Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин"
На правах рукописи
005010923
РОМАНОВА Юлия Романовна
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ИНФЕКЦИОННОСТИ ВИРУСА ГРИППА И ИММУНОГЕННОСТИ ПРОТИВОГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН
03.02.02 - Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
1 МАР Ш
Санкт-Петербург - 2012
005010923
Работа выполнена в Федеральном государственном
бюджетном
учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Компании «AVIR Green Hills Biotechnology», Австрия Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,
академик РАМН Киселев Олег Иванович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор,
академик РАМН Каверин Николай Вениаминович
доктор медицинских наук, профессор,
академик РАМН Ершов Феликс Иванович
доктор биологических наук Харченко Евгений Петрович
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится 20 марта 2012 г. в «7<><у» часов на заседании диссертационного совета Д 001.043.01 при ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. профессора Попова, 15/17)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан _февраля 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 001.04? Л' кандидат медицинских наук
Суховецкая Вера Федотовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Многообразие вирусов гриппа - генетически детерминированный признак. Сегментированная организация генома вируса гриппа, состоящего из (-)РНК, способствует обмену генетической информацией между штаммами при смешанной инфекции за счет реассортации. Отсутствие корректирующей активности у вирусной полимеразы приводит к высокой частоте мутаций в генах вируса гриппа, ответственных за регулярное появление вариантов с новыми антигенными свойствами.
В 1997 году птичий вирус гриппа A(H5N1) инфицировал 18 человек, у 6 из них заболевание завершилось смертельным исходом (Matrosovich et al., 1999). Высокая патогенность этих вирусов и беспрецедентное распространение среди птиц создали опасность возникновения нового пандемического штамма. Эта угроза вызывает необходимость усовершенствования существующих противогриппозных вакцин.
Для предотвращения пандемии вируса A(H5N1) с помощью существующих инактивированных вакцин необходимо сначала определить доминирующий пандемический штамм и затем произвести вакцину в количестве, необходимом для вакцинации всего населения. Инактивированная вакцина не может быть произведена заранее, поскольку в случае несовпадения вакцинного и пандемического штаммов по антигенным свойствам защита не будет эффективной. Следующая сложность связана с патогенностью данного вируса для куриных эмбрионов - основного субстрата для производства современных вакцин.
Суммируя результаты проведенных клинических испытаний с вакцинами против вирусов гриппа сероподтипа H5N1, можно заключить, что инактивированные вакцины (в дозе 15 мкг НА) обладают низкой иммуногенностью. Только двукратная иммунизация с двойным количеством антигена обеспечивала протективный иммунитет. При такой эффективности в случае пандемии потребуется в 4 раза больше вакцины, чем обычно и, следовательно, больше времени для полноценной защиты населения.
Вакцинация живыми вакцинами, в отличие от инактивированных, вызывает более длительную и кросс - протективную защиту (Belshe et al., 2000; Liang et al., 1994; Meitin, Bender, and Small, 1991). Поэтому живые вакцины в случае пандемии позволяют значительно быстрее защитить население. Недостатком является репродукция штаммов в респираторном тракте, которая может вызвать нежелательное распространение вакцинного вируса в популяции людей. Результаты испытаний живых холодоадаптированных вакцин подтипа Н5 противоречивы. Вакцинные кандидаты, полученные на основе донора A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), содержащие поверхностные антигены H5N1 вирусов A/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/213/03 почти не репродуцировались в респираторном тракте привитых и вызывали очень слабый иммунный ответ (Karron et al., 2009). Вакцина, приготовленная на основе донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и низкопатогенного для птиц штамма A/yTKa/Potsdam/86/92 (H5N2), интенсивно реплицировалась в верхних отделах
з
респираторного тракта привитых, но вызывала прирост антител только у 31% вакцинируемых (Desheva et al., 2006; Rudenko et al., 2008). Причины различий до настоящего момента не выяснены.
В данной работе был использован новый подход, основанный на создании аттенуированных штаммов, дефектных по репродукции в ИФН компетентных клетках, за счет удаления белка вируса гриппа NS1 (Egorov et al., 1998). Белок NS1 - один из факторов патогенности вируса, ответственный за подавление врожденного иммунитета хозяина и позволяющий вирусу гриппа успешно реплицироваться на фоне подавленной системы ИФН (Fernandez-Sesma, 2007; Krug et al., 2003). Удаление белка NS1 ведет к абортивной репликации вируса из-за активации широкого круга противовирусных факторов и формирования противовирусного статуса в клетках (Egorov et al., 1998; Ferko et al., 2004; Garcia-Sastre and Biron, 2006). Таким образом, ANSI вирусы индуцируют синтез различных белков, а их антигены презентируются в клетках респираторного тракта аналогично живой вакцине.
Эффективность интраназальной живой вакцины зависит от того, как вакцинный вирус инфицирует клетки верхних дыхательных путей. Важным, но не единственным фактором является рецепторная специфичность НА вируса гриппа. Кроме того, клетки дыхательных путей в ответ на воспаление или раздражение начинают выделять протоны, что приводит к снижению кислотности секрета носовой полости человека (England et al., 1999; Hehar et al., 1999; McShane et al., 2003; Washington et al., 2000). Кислая среда, вызывает необратимое конформационное изменение НА, необходимое для слияния вирусной и эндосомальной мембран (Carr, Chaudhry, and Kim, 1997). Если изменение конформации происходит до попадания вируса в эндосомы, то вирус теряет инфекционность. Поэтому, для преодоления секреторного (мукозного) барьера НА вируса гриппа должен обладать определенной стабильностью к кислой среде. Вирусы гриппа человека и птиц отличаются по чувствительности к кислой среде (Scholtissek, 1985; Skehel and Wiley, 2000). Мы предположили, что низкая инфекционность высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих и, как следствие, низкая эффективность полученных на их основе живых аттенуированных вакцин, обусловлены высоким значением рН активации НА, ответственным за его низкую стабильность.
Цель исследования. Выявление генетических детерминант инфекционности вируса гриппа для млекопитающих и иммуногенности противогриппозных вакцин; поиск путей повышения прививочных свойств кандидатов в вакцинные штаммы живой интраназальной вакцины на модели вирусов, аттенуированных удалением NS1 гена.
Задачи исследования:
1. Получение аттенуированного вакцинного кандидата, содержащего поверхностные антигены высокопатогенного штамма вируса гриппа птиц A(H5N1) путем модификации NS гена методом обратной генетики.
2. Разработка условий культивирования полученного вакцинного кандидата в тканевой культуре Vero.
3. Изучение безвредности, иммуногснности и защитных свойств вакцинного кандидата в доклинических исследованиях на цыплятах, мышах, хорьках и обезьянах.
4. Введение мутации в ген НА высокопатогснного штамма вируса гриппа A(H5N1), снижающей рН конформационного изменения белка НА и получение вакцинного кандидата, содержащего мутантный НА, методом обратной генетики.
5. Изучение свойств вакцинного кандидата, содержащего мутантный НА, ¡n vilro в клеточных культурах и in vivo (инфекционность, иммуногенность и иротсктнвная эффективность) на мышах.
6. Изучение роли мутаций, возникающих в НА вирусов гриппа человека при пассировании в тканевой культуре Vero, на стабильность вирусов и иммуногенность вакцинных кандидатов для хорьков.
7. Поиск путей предотвращения появления адаптационных мутаций за счет изменения условий культивирования вирусов в тканевой культуре Vero.
8. Изучение влияния адаптационных мутаций, снижающих стабильность вирусов, на урожайность и иммуногенность инактивированных противогриппозных вакцин.
Научная новизна работы. В работе впервые показано, что инфекционность и иммуногенность вирусов гриппа для млекопитающих определяются значением рН при котором происходит конформационное изменение основного поверхностного белка вируса гриппа - НА (рН активации). Высокое значение рН активации НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц подтипа H5N1 является причиной их сниженной инфекционностп для млекопитающих. Понижение рН активации Н5 НА путем введения мутации в НА2 субъсднницу приводит к повышению инфекционностп вируса для млекопитающих. Доказано, что мутации, возникающие при адаптации штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах, приводящие к снижению стабильности НА вирусов в кислой среде и ири повышенной температуре, ведут к снижению иммуногенности живых интраназальных вакцин. Предложены условия культивирования штаммов вируса гриппа человека в тканевой культуре, позволяющие предотвратить появление дестабилизирующих адаптационных мутаций. Применение данных условий для культивирования вакцинных штаммов в тканевых культурах ведет к повышению урожайности произведенных из этих штаммов инактивированных противогриппозных вакцин.
Теоретическая значимость проведенных исследований. Полученные результаты имеют фундаментальное значение, поскольку впервые демонстрируют связь между молекулярной генетикой вирусов гриппа и их инфекционноетью и иммуногенностью. Показано, что инфекционность штаммов вируса финна для млекопитающих, а следовательно и эффективность полученных на основе этих штаммов живых вакцин определяется значением рН, при котором происходит конформационное изменение НА вируса гриппа,
ответственное за слияние вирусной и эндосомальной мембран. Продемонстрирован новый механизм аттенуации высокопатогснных штаммов вируса гриппа птиц подтипа H5N1 путем удаления NS1 гена в сочетании с модификацией сайта расщепления НА, который лег в основу создания вакцин нового типа, а именно, живых интраназальных не реплицирующихся в респираторном тракте вакцинируемых. Установлена критическая роль адаптационных мутаций, возникающих в НА при культивировании вирусов в тканевых культурах, приводящих к снижению иммуногенносги вакцинных штаммов живых противогриппозных вакцин.
Практическая значимость работы. Разработан новый метод аттенуации вируса гриппа за счет удаления NS1 белка. Получен иммуногенный вакцинный штамм для живой противогриппозной вакцины подтипа A(H5N1), обладающий кросс - протсктивными свойствами. Результаты доклинических исследований послужили основой для проведения клинических испытаний вакцинного штамма A(H5N1). Разработаны новые условия культивирования в тканевых культурах вирусов гриппа - кандидатов в вакцинные штаммы живых вакцин для интраназального применения, позволяющие предотвратить появление адаптационных дестабилизирующих мутаций в НА и, таким образом, сохранить их высокую инфскционность и иммуногснность. Применение новых условий культивирования при производстве вирусной массы для инактивированных вакцин приводит к повышению эффективности производства.
Положения, выносимые на защиту:
1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок вируса гриппа птиц подтипа H5N1 в комбинации с модификацией сайта расщепления НА -эффективный метод аттенуации высокопатогснных штаммов вируса гриппа.
2. Интраназальная иммунизация ANSI вакцинным кандидатом подтипа H5N1 вызывает кросс-реактивный и протсктивный иммунитет при отсутствии вирусной репродукции.
3. Высокий уровень рН активации НА (5,8 - 6,0) высокопатогснных штаммов вируса гриппа птиц A(H5N1) - фактор низкой инфекционное™ и иммуногснности этих вирусов для млекопитающих.
4. Понижение рН активации НА высокопатогснных штаммов вируса гриппа птиц до уровня вирусов гриппа человека, путем введения мутаций в НА, приводит к повышению их инфекционное™ и иммуногенносги для млекопитающих.
5. Адаптация сезонных штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах при стандартных условиях приводит к появлению дестабилизирующих мутаций в НА. Эти мутации вызывают снижение иммуногсности вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин, полученных на основе адаптированных вирусов.
6. Культивирование вирусов в тканевой культуре при пониженной кислотности среды предотвращает появление адаптационных мутаций в НА вируса гриппа и позволяет улучшить урожайность и иммуногенность производимых но данной технологии вакцинных штаммов для живых и инактивированных вакцин.
Внедрение результатов работы. 1 Jo теме работы получен один международный патент US 7,494,659В2 «Live attenuated influenza vaccine» и подана одна заявка на международный патент US 2010/0172934 Al «Method for production of pH stable enveloped viruses». Методом обратной генетики получен вакцинный штамм, содержащий поверхностные антигены высокопатогенного штамма вируса гриппа подтипа H5N1, апенуированный путем модификации NS гена. Полученные данные создали базу для проведения клинических испытаний ANSI вакцинного кандидата подтипа H5N1 на людях. Предложен новый способ культивирования вирусов в тканевых культурах. Полученные результаты создают базу для внедрения принципиально нового типа вакцины в практику здавоохранения.
Апробация материалов диссертации. Результаты диссертационной работы докладывались на Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Бангкок, 2007), Международной конференции но проблемам птичьего гриппа (Париж, 2007), 6-й и 7-й Международных конференциях „Options for influenza control and prevention" (Торонто, 2007; Гонконг, 2010), Международной конференции „Negative Strand Viruses" (Брюгге, 2010), Конференции ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, 2008), Конференции ВОЗ «Вакцины, вызывающие иммунитет широкого спектра» (Женева, 2011).
Личный вклад автора заключался в определении проблемы, в формулировании цели и задач исследования. Под руководством и с участием автора получены рекомбннантные вирусы, исследованы их свойства in vitro и in vivo. Вес материалы, представленные в диссертационной работе, обобщены и проанализированы автором.
Публикации, lio теме диссертации опубликовано 24 статьи и один научный обзор в журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 международный патент и подана заявка на 1 международный патент.
Объем а структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 33 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, 7 выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 195 источников на русском и английском языках.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
Эпидемические вирусы гриппа человека A/Solomon Island/3/06 (H 1N1 ) (SL/03/06), A/Brisbane/59/07 (H1N1) (BN/59/07), A/Uruguay/716/07 (H3N2) и рсассортант NYMC X-161B (ангигенно аналогичен вирусу A/Wisconsin/67/05, H3N2). Первичные изоляты A/Vienna/25/07 (H3N2) (VI/25/07) (MDCK), A/Vicnna/28/06 (MDCK.), A/Thucringcn/2202/08 H3N2 (MDCK.), А/Санкт-11стсрбург/14/10 HINlv (SP/14/10). Высокопатогенныс H5N1 вирусы гриппа птиц A/Vietnam/1203/04 (A/VN/1203/04) и A/Thailand/01/04 (TH/01/04) и низкопатогенный вирус A/duck/Singaporc/1/97 H5N3 (Dk/Sing/97).
Тканевые культуры Vero и MDCK культивировали в бсссыворогочной срсде Opti-pro (Invitrogcn) и в средс DMEM (Invilrogcn), содержащей 2% сыворотки новорожденного теленка (Invitrogcn), соответственно.
Конструирование вирусов методом обратной генетики. Сегменты НА, NA и M вируса A/VN/1203/04 были синтезированы согласно сиквснсу, опубликованному в GenBank (No. AY818135, AY818141, AY8I8144). Синтезированные ссгмснты были клонированы в бинаправленные плазмиды pHW2006. Аналогичным образом были получены плазмиды, кодирующие остальные гены вируса гриппа. Вирусы получали трансфскцией нлазмид в клетках Vero, используя нуклеофектаминовую технологию. Аналогично были получены 6:2 реассортанты вирусов A/Indoncsia/05/05 и A/Hong Kong/213/03 с функциональным NS1, названные соответственно VN1203, IND05, НК213 и использованные для изучения защищенности на животных. Вирус IND05FA был получен адаптацией IND05 к легким хорьков. Мутация НА2 58К—>1 была введена путем сайт индуцированного мутагенеза (Stratagcnc). Методом обратной генетики также получали вакцинные кандидаты (6:2) сезонных вирусов гриппа A/Vic/28/06 (H3N2) и A/Thu/2202/08 (H3N2).
Патогенность, иммуногеиность и протективная эффективность вирусов для лабораторных животных. Все опыты на животных выполнялись с соблюдением требований Хельсинской декларации. Цыплятам вакцинный штамм VN1203ANS1 вводили в дозе 7,1 log|0 ТЦДя> в объеме 0,2 мл внутривенно (i.v.) или интраназально (i.n.). Птиц наблюдали в течение 14 дней. В орофарингсальных смывах и смывах клоаки наличие вируса проверяли на 3-й день после вакцинации. Для определения иммуногснности и защищенности беспородных мышей иммунизировали i.n. под наркозом одно- или двукратно вирусом VN1203ANS1, взятым в дозе 5,3 log,» ТЦД^, с интервалом в 3 недели. Через три недели после каждой иммунизации собирали сыворотки и анализировали в РТГА и ИФА. Оставшихся животных заражали вирусами VN1203 (3,3 log,о), НК213 (3,2 log,„), IND05 (2,2 log,,,) или dk/Sing/97 (4,2 log,,,). На 3 и 5 день после заражения мышей забивали и определяли наличие вируса в 10% суспензии тканевых гомогенатов. Для определения инфекционное™ беспородных мышей инфицировали i.n. без наркоза вирусом в дозе 4,5; 3,5 или 2,5 logio в объеме 20 мкл. Через 60 ч после заражения животных забивали и
собирали пробы носовой ткани, готовили 10% суспензию и определяли содержание вируса титрованием на Vero клетках. 50%-ную мышиную инфекционную дозу (MID50) подсчитывали методом Kerber, и выражали в ТЦД50 соответствующих 1 МЮ51| (Lorenz and Bogel, 1973). Для гистологической оценки инфекционное™ группы BALB/c мышеи иммунизировали i.п. под наркозом вирусами VN1203ANS1 или VN1203ANS 1-К581 в дозе 6 log,,, ТЦД5« в объеме 50 мкл. Через 12 ч после инфицирования мышей забивали. Из органов респираторного тракта (слизистая носовой полости, трахея и легкие) готовили препараты, фиксированные 7% формалином и парафином. Клетки, инфицированные вирусом гриппа, красили моноклональными антителами против вирусного NP с последующим контрастированием и фотографированием. Для получения носовых секретов мышам вводили 0,1 мг пилокарпина (Sigma). Выделяющийся секрет собирали на пористый носитель и олюировали в 50 мкл стерильного PBS на льду в течение 4 ч. Секреты объединяли и антитела IgA определяли в ИФА. Хорьков (Biolcst, Чешская республика) иммунизировали дважды i.п. вирусом VN1203ANS1 в дозе 7,8 logui ТЦД50 с интервалом в 4 недели. На 3-й день после иммунизации 10 животных из опытной группы и 6 из контрольной забивали, собирали пробы легких, носовой полости, мозга, почек, кишечника, готовили 10% суспензию и анализировали на наличие вируса титрованием на клетках Vero. Антитела в сыворотках определяли методом РТГА и МНТ. Изучение иротсктивной эффетивности вирусов проводили в компании Retroscrccn Virology Ltd., (UK). Хорьков иммунизировали под легкой анестезией i.п. с интервалом в 18 дней вирусом VN1203ANS1, в дозе 8,1 logwTLUko. Через 14 дней после иммунизации животных заражали под наркозом вирусом IND05-FA, в дозе 6,3 loguiTLUbo. Носовые смывы собирали перед иммунизацией, 14 дней после и на 1, 3, 5 и 7 день после заражения. Макакам вирус VN1203ANS1 вводили интраназально иод наркозом в дозе 7,8 logioTLUbu однократно в виде спрея. (Biotest, Чешская Республика). Животных наблюдали на наличие клинических симптомов и взвешивали. Сыворотки крови собирали до иммунизации и через 4 недели после иммунизации. Носовые смывы собирали до и через 2 дня после иммунизации. Наличие вируса в смывах определяли титрованием ТЦД50 на Vero.
Изучение вирусов методом атомно силовой микроскопии проводилось в сотрудничестве с Институтом Физической Химии и Биохимии (Москва, Россия) и Институтом Биофизики (Линц, Австрия).
Статистическая обработка данных. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (М±а). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы с использованием I-теста Стьюдснта или U - теста Mann- Whitney. Различия считались достоверными при р <0,05.
Получение Н51М вакцинного кандидата путем модификации N8 гена и изучение его свойств
Конструирование вакцинного кандидата
Вакцинный кандидат был получен методом обратной генетики трансфскцисй 8 плазмид, кодирующих вес вирусные гены и белки в клетки Vero. Структура плазмид показана на Рис.1. В качестве донора поверхностных антигенов был выбран штамм A/VN/1203/04 (H5N1). Сайт расщепления НА высокопагогснного вируса был модифицирован путем замещения оригинального сайта RERRRKKR/GLF на генетически стабильный TETR/GLF, встречающийся у низко патогенных птичьих вирусов (Horimoto ct al., 2006).
Рис. 1 Карта плазмид, содержащих вирусные фрагменты.
Вирус сконструирован как 5:3 реассортант, в котором гены, кодирующие НА, NA и M белки были заимствованы от A/VN/1203/04, а всс остальные гены от вакцинного штамма IVR- 116. 1VR-116 - вакцинный штамм для инактивированной противогриппозной вакцины, являющийся рсассортантом, содержащим НА и NA гены от вируса гриппа A/New Calcdonia/20/99 (H INI), PB1 ген от A/Texas/1/77 (H3N2), и остальные гены от вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8). Вирус IVR-116 был предварительно адаптирован к росту на клетках Vero, что привело к появлению мутаций в белках: PA (N10S, P275L, D682N), NP (S287N), Ml (А146Т) и М2 (А27Т). Ген NS вируса IVR-116 был модифицирован путем удаления рамки считывания NS1 белка (Рис.2).
В результате, в геном вакцинного кандидата было введено 2 аттснуирующих фактора, а именно: замена фуринового сайта расщепления НА высокопатогенного штамма вируса гриппа п тиц на зависимый от трипсина сайт и делеция гена, кодирующего NS1 белок. Полученный путем трансфскции клеток Vero соответствующими плазмидами вирус был назван VN 1203ANSI.
Ген вируса гриппа
pHW-V-1203-xx
V
NS1 mRNA • •
NEPmRNA •"{K--
Ь 4NS1 ■ I 418 nt
NEP mRNA •-! ~T-a,,. 121 aa
Рис.2 Структура и модификация NS гена
(A) Схематическое изображение NS гена и NS- специфической мР11K вируса дикого типа.
(B) Транефектант ANSI вируса гриппа. Геномный РНК фрагмент (белый сегмент), две некодирующие области (черные сегменты) и NS- специфическая мРПК, включающая юн структуру (черный круг) и поли- Л конец. Темно-серый фрагмент - открытая рамка считывания NS1 белка. Светло- серый сегмент - рамка считывания NHP белка.
Вирус VN1203ANS1 репродуцировался в клетках Vero до титра 8,5 log i с)Т ЦД50/мл, образовывал четкие бляшки в культуре в присутствии трипсина и не образовывал бляшек без трипсина.
Аттенуация, иммуногекность и иротективная эффективность вакцинного кандидата VN1203ANS1 в доклинических испытаниях
В первую очередь была проверена аттенуация вакцинного кандидата на цыплятах. Для этого птиц заражали внутривенно или интраназально (i.v или i.п.) вирусом VN1203ANS1 в дозе 7,1 или 6,8 logniTLLOoo, соответственно. Ни у одной из инфицированных птиц не было выявлено признаков болезни или патологических повреждений. Инфекционный вирус не выделялся из назофарингеальных смывов или смывов клоаки на третий день после i.v. или i.п. иммунизации, подтверждая нерсплицирующийся фенотип в тканях п тиц.
Далее иммуногенность и иротективная эффективность вакцинного кандидата была проверена на мышах. Мышей иммунизировали i.п. однократно вирусом VN1203ANS1 в дозе 5,3 logm ТЦД50. Инфекционный вирус не был обнаружен ни в одном из изученных органов на 2-й день после инфицирования, а именно: в клетках слизистой носовой полости, в легких, мозге и в селезенке. Антитела в крови через 3 недели после иммунизации не определялись в реакции торможения агглютинации (РТГА), однако в иммуноферментном анализе (ИФА) среднегеометрический титр (СГТ) титр lgG антител уже после первой иммунизации составил 2940. После второй иммунизации титр вырос до 17828.
Следующим этапом было изучение протсктивных свойств данного вакцинного штамма. Для заражения вакцинированных животных были использованы 6:2 реассортанты VN1203, НК213, IND05 с функциональным NS1 геном и низкопатогенный для птиц вирус dk/Sing/97 (H5N3). Все вирусы содержали трипсин зависимый сайт расщепления НА и реплицировались в легких контрольных мышей до 4,0-5,0 login ТЦДм/мл. Оказалось, что однократная иммунизация приводила к ускоренной элиминации вируса из легких по сравнению с контролем (р<0.05). На 5-й день после заражения вирус практически отсутствовал в легких большинства животных, независимо от используемого вируса. Двукратная иммунизация приводила к полной защите животных, так как вирус отсутствовал в легких на 3-й и 5-й дни. Таким образом, даже при отсутствии антител, определяемых в РТГА, вакцинный кандидат VN1204ANS1 защищал животных от заражения реплицирующимися Н5 штаммами.
Для получения более детальной информации о безвредности и иммуногенности вакцинного кандидата VN1203ANS1 было проведено изучение прививочных свойств на хорьках, как наиболее адекватной модели для изучения живых противогриппозных вакцин. Сначала была изучена безвредность вакцинного кандидата при i.п. иммунизации в дозе 7,8 logI(, ТЦД5(> дважды с интервалом в 4 недели. У животных не было выявлено потери веса или температурных реакций. Также не было обнаружено вируса в носовых смывах (на 3 день). Вирус отсутствовал в легких, мозге (включая церебрум, мозжечок и мост), кишечнике и почках. Инфекционный вирус был изолирован у 2 из 10 животных (в следовых количествах) только в пробах гомогенатов тканей слизистой носовой полости и представлял остатки введенного вакцинного вируса.
Титры антител у иммунизированных животных были проверены после первой и второй иммунизации в РТГА и МНТ. Учитывая результаты низкой иммуногенности вирусов H5N1 в РТГА у мышей, были модернизированы антигены, используемые в РТГА в соответствии с наблюдением Hoffmann (НоГГтапп et al., 2005). Авторы обнаружили, что замена S на N в положении 223 НА приводила к ослаблению связи с рецептором и, следовательно, к повышению титров в РТГА, поскольку меньшее количество атитсл было достаточно для разрушения этой связи. Эта замена была введена в НА вируса A/VN/1203/04 и методом обратной генетики был получен мутант, который позволил повысить чувствительность РТГА с куриными эритроцитами в 4 раза. Введенная мутация повысила чувствительность теста с вирусом A/VN/1203/04 до уровня, наблюдаемого в реакции с лошадиными эритроцитами (протокол ВОЗ). Введение этой же мутации в НА вируса 1ND05 (H5N1) не имело эффекта, поэтому в этом случае использовали протокол ВОЗ РТГА.
Определение иммунного ответа показало, что однократная иммунизация животных вызвала повышение титров антител в сыворотках хорьков в РТГА с куриными эритроцитами (СГТ= 36) против гомологичного штамма A/VN/1203/04. Повторная иммунизация привела к удвоению титров (СГТ = 84). Антитела к гетсрологичному антигену IND05 отмечались только у половины
¡вотнь ГА I. лошадиными эритроцитами). Более высокие титры антител юлюда. МН1. Статистически достоверное увеличение титров антител в 1НТ отмс после однократной иммунизации к гомологичному (СГТ =
+5) н гетер1 чу (СГТ = 93) антигенам со значительным увеличением
фои поел,- н : иммунизации (СГТ= 1351 и С1Т= 181, соответственно)
ис. 3).
ыла проверена защищенность животных от гичным штаммом. Для этого животных однократно или двукратно вирусом с интервалом в 18 дней, а затем заражали Ы. Измерение антител в крови го сывороточные антитела в РТГА и выявлялись только после двукратной
В 01.4!. ноторной
ИММ\ НИЗИ]
\ ' i 03 W и , сом I цнниров МИТ к гстероло!i иммунизации.
. лом эк инфекцш. |и интр 8,1
'О-
(6,3
IbKOB HOi
'v штамму
А VN :
10
1 Г в ai ■■
¿6 f— ü- 4 N ra (UI ТШБ" D I ■■
° 2 líThilHll
0 1ЦД пик
до 1 доза 2 дозы
С 15- oRBC
f 0-ti— X ? 5 DE D ЕЕ -иш- DE ■
o _J
0 шывш
до 1 ДОЗЭ 2 дозы
Рис.3 Сывороточные антитела
иммунизации
Обратный титр антител в РТГЛ был
IND05
ь 1
¡= 4 _i
0
<© *
<t>
* *t ш С- т т
яо t аозз 2 девы М U0S3 Позы *';ь:вс * 'hkfciC *
15-
t Си
0 J
41 L
ЧЪг
и
á¿
_А_
Mil
к
к
.'лжт
ДО
1 дева
|.|Л-*п^пппп1 ** пп- с ,--------------™Ф антител в МШ был равен
по, р<0.0001 .**р<0.05, Вшёепи-тест
Вирус INП05_ГА не вызывал симптомов заболевания у контрольных хорьков, однако реплицировался в носовой полости животных до титра 3 3 1оц1() I ЦДм/мл на третий день после заражения (Рис. 4).
13 5 7
Дни после инфнцирования
Рис.4 Репликация гегерологичного штамма в респираторном тракте иммунизированных животных
Опыт показал, что всс животные были защищены как после одно- так и двукратной иммунизации. Репродукция штамма Ш005_РА в верхнем отделе респираторного тракта полностью предотвращалась, несмотря на низкие тигры антител в крови мышей. Защищенность животных можно объяснить наличием местных 1«А антител в носовых смывах хорьков. Антитела определялись в носовых смывах 2 из 7 животных после однократной иммунизации и у всех животных после повторного введения вакцинного вируса (Рис.5).
2/7»
550 "
500 -
450 "
400 "
3 350 "
ЕЕ 300 -
< 250 "
О)
200 "
150 -
100 "
50 -
0
8/8а
о
РВБ
—I-1—
до 1 д
ДО
3/8а
аэ
1 Д 2 д
Рис.5 Выявление вирусспсцифических ^А антител в носовых смывах иммунизированных хорьков
Поскольку макаки являю гея адеква тной моделью для изучения патогенеза гриппозной инфекции H5N1, то аттснуацию и иммуногенность штамма VN1203ANS1 проверили на обезьянах macaca mulalla. Взрослых макак иммунизировали i.п. вирусом VN1203ANS1 в дозе 7,8 logm ТЦД3() без наркоза. У животных не наблюдался подъем температуры или респираторные симптомы, что подтвердило безвредность данного штамма для приматов. Титрование носовых смывов, взятых на 2 и 4 дни после иммунизации не выявило инфекционного вируса, подтверждая дефектность репродукции данною штамма в ИФН компетентных системах. Несмотря на отсутствие репродукции, повышенный уровень интерлейкинов IL-lß, IL-2, IL-6. IL-8, IL-4, IL-12p70 и цитокинов ИФНу, TNFa и GM CSF определялся в носовых секретах на 2-й день после вакцинации. Спектр выявленных цитокинов свидетельствует о вовлеченности эпителиальных клеток и клеток иммунной системы аналогично процессам, происходящим у людей при инфицировании эпидемическим вирусом гриппа (Haydcn el al., 1998). Изучение иммуногенности показало, что однократная иммунизация макак вирусом VNI203ANS1 индуцировала выработку гомологичных сывороточных (СГТ=64, РТГА) и нейтрализующих (СГТ = 362, МНТ) антител в крови животных (Рис.6).
oí о
в
СП
о
6 -4 " 2 " О -
10 8 6 4 2 0
■Г1
до 1 доза VN1203
до 1 доза
<т>
до3
1 доза3
IND05
¿J d . л.
до 1 доза VN1203
до 1 доза IND05
Рис.6 Прирост сывороточных антител в крови макак после однократной иммунизации
Титр антител определяли в РТГА или MIIT е VN1203 (куриные эритроциты) или 1ND05 (эритроциты курицы и лошади «а»). *р <0,05 Mann-Whitney U-тест.
Таким образом, вакцинный кандидат VN1203ANS1 оказался иммуногснным для приматов, индуцируя образование гомологичных антител в крови уже после однократной иммунизации. Антитела определялись в крови животных даже через 6 месяцев после иммунизации, при этом титр снижался в 2 раза. Прирост антител против гстерологичного штамма 1ND05 определялся только в РТГА с эритроцитами лошади.
Повышение инфекционности и иммуногенности H5N1 вакцинного кандидата VN1203ANS1
Суммируя результаты доклинических испытаний вакцинного кандидата VN1203ANSI, можно сделать вывод, что штамм H5N1, полученный модификацией NS гена и сайта расщепления НА безвреден для лабораторных животных. Отсутствие репродукции в слизистой носовой полости и других органах было показано на цыплятах и трех видах животных, а именно: мышах, хорьках и макаках. Иммуногенная активность штамма H5N1 уступала иммуногенности сезонных вирусов по данным РТГА. Однако, антитела регулярно выявлялись в МНТ и ИФА. Вакцинный штамм также защищал животных от реинфекции реплицирующимися гомологичным или гетерологичным штаммами. Сниженная иммуногенность в РТГА отмечалась практически для всех вакцин, приготовленных из высокопатогенных штаммов подтипа H5N1. Поэтому важной задачей было выяснение причин этого снижения и поиск путей ее повышения.
Поскольку эпителиальные клетки респираторного тракта человека в ответ на раздражение или воспаление выделяют прогоны (Н ), которые могут привести к закислению в носовой полости до рН 5,2 (Fischer, Widdicombc, and Illck, 2002; Washington et al., 2000), то вирусы должны обладать определенным уровнем стабильности к кислой среде. Мы сравнили инфскционность эпидемических вирусов гриппа человека разных подтипов и высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц A(H5N1) на эпителиальных клетках человека (HNEp) in vitro при различном значении рН среды. Для исследования использовали эпидемические вирусы BN/59/07 (H1N1), Vl/25/07 (H3N2), SP/14/10 (HINlv) и высокопатогенныс птичьи вирусы A/VN/1203/04 (H5N1) и ТН/01/04 (H5N1). Вирусы смешивали с кислым (рН 5,4 и/или 5,6) или нейтральным (рН 7,4) буфером и наносили на монослой HNEp клеток. Инкубировали 30 мин, удаляли инокулят и инкубировали клетки в нейтральной среде 5 ч без трипсина. Эффективность инфекции оценивали окрашиванием NP белка вируса гриппа моноклональными антителами (Рис.7).
Все вирусы гриппа человека BN/59/07 (H1N1), VI/25/07 (H3N2), SP/14/10 (HINlv) заражали HNEp клетки при рН 5,4 - 5,6 почти также эффективно, как и в нейтральной среде. (Рис.7А). Однако, оба штамма H5N1 A/VN/1203/04 и ТН/01/04 эффективно инфицировали клетки человека в нейтральной среде, но теряли инфскционность при закислснии до рН 5,6 (Рис.7В). Аналогичная
зависимость инфекционности вирусов от рН среды наблюдалась для вирусов на клетках Vero.
А рН 5.4 рН 5.6 рН 7.5
BN/59/07 H1N1
VI/25/07 H3N2
SP/14/10 H1N1V
В рН 5.6 рН 7.5
VN1203 H5N1
ТН/01/04 H5N1
Рис. 7 Инфекционность вирусов гриппа человека и птиц на клетках HNEp при различном значении рН
Таким образом, вирусы гриппа человека более устойчивы к кислому рН чем высокопатогенные вирусы гриппа птиц. Для повышения стабильности вируса H5N1 мы решили снизить рН конформационного изменения НА до уровня, известного для вирусов гриппа человека путем введения мутации 58 К—»1 в НА2 субъединицу (Рис.8). Так был сконструирован реассортант VN1203ANS1-K58I, отличающийся от VN1203ANS1 вируса наличием только одной мутации НА2 58К—»1. Дополнительно была сконструирована аналогичная пара вирусов VN1203wtNS и VN1203wtNS-K58I, содержащих полноценный NS сегмент. Для проверки роли введенной мутации, оба реассортанта VN1203ANS1 и VN1203ANS1-K58I были изучены в тесте гемолиза с эритроцитами человека. Оказалось, что исходный реассортант VN1203ANSI вызывал слияние вирусной мембраны с мембраной эритроцитов при значении рН < 5,6, тогда как мутантный вирус VN1203ANS1-K58I при рН < 5,3 (Рис. 9). Необходимо отметить, что мутантный вирус VN1203ANS1-K58I по профилю активации НА был похож на сезонный штамм вируса гриппа человека SL/03/06 (H1N1).
Рис.8 Положение мутации НА2 K58I на трехмерной структуре НА
Сравнение стабильности обоих вирусов при повышенной температуре показало, что вирус VN1203ANSI терял более 2 logi0Tim50Awi инфекционной активности уже при 50°С, тогда как аналогичная обработка не изменяла инфекционную активность мутантного вируса. Инкубирование при 52°С приводило к полной потере инфекционной активности вируса VN1203ANS1 и к снижению активности мутантного вируса VN1203ANS1-K58I на 1,0 logio/мл.
Мутантный вирус VN1203ANS1-K58I оказался также более стабилен к кислой среде, инфицируя Vero клетки при рН 5,6, тогда как для вируса VN1203ANS1 предел инфицирования был отмечен при рН 5,8 (Рис.ЮА). Эти данные были подтверждены на MDCK клетках в аналогичном опыте. Инфицированные клетки MDCK подсчитывали методом проточной цитометрии (Рис.10В). Для сравнения вирус гриппа человека BN/59/07 (H1N1) был инфекционен на клетках Vero при рН 5,4 и инфицировал 32% клеток MDCK даже при рН 5,2 (Рис. ЮС). Таким образом, путем замены одной аминокислоты в НА2 вакцинного кандидата H5N1 нам удалось повысить его инфекционность в кислой среде. Необходимо отметить, что вирус VN1203ANS1-K58I оставался несколько менее стабилен, чем вирус гриппа человека.
в 7.5
со i 76.3%
■а
. ft
о 2 1 В
£ 1 Bi
>
Z hL 66.5%
< 5 i ц
8 * к
5 1 ■и, ; J1
>
с 7.5
L к
49.3
%
I к
{
i
5.8 5.6
LT IT U" L L
Рис. 10 Зависимость инфекционности вирусов в клетках Vero и MDCK. от рН
Вирусы гриппа птиц, в отличие от штаммов вируса гриппа человека, более резистентны к ингибиции закисления эндосом лизосомотропными агентами (хлоракин или NH4C1) (Di Trani et al., 2007). Поэтому мы сравнили инфекционность VN1203ANS1 и VN1203ANS1-K58] вирусов в присутствии данных реагентов (Рис. 11). В качестве контроля был использован сезонный штамм вируса гриппа BN/59/07 (H1N1). Оказалось, что инфекция клеток Vero вирусом VN1203ANS1-K58I в присутствии 10 мкМ хлоракина была снижена и полностью подавлялась при использовании этого реагента в концентрации 50 мкМ. Однако, рост исходного штамма лишь незначительно снижался при добавлении 50 мкМ хлоракина. Вирус BN/59/07 (H1N1) был наиболее чувствителен к хлоракину, так как его инфекционность существенно снижалась уже при использовании 1 мкМ хлоракина. Эти результаты были подтверждены также при использовании 1 мМ NH4CI.
Рис. 11 Чувствительность вирусов к лизосомотронным агентам
Таким образом, введение мутации НА2 58К—>1 повысило стабильность вируса к кислой среде и повышенной температуре и понизило чувствительность к лизосомотроптым агентам. То есть фенотип вируса стал более похож на фенотип вирусов гриппа человека.
Оценку влияния стабильности НА на репродукционную активность вирусов в тканевых культурах проводили на парс вирусов VN1203wlNS и VN1203wtNS-K58I, содержащих полноценный NS1 белок. Стабильность этих вирусов в кислой среде и при повышенной температуре была идентичной ANSI вирусам. Кривые роста в клетках Vero, MDCK, А549 (карцинома легких) и НВЕ показали, что мутация 58К—>1 снизила репродукционную активность вируса VN 1203vvtNS-K581 в клетках НВЕ приблизительно в 150 раз по сравнению с вирусом VN1203wlNS. Аналогичная тенденция наблюдалась на клетках Vero, MDCK и А549, хотя разница не была статистически достоверной. Таким образом, введение мутации, снижающей значение рН активации вирусного НА может снижать эффективность роста вирусов в тканевых культурах.
Для оценки роли полученных in vitro наблюдений для интраназальной иммунизации in vivo мы сравнили инфекционность вирусов VN1203\vtNS и VN 1203vvlNS-K581 но минимальной дозе, вызывающей репродукцию в верхних дыхательных путях мышей (MlDjH). Мышей иммунизировали i.п. в дозе от 2,5 до 4,5 1оцк)ТЦДд). Через 60 ч после заражения собирали пробы из верхних дыхательных путей и определяли в них наличие инфекционного вируса титрованием на Vero. Результаты показали, что MID;« для мутантного вируса VN 1203wlNS-K58l (MIDÍ0 2,9 logm) была в 25-раз ниже дозы, полученной для вируса без мутации VN1203wtNS (MID51) 4,3 logm) (Рис.12).
Для сравнения инфекционное™ вирусов в пределах одного цикла репродукции мышей инфицировали вакцинными кандидатами VN1203ANS1 и VN1203ANS1, дефектными по репродукции в ИФН компетентных клетках (6,0 logm ТЦД511). Качественную оценку инфекционное™ проводили сравнением числа очагов инфекции в слизистой носа, трахее и легких методом иммуногистохимии, окрашивая NP белок моноклональными антителами.
■ УМ1203ЛМ31
4.5
5/6 О УМ1203ДЫ51-К58|
4.0
4.5 3.5 2.5
Доза заражения [1оЗю ТЦД 50/мышь]
Рис.12 Сравнительная оценка инфекционное™ (МЮЯ) вирусов в верхнем отделе респираторного тракта мышей
Цифрами укачано число инфицированных животных/общее число зараженных животных. Вертикальные линии представляют стандартное отклонение.
Оказалось, что мутантый вирус УЫ1203ДЫБ 1-К.581 приводил к значительно большему количеству очагов во всех анализируемых тканях. (Рис. 13). Таким образом, введение мутации К.581, ведущее к повышению стабильности НА вакцинного кандидата УЫ1203ДН81 сероподтииа Н5Ы1, приводило к повышению инфекционности вируса в респираторном тракте мышей. Далее мы проверили, вызывает ли мутантный вирус УК 1203Д№1-К.581 образование более высоких титров антител.
Оказалось, что однократная ¡.п. иммунизация мышей вирусом УГ\11203Д1М81 вызывала выработку антител с СГТ= 6,3, тогда как титр антител при введении мутантного вируса УЫ1203ДЫ81-К581 был равен 25,4 (Рис.14А). Более высокие титры антител были выявлены также в МНТ после иммунизации мутантным вирусом УМ1203Д!ч181-К581 (С1Т = 57) по сравнению с исходным вирусом УМ1203Д^1 (СГТ = 27,9) (Рис. 14В). Более высокая иммуногенность вируса УЖ203Д1М81-К.581 (СГТ = 8127 но сравнению с СГТ = 3225) была показана также методом ИФА (Рис.14С). Мутантный вирус вызывал в 4 раза больше специфических противогриппозных секреторных антител ^А в пуле носовых смывов животных (Рис. 140) (* р < 0,05 ,1-81ис1сЩ тест).
Таким образом, однократная иммунизация мышей вирусом УЫ1203ДК51-К581, содержащим НА улучшенной стабильности, приводила к существенному повышению системного и секреторного антительного иммунного ответа.
Нос Трахея Легкие
Рис. 13 Инфекционность вирусов в респираторном тракте мышей по данным иммуногистохимии
14 13 12
гч
та
5 11 о
я ,0
л
А.АА.
л
г * к
\
• ••
УЖ203дМ51 \fN120aiNS1-K581
УМ1203ДМ31 УМ 203ДМ51-К581
Рис.14 Иммунотенность вирусов после однократной иммунизации мышей
\/Н12034 N31 УМ12034М81-К58!
Повышение стабильности НА высокопатогенного вируса гриппа птиц Н5Ш за счет снижения значения рН активации НА до уровня вирусов гриппа человека
приводит к повышению инфекционное™ в респираторном тракте млекопитающих и иммуногенности при i.n. введении.
Стабильность НА как фактор иммуногенности сезонных живых противогриппозных вакцин
При адаптации вирусов гриппа человека к росту в тканевых культурах возникают мутации, приводящие к повышению рН активации НА. Представлял интерес вопрос, как влияют эти мутации на инфекционность вирусов и на иммуногенность живых вакцин. Поэтому, на модели вакцинных кандидатов с удаленным NS1 белком мы изучили роль адаптационных Vero мутаций в иммуногенности штаммов.
Получение ANSI вакцинных кандидатов сероподтипа H3N2
Для получения вакцинных кандидатов НА и NA гены H3N2 первичных изолятов A/Vie/28/06 и A/Thii/2202/08 секвенировали, клонировали в плазмиды и трансфицировали в клетки Vero вместе с плазмидами, кодирующими все остальные гены вируса IVR-116. Ген NS1 белка был удален. Полученные вирусы VieA и ThuA пассировали в Vero клетках. Сравнение сиквенсов генов адаптированных и исходных вирусов выявило мутации в гене НА (Табл.1).
Табл.1 Свойства исходных эпидемических вирусов и реассортантов.
Происхождение НА и NA Вирус Мутации" рН инфекци-онностиь рН активации с Темп, стабильно
Исх. вирус - 5,4 5,8 65°С
A/Vie/28/06 VieA - 5,4 5,8 65°С
VieA-G75R НА2 G75R 5,8 6,2 60°С
Исх. вирус - 5,4 5,8 65°С
A/Thu/2202/08 ThuA - 5,6 5,8 65°С
ThuA-L194P HAÏ L194P 5,8 6,3 60°С
а Аминокислотные замены в НА; Самое низкое значение рН инфицирования клеток;с Самое высокое значение рН, вызывающее гемолиз эритроцитов; й Самая низкая температура, ингибирующая НА активность
Реассортант вируса А/У1е/28/06 содержал мутацию 07511 в субъединице НА2 и был назван У1еД-075Я. Эта мутация находится в районе взаимодействия двух спиралей стебля НА, и потенциально может влиять на стабильность НА
тримера (Ви11о1^11 й а1., 1994; На е1 а1., 2002). В реассортанте Т1шЛ появилась мутация в НА1 субъединице Ы94Р, и поэтому вирус был назван ТЬиД-Ы94Р. Данная мутация является частью рецептор - связывающего сайта НА и может влиять на антигенные и иммуногенные свойства вирусов гриппа. На Рис.15 показано положение мутаций на трехмерной структуре НА. В ЫА обоих вирусов мутаций обнаружено не было.
Рис. 15 Положение мутаций, возникших при адаптации, на трехмерной структуре НА
Влияние адаптационных мутаций в НА на стабильность вакцинных кандидатов подтипа НЗШ
НА вируса гриппа человека претерпевает конформационное изменение, вызывающее слияние эндосомаяьной и вирусной мембран при рН 5,1 - 5,4. Обнаруженные мутации 075Л и Ы94Р потенциально могут изменить это значение рН. Поэтому, мы сравнили значения рН активации НА для первичных изолятов А/\^е/28/06 и АЛЪи/2202/08 и полученных на их основе реаесортантов УшА-С}75Я и ТЬцД-1Л94Р. Оказалось, что мутации 075К и 1Л94Р привели к повышению рН активации НА вирусов У]еД-075К. и ТЬиД-Ы94Р на 0,4 и 0,5 единиц, соответственно (Рис. 16). Далее мы сравнили устойчивость вирусов при нагревании. Вирусы инкубировали при температуре
НА1 1194Р
от 35°С ло 70°С в течение 30 мин, и измеряли изменение НА тигра. Оказалось, что оба первичных изолята после инкубирования при 60°С сохраняли НА активность, тогда как рсассортанты, содержащие мутантный НА. почти полностью теряли НА активность уже при температуре 55°С (Табл.1).
рНМ рН 5.6 рН S.8 рНб.О рНб.г |>Н6.-« рН 7.5
A V&nn.z шт % ш m II ■ m
Viçù
■ *• Í кя 11 m m lu
S,"'" ф % m 1H
A'Thueringeft' ■ H НН IS ■ m « m
BSËfl я II ■ КЗ |j¡ II
1 Thu.>U94P -г Щ il ■
Рис. 16 Сравнение рН активации НА первичных изолятов и полученных на их основе рсассортантов
Клетки Vero инфицировали при moi 2 соответствующими вирусами. Добавляли эритроциты, меченные реагентом R18, которые адсорбировались на жспрессированпый на поверхности ИЛ. Клетки обрабатывали буферами с указанным pli. Слияние мембран вируса и эритроцитов приводило к проникновению R18 в клетку. Результат оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа.
Затем сравнили инфскционность вирусов в тканевой культуре Vero в кислой среде (Рис.17А). Эксперимент показал, что оба первичных изолята инфицировали клетки в кислой срсдс до рН 5,4. тогда как оба рсассортанта VieA-G75R и ThuA-L194P были инфекционны только при рН >5,8.
Суммируя полученные данные, можно заключить, что мутации НА2 G75R и HAÏ L194P, возникшие в результате адаптации, снизили устойчивость НА к кислой срсдс и повышенной температуре, а значит снизили и общую стабильность вирусов. Интересно отметить, что первичные изоляты проявили более высокую инфскционность при рН 5,6-5,8 . чем при нейтральном рН 7,5 (Рис.17). Это наблюдение позволило предположить, что стандартные условия культивирования вирусов на Vero при нейтральном рН не являются
оптимальными для роста НЗЫ2 вирусов. Поэтому далее была предпринята попытка культивирования вирусов при пониженном рН среды.
A/Vienna/ 28/06
VieJi
Viea-G75R
AThueringen/ 2202/08
ThuA
ThuA-Lt94P
Рис. 17 Инфскционность вирусов при пониженном рН на клетках Vero
Пассирование H3N2 вакцинных кандидатов в тканевой культуре Vero при
пониженном рН среды
Рсассортанты VicA и ThuA, полученные сразу после трансфекции, пассировали только в условиях пониженного рН. Для этого инфицирование клеток проводили в буфере с рН 5,6, а последующее культивирование вируса при рН среды 6,5. Полученные таким образом рсассортанты сравнили с первичными изолятами A/Vie/28/06 A/Thu/2202/08 но первичному сиквенсу НА, антигенным свойствам, рН активации НА, а также инфекционности в кислой среде и стабильности при повышенной температуре. Результаты сравнения представлены в Табл.1. Оказалось, что данный метод пассирования позволил избежать появления мутаций в НА обоих реассортантов. Сравнение антигенных свойств первичных изолятов с соответствующими реассортан гами в реакции с постинфекционными сыворотками хорьков не выявило между вирусами антигенных различий. Кроме того, рсассортанты VicA и ThuA сохранили термо- и рН стабильность соответствующих первичных изолятов. Рсассортанты ThuA и VieA проявили почти такую же инфекционность на ]-
клетках Vero как и эпидемические вирусы А/Т1ш/2202/08 и A/Vie/28/06 при рН > 5,4 (Рис.17).
Таким образом, селективное давление в виде пониженного рН среды при культивировании вирусов в клетках Vero предотвратило появление адаптационных мутаций в НА и сохранило стабильный фенотип вирусов, характерный для первичных изолятов.
Дестабилизирующие мутации в НА H3N2 вакцинных кандидатов снижают нммуногенность вирусов для хорьков
Для проверки влияния мутаций, снижающих стабильность вирусов, на нммуногенность вакцинных кандидатов группы из 5 хорьков иммунизировали i.п. парами вирусов VicA или VicA-G75R и ThuA пли ThuA-LI94P в дозе 6.0 logmTLUkn. Иммунизация не вызвала у животных никаких клинических симптомов заболевания, что подтвердило аттснуированность данных штаммов. Кроме того, в носовых смывах на 1, 3 и 5-й день после иммунизации вирус не был обнаружен, что подтвердило нсрсплицируюшийся фенотип ANSI вакцинных кандидатов. Сыворотки крови собирали до и на 28-й день после иммунизации и определяли в них антитела в РТГА и МНТ. Оказалось, что иммунизация вирусом VicA, содержащим исходный НА приводила у 100% животных к индукции антител со СГТ равным 121 в РТГА и 588 в МНТ (Рис.18А, В). Иммунизация мутантным вариантом V¡cA-G75R вызывала значительно более низкие СГ"Т, а именно, 28 в РТГА и 76 в МНТ. Эта же закономерность была отмечена и для второй пары вирусов ThuA и ThnA-L194P (Рис.18 С, D). В фуппе хорьков, иммунизированных вирусом ThuA прирост антител был отмечен у 4 из 5 животных со СГТ антител 56 в РТГА и 256 в МНТ. Однако, ни одно из животных не ответило на иммунизацию вирусом ThuA-L194P по данным РТГА и МНТ.
Таким образом, вакцинные кандидаты, содержащие НА, идентичный по сиквснсу первичным изолятам и определяющий стабильный фенотип, оказались более иммуногенны для хорьков при i.п. иммунизации. Пассирование вирусов в закисленной срсдс позволило предотвратить появление адаптационных мутаций в НА.
А 12-1
10-
о
1— «-
а
4-
2-
*
-I-1—<ж
рт рг*
VI «4 VI»
12-1
10-
О)' о •-
О. I-
»—т-
ргш " рг.
ТЬий ть
10
6) I-
_о £
•в
4) 12 10'
о) »■ о
£
2
\П»а
Тг
ргв-др
рОЙ-ПОСЛв
|Г» рой
ЛСТбЙ
-1-1—
ргш рок
ТИиД-ИМР
Рис. 18 Иммунный ответу 1 ориюнталышя линия соотвстств'. Влияние стабильное!
юле однократной иммунизации * р < 0.05.
на урожайность инактмвированных про, снриннозных вакцин
Полученные результаты позволяют заключить, что стабильность молекулы НА определяемая первичной структурой гена, оказывает прямое действие на инфскционность и иммуногснность вакцинных штаммов для живой противогриппозной вакцины. Большинство производимых в мире в настоящее время противогриппозных препаратов - ««активированные вакцины культивируемые на куриных эмбрионах. Выделяемые от больных гриппом вирусы часто не обладают параметрами роста в куриных эмбрионах удовлетворяющими требованиям производителей вакцин. Например, вирусы сероподтипа Н3№ иногда совсем не растут в куриных эмбрионах. Пол ому для производства вируссодсржащей массы часто используют адаптированные мутантные вирусы. Представлял интерес вопрос, связаны ли мутации появляющиеся при адаптации к росту в куриных эмбрионах, с потерей с.аоильности НА и влияют ли они на качество производимых из этих вирусов инактивированных вакцин?
Стабильность вирусов, рекомендованных ВОЗ для производства вакцин
В 2008 г вирус A/Brisbanc/10/07 H3N2 (BN/10/07) был рекомендован для производства вакцины. Однако, урожай этого вируса в куриных эмбрионах был достаточно низким для производства. Поэтому был выбран штамм A/Uruguay/716/07 (UR/716/07), полученный путем изоляции на первичных клетках почки цыпленка и растущий значительно лучше в куриных эмбрионах. При сравнении сиквснса НА вирусов BN/10/07 и UR/716/07 была выявлена одна аминокислотная замена в позиции НА1 138 A—>S. Сравнение сиквснсов гена НА вирусов UR/716/07, BN/10/07 и IVR147 (реассортант BN/10/07 с вирусом PR8) с сиквснсом НА первичных изолятов этой же антигенной разновидности, но не имеющих адаптационных мутаций, показал, что клинические изоляты отличаются от всех рекомендованных вирусов но позиции НА1 194L. У адаптированных вирусов в этом положении находится 194Р. Согласно нашим данным и данным литературы, замена в положении 194 L—>Р приводит к снижению стабильности вирусов и их иммуногснности при интраназальном введении хорькам. Поэтому вирусы UR/716/07. BN/10/07 и 1VR147 сравнили с первичными изолятами А/Нижний Новгород/668/08 (NN/668/08) и А/Астрахань/10/07 (АН/10/07) но параметрам рН активации НА, стабильности к повышенной температуре и кислой среде. Вирусы NN/668/08 и АН/10/07 были выделены на MDCK. и прошли ограниченное число пассажей на Vero. Сиквснс НА этих вирусов был идентичен сиквснсу НА в клиническом материале.
Сравнение рН активации НА вирусов методом гемолиза показало, что значение было наименьшим (рН < 5,6) для первичных изолятов NN/668/08 и АН/10/07. Для BN/10/07 оно было < 5,8. а для вирусов UR/716/07 и IVR147 повысилось до < 6,1 (Рис. 19).
Аналогичные результаты были получены при сравнении инфекционное™ вирусов в тканевой культуре в кислой среде (Рис. 20).
bn/10/07
ur/716/07
ur/716/07 acidic
ivr147
ан/10/07
NN/668/08
Рис.20 Инфекционность вирусов при пониженном рН на клетках Vero
Вирусы NN/668/08 и АН/10/07 были инфекционны при рН >5,6 и рН >5,4 соответственно, тогда как 1VRI47 и UR/716/07 оказались инфекционны только при рН>6,1. Вирус BN/10/07 занимал промежуточное положение, сохраняя инфекционност ь при рН >5,8.
Результаты изучения стабильности вирусов при повышенной температуре подтвердили данные стабильности в кислой среде. Так, оба первичных изолята NN/668/08 и АН/10/07 теряли НА активность при температуре на 5°С выше, чем вирус BN/10/07 и 10°С выше, чем вирусы UR/716/07 и 1VR147.
Повышение стабильности вируса, путем пассирования в клетках с пониженным рН среды
Учитывая полученные ранее результаты, была предпринята попытка повысить стабильность вируса UR/716/07 пассированием в закисленной среде (рН 6,5). Параллельно вирус UR/716/07 пассировали в нейтральной среде. После нескольких пассажей сравнили параметры стабильности обоих вариантов (Табл.2). Оказалось, что вирус UR/716/07_neulral, пассированный в нейтральной среде, не изменил фенотин и не приобрел дополнительных мутаций и был идентичен вирусу UR/716/07. Однако, после 10 пассажей в кислой среде вирус, названный UR/716/07_acid, приобрел 2 мутации в НА. Первая замена 194Р —>L в НА1 субединицс, представляет первостепенный интерес, поскольку L в позиции 194 была обнаружена у первичных изолятов. Поэтому эта мутация может рассма триваться, как реверсия в дикий тип. Вторая
рН 6.1 рН 6.0 рН 5.8 рН 5.6 рН 5.4 рН 5.2
мутация произошла в НА2 еубъсдинице в положении 45 I —» Т. Известно, что мутации в этой области НА могут влиять на стабильность.
Изучение свойств полученного вируса показало, что UR/716/07_acid характеризовался более низкой рН активацией НА, повышенной стабильностью при инфицировании в кислой среде (рН >5.6) и более высокой устойчивост ью к повышенной температуре, чем исходный штамм UR/716/07 (Табл.2).
Табл. 2: Свойства вирусов с различной историей пассажей на клетках Vero
Мутации рн рН Теми.
Вирусы НА1 НА2 инфекци- актива- стабиль-
53 138 173 194 45 онное™11 ции НАЬ ность НА1
BN/10/07 D А К Р 1 5,8 6,0 60°С
UR/716/07 D S К Р 1 6.1 6.3 55°С
UR/716/07_acid D S К L Т 5.6 5.6 65°С
IVR-147 D А К. Р I 6.1 6,2 55°С
АН/10/07 D А к. L 1 5.4 5.6 65°С
NN/668/08 N Л N L 1 5,6 5.8 65°С
'' Нижняя граница рП. нри которой происходи!' инфицирование клеток ь Верхняя граница рП. вызывающая активацию НА 1 Нижняя граница температуры, нри которой вирус теряет НА активность
Для изучения влияния стабильности НА на качество препарата инактивированной вакцины были произведены две серии из соответственно более и менее стабильного вирусов в 32 л ферментерах. Обе серии были очищены методом градиентного центрифугирования в сахарозе и инактивированы формальдегидом. Полученные препараты сравнили по ряду параметров, котролирусмых для инакгивированных вакцин (Табл.3).
Табл.3 Сравнение вакцинных препаратов, полученных при разных условиях
культивирования
Препарат вируса Параметры
SRD / общий белок Vero белок / SRD НА [мкг /мл] Общий белок [мкг/мл] НА/ общий белок
UR/716/07 acid 1,44 0.05 122 319 0.38
UR/716/07 neutral 0.48 0.06 134 327 0.41
Оказалось, что главный параметр инактивированых вакцин -урожайность, измеряемая в гесте радиальной иммунодиффузии (SRD) оказалась в три раза выше для вируса UR07_acid при сравнении с вирусом UR/716/07 neutral. Для остальных параметров, включающих общий белок и белок Vero клеток не было выявлено статист ически достоверных различий.
Оба препарата были проверены на способность индуцировать антитела при парентеральном введении мышам. Вводимые вирусы были уравнены по параметру SRD и разведены до соответствующих концентраций НА (от 4,75 мкг до 30 нг). Результат показал, что оба препарата оказались в одинаковой степени иммуногенны для мышей с небольшим преимуществом UR07_acid достоверным при использовании дозы 0,95 мкг НА (Рис.21).
Рис.21 Иммуногенность препаратов UR07_acid и UR07_nculral для мышей
Таким образом, культивирование вируса в тканевой культуре Vero в среде с пониженным рН позволило получить более стабильный вирус. Производство более стабильною вируса в фермен тере при стандартных условиях привело к получению в 3 раза большего урожая НА, чем производство менее стабильного вируса. В конечном счете модификация условий культивирования вируса привела к увеличению в три раза числа произведенных доз препарата инактивированной вакцины.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методом обратной генетики сконструирован реассортантный вакцинный кандидат для интраназальной иммунизации, содержащий поверхностные антигены высоковирулснтного птичьего вируса гриппа A/Victnam/1203/04 (H5N1) и остальные гены от лабораторного штамма 1VR-116. Аттенуация
реассортанта достигалась за счст удаления иолиосновного сайта расшспления НА и рамки считывания белка NS1. Полученный вакцинный кандидат, названный VN1203ANS1, был безвреден для цыплят и лабораторных животных (мыши, хорьки, макаки)- В отличие от штаммов холодоадаш ированных вакцин, вирус VN1203ANS1 не реплицировался в респираторном тракте прпвпвитых животных, но при этом индуцировал выработку секреторных и сывороточных антнтсл и защищал животных от инфекции. Однако, даже при использовании высокой иммунизирующей дозы, иммуногснность ANSI H5N1 вакцинного кандидата уступала иммуногенности аналогичных штаммов сезонных вирусов гриппа.
Сравнение вирусов гриппа птиц и человека показало, что высоконатогснныс птичьи вирусы отличаются от человеческих по способности инфицировать -эпителиальные клетки человека в кислой среде. Эти различия обусловлены разными значениями рН активации НА. Поскольку клетки слизистой секрстируют протоны в ответ на раздражение или воспаление, то была сформулирована гипотеза об определяющей роли значения рН активации НА в ограничении инфекционное™ высокопатогснных птичьих вирусов гриппа ссроподтииа H5N1 для млекопитающих. Для доказательства данной гипотезы в НА H5N1 вакцинного кандидата была введена точечная мутация К581, снижающая рН активации НА и повышающая cí o кислотную и температурную резистентность. Оказалось, что данная мутация также повысила инфекционность рсассортанта in vivo, а именно, увеличила число очагов инфекции в различных отделах респираторного тракта мышей и привела к достоверно более высоким титрам секреторных и сывороточных антител. Таким образом, впервые показано, что низкая инфекционность высокопатогснных штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих и низкая иммуногснность полученных на их основе живых вакцин определяется высоким значением рН активации НА высоковирулентных вирусов гриппа птиц.
Кроме тою, мы установили, что мутации, возникающие в НА при культивировании вирусов гриппа человека в тканевых культурах, также приводят к повышению значения рН активации НА и, следовательно, к снижению стабильности вирусов и иммуногенности полученных на их основе штаммов живых интраназальных вакцин. Был предложен новый способ культивирования вирусов гриппа человека в тканевых культурах, а именно в среде с пониженной кислотностью, который позволил предотвратить возникновение дестабилизирующих мутаций. Применение предложенной технологии для производства препарата тканевой инактивированной противогриппозной вакцины позволило повысить эффективность производства в 3 раза.
Таким образом, значение рН активации НА является фактором, критически влияющим на инфекционность вируса гриппа для млекопитающих и иммуногснность вакцинных штаммов живых и инактивированных противогриппозных препаратов.
выводы
1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок в сочетании с модификацией сайта расщепления НА и реассортацией генов, кодирующих внутренние белки, приводит к аттенуации высокопатогенного вируса гриппа птиц подтипа H5N1 и позволяет создать вакцинный кандидат, аттснуированный для лабораторных животных при интраназальном введении.
2. Инграназальное введение H5N1 ANSI вакцинного кандидата не вызывает побочных реакций у цыплят, хорьков и макак и не сопровождается репликацией вируса в респираторном тракте и других органах лабораторных животных, подтверждая нерсплицирующийся фенотип вируса в интерферон компетентных клетках.
3. Интраназальная иммунизация H5N1 ANSI вакцинным кандидатом индуцирует нейтрализующие и секреторные антитела, вызывая кросс-реактивный в пределах подтипа протективный иммунитет, показанный на трех моделях лабораторных животных.
4. Введение мутации К58! в НА2 субьединицу Н5 НА снижает рН активации НА и повышает устойчивость вакцинного кандидата к повышенной температуре и кислой среде.
5. Введение мутации K58I в НА2 субьединицу НА H5N1 вакцинного кандидата обусловливает его более высокую инфекционность в респираторном тракте млекопитающих, повышающую иммуногенность вируса при интраназальном введении.
6. Адаптация вирусов гриппа человека к росту в тканевых культурах приводит" к появлению дестабилизирующих мутаций в НА (L194P; G75I), приводящих к снижению иммуногенности вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин.
7. Культивирование вирусов в тканевых культурах при пониженном рН среды предотвращает появление дестабилизирующих мутаций в НА и позволяет повысить иммуногснность вакцинных кандидатов живых вакцин и урожайность штаммов, используемых для производства инактивированных противогриппозных вакцин.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Патенты
1. US 2010/0172934 Al Method for production ofpH stable enveloped viruses. Krcnn В., Wolschck M., Romanova J.. Egorov A., Nakowilsch S. (Заявка подана)
2. US 7,494,659B2 Live attenuated influenza vaccine. Katingcr H„ Egorov A., Fcrko В., Romanova J„ Katinger D.
Научные обзоры
Romanova J. The fight against new types of influenza virus. Biotechnol J. 2006; l(12):1381-92.
Статьи в реферируемых журналах
1. Romanova. J. R„ T. A. Ermachcnko, G. 1. Alcxandrova, and G. A. Tannock. Interference between cold-adapted (ca) influenza A and В vaccine réassortants or between ca réassortants and wild-type strains in eggs and mice. Vaccine., 1994; 12:23-27.
2. Tannock, G. A., J. R. Romanova, and J. A. Paul. The immunogcnicity of réassortants of the cold-adapted influenza A master strain A/Ann Arbor/6/60 is determined by both the genes for cold- adaptation and the hacmagglutinin gene. Arch Virol., 1995; ¡40:201-209.
3. Romanova, J. R„ G. A. Tannock, and G. I. Alcxandrova. Protective responses in mice to vaccination with multiply administered cold-adapted influenza vaccine réassortants and wild-type viruses. Vaccine., 1997; 15:653-658.
4. Fcrko, В., D. Katingcr, A. Grassaucr, A. Egorov, J. Romanova, В. Nicblcr, H. Katinger, and T. Muster. Chimeric influenza virus replicating predominantly in the murine upper respiratory tract induces local immune responses against human immunodeficiency virus type 1 in the genital tract. J Infect Dis., 1998; 178:1359-1368.
5. Egorov, A., S. Brandt, S. Scrcinig, J. Romanova. В. Fcrko, D. Katingcr, A. Grassaucr, G. Alcxandrova, H. Katingcr, and T. Muster. Transfcctant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vera cells. J Virol., 1998; 72:6437-6441.
6. Grassaucr, A., A. Y. Egorov, B. Fcrko, 1. Romanova, H. Katingcr, and T. Muster. A host restriction-based selection system for influenza hacmagglutinin transfcctant viruses. J. Gen Virol., 1998; 79:1405-1409.
7. Fcrko B, Stasakova J, Scrcinig S, Romanova J. Katingcr D, Nicblcr B, Katingcr H, Egorov A. Hyperattcnuatcd recombinant influenza A virus
nonstructural - protein - encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in micc. J Virol., 2001; 75( 19): 8899-908.
8. Romanova J, Katinger D, Fcrko B, Voglaucr R, Mochalova L, Bovin N, Lim W, Kalinger H, Egorov A. Distinct host range of influenza H3N2 virus isolates in Vera and MDCK cells is determined by cell specific glycosylation pattern. Virology., 2003; 307(1): 90-7.
9. Mochalova L, Gambaryan A, Romanova J, Tuzikov A, Chinarcv A, Kalinger D, Katinger H, Egorov A, Bovin N. Receptor-binding properties of modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken cmbryonatcd eggs. Virology., 2003; 313(2): 473-80.
10. Katinger D, Romanova J, Fcrko B, Fekctc H, Egorov A. Effect of a single mutation in neuraminidase on the properties of Influenza B virus isolates. Arch Virol., 2004; 149(1): 173-81.
U.KiUel C, Screinig S, Fcrko B, Stasakova J, Romanova J, Wolkerstorfcr A, Katinger H, Egorov A. Rcscue of influenza virus expressing GFP from (he NSI reading frame. Virology., 2004; 324(1): 67-73.
12.Romanova J. Kalinger D, Fcrko B, Vcelar B, Screinig S, Kuznctsov O, Stukova M, Erofecva M, Kisclev O, Katinger H, Egorov A. Live cold-adapted influenza A vaccinc produced in Vero cell line. Virus Res., 2004; 103(1-2): 187-93.
13.Katinger D, Mochalova L, Chinarcv A, Bovin N, Romanova J. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates. Arch Virol., 2004; 149(11): 2131-40.
14.Stasakova J, Fcrko B, Kiltel C, Screinig S, Romanova J, Katinger H, Egorov A. Influenza A mutant viruses with altered NSI protein function provoke caspasc-l activation in primary human macrophages, resulting in fast apoptosis and release of high levels of intcrlcukins lbcta and 18. J Gen Virol., 2005; 86(Pt 1): 185-95.
15.Kiltel C, Fcrko B, Kurz M, Voglaucr R, Screinig S, Romanova J. Stieglcr G, Katinger H, Egorov A. Generation of an influenza A virus vector expressing biologically activc human intcrlcukin-2 from the NS gene segment. J Virol., 2005; 79(16): 10672-7.
16.E.M.Rapoport, L.V.Mochalova, H.-J.Gabius, J.Romanova, N.V.Bovin. Search for additional influenza virus to cell interactions. Glycoconj.J., 2006; 23: 115125.
17.Fcrko B, Kittel C, Romanova J, Screinig S, Katinger H, Egorov A. Live attenuated influenza virus expressing human intcrlcukin-2 reveals increased immunogenic potential in young and aged hosts. J Virol., 2006; 80(23): 11621-7.
18.Wrcssnigg N, Voss D, Wolff T, Romanova J, Ruthsatz T, Mayerhofer I, Reiter M, Nakowitsch S, Humcr J, Morokutti A, Muster T, Egorov A, Kittel C. Development of a live-attenuated influenza B DeltaNSl intranasal vaccinc candidate. Vaccine., 2009; 27(21): 2851-7.
19.Romanova J, Krenn BM, Wolschek M, Ferko B, Romanovskaja-Romanko E, Morokutti A, Shurygina AP, Nakowitsch S, Ruthsatz T, Kiefmann B, König U, Bergmann M, Sachet M, Balasingam S, Mann A, Oxford J, Slais M, Kiselev O, Muster T, Egorov A. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS 1 H5N1 influenza vaccine. PLoS One., 2009; 4(6): e5984.
20.Wacheck V, Egorov A, Groiss F, Pfeiffer A, Fuereder T, Hoeflmayer D, Kundi M, Popow-Kraupp T, Redlberger-Fritz M, Mueller CA, Cinatl J, Michaelis M, Geiler J, Bergmann M, Romanova J, Roethl E, Morokutti A, Wolschek M, Ferko B, Seipelt J, Dick-Gudenus R, Muster T. A novel type of influenza vaccine: safety and immunogenicity of replication-deficient influenza virus created by deletion of the interferon antagonist NS1 J Infect Dis., 2010; 201(3): 354-62.
21.Krenn BM, Egorov A, Romanovskaya-Romanko E, Wolschek M, Nakowitsch S, Ruthsatz T, Kiefmann B, Morokutti A, Humer J, Geiler J, Cinatl J, Michaelis M, Wressnigg N, Sturlan S, Ferko B, Batishchev OV, Indenbom AV, Zhu R, Kastner M, Hinterdorfer P, Kiselev O, Muster T, Romanova J. Single HA2 mutation increases the infectivity and immunogenicity of a live attenuated H5N1 intranasal influenza vaccine candidate lacking NS1. PLoS One., 2011; 6(4): el8577.
22.Nakowitsch S, Wolschek M, Morokutti A, Ruthsatz T, Krenn BM, Ferko B, Ferstl N, Triendl A, Muster T, Egorov A, Romanova J. Mutations affecting the stability of the haemagglutinin molecule impair the immunogenicity of live attenuated H3N2 intranasal influenza vaccine candidates lacking NS1. Vaccine., 2011; 29(19): 3517-24.
23.Roethl E, Gassner M, Krenn B.M., Romanovskaya-Romanko E.A., Seper H, Romanova J. Nakowitsch S, Sturlan S, Wolschek M, Sirotkin A, Kiselev O, Muster T, Egorov A. Antimycotic-antibiotic amphotericin В promotes influenza virus replication in cell culture. J Virol., 2011; 85(21): 11139-45.
24.Романовская-Романько E.A., FerkoB., Вышемирский О.И., Романова Ю.Р.. Krenn В., Muster Т., Грудинин М.П., Лапин Б.А., Егоров А.Ю., Киселев О.И. Доклинические исследования интраназальной живой гриппозной H5N1 вакцины с удаленным NS1 геном// Вопросы вирусологии. - 2011.-№6, стр.19-22.
Список сокращений
ACM - атомно силовая микроскопия,
А549-клетки карциномы легких
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
ВПЧ - вирусоподобные частицы
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФН - интерферон,
ИФА- иммуноферментный анализ
МНТ - микронейтрализация
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РТГА - реакции торможения гемагглютинации
СГТ - среднегеометрический титр
ТЦД50 - тканевая цитопатическая доза
FCS - fetal calf serum (сыворотка новорожденного теленка)
IL - интерлейкин
i.n. — интраназально
i.v. - внутривенно
Gal - галактоза
GM-CSF- granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) НА - гемагглютинин
НВЕ - human broncheal epithelial (бронхиальные эпителиальные клетки человека)
MDCK - Madin Darby Canine kidney (клетки почки собаки)
MID50 - mouse infectious dose (доза, вызывающая инфицирование мышей)
moi - multiplicity of infection (множественность заражения)
MRC - Medical Research Council (Медицинский исследовательский центр)
NA - нейраминидаза
NEP - nuclear export protein (белок экспорта из ядра)
NHEp - nasal human epithelial (эпителиальные клетки носовой полости
человека)
NP - нуклеопротеин
NS1 - неструктурный белок
OAS - олигоаденилатсинтетаза
PBS - phosphate buffered saline (фосфатный буфер)
PKR - proteinkinase R (протеинкиназа R
RDE - receptor destroying enzyme (фермент разрушающий рецепторы)
RFU - relative fluorescent units (относительные флуоресцентные единицы)
RLU - relative light units (относительные единицы свечения)
SFM - serum free medium (бессывороточная среда)
SPF - specific pathogen free (свободные от специфических патогенов)
SRD - single radial immunodiffusion (единичная радиальная диффузия)
TNF - tumor necrosis factor (фактора некроза опухолей)
WT - wild type (дикий тип)
Подписано в печать 13.02.12 Формат 60х84'/]б Цифровая Печ. л. 2.25 Уч.-изд.л. 2.25 Тираж 150 Заказ 10/02 печать
Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Романова, Юлия Романовна
1 ВВЕДЕНИЕ.
2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
2.1 Высокопатогенный вирус гриппа птиц.
2.2 Современные тенденции в разработке противогриппозных вакцин.
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1 Тканевые культуры.
3.2 Вирусы.
3.2.1 Эпидемические штаммы вируса гриппа.
3.2.2 Конструирование вирусов методом обратной генетики.
3.3 Секвенирование.
3.4 Культивирование и титрование вирусов.
3.5 Титрование вируса методом бляшек с/без трипсина.
3.6 Получение и инфицирование макрофагов.
3.7 Индукция ИФН в бронхиальных эпителиальных клетках человека.
3.8 Определение сывороточных и секреторных антител.
3.9 Инфекционность и патогенность вирусов для цыплят.
3.10 Инфекционность и иммуногенность вирусов для мышей.
3.11 Патогенность, иммуногенность и протективная эффективность вирусов для хорьков.
3.12 Патогенность и иммуногенность вирусов для макак.
3.13 Определение цитокинов в носовых смывах макак.
3.14 Гемолиз тест.
3.15 Анализ стабильности вирусов методом атомно- силовой микроскопии
3.16 Инфекционность вирусов in vitro при различном рН среды или в присутствии лизосомотропных агентов.
3.17 Проточная цитометрия.
3.18 Кинетика вирусного роста.
4 РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1 Получение H5N1 вакцинного кандидата с модифицированным NS геном и изучение его свойств.
4.1.1 Конструирование вакцинного кандидата.
4.1.2 Рост вакцинного кандидата VN1203ANS1 в клетках Vero.
4.1.3 Стимуляция ИФН в бронхиальных эпителиальных клетках человека (НВЕ) и макрофагах вакцинным штаммом VN1203ANS1.
4.1.4 Патогенность вакцинного кандидата VN1203ANS1 для цыплят.
4.1.5 Иммуногенные и протективные свойства вакцинного кандидата VN1203ANS для мышей.
4.1.6 Аттенуация, иммуногенность и протекгивная эффективность вакцинного кандидата VN1203ANS1 для хорьков.
4.1.7 Аттенуация и иммуногенность вируса VN1203ANS1 для макак.
4.2 Повышение инфекционности и иммуногенности H5N1 вакцинного кандидата VN1203ANS1.
4.2.1 Зависимость инфекционности вирусов гриппа от рН среды.
4.2.2 Введение мутации 58К—И в НА вакцинного кандидата VN1203ANS1.
4.2.3 Мутация 58К-И снижает рН активации НА вируса VN1203ANS1.
4.2.4 Сравнение стабильности вирусов в кислой среде методом атомно-силовой микроскопии.
4.2.5 Стабильность вирусов при повышенной температуре.
4.2.6 Инфекционность вирусов на клетках Vero и MDCK.
4.2.7 Чувствительность вирусов к лизосомотропным агентам.
4.2.8 Репродукционная активность вирусов в тканевых культурах.
4.2.9 Инфекционность исходного и модифицированного вирусов для мышей.
4.2.10 Иммуногенная активность вирусов для мышей.
4.3 Стабильность НА как фактор иммуногенности сезонных живых противогриппозных вакцин.
4.3.1 Получение ANS1 вакцинных кандидатов сероподтипа H3N2.
4.3.2 Влияние адаптационных мутаций в НА на стабильность вакцинных кандидатов сероподтипа H3N2.
4.3.3 Пассирование H3N2 вакцинных кандидатов в тканевой культуре Vero при пониженном рН среды.
4.3.4 Дестабилизирующие мутации в НА H3N2 вакцинных кандидатов снижают иммуногенность вирусов для хорьков.
4.4 Влияние стабильности НА на урожайность вируса для инактивированных противогриппозных вакцин.
4.4.1 Стабильность вирусов, рекомендованных ВОЗ для производства вакцин
4.4.2 Повышение стабильности вируса при пассировании в тканевой культуре с пониженным рН среды.
5 ОБСУЖДЕНИЕ.
6 ВЫВОДЫ.
7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин"
В 1997 году птичий вирус гриппа подтипа A(H5N1) инфицировал 18 человек, 6 из них со смертельным исходом. Высокая патогенность этих штаммов и беспрецедентное распространение среди птиц создали опасность возникновения новой пандемии и вызвали необходимость усовершенствования существующих противогриппозных вакцин. Результаты клинических испытаний вакцин против вирусов гриппа сероподтипа H5N1 показали, что инактивированные вакцины (в дозе 15 мкг НА) обладают низкой иммуногенностью. Только двукратная иммунизация с двойным количеством антигена обеспечивала протективный иммунитет. При такой эффективности в случае пандемии потребуется в 4 раза больше вакцины, чем обычно и, следовательно, больше времени для полноценной защиты населения. Живые вакцины, в отличие от инактивированных, вызывают более длительную и кросс - протективную защиту. Поэтому в случае пандемии живые вакцины позволяют значительно быстрее защитить население. Их недостатком является репродукция штаммов в респираторном тракте, которая может вызвать нежелательное распространение вакцинного вируса в популяции людей. Результаты испытаний живых холодоадаптированных вакцин сероподтипа Н5 противоречивы. Вакцинные кандидаты, полученные на основе донора A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) (США), содержащие поверхностные антигены H5N1 вирусов A/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/213/03, не репродуцировались в респираторном тракте привитых и почти не вызывали иммунный ответ. Вакцинный штамм, приготовленный на основе донора А/Ленин град/134/17/57 (H2N2) (Россия) и низкопатогенного для птиц штамма А/утка/Potsdam/86/92 (H5N2), наоборот, интенсивно реплицировался в верхнем отделе респираторного тракта привитых и вызывал прирост антител у 31% привитых. Причины различий до настоящего момента не выяснены. В данной работе был использован новый подход, основанный на создании аттенуированных штаммов (ANS1 вирусов гриппа), дефектных по репродукции в компетентных по ИФН клетках, за счет удаления белка NS1. Белок NS1 - один из факторов патогенности вируса гриппа, ответственный за подавление врожденного иммунитета хозяина и позволяющий ему успешно реплицироваться на фоне подавленной системы ИФН. Удаление белка NS1 ведет к абортивной репликации вируса из-за активации широкого круга противовирусных факторов и формирования противовирусного статуса в клетках. Таким образом, ANS1 вирусы индуцируют синтез различных белков, а их антигены презентируются в клетках респираторного тракта аналогично живой вакцине. Эффективность интраназальной живой вакцины зависит от того, как вакцинный вирус инфицирует клетки верхнего респираторного тракта. В этом процессе важным, но не единственным фактором является рецепторная специфичность НА вируса гриппа. Кроме того, клетки дыхательных путей в ответ на воспаление или раздражение начинают выделять протоны, что приводит к снижению кислотности носовой полости человека. Кислая среда, вызывает необратимое конформационное изменение НА, необходимое для слияния вирусной и эндосомальной мембран. Если изменение конформации НА происходит до попадания вируса в эндосомы, то вирус теряет инфекционность. Поэтому, для преодоления мукозного барьера НА вируса гриппа должен обладать определенной стабильностью в кислой среде. Вирусы гриппа человека и птиц отличаются по чувствительности к кислой среде. Мы предположили, что низкая инфекционность высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих и, как следствие, низкая эффективность полученных на их основе живых аттенуированных вакцин, обусловлены высоким значением рН активации НА, дестабилизирующим его структуру. Выявление генетических детерминант инфекционности вируса гриппа для млекопитающих и иммуногенности противогриппозных вакцин составило цель настоящего исследования.
2 Литературный обзор
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Романова, Юлия Романовна
6 Выводы
1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок, в сочетании с модификацией сайта расщепления НА и реассортацией генов, кодирующих внутренние белки, приводит к аттенуации высокопатогенного вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1 и позволяет создать вакцинный кандидат, аттенуированный для лабораторных животных при интраназальном введении.
2. Интраназальное введение H5N1 ANS1 вакцинного кандидата не вызывает побочных реакций у цыплят, хорьков и макак и не сопровождается репликацией вируса в респираторном тракте и других органах лабораторных животных, подтверждая фенотип абортивной репликации вируса в компетентных по интерферону клетках.
3. Интраназальная иммунизация H5N1 ANS1 вакцинным кандидатом индуцирует нейтрализующие и секреторные антитела, вызывая кросс-реактивный в пределах подтипа протективный иммунитет, показанный на трех моделях лабораторных животных.
4. Введение мутации K58I в НА2 субъединицу Н5 НА снижает рН активации НА и повышает устойчивость вакцинного кандидата к повышенной температуре и кислой среде.
5. Введение мутации K58I в НА2 субъединицу НА H5N1 вакцинного кандидата обусловливает его более высокую инфекционность в респираторном тракте млекопитающих, повышающую иммуногенность вируса при интраназальном введении.
6. Адаптация вирусов гриппа человека к росту в тканевых культурах приводит к появлению дестабилизирующих мутаций в НА (L194P; G75I), приводящих к
- 137снижению иммуногенности вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин.
7. Культивирование вирусов в тканевых культурах при пониженном рН среды предотвращает появление дестабилизирующих мутаций в НА и позволяет повысить иммуногенность вакцинных кандидатов живых вакцин и урожайность штаммов, используемых для производства инактивированных противогриппозных вакцин.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Романова, Юлия Романовна, Санкт-Петербург
1. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб: Наука, 1994.
2. Гендон Ю.З. Живые холодоадаптированные реассортантные гриппозные вакцины / Вопросы вирусологии / РАМН 2001, Т.З, с. 5-12.
3. Гендон Ю.З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа: обзор // Вопросы вирусологии. — 2007. — N 1 . — С. 4-10.
4. Киселев О.И., Цыбалова Л.М., Покровский В.И. Состояние разработки вакцин против вируса гриппа H5N1 в мире и России. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. №5. С.28-38
5. Киселев О.И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства // Биотехнология. 2010. - №2. - С. 1-17.
6. Покровский В.И., Киселев О.И. Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф СПб.Росток, 2005 - 376 с.
7. AN A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP (2000) Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of M1 protein. J Virol 74: 8709-8719
8. Alymova IV, Kodihalli S, Govorkova EA, Fanget B, Gerdil C, Webster RG (1998) Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza B virus vaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs. J Virol 72: 4472-4477
9. Asahi-Ozaki Y, Yoshikawa T, Iwakura Y, Suzuki Y, Tamura S, Kurata T, Sata T (2004) Secretory IgA antibodies provide cross-protection against infection with different strains of influenza B virus. J Med Virol 74: 328-335
10. Belshe RB, Edwards KM, Vesikari T, Black SV, Walker RE, Hultquist M, Kemble G, Connor EM (2007) Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med 356: 685-696
11. Bernstein Dl, Edwards KM, Dekker CL, Belshe R, Talbot HK, Graham IL, Noah DL, He F, Hill H (2008) Effects of adjuvants on the safety and immunogenicity of an avian influenza H5N1 vaccine in adults. J Infect Dis 197: 667-675
12. Beyer WE, Palache AM, Osterhaus AD (1998) Comparison of Serology and Reactogenicity between Influenza Subunit Vaccines and Whole Virus or Split Vaccines: A Review and Meta-Analysis of the Literature. Clin Drug Investig 15: 1-12
13. Boulay F, Doms RW, Wilson I, Helenius A (1987) The influenza hemagglutinin precursor as an acid-sensitive probe of the biosynthetic pathway. EMBO J 6: 26432650
14. Bresson JL, Perronne C, Launay O, Gerdil C, Saville M, Wood J, Hoschler K, Zambon MC (2006) Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza AA/ietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomised trial. Lancet 367: 1657-1664
15. Bright RA, Carter DM, Crevar CJ, Toapanta FR, Steckbeck JD, Cole KS, Kumar
16. NM, Pushko P, Smith G, Tumpey TM, Ross TM (2008) Cross-clade protective-143 immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS ONE 3: e1501
17. Brown JD, Goekjian G, Poulson R, Valeika S, Stallknecht DE (2009) Avian influenza virus in water: infectivity is dependent on pH, salinity and temperature. Vet Microbiol 136: 20-26
18. Brownlee GG, Fodor E (2001) The predicted antigenicity of the haemagglutinin of the 1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 356: 1871-1876
19. Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC (1994) Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 371: 37-43
20. Carr CM, Kim PS (1994) Flu virus invasion: halfway there. Science 266: 234-236
21. Carr CM, Chaudhry C, Kim PS (1997) Influenza hemagglutinin is spring-loaded by a metastable native conformation. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 14306-14313
22. Chen H, Li Y, Li Z, Shi J, Shinya K, Deng G, Qi Q, Tian G, Fan S, Zhao H, Sun Y, Kawaoka Y (2006) Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in western China. J Virol 80: 5976-5983
23. Chen Z, Zhou H, Jin H The impact of key amino acid substitutions in the hemagglutinin of influenza A (H3N2) viruses on vaccine production and antibody response. Vaccine 28: 4079-4085
24. Chen Z, Zhou H, Jin H (2010) The impact of key amino acid substitutions in the hemagglutinin of influenza A (H3N2) viruses on vaccine production and antibody response. Vaccine 28: 4079-4085
25. Clements DA, Langdon L, Bland C, Walter E (1995) Influenza A vaccine decreases the incidence of otitis media in 6- to 30-month-old children in day care. Arch Pediatr Adolesc Med 149: 1113-1117
26. Cyranoski D (2005) China's chicken farmers under fire for antiviral abuse. Nature 435: 1009
27. Daniels PS, Jeffries S, Yates P, Schild GC, Rogers GN, Paulson JC, Wharton SA,
28. Douglas AR, Skehel J J, Wiley DC (1987) The receptor-binding and membrane- 145fusion properties of influenza virus variants selected using anti-haemagglutinin monoclonal antibodies. EMBO J 6: 1459-1465
29. Daniels RS, Downie JC, Hay AJ, Knossow M, Skehel JJ, Wang ML, Wiley DC (1985) Fusion mutants of the influenza virus hemagglutinin glycoprotein. Cell 40: 431-439
30. De Filette M, Ramne A, Birkett A, Lycke N, Lowenadler B, Min Jou W, Saelens X, Fiers W (2006) The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection. Vaccine 24: 544-551
31. Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T (1998) Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol 72: 6437-6441
32. England RJ, Homer JJ, Knight LC, Ell SR (1999) Nasal pH measurement: a reliableand repeatable parameter. Clin Otolaryngol Allied Sci 24: 67-68- 146
33. Ernst WA, Kim HJ, Tumpey TM, Jansen AD, Tai W, Cramer DV, Adler-Moore JP, Fujii G (2006) Protection against H1, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines. Vaccine 24: 5158-5168
34. Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Kittel C, Sereinig S, Katinger H, Egorov A (2004) Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes. J Virol 78: 13037-13045
35. Fernandez-Sesma A (2007) The influenza virus NS1 protein: inhibitor of innate and adaptive immunity. Infect Disord Drug Targets 7: 336-343
36. Fischer H, Widdicombe JH, lllek B (2002) Acid secretion and proton conductance in human airway epithelium. Am J Physiol Cell Physiol 282: C736-743
37. Fischer H, Widdicombe JH (2006) Mechanisms of acid and base secretion by the airway epithelium. J Membr Biol 211:139-150
38. Flynn KJ, Belz GT, Altman JD, Ahmed R, Woodland DL, Doherty PC (1998) Virus-specific CD8+ T cells in primary and secondary influenza pneumonia. Immunity 8: 683-691
39. Gabriel G, Herwig A, Klenk HD (2008) Interaction of polymerase subunit PB2 and NP with importin alphal is a determinant of host range of influenza A virus. PLoS Pathog 4: e11
40. Garcia-Sastre A, Egorov A, Matassov D, Brandt S, Levy DE, Durbin JE, Palese P, Muster T (1998) Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology 252: 324-330
41. Garcia-Sastre A, Biron CA (2006) Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science 312: 879-882
42. Garcia MA, Gil J, Ventoso I, Guerra S, Domingo E, Rivas C, Esteban M (2006) Impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action. Microbiol Mol Biol Rev 70: 1032-1060
43. Grubb BR, Boucher RC (1999) Pathophysiology of gene-targeted mouse models for cystic fibrosis. Physiol Rev 79: S193-214
44. Guan Y, Peiris JS, Lipatov AS, Ellis TM, Dyrting KC, Krauss S, Zhang LJ, Webster RG, Shortridge KF (2002) Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 8950-8955
45. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2001) X-ray structures of H5 avian and H9swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs.
46. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 11181-11186-148
47. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. EMBO J 21: 865-875
48. Hatta M, Gao P, Halfmann P, Kawaoka Y (2001) Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses. Science 293: 1840-1842
49. Hatta M, Hatta Y, Kim JH, Watanabe S, Shinya K, Nguyen T, Lien PS, Le QM, Kawaoka Y (2007) Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory tracts of mice. PLoS Pathog 3: 1374-1379
50. Hayden FG, Fritz R, Lobo MC, Alvord W, Strober W, Straus SE (1998) Local and systemic cytokine responses during experimental human influenza A virus infection. Relation to symptom formation and host defense. J Clin Invest 101: 643-649
51. Hehar SS, Mason JD, Stephen AB, Washington N, Jones NS, Jackson SJ, Bush D (1999) Twenty-four hour ambulatory nasal pH monitoring. Clin Otolaryngol Allied Sci 24: 24-25
52. Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6108-6113
53. Hoffmann E, Lipatov AS, Webby RJ, Govorkova EA, Webster RG (2005) Role of specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 influenza virus vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 12915-12920
54. Holmgren J, Czerkinsky C, Eriksson K, Mharandi A (2003) Mucosal immunisation and adjuvants: a brief overview of recent advances and challenges. Vaccine 21 Suppl 2: S89-95
55. Horcas I, Fernandez R, Gomez-Rodriguez JM, Colchero J, Gomez-Herrero J, Baro AM (2007) WSXM: a software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. The Review of scientific instruments 78: 013705
56. Huckriede A, Bungener L, Stegmann T, Daemen T, Medema J, Palache AM, Wilschut J (2005) The virosome concept for influenza vaccines. Vaccine 23 Suppl 1: S26-38
57. Ilyushina NA, Govorkova EA, Russell CJ, Hoffmann E, Webster RG (2007) Contribution of H7 haemagglutinin to amantadine resistance and infectivity of influenza virus. J Gen Virol 88: 1266-1274
58. Jefferson T, Rivetti A, Harnden A, Di Pietrantonj C, Demicheli V (2008) Vaccines for preventing influenza in healthy children. Cochrane Database Syst Rev: CD004879
59. Jegerlehner A, Schmitz N, Storni T, Bachmann MF (2004) Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J Immunol 172: 5598-5605
60. Johansson BE (1999) Immunization with influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. Vaccine 17: 20732080
61. Jones T, Allard F, Cyr SL, Tran SP, Plante M, Gauthier J, Bellerose N, Lowell GH, Burt DS (2003) A nasal Proteosome influenza vaccine containing baculovirus-derived hemagglutinin induces protective mucosal and systemic immunity. Vaccine 21: 3706-3712
62. Karlsson H, Hessle C, Rudin A (2002) Innate immune responses of human neonatal cells to bacteria from the normal gastrointestinal flora. Infect Immun 70: 6688-6696
63. Katz JM, Lu X, Frace AM, Morken T, Zaki SR, Tumpey TM (2000) Pathogenesis of and immunity to avian influenza A H5 viruses. Biomed Pharmacother 54: 178-187
64. Kendal AP (1997) Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? Eur J Epidemiol 13: 591-609
65. Kistner O, Howard MK, Spruth M, Wodal W, Brühl P, Gerencer M, Crowe BA,
66. Savidis-Dacho H, Livey I, Reiter M, Mayerhofer I, Tauer C, Grillberger L, Mündt W,-151
67. Falkner FG, Barrett PN (2007) Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses. Vaccine 25: 6028-6036
68. Kodihalli S, Goto H, Kobasa DL, Krauss S, Kawaoka Y, Webster RG (1999) DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice. J Virol 73: 2094-2098
69. Krug RM, Yuan W, Noah DL, Latham AG (2003) Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells: the roles of the viral NS1 protein. Virology 309: 181-189
70. Kuiken T, Rimmelzwaan G, van Riel D, van Amerongen G, Baars M, Fouchier R, Osterhaus A (2004) Avian H5N1 influenza in cats. Science 306: 241
71. Leroux-Roels I, Bernhard R, Gerard P, Drame M, Hanon E, Leroux-Roels G (2008) Broad Clade 2 Cross-Reactive Immunity Induced by an Adjuvanted Clade 1 rH5N1 Pandemic Influenza Vaccine. PLoS ONE 3: e1665
72. Liang S, Mozdzanowska K, Palladino G, Gerhard W (1994) Heterosubtypic immunity to influenza type A virus in mice. Effector mechanisms and their longevity. J Immunol 152: 1653-1661
73. Limberis M, Anson DS, Fuller M, Parsons DW (2002) Recovery of airway cystic fibrosis transmembrane conductance regulator function in mice with cystic fibrosis after single-dose lentivirus-mediated gene transfer. Hum Gene Ther 13: 1961-1970
74. Lleonart R, Naf D, Browning H, Weissmann C (1990) A novel, quantitative bioassay for type I interferon using a recombinant indicator cell line. Biotechnology (N Y) 8: 1263-1267
75. Lorenz RJ, Bogel K (1973) Laboratory techniques in rabies: methods of calculation. Monogr Ser World Health Organ: 321-335
76. Maeda T, Ohnishi S (1980) Activation of influenza virus by acidic media causeshemolysis and fusion of erythrocytes. FEBS Lett 122: 283-287-153
77. Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, Webster R (1999) The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J Virol 73: 1146-1155
78. McShane D, Davies JC, Davies MG, Bush A, Geddes DM, Alton EW (2003) Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J 21: 37-42
79. Meitin CA, Bender BS, Small PA, Jr. (1991) Influenza immunization: intranasal live vaccinia recombinant contrasted with parenteral inactivated vaccine. Vaccine 9: 751-756
80. Mutsch M, Zhou W, Rhodes P, Bopp M, Chen RT, Linder T, Spyr C, Steffen R (2004) Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med 350: 896-903
81. Nicholls JM, Chan MC, Chan WY, Wong HK, Cheung CY, Kwong DL, Wong MP, Chui WH, Poon LL, Tsao SW, Guan Y, Peiris JS (2007) Tropism of avian influenza A (H5N1) in the upper and lower respiratory tract. Nat Med 13: 147-149
82. Nolan T, Richmond PC, Formica NT, Hoschler K, Skeljo MV, Stoney T, McVernon
83. J, Hartel G, Sawlwin DC, Bennet J, Ryan D, Basser RL, Zambon MC (2008) Safetyand immunogenicity of a prototype adjuvanted inactivated split-virus influenza A
84. H5N1) vaccine in infants and children. Vaccine 26: 6383-6391- 154
85. Olsen B, Munster VJ, Wallensten A, Waldenstrom J, Osterhaus AD, Fouchier RA (2006) Global patterns of influenza a virus in wild birds. Science 312: 384-388
86. Palache AM, Brands R, van Scharrenburg GJ (1997) Immunogenicity and reactogenicity of influenza subunit vaccines produced in MDCK cells or fertilized chicken eggs. J Infect Dis 176 Suppl 1: S20-23
87. Pau MG, Ophorst C, Koldijk MH, Schouten G, Mehtali M, Uytdehaag F (2001) The human cell line PER.C6 provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccines. Vaccine 19: 2716-2721
88. Pushko P, Tumpey TM, Van Hoeven N, Belser JA, Robinson R, Nathan M, Smith G, Wright DC, Bright RA (2007) Evaluation of influenza virus-like particles and Novasome adjuvant as candidate vaccine for avian influenza. Vaccine 25: 42834290
89. Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM (2007) Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. J Virol 81: 3514-3524
90. Rachakonda PS, Veit M, Korte T, Ludwig K, Bottcher C, Huang Q, Schmidt MF, Herrmann A (2007) The relevance of salt bridges for the stability of the influenza virus hemagglutinin. Faseb J 21: 995-1002
91. Reed LJ, Muench H (1938) A simple method for estimating fifity percent endpoints. Am J Hyg 27: 493-497
92. Reed ML, Bridges OA, Seiler P, Kim JK, Yen HL, Salomon R, Govorkova EA, Webster RG, Russell CJ (2009) The pH of activation of the hemagglutinin protein regulates H5N1 influenza virus pathogenicity and transmissibility in ducks. J Virol 84: 1527-1535
93. Reed ML, Yen HL, DuBois RM, Bridges OA, Salomon R, Webster RG, Russell CJ (2009) Amino acid residues in the fusion peptide pocket regulate the pH of activation of the H5N1 influenza virus hemagglutinin protein. J Virol 83: 3568-3580
94. Reid AH, Taubenberger JK, Fanning TG (2004) Evidence of an absence: the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus. Nat Rev Microbiol 2: 909-914
95. Rimmelzwaan GF, Kuiken T, van Amerongen G, Bestebroer TM, Fouchier RA, Osterhaus AD (2001) Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model. J Virol 75: 6687-6691
96. Rinia HA, Snel MM, van der Eerden JP, de Kruijff B (2001) Visualizing detergent resistant domains in model membranes with atomic force microscopy. FEBS Lett 501: 92-96
97. Romanova J, Katinger D, Ferko B, Voglauer R, Mochalova L, Bovin N, Lim W, Katinger H, Egorov A (2003) Distinct host range of influenza H3N2 virus isolates in Vero and MDCK cells is determined by cell specific glycosylation pattern. Virology 307: 90-97
98. Sato SB, Kawasaki K, Ohnishi S (1983) Hemolytic activity of influenza virus hemagglutinin glycoproteins activated in mildly acidic environments. Proc Natl Acad Sci U SA80: 3153-3157
99. Scholtissek C (1985) Stability of infectious influenza A viruses at low pH and at elevated temperature. Vaccine 3: 215-218
100. Seo SH, Hoffmann E, Webster RG (2002) Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat Med 8: 950-954
101. Shinya K, Hamm S, Hatta M, Ito H, Ito T, Kawaoka Y (2004) PB2 amino acid at position 627 affects replicative efficiency, but not cell tropism, of Hong Kong H5N1 influenza A viruses in mice. Virology 320: 258-266
102. Shinya K, Ebina M, Yamada S, Ono M, Kasai N, Kawaoka Y (2006) Avian flu: influenza virus receptors in the human airway. Nature 440: 435-436
103. Skehel JJ, Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem 69: 531-569
104. Steel J, Lowen AC, Mubareka S, Palese P (2009) Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathog 5: e1000252
105. Stephenson I, Nicholson KG, Colegate A, Podda A, Wood J, Ypma E, Zambon M (2003) Boosting immunity to influenza H5N1 with MF59-adjuvanted H5N3 A/Duck/Singapore/97 vaccine in a primed human population. Vaccine 21: 16871693
106. Stray SJ, Air GM (2001) Apoptosis by influenza viruses correlates with efficiency of viral mRNA synthesis. Virus Res 77: 3-17
107. Suguitan AL, Jr., McAuliffe J, Mills KL, Jin H, Duke G, Lu B, Luke CJ, Murphy B, Swayne DE, Kemble G, Subbarao K (2006) Live, attenuated influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets. PLoS Med 3: e360
108. Suzuki Y (2005) Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host rangevariation of influenza viruses. Biol Pharm Bull 28: 399-408-160
109. Takada A, Matsushita S, Ninomiya A, Kawaoka Y, Kida H (2003) Intranasal immunization with formalin-inactivated virus vaccine induces a broad spectrum of heterosubtypic immunity against influenza A virus infection in mice. Vaccine 21: 3212-3218
110. Takeuchi K, Lamb RA (1994) Influenza virus M2 protein ion channel activity stabilizes the native form of fowl plague virus hemagglutinin during intracellular transport. J Virol 68: 911-919
111. Takeuchi O, Akira S (2008) MDA5/RIG-I and virus recognition. Curr Opin Immunol 20: 17-22
112. Tamura S, Tanimoto T, Kurata T (2005) Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines. Jpn J Infect Dis 58: 195-207
113. Tamura SI, Asanuma H, Ito Y, Hirabayashi Y, Suzuki Y, Nagamine T, Aizawa C, Kurata T, Oya A (1992) Superior cross-protective effect of nasal vaccination to subcutaneous inoculation with influenza hemagglutinin vaccine. Eur J Immunol 22: 477-481
114. Tellier R (2009) Aerosol transmission of influenza A virus: a review of new studies.
115. J R Soc Interface 6 Suppl 6: S783-790-161
116. Thompson CI, Barclay WS, Zambon MC, Pickles RJ (2006) Infection of human airway epithelium by human and avian strains of influenza a virus. J Virol 80: 80608068
117. To KF, Chan PK, Chan KF, Lee WK, Lam WY, Wong KF, Tang NL, Tsang DN, Sung RY, Buckley TA, Tarn JS, Cheng AF (2001) Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A H5N1 virus. J Med Virol 63: 242-246
118. Treanor JJ, Betts RF, Smith GE, Anderson EL, Hackett CS, Wilkinson BE, Belshe RB, Powers DC (1996) Evaluation of a recombinant hemagglutinin expressed in insect cells as an influenza vaccine in young and elderly adults. J Infect Dis 173: 1467-1470
119. Treanor JJ, Campbell JD, Zangwill KM, Rowe T, Wolff M (2006) Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine. N Engl J Med 354: 1343-1351
120. Treanor JJ, Schiff GM, Couch RB, Cate TR, Brady RC, Hay CM, Wolff M, She D, Cox MM (2006) Dose-related safety and immunogenicity of a trivalent baculovirus-expressed influenza-virus hemagglutinin vaccine in elderly adults. J Infect Dis 193: 1223-1228
121. Tumpey TM, Renshaw M, Clements JD, Katz JM (2001) Mucosal delivery of inactivated influenza vaccine induces B-cell-dependent heterosubtypic cross-protection against lethal influenza A H5N1 virus infection. J Virol 75: 5141-5150
122. Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, Zeng H, Solorzano A, Swayne DE, Cox NJ, Katz JM, Taubenberger JK, Palese P, Garcia-Sastre A (2005) Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science 310: 77-80
123. Vanderlinden E, Goktas F, Cesur Z, Froeyen M, Reed ML, Russell CJ, Cesur N, Naesens L Novel inhibitors of influenza virus fusion: structure-activity relationship and interaction with the viral hemagglutinin. J Virol 84: 4277-4288
124. Vanlandschoot P, Beirnaert E, Neirynck S, Saelens X, Jou WM, Fiers W (1996) Molecular and immunological characterization of soluble aggregated AA/ictoria/3/75 (H3N2) influenza haemagglutinin expressed in insect cells. Arch Virol 141: 17151726
125. Vanlandschoot P, Beirnaert E, Grooten J, Jou WM, Fiers W (1998) pH-dependent aggregation and secretion of soluble monomeric influenza hemagglutinin. Arch Virol 143: 227-239
126. Vercammen E, Staal J, Beyaert R (2008) Sensing of viral infection and activation of innate immunity by toll-like receptor 3. Clin Microbiol Rev 21: 13-25
127. Vesikari T, Fleming DM, Aristegui JF, Vertruyen A, Ashkenazi S, Rappaport R,
128. Washington N, Steele RJ, Jackson SJ, Bush D, Mason J, Gill DA, Pitt K, Rawlins DA (2000) Determination of baseline human nasal pH and the effect of intranasally administered buffers. International journal of pharmaceutics 198: 139-146
129. Weldon WC, Wang BZ, Martin MP, Koutsonanos DG, Skountzou I, Compans RW Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS ONE 5
130. Wine JJ, Joo NS (2004) Submucosal glands and airway defense. Proceedings of the American Thoracic Society 1: 47-53
131. Wood JM, Major D, Newman RW, Dunleavy U, Nicolson C, Robertson JS, Schild GC (2002) Preparation of vaccines against H5N1 influenza. Vaccine 20 Suppl 2: S84-87183.184.
132. Yoshikawa T, Matsuo K, Suzuki Y, Nomoto A, Tamura S, Kurata T, Sata T (2004) Total viral genome copies and virus-lg complexes after infection with influenza virus in the nasal secretions of immunized mice. J Gen Virol 85: 2339-2346
-
Романова, Юлия Романовна
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2012
-
ВАК 03.02.02
- Особенности эволюции вирусов гриппа в период 1986-98 гг.
- Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2
- Характеристики вируса гриппа, влияющие на показатели гуморального иммунного ответа в эксперименте и при вакцинации
- Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ
- Доклиническая и клиническая безопасность и иммунологическая эффективность инактивированной вакцины для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/Н1N1
