Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система лизоцим - антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Система лизоцим - антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов"

-- од

■1 мл ¡'г'Ч

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

СОЛОВЫХ

Галина Николаевна

/

СИСТЕМА ЛИЗОЦИМ - АНТИЛШОЦИМ МИКРООРГАНИЗМОВ В ФОРМИРОВАНИИ ВОДНЫХ СООБЩЕСТВ ПРЕСНЫХ ВОДОЕМОВ

03.00-07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск -1995

Работа выполнена на кафедре биологии Оренбургской Государственной медицинской академии.

Научный консультант - заслуженный деятель науки РСФСР, член-корреспондент РАЕН, проф. О.В. БУХАРИН.

Официальные оппоненты: Новожилова М.И. - доктор биологических наук, профессор Антипчук А.Ф. - доктор биологических наук, профессор Кондрашова З.Н. - доктор медицинских наук, профессор

Ведущее учреждение: Институт Экологии растений и животных Уральского отделения Российской Академии наук.

Защита диссертации состоится "_"_1995 г.

в " _ " часов на заседании диссертационного совета

Д.084.04.02. при Челябинском Государственном медицинском институте по адресу: 454092, Челябинск -92, ул. Воровского д. 64 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "_" _ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор А.В.Зурочка

Общая характеристика работы. Жизнь водоёма, его биоценозов, обуславливается деятельностью бактериального населения, которое неразрывно связано с жизнедеятельностью более высоко организованных представителей фиш- и зоонаселения.

Деятельность микроорганизмов в водоёме тесно связана с экологической обстановкой окружающей среды, её физическими и химическими особенностями и со всем комплексом гидробионгов.

Несмотря на большое число работ посвященных вопросам взаимоотношений среди гидробиошои, понимание лой проблемы нихичиття на начальном этапе и ограничивается изучением трофических связей среди микроорганизмов: фито-, зоо-, и бактериопланктона (Крючкова Н.М, 1984,1989). Обнаружение устойчивых природных факторов формирующих водные сообщества позволит решить многие актуальные проблемы современной водной микробиологии - разработать теорию функционирования экосистем, создать основы рационального ведения хозяйства и управления водными ресурсами,а также решить проблему оценки и прогноза состояния водных систем. Качество оценок и прогноз во многом определяется тем, насколько глубоко исследована природная изменчивость и функциональная активность экологических процессов в водоеме (Кожова О.М., Мамонтова Л.М. 1979). Естественно, это требует проведения многолетних режимных наблюдений с целью выявления естественных циклов динамики всех компонентов водных экосистем. По мере получения материалов становится возможным решение вопроса об изучении эколого-физиологических связей гидробионтов в водоемах, а также оценка влияния той или иной формы антропогенного воздействия на них.

Все эти исследования объединены одной задачей - поиском критериев, позволяющих прогнозировать состояние природных водоемов. Это направление одно из приоритетных в современной микробиологии. На сегодняшний день ведется поиск функциональной системы наиболее информативной для выяснения состояния биоценозов в гидробиологии.

Исследование механизмов функционирования водных экосистем приобретает все большую значимость еще и потому, что это связано с вопросами эвтрофирования водоемов и, как следствие, с проблемой

получения чистой воды, решение которой тормозится недостаточностью, а иногда и отсутствием данных о взаимоотношениях водных организмов и факторах их регулирующих. (Болсуновский А .Я., Абросов H.A. Звегинцева Н.И., Хромичек Е.Б., Пролубников A.M.,1991 ). Несмотря на значительное число работ посвященных этой сложной проблеме, понимание взаимоотношений среди гидробионтов находится на начальном этапе.

Широкое распространение лизоцимного фактора среди растений (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974), грибов (КриссА.Е., 1940; Ghuysen J.M., Saltón M.R., I960.), простейших (Chung J.C., Uhfdhyay J.M. Parcia, 1969; Katz W, Berger D, Marnin H.H., 1971), бактерий (Meyer R.,

Palmer J.W., Thjmpppson R, 1936; Thomson R., 1940), вирусов (Welsch M., Salmon J., 1950; Зуев В. A. ,1969) и других групп микроорганизмов (Акатов К., Журавлев И. А., 1975.), его участие в формировании микроорганизмов и обнаруженная способность бактерий инактивировать лизо-цим - антилизоцимная активность (Бухарин О.В.,1987) привлекло наше внимание в плане изучения популяционных и межпопуляционных взаимоотношений в водном биоценозе. Роль мурамидазы, как фактора неспецифической защиты, во многих тканях организма человека и животных (Бухарин О.В., 1993), позволяет предположить возможное его участие как фактора защиты и у гидробионтов в водных сообществах, а обнаружение у некоторых видов гидробионтов антилизо-цимного фактора предполагает существование функциональной системы "лизоцим-антилизоцим" в водном биоценозе.

Актуальность работы заключается в том, что в ней впервые предпринята попытка изучить вопрос о распространении лизоцимного и антилизоцимного факторов у гидробионтов и оценить их роль во взаимоотношениях между организмами в водных биоценозах. Использована функциональная система " лизоцим-антилизоцим" в качестве экологического критерия, позволяющего не только прогнозировать состояние водных объектов, но и оптимизировать взаимоотношения в системе "общество-природные ресурсы." Работа включена научно-производственным Советом по проблемам охраны окружающей среды и

рационального использования природных ресурсов в Республиканскую межотраслевую комплексную программу "Человек и окружающая Среда", а также в Региональную программу "Урал-Экология".

Исходя из сказанного, цель работы - изучение эколого -функциональной системы гидробиоитов "лизоцим - антилизоци.м" и ее роль в регуляции биоценоза в водоеме.

В рамках згой цели решались следующие задачи:

1. Изучение сезонной, годовой и пространственной динамики, эколого-функиионялынлх показателей шдрооионюв в волпгмяу т^пн^м зоны, их изменения под воздействием антропогенных факторов.

2. Разработка методов определения лизоцимной. и антилизоцимиой активностей гидробиоитов.

3. Изучение роли лизоцима фитопланктона, зоопланктона, бактерио-планктона и антилизоцимиой активности бактерий в их взаимоотношениях в биоценозе.

4. Определение динамики функциональной системы "лизоцим-антилизоцим" гидробиоитов под воздействием различных факторов внешней среды.

5. Изучение возможности использования лизоцимных и антилнзо-цимиых факторов бактерий в биологической индикации состояния водоемов.

6. Оценка состояния водоемов под контролем разработанного метода биоиндикации.

Научная новизна работы определяется следующими результатами:

Впервые разработаны методические подходы определения лизоцимной и антилизоцимиой активностей у гидробиоитов. Выявлено наличие мура-мидазиой активности у фитопланктона, зоопланктона, бактериопланкто-на и антилизоцимиой активности у водных бактерий в гидробиоценозах. Представлены экспериментально-натурные доказательства наличия эколого-функциональной системы "лизоцим - антилизоцим" у микроор-ганизов и показана ее роль в формировании водных биоценозов.

Оценена динамика системы "лизоцим-антилизоцим" под влиянием антропогенных нагрузок. Разработан способ прогнозирования экологиче-

ского состояния водных биоценозов (пол. реш. по заявке на изобретение за N5039988/13, от 29.12.93г.).

Теоретическое и практическое значение работы определяется тем, что впервые обосновано наличие "лизоцим- антилизоцимной" системы у гидро-■бионтов- в формировании водных биоценозов. Система "лизоцим-антилизоцим" микроорганизмов использована в биоиндикации состояния водоемов. Впервые проведены многолетние гидробиологические исседова-ния водоемов степной зоны Урала.

Впервые представлена экологическая характеристика водоемов под контролем функциональной системы "лизоцим- антилизоцим" бактерий.

Фрагмент работы экспонировался на ВВЦ России в тематической выставке "Экология - 94" и экспонат отмечен знаком лауреат ВВЦ.

Разработанный "Способ прогнозирования водных биоценозов" внедрён в работу научно-производственных предприятий "ЭКОБИОС" и "САНЭКО" г. Оренбурга, а также в работу Оренбургского областного КОМИТЕТА охраны окружающей Среды и природных ресурсов.

Положения, выносимые на защиту:

1 .Функциональная система гидробионтов "лизоцим - антилизоцим" принимает участие в формировании водных биоценозов .

2.Система "лизоцим - антилизоцим" микроорганизмов позволяет оценивать качество биоценоза и является "инструментом" биоиндикации состояния водоема.

Апробация работы . Материалы диссертации были доложены и обсуждены на VII съезде микробиологов (г.Алма-Ата, 1985), VI съезде гидробиологов (г.Мурманск, 1990 ). На региональных совещаниях "Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование" (Свердловск, 1985, 1987, 1989); на научно-практической конференции "Экологические проблемы реки Урал и пути их решения" (Гурьев, 1989); на шестой • научно-практической конференции врачей инфекционистов, микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Оренбург, 1994); на Российской научно - практической конференции "Персистенция микроорганизмов" (Оренбург, 1994).

Структура диссертации . Диссертационная работа состоит из вве-

дения, обзора литературы, характеристики экспериментальных моделей и методов исследования, четырех глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов, выводов и списка литературы. Дис-серкпшя изложена на 330 страницах , содержит 36 рисунков и 31 таблицу. Список литературы включает 205 источника, из которых 136 опубликовано в отечественных и 69 в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общий план исследования. Работа выполнена на р.Урал, его притоках и I'ршишнском иплохрани.тнще "Л период с 1974 но ¡94¿ шли ч такие? в условиях лабораторного эксперимента. На нервом этапе были изучены особенности формирования гидрофауны, изучены пути трансформации энергии в сложившихся биоценозах исследуемых водоемов. С этой целью анализировалось состояние фитопланктона и зоопланктона, а также оценивалась фотосинтетическая активность водорослей. Изучен микробиологический режим водоемов: сезонная и годовая динамика бактерий, скорость их генерации и бактериальная продукция, и интенсивность микробной деструкции. Полученные результаты позволили выявить естественные циклы динамики всех компонентов биоценоза. В связи с тем, что было высказано предположение о роли лизоцимного фактора у гидробионтов в формировании водных биоценозов, на втором этапе были предложены методы выделения и учета лизоцимактивных и анти-лизоцимактивных форм бактерий воды водоемов, а также методы определения лизоцима фитопланктона, зоопланктона. Разработаны методы сокультивирования водорослей и бактерий, простейших и бактерий. Все это позволило на третьем этапе оценить уровень лизоцимного и антилизоцимого факторов у гидробионтов открытых водоемов и проанализировать закономерности функционирования системы " лпзоцим--антилизоцим" в водных биоценозах внутри таких сообществ как: "бактерии-бактерии","бактерии-фитопланктон" и "бактерии -зоопланктон".

Изучено влияние различных экологических факторов на систему "лизоцим-антилизоцим", показано, что это активно функционирующая система в природных водоемах, чутко реагирующая на любые изменения в биоценозе, исходя из этого на четвертом этапе был разработан "способ

прогнозирования состояния водных биоценозов", основанный на изучении количественных и качественных характеристик микроорганизмов, обладающих лизоцимным и антилнзоцимным признаками. Разработанный способ позволяет выявлять ранние нарушения в состоянии водных биоценозов с использованием в качестве " инструмента" биоиндикации загрязнения воды функциональной системы "лизоцим -антилизоцим" (пол. реш. на изобретение за N5039988/13 от 29.12.93 г.), и на заключительном, пятом этапе работы была проведена характеристика водоемов под контролем функциональной системы "лизоцим-антилизоцим" микроорганизмов и составлена карта экологического мониторинга некоторых водоемов Уральского бассейна.

Экспериментальные модели Объектами экспериментальных исследований служили 20 штаммов сапрофитных микроорганизмов, 4 культуры водорослей и 6 культур зоопланктеров. Культуры бактерий были любезно предоставлены проф. М.И.Новожилововой из коллекции водных микроорганизмов, выделенных из воды Урало-Каспийского бассейна, Института микробиологии и вирусологии Академии Наук Казахстана.

Культуры зоопланктеров получены из ИМП им. Марциновского г. Москва. (Entamoba moshkovskii, Ameba proteus, Entameba histolica) Культуры Paramecium caudatum , Paramecium colpoda и Daphnia magna были выделены из исследуемых водоемов. Объектами исследования служили также водоросли (Scenedesmus oblicus, Aphanisjmenon flos - aquae, Clorella vulgaris и Anabena variabilis), полученные из Института ботаники РАН, г. Санкт-Петербург. Изогенные клоны Artrobacter spp., используемые для сокультивирования, были выделены из воды открытого водоема методом "отпечатков ". Штаммы отличались друг от друга по величине антилизоцимного признака: О, 2, 6 мкг.

Методы исследования Гидробиологические исследования проведены по общепринятым в гидробиологии методам: определение первичной продукции и деструкции органического вещества по Винбергу Г.Г. (1934,1960). Расчет величины фотосинтеза под 1 кв. м поверхности по В.И Романенко(1973). Общая

численность и биомасса микроорганизмов в воде по А.С.Разумову (1947), время генерации и бактериальной продукции по М.В.Иванову (1964) и А.П.Романовой - А.И.Зоновом (1964). Биохимическое потребление кислорода по С.И.Кузнецову (1963). Определение лизоцимнон и ангилию-цнмной активностей бактерий по О.В.Бухарину с сооавторами (1985). Количество выделяемого лизоцима определяли по шкале, иредложеной Б.Я.Усвяцоны.м (1984). Определение лизонимной активности воды проводили методом цилиндриков (БухаринО.В.. Ппянишникопа П И Угияпт» Ь.Я ИХ1» Изучение взаимоотношений бактерии с Сомориамн. мм- и фитопланктоном осуществляли по разработанным нами методикам. (Соловых Г.Н.,1994). Определение лизоцимнон активности гидробионтов проводили по методике Соловых Г.Н.(1993) .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.1 Разработка метода выделения и учета лизоцимактивных и шпилтоциактивных бактерий из воды природных водоемов.

На сегодняшний день острее встает вопрос об оценке качества воды с санитарно-гигиенических и экологических позиций с учетом обнаружения условно-патогенных микроорганизмов, но, именно, с их выделением имеются некоторые сложности. Определяющим в этой проблеме является: небольшое количество подобных микроорганизмов, имеющихся в исследуемом материале; некоторое торможение их роста, вызываемое используемыми питательными средами-МПА. Эндо, Левина, Плоскирева и др., применение которых к тому же не учитывает некоторых особенностей выявляемых бактерий; отсутствие маркеров характеризующих уже на ранних этапах выделения, чистой культуры потенциальные способности изучаемых биообъектов в плане проявления ими патогенности.

Наиболее перспективной маркерной характеристикой условно-патогенных микроорганизмов является антилизоцимный признак (БухаринО.В., 1987 ). В клинических и лабораторных условиях для установления диагноза заболевания существует ряд методов выделения микроорганизмов, обладающих антилизоцимной активностью, (Бухарин О.В., УсвяцовБ.Я., МалышкинА.П., НемцеваН.В., 1984, Прусс В.Ф., 1987). Методы заключаются в подращивании исследуемого материала (клеток слу-

щепного эпителия из уретры, кишечника, носа, бронхов и т.д) в средах 199 и Игла с последующим выделением чистой культуры возбудителя и его идентификацией. Однако, приведенные методы, направлены на поиски возбудителя болезни. Использование в качестве исследуемого материала клеток эпителия оправдывает применение этих сред , как наиболее близких по составу к внутренней среде тканей организма и обеспечивающих жизнеспособность как клеток, так и возбудителя, находящегося в них. Кроме того, в предлагаемом методе используется в качестве среды МПА, в котором вырастает 0,001-0,1% от общего числа бактерий обитающих в воде (Разумов A.C., 1947), так как количество органического вещества в реках и водохранилищах не превышает 2 - 13 мг С/ л., что намного ниже его величины, в таких питательных средах, как МПБ, МПА, МПЖ, Сусло и др., основу которых составляют экстракты мяса, пептон или большое количество сахара. Очевидно, водная среда "селекционирует" виды бактерий развивающихся при тех же концентрациях веществ, которые имеются в водоемах. Поэтому, в целях выделения свободноживущих микроорганизмов из водоемов, эти среды не пригодны, т.к. значительно отличаются по составу от естественной среды обитания искомых биообъектов. Наиболее близким по составу является способ посева исследуемой воды на безбактериальную воду с последующим подращиванием при 25, 28 градусах С (В.И.Романенко, Е.П.Никифорова, 1978). Безбактериальная вода содержит все минеральные и органические вещества, необходимые для жизнедеятельности свободно-живущих микроорганизмов и позволяет учесть 10-20% бактерий от числа, полученного методом прямого счета.

Однако, эта среда не дает возможности преимущественного выделения микроорганизмов с антилизоцимной активностью, относящихся к потенциально-патогенным. Для этого нами предложено, исследуемую пробу воды из природного водоема (исследуемый материал) в количестве 1 мл засевать в жидкую среду накопления, приготовленную из натуральной воды с естественным содержанием органического вещества, которая дополнительно, в целях выделения микроорганизмов с антилизоцимной активностью, содержит лизоцим в концентрации 5-10х104 г/мл. Время культивирования исследуемого материала составляет 2-3 часа, так как за этот период проис-

ходит смена'1 генерации олигокарбофильных форм бактерий, которых подавляющее большинство в водоеме, а присутствие .тицозима в используемой среде накопления. позволяет селективно отобран, формы с аши-лизоцимным признаком. Отличием предлагаемого способа является то, что в целях улучшения качества и повышения точности анализа к "безбактериалыгой воде" прибавляют шноцим в концентрации, который обеспечивает преимущес! венный рос1 потенциально патогенным микроорганизмам, обладающим маркером персистеимии - ¡»»«тк.ипецгки-иоп актныюс1ьш. Эю пишичилп п'гчтергптъ жизнеспособное^ ашилизо-цимных форм, снижая в 4 раза рост сопутствующей микрофлоры и повышая в 6 раз число антилизоцимактивных форм. При этом, введение в среду лизоцима в количествах, превышающих 20 весовых процентов, в концентрациях больших 1,0 х 104 г/мл., подавляет рост микроорганизмов (в том числе и обладающих антипнзоцимным признаком), а в концентрациях меньших, чем 0,5 х 107мл. т.е. в количестве меньше, чем 12,0 весовых процентов эффективность действия лизоцима снижается, т.к. наблюдается уменьшение количества выделяемых форм с антилизоцимным признаком и бурный рост сопутствующей микрофлоры.

Питательную среду готовили следующим образом: первым этапом было приготовление безбактериальной воды. Вода из незагрязрязненного водоема профильтровывалась в стерильной воронке через асбестовый фильтр Зейца, под который вниз подкладывлся мембранный фильтр N 3 для задержания волокон асбеста. Перед фильтрацией через асбестовый фильтр пропускали 50-100 мл. кипящей дистиллированной воды для его очистки, затем фильтровали воду из незагрязненного водоема. Полученную воду разливали в пробирки по 10 мл, закрывали ватными пробками, и стерилизовали в автоклаве при 0,5 атмосферы. Для нормального развития микроорганизмов необходимо подвесгн рН близко к нейтральному. Для этого пробирки ставят на 2-5 часов в эксикатор, в который помещали стакан с 5--10г. бикарбоната натрия и приливали 15-20 мл 20% -ной серной кислоты. Через 2-5 часов пробирки вынимали. Вторым этапом явилась подготовка водного раствора лизоцима в концентации 0,5х104 г/мл , который готовили так: в 100 мл стерильной безбактериальной воды растворяли 5,0 мг су-

кого препарата яичного лизоцима (изготовитель: Объединение "Мосмед-биопрепараты им. Л.Я.Карпова"). Полученный раствор добавляли в питательную среду (безбактериальная вода). Варианты соотношений компонентов в предлагаемой питательной среде представлены в таблице 1.

Приготовленную таким образом питательную среду разливали по пробиркам и засевали в нее воду из водоемов. Инкубировали в при 25-28 0 С в течении 2-3 часов с последующим пересевом на МПА и подсчетом числа выросших колоний и определением у них наличия антилизоцимак-тивного признака. Антилизоцимная активность у выделенных микроорганизмов определялась по методу О.В. Бухарина (1985). Для этого к 1,5%-ному питательному агару добавляли определенные дозы яичного лизоцима создавая его концентрацию 3-6 мкг/мл и в среду добавляли 1мл исследуемого материала, подращенного на безбактериальной воде с лизоци-мом. После суточной инкубации при 25-28° С выросшие колонии убивались парами хлороформа в течение 30-40 минут. Затем поверхность 1,5%-ного агара с выросшими колониями водных микроорганизмов заливали вторым сдоем 0,7% агар, смешанным с индикаторной культурой Micrococcus lysodeikticus N2665 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича ). Антилизоцимная активность учитывалась после суточной инкубации в термостате по наличию зон стимуляции роста Micrococcus lisodeikticus вокруг исследуемых колоний водных микроорганизмов. Применение предлагаемого способа позволяет в 5-7 раз чаще, выделять из исследуемых проб воды микроорганизмы с антилизоцимным признаком.

Таблица 1.

Варианты соотношений компанентов питательных сред

Конечная концентрация лизоцима

Компоненты среды ( в мл) Среда 1 5 мкг Среда 2 6 мкг Среда 3 7 мкг Среда 4 8 мкг Среда 5 9 мкг Среда 6 10 мкг

"Безбатериальная" вода (профильтрованная) 8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0

Исследуемая вода 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Водный р-р лизоцима (0,5x104 г/мл) 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

В этом и состоит практическая ценность предлагаемого способа.

Компоненты разработанной питательной среды доступны, она может быть приготовлена в любой микробиологической лаборатории.

С целью бысгрого и удобного учета лизоцим и антилизоцнмакчивпых бактерий нами предложен метод учета этих форм с использованием мембранных фильтров фирмы "Сыппор". Исследуемые пробы воды фильтруются через мембранные фильтр!.] с диаметром пор 0,19 мк (фильтры предварительно киняпп в стерильной бе^актериалыюй воде), а затем фильтры с осажденными на них микроорганизмами пометают ия 1,5 "и мясопеиюнный агар < iVli i A i

Определение антилизоцимной активности осуществлялось по методике Бухарина О.В. (1984 ) в нашей модификации. Модификация заключалась в следующем: фильтры накладывались на питательные среды (МПА), содержащие лизоцим и 0,5 мл 1 миллиардной взвеси культуры Micrococcus lisodeikticus (штамма 2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Для качественного учета уровня лизоцимной активности микробов концентрация лизо-цпма в питательной среде составляла 0,6x104 г/мл , так как именно этот уровень лизоцимной активности является определяющим в перси-стенции микроорганизмов (Бухарин О.В., 1985 ). С целью количественной оценки антилизоцимной активности в питательных средах создавали концентрации лизоцима 0,2х104-1.0х04 г/мл. Учет антилизоцимной активности осуществлялся через 24 часа после инкубации в термостате при 37" С, после чего фильтры с выросшими на них колониями микроорганизмов снимались, а на поверхности питательной среды учитывались проецирующиеся под ними зоны стимуляции роста микрококка. Количественный учет осуществляется по наибольшей концентрации лизоцима, которая инактивируется микроорганизмами.

Определение лнзоцимактивной микрофлоры поды осуществляли по методике Бухарина О.В. (1984) в нашей модификации. Модификация заключалась в следующем: микроорганизмы адсорбировались на фильтрах, которые накладывались на питательную среду, в которую добавлялось 0,5 мл 1 миллиардной взвеси Micrococcus lysodeikticus (шт. 2665 ГИСК им. J1.A. Тарасевича ), а затем фильтры инкубировали 24 часа в термостате при 37° С. После инкубации фильтры с выросшими коло-

ниямк микроорганизмов снимались, а на поверхности питательной среды учитывались зоны лизиса микрококка.

1.2. Методика определения лизоцимной активности зоопланктеров Мурамидазная активность исследовалась в гомогенатах амеб, дафний, парамеций, а также в средах их культивирования. Гомогенаты зоопланктеров готовили из культур, достигших стационарной фазы, получали взвеси зоопланктеров, которые отмывали от питательной среды и сопутствующих бактерий путем многократного (5-7раз) центрифугирования (5-7мин), при 500 об./мин. с обязательной заменой надосадка стерильной безбактериальной водой. Конечная концентрация зоопланктеров составляла 500 клеток/мл. Затем взвесь клеток подвергалась 3-5 кратному замораживанию и оттаиванию, после чего их центрифугировали при 3 тыс. об./мин (15-20мин) и производили заборы надосадка. Культураль-ную жидкость для опытов готовили из надосадка исследуемых культур путем его центрифугирования при 3 тыс. об./мин. в течении 20-25 мин. На первом этапе в гомогенате зоопланктеров качественным методом определялась мурамидазная активность (Бухарин О.В., 1974). Результат выражали в крестах : (+) - есть просветвление взвеси, ( + ) - сомнительный результат, (-) - просветвление взвеси отсутствует. Просветление взвеси свидетельствовало о лизисе суспензии микрококка и, следовательно, о наличии му-рамидазной активности в образце. На втором этапе мурамидазнеую активность гомогената простейших и культуральной жидкости определяли тубдиметрическим методом (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974). 1.3. Методика определения мурамидазной активности фитопланктона Мурамидазная активность фитопланктона исследовалась в гомогенатах водорослей, а также в среде для культивирования. Гомогенаты водорослей готовили из культур, достигших фазы умеренного цветения, т.е. когда образовался слой всплывающих водорослей (Жукинский В.Н., Оксинюк О.П., Цееб Я.Я., Георгиевский В.Б., 1977). Взвесь водорослей подвергали 5-7 кратному центрифугированию (500 об/мин - 5мин), с заменой надосадка 0,15 М фосфатным буфером (рН-6), после чего взвесь подвергали 3-5 кратному замораживанию и оттаиванию, а затем центрифугировали при 3 тысячах оборотах в минуту (15-20 мин.) и произво-

лили ¡аборы иадосадка. Полученный гомогенаг микроскопически проверяли на чистоту от бактерий. Культуральнуго жидкость для опытов готовили из иадосадка культуры водорослей. Для чего надосадок центрифугировали при 3 тыс. об./мин I! течении 20-25 минут. Мурампдашую ак-гнвносгь определяли тубдиметрическим методом (Бухарин О.В., Васи-леиН.В.. 1974) .

2. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СИСТЕМА ".111 301(ИМ-А1 I I I 1.11 ПОЦИМ" У ГИДРОБИОНТОВ II ЕЕ РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ВОДНЫХ ииоиыннов

2Л. Характеристика и распространение лизоцнмной ( мурамидазной) активности у гидробнонтов. Результаты исследования лизоцнмной активности у гидробнонтов разных трофических уровней: продуцентов-водорослей, консументов-зоопланктеров и редуцентов-бактерий показали, что лизоцимный фактор широко распространен у представителен различных гидробиоло! ических групп открытых водоемов (табл.2.3).

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОДОЕМОВ И РОЛЬ

ЛИЗОЦИМ-АНТИЛИЗОЦИМНОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ. ЗЛ Характеристика микробиологических процессов в р.Урал и Ирнклинском водохранилище.

Таблица 2.

Мурамидазнаи активность гомогенатпв гидробнонтов

Вид щдробпонта : Л1 у pa ми даз 11 а я а к i и в и ост ь гомогенатов (в мкг/мл )

Фитопланктон :

Scenedesmus obliquus, Kriiger 0,38+/- 0,2

Aphanizomenon flos-aquae 0,43+/- 0,1

Clilorella vulgaris Beijcr 0.48+/- 0,2

Anabaena variablis Kiits 0.45+/- 0.3

Зоопланктон:

Entamaeba histolytica 0,50 +/- 0,12

Amoeba Moshkovskii 0,60 +/-0,20

Amoeba proteus 0,70 +/- 0,10

Daphnia magna 0,64 +/- 0,15

Paramecium caudatum 0,68 +/- 0,11

Paramecium colpoda 0,69 +/- 0,11

Гомогенаты всех исследованных видов водорослей и зоопланктеров обеспечивали лизис индикаторной культуры на лизоцим - Micrococcus

Й50с1е1кпси5, причем степень лизиса мало зависела от вида водоросли пли зоопланктера. Однако, культуральная жидкость, взятая из культур водорослей и зоопланктона микрококк не лизировала, что свидетельствовало о незначительной экскреции эндогенного лизоцима живыми водорослями и зоопланктерами во внеклеточное пространство.

Оценка микрофлоры по лизоцим-антилизоцимному признаку показала, что среди водных бактерий встречаются как лизоцимактивные, так и антилизоцимактивные формы, которые характеризуются высоким уровнем активности (ЛА - 0,015-0,2 мкг/кол, АЛА - 10-22 мкг/мл). Следовательно, у гидробионтов различных трофических уровней в естественных водоемах широко распространен лизоцимный и антцлизоцимный факторы, что позволило поставить вопрос об их роли во взаимоотношениях гидробионтов друг с другом и в формировании микробиологического режима водоемов.

Таблица 3.

Характеристика водной микрофлоры по лизоцпм (JIA) -_антнлизоцимному (АЛА) признаку._

Видовой состав микрофлоры JIA АЛА Видовой состав микрофлоры JIA АЛА

Род Artrobacter

A.globiforvis - +

A.citreus + A.aurescens - +

Род Micrococcus

MJuteus + -

M.roseus + М.aureus + -

M.sulitilis + - M.citrcus + -

M.flavus + - M.cremoides + -

M.alba + - M.radiatus + -

M. viriculosis + - M.cirrhiforinis + -

Род Sarcina

S.citrins +/- +/- S.flava +/- +/-

S.luteus +/- +/- S.alba +/- +/-

Род Bacillus

B.brevis - + B.glutinosus - +

B.coprogeues - + B.cereus - +

B.filaris - + B.idosus - +

B.mycoides - + B.megatherium - +

Род Echerichia

E. coli - +

Род Mycobacterium

M.album +/- +/- M.mucosus +/- +/-

M.lacticium +/- +/-

"+" - наличие признака ; "-" - отсутствие признака; "+"/- - наличие признака сомнительно;

Результаты исследования общей численности бактерий воды показа-

ли, что их количество в воде исследуемых водоемов достигает сотен тысяч

и даже нескольких миллионом в 1 мл (Соловых Г.Н., 1974. Соловых Г.H . 1985)

В бактерионланктоне та исследуемые голы, отмечена тенденция к ею увеличению, чю. по-видимому, следует обьяспить растущим загрязнением бассейна р.Урал.

Выявлена связь между численностью бактерий в разные годы и \ ров-нем воды п водоеме: в годы с высоким уровнем воды повышается и общая численность бактеций в результате, нгппгпелптчшпт ттляш«« г;-л-.. >>%...; г плчгсшн.::::; -¡лептами ч ja ¡~ча _>р]л> ¡ионной дел lumiiut ш m .дм. способствующей поступлению аллохтонного органического вещества в водоем, Исследования общей численности бактерий в воде Ирпк.типского водохранилища показали, что количество их также широко варьировало по сезонам и годам и составило 0,24 млн. кл/мл - 15,6 млн. кл/мл., а их биомасса 0,24 - 11,24 мг/л.

По акваюрии водохранилища, выше поступления теплых вод (пойма р.Урал) число бактерий колебалось ог 1,2 до 3,62 млн. кл/мл (ср. - 2.74 млн. кл/мл). Примерно столько же бактерий регистрировалось на разрезе, расположенном ниже сброса теплых вод , 1,26 - 5,98 млн.кл/мл (в ср. 2,77 млн. кл/мл). В зоне теплового загрязнения их численность составила 2.09 - 5,13 млн. кл/мл ( в ср. 3,02 млн. кл/мл).

В юрым фактором, определяющим динамику микробных сообществ в иггттедуеммх водоемах, является органическое всщсстпо продуцируемое в процессе фоюеншеза фитопланктона, и, поступающее в реплыа-те отмирания фито- и зоопланктона. В годы максимальной прудукции фитопланктона отмечалось и более высокое содержание бактерий. Нашими исследованиями установлено, что 23-80% органического вещества, продуцируемою в процессе фотосинтеза фитопланктона, минерализуется за счег микробной деструкции.По литературным данным под влиянием различного рода антропогенных воздействий происходит изменение гидробиологического режима водоема и, в частности, повышение концентрации в воде патогенных видов бактерий, пребывающих на стадии сапрофитизма. (Булашов А.Я., Лоскутов Н.Ф., Лошаков Ю.Г., 1974). "Малым" фактором патогенности является антилизоцимный признак (Бухарин О.В. 1992), по-

этому нами проведен анализ лизоцим-антилизоцнмного сообщества среди саирофитирующих форм водных бактерий.

3.3. Характеристика лизоцим - антилизоцимного сообщества среди са-профитирующих форм бактерий.

Изучение бактериальных сообществ в р.Урал и Ириклинском водохранилище показало, что в популяциях этих водоемов широко представлены как лпзоцимактивные, так и антнлизоцимактивные формы бактерий.(Табл. 4, 5).

Таблица 4. Содержание ЛА и АЛА форм бактерий в р.Урал

Станции ОМЧ (тыс. кл/мл.) ЛА ( кое/мл.) % АЛА (кое/мл.) % .

Дубки 634+/- 15,0 26,6+/-,50 4,06 63,4+/- 12,3 13,76

Водозабор 1503+/-38,5 56,3+/- 8,0 3,47 52,3+/-10,8 3,45

Мост 546+/-12,0 21,3+/-0,39 3,9 24,8 +/- 6,8 11,7

У сброса 1192+/-184,0 48,5+/- 6,4 4,17 90,5+/- 2,1 7,84

Сток Сакмары 68 +/-16,2 150+/-40.5 2,27 52,0+/- 10,8 5,57

Зеленый Яр 545+/- 84,4 62,3+/16,0 11,4 54,6+/- 16,0 15,1

В Урале количество лизоцимактивных бактерий составляли 9,87 -11,4% отОМЧ (21,3 +/- 0,39 - 150,0 +/- 40,5), а в Ириклинском водохранилище - 22 +/- 0,43 - 400 +/- 80,0 кое/мл (0,42 - 3,29 % от ОМЧ). Антилизо-цимактивные формы бактерий вУрале по средне-годовым данным составили 24,8 +/- 6,8 - 90,5 +/- 3,1 кое/мл (3,45 -15,1 %), а в Ириклинского водохранилище их численность была выше (128 +/- 56,0 - 1100 +/- 122,0 кое/мл, или 0,22- 8,92% от ОМЧ).

В сезонной динамике JIA и АЛА форм бактерий отмечены следующие закономерности: в мае, в период цветения диатомовых водорослей и поступления аллохтонной микрофлоры с водосборной площади, в воде в одинаковой степени были представлены как ЛА, так и АЛА формы бактерий (ЛА составляли 7,1 - 35% от ОМЧ, а АЛА 14 - 30,8 % от ОМЧ). В июне наблюдалось отмирание диатомового планктона, в результате чего вода обогащалась легкодоступным органическим веществом, а в ответ на это про-

исходил всплеск ОМЧ, в лизоцим-антилизопимном сообществе снизилось число ЛА бактерий, но возросло количество АЛА форм ( ЛА - 10 - 23%,

АЛЛ - 20 - 64% ).

Таблица 5.

Содержание ЛА и АЛА форм бактерий в Приклинском водохранилище.

Разрезы .V» ОМЧ (тыс. кл/мл.) АЛА (кое/мл.) /ii Л А (кое/мл.)

Ниже ; | езоот/'-ш 22:>+/- 43 1 iti 1IMI4-/- )П 1 /)';

сброса 2 5120+/-102 317+/-63.4 6,19 22+/-0.43 0,42

3 10650+/-213 950+/-129 8,92 175+/-35.0 1,64

Зона 4 549 5+/-109 600+/-120 1,09 50+-/-10,0 1,09

сброса 5 4600+/-192 I28+/-56 2,74 33+/-6,6 0,71

6 2985+/-507 500+/-55 - 0 -

Выше 7 7586+/-I51 1100+/-122 0,14 250+/-50, 3,29

сброса S 1190+/-238 580+/-12 48,7 80+/-16 0,26

9 42600+/-814 600+/-12 0,14 375+/-75 0,88

Ганалык Ю 18575+/-377 420+/- 84 2,26 150+/-30 0,80

Суундук 11 8273+/-165 716,6+/-143 2,48 200+/- 42 2,41

Прмплотинн 17 19700+/-394 144+/-28.8 0,22 400+/-80 2,03

ы м плес

По многолетним данным в исследуемых нами водоемах второй пик в численности бактерий приходился на конец августа, начало сентября (период цветения протококков и сине-зеленых водорослей). В конце августа (начало цветения) происходило некоторое снижение ОМЧ, а в ли-зоцим-антилизоцимном сообществе преобладали ЛА микробы, (7,5-25% от ОМЧ). В период активного цветения фитопланктона (сентябрь) наблюдалось массовое развитие Aphonizomenon flos - aquae, а в зоопланктоне доминирование коловраток родов Brochionus Synchaeta, Asplanchus, и массовое отмирание других таксонов, в результате чего в воду поступали эндогенные вещества и в том числе лизоцим, переходя в экзогенное состояние, о чем свидетельствовал тот факт, что вода в этот период лизировала Micrococcus Iysodeikticus, т.е. обладала "лизоцимной активностью".

В ответ на экзогенное поступление лизоцима происходило повышение ОМЧ, но снижение ЛА форм бактерий, с одновременным ростом АЛА форм микробов (24,2 - 46% от ОМЧ ) и усилением их активности. Замечено, что в период максимальной численности бактерий, наблюдалась большая гетерогенность микробов по антилизоцимному признаку, причем в микробных сообществах преобладали штаммы с высокой антшшзоцим-ной активностыо-6-10 мкг ( 80 - 90 %), а число штаммов с низким уровнем АЛА (2-4 мкг) было минимальным (0-20%).

Таблица 6

Концентрация лизоцима в воде р.Урал у г.Оренбурга (сентябрь 1988 г.).

Станции ЛА воды ЛА бактерии АЛА бактерии

(кое/мл) (кое/мл)

Водозабор 5,50 48+/-5,0 124+/-15,0

Дубки 3,00 39+/-6,0 121+/-20,5

Мост 1,74 21+/-4,0 123+/-18,2

Зеленый Яр 2,10 32+/-7,0 119+/-20,0

Примечание: ЛА воды - лизоцимная активность в мкг.

Падение численности бактерий сопровождалось возрастанием ЛА форм бактерий, а в антилизоцимном сообществе происходило снижение гетерогенности микробной популяции, почти не встречались штаммы с уровнем 8-10 мкг/мл, а низкоактивные формы бактерий составляли 80 -93%.

Полученные данные позволили нам предположить, что соотношение лизоцим продуцирующих (ЛА) и лизоцимдеградирующих (АЛА) бактерий отражают состояние биоценоза в целом и между ними существуют определенные взаимоотношения. Исследование клонального состава микроорганизмов, определяющих популяцию АЛА и ЛА организмов, находящихся во взаимодействии друг с другом показали несколько вариантов таких взаимодействий: 1 - вариант - присутствие в сообществе как ЛА, так и АЛА микроорганизмов; П - вариант - наличие только АЛА форм; Ш вариант -видимое отсутствие как тех, так и других вариантов гидробионтов.

Выявлено, что АЛА бактерий, больше в тех случаях, когда в сооб-

шестпе регистрируется присутствие ЛА форм с высокой активностью, при этом уровень АЛА признака сохраняется также достаточно высоким. В тех сообществах, где изначально не фиксировачись ЛА микробы, уровень АЛА признака у бактерий был низкий, а количество форм, обладающих jtiim признаком, незначительно. Ишересен реплыат, полученный при исследовании III варианта пзанмоотношешш в сообщеове (ЛА = 0. АЛА =0). Клонально-популяпионный анализ воды в ли.\ биоценозах выявил присутствие небольшого количества как ЛА так н апд hmnu юрин. но як-тиин«ст! форм г пепу.'ищпи ц^дльллЛ.и ¡>, Ч|ч и pel и-

стрировалось при скрининге как "нулевой" вариант. Было также отмечено, что антилизоцимная активность переставала проявляться тогда, когда количество таких вариантов бактерий снижалось до 10% от числа всей популяции. Эта закономерность прослеживалась во всех вариантах взаимоотношений, выбранных для изучения.

Таким образом, исследование динамики бактерпоплапк юна показало, что в течении года происходило изменение структуры микробной популяции по лизоцим - антилизоцимпому признаку и одним из возможных механизмов, участвующих в формировании биоценотических отношений, является лизоцим, выделяемый экзогенно гидробионтами в процесе их отмирания.

3.4 Модельная система "бактерии - зоонланктсры".

В естественных условиях бактерии контактируют с другими микроорганизмами биоценоза и в том числе, зоопланктоном и фитопланктоном. Однако, факторы и механизмы, определяющие эти взаимоотношения мало изучены.

В серии предварительных экспериментов нами обнаружена лизо-нпмная активность у различных видов зоонланктеров: Ent. histolitica, Amoeba proteus, Daphnia magna, Paramecium caudatum, Paramecium colpoda. Причем, вне зависимости от вида, гомогенаты обеспечивали степень лизиса микрококка, эквивалентную активности 0,50 - 0,70 мкг лизо-цима яичного белка. Наличие мурамидазной активности у зоопланктеров позволило провести анализ бактериально-зоопланктонного взаимодействия с позиции баланса в системе "антилизоцим бактерий - мурамндаза

зоопланктеров". При 72 часовом культивировании парамеции Р. со1рос1а и изогенных клонов АЛгоЬааег врр. с антилизоцимной активностью 0,2 и 6 мкг отмечено, что в тех случаях, когда нзоклоны имели низкую активность АЛА - 0 и 2 мкг, простейшие развивались быстрее, о чем свидетельствовало увеличение их числа. Если же зооплаиктеры сокультивировались с клонами, имеющими 6 мкг АЛА, то простейшие росли медленно и даже гибли. Таким образом, уровень АЛА микробов отражался на популяции зоопланктеров.(Табл.7).

Таблица 7 .

Результаты совместного культивирования "зоопланктсры-бактерии".

Культура зоопланктеров Характеристика миксткуль-туры до сокультивирования Характеристика миксткуль-туры после сокультивирования

Зоопланктеры Бактерии Зоопланктеры Бактерии

числ. кл. ЛА мкг/мл АЛА мкг/мл числ. кл. ЛА мкг/мл АЛА мкг/мл

Paramecium 500 0,69+/-0,11 0 810 0,50+/-0,01 0

colpoda 500 0,70+/-0,12 2 700 0 2

500 0,69+/-0,12 6 300 0 6

Daphnia 500 0,64+/- 0,15 0 700 0,48+/-0,02 0

magna 500 0,64+/-0,15 2 600 0 2

500 0.64+/-0Д5 6 200 0 6

Микроскопические исследования показали,что при сокультнвирова-нии Р.со1рос1а и изогенных клонов Аг1гоЬас1ег врр., обладающих нулевым уровнем АЛА, в каждой особи простейших в среднем находилось по 1-3 пищеварительной вакуоли и через 72 часа уровень АЛА бактерий оставался равным 0 мкг, а уровень эндогенного лизоцима в теле зоопланктеров сохранялся на том же уровне или снижался до 0,50 +/- 0,02 мкг/мл. (контроль 0,69 +/- 0,02мкг/мл).При сокультивировании с клонами, имеющими уровень АЛА 2 мкг, в теле простейших наблюдалось образование 58 вакуолей на каждую особь, а АЛА бактериальных клонов сохраняла свой уровнь, в то время как лизоцим у зоопланктеров не регистрировался. При совместном выращивании Р. со1ро<1а и изогенных клонов АПгоЬас1ег зрр. обладающих 6 мкг АЛА, у большинства простейших отме-

чалась разряжснность цитоплазмы, набухание клеток, переполнение их микроорганизмами, явление цитолиза и выход бактерий из тела простейших Ii среду. При этом уровень АЛА у бактерий оставался рапным 6 мкг, а лизоцим у зоопланктеров пе обнаруживался, хотя в контроле он оставался на уровне 0.69+/-0.02 mki/мл. Следовательно, АЛА бактерии, попавшие в тела зоопланктеров. ;iei радирует их лизоцим, а высокий ее уровень способствуй накоплению бактерий Biiyipii клеток зоопланктона, их переполнению микробами и гибели зоопланктеоов. Низкий vniwcui. АЛА V Самсрии о»ка:мгчиняетппп?<» г>чг?гг,прмяп10С С0"л;те.1ьс1ьо Пакюрни и простейших в природных водоемах, не вызывая их гибели.

Таким образом прослежена активно функционирующая система: "лизоцим зоопланктеров - антнлизоци.м бактерий".

3.5 Модельная система "водоросли-бактерии".

В литературе нет четкого представления о факторах, регулирующих, бактериально-фитонланктонные взаимоотношения. По нашим данным уровень лизоцима в гомогенатах водорослей составил 0,38 - 0,48 мкг/мл. В микст-культуры были взяты изогенные клоны Artrobacter spp, имеющие антилизоцимную активность 0, 2. 3 мкг/мл. Сокультивирования водорослей и бактерий осуществляли 72 часа при 27" С.

Отмечено, что при сокультивирования Scenedesmus quadricauda с Artrobacter spp, имеющим АЛА = 0 мкг, лизоцим у водорослей сохранился на прежнем уровне - 0,38 +/- 0,2 мкг/мл. После сокультивирования этой водоросли с изогенным клоном, имеющим АЛА 2 мкг, в клетках водорослей уровень лизоцима упал до 0 мкг/мл, а среди бактерий стали обнаруживаться клоны с уровнем АЛА превышающим исходный уровень (3-4мкг).Через !2 часов их число составило 24%. Спустя 24-48 часов количество таких клонов было 52%, а через 72 часа их доля в микробной популяции составила б4%.(Табл.8). Такие же закономерности отмечены и при сокультивировании других водорослей (Aphonizoraenon flos - aquae и Chlorella vulgaris) с Artrobacter spp. В тоже время, анализ состояния ли-зоцимной активности водорослей в процессе культивирования показал, что при 12 часовом совместном пребывании водорослей с бактериями в присутствии форм обладающих АЛА активностью, происходила деграда-

ция лизоцима водорослей на 21% от исходного уровня, а через 24-48 час. уровень лизоцима в клетках снижался на 42-52%, а к 72 часу культивирования лизоцим в клетках деградировался полностью (0 мкг/мл).

Таблица.8

Результаты совместного культивирования водорослей и бактерий(мкг/мл).

Культура зоопланктсров Характеристика микст-культуры до сокул(лидирования Характеристика мнксткуль-туры после сокультивирова- Ш1И

Водоросли Бактерии Водоросли Бактерии

ЛА мкг/мл АЛА мкг/мл ЛА мкг/мл АЛА мкг/мл

8сепе{1е5ти« 0,38+/-0,2 0 0,38+/-0,2 0

(1иас1пеаи(]а 0,38+/-0,2 2 0+/-0,1 2,0+/-0,1 2,5+/-0,1 3,9+/-0,3

0,38+/-0,2 3 0+/-0Д 3,1+/-0,2 4,3+/-0,1

АрЬош/.отепоп 0,43+/-0,1 0 0,43+/-0,1 0

Аоэ-ачиае 0,43+/-0,1 2 0,13+/-0,2 2,1+/-0,1 3,3+/-0,2

0,43+/-0,1 3 0+/-0Д 3,0+/-0,2 4,3+/-0,1 4,9+/-0,3

СЫогеИа 0,48 +/- 0,2 0 0,48 +/- 0,2 0

уи^апз 0,48 +/- 0,2 2 0,10+/-0,1 3,2+/-0,2 4,5+/-0,1

0,48 +/- 0,2 3 0+/-0,1 4,1+/-0,2 4,9+/- 0,2

Полученные результаты позволили предположить, что в процессе бактернально-фитопланктонного взаимодействия происходило изменение биологических характеристик бактерий в сторону повышения уровня АЛА бактерий и деградации лизоцима у водорослей.

Таким образом, установлена функциональная связь в лизоцим-антилизоцимном сообществе "водоросли-бактерии".

3.6. Механизмы лизоцим - ашилизоцпмных взаимоотношений у водных бак' I срни (зк'енеримеи I ильные данные).

Исследование механизмов взаимоотношений внутри лизоиимного со-

оГццеова в условиях лабораюрного водного микрокосма показали, чю биологические компоненты и продукты обмена в ходе сукцессии экг-перимен 1алыюю микрокосма ос)авалис|> стабильными. До начала ош.па количество ЛА бактерий в микрокосме превышало число АЛА - форм в 30 р«и. Чс1)е« чт: моте тчтуИт»"ИЧ раСТГГрЯ ЛПЗОЦПМа Л А -

снизилось, а число АЛА - бактерий возрасло. К 9 часу эксперимента эта тенденция сохранялась, но к исходу первых 12 часов от начала опыта произошло вновь увеличение количества ЛА - форм и уменьшение числа АЛА - форм бактерий и затем 12 часов данная закономерность сохранялась. В последующие 8 дней, при сохранении постоянного уровеня лизоцима в лабораторном микрокосме, прослежены последовательные пики в количестве ЛА и АЛЛ мпкроор! анизмов с периодичностью 1-2 сугок. При этом максимальному числу ЛА микроорганизмов соответствовал минимальные числа АЛА форм и наоборот. В период минимального количества АЛА-фор.м в воде преобладали бактерии с низким уровнем антнппзоцимной активности. Таким образом, прослежено, что в водном биоценозе лизопи-макшвнме и антплизопимные микроорганизмы формируют функциональную систему "лизоцим - антилизоцим".

С'Н'дотиш'лмю обнаружена лизоцимная активность в гидрпбионтои разных трофических уровней: водорослей, зоопланктеров и бактерий, а также получены данные лабораторных экспериментов и исследований в природных водоемах, позволяющие обосновать существование функциональной системы "лизоцим гидробиоптов - антилизоцим бактерий", которая является регулирующим звеном в формировании водных микробиоценозов.

Антилизоцим бактерий

4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СИСТЕМА: "ЛИЗОЦИМ-АНТИЛИЗОЦИМ" БАКТЕРИЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ВОДНОЙ СРЕДЫ.

Лизоцим гидробионтов

Численность, состав, функциональная активность бактериальных популяций в водных биоценозах определяют различные факторы биогенной и абиотической природы: фито- и зоопланктеры, температура, рН водной среды, поэтому в дальнейших исследованиях были проведены экспериментально-натурные исследования действия некоторых экологических факторов на систему "лизоцин - антилизоцим" бактерий.

4.1 Влияние рН водной среды на систему "лизоцим-антилнзоцим" у

микробов.

При изучении влияния рН на лизоцим-антилизоцимную систему бактерий мы исходили из того, что условия деятельности лизоцима характеризуются следующими оптимальными параметрами. рН - от 5,0 до 7,0 (Кравченко Н.А., 1972), а при изменении рН до 4,5, активность лизоцима уменьшается (.1то1о е1 а1., 1969 ), при рН 8,4, лизоцим почти не активен (Черкасов И.А., Кравченко Н.А., 1969). Экспозиция лизоцима в дистиллированной воде при рН -6,1 на видимом свету вызывает снижение его активности (Оигшап, 1968).

Все это позволило в лабораторных условиях вначале создать уровень рН - 7,0 - 7,5. В этих условиях в микрокосме преобладали ЛА бактерии с активностью 2,10-3,00 мкг/кол. над АЛА, с уровнем активности 1 -2 мкг/кол.. Через 1 час после закисления и стабилизации рН до 6,1 в микрокосме наблюдалось увеличение АЛА и ЛА бактерий в сравнении с их исходным содержанием, а к 3 часу отмечено снижение тех и других форм микробов, через сутки количество ЛА бактерий упало до нуля, в то время как число АЛА форм возросло в 30-50 раз. Численность АЛА бактерий достигала максимума на третьи сутки эксперимента, а в последующие 6 дней происходило колебание численности АЛА форм с переодичностыо в 1-2 суток. Отмечено что среди антилизоциактивных микробов появились клоны превышающие исходный уровень активности. После прекращения закисления аквариума,рН воды в течение 2-х суток восстанавливался, а в микрокосме резко снижалось число АЛА бактерий и возросло количество ЛА форм, а в их динамике наблюдались пики с периодичностью в 2-4 суток.

Таким образом, нарушение экологического равновесия в лабораторном

водном микрокосме за счет изменения pli войной среды приводит к резкому хвеличени:< ■ . \.ЧЛ форм микробов и снижению число .1.4 очктерий

! 1сслсд.'in.unie сосюянпя ли jomi.unoi о сообщес1ва микробов и рН воды в условиях ест cul венных водоемов покачало, чю в aisrvcie на раишч-ных станциях р.Урал величина pli колебалась от 6 до 10.3 и коррелировала с солержанием juiíoiiiimiioio сообшес nia микробов, причем прослежено три уровня корреляции: 1-ЫЙ - когда количество ЛА бактерий составная ?-1Л ----/•;- э при ,Л\ и^ЛЫ На Них V 1-ттЧГ 2-ОЙ - 'Hiw.O ЛА

бак le)>ип колебалось от 28 до 57 кое/мл, а рН от 7 до 7,9 и 3-ий - когда число лизонимактивных форм достигло максимума - 107-152 кое/мл, при рН на этих разрезах 6 - 6,6.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее оптимальным для активности лизоцима рН, в условиях естественного водоема, был - 6,0-6.6 . т.к. в воде регистрировалось максимальное число ЛА форм бактерий. При рН - 7.0-7.9 численность лизоцимактивных форм снижалась в 2-2,5 раза. Практически не регистрировался лнзоцим у микробов на станциях, где рН воды колебалосл, oí 8.8 до 10,3.

Анализ клональных изменений в структуре антилизоцимной бактериальной популяции при различных рН водной среды показал: при рН воды - 8.8-10,3, доминировали клоны с низкой АЛА активностью (1-4 мкг/мл), а при рН воды 7,0-7,9 преобладали клоны с большой актив-Hocibio - 5-10 мкг/мл. При ошимальных рН водной среды - 6-6,6, в популяции ангилнзоцимакшвпой микрофлоры отмечалась максимальная активность клонов - 10 мкг/мл. Таким образом, было выявлено, что система "лнзоцим-антилизоцим" микробной популяции активно реагирует на изменения рН водной среды, т.е. является весьмя динамичной.

4.2. Темпера турный фактор водной среды и его роль в экологии водоемов.

Одним из мощных экологических факторов, во многом определяющим интенсивность биологических процессов в водоеме, является температура. Температурный режим водоемов часто нарушается из-за теплового загрязнения сбросными водами ТЭС и АЭС. Подогретые воды усиливают рост бактерий, в том числе условно патогенных и патогенных (Булашов А .Я., Лоскутов Н.Ф., Лошаков Ю.Т., 1974).

Исследования температурного фактора воды с позиции его роли в формировании микробных популяции и лизоцим-антилизоцимного сообщества показали, что в Ириклинском водохранилище, в зоне действия тепловых сбросов, происходило усиление процессов образования вещества за счет фотосинтеза до 946,8 гС-1193,4гС, против 730,2 г С выше сброса, а это способствовало росту бактериальной популяции в результате увеличения скорости ее генерации. Образующиеся органическое вещество подвергается далее бактериальному окислению - деструкции. В идеально сбалансированной системе наблюдается равенство процессов синтеза и деструкции органического вещества. Сброс подогретых вод может существенно изменить круговорот органического вещества. Исследования показали, что в зоне активного подогрева, в годы с высокой прогреваемостью воды (1975, 1976, 1977, 1979) за счет солнечной инсоляции, происходило снижение минерализации и возрастание доли продукционных процессов в балансе органического вещества в водоеме. В годы с низким естественным прогревом воды (1981 - 1983 гг) заметного воздействия подогретых вод на деструктивную активность бактерий не наблюдалось. В круговороте вещества в водохранилище бактериями минерализовалось 23 - 69% от всей фотосинтетической продукции, остальная же его часть минерализовалась в донных отложениях.

Показателем активности процессов деструкции органического вещества на ферментном уровне является общая дегидрогеназная активность (ДА) смешанной микробной популяции. Результаты проведенных в 1978 г. исследований показали, что ДА микрофлоры илов колебалась от 0,008 до 0,180 мг формазана на 1 г сырого ила в час. Число сапрофитов и деструкция илов коррелировали между собой и испытывали угнетение в районе сброса подогретых вод ГРЭС, в то время как ДА подогретыми водами стимулировалась. Следовательно, температура воды регулирует не только численность но и ферментативную активность бактериальных сообществ. В.А.Гриценко (1989), изучая работу другой ферментативной системы у бактерий - антилизоцимную активность показал, что субоптимальные температуры модифицируют свойства энтеробактерий, повышая их антилизоцимную активность.

Опенка влияния подогрева воды на турбинах ГРЭС на антили-зоиимп\ю актпвноси», проведенная в условиях эксперимента и природного водоема показала: что антилизоцимная активность у бактерий находится в прямой ¡ависимости 01 температуры культивирования.

Бактерии проявляли максимальную антилизоцимную активность при 37° С кч'лыпнпрованпя - 10 мкг/мл +/- 0.1. коюрая памп принималась ¡а 100%. Практически не проявлялась антилизоцимная активность при 4° С

м г к «Г1ИШ»ЯГ ■»и»«НТп "~П1Ма). ПрЦ ЬОСШИС-^еШЮМ

температурном оптимуме уровень антилизоцимной активности составил 62 - 63% от максимума пли 6,2 - 6,3 мкг/мл. В летнем оптимуме температур АЛА была выше и составила 80% от максимального уровня. Все эти данные свидетельствуют о термоиндуцибельности антилизоцимного признака. В последующей серии экспериментов штаммы, выращенные при субоптимальных температурных режимах переносили в режим турбин - 37° С. Оказалось, что переход с зимнего оншмума к 37" С увеличивает антилизопимную активность у бактерий на 61% , а с летнего температурного режима к 37" на 4-23 %. Таким образом, переход из субоптимальных температур (4 , 10 , 14 , 18 , и 25°) в режим турбин (37° С) у микроорганизмов стимулировал антилизоцимную активность. Установлено, что если летняя температура воды составляет 26 - 27? С и выше, то антилизоцимная активность бактерий, поступивших с турбин в водоем-охладитель сохраняется на максимуме - 8 - 10 мкг/мл. Выходе термальных вод с турбин (37" С) и условия зимнего режима (4и С) сохраняет антилизоцимную активность на уровне 4,2+/-0,2 мкг/мл, в то время как культуры выращенные при 4° С этого признака не проявляли. Следовательно, регулируя температуру воды в водоеме-охладителе, можно регулировать и санитарное состояние водоема. Подтверждением этих выводов являются данные анализов, проведенных в сбросном канале ГРЭС и в зоне поступления термальных вод в Ириклинское водохранилище и на водозаборе (Табл.9).

Полученные данные показали, что в сбросном канале и в зоне поступления термальных вод наблюдалось преобладание АЛА форм бактерий в биоценозах. Одновременно в зоне свободной от термальной нагрузки и с относительной температурной стабильностью преобладали ЛА

формы микроорганизмов: водозабор, приллотинный плес, что подтверждает результаты лабораторных экспериментов.

Таблица 9

Микробиологическая характеристика воды Ириклинского водохранилища

Название станций ОМЧкл/мл АЛАкое/мл ЛАкое/мл

Водозабор 1360 +/-27,0 110+/-24 120 +/- 30

Какал 2200 +/- 44,0 860 +/- 47 150 +/- 45

выхода из капала 6700 +/- 91,0 295 +/- 59 55+/-11

Ст.2 ниже выхода 4575+/- 91,0 88 +/-17 110+/- 22

Прнплотинный плес 2050 +/- 41 93 +/-18 215 +/- 3,0

Полученные данные позволили сделать вывод, что система лизо-цим-антилизоцим микроорганизмов весьма динамична и поэтому может быть использована в биоиндикации водоемов. На основании полученных данных нами разработан способ прогнозирования водоемов.

5. СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ БИОЦЕНОЗОВ.

Антропогенные сбросы изменяют среду обитания гидробионтов, в результате изменяется их качественный и количественный состав, меняется . биоценоз и изменяется качество воды, т.е. ее биологическая полноценность - способность обеспечить воспроизводство (основных звеньев) экологической системы, сформировавшихся в предыстории и пригодность ее для конкретных видов водопользования (Печуркин Н.С., 1985; Строганов Н.С., 1972.). В связи с этим встает задача разработки принципов оценки качества вод, или проблема экологического нормирования, которая связана с определением степени изменения природного водоема в результате хозяйственной деятельности (КотоваЛ.М., Рыжков Л.П., Полина A.B., 1989).

В биоиндикации антропогенного загрязнения водоема широкое распространение получили микробиологические методы, основанные на учете общего числа сапрофитных бактерий (Разумов А.С, 1932) или на основании кили-титра и коли-индекса (Разумов А.С.1947). Кишечная палочка - сапрофит, но ее обнаружение в воде свидетельствует о возможности присутствия в ней и патогенных микробов.

Наиболее надежно характеризуют качество воды и еоеюяние водною биоценоза оценка их по гидробиологическим ио.чазак'лям. ч е оценка пригодное гп воды для питьевого водоснабжения, а водоема для рыбо\о(яп-ственных нелеп. Для выявления "откликов" на антропогенные воздейепшя биоценоза мспользуют фпто-. зоопланктонные и беиюеные формы гид-робпоптов (Тарасов А.С.. 1 МУЗ: Миллпус АЛО.. Кавыск В.О.. 1979: Ж\кинскип В.Н., Окспнюк О.П., Цсеб Я.Я., Георгиев В.Б., 1977) . В основу оценки состояния ппппеия ятпп" г?"™":::"':" 7:п*:естхс:ший и кол»чсс1всн-имп состль фшиилапкюн<1 и и\ физиологическую активность (продукцию фитопланктона, индекс самоочищения и т.д.). Однако, все предлагаемые методы не лишены целого ряда недостатков :

1. Длительность и трудоемкость обработки взятых проб, а отсюда и низкая оперативность в регистрации антропогенного воздействия на состояние биоценоза.

2. Регистрация уже состоявшегося изменения в биоценозе, его функционирование, а не предсказания его начала.

3. Не учитываются механизмы, обеспечивающие функционирование сообщества.

Исходя из полученных нами данных о существовании в водоеме динамичной системы "лизоцим - антилизоцим" у микробов был предложен способ бпоиндикации ранних изменении в водном сообществе, отличающийся повышенной точностью нропюшрования состояния биоценоза. Решение поставленной цели осуществлено путем использования в качестве тестов биоиндикации титра лизоцимактивных и антилизоцимактивных микроорганизмов с последующим определением индекса Л, получаемого по соотношению количества лизоцимактивных (ЛА) к антплизоцимак-гпвным микроорганизмам (АЛА) :

Л - показатель экологического состояния водного биоценоза. М1 - количество микроорганизмов с лизоцимной активностью. М2 - количество микроорганизмов с антилизоцимной активностью.

Способ запатентован (положительное решение по заявке на изобретение N50399881/13 от 29.12.93г.).

Таким образом, система "лизоцим-антилизоцим" бактерий воды бе-

Л= ■

М1

М2

рется в качестве "методического инструмента" биологической индикации водного биоценоза. Создание заявленного способа стало возможным после определения следующих моментов:

1. Сброс в водоем промышленных и бытовых стоков оказывает воздействие на все звенья гндробионтов в водном биоценозе, как на фитопланктон, зоопланктон, так и микрофлору, изменяя их качественный и количественный состав.

2. Изменение состава биоты отражается на сапробности воды, на функциональной активности (интенсивности суточной продукции, процессах минерализации-деструкции органического вещества за счет микрофлоры, интенсивности самоочищения и т.д.), что в свою очередь сказывается на классификационной характеристике воды.

3. Сравнительный анализ данных, полученных при использовании в качестве критерия оценки состояния биоценозов способа, взятого за прототип и предлагаемого показал, что по мере усиления степени загрязненности воды происходит заметное увеличение числа антилизоцимак-тивных форм и снижение лизоцимактивных от общего микробного числа (ОМЧ), регистрируемого на мясо-пептоном агаре.

Таким образом, введение данного показателя позволяет контролировать экологическое состояние биоценозов в водоеме:

| 1 < Л < 1 |

благополучное неблагополучное

состояние биоценоза

Новизна заявленного способа заключалась в том, что для оценки и прогнозирования состояния водного биоценоза использовали соотношение в системе "лизоцим - антилизоцим" водных бактерий. Способ существенно отличается от известных в санитарной гидробиологии, т.к. в качестве инструмента биоиндикации состояния водного биоценоза предложено использовать более ранние измененения в микрофлоре водоема: соотношение количества лизоцимактивных форм к антилизоцимактивным.

По полученным данным численности лизоцим и антилизоцимак-тивных бактерий вычисляется коэффициент Л. Оценка и прогнозирование

состояния биоценоза делаются по соотношению 1< Л < I.

Таблица 10

Мони Юрии! за! ря шення полной среды р. Урал у I .Оренбур! а по уровню отношения лпзоцим- к антплиюцимакшинмм бак!сриям

С г а н ц и и Л А АЛА Л А АЛА Л

ИЮНЬ

1. Дубки у нос.Ивановки леп.бер. 10% 12% 0,8

2, Дубкл ^ шрйн.оер,) )«/„ 1 Г" «М

3. Водозабору 1 ор.и.шжей (нран.бер.) 1%. 0,5 <1

4. Водозабор (лев.бер.) 10%» 2% 5 >1

5. Очистные сооружения (сток с очист. 50%, все 0,00 <1

сооружениями, пр.бер.)

6. Очистные сооружения (лев.бер.) 20%, 2% 10 >1

7. У стока р.Сакмары (прав.бер.) 20%, 69% 0,3 <1

8. Против стока р.Сакмары (лев.бер.) 63%, 7% 9 >1

ИЮЛЬ

I. Дубки у пос.Ивановки лев.бер. 4,7%о 87,5% 0,05 <1

2. Дубки у пиоперских лагерей (прав.бер.) 7,0%о 23,0% 0,3 <1

3. Водозабор у гор.плнжей (прав.бер.) 1%, 87,0% 0,01 <1

4. Водозабор (леп.бер.) 50,6%, 25,7%, 2 >1

5. Очистные сооружения (сток с очист. 2,6%, 9,6% 0.2 <1

сооружениями, пр.бер.)

6. Очистные сооружения (лев.бер.) 8,6% 1% 8,0 >1

7. У стока р.Сакмары (прав.бер.) 6,2%о 39,2% 0,15 <1

8. Против стока р.Сак мары (лев.бер.) 5,7% 0,9% 6 >1

Приводим примеры конкретного выполнения заявленного способа. Наиболее крупной рекой Европейской части России является р.Волга. Анализ соотношения лизоцимактпвных и антилизоцимактивных микроорганизмов в бассейне р.Волги на протяжении от вододелителя до г. Астрахани в наиболее стабильный для биоценозов теплый период август -сентябрь (осень) показал, что осенний период (август-сентябрь) характеризовался наиболее стабильной погодой (отсутствием дождей, хорошим

прогревом воды), что способствовало формированию устоявшихся биоценозов на каждой станции, поэтому любое антропогенное влияние в этот период регистрируется достаточно четко.

Определение экологического состояния биоценозов в р.Волге и ее притоках (таблица II) по отношению лизоцимактивных к антилизо-цимактивным микроорганизмам (Л) показал, что в местах сброса хозяйственно-бытовых и промышленных стоков, коэффициент Л был значительно меньше 1 (0,01 - 0,5 ) (ст. 1, 4, 7, 8, 10, 11), чем на станциях, расположенных выше этих стоков или у истока рек (ст. 2, 3, 5, 6, 9), где коэффициент Л > 1, что свидетельствует об экологическом благополучии в водных биоценозах на этих станциях.

Дополнительно проведенные гигиенические исследования показали отсутствие в этих точках токсических воздействий. Таким образом, определение соотношения количества лизоцимактивных форм к ан-тилизоцнмактивным формам бактерий является надежным критерием оценки состояния биоценоза.

Пример. Оценка состояния водных биоценозов в р.Урал и у г. Оренбурга по уровню соотношения лизоцимактивных к антилизоци-мактивным бактериям была проведена по результатам исследования проб, отобранных в июне и июле 1990 г.

На основании данных, представленных в таблице 10 видно, что на станциях, расположенных в зоне поступления стоков от населенных пунктов (ст.1), пионерских лагерей (ст. 2), с очистных сооружений (ст.5) и у устья р.Сакмары (ст. 7), несущий сточные воды с Сакмарской ТЭЦ, соотношение лизоцимактивных к антилизоцимактивным формам бактерий не превышало 1 и коэффициент Л колебался от 0,01 до 0,8. Таким образом, коэффициент Л меньше 1 отражает экологическое неблагополучие в биоценозах. На станциях, расположенных в зонах экологически чистых (ст. 4, 6, 8), т.е. участках реки, не получающих антропогенные загрязнения с водосборной площади, коэффициент Л был выше 1 (от 2 до 10), что свидетельствует об экологически благополучных биоценозах на этих станциях.

Таким образом, определение соотношения лизоцимактивных форм бактерий к антилизоцимактивным является хорошим показателем в оценке

состояния биоценоза. Способ просгв исполнении. Не требует больших затратна подготовку лаборантов-исполнителей и позволяет ускорил, получение реп'лматов исследований, харакгори*ующпх состояние биоценоза.

6. О ПК шел СОСТОЯНИЯ ВОДОЕМОВ ИОД КОНТРОЛЕМ ФУНКЦИОНАЛЬНОМ СИСТЕМЫ "ЛИЮЦ11М -ЛПТПЛШОЦИМ"

ПАКТЕРИП.

Крупнейшими реками Европейской части России являются Вози а и Урал, большая протяженность и высокая антпопог<»мия« «^-ру?:::; з.й-тг»р гг неоохоничлет«- прггеденпл 1 ¡ыробпчлш нчеекп.х мони-

торинговых работ по экологическому состоянию этих водоемов. Поэтому, на последнем этапе работы были проведены исследования по оценке состояния биоценоза с помощью разработанного нами биотического теста Л, а также по основным микробиологическим показателям: числу са-профитов, обшей численности микробов, кишечной палочке и по оценке функциональной аклшности биоценоза, скорости бполо1 ичеекчн о самоочищения воды в нем. Полученные данные представлены в данной I лаве.

6.1. Микробиологическая характеристика загрязненности р Урал и его

притоков.

Анализ микробиологических показателей загрязненности в р.Урал у г. Оренбурга показали, что под влиянием антропогенных злгряшеннй. поступающих со стоками с очистных сооружений /станция 5/ численность сапрофитной микрофлоры и бактерий кишечной палочки зиачшельнн воз-рлечае!. Так. если на разрезе Дубки /станция I/, расположенном выше спуска сточных вод, число сапрофитов колебалось в различные годы исследования от 100 до 440000 клеток в 1 мл, а бактерий группы кишечной палочки - 200-28000 клеток в I л то в районе поступления стоков с очисшых сооружении /станция 51 число сапрофитов возрастало до 1600 - 950000 клеток в 1 мл. а кишечной палочки до 1000 -109000 кл/л. Высокой сохранялась их численность и ниже поступления стоков, у Зеленого Яра /станция 6/. Количество бактерий кишечной палочки здесь составило 1500-44000 кл/л.

При этом более высокое число сапрофитов было у правого берега т.е. по месту впадения стоков. Достаточно привести данные за 1991 год. Так в районе очистных сооружений у правого берега число сапрофитов составило 2200 -120000 клеток на мл, а у левого берега - 400 - 2500. Такую же зако-

номерностъ можно отметить и в районе Зеленого Яра, где количество са-профитов у правого берега было 16000 - 9200 клеток/мл. Аналогичную картину мы наблюдали и в содержании общего числа бактерий н бактерий кишечной палочки.

Отражением состояния водного биоценоза являются процессы бактериальной деструкции органического вещества, т.к. они составляют основу биологического самоочищения воды водоемов, а значит и его благополучия. Поэтому оценка быстроты минерализации легкодоступного органического вещества в р. Урале на разных разрезах исследуемого участка реки была одним из показателей биологического благополучия биоценоза. Об интенсивности распада легкодоступного органического вещества в воде судили по сапоставлению величины суточной деструкции и БПК (Марголина Г.Л., 1969).

Полученные данные показали, что количество легкодоступного вещества, определяемого по БПК, достигало в 1989 г. 0,20-11 мг Оз/л (среднее - 6,0 мг О2 /л). За одни сутки в 1 л воды во время максимального ее прогрева в июне-августе 1989 г. разрушалось 0,35-0,50 мг Ог, (среднее-1,31мг02), а в 1990г. 0,28-1,67мг (среднее-0,73). В 1991 г. в период максимального прогрева (май-июль) минерализовалось 0,96-4,02 мг органического вещества, выраженного в кислородных единицах (среднее =2,03 мг Ог /л сутки).

Интенсивность процессов распада органического вещества изменялась на протяжении вегетационного периода. Самые низкие величины деструкции наблюдались в октябре 1989г. при 1-2,6 - 8,8° С, в августе 1990г., когда температура воды снизилась до 12-13° С, в результате общего похолодания, а также в сентябре 1991г. (I - 14-16° С). Влияние температуры на интенсивность процессов распада органического вещества очень четко прослеживается в августе 1990 г. При высоком содержании легкодоступного органического вещества в воде - 4,75 мг Ог/л, величина минерализации составила всего лишь 0,30 мг Ог/л, что связано со значительным понижением температуры воды. Максимальная скорость деструкции наблюдалась в 1989 г. при I - 20,8° С (среднее - 2,5 мг Ог/л), а в 1990г. при такой же температуре интенсивность деструкции была значительно ниже (среднее -

1.07.М1 0:/л ): Это говорит о том, что на величину минерализации оказывает влияние не только температура поды в момент наблюдения, но и общее еосюяпие водоема в этот период а также характер посыпающего оргаипчсско] о вещества, подвергшегося распаду. В зоне поступления сю-коц происхи.шло замедление процессов самоочищения воды. Так в 1У89 г выше поступления стоков (Дубки), процессам распада подвергалось 25 -НО" II легкодоступного органического вещества, в то время как в районе поступления стоков г гсср}л.ынш 1<л.5( щхшгчгач рясгтядп с суп'и гт-дгсргались лишь з-20% от лсгкодос1упного органического вещества. В 35 км ниже сброса (Зеленый Яр) процессы самоочищения восстанавливаются и составляют 26-56% от легкодоступного органического вещества. Такие же закономерности мы наблюдали и в другие годы исследования.

Нами обнаружено, что по мере усиления степени загрязнения водоема происходило и увеличение числа антплпзоцимактпвных микрооргашы-мов. Оценка состояния водных биоценозов в р.Урал у г.Оренбурга по соотношению лизоцимактивных к антилизоцимактивным бактериям /Л/ показала, что в зоне поступления стоков с городских очистных сооружений величина Л колебалась от 0,01 до 0,6, что явилось подтверждением экологического неблагополучия в состоянии биоценозов па этом разрезе. Из данных представленных на рисунке 1 видно, что экологически неблагополучными были также участки реки, расположенные в районе впадения р. Сакмары и на станциях 1,2, где регистрировали сгоки ог пионерла!ерей и поселка Ивановка, а в лизоцимном сообществе микробов доминировали антилизоцимактивные формы, отсюда индекс "Л" колебался от 0.01 до 0,8. Изменения соотношения в микробной популяции в сторону увеличения АЛА форм, а отсюда и падение биотического индекса "Л" ниже I, явились подтверждением неблагополучия в биоценозах реки па этих станциях, которые мы выявили стандартными гидробиологическими методами. Следовательно, под влиянием антропогенных сбросов Оренбурга в Урале происходили изменения в качественном состоянии биоценоза, о чем четко прогнозирует предложенный биотический индекс "Л".

Результаты проведенного мониторинга по лизоцим-антилизоцимному

соотношению в микробных популяциях Урала и его притоков, а также крупнейшем водохранилище, расположенном в верховье реки представлены на рис 1. Как видно из рисунка по качеству воды к грязным были отнесены реки Черная, у п. Черноречье и река Каргалка у п.Мужичья Павловка.

Анализ соотношения микробов, обладающих лизоцимной и антили-зоцимной активностью показал, что в микробном сообществе рек Черной и Каргалки на указанных станциях преобладали АЛА формы, отсюда "Л" был равен 0,32, т.е. меньше 1, а процессам минерализации подвергалось лишь 10 - 25% органического вещества. К загрязненным по классу ка. чества воды были отнесены следующие притоки Урала: река Каргалка у поселка Каргала и у поселка Горный. По степени сапробности воды река в этих точках характеризуется как мезосапробная, а в лизоцимном сообществе преобладание лизоцимактивных форм, отсюда показатель "Л" приближался к 1 и составлял 0,7 - 0,9. Для воды с удовлетворительной степени чистоты: река Сакмара - п. Подмаячный, река Каргалка -п.Сергиевка показатель "Л" был равен 2,5 и 25 соответственно. В указанных точках значения "Л" на много превышают единицу, что свидетельствовало о стабильном состоянии биоценозов. Об этом же говорит и активность процессов самоочищения. За сутки здесь подвергается распаду в процессе микробной минерализации от 45 - 80%о легкодоступного органического вещества.

6.2 Микробиологический мониторинг воды Ириклинского водоранилища

За последние годы в водохранилище наметилась тенденция к цветению водоема. Сложившаяся ситуация и явилась причиной проведения работы по микробиологическому мониторингу воды Ириклинского водохранилища (рисунок 2).

Полученные результаты позволили выделить в водохранилище ценозы с "нормальными" и "нарушенными" биологическими структурами. Наиболее загрязненными были участки водохранилища, расположенные на станции 4,5 (зона поступления тепловых сбросов). На этих станциях высоким было ОМЧ и коли-индекс (> 3), На станции, расположенной у

впадени р.Таналычки, ОМЧ было низким, однако, 1/4 часть их составляли антилизоцимактивныс формы, отсюда "Л" был меньше 1 (0,1 -0.2). чю юворило о неблагополучии в биоценозах этих станций. По-видимому, на состояние биоценоза на этой станции оказывают влияние к'.мюхенные сбросы из Башкирии, поступающие в водохранилище со стоком р.'Ганалык. Их влияние прослеживалось и ниже по водохранилищу -С1анция 3, где антшшзоцимактивные формы в 2-3 раза превышали число т":сцп:.!и.ч.»1Ъ11ыл оаюерии <".>("= *м». 1} Патггсрядсииеа ¿iomv яьляею* повышенное содержание органического вещества (БПК полное - 20,9 мг 0:/л, против 5,26 мг Оз/л выше поступления техногенных тепловых сбросов), а также падение бактериальной активности (скорость размножения бактерий была в 2-3 раза ниже-58,1 часа против 35,8 часа) и интенсивности минерализации. Дестабилизация биоценоза наблюдалась в районе пристани (ст. 18), о чем говорило высокое содержание ОМЧ и колп-индекс (>3). БПК полное (9,9 мг 0:/л), а также преобладание в воде иерсистемт-ных форм бактерий (АЛА). О значительном неблагополучии в этих биоценозах говорит факт цветения сине-зеленых и полное отсутствие зеленых водорослей, а это является показателем вторичного, биологического загрязнения водохранилища, т.е. его евтрофирования. Преобладание ан-тилизоцимактивных форм бактерий отмечалось на станциях 9, ниже нос. Мирный и 10 и 11 (рр.Таналык и Суундук), и биотический индекс "Л" был ниже I. В фитопланктоне на этих станциях были представлены кроме диатомовых и зеленых, сине-зеленые: Anosoena lemmemarii, Aphonuzomenon flos-aquae, Microcystis aeruginosa, являющиеся и мезосапробами, показателями загрязненной и грязной воды, говорящих о неблагополучия биоценоза. Наибольшей стабильностью характеризовались биоценозы па станциях 17, 7, 2.

7m«mw Фёшфяшчфятже

I-11.Кршстск.»одомрмишп!« It. р. Г рол при. «араг, п. JUnba М.СЛкякмв pp. »род ш Саишара irpaa.eapar

-------—- II. Водомбор, про*. dapar ----- -

19. Во до* ago р. мв. 0«р«г * J. p. Урлд, ж/д HOOT II. p. Урал npaa.eapar, edpoo 39. р.Трм Jaa.tepar, сброс

II. р. Чармал, л« Ч«рюр«чы

13. р. Каргелкл, п. Каргма

14. р. Н»ргал*т, /г. М. бятлсакв

15.р. Каргалка, л.Гормы* К. р. Каргалка. о. Саргяаака 17. р. Урал М1. бараг, Я.ЛУбкл

И.Сляшаа pp. Урал ■ Сакмара «■■.«•par М. р. Клак (аааь) tt, р. Клан (шг/л)

колмчастао lA-fop« махроорголшиоя

в-

колччаотм АДА-|ерм шкроорг«нмаида отсутетааа |лорн

_£ис i. Cxmia

шкробшлогачвсяйто жмосгорохвга вода ompumz впуямгш Уральского Оасовйвя

JW2

Карта-схема гидробиологического мониторинга Ириклинского водохранилища . ;

Ж

Микроорганизмы Водоросли . ,

Био^ст^реякдня

Разнообразие водорослевых биоценозов Лизоцимактивные формы преобладали над антилизоцимактивными, отсюда "Л" был равен 1,2-1,6.0 чистоте воды в этих биоценозах говорит и

• -АЛА

0 ЛА

е - диатомовые*

о " - зеленые

• сине-зеленые

о . нетоксичная

в - среднегоксичн.

в ' токсичная

преобладание в фитопланктоне лини, диатомовых и пирофитовых водорослей.

Таким образом, в результате проведенною микробнолотчсскою мониторинга Ириклинского водохранилища выявлены зоны ainponoieii-пого влияния, одна из которых связана с поступлением термальных вод: ст. 1, 4. 5 и перестройкой микробиоценозон. Другая зона неблагополучия связана с поступлением техногенного загрязнения (фенолов, нефтепродуктов, тяжелых металлов и т.д.). стянпи" о !« !!,£, 3.

6.3 Микробиологический мониторинг воды р.Волгн.

Для расширения и уточнения возможностей использования разработанного способа в прогнозировании состояния водоемов, по результатам анализов, проведенных в 1989 - 90 гг. Н.В. Немцевой по определению количества лизоцимактивных и антилизоцимактивных микроорганизмов в реках Волго-Ахтубинской поймы осуществлена оценка биоценозов в этой водной системе (табл.11). Полученные результаты показали, что в местах

Таблица 1I

Определение экологического состояния

биоценозов в реках Волжского бассейна

Характеристика станции % лизоци- % аитшш- Л А л

мактивных зоцнмактив пых АЛА :

ОСЕНЬ

1. р.15олга, район вододелителя 0 40 0,01 <1

2. Исток р.Бузан 70 45 1,5 >\

3. р.Бузан выше ж/д моста 15 10 1,5 >1

4. р. Ахтуба, ниже с.Сентовка 25 50 0,5 <1

5. р.Берекет выше с.Степного 20 10 2 >1

6. Исток р.Кигач 30_ 10 3 >\

7. Уегье р.Берекет 10 25 0.4 <1

8. Река Бузан 15 40 0,35 <1

9. Река Бахтимир 35 35 1 =1

10. р.Волга у с.Плышка 5 45 0,1 <1

11. р.Волга, г.Астрахань 0 50 0,0 <1

сброса хозяйственно-бытовых и промышленных стоков: р.Волга, район вододелителя, р. Ахтуба, ниже с. Сентовка, устье р. Берекет, река Бузан, р. Волга у села Ильинки и г. Астрахани, антилизоцимактивные формы бактерий преобладали над лизоцимактивными и биотический коэффициент

был меньше 1(0.01-0,5). На станциях же расположенных выше этих стоков : исток реки Бузан, исток р. Берекет, выше с. Степного, исток р.Кигач, р.Бахтимир и р.Бузан выше ж/д моста , в воде преобладали лизоцимак-тявные формы, а коэффициент "Л" превышал 1 (1,5 -3,0) что говорит об экологическом благополучии исследуемых водоемов на этих участках. Таким образом, предложенный индекс позволил провести оценку биоценозов в бассейне Волго-Ахтубинской поймы .

Следовательно система лизоцим-антилизоцим может служить инструментом гидробиологического мониторинга в плане определения экологического состояния водоема.

ВЫВОДЫ

(.Впервые обосновано существование системы "лизоцим-антилизоцим" микроорганизмов в природных водоемах и показано,что эта система является одним из факторов формирующих водный биоценоз.

2.Установлена пригодность системы "лизоцим-антилизоцим" в качестве экологического критерия состояния биоценозов, на основании чего предложен "способ прогнозирования водных биоценозов", основанный на обнаружении количественно-качественных сдвигов в функциональной системе "лизоцим-антилизоцим" у бактерий, позволяющий выявлять антропогенные загрязнения в водоеме.

3. Разработаные методические подходы к определению лизоцмнон и антилизоцимной активностей гидробионтов (фито-, зоо- и бактериопланк-тона), и подобранная специальная питательная среда ("безбактериальная вода"), содержащая яичный лизоцим в концентрации 0,5х10"4 мкг/мл с использованием мембранных фильтров фирмы "Сынпор" с диаметром пор 0,19мк., позволили оценить уровень лизоцимной и антилизоцимной активностей гидробионтов.

4.Впервые установлено, что у микроорганизмов различных экологических ниш: бактерий, водорослей и зоопланктеров наблюдается высокая частота встречаемости лизоцимного признака, с хорошо выраженной гетерогенностью у видов по данному признаку.

5. Анализ бактериальных сообществ водоемов показал, что в них

широко представлены антилизощшактивные штаммы. Повышение численности бактерий сопровождается возрастанием числа клонов с высокой АЛА активностью, а при снижении обсемепепноеги воды увеличивается количество бактерий с низким уровнем активности .

(). Анализ результатов изучения системы "лпзоцим гидробионов - ан-ТИЛПЗОЦИМ бактерий" показал,что высокий уровень АЛА у бактерий (2-6 mki ) вызывал деградацию лизоцима у простейших, обеспечивая бактериям способность персистировать в их клетях « « последующем. игреподнешпо ч цитолиз прос1гин!ц\ »f снижению численности их популяции. В системе "лпзоцим фитопланктона - антилизоцим бактерий", антцлизоцимная активность бактерий деградировала лизоцим водорослей, который переходя в экзогенную форму способствовал отбору в микробной популяции бактериальных клонов с высоким уровнем антилизоцимной активности.

7. Динамику микробных популяций в водоеме определяет органическое вещество, поступающее в процессе фотосинтеза фитопланктона и отмирания гидробионтов и регулирующее "лизоцим - аитилизоцимные" взаимоотношения в микробиоценозах.

8. К экологически значимым факторам в регуляции лизоцим-антнлпзоцимных сообществ в водоеме отнесены pH и температура воды. Установлены оптимальные значения pH (6 - 6,6) для продукции лизоцима у бактерий и термоиндуцибильностъ антилизоцимного признака.

9. По результатам 20 летних режимных наблюдений на водоемах степной зоны выявлены естественные циклы динамики микроорганизмов и круговорота органического вещества в их биоценозах и показана возможность использования системы "лизоцим-антилизоцим" как инструмента в скри-нинговых исследованиях в рамках микробиологического мониторинга водоемов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гидробиологическая характеристика среднего течения реки Урал //Журнал Микробиология, т. ХУП., вып. 2 - 1973. - С. 336-339.

2. Биопродукционные процессы в р.Урале у г.Оренбурга // Гидробиологический журнал, N 1, т. X. - 1974. - С. 77-80.

3. Роль отдельных групп микроорганизмов в процессах самоочищения

р.Урал // Тезисы докладов 4-й научной конференции молодых ученых Оренбургского мединститута. - 1976. - С. 36.

4. Численность и биомасса микроорганизмов в донных отложениях р.Урала // В кн.: Питьевые, минеральные к сточные воды Оренбургской области, г.Оренбург. - 1976. - С. 128-130.

5. Микрофлора, интенсивность фотосинтеза, фитопланктона и деструкция органического вещества в р.Урал //Ш съезд Всесоюзного гидробиологического об-ва. Тезисы докладов, Т. 3. - Рига. - 1976. - С. 142-144.

6. Первичная продукция и деструкция органического вещества в р.Урал // В кн.: Биологические основы рыбного хозяйства Средней Азии и Казахстана, Душанбе. - 1976. - С. 71-73. (Соавт. Б.С.Драбкин).

7. Распад органического вещества в р.Урал и роль микроорганизмов в этом процессе // В кн.: Биологические основы рыбного хозяйства Средней Азии и Казахстана, Душанбе. - 1976.-С. 171-173.

8. Итоги и перспективы изучения гидробиологического режима Ириклин-ского водохранилища // В сб.: Проблемы экологии Прибайкалья, г. Иркутск.-1979. - С. 43-44.

9. Потенциальная способность микрофлоры воды Ириклинского водо-хранила к окислению нефтепродуктов и интенсивность самоочищения //Тезисы докладов Уральской конференции "Проблемы экологии, рационального использования и охраны природных ресурсов на Урале", г.Свердловск. - 1980. - С. 33-34.

10. Интенсивность процессов самоочищения воды Ириклинского водохранилища // Тезисы докладов научно-практической конференции в сб. "Ученые-производству", г. Оренбург. -1980. - С. ПО-112. (Соавт. М.А.Зубкова).

11. К микробиологической характеристике Ириклинского водохранилища // Сб.: Биологические ресурсы водоемов Урала, их охрана и рациональное использование, Пермь. - 1983,- С. 65-67. (Соавт. Н.А.Петинова, М.А.Зубкова).

12. Биопродукционные процессы в Ириклинском водохранилище // Сб. "Биологические ресурсы водоемов Урала, их охрана и рациональное использование", г. Пермь. - 1983. - С. 67-69. (Соавт. Н.А.Петинова).

13. Изменение водной экосистемы Ириклинского водохранилища под влиянием подогретых вод. // Сб.: Охрана природы и здоровье человека. -Оренбург. - 1983. - С. 13-16.

14. Численность и биомасса, время генерации бактерий в воде Ириклинского водохранилища // Сб.: "Охрана природы и здоровье человека"- Орен-

бург, - 1983.-С. 16-19.

15.Opistorchis felineus как компонент биоценозов рек Урал и Сакмара в Оренбургском области. // II Всесоюзной съезд паразитологов. Киев- ( 483. С.23(>-238.

16. Гидрохимическое. гидробиологическое и сашплрное изучение воды Ириклинского водохранилища в связи со спуском в водоем больших масс подо-rpeii.ix вод Приклинской ГРЭС. // Сб.: '' Влияние окружающей и прошвод-ственной среды на здоровье рабочих промышленных предприятий", - Оренбург.-19S1- С. 2 о. {Соаы.. ii h Очифссп, Н.Д.Ослдчол, С.М.Кишна».

17. Круговорот органического вещества в воде и грунтах Ириклинского водохранилища // Сб.: "Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование" . Изд. УОАН СССР, г.Свердловск. - 1986. - С. 141.

18. Процессы деструкции органического вещества в воде и грунтах Ириклинского водохранилища // Сб.: "Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование". Изд. УО АН СССР, г. Свердловск. - 1986. - С. 143. ( Со-авт.: М.М.Павлова).

19. Биологическое потребление кислорода и процессы самоочищения воды в Ириклинском водохранилище// Сб.: Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование. Изд. УО АН СССР, г.Свердловск. - 1986. - С. 142. (Соавт. : М.А.Зубкова).

20. Микробиологическая характеристика Ириклинского водохранилища II Сб.: "Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование". Изд. УОАН СССР, г.Свердловск.- 1986,- С. 144. ( Соавт.: Н.В.Майко, М.М.Павлова).

21. "Цветение" воды р.Илек как результат нарушения процессов саморегуляции в гидробиоценозах // Сб.: "Экологические проблемы реки Урал и пути их решения". - Гурьев. - 1989. - С. Ю9-110.

22. Обзор гидробиологических исследований на р.Урал // Сб.: "Экологические проблемы реки Урал и пути их решения", г. Гурьев. - 1989. - С. 111-113.

23. Лизоцимная активность гидробиоитов р.Урал II Сб.: "Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование". Изд. УОАН СССР, г. Свердловск. - 1989.-С. 129-130. (Соавт. Е.И.Бритвина, Э.И.Дедков).

24. Общая численность, время генерации и бактериальная продукция микробов р.Урал И Сб.: "Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование". Изд. УОАН СССР, г. Свердловск. - 1989,- С. 128. (Соавт.

М.М.Павлова).

25. Первичная продукция фитопланктона Ириклинского водохранилища // Сб.: "Гидробиологическая характеристика водоемов Урала". Изд. УОАН СССР, г.Свердловск. - 1989. - С. 39-49.

26. Влияние антропогенных факторов на гидробиологический режим Уральского бассейна. //Тезисы докладов в сборнике "Регионального семинара -совещания по проблемам охраны окружающей Среды Поволжья и Средней Азии при выполнении строительно-монтажных работ на нефтяных объектах", Оренбург - 1990. - С.22-24.

27. Первичная продукция и деструкция органического вещества Ириклинского водохранилища на р.Урале //Сб.: Тез. 6 съезда гидробиологов, г. Мурманск. - 1991. - С. 203-205.

28. Характеристика и прогнозирование состояния биоценозов пресноводных экосистем //Ж.: Экология.-N 6. - 1994. - С.82-85. ( Соавт.: О.В.Бухарин, Н.В.Немцева).

29. Функциональная система "лизоцим-антилизоцим" у гидробионтов и ее роль в формировании водных биоценозов //Ж. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1994.- прилож. УШ-1Х.- С. 95-98. (Соавт. Н.В.Немцева).

30. Метод выявления и учета антилизоцимактивных бактерий из воды природных водоемов // Научн. труды ученых Оренбургской академии. Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины .-Т.ХХ IX. - 1994.-С. 88-89.

31. Способ прогнозирования состояния водных биоценозов. // Положительное решение на изобретение N5039988/13, 1994г. (Соавт.: О.В.Бухарин, Н.В.Немцева, Г.П.Алехина).

32.Микробиологический метод диагностики состояния водных биоценозов. // Информационный листок ВВЦ. "Экология-1994". (Соавт.: О.В.Бухарин, Н.В.Немцева, Г.П.Алехина).