Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов"

<Г,~)

На правах рукописи НЕМЦЕВА Наталия Вячеславовна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЦЕНОТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ГИДРОБИОНТОВ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В САНИТАРНОЙ ОЦЕНКЕ ВОДОЕМОВ

03. 00. 07- микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ЧЕЛЯБИНСК - 199.8

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской Академии наук и Оренбургской государственной медицинской академии МЗ РФ.

Научный консультант: член-корреспондент РАМН, заслуженный

деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор О.В.БУХАРИН

Официальные оппоненты: 1. доктор медицинских наук, профессор

З.Г. Габидуллин,

2. доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц,

3. доктор медицинских наук, профессор Ю.Д. Каган

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится « <7 » 1998 года в « сов

на заседании Диссертационного совета Д.084.04.02 при Челябинской государственной медицинской академии (454092, Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан: ь » 1998 года.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

А.В.Зурочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регистрируемое повсеместно ухудшение экологического и санитарного состояния водоемов определило повышенный интерес исследователей к углубленному изучению водных микроорганизмов (бактерий, водорослей и простейших), составляющих первичное звено экологических систем и являющихся наиболее информативной диагностической компонентой биоты. Эти микроорганизмы характеризуются многообразием форм, а также широтой своих биоценотическнх взаимодействий (Заварзин Г.А.,1992; Уморин П.П.,1992; Звягинцев Д.Г. с соавт., 1993; Venkateswarlu V. , 1986; Drake J.А., 1991). Их изучение позволило выявить и описать множество новых видов, участвующих в симбиотиче-ских взаимоотношениях (Родина А.Г., 1965; Романенко В.И., Кузнецов С.И., 1974), а также оценить их значение для экологического состояния водоемов (Горленко В.М. с соавт. 1977). При этом основой исследований водных микроорганизмов служат количественные показатели общего числа особей, видового разнообразия, биомассы, доли индикаторных и са-нитарно-показательных видов (Кузнецов С.И., Дубинина Г.А., 1989). Однако наиболее информативными для определения санитарного и экологического состояния объектов внешней среды являются качественные показатели, позволяющие выявлять предшествующие необратимым изменения природной среды (Бухарин О.В. с соавт., 1996; 1997). Поэтому микробиологическая характеристика микробиоценозов, основанная на анализе межмикробных симбиотических взаимодействий гидробионтов, связанных участием в круговороте микро- и макроэлементов (Глаголева O.E. с соавт., 1992), или продукцией биологически активных веществ, например, -лизоцима (Готтшалк Г., 1982; Шлегель Г., 1987), может быть использована для оценки состояния водоемов.

В настоящее время известно наличие лизоцимной активности у широкого круга организмов, включая бактерии, водоросли и простейших (Купер Э„ 1980; Багшок Н.В. с соавт., 1983; Bagnyuk V.M. et al., 1990). Изучается способность микроорганизмов, в основном бактерий, к деградации лизоцима - антилизоцимная активность, направленная на выживание патогена в организме хозяина путем защиты своего пептидогликанового полимера от воздействия лизоцима (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1996). Исследование антилизоцимной активности у микроорганизмов, однако, ограничено узким кругом патогенных для человека бактерий. Существование антилизо-цимного признака у других микроорганизмов, например, - у водорослей и простейших остаются под вопросом, хотя существование у них подобного механизма вполне объяснимо с общебиологических позиций.

Соловых Г.Н. (1995) представлены данные о наличии лизоцим-антилизоцимных взаимодействий у гидробионтов в биоценозах водоемов,

названные автором «системой». В данном случае под системой понимается взаимодействие двух составляющих: лизоцимактивных и антилизоци-мактивных форм организмов. Однако остаются невыясненными широта распространения и степень выраженности этих признаков у гидробионтов. Имеющиеся в литературе данные о лизоцим-антилизоцимных взаимодействиях бактерий с водорослями и с простейшими носят предварительный характер и нуждаются в специальном экспериментальном изучении. Не определен характер лизоцим-антилизоцимных связей у гидробионтов и их функциональное значение в жизнедеятельности водных сообществ.

Таким образом, изучение лизоцим-антилизоцимных взаимодействий водных микроорганизмов имеет фундаментальное значение, выявляя новые формы симбиотических связей в естественных биоценозах, а в прикладном аспекте важно для разработки и апробации новых способов диагностики экологического и санитарного состояния водоемов.

Цель работы - микробиологическая характеристика симбиотических связей среди водных микроорганизмов на основе лизоцим-антилизоцимных взаимодействий и их роли в функционировании водных сообществ и формировании качества воды природных водоемов. Основные задачи:

1. На основании изучения видового разнообразия сообществ пресных водоемов, различающихся санитарным состоянием, оценить распространение и выраженность персистентных свойств бактерий, водорослей и простейших, отобрать наиболее информативные признаки, пригодные для анализа биоценотических взаимодействий у гидробионтов.

2. Изучить роль и значение функциональной связи «лизоцим-антилизоцим» в жизнедеятельности водных сообществ (бактерий, водорослей и простейших).

3. На основе изменения биоценотических взаимодействий гидробионтов под действием абиотических и биотических факторов антропогенной природы определить биоиндикационные возможности лизоцим-антилизоцимных связей для оценки качества воды.

4. На основе изменения биоценотических взаимодействий гидробионтов под действием абиотических и биотических факторов антропогенной природы определить биоиндикационные возможности лизоцим-антилизоцимных связей для оценки качества воды.

5. С использованием микробиологической характеристики симбиотических взаимодействий гидробионтов разработать новые методические подходы в оценке экологического и санитарного состояния поверхностных водоемов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Взаимодействия «лизоцим-антилизоцим» в водорослевых сообществах могут существовать автономно от бактериальных, а также иметь характер сложных сетевых связей в водных биоценозах.

2. Лизоцим гидробионтов определяет степень гетерогенности бактериальных популяций по антилизоцимному признаку.

3. Лизоцим-антилизоцимные взаимодействия служат универсальным механизмом, обеспечивающим существование сочленов альго-бактериальных и протозойно-бактериальных сообществ.

4. Микробиологическая характеристика симбиотических взаимодействий гидробионтов - новый подход в оценке качества воды пресных водоемов.

Научная новизна.

Впервые у водорослей обнаружена связь «лизоцим-антилизоцим», функционирующая как автономно внутри одного сообщества, так и являющаяся компонентом сложных сетевых взаимодействий гидробионтов. Выявлен универсальный характер лизоцим-антилизоцимных взаимоотношений в бактериальных, альго-бактериальных и протозойно-бактериальных сообществах. Показано участие лизоцим-антилизоцимных взаимодействий в жизнедеятельности водных биоценозов, где лизоцим гидробионтов регулирует гетерогенность бактериальных популяций по антилизоцимному признаку, а антилизоцимный фактор обеспечивает выживание микроорганизмов.

На основе микробиологической характеристики симбиотических взаимодействий гидробионтов разработаны новые подходы к оценке качества воды природных водоемов.

Практическая значимость работы.

Результаты исследований позволили разработать новые методы оценки санитарного состояния водоемов: "Способ определения свежего фекального загрязнения поверхностных водоемов " (патент РФ N 2078823), "Способ определения степени сапробности воды пресных водоемов" (Пол. реш. ВНИИГПЭ на выдачу патента РФ от 29.12.1997 г. по заявке на изобретение № 96120743), а также " Способ прогнозирования состояния водных биоценозов " (патент РФ № 2052816).

Сравнительная оценка показала высокую эффективность и соответствие разработанных методов общепринятым стандартам, что позволяет использовать их в системе экологического и санитарно-гигиенического мониторинга водоемов.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были доложены и обсуждены на I - ой областной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 1993); юбилейной научной сессии "Актуальные проблемы теоретической

и клинической медицины", посвященной 50 - летию Оренбургского медицинского института (Оренбург, 1994); всероссийской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 1994); юбилейных чтениях памяти В.Д. Тимакова в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (март 1996, Москва), региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 1996); 7 съезде всероссийского Общества эпидемиологов, бактериологов и паразитологов (Москва, 1997); всероссийской научной конференции по проблемам персистенции микроорганизмов (Оренбург, 1997); фрагменты работы экспонировались во Всероссийском выставочном центре в рамках выставок «Экология-94», «Экология-95», «Охрана окружающей среды-96», «Охрана окружающей среды-97», «Экологи - 850 летию Москвы», «Водоочистительные устройства и приборы контроля качества питьевой воды - 97», «Наука России - агропромышленному комплексу» (1997-98), а также на областных выставках научно-технического творчества молодежи, где отмечены Дипломом лауреата (Оренбург, 1995) и Дипломом II степени за лучшую научно-техническую разработку (Оренбург, 1996). Работы по материалам диссертации отмечены на конкурсе: научно-исследовательских работ молодых ученых и специалистов им. А.Д. Сахарова (Оренбург, 1996) - второе место, и на конкурсе научно-исследовательских работ ученых и специалистов им. И.И.Мечникова (Оренбург, 1997)- 1 место.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, получено 2 патента РФ и 1 приоритетная справка ВНИИГПЭ (см. список).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 252 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 190 отечественных и 97 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 56 рисунками.

Основные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором, исследования с использованием электронной микроскопии проводились в комплексе с лабораторией анатомии микроорганизмов (руководитель - к.б.н. Н.Д.Константинова) НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.

Исследование антилизоцимной активности водорослей проводилось совместно с к.б.н. Алехиной Г.П. (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург), мониторинг за экологическим состоянием Ириклинского водохранилища осуществляли совместно с д.б.н. Г.Н.Соловых (Оренбургская Государственная медицинская академия).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Основным материалом для проводимых исследований послужила вода среднего течения реки Урал в районе города Оренбурга. Ряд исследований, связанных с экологическим мониторингом, был проведен также на Ириклинском водохранилище (1991-1993) и в дельте реки Волги (1987-1990). Состояние водоисточников оценивалось по физико-химическим, гидробиологическим и микробиологическим параметрам в соответствии с методическими и инструктивными материалами, указанными в табл.1.

Качественные пробы планктона отбирали планктонной сеткой, количественные - батометром Молчанова. Исследуемую воду фильтровали через мембранные фильтры № 0,19; 0,3; 0,4 фирмы " Сынпор ". Пробы, предназначенные для количественного анализа, фиксировали добавлением 3-4 капель 40% - го раствора формалина. Выделение гидробионтов, их идентификация, а также определение биологических свойств осуществляли общепринятыми методами (табл.1).

Аксенические культуры водорослей получали путем разобщения на единичные клетки концентрированной водорослевой массы по поверхности агаризованной среды Прата, содержащей водный раствор мертиолата в концентрации 2 10" г/л (оригинальная методика).

В работе использованы изогенные штаммы Escherichia coli К-12 J53, любезно предоставленные проф. В.М. Бондаренко (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, г. Москва). Штамм Е. coli К-12 J53 tr 22-110, благодаря встроенной в него плазмиде, имел антилизоцимную активность, тогда как штамм Е. coli К-12 J53 не проявлял указанного признака. Предварительная оценка не выявила цитотоксичности исследуемого штамма эшерихий (вариант АЛА-) в тесте на аксенической культуре инфузорий Tetrachymena pyriformis, что обусловило возможность его использования для анализа взаимодействий с тетрахименами в качестве контроля.

Трехсуточные бульонные культуры инфузорий в объеме 5 мл, содержащие 104 особей/мл, заражали изогенными штаммами E.coli К-12 J53 tr 22-110 (ALA+ опыт) и E.coli К-12 J 53 (ALA- контроль) в дозе 106 КОЕ/мл. Опытные и контрольные образцы культивировали при 22-25°С. Учет результатов сокультивирования осуществляли на 1,5,10,15,20,30 и 40-е сутки.

Для популяционной характеристики антилизоцимной активности выросшие колониями на питательной среде клоны кишечных палочек в количестве не менее 100 методом "отпечатков" переносили на среды, со-

Изученные параметры водоисточников и методы их оценки.

Регистрируемые свойства Способ оценки

1 2 3

Физико-химическая характеристика водоемов Температура (среднегодовая и в момент отбора), кислотно-щелочное равновесие или рН воды, концентрация растворенного кислорода ( рОг), биологическое потребление кислорода (БПК5 и БПКПОлн-), запах, прозрачность, цветность, мутность, сухой остаток, наличие и концентрация сульфатов, хлоридов, железа, марганца, никеля, цинка, олова и др.. Общая жесткость, щелочность общая и некарбонатная, концентрация кальция, магния, калия+натрия, бикарбонатов, солей аммония,нитратов, нитритов, фенола, нефтепродуктов(суммарно) и т.п. Общая токсичность воды ( Биотестирование с использованием Paramecium caudatum). ГОСТы 18963-73 "Вода питьевая"; 24481 -80 "Вода питьевая. Отбор проб"; 2874-73 "Вода питьевая, методы анализа"; 17.1.03 - 77/СТ СЭВ 1924-79 " Охрана природы. Гидросфера. Правила выбора и оценки качества водоисточника централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения", "Правила охраны поверхностных вод от загрязнения сточными водами"; "Методы исследования качества воды водоемов'^ Новиков Ю.В. и др., 1990). "Методические рекомендации по применению методов биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабже-ния"(1995).

Гидробиологическая характеристика водоемов Определение биомассы бактерио- и фитопланктона. Подсчет численности бактерий, простейших и водорослей, индекса видового разнообразия, сапроб-ности и индекса сапробности. Оценка степени загрязненности воды. "Унифицированные методы исследования качества воды.Методы биологического анализа во-ды"(1983);"Водопользование и охрана водоемов. Классификация качества текучих вод" стандарт ГДР TVL 22764-1982 (Жукинский В.Н. и др. (1981; 1990); Шеннон и Уэвери (1949); Kolkwitz R. et Marsson M. (1902;1908), R. Pantle et H. Buch (1955 ); шкала Wilim J. et DorrisT. (1965).

Таблица [.(продолжение)

1 2 3

Санитарно-мпкробиологическая характеристика водо-CMOI! Типичность морфологии выделенных микро-водорослсй и простейших. Определение общей микробной обссмененно-сти воды; выделение бактерий группы кишечных палочек с вычислением индекса ЛКП/ КП; Типичность морфологических и тинкториаль-пых свойств выделенных бактерий; Определение их культуральиых, биохимических свойств, а также видовой принадлежности Лизоцимная и аптилизоцимная активность у водорослей, простейших и бактерий. "Антиинтерфероновая активность" Антикомплементарная активность "Определитель пресноводных водорослей СССР" (1951-1959; 1969); "Жизнь пресных водоемов (1949). ГОСТ 2874-82; ГОСТ 18963-73; Методуказапия по санитарно-микробио-логичсскому анализу воды поверхностных водоемов (1981). На среде Эндо, МПА, Сабуро и др., оксидазная проба, окраска по Граму, световая микроскопия. Энтсрогссты, стафитесты, анаэротссты, неферм-тесты (La Chema); реакция агглютинации на стекле со специфическими групповыми и моно-рецепторными сыворотками; Идентификация с помощью Bergey's Manual Determinetive (1994). Чашечным методом с использованием принципа отсроченного антагонизма по отношению к тест-культуре Micrococcus lysodeikticus; фотонефело метрическим методом (Бухарин О.В. и др.. 1974). Чашечным методом с использованием принципа отсроченного антагонизма к тест-культуре Corynebacterium xerosis (Бухарин О.В., Соколов В.Ю.,1990). Фотопефелометрическим методом по скорости лизиса комплементом сенсибилизированных эритроцитов барана (Мисстов И.А.. 1993)

держащие яичный лизоцим для определения антилизоцимной активности. Все эшерихии независимо от источника выделения обладали типичными биологическими свойствами. Кишечные палочки серогрупп 0-20, 0-111 , 0-75, 0-128, 0-114 изолированы от больных людей. От здоровых людей, а также из реки Урал в районе водозабора (чистая зона) и сброса (загрязненная зона), из очистных сооружений были выделены типичные кишечные палочки, несеротипируемые стандартным набором диагностических сывороток.

Подготовку образцов для электронной микроскопии и ультраструктурные исследования проводили на базе лаборатории анатомии микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи по методикам, принятым в электрон-номикроскопических исследованиях. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-100В при инструментальных увеличениях от х 3000 до 60000, производя выборочную фоторегистрацию.

Полученные результаты подвергнуты статистической обработке (Каминский Л.С., 1964).

Результаты исследования н их обсуждение.

В качестве фоновых данных была использована видовая характеристика гидробионтов - обитателей пресноводных водоемов. Исследования начали с изучения альгофлоры. За период проводимых исследований в р. Урал и в его притоках обнаружено. За период проводимых исследований в р. Урал и в притоках обнаружено 230 видов водорослей, относящихся к следующим отделам: сине-зеленые - 35, золотистые - 2, диатомовые - 92, желто-зеленые - 5, эвгленовые - 10, пирофитовые - 6, зеленые - 80.

Диатомовые наиболее часто были представлены видами Cyclotella meneghiniana, Navícula gracilis, N. radiosa, Diatoma vulgare. Среди зеленых чаще всего обнаруживались Scenedesmus acuminatus, Oocystis lacustris, Coelastrum mícroporum, Pediastrum boryanum, Scenedesmus quadricauda, Ankistrodesmus angustus, Dictyosphaerium pulchellum, Pediastrum tetras, Pandorina morum. Среди сине-зеленых водорослей доминировали Anabaena flos-aquae, Merismopedia punctata, Aphanizomenon flos-aquae, Microcystis aerugenosa, M. flos-aquae, Oscillatoria limosa.

Бактериальную компоненту альго-бактериального сообщества составляли 54 вида, причем наиболее часто из воды выделяли изоляты представителей семейства Enterobacteriaceae (33-40%), а также Bacillaceae (1732%), Streptococcaceae (17%), Vibrionaceae (4-13%), Pseudomonadoceae (7%), Beggiatoa (2%). Среди простейших - обитателей исследованных рек было зарегистрировано около 50 видов классов Phytomastigophorea, Zoomastigophorea, Lobosea, Heliosoea , а также Ciliatea. Среди них наиболее часто встречались Chlamidomonas debrayara, Litonotus cygnus, Euplotes patella, E. liaron, Paramecium bursaria и Didinium nasutum, Euglena viridis, Pelomixa palustris, Actinophrys sol, Colpidium colpoda, Litonotus cygnus,

Dileptus anserl, Stilonichia mytilus, Urotrichia globosa, Euplotes patella, Leucophrydium putrium и Aspidisca lunceus.

Далее был проведен анализ распространения у выделенных гидро-бионтов персистентных свойств. Среди обнаруженных изолятов бактерий наиболее активными продуцентами лизоцима были Azotobacter chroococcum, Sphaerotilus natans и Pseudomonas stutzen. Наивысшую анти-лизоцимную активность проявляли Artrobacter picolinofylus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, E, coli. Из аллохтонной части биоты высокие значения антилизоцимной активности встречались у S. typhimurium, S. flexneri и S. sonnei. Кроме антилизоцимной активности у выделенных микроорганизмов регистрировалась также антикомплементарная и «антиинтерфероно-вая» активности. В реке Урал были выделены бактерии относящиеся к 9 видам, среди которых антилизоцимным признаком характеризовалась Pseudomonas putida и Klebsiella ozenae. Также встречались культуры, обладающие разной комбинацией признаков: одновременно антилизоцимной и «антиинтерфероновой активностью» (Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa) или антилизоцимной и антикомплементарной активностями (Hafnia alvei, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii). У Serratia marcescens, Klebsiella ozaenae, Proteus vulgaris, Escherichia coli определялись все три признака. Поскольку «антиинтерфероновая» и антикомплементарная активности были характерны, в основном, для санитарно-показательной микрофлоры и не встречались у других микроорганизмов, мы сконцентрировали свое внимание на лизоцимном и антилизоцимном признаках гидро-бионтов. Сведения, приведенные Соловых Г.Н. (1995) и полученные нами данные, дали основание считать, что именно эти свойства широко представлены в планктонных сообществах водоемов (табл.2 - 4).

В популяциях водных микроорганизмов были выявлены культуры, обладающие лизоцимной (0,2 103 - 1,6 103 КОЕ/мл) и антилизоцимной активностью (0,8 10'- 1,8 10 КОЕ/мл). Диапазон антилизоцимного признака у выделенных бактерий колебался от 2 до 15 мкг/мл, а лизоцимного - от 0,012 до 0,06 мкг/мл. Антилизоцимной активностью характеризовались условно-патогенные и санитарно-показательные микроорганизмы (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Klebsiella putida, Pseudomonas putida), a также типичные представители водной микрофлоры* Artrobacter picolinophylus, A. terregens, Azotobacter vinilandii, Flexitrix doroteae и др. Лизоцимактивными были Bacillus subtilis, Micrococcus roseus и Micrococcus varians, Sphaerotilus natans и др.

Учитывая, что данные по распространению лизоцимной и антилизоцимной активности среди бактериальной микрофлоры водоемов носят разрозненный, а порой и противоречивый характер, мы проанализировали имеющиеся в литературе сведения и соотнесли их с собственными данными (помечены звездочкой, табл. 2).

Распространение и уровни лизоцимной и антилизоцимной активности среди водной бактериофлоры

Вид Лизоцимная активность Антилизоцимная активность

(частота, уровень) (авторы) (частота, уровень) (авторы)

1 2 3 4 5

Escherichia coli у 10-17% изолятов (Бухарин с соавт.,1972) у 93% изолятов (Бухарин, Ананьина, 1983), (Гриценко, Ляшен-ко, 1994)

Citrobacter freundii нет* Немпева, Алехина (1996) у 80% изолятов* Немцева. Алехина (1996)

Salmonella misson, S.typhimurium, Shigella flexneri, S. sonnei у 5-30% изолятов уЗ% изолятов* (Малышкин, 1985) (Куликова с соавт.,1975) (Немцева, 1981) у 64 % изолятов (5-10 мкг) у 76 - 86,7% изолятов(6-12 мкг/мл)* (Усвяцов, 1983) (Немцева, 1983)

Klebsiella ozaenae K. pneumoniae у 50-70% изолятов* Немцева, Алехина (1996) у 40-50% изолятов(3-8 мкг/мл) у 30% изолятов (2-4 мкг/мл)* (Сурикова, 1992);

F.nterobacter cloaceae у 70% изолятов(2-6 мкг/мл)* Немцева, Алехина (1996)

Serratia marcescens у 60% изолятов (6-8 мкг/мл)* Немцева, Алехина (1996)

Proteus mirabilis P. vulgaris у 60% изолятов ( 4-6 мкг/ мл)* Немцева, Алехина (1996)

Pseudomonas aeruginosa, P. putida P. stutzeri У 25% изолятов у 20% изолятов (0,02+0,001мкг/мл)* у 30% изолятов (0,68+0,34 мкг/мл)* (Куликова с еоавт., 1975) Немцева, Алехина (1996) « « « « у2-5% изолятов (3-8 мкг/мл)* у 80% изолятов (3-8 мкг/мл)* у 70% изолятов (2-6 мкг/ мл)* Немцева, Алехина (1996) « « « «

Таблица 2 (продолжение)

1 2 3 4 5

Aeromonas aerogencs нет* Немцева, Алехина (1996) нет* Немцева, Алехина (1996)

Л. hydrophila нет* « « 2-4 (мкг/мл)* « «

Cardiobacterium hominis нет* Немцева, Алехина (1996) 50% изолятов (3-4 мкг/мл)* Немцева, Алехина (1996)

Beggiatoa gigantea, У 20% изолятов* Немцева, Алехина (1996) нет* Немцева, Алехина (1996)

В. alba

Sphaerotilus natans у 100% изолятов Немцева, Алехина (1996) ист* Немцева, Алехина (1996)

( 0.4+0,02 мкг/мл)*

Artrobacter нет* Немцева, Алехина (1996) у 60% изолятов Немцева, Алехина (1996)

picolinofylus, у 70% изолятов « « (6-8 мкг/мл)* « «

Л. terregcns. (0,0210,001 кг/мл)*

A. giobiformis. нет (Соловых, 1995) есть (Соловых, 1995)

A. cilrcus нет « « « «

Bacillus brevis. нет (Соловых, 1995) есть (Соловых, 1995)

В coprogenes. ист « <i есть « «

B. filaris. нет « « есть « «

B. mycoides, нет « « есть « «

B.giobiformis, нет « « есть « «

B. cereus. нет « « есть « «

B. idosus. нет « « есть « «

B. megatherium нет « « есть « «

B. subtilis. нет Kaufman, Bauer (1956), нет* Немцева, Алехина (1996)

B. cereus, нет Strange, Dark (1957), нет* « «

B. mesentcricus, нет Куликова с соавт.(1975) нет* « «

Azotobacter vinilandii нет* Немцева, Алехина (1996) У 20% изолятов (2мкг/мл)* Немцева, Алехина (1996)

A. chroococcum у 10% изолятов (0,2 « « нет « «

мкг/мл)*

Таблица 2 (продолжение)

1 2 3 4 5

Nocardia opaca, 0,02 мкг/мл (единичные « « нет* « «

N. paraffinae наблюдения)'1' 0.15 мкг/мл (единичные наблюдения)* « « нет « «

Flexibactcr 0,02 мкг/мл* « « нет* (единичные наблюде- « «

aggregans (единичные наблюдения) ния)

нет* (единичные наблю- « « 2 мкг/мл (единичные на- « «

Flexithrix dorotheae дения) блюдения)*

Calymmatobacterium 0,012 кг/мл* « « нет* (единичные наблюде- « «

granulomatis (единичные наблюдения) ния)

Streptococcus faecalis у 20% изолятов Немцева, Алехина (1996) нет* Немцева, Алехина (1996)

(0,02мкг/мл)*

Micrococcus sp. есть Holt (1971) нет (Соловых, 1995)

Micrococcus roseus, есть (Соловых, 1995) нет » »

M. varians, есть » » нет » »

M. luteus. есть » » нет » »

M. subtilis, есть » » нет » »

M. flavus. есть » » нет » »

M. alba, есть » » нет » »

M. viriculosis есть » » нет » »

M. aureus, есть (Соловых, 1995) нет » »

M. citreus, есть » » нет (Соловых, 1995)

M. cremoides, есть » » нет » »

M. radiatus, есть » » нет » »

M. cirrhiformis есть » » нет » »

M. species есть Багнюк с соавт.(1980) нет » »

Лизоцимная и антилизоцимная активность _Различных водорослей.__

Продукция Антилизоцимная

Виды водорослей лизоцима активность

водорослями водорослей

(м к г/мл) (м кг/мл)

1 2 4

сине-зеленые

l.Aphanizomenon flos-aquae(L) Ralfs 5,5 0

2. Microcyctis aerugenosa Kutz. 0 3

3. M. flos-aquae (Wittr.) Kirchn. 0,19 0

4. Merismopedia tenuissima Lemn. 0 3

5. M. glauca (Ehr.) Nag. 0 0

6. Oscillatoria limosa Ag. 0 3

7. 0. Sancta (Kutz.) Gom. 0 3

8. Coelosphaerium kuetzingianum Nag. 0 0

9. Anabaena lemmermany P.Rieht. 0 3

зеленые

10.Scenedesmus quadricauda (Turp.)Breb. 0.3 0

11. S. acuminatus (Legerh.) Chood. 0 6

12. S. bijugatus (Turp.) Kutz. 0 0

13. S. intermedius Chood. 0 2

14. S. denticulatus Lagerh. 0 0

15. Ankistrodesmus acicularis (A.Br.) Korsch. 0 3

16. A. angustus Bern. 0.3 0

17. Pandorina morum Bory 0 3

18. Oocistis lacustris Chod. 0.3 0

19. Pediastrum boryanum Turp. Menegh. 0.3 0

20. Chlorella vulgaris Beiyr. 0 2

диатомовые

21. Cyclotella menegheneana Thw. 0 0

22. Fragilaria crotonensis Kitt. 0 0

23. Sunedra ulna (Niyzsch.) Ehr. 0.03 0

24. Navicula cryptocephala Kutz. 0 0

25. Nitzschia siginoidea (Ehr.) Wsm. 0 0

26. Cymbella cistula (Hemp.) Gum. 0 0

27. Diatoma vulgare Bory 0.03 0

28. D. elangatum (Lyngb.) Heib. 0 0

29. Amphora ovalis Kutz. 0 0

30. Bacillaria paradoxa Gmelin. 0 0

В результате обозначился широкий круг сапрофитической микрофлоры, характеризующейся лизоцимным и антилизоцимным признаками.

В флористическом списке выделенных из изучаемых водоемов водорослей, были отобраны наиболее распространенные виды для выделения их монокультур и определения у них лизоцимной и антилизоцимной активностей. Из 30 исследуемых альгокультур у 8 выявлена лизоцимная активность. Из них четвертая часть относилась к сине-зеленым, около половины - к зеленым водорослям и четверть - к диатомовым. В количественном отношении продукция лизоцима у сине-зеленых водорослей (2,85 + 0,14 мкг/мл), значительно превышала таковую у зеленых и диатомовых (0,3 мкг/мл и 0,03 мкг/мг).

Антилизоцимная активность наиболее широко была представлена среди сине-зеленых водорослей (50% изучаемых видов) (табл.3) и составляла в среднем 3 + 0,15 мкг/мл. Самыми активными среди них оказались: Microcystis aerugenosa, Oscillatoria limosa, O. sancta, Merismopedia tenuissima. Возможно, это связано с наличием пептидогликанового полимера у прокариотических сине-зеленых водорослей и необходимостью его защиты от лизоцима, выделяемого другими представителями биоценозов. Антилизоцимный признак также имел место у зеленых водорослей (33%), среди которых наиболее активными были: Scenedesmus acuminatus, Ankistrodesmus acicularis, Pandorina morum. В итоге выявлено, что водоросли, также, как и бактериальные культуры характеризовались наличием лизоцимной и антилизоцимной активности.

Среди простейших также были выявлены различные по степени ли-зоцимпродукции виды - как высокие (P. caudatum Ehrb., T. pyriformis Ehrb., P. palustris Greet.), так и низкие (M. cordiformis Schew.). У широко распространенных в исследуемых реках С. colpoda Ehrb., С. cucullus О.F. Müll, V. nebulifera O.F. Müll, L. cygnus O.F. Müll и D. anser O.F. Müll, наблюдался средний уровень проявления лизоцимного признака (табл.4). Что касается антилизоцимной активности, то в наших исследованиях у простейших она не найдена.

Таким образом, в ряду экспериментально изученных у гидробионтов факторов персистенции лизоцим-антилизоцимные характеристики занимают ведущее положение. Широкое представительство у водоемной микрофлоры лизоцима неизбежно должно было способствовать появлению микроорганизмов, умеющих преодолевать этот барьер. Вот почему выявление антилизоцимной активности у ряда гидробионтов, направленной на деградацию лизоцима других организмов, мы расценили как вектор системы, влияющей на процесс симбиотических взаимоотношений в водных сообществах.

Особый интерес представляло изучение лизоцим-антилизоцимных взаимодействий у водорослей как наименее изученной в этом отноше-

нии компоненты биоценоза.

Уровень лизоцимау некоторых простейших

Виды Лизоцимная активность

в гомогенате мкг/мл в пересчете на I клетку

Paramecium caudatum 0,96+0,03 1,92 10°

Colpidium colpoda 0,38+0,02 0,95 10"3

Colpoda cucullus 0,37+0,02 0,93 ТО"3

Hexotricha caudata 0,50+0,02 1,00 10"3

Chilodonella unciata 0,40+0,02 0,80 10"3

Tetrahymena pyriformis 1,2+0,06 2,4010"3

Amoeba proteus 0,88+0,03 1,7610"3

Vorticella nebulifera 0,50+0,02 1,0010"3

Meseres cordiformis 0,11±0,01 0,22 10"3

Litonotus cygnus 0,63+0,03 1,2610"3

Dileptus anser 0,50+0,02 1,0010"3

Значение лизоци.м-антилнзоцимных связен для микроводорослевых сообществ

Наличие лизоцимного и антилизоцимного признаков у представителей альгофлоры дает основание заключить, что в альгосообществе существует самостоятельная связка «лизоцим-антилизоцим». На автономный характер ее «работы» указывают полученные нами экспериментальные данные по климактерической сукцессии изолированного природного водорослевого биоценоза, состоящего первоначально из 131 вида водорослей и стабилизировавшегося на уровне 4 видов,через 12 месяцев (срок наблюдения). В результате получены стойкие ассоциации альгокультур Aphanizomenon flos-aque, Pediastrum boruanum (ЛА, соответственно, 5,5 и 0,3 мкг/мл) и Scenedesmus acuminatus, Oscillatoria limosa (АЛА по 3,0 мкг/мл), в которых лизоцимактивные формы сочетались с антилизоцимак-тивными, что и обеспечивало их длительное существование.

В ходе полевых исследований отмечено, что водоросли, обладающие лизоцимной и антилизоцимной активностью, не только широко распространены в реке Урал и его притоках, но и встречались там на протяжении всего года. Возможно, наличие лизоцимной активности обеспечивает водорослям антагонистические преимущества и создает условия для расширения местообитаний и экологических ниш, тогда как антилизоцимная активность представителей альгофлоры сдерживает эти тенденции у других видов, способствуя их сосуществованию в водных биоценозах подобно тому, как это было показано в отношении бактерий (Бухарин О.В., 1994).

В природных биоценозах нами обнаружен однотипный характер изменения численности водорослей и бактерий с лизоцимным и антилизо-цимным признаками (рис. 1), что также, вероятно, свидетельствует о возможности самостоятельного функционирования лизоцим-антилизоцимных связей в водорослевых и бактериальных сообществах. По-видимому, взаимодействия такого рода необходимы водорослям для совместного существования и устойчивости их сообществ. Это справедливо и для периода «цветения» водоемов, когда наблюдается преимещуственное развитие 2-3 видов водорослей. Л.В. Григорьевой с соавт. (1985) представлены сведения о конкурентном взаимодействии альгокультур Microcystis aeruginisa и Aphanizomenon flos-aquae во время «цветения» водоемов, одновременно оказывающее подавляющее действие на сопутствующую бактериофлору. Это находит объяснение в свете наших данных: М. aeruginisa характеризуется антилизоцимным признаком (2-3 мкг/мл), а культура A. flos-aquae лизоцимактивна. Таким образом, данные виды объединены связкой "лизоцим-антилизоцим", обеспечивающей автономное от бактерий функционирование альгоценоза.

В то же время ясно, что водорослевые сообщества не являются замкнутой системой, а входят составной частью в биоценоз и находятся в постоянном контакте с бактериями и простейшими. Поэтому лизоцим-антилизоцимные взаимодействия в водном биоценозе могут принимать характер сложных сетевых связей. На это указывают наши результаты экспериментального сокультивирования бактерий и водорослей: длительное существование бактерий Е. coli, характеризующихся антилизоцимным признаком, в присутствии лизоцима водоросли S. quadricauda (42 суток -срок наблюдения). В противоположность этому, доля кишечных палочек, лишенных антилизоцимного признака, постепенно снижалась и к 28 суткам они элиминировались из экспериментального биоценоза. Таким образом, при сокультивировании бактерий и водорослей наблюдалось противодействие лизоциму водорослей со стороны антилизоцимной активности эшерихий. При наличии в исследуемом микрокосме живых водорослей, стабильно сохраняющих численность, полученные данные могут свидетельствовать об истощении лизоцима водорослей антилизоцимным фактором бактерий.

В природных водоемах также прослежено взаимное влияние лизоцимных и антилизоцимных водорослей и бактерий, выражающееся в снижении доли антилизоцимактивных видов водорослей вслед за увеличением доли лизоцимактивных видов бактерий и наоборот (рис 1). В своих исследованиях мы не изолировали сопутствующую водорослевую флору от простейших. Однако единичные находки Chlorella vulgaris, характеризующиеся антилизоцимным признаком, могут объяснить частое

Лизоцимная активность

800000

о.

5 600000 [Ц

1 400000 | 200000 0

■3=1

-Й

Лизоцимная и антилизоцимиая активность

800000

о.

5 600000

400000 | 200000 0

Антилизоцимная активность

800000

о н

0 ¡..аН^К*?^

Рис. 1. Количество лизоцим- и антилизоци-мактивных водорослей (столбики) и бактерий (кривые) в разных акваториях бассейна реки Урал (1. р. Урал «водозабор»; 2. р. Урал «сброс»; 3. р. Сакмара; 4. р. Каргалка; 5. р. Черная).

мутуалистнческое сосуществование этою вида водорослей с инфузориями, описанное рядом авторов (Уиттакер Р., 1980; Маргелис Л., 1983), функционированием лизоцим-антилизоцимной связки.

Таким образом, в природных водных сообществах лизоцим-антилизоцимные взаимодействия у водорослей могут осуществляться как-автономно от бактериальных или других компонентов биоценоза, так и иметь характер сложных сетевых связей. Это положение соответствует общим экологическим представлениям о функционировании биоценозов. Согласно современной формулировке правила К.Мебиуса - Г.Ф. Морозова: «виды в биоценозе приспособлены друг к другу настолько, что их сообщество составляет внутренне противоречивое, но единое и взаимно увязанное целое» (Реймерс Н.Ф., 1994). По-видимому, участие лизоцима в межпопуляционных взаимодействиях биоценоза невозможно без его антипода — антилизоцимного фактора. Выявленный антилизоцимный признак необходим гидробионтам для преодоления лизоцимной активности других сочленов биоценоза и, в итоге, для устойчивого существования последнего. Логично ожидать, что антилизоцимактивные формы инактивируют лизоцим, и именно в этом состоит механизм взаимодействия сочленов сообщества.

Это предположение могло быть проверено в эксперименте на модельных системах «лизоцим-антилизоцпм» симбионтов, где их отношения основаны на фермент-субстратных связях.

Лизоцпм-антилнзоцимныс взаимодействия как универсальный механизм выживания микроорганизмов в альго-бактерпальных н протозойно-бактернальных сообществах

Изучение модельной системы «водоросли-бактерии» осуществлено при экспериментальном сокультивированни аксенической культуры водоросли Scenedesmus quadricauda с Е. coli J53 22-1 10 (АЛА+). Сокультиви-рование проводилось в колбе объемом 2 дм' в течение 42 суток при обычном световом режиме и температуре 20"С. Контролем служила колба, содержащая водоросль указанного вида и исходный изогенный штамм кишечной палочки J53 (АЛА -). Максимальные значения лизоцимной активности водорослей (6 мкг/мл) отмечали на 3 сутки опыта, затем наблюдалась некоторая стабилизация в продукции лизоцима (6-14 сутки), с последующим снижением продукции лизоцима до 2-3 мкг/мл и исчезновением признака к 30 суткам эксперимента. Антилизоцимная активность эшс-рихий с начала эксперимента с 3 мкг/мл постепенно нарастала и к 14 суткам составила 5 мкг/мл. К 35 - 42 суткам отмечено снижение антилизо-цимной активности, которая стабилизировалась на уровне 4 мкг/мл. В контрольном микрокосме в условиях сокультивирования S. quadricauda и Е. coli (АЛА-) продукция лизоцима водорослями наблюдалась в обычном режиме (0,3 - 0,4 мкг/мл), а антилизоцимная активность у исследуемых

бактерий не проявлялась.

Аналогичная закономерность выявлена при использовании другой модельной системы: «простейшие - бактерии», в условиях экспериментального сокультивировання аксенической культуры инфузорий Т. pyriformis с той же изогенной парой Е. coli J53 (АЛА -) и J53 22-110 (АЛЛ +). В опытных образцах концентрация кишечных палочек (вариант AJIA+) в первые сутки снизилась до 104 КОЕ/мл с последующим подъемом на 14-е сутки до 5 105 КОЕ/мл. К 21 суткам численность E.coli (АЛА+) установилась на уровне 104 КОЕ/мл и сохранялась до конца эксперимента. В контрольных образцах численность кишечных палочек (вариант АЛА-) в первые сутки снизилась с 107 КОЕ/мл до 8 102КОЕ/.мл, к седьмым суткам -до Ю"КОЕ/мл, а к 28 суткам - 10' КОЕ/мл. На 35 сутки они перестали выделяться из образцов, что, по-видимому, связано с их полным «выеданием» простейшими. Численность инфузорий во всех опытных образцах до начала эксперимента была 103- 104особей/мл и сохранялась на этом уровне до конца эксперимента (рис.2).

Уровень эндогенного лизоцима простейших в контрольных образцах колебался от 1,19+0,06 мкг/мл в начале опыта до 0,8+0,10 мкг/мл к концу наблюдений. Сходное количество мурамидазы (1,2+0,06 мкг/мл - 0,7+0,10 мкг/мл) регистрировалось и у интактных простейших. Контроль аитили-зоцимной активности у эшерихий (АЛА-) в ассоциации с тетрахименами давал отрицательные результаты на протяжении всего срока эксперимента.

У простейших, сокультивировавшихся с антилизоцимактивным вариантом кишечных палочек, уровень эндогенного лизоцима снижался гораздо сильнее - до 0,2+0,01 мкг/мл к 14 суткам. С 21 суток до окончания эксперимента эндогенный лизоцим у простейших уже практически не обнаруживался (рис 3). При наличии в отобранных пробах живых активных простейших выявленный факт может свидетельствовать о нейтрализации лизоцима простейших с помощью антилизоцима бактерий.

С целью изучения ультраструктурных изменений эшерихий с анти-лизоцимным признаком в фагосомах (пищеварительных вакуолях) инфузорий на разных стадиях взаимодействия и определения судьбы бактерий, поглощенных простейшими, были поставлены специальные эксперименты в динамике (1- 3 - 6 - 24 часа) с последующим электронно-микроскопическим исследованием. Преимущество было отдано бактериальной модели Е.

coli (АЛА+) в силу установленного цитопатогенного воздействия культур с антилизоцимным признаком на инфузории.

Электронно-микроскопические исследования через 1 час контакта бактерий с простейшими выявили формирование большого числа фагосом преимущественно в области перистома ("глотки") инфузорий: одни из них содержали единичные бактериальные клетки, другие - до 50 - 60. 11а неко-

ш О

s о. <и £ го ю

28 35

сутки

Рис. 2. Динамика численности простейших и Е. coli при совместном культивировании I.E. coli (AJIA-), 2. Е. coli (AJIA+), 3. Инфузории

х Э ш

н ^

R ^

° 2

О. ^

Г- L.

1— v

гг о

1,4 q 1.2 \ 1 f

0,8 ^ 0,6 ^ 0,4 0,2 0

I I I I I I

со ю

п

-г I I

р 4,5 4

\ 3'5 \ 3

г 2,5

\ 2

: 1,5

\ 1

г 0,5

0

со см

со

о

CL Ш t-ъс ГО

Ю <

сц <

сутки

Рис. 3. Динамика продукции лизоцима простейшими и антилизо-цимной активности Е. coli (AJIA+) СЗ - лизоцим простейших; - - антилизоцимная активность Е. coli

торых срезах зафиксированы поглощенные бактерии, не отличающиеся от контрольных (интактных), однако вокруг вакуоли концентрировались лизосомальные гранулы с ферментом (из которых некоторые уже освободились) и митохондрии, что свидетельствовало о начавшемся процессе переваривания бактерий.

В более поздние сроки взаимодействия антилизоцимактивных эше-рихий с простейшими (3 и 6 часов) в одной клетке инфузории можно было видеть фаголизосомы, содержащие бактерии разной степени сохранности. Одни фагосомы заполнены очень плотными бактериальными клетками измененной формы, в других фагосомах множество эшерихий было полностью переварено. Наконец, в тех же фагосомах нередко сохранялись единичные (2 - 4) интактные бактерии, окруженные многослойными миелино-подобными структурами. Одновременно во всех фагосомах клеток тетра-химен после б часов контакта с исходным изогенным штаммом эшерихий (АЛЛ-) наблюдалась картина разрушения бактерий, характерная для процесса завершенного фагоцитоза.

Через сутки взаимодействия антилизоцимактивных кишечных палочек с инфузориями в большинстве фагосом остались фрагменты утилизированных бактерий, другие содержали множество микроорганизмов, находящихся в разной степени деструкции, а также единичные, устойчивые к перевариванию клетки, по своей ультраструктуре не отличающиеся от ин-тактной культуры эшерихий, несущих антилизоцимный признак. Как следует из полученных результатов, отдельные клетки кишечных палочек с антилизоцимной активностью способны выживать в простейших. Таким образом, взаимодействия инфузорий с эшерихиями (АЛА+) на ультраструктурном уровне в динамике от 1 до 24 часов носят характер незавершенного фагоцитоза.

Способность антилизоцимактивных бактерий деградировать лизо-цим простейших и водорослей, очевидно, способствует устойчивому сосуществованию бактерий, простейших и водорослей в водных биоценозах и, по-видимому, служат одним из механизмов, обеспечивающих резерву-арную роль простейших и водорослей (Литвин В.Ю., 1987, 1996; Пушка-рева В.И., 1994)

Таким образом, фактические данные о взаимодействии бактерий и гидробионтов на моделях Е. coli J 53 (АЛА+) с тетрахименами и водорослями S. quadricauda продемонстрировали важное значение функциональной связки «лизоцим-антилизоцим» для выживания бактериальной популяции. Вместе с тем функциональная зависимость «лизоцим-антилизоцим», выявленная Пруссом В.Ф. (1987) при инфекционной патологии, а также Немцевой Н.В. (1983) и Зарпфуллиной Л.А. (1985) при заражении различными бактериальными патогенами хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов, что свидетельствует об универсальности

данного механизма. Очевидно, он способен работать как в воде - в альго-бактериальных и протозойно-бактериальных сообщества, и в других условиях - в организме человека или животного.

Следует отметить, что выявление лизоцим-антилизоцимных взаимодействий в альго-протозойно-бактериальных сообществах водоемов, расширяют рамки традиционных представлений об антилизоциме микроорганизмов только как о факторе персистенции патогенных микроорганизмов в организме человека. Есть все основания считать эти взаимодействия важной составной частью универсального механизма регуляции биоценотических взаимоотношений микроорганизмов в разных средах обитания.

Устойчивость популяций в сообществах во многом определяется их генетической гетерогенностью (Уиттекер Р., 1980). Поэтому популяционная структура изолятов, выделенных из организма человека или водной среды, может характеризовать их адаптивные возможности, что важно для оценки состояния природных биоценозов (Печуркин Н.С.,1978; Емельянов И.Г., 1994). В этой связи мы попытались проследить возможное регулирующее влияние гидробионтов на гетерогенность бактериальных популяций как в экспериментах, так и при изучении природных образцов.

По мере накопления в бактериофлоре аквариума доли лизоцимак-тивных форм бактерий (130+3,8 КОЕ/мл) у антилизоцимактивной части бактериальных популяций наблюдалось расширение гетерогенности по изучаемому признаку (2-8 мкг/мл) и, наоборот, при низких значениях доли JIA-форм бактерий (10+0,5 КОЕ/мл) в воде гетерогенность антилизоцимактивной части бактериопопуляций была минимальной (2-4 мкг/мл). В природных альго-бактериальных сообществах в условиях преобладания лизоцимактивных форм водорослей в популяциях сопутствующих им бактерий антилизоцимный признак варьировал в пределах 1-12 мкг/мл в то время как при минимуме лизоцимактивных водорослей гетерогенность бактериальных популяций по антилизоцимному признаку была значительно ниже (1-5 мкг/мл).

В условиях экспериментального сокультивирования с водорослями S. quadricauda в популяции Е. coli J 53 22-110 (АЛА - 3+0,2 мкг/мл) до начала эксперимента присутствовали клоны с уровнем антилизоцимной активности 2, 3 и 4 мкг/мл. К 14 суткам от начала сокультивирования с водорослями из популяции Е. coli исчезли клоны с низкой антилизоцимной активностью (2 мкг/мл), а выявлялись варианты с уровнем от 3-7 мкг/мл. На 30 сутки опыта при минимальных значениях лизоцимной активности водорослей средний уровень антилизоцимной активности эшерихий был 4+0,2 мкг/мл. Их популяция была представлена клонами с уровнем антилизоцимной активности от 3-5 мкг/мл. В итоге выявлено, что в процессе

взаимодействия лизоцима водорослей и антилизоцима бактерий происходило изменение антилизоцимной активности эшерихий. В результате использования популяционного анализа удалось выяснить, что усиление ан-тилизоцимного признака связано со снижением в популяции доли клонов с низкой антилизоцимной активностью (2 мкг/мл) и увеличением доли клонов с уровнем признака 4-7 мкг/мл, и, наоборот, снижение антилизоцимной активности кишечных палочек связано с исчезновением из их популяции клонов с уровнем признака 6-7 мкг/мл.

Подобная закономерность в популяционных перестройках, вызванных влиянием лизоцима, выявлена и на другой экспериментальной модели - «простейшие-бактерии». У штамма E.coli К-12 J53 22-110, сокульти-вируемого с тетрахименами, до начала эксперимента антилизоцимная активность проявлялась на уровне 3,0+0,15 мкг/мл. При этом в популяции кишечных палочек обнаруживались клоны с разным ее уровнем:

2 мкг/мл(10%), 3 мкг/мл (80%) и 4 мкг/мл (10%). В первые сутки средний уровень антилизоцимной активности кишечных палочек снизился незначительно (2,8+0,20 мкг/мл, против 3,0+0,10 мкг/мл до начала эксперимента). Однако доля клонов с разной антилизоцимной активностью значительно изменилась: клоны с уровнем признака 2 мкг/мл составили 40%,

3 мкг/мл - 40% и 4 мкг/мл - 20%. К 7 суткам у этого штамма был зарегистрирован подъем антилизоцимной активности до 3,7+0,21 мкг/мл. В популяции к этому времени перестали обнаруживаться клоны с антилизоцимной активностью 2 мкг/мл и выявлялись клоны с уровнем признака от 3 до 5 мкг/мл. На 14 сутки антилизоцимная активность всех клонов регистрировалась на уровне 4 мкг/мл с последующей диссоциацией на варианты от 2 до 6 мкг/мл к 40 суткам наблюдения. Средний уровень антилизоцимной активности всей популяции, выделенных из простейших кишечных палочек, был близок к исходному и составил 3,2+0,25 мкг/мл.

Таким образом, в результате лизоцим-антилизоцимных взаимодействий в ассоциации кишечных палочек с водорослями и простейшими, осуществлялась структурная перестройка клонов бактериальной популяции и возрастание гетерогенности популяции по антилизоцимному признаку. Возможно, что выявленная закономерность имеет более общий характер, поскольку подобное влияние лизоцима на гетерогенность бактериальных популяций по антилизоцимному признаку было выявлено В.Е.Герасимовым (1987) и С.Д. Борисовым (1987) при заражении различными патогенными бактериями хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов.

От экспериментальных моделей мы перешли к природным водоемам. Были исследованы культуры Е. coli, изолированные из открытых водоемов, очистных сооружениях и от людей. В результате выявлено, что в популяциях кишечных палочек, выделенных из организма больных людей

94,3% клонов характеризовались наличием антилизоцимного признака, тогда как у 5,6% клонов таковая отсутствовала. В популяции кишечных палочек обнаруживались клоны с разным уровнем выраженности антилизо-цимной активности: 22% характеризовались уровнем признака 1-2 мкг/ мл, 13,2% - 3-4 мкг/ мл, 24% - 5-6 мкг/ мл, 25% - 7-8 мкг/ мл, 10,6% -9-10 мкг/ мл и 0,4% - 11-12 мкг/мл.

У кишечных палочек, изолированных от здоровых людей, гораздо чаще обнаруживали клоны с отсутствием исследуемого признака (52%). Доля клонов с антшшзоцимной активностью в популяции этих микроорганизмов была несколько иной: у 18% клонов антилизоцимная активность проявлялась на уровне 1-2 мкг/ мл, у 20% - 3-4 мкг/ мл, и у 10% - 5-6 мкг/мл. Вариабильность антилизоцимного признака внутри популяций кишечных палочек, изолированных из организма здоровых людей, была в 1,2 раза ниже по сравнению с эшерихиями, изолированными от больных. Таким образом, у больных людей по сравнению со здоровыми наблюдалась значительная гетерогенность популяций кишечных палочек с широкой вариабильностью антилизоцимного признака.

Результаты исследования открытых пресных водоемов показал, что у эшерихий, обитающих в чистой зоне, преобладали клоны с отсутствием данного признака (51%), меньшую долю составляли клоны с АЛА 1-2 мкг/ мл (37%) и 3-4 мкг/мл (11,7%) . В популяциях микроорганизмов, обитающих в загрязненной зоне водоема, диапазон значений признака был в 2,5 раза шире: 0 мкг/мл - 1%, 1-2 мкг/ мл - 45%), 3-4 мкг/ мл -27%, 5-6 мкг/ мл - 15%>, 7-8 мкг/ мл -7% ,9-10 мкг/ мл- 3% и 11-12 мкг/мл - 2%. Сходные данные получены для кишечных палочек, циркулирующих в очистных сооружениях: у 56% клонов уровень антилизоцимной активности был 12 мкг/ мл, у 22% - 3- 4мкг/мл, у 6, 8, 3 и 5 %% клонов, соответственно: 0; 5-6; 7-8 и 9-10 мкг/ мл. Таким образом, у кишечных палочек, обитающих в загрязненной воде, возрастала гетерогенность популяций по сравнению с изолятами из чистой зоны.

Полученные нами данные об участии лизоцима гидробионтов в регуляции гетерогенности бактериальных популяций в водных сообществах дополняют гипотезу клонально-селекционного механизма поддержания вирулентности бактерий в процессе их циркуляции среди естественных хозяев в почвенных и водных экосистемах (Литвин В.Ю., Пушкарева В.И., 1994). Можно полагать, что антилизоцимная активность бактерий также противодействует их уничтожению простейшими и водорослями во внешней среде. Вместе с тем, у кишечных палочек, изолированных из различных источников (открытые водоемы, очистные сооружения, организм человека), выявлены перестройки клонапьной структуры популяции по ан-тилизоцимному признаку, причем усиление гетерогенности популяции кишечных палочек, очевидно, носит адаптивный характер в изменяющих-

ся условиях среды обитания.

В итоге проведенных исследований установлено, что в природных водоемах наряду с выявленной ранее лизоцим-антилизоцимной связью внутри бактериальных популяций (Соловых Г.Н., Немцева Н.В., 1994), у водорослей функционирует подобная связь, характеризующаяся как автономией в рамках водорослевых сообществ, так и принимающая участие в сложных сетевых взаимодействиях с другими гидробионтами. В этой связи мы склонны рассматривать лизоцим-антилизоцимные связи гидро-бионтов как важный фактор, обеспечивающий жизнедеятельность водных биоценозов в целом (рис.4).

Учитывая это, уместно предположить, что изменения условий обитания вызовут сдвиги данных взаимодействий, что может быть использовано в качестве показателя состояния водоемов.

Разработка н апробация новых методов оценки экологического и санитарного состояния пресноводных водое.мов

Прежде всего необходимо было доказать возможность использования выявленных связей в качестве инструмента индикации экологического состояния водных объектов.

Наиболее значимые абиотические факторы, определяющие ход биологических процессов в водоеме, - температура и рН; мы изучали их воздействие на лизоцим - антилизоцимные взаимоотношения водорослей как в экспериментах, так и в естественных условиях.

В экспериментальных водоемах объемом 1,5 дм3 было установлено, что температурный оптимум лежит в пределах +21. ,.+25°С, когда количественные и качественные показатели лизоцимной активности зеленых и сине-зеленых водорослей достигали максимальных значений, обеспечивая в наибольшей мере процессы самоочищения водоемов, тогда как наименьшая активность наблюдалась в температурных интервалах +4°С...+10°С; +11°С...+20°С и +21°С...+25°С. При повышении температуры до +30°С (зона пессимума), что обычно имеет место при тепловых загрязнениях водоемов при сбросе термальных вод ТЭС и ГРЭС, наблюдалось увеличение антилизоцимактивных форм водорослей и, значит, ослабление процессов самоочищения водоемов. В ходе опытов установлено, что для бактериофлоры температурный оптимум антилизоцимной активности также находится на отметке +30°С, что может также отрицательно влиять на жизнедеятельность водоемов.

Полученные результаты выявили возможность температурной зависимости лизоцим-антилизоцимных взаимодействий микроорганизмов, что может оказаться полезным для выявления тепловых загрязнений от ТЭЦ, ГРЭС и АЭС.

Известно, что при поступлении различных токсикантов и ксенобиотиков в водоем изменяется водородный показатель (рН) воды. Поэтому

1 .Обеспечение жизнедеятельности биоценоза

2. Механизм выживания гидробионтов

3.Регуляция гетерогенности популяций микроорганизмов

ю

I Лптилизоцимактивные I | формы |

Рис. 4. Значение лизоцим-антилизоцимных связей как формы симбиотических взаимодействий

в планктонных сообществах

мы проследили возможное влияние сдвига рН на лизоцим-антилизоцимные взаимодействия водорослей и бактерий.

Для оценки влияния кислотности среды на соотношение Л А и АЛА форм бактерий природную воду в лабораторном аквариуме с природной водой закисляли до значений 5,0-5,5 добавлением 0,1 н соляной кислоты. Контролем служила исходная вода (рН 6,0 - 6,2). В бактериофлоре исходного водного микрокосма (рН 6,2) преобладали лизоцимактивные формы (50+3,0 КОЕ/мл), а антилизоцимактивные - регистрировались в небольших количествах (15+1,0 КОЕ/мл). После закисления воды в течение первых суток доля лизоцимактивных бактерий в биоценозе снизилась до минимальных значений (2+1,0 КОЕ/мл), на фоне увеличения доли антили-зоцимактивных микроорганизмов с 20+1,0 до 150+7,0 КОЕ/мл. В течение последующих 10 суток, года рН воды поддерживался на заданном уровне, число лизоцимактивных микроорганизмов не превышало 5+1,0 КОЕ/мл, при преобладании форм, обладающих антилизоцимной активностью. После восстановления рН воды до значений 6,0 - 6,2 число АЛА-форм микроорганизмов резко снизилось (8+1,0 КОЕ/мл) на фоне низкого содержания ЛА-форм (2+1,0 КОЕ/мл) бактерий. Однако восстановления в периодичности последовательной смены пиков одних форм другими (как это наблюдалось в контроле) за исследуемый период не отмечено. Следовательно, нарушение экологического равновесия в лабораторном микрокосме за счет изменения рН воды приводило к необратимым глубоким изменениям в биоценозе. По результатам проведенных нами исследований значения рН от 6,2 до 8,0 являются оптимальными для жизнедеятельности в условиях открытых водоемов как лизоцимактивных, так и антилизоцимактивных водорослей. На границе зон пессимума и гибели (рН 5,0), когда состояние экосистемы характеризуется как критическое, у водорослей утрачивается способность проявлять лизоцимную и антилизоцимную активности. В то же время при рН 8,4 и более происходит активация антилизоцимактивных водорослей при отсутствии лизоцимных форм, что служит неблагоприятным прогностическим признаком. Вероятно, это можно рассматривать в качестве раннего показателя наступающих глубоких и необратимых изменений в сообществе.

Таким образом, соотношение лизоцимактивных и антилизоцимных форм гидробионтов при изменении температуры и рН могут быть ранними диагностическими признаками изменений биоценотических отношений и, как следствие, снижения активности самоочищения водоемов.

Микробные ценозы являются достаточно информативной компонентой биоты: в силу высоких адаптивных возможностей микроорганизмы могут быстро реагировать на смену экологических условий изменением своей функциональной активности (Бухарин О.В. с соавт.,1991), поэтому могут использоваться в экологическом мониторинге водной среды (Кар-

певич А.Ф., 1983; Новиков Ю.В., Ласточкина К.О., Болдина З.Н., 1990).

Метод определения состояния водных биоценозов

В основу разработанного метода был положен расчетный показатель «Л» оценки лизоцим - антилизоцимных взаимодействий гидробионтов - соотношение лизоцимактивных (М|) и антилизоцимактивных (М2) микроорганизмов как показатель экологического состояния водоемов. Л = М] / Мг- Дальнейшие исследования позволили усовершенствовать критерии экологического благополучия. Мы отказались от «Л»=1 как основного показателя экологического благополучия, так как в этом случае не учитывалась вся гамма микроорганизмов биоценоза. Полученные в предварительных исследованиях значения «Л» для рек Уральского бассейна мы соотнесли с другими гидробиологическими показателями (биомасса фитопланктона, продуктивность водорослей, БПКпол„., саиробность) и сравнили с разработанной Алимовым А.Ф.(1994) шкалой «буферности» системы, обеспечивающей ее устойчивость к антропогенным нагрузкам. В результате наша оценочная шкала состояния водных биоценозов приняла следующий вид:

0 - 2 > «Л» > 5 - экологическое неблагополучие 2 < «Л» < 5 - экологическое благополучие.

Использование разработанного «Способа прогнозирования состояния водных биоценозов» (Патент РФ № 2052816, Бюл. № 2, 1996) в комплексе работ по санитарно-экологическому мониторингу водоемов позволило быстро выявлять очаги неблагополучного состояния водной среды, как это было сделано бассейнах Волги и Урала (рис. 5 и 6). Исследования показали, что в биоценозах рек Ахтубы, Бузана, Берекета и Кигача преобладали антилизоцимные формы микроорганизмов; расчетный показатель «Л» имел низкие значения (0,7-1,5). Такая же картина наблюдалась в реке Волге в районе города Астрахани (Л = 1). Исключение составили устье реки Берекет и исток реки Кигач, в которых соотношение ЛА/АЛА микроорганизмов колебалось от 2 до 3 (рис.5). Таким образом, проведенные исследования выявили нестабильное состояние биоценозов рек Волго-Ахтубинской поймы, связанное, по-видимому, со значительным загрязнением вод промышленными и хозяйственно-бытовыми стоками. По данным Астраханской гидрометеообсерватории в обследованных реках неоднократно наблюдались превышения ПДК тяжелых металлов, фенолов, нефтепродуктов и др. Кроме того, большинство из обследованных рек находятся в непосредственной зоне влияния Астраханского газоконденсатно-го месторождения (АГКМ) и Астраханского газоперерабатывающего завода (АГПЗ).

В реке Урал и его притоках, а также в Ириклинском водохранилище (рис. 6) также были проведены соответствующие исследования. В р. Урал у города Оренбурга по гидробиологическим показателям, а также по

показателю «JI» в зоне поступления стоков от населенных пунктов (ст. 17,19) отмечалось неблагополучное экологическое состояние, а вода на этих участках характеризовалась как «грязная»: Л = 0,1 - 0,8 усл. ед. Подобная ситуация отмечена и на станции 23 «сброс», где расположен выброс с городских очистных сооружений. В этом случае соотношение количества ЛА и АЛА микроорганизмов колебалось от 0,01 до 0,6 усл. ед., что также означало экологическое неблагополучие водных биоценозов. В зонах реки, не испытывающих значительной антропогенной нагрузки (ст. 20, 22, 25), регистрировалось благополучное состояние водных биоценозов: показатель «Л» колебался от 2 до 5 условных единиц. Аналогичное изучение притоков реки Урал в районе г. Оренбурга выявило загрязнения р.Чсрнон (у п. Черноречье) и р. Каргалки (у п. М.Павловка, п. Горный и п. Каргала). Вода в этих водоемах содержала не значительные количества растворенного кислорода, в микробных сообществах преобладали АЛА-формы, (Л = 0,32- 0,7 усл. ед.), что соответствовало неблагополучному состоянию водных биоценозов.

Для воды с удовлетворительной степенью чистоты (р.Сакмара - п. Подмаячный) показатель «Л» был равен 2,5 усл. ед. что по нашим данным свидетельствовало об экологическом благополучии водных биоценозов. В расположенном на реке Урал Ирнклинском водохранилище - в сбросном канале с агрегатов Ириклинской ГРЭС и в зоне поступления термальных вод в водохранилище (станция 4) выявлено преобладание микроорганизмов, обладающих антилизоцимным признаком. В зоне, свободной от термальной нагрузки, с относительной чистотой воды (станции 1, 5 и 7) преобладали ЛА-формы микроорганизмов. В процессе проводимых исследований с использованием расчетного показателя «Л» были выявлены два участка водохранилища, испытывающие значительные нагрузки. Это станции 4, 5 и 6, постоянно подвергающиеся тепловому загрязнению, и станции 10 и 11, водные биоценозы которых испытывают воздействие токсикантов, вносимых стоками рек Таналычки и Суундук (рис.6). Показательно, что именно на этих участках в биотесте отмечалась средняя и высокая степень токсичности воды; для этих же зон (ст. 5,6,10 и 11) характерны водоросли Microcystis aeruginosa, служащие индикатором высокой антропогенной нагрузки на водоем.

Таким образом, экспериментальное обоснование и проверка разработанного метода в природных водоемах позволяет считать, что система «лизоцим - антилизоцим» гидробионтов в микробиоценозах достаточно лабильна и может быть использована для определения состояния водных биоценозов.

Метод определения свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов

Оценка санитарного состояния открытых водоемов и источников

Рис. 5. Оценка с помощью показателя «Л» уровня загрязнения рек Волго-Ахтубииской поймы Условные обозначения: I I -ЛА бактерии

■■ - АЛА бактерии - ЛА водоросли у/А - АЛА водоросли 1,2,3---- показатель «Л»

МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ПРЕСНЫХ ВОДОЕМОВ Рисунок 6.

и»

Условные обозначения-

1-11. Ириклимское водохранилище

12. р. Черная

13-16. р. Каргалка

17-25. р. Урал

26-27. р.Сакмара

^^ - экологическое благополучие - экологическое неблагополучие

1,2,3- - значения показателя «Л», при

0-2 >"Л" > 5 - экологическое неблагополучие, 2 < "Л" < 5 - экологическое благополучие. - свежее фекальное загрязнение

питьевого водоснабжения является неотъемлемой частью работы санитарно-эпидемиологических служб. Однако быстрых и надежных способов оценки фекального загрязнения водоемов мало. Существующие методы ориентированы только на количественные показатели микрофлоры, а качественные ее характеристики не учитываются. Это обедняет оценку санитарного состояния водоема и не позволяет определить сроки произошедшего фекального загрязнения, раннее выявление которого важно для эффективности проведения санитарно-эпидемиологических мероприятий.

Мы попытались разработать новые подходы к биоиндикации свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов, основанные на ряде качественных показателей: антилизоцимной, антикомплементарной и «антиинтерфероновой» активности, которые по данным Гриценко В.А., Ляшенко И.Э.(1994) могут служить маркерами санитарного неблагополучия. В связи с этим, разработан новый метод, включающий выделение культур лактозо-позитивных кишечных палочек (ЛКП), дополнительно у которых определяются антилизоцимная (АЛА), антикомплементарная (АКА) и "антиинтерфероновая" (АИА) активности. Показатели АЛА > 4 мкг/мл, АКА > 0,5 усл.ед. и "АИА" > 0,1 усл.ед. свидетельствуют о присутствии свежего фекального загрязнения.

Комплекс качественных характеристик выделенных ЛКП как инструмент биоиндикации свежего фекального загрязнения позволил выявлять сроки его возникновения и зоны распространения. Практическое использование разработанного метода в санитарно-гигиеническом мониторинге водоемов бассейна р. Урал позволило быстро выявлять очаги свежего фекального загрязнения воды и улучшить его индикацию по сравнению с общепринятыми методами на 30%.

Метод определения сапробности пресноводных водоемов

При выборе источника открытого питьевого водоснабжения важна оценка сапробности водоема. Наиболее чувствителен к изменяющимся условиям внешней среды фитопланктона. Водоросли, благодаря высокой чувствительности к условиям окружающей среды, играют важную роль при биологическом анализе воды, для многих из них уже известны показатели сапробности (в отличие, - например от бактериальной флоры) и разработаны соответствующие таблицы (Вассер С.П. с соавт., 1989).

Мы рассматриваем сапробность как комплекс физиолого-биохимических свойств организма, обусловливающий его способность обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, отражающим, в частности, степень ее загрязнения. Сапробностыо традиционно оценивается загрязненность вод органическими веществами (Кочемасова З.Н. с соавт., 1987). Существующие методы оценки сапробности водоемов ориентированы на применение известной системы Колквица и Марсона (Ко1к\укг II. и Магзэоп М., 1908), которая заключается в определении сте-

пени сапробности воды с использованием индикаторных видов микроорганизмов, в том числе и водорослей. Степень сапробности водоема оценивается по усредненному суммарному показателю индексов сапробности максимального количества водорослевых организмов, обнаруживаемых в водоеме. Понятно, что этот метод весьма трудоемкий, а исследования занимают длительный срок.

В ходе наших исследований выявлено, что для водных объектов с поли- и а-мезосапробными типами воды характерно преобладание антили-зоцимных (АЛА) форм водорослей, тогда как водные объекты с (3-мезо и олигосапробным состоянием характеризовались преобладанием лизоци-мактивных (ЛА) форм. В этой связи стало ясно, что для определения сапробности воды нет необходимости выделять все микроводоросли из отобранных проб - достаточно выделить индикаторные виды, обладающие ли-зоцимной и антилизоцимной активностью. У них определяют сапробные индексы, вычисляют среднее значение и по нему судят о степени сапробности водоема. Это существенно упрощает исследования, ограничивая их лизоцим-ангилизоцимной частью альгосообщества и ускоряя определение сапробности водоема в 2-5 раз.

Комплекс разработанных методов оценки состояния водных биоценозов, определения фекального загрязнения и сапробности водоемов был апробирован в Уральском бассейне - в районе города Оренбурга (рис.7), где удалось выявить очаги фекального загрязнения на Урале в точке сброса с городских очистных сооружений и на р. Черной, а также выявить неблагополучное состояние рек Урала, Черной и Каргалки, связанное с ухудшением сапробности этих водоемов.

Результаты исследований показали, что наиболее чувствительными для экологической оценки водоемов являются лизоцимная и антилизо-цимная активности гидробионтов, в то время как для оценки антропогенной нагрузки на водоемы лучше подходит комплексное определение антилизоцимной, антикомплементарной и «антиинтерфероновой» активностей.

Использование разработанных методов в комплексе санитарно-гигиенических и экологических работ позволило повысить точность определения фекального загрязнения водоемов, ускорить определение сапробности водоемов и состояния водных биоценозов, что свидетельствует об информативности и эффективности данных методов.

Оценивая в целом полученные экспериментально-натурные мате риалы по микробиологической характеристике симбиотических взаимодействий гидробионтов, следует отметить, что эти данные открывают новые методические возможности для дальнейшего изучения жизнедеятельности водных биоценозов и для разработки новых подходов к определению качества воды пресных водоемов.

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА САНИТАРНОГО И ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ

РЕК УРАЛЬСКОГО БАССЕЙНА

Рисунок 7.

Условные обозначения:

- ЛА микроорганизмов;

- АЛА микрорганизмов; 5,0 ) - показатель «Л»;

V - свежее фекальное загрязнение; 2,75 - сапробность водоема.

и> ■л

выводы

1. Взаимодействия «лизоцим-аитилизоцим», широко распространенные в пресноводных водоемах, обеспечивают как автономное функционирование водорослевых сообществ, так и сложные сетевые связи разных компонентов водных биоценозов.

2. Экспериментальное культивирование эшерихий в ассоциациях с водорослями и простейшими выявило, что антилизоцимная активность бактерий вызывает деградацию лизоцима гидробионтов, являясь одним из условий выживания микроорганизмов в естественных биоценозах водоемов.

3. На ультраструктурном уровне впервые показано, что антилизоцимный признак эшерихий обеспечивает незавершенный характер фагоцитоза бактерий инфузориями.

4. Выявлено, что лизоцим гидробионтов в экспериментальных условиях и в природных водоемах способствовал усилению гетерогенности сопутствующих бактериальных популяций по антилизоцимному признаку.

5. У кишечных палочек, изолированных из различных источников обитания (открытые водоемы, организм человека, биологические препараты), отмечен сдвиг в сторону увеличения количества антилизоцимактивных клонов, а также усиление гетерогенности популяции по антилизоцимному признаку при изменении условий их обитания.

6. Выявлено, что степень гетерогенности бактериальных популяций, продуктивность и численность лизоцимактивных и антилизоцимактивных форм в альго-бактериальных сообществах отражают глубину санитарно-эпидемиологических и экологических изменений в водных экосистемах.

7. Установлено, что лизоцим-антилизоцимные признаки гидробионтов являются чувствительными индикаторами экологических изменений и пригодны для характеристики состояния биоценозов и сапробности водоемов, тогда как комплексное определение персистентных свойств бактерий (антилизоцимной, антикомплементарной и "антиинтерфероновой" активности) способствует выявлению свежести фекального загрязнения поверхностных вод.

8. На основе микробиологической характеристики симбиотических взаимодействий гидробионтов предложены новые подходы к оценке экологического и санитарного состояния природных водоемов.

Синеок работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов.// ЖМЭИ, 1994,- № 2,- с. 27-28 (соавт. О.В.Бухарин, Б.Я.Усвяцов, А.П. Малышкин).

2. Возможности и перспективы использования биологических тест-систем для индикации техногенных загрязнений окружающей среды. // Тез. докл. Всесоюзной научно-технической конференции «Проблемы добычи, транспорта и переработки нефти и газа.- Оренбург, 1991.- с. 91.

3. Использование популяционного анализа при изучении биогенного воздействия токсикантов на микроорганизмы. // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума «Микробиология и охрана биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия».- Оренбург, 1991.- с. 86-87.

4. Функциональная система "лизоцим-антилизоцим" у гидробионтов и ее роль в формировании водных биоценозов //ЖМЭИ., 1994.-Н5(приложение).- с. 95-99 (соавт. Соловых Г.Н.).

5. Характеристика и прогнозирование состояния биоценозов пресноводных экосистем. // Экология, 1994.- № 5-6. -с. 82-85 (соавт. Соловых Г.Н, Бухарин О.В.)

6. Ускоренный метод определения лизоцимной и антилизоцимной активности у водных микроорганизмов для гидробиологического мониторинга. //"Молодые ученые - здравоохранению". Материалы XII итоговой конференции молодых медиков, посвященной 50-летию института. -Оренбург, 1994. - с.59-60 (соавт. Алехина Г.П.).

7. Метод выделения и учета антилизоцимных бактерий из воды природных водоемов.// "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины". Сборник научных трудов ученых Оренбургского мединститута т. XXIX. - Оренбург, 1994.- с.88-91 (соавт. Г.Н. Соловых, Алехина Г.П.).

8. Медицинские аспекты охраны окружающей среды и здоровья человека.// "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины". Сборник научных трудов ученых Оренбургского мединститута т. XXIX. - Оренбург, 1994.- с.22-23 (соавт. Г.Н. Соловых, В.В.Петров, В.А.Бурдаков, В.О.Бабкин и др.).

9. Методы биотестирования в системе гидробиологического мониторинга.//Тез. докладов региональной конференции молодых ученых ученых Урала и Поволжья, посвященной 250 летию Оренбургской губернии.- Оренбург, 19994.- т. 1,- с. 72-73.

Ю.Антилизоцимный признак в микробиологической характеристике речных альгобактериальных сообществ. //ЖМЭИ., 1996.-N3.-0.93-96 (соавт. Алехина Г.П.).

11. Популяционная характеристика факторов персистенции кишечных палочек, выделенных из различных экониш. //Бюл. экспериментальной