. coli 252 и К. pneumoniae 278 и 275 показало нарастание числа копий пДНК с увеличением концентрации хлорамфеникола до бактериостатиче-ской в 1,3 раза. Исследование динамики данного показателя у указанных штаммов под воздействием акридинового оранжевого показало снижение копийности плазмид вплоть до полного отсутствия регистрируемых количеств пДНК уже при достижении начальной ингибиторной концентрации препарата. Однако вторичное исследование получаемых клонов показывало сохранность плазмид в бактериальных клетках, что свидетельствовало об адаптированное™ штамма бактерии-хозяина к наличию плазмид с ослабленным контролем репликации (Bouma J.E., Lenski R.E., 1988; Гану-совВ.В., 2001).

Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемых видов энтеробактерий с различным профилем наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима выявило существенное изменение признака под воздействием данных препаратов только у штаммов S. enterica и К. pneumoniae, содержащих гомологи гена pliC и незначительную динамику исходных значений антилизоцимной активности энтеробактерий, содержащих в генотипе только гомологи гена ivyC. В то же время под воздействием циклоферона уровень антилизоцимной активности снижался у всех групп энтеробактерий до нулевых значений.

Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемого штамма при действии акридинового оранжевого выявило сходную картину: при повышении концентрации акридинового оранжевого до уровня начальной ингибирующей концентрации происходило уменьшение уровня антилизоцимной активности до нулевых значений. Под действием препарата «Циклоферон» также наблюдалось снижение значений антилизоцимного признака вплоть до полного его отсутствия.

Ингибирование числа копий плазмидной ДНК и уровня антилизоцим-ной активности под действием акридинового оранжевого и повышение данных показателей после воздействия хлорамфеникола у исследованных штаммов не зависимо от видовой принадлежности и плазмидного профиля, а также при наличии генов секретируемых ингибиторов лизоцима любого из двух известных типов подводит к выводу о комплексном действии исследуемых препаратов на различные анаболические системы бактериальной клетки, которое реализуется, возможно, через неспецифическое изменение интенесивности синтеза и деградации нуклеиновых кислот аппарата трансляции (J Midgley., W.Gray, 1971; V. Shen, Н. Bremer, 1977).

Уменьшение уровня антилизоцимной активности под действием «Циклоферона» при отсутствии влияния его на копийность плазмид показывает, что механизм регуляции персистентных свойств препаратом «Цик-лоферон» находится не на уровне генотипа и не может быть обусловлен уменьшением «дозы генов», локализующихся в плазмидах с нестрогим контролем репликации.

Попытка стимуляции секреции внеклеточных ингибиторов лизоцима методом пептидогликанового стресса, вызванного ß-лактамным антибиотиком, не привела к достоверному изменению выраженности антилизо-цимного признака, что согласуется с данными как ранних работ посвященных регуляции антилизоцимного фенотипа (В.Ю. Соколов, 1990, О.В. Бухарин, 1999), так и с точки зрения характеристики конкретных секретируемых ингибиторов семейства ivyC, основной пул которого локализуется в периплазматическом пространстве энтеробактерии, и семейства pliC, зависимость продукции которого от стресс-регуляторной системы Res не показана.

Таким образом, результаты проведённой работы позволили выделить три основных момента:

1. Антилизоцимная активность энтеробактерий является частью общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов и определяется наличием генов секретируемых ингибиторов лизоцима.

2. Применение молекулярно-генетического подхода в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР позволяет выявлять гены секретируемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.

3. Проведенный анализ демонстрирует, что наличие гена /ууС у исследованных штаммов энтеробактерий не сопряжено с высоким уровнем АЛА, тогда как наличие гена рИС (как хромосомной, так и плазмидной локализации) соотносится с высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Андрющенко, Сергей Валерьевич, Оренбург

1. Бондаренко, В.М. Антилизоцимный фактор Klebsiella pneumoniae: природа, биологические функции и генетический контроль / В.М. Бондаренко, В.Г. Петровская, А.Л. Яблочков // Журн. микробиол.- 1994-№1- С. 22-28.

2. Характеристика плазмиды Klebsiella pneumoniae, несущей маркеры лекарственной устойчивости и антилизоцимной активности / В.М. Бондаренко, А.Л. Яблочков, Ю.М. Романова и др. // Журн. микробиол 1988— №3.-С. 28-32.

3. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин; Екатеринбург, УрО РАН М.: Медицина. 1999 - 365 с.

4. Бухарин, О.В., Скрининг плазмид у бактерий рода Bacillus, обладающих антилизоцимной активностью / О.В. Бухарин, Д.А. Кириллов, В.А. Кириллов //Журн. микробиол -2006-№1-С. 3-6.

5. Влияние циклоферона на биологические свойства бактериальных внутриклеточных патогенов / О.В. Бухарин, Д.А. Кириллов, Н.В. Шеенков и др. // Журн. микробиол. 2005. - №3. - С. 8-10.

6. Ганусов, В.В. Популяционная динамика бактериальных плазмид / В.В. Ганусов, А.В. Брильков, Н.С.Печуркин // Математическое моделирование.-2001.-№13. С. 77-98.

7. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. / С. Гланц // М.: Практика, 1999.- 459 с.

8. Зыкова, Л.С. Этиологическая характеристика пиелонефрита и её значение для экспериментально-клинического обоснования антибактериальной терапии: автореф. дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / Л.С. Зыкова-Челябинск, 1986.-26 с.

9. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 480 с.

10. Петровский, А.С. Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций: автореферат дис. .канд. биол. наук: 03.01.06 / А.С. Петровский. Москва, 2012. - 20 с.

11. ПЦР "в реальном времени" // Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. М.: БИНОМ. - 2009. - 223 с.

12. Соколов, В. Ю. Механизм антилизоцимной активности бактерий: автореферат дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / В. Ю. Соколов. Челябинск, 1990.-22 с.

13. Фельдман, С.З., Клиническое значение факторов персистенции возбудителя при сальмонеллезной инфекции у детей / С.З. Фельдман, Ю.Д. Каган, Б.Я. Усвяцов, Л.И. Паршута // Журн. микробиол. 2003. - №4. - С. 59-60.

14. Чайникова, И.Н. Инфектологическая характеристика сальмонеллеза: автореф. дис . док. мед. наук: 03.00.07, 14.00.36 / И.Н. Чайникова. -Оренбург, 2006. 48 с.

15. Черкасов, С.В. Ассоциативный симбиоз как биологическая основа колонизационной резистентности хозяина: дис. . док. мед. наук: 03.02.03/ С.В. Черкасов. Оренбург, 2011. - 258с.

16. Structure and evolution of the Ivy protein family, unexpected lysozyme inhibitors in gram-negative bacteria / C. Abergel, V. Monchois, D. Byrne et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 2007. - №15. - P. 6394-6399.

17. Activation of the Salmonella Typhimurium Mrr protein / A. Aertsen, M. Tesfazgi, C.W. Michiels // Biochem Biophys Res Commun. 2008. -№2. -P. 435^439.

18. Akesson, P. Protein SIC, a Novel Extracellular Protein of Streptococcus pyogenes Interfering with Complement Function / P. Akesson, A. Sjoholm, LJ. Bjorck // Biol. Chem. USA 1996. - №271, P. 1081-1088.

19. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins / MM. Babu, M.L. Priya, A.T. Selvan et al. // J. Bacteriol. 2006. №188. - P. 2761-2773.

20. The peptide antibiotic LL-37 / hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial activity at the airway surface / R. Bals, X. Wang, M. Zasloff et al. 1998. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA -№95.-P. 9541-9546.

21. Attribution of the Various Inhibitory Actions of the Streptococcal Inhibitor of Complement (SIC) to Regions within the Molecule / M.J.Binks, B.A. Fernie-King, D.J. Seilly et al. // The Journal of Biological Chemistry. 2005. - V.280. - P. 20120-20125.

22. Structure and metal-dependent mechanism of peptidoglycan deacetylase, a streptococcal virulence factor / D.E. Blair, A.W. Schüttelkopf, J.I. MacRae et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA - 2005. - №43. - P. 15429-15434.

23. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 / F.R. Blattner, G. Plunkett, C.A. Bloch et al. // Science. USA - 1997. - №277. - P. 14531462.

24. Blundell, J.K. The peptidoglycan ofNeisseria gonorrhoeae: O-acetyl groups and lysozyme sensitivity. / J.K. Blundell,, G.J. Smith, H.R. Perkins // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - №9. - P. 259-261.

25. Boneca, I.G. The role of peptidoglycan in pathogenesis / I.G. Boneca // Cum Opin. Microbiol. 2005. - №8. - P. 46-53.

26. Bouma, J.E. Evolution of a bacteria/plasmid association / J.E. Bouma, R.E. Lenski //Nature. 1988. -№335. - P. 351-352.

27. Brock, T.D. Chloramphenicol. / T.D. Brock // Bacteriol Rev. 1961. №1. -P. 32-48.

28. Global Analysis of Extracytoplasmic Stress Signaling in Escherichia coli / S. Bury-Moné, Y. Nomane, N. Reymond et al. // PLoS Genet. 2009. -№9 P. 1640-1651.

29. Purification of Ivy, a lysozyme inhibitor from Escherichia coli, and characterisation of its specificity for various lysozymes / L. Callewaert, B. Masschalck, D. Deckers et al. // Enzyme Microb Technol. 2005. - №2. -P. 205-211.

30. A new family of lysozyme inhibitors contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria / L. Callewaert, A. Aertsen, D. Deckers et al.// PLoSPathog.- 2008.- №3.-P. 1000-1019.

31. Detection of a Lysozyme Inhibitor in Proteus mirabilis by a New Reverse Zymogram Method / L. Callewaert, L. Vanderkelen, D. Deckers et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2008. -№15. P.4978-4981.

32. The Res Two-Component System Regulates Expression of Lysozyme Inhibitors and Is Induced by Exposure to Lysozyme / L. Callewaert, K.G.A. Vanoirbeek, I. Lurquin et al. // Bacteriol. 2009. - №6. - P. 19791981.

33. Canny, G.O. Bacteria in the Intestine, Helpful Residents or Enemies from Within? / G.O. Canny, B.A. McCormick // Infect Immun. 2008. - №8. -P. 3360-3373.

34. Sequencing and analysis of the large virulence plasmid pLVPK of Klebsiella pneumoniae CG43 / Y.T. Chen, H.Y. Chang, Y.C. Lai et al. // Gene. 2004. - №4. - P. 189-198.

35. Advances in the modulation of microbial ecology of the gut in early infancy / R. Chierici, S. Fanaro, D. Saccomandi et al. // Acta Paediatr. Suppl. -2003.- №91.-P. 56-63.

36. Clarke, A. 0-aeetylated peptidoglycan: its occurence, pathobiological significance, and biosynthesis / A. Clarke, C. Dupont // Can. J. Microbiol. -1992.- №38.-P. 85-91.

37. Clarke, A. Pathways for the O-acetylation of bacterial cell wall polymers / A.J. Clarke, H. Strating, N.T. Blackburn. N.Y.: Plenum Publishing Co., 2000.-P. 187-223.

38. Courvalin, P. Genetics of glycopeptide resistance in gram-positive pathogens. / P. Courvalin // Int. J. Med. Microbiol. 2005. - №294. P. 479- 486.

39. Factors affecting plasmid production in Escherichia colifrom a resource allocation standpoint / D.S. Cunningham, R.R. Koepsel, M.M. Ataai et al. // Microb Cell Fact. 2009. - №8 P. 18-27.

40. Dupont, C. Dependence of lysozyme catalyzed solubilization of Proteus mirabilis peptidoglycan on the extent of O-acetylation / C. Dupont,

41. A.J. Clarke// Eur. J. Biochem. -1991.-№195.-P. 763-769.

42. Recent advances in carbohydrate bioengineering / H.J. Gilbert, G. Davies,

43. B. Henrissat, et al. Cambridge, United Kingdom: The Royal Society of Chemistry, 1999.- 312 p.

44. Daigle, F. Identification of Salmonella typhi genes expressed within macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS) / F. Daigle, J.E. Graham, R. Curtis // Mol. Microbiol. 2001. - №5. - P. 12111222.

45. Periplasmic lysozyme inhibitor contributes to lysozyme resistance in Escherichia coli / D. Deckers, B. Masschalck, A. Aertsen et al. // Cell Mol. Life Sci.-2004.-№10.-P. 1229-1237.

46. The non-enzymatic microbicidal activity of lysozymes / K. Düring, P. Porsch, A. Mahn et al. // FEBS Letters. 1999. - №449 P. 93-100.

47. Ellison, R.T. Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme / R.T. Ellison, T. J. Giehl //J. Clin. Investig. 1991. -№88. P. 1080-1091.

48. Lactoferrin and transferrin damage of the gram-negative outer membrane is modulated by Ca2+ and Mg2+ / R.T. Ellison, F.M. LaForce, T. Giehl, et al. // J. Gen. Microbiol. 1990. - №136. - P. 1437-1446.

49. Erickson, K.D. The Res phosphorelay system is specific to enteric pathogens/commensals and activates ydel, a gene important for persistent Salmonella infection of mice / K.D. Erickson, C.S. Detweiler // Mol. Microbiol. 2006. - P. 62883-62894.

50. Streptococcal inhibitor of complement (SIC) inhibits the membrane attack complex by preventing uptake of C567 onto cell membranes / Fernie-King, B. A., Seilly, D. J., Willers, C. et al. // Immunology. 2001. -№103, P.390-398.

51. Foster, T.J. Plasmid-Determined Resistance to Antimicrobial Drugs and Toxic Metal Ions in Bacteria / T.J. Foster // Microbiological Rev. 1983. -№3.-P. 361-409.

52. Franken, C. Tissue distribution of antileukoprotease and lysozyme in humans / C. Franken, C.J.M. Meijer, J.H. Dijkman. // J. Histochem. Cytochem. 1989. - №37 - P. 493-498.

53. Ganz, T. Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia / T. Ganz, J. Weiss. Semin. Hematol. - 1997. - №34 - P. 343-354.

54. Garcia, R. 2005. A review of the possible role of oral and dental colonization on the occurrence of health care-associated pneumonia: underappreciated risk and a call for interventions / R. Garcia // Am. J. Infect. Control. -2005.-№33.-P. 527-541.

55. Gaynes, R. Overview of nosocomial infections caused by gram-negative bacilli. / R. Gaynes, J.R. Edwards //Clin. Infect. Dis. -2005. №41. -P. 848-854.

56. GenBank Электронный ресурс.: genetic sequence database / National Library of Medicine. Электрон, база данных. - NCBI, США. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

57. Germaine, G.R. Simple and rapid procedure for the selective removal of lysozyme from human saliva / G.R. Germaine, L.M. Tellefson. // Infect. Immun. 1979. - №26. - P. 991-995.

58. Grinde, B. A lysozyme isolated from rainbow trout acts on mastitis pathogens. / Grinde, B. // FEMS Microbiol Lett. 1989. - №2. - P. 179-182.

59. Grossowicz, N. Methods for determination of lysozyme activity / N. Grossowicz, M. Ariel // Methods Biochem. Anal. 1983. -№29. - P. 435446.

60. Characterization of the Salmonella typhimurium pagC/pagD chromosomal region /J.S. Gunn, C.M. Alpuche-Aranda, W.P. Loomis et al. // J. Bacterid. 1995.-№17.-P. 5040-5047.

61. Hartas, J. Streptococcus pyogenes strains containing emml2 and emm55 possess a novel gene coding for distantly related SIC protein / J. Hartas, K.S. Sriprakash // Microb. Pathog. 1999. - №26. - P. 25-33.

62. Enterococcus faecalis Constitutes an Unusual Bacterial Model in Lysozyme Resistance / L. Hébert, P. Courtin, R. Torelli et al. // Infect. Immun. 2007. -№11.-P. 5390-5398.

63. Heukeshoven, J. Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit: Staining of sodium dodecyl sulfate gels / J. Heukeshoven, R. Dernick // Electrophoresis. 1988. - №9. - P. 28-32.

64. Nikaido, H. Molecular Basis of Bacterial Outer Membrane Permeability Revisited / H. Nikaido // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - №4. -P. 593-656.

65. Huang, Y.-H. The role of the Res phosphorelay in Enterobacteriaceae / Y.-H. Huang, L. Ferrières, D. J. Clarke //Res. Microbiol. -2006. №157. -P. 206-212.

66. Processing of lysozyme at distinct loops by pepsin: a novel action for generating multiple antimicrobial peptide motifs in the newborn stomach / H.R. Ibrahim, D. Inazaki, A. Abdou et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2005.-№1726.-P. 102-114.

67. Ibrahim, H.R. Ovotransferrin antimicrobial peptide (OTAP-92) kills bacteria through a membrane damage mechanism / H.R. Ibrahim, Y. Sugimoto, T. Aoki // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - №1523. - P. 196-205.

68. Amino acid sequences of lysozymes newly purified from invertebrates implay wide distribution of a novel class in the lysozyme family / Y. Ito, A. Yoshikawa, I. Hotani et al. // Eur. J. Biochem. 1999. - №259. -P. 456-461.

69. Johanson, W.G. Changing pharyngeal bacterial flora of hospitalized patients. Emergence of gram-negative bacilli / W.G. Johanson, A.K. Pierce, J.P. Sanford. //N. Engl. J. Med. 1969. -№281. -P. 1137-1140.

70. Systematic Mutagenesis of the Escherichia coli Genome / Y. Kang, T. Durfee, J.D. Glasner et al. // J. Bacteriol. 2004. - №15. - P. 4921^1930.

71. Kaufmann, E. SDS-PAGE strongly overestimates the molecular masses of the neurofilament proteins / E. Kaufmann, N. Geisler, K. Weber // FEBS Lett. 1984.-№1.-P. 81-84.

72. Structural evidence for lack of inhibition of fish goose-type lysozymes by a bacterial inhibitor of lysozyme / P. Kyomuhendo, I.W. Nilsen, B.O. Brandsdal et al. // Springer-Verlag. 2008. - №1007. P. 309-317.

73. Laemmli, M. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4 / Laemmli, M. // Nature. 1970. - №227 - P.680-685.

74. Lam H-M, Winkler ME. Characterization of the complex pdxH-tyrS operon of Escherichia coli K-12 and pleiotropic phenotypes caused by pdxH insertion mutations. J Bacteriol. 1992;174:6033-6045.

75. Laubacher, M.E. The Res phosphorelay is a cell envelope stress response activated by peptidoglycan stress and contributes to intrinsic antibiotic resistance / M.E. Laubacher, S.E. Ades //J. Bacteriol. -2008. №190. -P. 2065-2074.

76. Pseudomonas aeruginosa and the oropharyngeal ecosystem of tube-fed patients / A. Leibovitz, M. Dan, J. Zinger et al. // Emerg. Infect. Dis. 2003. - №9. - P. 956-959.

77. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAOl: a tool for identifying differentially regulated genes

78. S. Lewenza, R.K. Falsafi, G. Winsor, et al. // Genome Res. -2005. -№15.-P. 583-589.

79. Molecular Basis of Bacterial Defense against Host Lysozymes: X-ray Structures of Periplasmic Lysozyme Inhibitors PHI and PliC / S. Leysen, J.M. Van Herreweghe, L. Callewaert et al. // Journal of Molecular Biology. 2011.-№5.-P. 1233-1245.

80. Lin-Chao, S. Effect of the bacterial growth rate on replication control of plasmid pBR322 in Escherichia coli / S. Lin-Chao, H. Bremer // Mol Gen Genet.- 1986.-№1.-P. 143-149.

81. Lovelady, C.A. Effect of exercise on immunologic factors in breast milk / C.A. Lovelady, C.P. Hunter, C. Geigerman // Pediatrics. 2003. -№111.-P. 148-152.

82. Lycett, G.W. Chloramphenicol releases a block in initiation of chromosome replication in a dnaA strain of Escherichia coli Kl2 / G.W. Lycett, E. Orr, R.H. Pritchard // Mol. Gen. Genet. 1980. - №2. - P. 329-336.

83. Consumption of milk from transgenic goats expressing human lysozyme in the mammary gland results in the modulation of intestinal microflora / A.E. Maga,, R.L. Walker, G.B. Anderson et al. // Transgenic Res. 2006. -№15.-P. 515-519.

84. Majdalani, N. Regulation and mode of action of the second small RNA activator of RpoS translation, RprA / N. Majdalani, D. Hernandez, S. Gottesman // Mol. Microbiol. 2002. - №46. - P. 813-826.

85. Role of RcsF in signaling to the Res phosphorelay pathway in Escherichia coli / N. Majdalani, M. Heck, V. Stout et al. // J. Bacteriol. 2005. №187. -P. 6770-6778.

86. Anti-infective factors in preterm human colostrum / N.B. Marthur, A.M. Dwarkadas, V.K. Sharma et al. // Acta Paediatr. Scand. 1990. -№79.-P. 1039-1044.

87. Mason, D.Y. The distribution of muramidase (lysozyme) in human tissues / D.Y. Mason, C.R. Taylor // J. Clin. Pathol. 1975. - №28. - P. 124-132.

88. Midgley, J.E.M. The control of ribonucleic acid synthesis in bacteria. The synthesis and stability of ribonucleic acid in chloramphenicol-inhibited cultures of Escherichia coli / J.E.M. Midgley, W.J.H. Gray // Biochem J. -1971.-№2.-P. 149-159.

89. Miller, E.M. Escherichia coli electrotransformation / E.M. Miller, J.A. Nickoloff// Methods Mol. Biol. 1995. - №47. - P. 105-113.

90. Miller, J. H. Experiments in molecular genetics / J. H. Miller. -N.Y.: Cold Spring Harbor Press. 1972. - 466 p.

91. Escherichia coli ykfE ORFan Gene Encodes a Potent Inhibitor of C-type Lysozyme / V. Monchois, C. Abergel, J. Sturgis et al. // J. Biol. Chem. -2001.-№276.-P. 18437-18441.

92. Cell wall substrate specificity of six different lysozymes and lysozyme inhibitory activity of bacterial extracts / D. Nakimbugwe , B. Masschalck, D. Deckers et al. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - №1. - P. 41-46.

93. Narita, S.-I. Amino Acids at Positions 3 and 4 Determine the Membrane Specificity of Pseudomonas aeruginosa Lipoproteins / S.-I. Narita, H. Tokuda // J. Biol. Chem. 2007. - №18. - P. 13372-13378.

94. Co-regulation of Salmonella enterica genes required for virulence and resistance to antimicrobial peptides by SlyA and PhoP/PhoQ / W.W. Navarre, T.A. Halsey, D. Walthers et al. // Mol. Microbiol. 2005. - №2. - P. 492508.

95. Urochordates carry multiple genes for goose-type lysozyme and no genes for chicken- or invertebrate-type lysozymes / I.W. Nilsen, B. Myrnes, R.B. Edvardsen et al. // Cell Mol Life Sei. 2003. №60. - P. 2210-2218.

96. Identification and isolation of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme / A. Pellegrini, U. Thomas, N.J. Bramaz et al. // Appl. Microbiol. 1997.-№82.-P. 372-387.

97. Peptidoglycan O-acetylation and autolysin profile of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. / J.M. Pfeffer, H.Strating, J.T. Weadge et al. // J. Bacteriol. 2006. - №3. - P. 902-908.

98. Peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylases from Bacillus cereus, highly conserved proteins in Bacillus anthracis / E. Psylinakis, I.G. Boneca, K. Mavromatis et al. // J Biol Chem. 2005. - №35. - P. 30856-30863.

99. Autotransporter-encoding sequences are phylogenetically distributed among Escherichia coli clinical isolates and reference strains / C. Restieri, G. Garriss, M.C. Locas // Appl. Environ Microbiol. 2007. -№5.-P. 1553-1562.

100. The solution structure of the protein ydhA from Escherichia coli / M. Revington, A. Semesi, A. Yee et al. // J. Biomol. NMR. 2006.- №35-P. 295-300.

101. Antimicrobial proteins and polypeptides in pulmonary innate defence / M.P. Rogan, P. Geraghty, C.M. Greene et al. // Respir. Res. 2006. - №7,-P. 29-39.

102. Improving the accuracy of PSI-BLAST protein database searches with composition-based statistics and other refinements / A.A. Schäffer, L. Ara-vind, T.L.Madden et al.// Nucleic Acids Res.- 2001.- №14.- P.2994-3005.

103. Systemic diseases in association with microbial species in oral biofilm from elderly requiring care / H. Senpuku, A. Sogame, E. Inoshita et al. // Gerontology. 2003. - №49. - P.301-309.

104. Growth characteristics of and virulence factor production by group A Streptococcus during cultivation in human saliva / S.A. Shelburne, C. Ganville, M. Tokuyama, et al. // Infect. Immun. -2005. №73. -P. 4723- 4731.

105. Shen, V. Chloramphenicol-Induced Changes in the Synthesis ofRibosomal, Transfer, and Messenger Ribonucleic Acids in Escherichia coli B/r / V. Shen, H. Bremer // J. Bacteriol. 1977. - №3. - P. 1098-1108.

106. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver stained Polyacrylamide gels / A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann // Anal Chem. -1996.-№68.-P. 850-858.

107. The COG database: an updated version includes eukaryotes / R.L. Tatusov, N.D. Fedorova, J.D. Jackson, A.R. Jacobs, B. Kiryutin, et al. // BMC Bioin-formatics. 2003. - №4. - P. 41.

108. Taylor, P. W. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against gramnegative bacteria / P.W. Taylor // Microbiol. Rev. 1983. - №47. P. 46-83.

109. Tomas, T.J. A simple and rapid method for the elimination of R plasmids from enteric bacteria / T.J. Tomas, W.K. William // Current Microbiology. 1984. -№11.- P. 155-158.

110. Lower respiratory tract lactoferrin and lysozyme arise primarily in the airways and are elevated in association with chronic bronchitis / A.B. Thompson, T. Bohling, F. Payvandi et al. // J. Lab. Clin. Med. 1990. - №115. -P. 148-158.

111. Tokuda, H. Sorting of lipoproteins to the outer membrane in E. coli / H. Tokuda, S-I. Matsuyama // Biochim. Biophys. Acta.- 2004- №1693.-P. 5-13.

112. MDP and other muropeptides direct and synergistic effects on the immune system / S. Traub, S. von Aulock, T.J. Härtung et al. // Endotoxin Res. -2006.-№2. -P. 69-85.

113. Recycling of the anhydro-N-acetylmuramic acid derived from cell wall murein involves a two-step conversion to N-acetylglucosamine-phosphate / T. Uehara, K. Suefuji, N. Valbuena et al. // J. Bacteriol. 2005. -№11.-P. 3643-3649.

114. Vollmer, W. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-acetylglucos-amine deacetylase in Streptococcus pneumoniae / W.Vollmer, A. Tomasz // 2000. J. Biol. Chem. - №275^ - P. 20496-20501.

115. Vollmer, W. Peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase, a putative virulence factor in Streptococcus pneumoniae / W.Vollmer, A. Tomasz // Infect. Immun. -2002. -№70. P. 7176-7178.

116. Paneth cell antimicrobial peptides: topographical distribution and quantification in human gastrointestinal tissues / J. Wehkamp, H.B. Chu, R. Shen et al. // FEBS Lett. 2006. - №580. - P. 5344-5350.

117. Weinberger, M. Inhibition of protein synthesis transiently stimulates initiation of minichromosome replication in Escherichia coli / M. Weinberger, C.E. Helmstetter // J. Bacteriol. 1989. - №7. - P. 3591-3596.

118. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis / K.M. Wu, L.H. Li, J.J. Yan et al. // J Bacteriol. 2009. - №14. - P. 4492-501.

119. Structural basis for the recognition of lysozyme by MliC, a periplasmic ly-sozyme inhibitor in Gram-negative bacteria / S. Yum, M.J. Kim, Y. Xu et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. - №2. - P. 244-248.

120. Zipperle, G.F. Glucosamine substitution and muramidase susceptibility in Bacillus anthracis /G.F. Zipperle, J.W. Ezzell, R.J. Doyle // Can. J. Microbiol. 1984. - №30. - P. 553-559.

Информация о работе

Андрющенко, Сергей Валерьевич
кандидата медицинских наук
Оренбург, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы