Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Колонизация полости рта и ее влияние на лизоцим-антилизоцимные взаимоотношения в экосистеме при кариесе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Колонизация полости рта и ее влияние на лизоцим-антилизоцимные взаимоотношения в экосистеме при кариесе"

На правах рукописи

АБРАМОВ ВИКТОР ГЕННАДЬЕВИЧ

«КОЛОНИЗАЦИЯ ПОЛОСТИ РТА И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА ЛИЗОЦИМ-АНТИЛИЗОЦИМНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В ЭКОСИСТЕМЕ ПРИ КАРИЕСЕ»

03.00.07 - Микробиология 14.00.21 - Стоматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003061712

государственном медицинском университете доктор медицинских наук, профессор В. С. Крамарь

доктор медицинских наук, профессор С. В. Дмитриенко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор А.С.Борзенко

доктор медицинских наук, профессор И.В. Маланьин

Работа выполнена в Волгоградском Научные руководители:

Ведущая организация: Саратовский государственный

медицинский университет

у/ 62&1

Защита состоится « »(^/<^^/^>007 года в часов на заседании диссертационного совета К 208.008.03 прй Волгоградском государственном медицинском университете (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета

Автореферат разослан Г0Да

Ученый секретарь диссертационного сове

доктор социологических наук, доцент V ¿Ко . Ковалева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Человек и окружающая среда представляют экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия (Б.А. Шендеров, 1996; 2001; A.A. Воробьев, 1998; Е.В. Тарасенко, 2000; Е.В. Омельянюк, 2001; О.Н. Куркина, 2003; В.Н. Царев, 2005).

За время жизни макроорганизма происходит смена ряда поколений микроорганизмов (И.Н. Разумович, 1990; Ю. Ершова, 1991; Е.И. Полишук, 1998; И.Г. Шонина, 1999; Т.Н.Климова, 2005). Соответственно этому эволюция и генетические изменения микроорганизмов в различных местах обитания подвержены более сильным влияниям, чем макроорганизм. При этом свойственные топодему приспособившиеся микробы существуют в сообществах, представляющих собой скопления популяций бактерий в строго ограниченном месте обитания (С.Д. Митрохин, 1999; Е.А. Воропаева, 2002; А.Ю. Миронов, 2002). Число и распространение микроорганизмов контролируются наличием в достаточном количестве, необходимом для их существования веществ, а также физико-химическими факторами окружающей среды (М.Д. Сирютина, 1998).

Известно, что бактерии проявляют некоторую избирательность локализации в связи с чем каждому из топодемов внешней среды свойственна относительно постоянная среда (Д.И. Садыкова, 1998; О.И. Пикуза, 1999; JI.H. Каза-рина, 2001; А.Б. Покатилов, 2001; Е.А. Загороднева, 2002; И.А. Новицкий, 2002; И.И.Иванова, 2004).

Микрофлора складывается и закрепляется в результате взаимодействия множества факторов (количество субстрата, его доступность, физические и химические факторы, воздействующие на субстрат, солнечный свет, токсические вещества).

Микробы, живущие в различных топодемах не только формируют состав флоры, но и принимают самое непосредственное участие в складывающихся отношениях с макроорганизмом (С.А. Калашникова, 1999; JI.B. Крамарь, 2003).

Длительное переживание бактерий в организме хозяина обеспечивается рядом факторов, способствующих адгезии микробов в экологической нише в целях сохранения вида. Устойчивое сосуществование с человеком возможно при наличии определенных биологических свойств микроорганизмов, направленных, как правило, на деградацию механизмов защиты хозяина (О.В. Бухарин, 1999). Своеобразную экологическую систему, тесно связанную с внутренней средой организма и его внешним окружением составляет полость рта (А.И. Рыбаков с соавт., 1990; O.A. Варавина, 2004; JI.B. Рутаковская, 2004; В.И.Комарова, 2005; А.И.Хавкин, 2006).

Неотъемлемой частью микроэкосистемы полости рта является нормальная микрофлора, обеспечивающая колонизационную резистентность (О.В. Бухарин с соавт., 1996; О.В. Чернышова, 2003).

Микрофлора полости рта рассматривается как первичная мишень для любого фактора, который прямо или опосредованно влияет на адгезию и колонизационную резистентность резидентной, транзиторной и добавочной микрофлоры (Б.А. Шендеров, 1989; A.A. Воробьев с соавт., 1998; 2001).

Экологическими детерминантами, благоприятствующими обитанию в полости рта микробов в основном являются состояние зубочелюстной системы, степень резистентности слизистой оболочки полости рта, состав и свойства смешанной слюны.

Изучая функционирование механизмов в полости рта, можно получить данные как о неблагоприятном внешнем воздействии, так и о нарушениях ней-рогуморальной регуляции как следствие какого-то заболевания (И.И. Олейник с соавт., 1987; 1991; И.Г.Пономарева, 2000). Одним из наиболее информативных показателей - «индикаторов» состояния здоровья как в целом, так и в полости

рта является её микрофлора и взаимодействие факторов местной и общей неспецифической и специфической резистентности (Т.В. Чижикова 2007).

В последние два десятилетия концепция активного участия симбиотиче-ской микрофлоры в поддержании здоровья и возникновении многих патологических состояний завоевывает все большую популярность. Микроэкологические аспекты этиопатогенеза многих заболеваний основываются на признании того, что симбиотическая микрофлора является интегральной частью организма (И.В.Лиманская, 2006).

Микрофлора полости рта в норме представлена различными видами микроорганизмов, выполняющих целый ряд физиологических функций. Но она же является причиной развития многих заболеваний полости рта, которые всегда сопровождаются нарушением нормального баланса между представителями аллохтонной и аутохтонной микрофлоры, при этом ферментативная деятельность бактерий зубной бляшки приводит к образованию органических кислот, способствующих деминерализации, а затем и образованию полости в тканях зуба. Параллельно с этим доминирующая бактериальная флора подвергается изменениям, демонстрируя феномен, известный как «микробиологическая последовательность». Можно предположить, что процессы биологической сукцессии требуют наличия у бактерий факторов, подавляющих нормальных симбионтов и вытесняющих их из ниш постоянного места обитания. В настоящее время изучение таких факторов и ферментов «агрессии», выяснение их роли в патогенезе заболеваний, привлекает всеобщее внимание исследователей. Разработка современных биотехнологий для изучения микробиоценоза полости рта и раннего обнаружения изменений может способствовать улучшению методов диагностики, оценке риска заболевания и эффективности лечения кариеса. Следовательно, последовательные и всесторонние микробиологические исследования играют важную роль в расшифровке этиологии кариеса, и предполагают пути к его профи-

лактике и лечению. Этим и обусловлена актуальность избранной темы в клиническом и теоретическом аспектах.

В связи с изложенным, целью работы явился анализ значимости системы «лизоцим-антилизоцим» в регуляции микробиоценоза полости рта при кариесе.

Для достижения этой цели требовалось решение ряда задач:

1. Изучить состояние зубов и дать характеристику кариеса у взрослых людей, живущих в условиях крупного промышленного города.

2. Определить бактериальную колонизацию различных биотопов полости рта у больных кариесом твердых тканей зубов.

3. Исследовать экологическую структуру бактериальных сообществ при кариесе различной интенсивности. Выявить взаимосвязь между степенью компенсации кариозного процесса и выраженностью микроэкологических нарушений у больных.

4. Для установления биологических механизмов создания и поддержания микробиоценоза изучить систему «лизоцим-антилизоцим» бактерий, колонизирующих полость рта у лиц обследуемых групп, и выяснить роль этих процессов в регуляции микробных сообществ.

5. Определить возможности использования количественного определения факторов персистенции для биологической индикации состояния биоценоза полости рта.

Научная новизна работы. При микробиологическом исследовании полости рта выявлено, что факторы, способствующие кариесу, приводят также к перестройке биоценоза, при этом установлена статистически значимая взаимосвязь между степенью компенсации кариозного процесса и выраженностью микроэкологических нарушений.

Выявлено, что в микрофлоре полости рта большинство симбионтов проявляют антилизоцимную активность, выраженность которой увеличивается с нарастанием тяжести кариозного процесса. Экспериментальным путем уста-

новлена способность условно-патогенных бактерий, обладающих антилизи-цимной активностью, угнетать продукцию лизоцима штаммами симбионтами, при этом гетерогенность бактериальных популяций по системе «лизоцим-антилизоцим» обеспечивает адаптацию микроорганизмов к меняющимся условиям в организме хозяина. Антилизоцимная активность УПБ способствует длительной персистенции патогенов, а также является индикаторным признаком бактерий, для которых средой обитания служит полость рта больного кариесом.

Предложена математическая модель дифференциации микроэкологических нарушений полости рта.

Положения, выносимые на защиту

1. Факторы, способствующие развитию кариеса, приводят также к перестройке биоценоза полости рта, что проявляется снижением количества нормальных симбионтов (Laktobacillus, S. salivarius, S. sanguis и S. epidermidis) и появлению в микрофлоре условно-патогенных микроорганизмов (S .mutans, S.haemolyticus, энтеробактерий, грибов и S.aureus).

2. Микроэкологические нарушения в полости рта сопряжены со степенью компенсации кариозного процесса, при этом доминирующая бактериальная флора подвергается изменениям, демонстрируя феномен «микробиологической последовательности».

3. Симбионтные микроорганизмы полости рта здоровых людей продуцируют лизоцим и редко проявляют способность к его деградации. При кариесе большинство бактерий имеют антилизоцимную активность, выраженность которой увеличивается с нарастанием тяжести кариозного процесса. Условно-патогенные бактерии, обладающие АЛА, угнетают продукцию лизоцима штаммами симбионтами.

4. Гетерогенность бактериальных популяций по системе «лизоцим-антилизоцим» обеспечивает адаптацию микроорганизмов к меняющимся условиям в организме хозяина.

5. Антилизоцимная активность УПБ обеспечивает длительную персистенцию патогенов, а также является индикаторным признаком бактерий, для которых средой обитания служит полость рта больного кариесом.

Практическая значимость исследований. Работа проводилась в соответствии с планом научно-исследовательской работы Волгоградского государственного медицинского университета. Тема вошла в отраслевую программу МЗ России и социального развития «Разработка медико-биологических проблем, направленных на улучшение показателей здоровья населения и экологического благополучия окружающей среды».

Результаты исследований внедрены в курс лекций и практических занятий кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ВолГМУ.

Проведенная работа дала основание представить уровень распространенности факторов персистенции микроорганизмов в процессе формирования биоценоза у взрослых с различной степенью тяжести процесса и резистентности тканей зуба при кариесе. Выявлена возможность использования системы «ли-зоцим-антилизоцим» в оценке благополучия биоценоза.

Разработаны и внедрены в практику здравоохранения следующие предложения:

способ оценки экологической значимости грамположительных кокков (акт внедрения № 100 от 15.04.2007 г., г. Волгоград); способ оценки благополучия микрофлоры полости рта (акт внедрения № 120 от 25.05.2007 г., г. Волгоград).

Разработаны, опубликованы и внедрены в практику следующие методические рекомендации для студентов, аспирантов и врачей:

- Микроэкологическая характеристика биоценоза полости рта. - 2006. -

31 с.

- Персистенция стрептококков. - Волгоград, 2006. - 29 с.

Результаты натурных и экспериментальных исследований легли в основу рационализаторского предложения: «Способ оценки благополучия биоценоза», утвержденного 30.04.2007 г. ВолГМУ.

Апробация работы п публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на конференции студентов и молодых ученых (2003, 2004, 2005, 2006, 2007). Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, терапевтической и детской стоматологии). По материалам работы опубликовано 6 статей, 2 учебно-методических пособия для студентов, аспирантов и врачей.

Объем н структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов и указателя литературы, включающего 263 источника, в том числе 157 отечественных и 106 зарубежных. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 34 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в Волгоградском государственном медицинском университете в период 2003 - 2007 годы на базе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, а также на кафедре стоматологии детского возраста и в клинике стоматологии. На первом этапе был подобран контингент больных, страдающих кариесом. Было проведено динамическое наблюдение за 108 пациентами трех различных возрастных групп (от 16 до 65 лет).

Изучение стоматологического статуса у находившихся под нашим наблюдением лиц проводилось по методике, рекомендованной ЦНИИС и ВОЗ.

При осмотре полости рта обращали внимание на гигиеническое состояние, наличие кариеса и его осложнений, состояние тканей пародонта, используя индексы КПУ, гигиены (ГИ), РМА и пародонтита. Состояние слизистой оболочки полости рта и красной каймы губ оценивали по A.JI. Машкиллей-

сону (1984). Все полученные клинические и лабораторные данные заносили в медицинскую карту, разработанную на основании предложений ЦНИИС.

Уровень резистентности зубов к кариесу оценивали по методике В.Б. Не-досеко. Об изменении уровня резистентности судили по вовлеченности в процесс зубов, локализация кариеса на которой для прежнего уровня устойчивость была не характерна.

Забор материала для бактериологического исследования проводился по методике В.С.Крамарь и Е.О.Кравцовой (1994). Микрофлора изучалась по методу Haenel (1979) в модификации С.К. Канарейкиной с соавт. (1981).

Для оценки качественного и количественного состава микрофлоры полости рта нами были обследованы зубной налет, слизистые оболочки языка, неба и щеки.

При проведении бактериологического исследования учитывали: 1) общее количество микроорганизмов; 2) стрептококки; 3) лактобактерии; 4) стафилококки; 5) дрожжеподобные грибы; 6) энтеробактерии.

Культивирование анаэробов осуществлялось в микроанаэростате системы Gas-Pak (OXOID, Англия).

Идентификация выделенных микроорганизмов проводилась на основании морфологических, культуральных, биохимических и антигенных признаков в соответствии с классификацией Берджи (1980).

Плотность популяции определяли путем подсчета микроорганизмов в 1 г зубного налета, на 1 см2 слизистой оболочки (КОЕ/ед.субстрата).

Антилизоцимная активность изучалась по методу О.В.Бухарина с соавт. (1984).

Оценку микроэкосистемы полости рта проводили с использованием коэффициента значимости (М.П. Наткевичайте-Иванеускене, 1985), видового разнообразия (Р. Уиттекера, 1988), типологии доминант с помощью показателя постоянства (С) по С.И. Сытнику (1989).

и

Все материалы были подвергнуты статистической обработке. Вычисления проводились в среде пакета STATISTICA 5.0, а также с использованием программы статистического и инженерного анализа MS Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для решения поставленных задач обследованию подвергнуто 215 человек в возрасте от 17 до 65 лет, 108 из которых имели кариес коронковой части зуба. Группу сравнения составили 107 человек, имеющих интактную полость рта. Большинство лиц контрольной группы были в возрасте до 45 лет (74,8%).

Все больные были разделены на три возрастные группы: первую (16-25 лет), вторую (26-45) и третью (46-65 лет). Среди больных основную массу обследуемых, также как и в контрольной группе, составляли люди в возрасте до 45 лет (73 человека, 67,6%), при этом соотношение женщин было в 2 раза больше, чем мужчин (69,4 и 30,6%).

Изучение стоматологического статуса показало, что распространенность и интенсивность кариеса среди лиц мужского пола была выше, однако нуждаемость в лечении зубов у мужчин и женщин была достоверно одинаковой.

Установлено, что с возрастом интенсивность кариеса нарастала. Так у лиц первой, наиболее молодой группы, среднее количество кариозных зубов на одного больного составляло 3,38±0,3, тогда как в третьей - 7,2±0,4 единицы. При анализе распределения больных по индексу КПУ была обнаружена аналогичная закономерность - значение показателя увеличивалось в соответствие с возрастом, составив 4,26 в первой, 14,20 во второй и 16,68 в третьей.

Одним из факторов, влияющих на развитие изучаемого заболевания, является резистентность зубных тканей к кариесу. При исследовании уровня резистентности по совокупности двух признаков (учет поражения определенных функционально-ориентированных зубов и интенсивность поражения кариесом)

установлено, что у большинства обследуемых (45 человек, 41,67%) значения показателя были средними, у 40 (37,03%) - низкими и у 19 (17,6%) - очень низкими (табл. 1). Высокий уровень резистентности был определен только у 4 человек, что составляло 3,7%.

Таблица 1

Резистентность зубов у лиц обследуемых групп

—^Резпстеность Пол Высокая Средняя Низкая Очень низкая

абс. % абс. % абс. % абс. %

Всего 4 3,7 45 41,67 40 37.03 19 17,6

Мужчины 2 1,85 18 16,67 10 9,26 5 4,63

Женщины 2 1,85 27 25,0 30 27,78 14 12,96

Из данных таблицы 1 видно, что большинство обследуемых (78,7%) имело средний и низкий уровни резистентности зубных тканей к кариесу.

При динамическом наблюдении за состоянием зубов лиц групп сравнения в течение года было установлено снижение уровня резистентности и увеличение индекса КПУ в каждой возрастной группе обследуемых (табл. 2).

Таблица 2

Динамика изменения резистентности твердых тканей зубов у наблюдаемых больных за год

Высокая, % Средняя, % Низкая, % Очень низкая, %

было стало было стало было стало было стало

М 3,1 3,1 59,3 46,9 31,3 37,5 6,3 12,5

Ж 1,3 1,3 42,1 31.6 39,5 44,7 17,1 22,4

При изучении распределения больных по степени компенсации было установлено, что компенсированный кариес у большинства наблюдаемых развивался у лиц, имеющих среднюю резистентность и низкие значения активности процесса (82,4%, 1,9 ЕД). При субкомпенсированном кариозная активность увеличивалась до 3,0 ЕД, а средний уровень резистентности определяли у 81,3% пациентов. При декомпенсированном процессе низкую и очень низкую

резистентность твердых тканей зубов к кариесу выявляли у 44,0% и 22, 7% лиц при показателях КПУ 17,7 и КА 3,7 ЕД соответственно. В этой же группе выявлены достоверно большие темпы прироста интенсивности кариеса за год.

Полученные данные позволили говорить о том, что резистентность зубных тканей является определяющим фактором, влияющим на активность и интенсивность кариеса.

Следующим этапом нашей работы было изучение микробной колонизации полости рта и поиск закономерностей ее формирования у больных с кариесом.

При изучении микробиоценоза полости рта лиц группы сравнения было установлено, что все изучаемые биотопы заселены разнообразными микроорганизмами. По мнению С.И. Сытник (1994), плотность микробных сообществ является основополагающим параметром биоценоза и определяется совокупностью как эндогенных, так и экзогенных факторов. Анализ полученных данных показал ее зависимость от исследуемого биотопа, при этом минимальное бактериальное наполнение выявляли на слизистых оболочках неба и щеки (1,29±0,61 -10 3 и 1,01±0,28 КОЕ/ед суб), максимальное - в зубном налете 2,34±0,70 • 105 КОЕ/ед суб., при этом средняя плотность колонизации микроорганизмами ротовой полости составляла 8,02 ±1,05 -104 КОЕ/ед.суб. (табл. 3).

Полученные данные свидетельствует, что в микробиоценозе полости рта доминирующими видами являются стрептококки, лактобактерии и стафилококки. Среди сообщества стрептококков преобладают S. salivarius и S. sanguis, составляя от 86 до 100% всех культур. Среди стафилококков наиболее часто регистрировался S. epidermidis.

Таблица 3

Микрофлора полости рта лиц с интактными зубными рядами, М±ш

Биотоп Микрооргапш5г~ Зубной налет Слизистая оболочка

неба щеки языка

Грампозитивная кокковая флора 1,35±0,78*104 1,58±0,01»102 1,05±0Д5»Ю1 7,92±0,95»101

Грамнегативная кокковая флора 2,98±3,i5*io' 2,00±0,10*102 l.OOiO^lO1 2,74±0,45»10'

Грампозитивная палочковидная флора 2,00±2,15«101 0,58±0,20*10' 1,51±0,40»102 2,90±0,50»101

Грамнегативная палочковидная флора 0 0 0 0

Грибы 7,34±3,76.102 0,59±0,01»102

Определение индивидуальных ценотипов (сочетаний доминирующих микробных видов) у лиц группы сравнения показало, что наиболее физиологичной является микрофлора, представленная S. salivarius, S. sanguis и Lactobacillus spp. Такой биоценоз назван нами ценотипом первого порядка, и был обнаружена у 63 (58,9%) человек. У 25,2% установлен нормоценоз второго порядка, характеризующийся сменой одного из доминирующих видов (S. sanguis в 14,0% случаев), появлением «вида наполнителя» (S. mitis - 9,3%) или снижением числа лактобактерий и наличием S. mitis (1,9%). У 15,9% здоровых людей определяли пограничный с патологическим ценотип третьего порядка, в котором произошло наполнение биоценоза ассоциацией условно-патогенных бактерий (S. mitis, золотистый стафилококк, грибы).

Установлено, что зубной налет здорового человека является биотопом, обладающим максимальной бактериальной плотностью (2,34±0,70-105 КОЕ/ед.суб.) и видовым разнообразием. Это делает его наиболее подверженным процессам биологической сукцессии.

Изучение микрофлоры у лиц, страдающих кариесом зубов, показало, что у данной группы пациентов происходили весьма значительные изменения со-

става биоценоза. Интенсивность этих сдвигов зависела от выраженности патологического процесса.

При кариесе в полости рта выявлен достоверно высокий уровень микробной колонизации по сравнению с таковым группы сравнения. При этом с высокой интенсивностью процесс бактериальной сукцессии происходит на слизистой оболочке щеки (4,65±0,02'104 КОЕ/ед.суб.) и языка (5,14±0,05"104 КОЕ/ед.суб.). Изменения среди грамположительной флоры резко коснулись стафилококков и стрептококков.

По мнению Д.Г. Дерябина (2006), стафилококки являются одним из главных условно-патогенных микроорганизмов, формирующих патологический биоценоз. С этих позиций было интересно проанализировать состав сообщества стафилококков у наблюдаемых (табл. 4).

Таблица 4

Частота встречаемости стафилококков в биоценозе полости рта у лиц обследуемых групп, %

Группа Компенсиро- Субкомпен- Декомпенсн- Сравнения

ванный сированный рованиыи

кариес кариес кариес

МикроорганизХГ-\ абс. % абс. % абс. % абс. %

S. aureus 10 22,8 33 40,2 33 47,1 28 26,2

S. epidermidis 13 26,4 46 56,1 49 70,0 68 63,6

S. saprophytics И 23,1 23 28,0 23 28,0 11 10,3

Было зарегистрировано резкое нарастание значимости S. aureus, который выделялся в 40,2% наблюдений при субкомпенсированном кариесе и в 47,1% при декомпенсированном, колонизируя в среднем 3,5±0,4 биотопа. Плотность колонизации S. aureus возрастала в ряду: компенсированный > субкомпенсиро-ванный > декомпенсированный кариес, достигая при декомпенсации величины 7,20±0,92'107 КОЕ/ед.суб., что было достоверно выше, чем в группах сравнения (р< 0,01). Таким образом, S. aureus встречался у больных в 2 раза чаще, а плотность его колонизации была более чем в 100 раз выше, чем S. epidermidis, который был доминирующим видом в микрофлоре здоровых.

Анализ данных показал снижение содержания S. salivarius (57,3, 54,8 и 41,4% по группам) и увеличение выделения S. mutans (25,6, 28,2 и 44,3% соответственно). Кроме того, у 26,2 % обследованных с компенсированным, у 28,1% с субкомпенсированным и у 44,3% декомпенсированным кариесом обнаруживали S. haemolyticus. Средняя плотность обсеменения слюнными стрептококками при кариесе достоверно уменьшалась на всех изучаемых биотопах, тогда как S. mutans и S. mitis - возрастала.

Проведенные исследования показали высокую частоту вегетирования в ротовой полости больных условно-патогенных микроорганизмов семейства Еп-terobacteriacea и грибов рода Candida. Грамотрицательные энтеробактерии были представлены Е. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. Наиболее часто их выделяли из зубного налета со средней бактериальной плотностью колонизации 7,75±0,3-103 КОЕ/ед.суб., при этом у 27,7% больных энтеробактерии колонизировали от 2 до 4 биотопов одновременно. Частота выделения грибов увеличивалась пропорционально тяжести кариозного процесса и при декомпен-сированном кариесе кандиды выделялись в 2 раза чаще, чем у здоровых людей.

Наличие в биоценозе при кариесе постоянно регистрируемых микроорганизмов позволило предположить существование сопряженных таксонов, встречающихся совместно чаще других. С этой целью с использованием статистического анализа (коэффициента корреляции Персона) проведено изучение взаимосвязей между степенью обсемененности биотопа, уровнем резистентности зубов, выраженностью кариеса и сочетанием групп микроорганизмов в пределах различных биотопов.

Анализ полученных данных подтвердил существование синергизма между S. aureus и Candida albicans у лиц с высокой, средней и низкой резистентностью на слизистой оболочке языка (ri=0,60, г2=0,57 и г3=0,69). При очень низкой резистентности зубных тканей такой синергизм являлся значимым только для зубного налета (г=0,70), что возможно и определяет интенсивность кариозного процесса у данной категории больных.

Все перечисленные изменения характеризовали собой дисбактериоз полости рта, обнаруживаемый у всех (100%) больных.

Выявлено, что условно-патогенные бактерии, вегетирующие в микрофлоре полости рта больных кариесом, располагают разнообразными секретирую-щими субстанциями, направленными на инактивацию механизмов клеточной и гуморальной защиты организма, одним из которых является способность деградировать лизоцим - антилизоцимная активность (АЛА). Высокая концентрация лизоцима в ротовой жидкости предполагает наличие у нормобионтов способности к его инактивации. Вместе с тем, при исследовании 95 штаммов микроорганизмов, выделенных у практически здоровых людей, было установлено, что антилизоцимной способностью обладали 86,3% культур, при этом наименьшие показатели были установлены для S. mutans и S. salivarius (отсутствие признака зарегистрировано в 20,8 и 17,6% соответственно, а большинство штаммов имели низкие значения признака) (табл. 5).

Таблица 5

Антилизоцимная активность условно-патогенных микроорганизмов, колонизирующих различные биотопы полости рта практически _здоровых людей, мкг/мл, М ± m_

Микроорганизмы Биотоп

Слизистая обатока твердого неба Слизистая оболочка спинки языка Слизистая оболочка щек 3}<5той налег

S. mutans 1,02 ±0,11 1,34 ±0,11 0,64±0,09 2,26 ±0,06

S. salivarius 1,19 ±0,09 1,47 ±0,08 0,96±0,09 2,87 ±0,11

S. aureus 1,56 ±0,22 1,78 ± 0,24 1,56 ±0,09 2,86 ±0,11

С. albicans 1,65±0,19 2,09 ±0,24 1,94±0,11 2,96 ±0,24

E. coli 1,89±0,11 2,76 ±0,08 2,01±0,07 2,28 ±0,24

При изучении АЛА условно - патогенных штаммов (Е. coli, S. aureus и грибов рода Кандида) большинство из них продемонстрировали наличие низкого и среднего уровня антилизоцимной активности, а количество высокоактивных штаммов составляло 20,0, 12,5 и 13,0% соответственно, при этом болыпин-

ство изолятов, имеющих высокий уровень АЛА, выделяли из микрофлоры зубного налета.

При анализе встречаемости персистенных характеристик было выяснено, что в микрофлоре здоровых людей преобладают симбиотические микроорганизмы, имеющие сочетание антилизоцимной и лизоцимной активности (53,2%), реже только с антилизицимной (27,3%) и лизоцимной активностью (8,0%). Культуры с полным отсутствием факторов персистенции составляли 11,5%.

Иные закономерности были установлены у больных с кариесом. Изучение микрофлоры показало, что лизоцимактивные штаммы встречались редко (19,4%), при этом преобладали варианты с низкими показателями признака (66,2%), тогда как изоляты с отсутствием ЛА составляли 80,6%.

Полученные данные свидетельствовали о резком усилении способности симбионтов, формирующих микробиоценоз при декомпенсированном кариесе, разрушать эндогенный лизоцим и о выравнивании популяции по этому признаку. В целом, было установлено нарастание антилизоцимной активности симбионтов в ряду: практически здоровые люди с интактными зубами < пациенты с компенсированным кариесом < пациенты с субкомпенсированным кариесом <пациенты с декомпенсированной формой кариеса.

Анализ сочетаний изучаемых признаков показал наличие трех вариантов нозологических профилей бактерий: 9% из них обладали как АЛА, так и ЛА, 3% - только ЛА, тогда как большинство микроорганизмов принадлежали к числу секретирующих только АЛА (88%), что достоверно выше чем в группах сравнения (р<0,01). Вероятно, что способность интенсивно деградировать му-рамидазу, является приспособительным механизмом, позволяющим условно-патогенным бактериям длительно персистировать в экологической нише, богатой эндогенным лизоцимом. С одной стороны, это позволяет им вытеснять нормальных симбионтов, не имеющих антилизоцимной активности, с другой, вызывать патологический процесс в тканях зубов и слизистых оболочках ротовой полости.

Для подтверждения этого предположения нами, на модели «лизоцим симбионта - антилизоцим УПБ», были изучены межпопуляционные взаимоотношения между представителями индигенной и аллохтонной флоры. С этой целью проведено экспериментальное сокультивирование 30 штаммов энтеробак-терий, золотистых стафилококков и грибов (по 10 равнозначно), обладающих высоким значением АЛА и выделенных от людей с кариесом, со слюнными стрептококками, не продуцирующими лизоцим (1 группа) и продуцирующим его со средним значением 5,2±1,3 у.е.(2 группа).

Результаты эксперимента показали (табл. 6), что при сокультивировании УПБ со стрептококками, не обладающими лизоцимной активностью, АЛА исходных штаммов не изменялась, тогда как при культивировании со штаммами с исходно высокой ЛА, происходил обратный феномен: АЛА активность условно-патогенных бактерий возрастала, а способность продуцировать лизоцим у симбионтов резко (в 2-3 раза) снижалась.

Таблица 6

Результаты совместного культивирования

условно-патогенных микроорганизмов и стрептококков (мкг/мл, у.е.)

Микроорганизм Характеристика до сокультивирования Характеристика после сокультивирования

УПБ (АЛА) S. salivarius (ЛА) УПБ (АЛА) S. salivarius (ЛА)

Е. coli 4,3±1,7 0 4,3±1,7 0

4,3±1,7 5,2±1,3 5,2±1,2 1,3±0,7

S. aureus 3,7±1,7 0 2,5±1,7 0

2,8±1,7 5,2±1,3 3,4±1,7 4,3±0,8

Грибы рода Candida 3,4±1,3 0 3,4±1,3 0

3,4±1,3 5,2±1,3 4,6±1,3 3,0±0,9

Полученные данные свидетельствуют о сопряженности изучаемых признаков у микроорганизмов, что, по-видимому, является общебиологическим свойством.

Результаты проведенного эксперимента позволяют понять сущность обнаруженных нами изменений микробиоценоза. У здоровых людей симбионтные

микроорганизмы полости рта продуцируют лизоцим и редко проявляют способность к его деградации. Бактериальная и эндогенная продукция лизоцима обеспечивает постоянный качественный и количественный состав микробных популяций ротовой полости здорового человека. При заселении данного биотопа УПБ, инактивирующими лизоцим, нормальные симбионты теряют способность к синтезу мурамидазы и вытесняются патогенной аллохтонной флорой. Этому также способствует наличие у УПБ множественных факторов агрессии и патогенности, направленных на инактивацию клеточной и гуморальной защиты организма. Именно здесь кроются механизмы создания и поддержания микробиоценоза.

С учетом способности сочленов биоценоза влиять на биологические свойства друг друга, нами было проведено совместное выращивание культур УПБ (штаммы S. aureus с разными исходными уровнями АЛА) со штаммом симбионтом (S. salivarius с лизоцимной активностью 5,0 у.ед.). Почасовые изменения признаков AJI и AJIA у исходных культур были подвергнуты математическому анализу, на основе которых были построены графики и вычислена критическая величина уровня антилизоцимной активности для условно-патогенного микроорганизма, которая оказалась равна 3,5 мкг/мл. Таким образом, нами было установлено пороговое значение антилизоцимного фактора, которое позволяет отнести любой изучаемый штамм к транзиторным, легко элиминирующимся из организма (АЛА <3,5 мкг/мл), или к резидентным (АЛА >3,5 мкг/мл) (рис.1).

Рис. 1. Сопряженность кинетики роста и динамики уровня АЛА у стафилококков

На основании полученных результатов предложен коэффициент экологического благополучия микробиоценоза (К=1,43), который выражается как соотношение лизоцимной активности нормального симбионта (S. salivarius, 5,0 у.ед.) к установленной критической AJIA тест-штамма (S.aureus, 3,5 мкг/мл). При величине коэффициента менее 1,43 биоценоз ротовой полости расценивается как неблагополучный, а соотношение выше 1,43 указывает на экологическое благополучие экосистемы.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что лизоцим-антилизоцимные связи бактерий являются важным звеном, обеспечивающим состояние микробиоценоза. Предлагаемая методика определения критических значений данных признаков дает возможность оценить экологическое благополучие биоценоза ротовой полости по уровню лизоцимной активности нормобионтов и антилизоцимной активности условно-патогенных бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Открытая экосистема полости рта влияет на среду обитания микроорганизмов в ней.

2. Установлено, что при развитии кариеса, причины, вызывающие его приводят к глубоким изменениям и перестройке микробиоценоза полости рта. Снижается доминирование и экологическая значимость основных симбионтов, а также увеличивается частота встречаемости транзиторной микрофлоры.

3. Обосновано существование лизоцим-антилизоцимных взаимоотношений в микрофлоре полости рта. Установлено, что эта система является одним из факторов, формирующих биоценоз.

4. Экспериментальным путем выявлена способность условно-патогенных бактерий, обладающих антилизоцимной активностью, угнетать продукцию лизоцима штаммами симбионтами.

5. Бактериальная и эндогенная продукция лизоцима обеспечивает постоянный качественный и количественный состав микробных популяций ротовой полости. При заселении данного биотопа УПБ, инактивирующими лизоцим, нормальные симбионты теряют способность к синтезу мурамидазы и вытесняются патогенной аллохтонной флорой. С наибольшей интенсивностью эти процессы происходят в зубном налете, что создает предпосылки для непрерывного прогрессирования заболевания.

6. Разработана математическая модель оценки экологического благополучия микроэкосистемы полости рта на основе определения порогового значения уровня антилизоцимного признака, которое позволяет отнести любой изучаемый штамм к транзиторным, легко элиминирующимся из организма (АЛА <3,5 мкг/мл), или к резидентным (АЛА >3,5 мкг/мл).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль системы лизоцим-антилизоцим в формировании биоценоза // Вестник ВолГМУ, 2003. №9. - С. 164-165. (Соавт. В.С.Крамарь, .В.Чуйкина).

2. Пространственная структура и экологическая значимость микрофлоры полости рта // Сборник: «Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической стоматологии».- Волгоград, 2005. - С. 55 - 68. (Со-авт. В.С.Крамарь, Т.С.Чижикова, Е.О.Кравцова и др.).

3. Энтеробактерии в микробиоценозе полости рта людей, страдающих синдромом раздраженной толстой кишки // Сборник: «Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической стоматологии».- Волгоград, 2006. - Вып. 1., Т.63. - С. 154 - 156. (Соавт. И.В.Лиманская, Т.Н.Климова и др.).

4. Колонизационная резистентность полости рта при различной степени активности кариозного процесса // Сборник: «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» // Материалы 64-й открытой конференции студентов и молодых ученых - Волгоград, 2006. - С.110-116. (Соавт. Т.Н.Климова).

5. Факторы вирулентности микроорганизмов, колонизирующих полость рта при различной степени активности кариозного процесса // Сборник: «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» // Материалы 66-й открытой конференции студентов и молодых ученых. - Волгоград, 2007. -С.110-111.

6. Микробиоценоз полости рта людей, проживающих в крупном промышленном городе в условиях техногенного прессинга // Сборник: «Актуальные вопросы стоматологии» // Материалы научно-практической конференции, посвященной 75-летию проф. В.Ю. Миликевича. - Волгоград, 2007. - С. 135137.

Подписано в печать 03.07 2007 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 220.

Издательство Волгоградского государственного университета. 400062, г. Волгоград, просп. Университетский, 100.