Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола

Серегина, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола"

На правах рукописи

СЕРЕГИНА Татьяна Александровна

Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутнрата и бутанола

03.02.07-Генетика

005055247

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055247

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «Гос-НИИГенетика»)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИГенетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Институт молекулярной генетики РАН

кандидат биологических наук ФГУП «ГосНИИГенетика»

Миронов Александр Сергеевич

Хмель Инесса Александровна Березина Оксана Валентиновна

Ведущая организация: кафедра генетики биологического факультета

МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «ОН» <-Зу 2012 года в_на засе-

дании Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан «СМ» ^Су 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В связи с ограниченными запасами доступной нефти, ростом парка автомобилей и некоторыми проблемами экологического, экономического и политического характера, возрастает интерес к биотопливу (альтернативным источникам энергии из возобновляемого сырья). Биомасса является четвертым по величине источником энергии после угля, нефти и природного газа.

Одним из основных видов биотоплива являются спирты, прежде всего этанол, который может быть добавлен к бензину, как для его экономии, так и для улучшения его некоторых параметров. Однако, у этанола есть сильный конкурент -бутанол, который полностью заменяет бензин для двигателей автомобилей. Бута-нол может использоваться как в смеси с бензином, так и выступать в качестве ко-растворителя в дизельной топливной смеси. Возможность получения бутанола из биомассы была открыта еще в ранние 1900-е. В течение двух Мировых Войн заводы по производству биобутанола были построены в США, России, Китае, Индии, Южной Африке и т.д. Однако, с развитием нефтяной индустрии, производство бутанола микробиологическим путем отошло на второй план из-за потери рентабельности [Не Huang, 2010].

За последние несколько лет возобновился интерес к бактериям рода Clostridia и к подобным микроорганизмам, как к возможным способам получения органических веществ, особенно бутанола, в настоящее время получаемого из нефтяного сырья. Clostridium acetobutylicum наиболее часто используется для промышленного производства бутанола.

С. acetobutylicum, осуществляет ацетонобутиловое брожение углеводов в две стадии: на первой накапливаются ацетат и бутират, во второй стадии продолжается утилизация глюкозы, в результате чего кислоты конвертируются в органические растворители н-бутанол, ацетон и этанол [Qureshi N, 2001; Zverlov V. V., 2006]. Такой двухстадийный процесс обеспечивает клетки АТФ как во время интенсивного роста культуры, так и при подготовке к споруляции, однако значительно затрудняет промышленное производство бутанола и делает его нерентабельным, по сравнению с производством из нефтяного сырья. Кроме того, С. acetobutylicum является

строгим анаэробом и обладает низкими показателями роста, что приводит к его низкой продуктивности. Недостаточно изученная генетическая система и физиология Clostridia затрудняют модификацию метаболических путей, необходимую для эффективной продукции бутанола [Lee J. Y., 2010]. Известны многочисленные попытки конструирования рекомбинантных штаммов на основе различных микроорганизмов, содержащих чужеродные клостридиальные гены биосинтеза бутанола [Pamela Р. Peralta-Yahya, 2012; Yang Gu, 2011; Yan-Ning Zheng, 2009]. Использование Kcoli в качестве реципиента генов клостридий позволяет применить разработанную методологию конструирования рекомбиниантных штаммов. Однако конструирование промышленных продуцентов бутанола предполагает не только высокий уровень экспрессии клонированных генов, но и высокую устойчивость культуры к бутанолу, - качество, которым известные штаммы E.coli и многие другие реципиенты не обладают.

Попытки конструирования продуцентов бутанола путем клонирование генов клостридий в различных микроорганизмах не привели к созданию эффективных штаммов, более того, в результате возникли существенные правовые ограничения в использовании генов клостридий для создания рекомбинантных продуцентов бутанола. Поскольку процесс биосинтеза бутанола может быть представлен как инвертированный процесс ß-окисления жирных кислот, возникло предположение о возможном биосинтезе бутанола в клетках E.coli без использования чужеродных генов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выяснение возможности биосинтеза бутанола культурой E.coli без использования чужеродных генов посредством обращенного пути ß-окисления жирных кислот. Кроме того, целью настоящей работы было получение штамма E.coli, обладающего повышенной толерантностью к бутанолу и исследование его фенотипических характеристик.

Для достижения указанных целей были сформулированы следующие задачи:

1. Конструирование штамма E.coli, усваивающего бутанол, как единственный источник углерода, с последующим обращением этого процесса при выращивании мутанта на среде с глюкозой.

2. Оптимизация метода получения бутанол-толерантного мутанта E.coli MG1655 ButR;

3. Проведение экспериментов по изучению различных фенотипиче-ских свойств полученного в ходе направленной микроэволюции мутанта MG1655 ButR;

4. Изучение влияния бутанола на экспресию in vivo лидерной области гена отрС у мутанта MG1655 ButR и родительского штамма MG1655;

Научная новизна и практическая значимость

В силу хорошей изученности, способности роста как в аэробных, так и в анаэробных условиях, Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов для конструирования рекомбинантных продуцентов бутанола. В геноме E.coli присутствуют гены, потенциально способные осуществить все этапы биосинтеза бутирата и бутанола. В рамках настоящего исследования была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола на основе естественного метаболического пути ß-окисления жирных кислот. Впервые была показана возможность обращения этого процесса с целью получения продуцентов бутирата и бутанола. Тем не менее, E.coli обладает высокой чувствительностью к таким токсическим факторам как органические растворители и в частности к бутанолу. Таким образом, вторым не менее важным направлением исследования является решение проблемы толерантности E.coli к бутанолу. В процессе селекции был получен штамм E.coli, толерантный к бутанолу и обладающий рядом фенотипических особенностей: гиперчувствительность к осмотическому шоку, устойчивость к этанолу и изопропанолу, устойчивость к сурфакцину, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом. Определен липидный состав мембраны бутанол-толерантного мутанта. Установлено, что бутанол является фактором регуляции экспрессии основных мембранных белков - поринов. Экспрессия гена отрС, кодирующего порин ОтрС, возрастает под действием бутанола. Нуклеотидные замены, обнаруженные в регу-ляторной области гена отрС мутанта ButR, обуславливают более низкий уровень экспрессии в нормальных условиях и обеспечивают более высокий уровень синтеза в присутствии бутанола. Выявление основных механизмов и ключевых генов, задействованных в повышении толерантности клеток к органическим растворителям,

позволит оптимизировать создание штаммов-продуцентов бутанола и других органических растворителей и сделать более рентабельным их производство.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология Наука XXI века» (г. Пущино, 16 -21 апреля 2012 года).

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИГенетика» 12 октября 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы, из них три в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Структура работы

Диссертация изложена на Ю1 странице печатного текста, включая &SL рисунков и таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы (ЙЬ наименования).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Конструирование штамма E.coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов

В основу конструирования штамма E.coli, продуцирующего бутират и бута-нол, было положено представление о биосинтезе бутирата и бутанола, как инвертированном пути р-окисления жирных кислот {Рис.1).

Первым шагом было конструирование штамма, эффективно утилизирующего бутанол и бутират, то есть имеющего активированный путь их р-окисления. В ранних исследованиях были описаны мутанты E.coli, способные использовать бутират и бутанол в качестве единственных источников углерода [Clark, D. Р., 1987]. Такие

мутанты должны содержать четыре необходимые мутации в генах/ас!1{, айЪС, асИгЯ и агоС.

глюкоза i

1 \

кША

пируват -> лактат

4 """

pta а&А ацетнл-СоА -> -> ацетат

ф ""¡в

ацетоацетил-СоА фУМГВ

с ad№ atoAO бутиральдегид ч- бутирил-СоА -» бутират

^ odhE бутанол

Рисунок 1. Схема биосинтеза бутирата и бутанола. Гены и соответствующие ферменты: IdhA - лактатдегидрогеназа, aceEF - субъединицы пируватдегидрагеназы, pta - фосфатацетилтранс-фераза, аскА - ацетаткиназа, atoB - ацетил-СоА ацетилтрансфераза (тиолаза II),fadEB - субъединицы оксидативного комплекса жирных кислот, atoAD - субъединицы комплекса ацетил-СоА:ацетоацетил-СоА трансферазы, adhE - ацетальдегид- алкогольдегидрогеназа.

1.1. Инактивация гена fadR

В клетках E.coli гены fadBA оперона, кодирующие ключевые ферменты пути ß-окисления жирных кислот, находятся под негативным контролем белка-репрессора - продукта гена fadR [Nunn, W.D., 1983]. Из литературных данных известно, что мутанты fadR, обладающие конститутивной экспрессией генов деградации жирных кислот, способны использовать жирные кислоты со средней длиной углеродной цепи в качестве единственного источника углерода [Overath, Р., 1969; SaJaniíro, J.P., 1971; Vanderwinkel Е, 1968].

Для инактивации гена fadR были использованы праймеры Fl и F2 (Рис. 2). Праймер Fl содержит на 5'-конце нуклеотидную последовательность N-концевого участка структурного гена fadR, а также последовательность, гомологичную сайту attR плазмиды pMW118-attL-ca/(CmR)-attR. Праймер F2 содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидам С-концевого участка гена fadR, а также последовательность, гомологичную сайту attL плазмиды pMW118-attL-cö/(CmR)-attR. Интеграция кассеты attL-caí(CmR)-attR в ген fadR подтвержда-

лась ПЦР-амплификацией с проверочных праймеров БЗ (5'-gtctgctatcagcgtagttag-3') и ¥4 (5'-aacgttgcccgccaagaatg-3'), фланкирующих ген /асО{ {Рис. 2). Выщепление маркера Сгпя, фланкированного ай-сайтами фага X, проводилось с помощью плаз-миды-помощника pMWts-int/xis. Выщепление маркера подтверждалось ПЦР-амплификацией с использованием тех же проверочных праймеров РЗ и ¥4.

Рисунок 2. Схема интеграции кассеты айЬ-са<(Стк)-аШ1 в хромосомный локус ],асШ и ее выщепление с образованием делеции Стрелками обозначены праймеры Р1 и Р2, использованные для амплификации кассеты аИЬ-с<я<(Стк)-аПК, а также контрольные праймеры ИЗ и И4.

выщепленне кассеты

Таким образом, на первом этапе нами был получен штамм TS1 {Рис.3, Табл. 1), несущий делецию гена fadR {AfadR) и обладающий конститутивным синтезом ферментов (3-окисления жирных кислот.

1.2. Инактивация гена aceF

Фенотип мутаций в гене алкогольдегидрогеназы (adhE) возможно проследить только в штаммах-ауксотрофах по ацетату [Clark, D Р., 1980]. Ген aceF кодирует одну из субъединиц пируватдегидрогеназного комплекса, катализирующего превращение пирувата в ацетил-СоА. Таким образом, инактивация гена aceF позволяет получить штаммы, нуждающиеся в источнике ацетата, в данном случае бутирата или бутанола. Инактивацию гена aceF проводили по описанной выше схеме.

Полученный в результате штамм TS16 {AfadR AaceF) при культивировании на минимальных средах проявлял зависимость от ацетата, плохо рос на среде с глюкозой и был не способен к росту на сукцинате как источнике углерода {Рис.3).

Таблица 1. Штаммы Е. coli, использованные в работе.

Штаммы Генотип Происхождение

MG1655 Дикий тип ВКПМ

TS11 Мутант MG1655, толерантный к бутанолу (ButR) Настоящая работа

TS14 Как MG1655, но AompF::Ктк Настоящая работа

TS16 Как MG1655, но АотрС::Кт* Настоящая работа

TS17 Как TS11, но AompFv.Km* Настоящая работа

TS19 Как TS11, но АотрСу.Кт"- Настоящая работа

TS22 Как MG1655, но AlacZwTet* Настоящая работа

TS32 TS22, содержащий вектор pBRl Настоящая работа

TS35 TS22, содержащий вектор pBR2 Настоящая работа

TS32-0 TS32, ноДоторй::Кт* Настоящая работа

TS35-0 TS35, но AompR::KmK Настоящая работа

TS32-C TS32, но AcpxR::Kmlí Настоящая работа

TS35-C TS35, но Дфхй::Ктк Настоящая работа

TS1 MG1655, uoAfadR Настоящая работа

TS16 TS1, но AaceF Настоящая работа, аук-сотроф по ацетату

TS113 TS16, но adhC Настоящая работа, рост на этаноле

TS132 TS113, но adhR Настоящая работа, рост на этаноле

TS322 TS132, но atoC Настоящая работа, рост на бутирате и бутаноле

TS324 TS322, но accF' Настоящая работа, рост на глюкозе

TS425 TS324, с Р,eratoB Настоящая работа

TS421 TS325, но AldhA Настоящая работа

TS428 TS325, но Apta Настоящая работа

4~метилпираз o.i

делеционный мутагенез ^

Т51 й/адЯ

¿«ягционныЗ мутагенез ^

Т$1б ДМЯ ЛосеР ауксотроф по ацетату

мутагена ни/прозогуомидином ф

Т5113 ДДОЯ ЛасеР, авЬЕ рост на этаноле

75132 АасеР, о4ЬЕ, адНЛ

рост на »таноле

отбор на среде МасСопкеу ^

ЛасеР, адЬЕ, а1оС рост на бутирате и бутаноле Р1 -трснсдукц и я оплел я асеГ" ф

Т5324 осеР, аёИЕ, а4НЯ, оЮС

рост на глюкозе

Т$3254/оЛЬ асеР, а<*Л£, ас/Л*, МоС, Р^оВ рост на глюкозе

снесение промотора Рж

TS421 tladR, тхР; adhE, adhft, atoC, P^tod, ¿UhA

TS42SüfadR. oceF*, odhE, adhR, atoC, P^atoB, Apta

Рисунок 3. Схема конструирования штаммов, продуцирующих бугират и бутанол.

1.3. Получение adhE мутантов Kcoli, способных расти на этаноле в аэробных условиях

В литературе описаны мутанты, обладающие высокой активностью AdhE-фермента (альдегид-алкогольдегидрогеназы) в аэробных условиях [Kaga, N., 2002]. Мы попытались оптимизировать стратегию получения этих мутаций с целью достижения лучших результатов.

Культуру ауксотрофа по ацетату TS 16 в поздней экспоненциальной фазе роста обрабатывали нитрозогуанидином. Затем клетки рассевали на минимальную среду с добавлением сукцината и этанола в качестве источников углерода. Таким образом, была получена серия мутантов, которые затем пересевали на минимальную среду, содержащую этанол, как единственный источник углерода. Далее селекцию этанол-утилизирующих мутантов проводили на индикаторной среде MacConkey, в которую в качестве источника углерода добавляли этанол. В процессе селекции был отобран мутант TS113.

На следующем этапе штамм TS 113 подвергали вторичной обработке нитрозогуанидином и высевали на минимальную среду, содержащую 0.1% этанола

и 2 шМ 4-метилпиразола (специфический ингибитор алкогольдегидрогеназы). В ходе селекции на минимальной среде с добавлением 0.1% этанола и возрастающих концентраций 4-метилпиразола (от 4 мМ до 10 мМ) был отобран наиболее хорошо растущий мутант TS132 {Рис. 5). По-видимому, улучшенный рост мутанта TS132 на этаноле обеспечивается дополнительной регуляторной мутацией adhR [Clark, D. P., 1987].

1.4. Идентификация мутаций в гене adhE

Секвенирование гена adhE штамма TS132 выявило наличие двух мутаций. Первая обнаруженная нами нуклеотидная замена G—»А локализуется в положении -257 и затрагивает Сга-бокс - участок связывания регуляторного белка Сга в промо-торной области гена adhE {Рис. 4).

FXS2 FIS3

ctatcattcqttattgttatctaqttqtgcaaaacatqCTAATQtagccaccaaatcata gatagtaagcaataacaatagatcaacacgttttgtacgattacatcggtggtttagtat

cTACAATttattaactgttagctataatggcgaaaagcgatgrtgaggggtg££§gcttt gatgttaaataattgacaatcgatattaccgcttttcgctacgactttccacagtcgaaa

Cra-Box (FruR)

FNR NarL +1 (Sigma38)

gcaaaaatTTGGATTTGGATCACgtaatcagtacccagaagtgagtaatcttgcttacgcc cgtttttaaacctaaacctagtgcattagtcatgggtcttcactcattagaacgaatgcgg

Рисунок 4. Нуклеотидная последовательность регуляторной области гена adhE. Жирным шрифтом и заглавными буквами обозначены -35 и -10 области промототра и сайт связывания регуляторного белка FNR, подчеркнуты сайты связывания белка FIS, жирным шрифтом и прописными буквами - сайт связывания белка NarL. Заштрихован сайт связывания белка FruR (Сга-бокс). Стрелкой показана нуклеотидная замена в Cra-боксе, полученная в геноме мутанта TS132.

Вероятно, эта замена приводит к дерепрессии гена adhE в аэробных условиях вследствие снижения сродства Сга-белка к мутантному Сга-боксу. Вторая мутация (G1701—»А) приводит к аминокислотной замене Glu568—»Lys, т.е. затрагивает кодирующую область гена adhE. Нуклеотидные замены в геноме штамма TS132, отобранного нами в ходе мутагенеза и селекции, идентичны мутациям, описанным ранее [Kaga, N.. 2002]. Таким образом, нами был получен мутантный аллель гена adhE, обеспечивающий синтез активной альдегид-алкогольдегидрогеназы в аэроб-

ных условиях, который предполагалось использовать для аэробной конверсии бу-тирата в бутанол.

1.5. Получение мутантов, растущих на бутирате и бутаноле, как единственных источниках углерода

Для получения вариантов, способных к росту на бутирате и бутаноле суспензию штамма Т8132 рассевали на индикаторную среду МасСопкеу, содержащую 0.5% бутирата или 0.5% бутанола, в качестве источников углерода. В ходе селекции удалось отобрать ярко красные колонии, активно метаболизирующие бути-рат и бутанол.

Рисунок 5. Рост мутантов Т8135, Т8321, Т5322 и Т8384 на минимальной среде с бутанолом (0.5%) в качестве единственного источник углерода. Чашку инкубировали при 30°С в течение 4В час.

Из литературных данных известно, что рост E.coli на бутирате и бутаноле обеспечивается мутациями в генах fadR и atoC [Clark, D. P., 1987; Nunn, W.D., 1983]. Очевидно, в процессе селекции мутантов, растущих на бутаноле и бутирате, нами были отобраны и спонтанные мутанты atoC. Наиболее хорошо растущий на средах с бутиратом и бутанолом мутант TS322 был выбран для дальнейшей работы (Рис.5, Рис. 3).

1.6. Восстановление функционального аллеля гена aceF

Для дальнейшего конструирования штамма, синтезирующего бутират и бутанол из глюкозы необходимо присутствие активного пируватдегидрогеназного комплекса, катализирующего превращение пирувата в ацетил-СоА.

Введение функционального аллеля гена aceF* в геном штамма TS322 проводилось путем трансдукции фагом P1/MG1655. Отбор трансдуктантов проводился на минимальной среде с добавлением 0.5% сукцината, в качестве источника углерода. Колонии, выросшие на среде с сукцинатом, проверяли на способность

метаболизировать глюкозу, контролем был исходный штамм MG1655. Один из полученных трансдуктантов (TS324) был использован в дальнейшей работе {Рис.3).

1.7. Подстановка гена atoB под контроль промотора Рш

Одним из ключевых этапов конструирования штамма, синтезирующего бути-рат из глюкозы, является преимущественная утилизация ацетил-СоА в ацетоаце-тил-СоА. Для успешной конкуренции с ЦТК за ацетил-СоА необходима повышенная экспрессия гена atoB, кодирующего тиолазу II [Atsumi, S., 2008]. Для усиления транскрипции гена atoB был использован промотор P,ei% один из самых сильных промоторов, экспрессирующихся в клетках E.coli [Lutz R., 1997]. Для подстановки гена atoB под контроль конститутивного промотора была сконструирована кассета P/t,,-attL-cß/(CmR)-attR - Р,е/ {Рис. 6), которая содержит промотор Рш, селективный маркер устойчивости к антибиотику и одновременно обеспечивает возможность интеграции промотора перед целевым геном atoB.

Выщепление маркера CmR, фланкированого att-сайтами фага X, проводили по схеме, описанной раннее для fadR. В итоге, был получен штамм TS325, содержащий в составе хромосомы ген atoB под контролем конститутивного промотора Рш {Рис.б). Таким образом, в полученном штамме TS325 была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола без использования чужеродных генов {Рис.1).

Рисунок 6. Схема интеграции кассеты tel В

хромосому перед структурным геном atoB и ее выщепление с образованием гибридной конструкции P,eratoB. Стрелками обозначены праймеры В1 и В2, использованные для амплификации кассеты attL-ca/(CmR)-attR-.P

/е/, а также контрольные праймеры ВЗ и В4.

1.8. Инактивация генов IdhA и pía, ответственных за синтез побочных продуктов при ферментации глюкозы в бутират и бутанол

Итак, сконструированный нами штамм TS325 AfadR aceF" adhE adhR atoC P,eratoB предположительно несет в себе все необходимые модификации для осуществления биосинтеза бутирата и бутанола. Однако, часть ацетил-СоА и NADH, необходимых для синтеза бутирата и бутанола расходуется при образовании побочных продуктов, таких как ацетат, лактат, этанол. Для блокирования этих процессов в геноме штамме TS325 были инактивированы гены биосинтеза лактата IdhA и ацетата pía [Causey, Т.В., 2004; Eiteman, M.F., 2006]. Инактивацию этих генов производили по описанной выше схеме с использованием плазмиды pMW118-attL-ca/(CmR)-attR. В результате получены два производных штамма TS325: TS421 AldhA, содержащий делецию гена IdhA и TS428 Apta, содержащий делецию гена pta (Рис.3). Генотип полученных в ходе работы штаммов представлен в таблице 1, а реализованная схема биосинтеза бутирата в штамме TS325 приведена на рисунке 1.

1.9. Содержание продуктов ферментации глюкозы в культуральной среде

Определение продуктов метаболизма штаммов TS325 AfadR aceF* adhE adhR atoC P,cratoB, TS421 AfadR aceF" adhE adhR atoC P,eratoB AldhA и TS428 AfadR aceF* adhE adhR atoC P,eratoB Apta производилось методом газовой хроматографии. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание этанола, ацетата, бутирата и бутанола в культуральной жидкости.

Штамм Аэробное культивирование Полуаэробное культивирование

Концентрация метаболитов (мМ):

этанол ацетат бутират бутанол этанол ацетат бутират бутанол

MG1655 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1

TS325 1.9 53.4 2.7 0.13 4.3 12.2 7.2 0.65

TS421 AldhA 2.1 36.7 3.1 0.13 6.1 24.1 11.4 0.71

TS428 Apta 2.0 5.1 3.5 0.13 <0.1 6.4 5.8 0.39

Как видно из данных таблицы 2, в отличие от родительского штамма М01655, штамм Т8325 его производные накапливают в культуральной жидкости небольшое количество бутанола, более заметные количества этанола, бутирата и,

особенно, ацетата в условиях аэробного роста. Важно подчеркнуть, что в условиях полуаэробного роста у штаммов происходит заметное перераспределение пулов ацетата и бутирата, причем последний возрастает за счет первого и достигает 800 мг/л (7.2 мМ) у штамма TS325 и 1.3 г/л (11.4 мМ) у штамма TS421 AldhA. Таким образом, полученные нами мутации, активирующие путь ß-окисления жирных кислот, позволяют клеткам E.coli ферментировать глюкозу с образованием бутирата (и бутанола).

2. Фенотипические свойства бутанол-толерантного мутанта E.coli

2.1. Направленная микроэволюцая штаммов в средах, содержащих бутанол

Направленную микроэволюцию клеток штамма E.coli MG1655 в средах, содержащих бутанол, проводили с использованием комбинации жидкой и твердой сред и варьированием температурных режимов. В процессе селекции был выделен мутант MG1655, способный расти в жидкой среде, содержащей 1.25% бутанола и на твердой среде с концентрацией бутанола 1.5%. Далее мы протестировали полученный мутант на способность расти в богатой среде при различных концентрациях бутанола (1.25%, 1.5% и 1.75%) и разных температурных режимах (30°С и 37°С) (Рис. 7).

2 1,8 1,6 1,4

О 0,8 0,6 0,4 0.2 0

Рисунок 7. Оптическая плотность культур штаммов 1УГО1655 (1) и МШ655 ВшИ. (2) после 24 часов культивирования в среде ЬВ с бутанолом при 30°С (А) и при 37°С (Б).

1 2

■1 4 ■1 Ii к

6/д 1.25% 1.5% 175% Концентрация бутанола

О 0,8

6/д 125% 1.5% 1,75% Концентрация бутанола

2.2. Устойчивость к бутанолу культур Е.соИ в стационарной фазе

Устойчивость к бутанолу стационарных культур определялась в полуанаэробных условиях. Культуры клеток, находящиеся в ранней стационарной фазе роста, помещали в пробирки с плотными крышками, куда добавляли бутанол в различных концентрациях (1%, 1.25%, 1.5% и 2%) и инкубировали в течении ночи. Выживаемость оценивали в КОЕ/мл. Разница между выживаемостью дикого штамма и его бутанол-толерантного мутанта невелика, однако, она все же присутствует, что может свидетельствовать о некоторых изменениях как в липидном составе мембран, так и в их белковой компоненте. На это указывают результаты эксперимента, представленные на рисунке 8.

В ходе эксперимента была выявлена характерная особенность мутанта М01655 ВиЖ - пониженная способность его клеток к агрегации. Потеря у клеток мутанта Мв1655 ВиЖ способности агрегировать является, возможно, следствием изменения белково-липидного состава мембран и, вероятно, связана с их повышенной устойчивостью к бутанолу.

Рисунок 8. Вид стационарных культур штаммов МС1655 и Мв1655 ВиИЗ. при культивировании в среде ЬВ с бутанолом: 1 - МБ 1655, без добавления бутанола; 2 - N«31655, 1% бутанола; 3 - N«31655, 1.5% бутанола; 4 - МС1655 ВиЖ, без добавления бутанола; 5 - Мв1655 ВиЖ, 1.5% бутанола.

2.3. Устойчивость к спиртам

Определение устойчивости мутанта Мв1655 ВиЖ к более гидрофильным спиртам (этанолу и изопропанолу) позволило оценить специфичность механизмов толерантности, приобретенных полученным в ходе селекции мутантом. Оценку устойчивости клеток мутанта и штамма дикого типа производили путем измерения 006оо ночных культур этих штаммов. Было показано, что мутант более устойчив к этим спиртам по сравнению со штаммами дикого типа {Табл. 3).

Таблица 3. Влияние различных стресс-факторов на рост бутанол-толерантного мутанта Е. coli и исходного штамма на богатой среде.

Штаммы MG1655 MU1655 ButR

Антибиотики (на диск) Диаметр зоны ингибирования роста (мм)

Ампициллин 30 мкг 20 25

Хлорамфеникол 30 мкг 20 26

Рифампицин 30 мкг 15 17

Апрамицин 30 мкг 12 16

Неомицин 50 мкг 8 19

Циклосерин 50 мкг 16 12

Сурфактин 12.5 мкг 14 0

Оксидативный стресс (на диск) Диаметр зоны ингибирования роста (мм)

3% Н202 5мкл 15 15

Паракват 50 мкг 10 12

Осмотический стресс ODgoo ночных культур

0.5 М ЫаС1 1.80 1.54

0.75 М ЫаС1 1.56 0.475

1 М ЫаС1 1.496 0.035

Влияние спиртов ODgoo ночных культур

7% Этанол 0.254 1.015

5% Изопропанол 0.305 1.709

2.4. Чувствительность к антибиотикам

Предполагая, что механизм устойчивости к спиртам у мутанта Мв1655 ВиЖ может иметь достаточно универсальный характер и, возможно, связан с механизмами множественной лекарственной устойчивости [Аопо К, 1998; Ахако Н., 1997; НауаяМ 5., 2003], мы оценили чувствительность бутанол-толерантного мутанта к разным группам антибиотиков. В ходе исследования было установлено, что бута-нол-толерантный мутант обладает повышенной чувствительностью к антибиотикам (З-лактамного ряда, а так же антибиотикам ингибирующим синтез белков (хлорам-фениколу, рифампицину, аминогликозидам) (Табл. 3). Однако, мутант Мв1б55 ВиШ обладал повышенной устойчивостью к антибиотикам, механизм действия ко-

торых связан с нарушением синтеза липидов (циклосерин) и дезорганизацией мембраны (сурфактин) {Табл. 3).

2.5. Оксидативный стресс

Оксидативный стресс является одной из составляющих повреждающего действия органических растворителей, в том числе и бутанола. Оксидативный стресс можно индуцировать такими веществами как Н202 или паракват [Farr S.B., 1991]. Проверка штаммов MG1655 и MG1655 ButR выявила одинаковый уровень чувствительности к стрессу, вызванному Н202. Однако мутант MG1655 ButR оказался чуть более чувствителен к параквату по сравнению с контролем (Табл. 3).

2.6. Чувствительность к осмотическому шоку

Осмотическую резистентность штамма MG1655 и мутанта MG1655 ButR определяли путем сравнения OD6oo ночных культур, выращенных в условиях высокой осмолярности среды (0.5-1.0 М NaCl). Было показано, что выживаемость мутанта MG1655 ButR резко снижается под воздействием гиперосмотической среды, по сравнению с родительским штаммом (Табл. 3). Подобная сверхчувствительность, возможно, связана с изменением количества неспецифических трансмембранных транспортеров - поринов.

2.7. Различия в липидном составе мембран штаммов MG1655 ButR и MG1655

Для определения возможных изменений мембранной структуры был проведен анализ липидного состава клеток штаммов MG1655 и MG1655 ButR. В таблице 3 приведены изменения в составе жирных кислот (ЖК) клеток родительского штамма и бутанол-толерантного мутанта. Значимые изменения в составе ЖК штамма MG1655 ButR состоят в появлении 3-гидрокси-тридекановой кислоты, что может отражать изменение структуры липида А липиполисахарида [Trent M.S., 2004; Zhu К., 2009]. В составе ЖК штамма MG1655 ButR было отмечено появление новых, нехарактерных для MG1655 жирных кислот (выделены жирным шрифтом). В частности у мутанта обнаруживаются тридекановая и два изомера пентадецено-вой кислоты. Остальные изменения носят количественный характер (Табл. 4).

Таблица 4. Состав жирных кислот клеток штаммов МС1655 и М01655 Вит (% от суммы

ЖК).

№ Жирная кислота Символ MG1655 MG1655 ButR

1 Додекановая 12:0 1.241 1.329

2 Тридекановая 13:0 0.412

3 Тетрадеценовая 14:1 0.188 0.134

4 Тетрадекановая 14:0 6.212 5.056

5 7-пентадеценовая 15:lw8 0.248

6 9-пеитадеценовая 15:lw6 0.091

7 Пентадекановая 15:0 1.966 6.405

8 3-гидрокси-тридекановая 13:0 ЗОН 0.224

9 7-гексадекановая 16:lw9 0.165 0.166

10 9-гексадекановая 16:lw7 6.889 12.07

11 11-гексадекановая 16:lw5 0.244 0.345

12 Гексадекановая 16:0 37.632 30.167

13 3-гидрокси-тетрадекановая 14:0 ЗОН 3.249 3.298

14 Цикло-гептадекановая 17 eye 24.905 19.259

15 Гептадеановая 17:0 1.299 3.672

16 11-октадекановая 18:lw7 6.616 13.356

17 Октадекановая 18:0 2.994 0.923

18 Цикло-нонадекановая 19 eye 6.355 2.843

Сумма ЖК 100 99.98

2.8. Композиция белков внешней мембраны у бутанол-толерантных мутантов

Сравнение белкового профиля родительского штамма МО 1655 и бутанол-толерантного мутанта ВиШ выявило некоторые отличия в количественном содержании поринов ОтрА ОтрС и ОтрБ в мембранной фракции. В наших условиях проведения ЗОЭ-гельэлсктрофорсза нам не удалось добиться разделения фракций белков ОтрС и ОтрР, которые близки по молекулярной массе (40.36 кБа и 39.33 кЭа, соответственно). Поэтому в геном родительского штамма МС1655 и мутанта ТвП ВЩЯ были внесены инсерции отрС::Кшк и отрР::Кша, полностью инакти-вирующие синтез соответствующих белков, после чего проводили выделение мембранных белков, их фракционирование и электрофоретический анализ в полиакри-ламидном геле (Рис.11).

У мутанта ВиШ (штамм Т817) можно видеть заметное снижение количества белков ОтрС и ОтрА в мембранной фракции. Еще более интересный результат получен при анализе мембранных фракций белков ОтрС и ОтрР, выделенных из бактерий штамма МИ 1655 и мутанта ВиШ, которые выращивали на минимальной

среде в присутствии 1.5% бутанола. В обоих контрольных штаммах бутанол полностью подавляет экспрессию поринов ОшрС и OmpF и частично порина ОтрА (Рис. И, дорожки 6 и 7).

У мутанта ButR под влиянием бутанола наблюдается практически полное подавление экспрессии порина OmpF (Рис.11, дорожка 8), но экспрессия поринов ОшрС и ОтрА сохраняется на прежнем уровне, как и у бактерий, выращенных на среде без добавления бутанола (Рис. 11, дорожки 5 и 9).

170

130'

95 г

55 43

, .......... 4 OmpC/OmpF

ЩШШ ....... * ОтрА

12 3456789

Рисунок 11. 1 - белковый маркер; 2 - TS16 (ДотрС), 3 - TS14 (AompF), 4 -TS19 (ButR АотрС), 5 -TS17 (ButR AompF); 6 - TS16 (ДотрС), 7-TS14 (AompF), 8 - TS19 (ButR AompC), 9 - TS17 (ButR AompF). Дорожки 2-5: мембранные белки, выделенные из клеток, выращенных в минимальной среде Адамса; дорожки 6-9: мембранные белки, выделенные из клеток, выращенных в минимальной среде Адамса с добавлением 1.5% бутанола.

Таким образом, ярким отличием мутанта ButR от родительского штамма является изменение содержания порина ОтрС в мембранной фракции в ответ на добавление бутанола в среду роста. Такое изменение может быть обусловлено как модификацией самого порина ОтрС, ограничивающей его встраивание в структурно-измененный липополисахарид [Ames G.F., 1974; Koplow J., 1974; Schnaitman С.А.,1993], так и с изменением регуляции экспрессии гена отрС с участием белков активаторов OmpR и CpxR.

3. Исследование изменения регуляции гена отрС под действием бутанола

3.1. Определение нуклеотидной последовательности генов отрС и отрЯ у мутанта ВиШ

Секвенирование хромосомного локуса ompR мутанта ButR не выявило каких-либо мутаций как в структурной, так и в регуляторной области этого гена (данные не представлены).

В то же время, мы обнаружили три нуклеотидные замены: -94С—>Т, -80Т—»A и -62А—>G в регуляторной области гена отрС, которые расположены, соответственно, в сайтах связывания Cía, Clb и С2Ь белка OmpR (Рис.12). Выявленные нуклеотидные замены одновременно затрагивают и сайты связывания другого ре-гуляторного белка - CpxR, которые, в свою очередь, перекрываются с сайтами связывания белка OmpR.

CpxRl CpxR2 CpxR3

TA G

.-100 I _I _. -70 I_._.-50

caltttACAITTTGflflACATCTA|t|ÄGCGATAAaTGÄAACATCTTAAAAGTTTTAGTÄTCATATTlc gtaaatgtaaaactttgtagatatcgctatttactttgtagaattttcaaaatcatagtataag

, cia__Clb | t C2a__С2b n СЗа_СЗЬ |

I I I

C1 C2 C3

-35 . .-20 .-10 .'+1 .+20

gtgTTGGATtattctgcatttttgggGAGAATggacttgccgactgattaatgagggttaatca cacaacctaataagacgtaaaaacccctcttacctgaacggctgactaattactcccaattagt

.+30 .+50 . ,+70 M К V

gtatgcagtqgcataaaaaagcaaataaaggcatataacagagggttaataacatgaaagttaa catacgtcaccgtattttttcgtttatttccgtatattgtctcccaattattgtactttcaatt

Рисунок 12. Нуклеотидная последовательность регуляторной области гена отрС. Старт транскрипции (+1) обозначен стрелкой; -10 и -35 последовательности промотора обозначены жирным шрифтом. Сайты связывания белка OmpR (Cl, С2 и СЗ) обведены рамкой, жирным шрифтом указаны консервативные нуклеотиды. Сайты связывания белка CpxR подчеркнуты жирной линией. Сайт связывания рибосомы подчеркнут тонкой линией. Нуклеотидные замены, обнаруженные в сайтах связывания белков OmpR и CpxR у мутанта ButR обозначены над нук-леотидной последовательностью.

3.2. Определение уровня экспрессии гена отрС в бесклеточных экстрактах мутанта ButR

Регуляторные зоны гена отрС мутанта ButR (TS 11) и родительского штамма MG1655 клонировали в малокопийный экспрессионный вектор pJEL250. Вектор pJEL250 содержит структурный ген lacZ, кодирующий синтез ß-галактозидазы без собственного промотора, что позволяет конструировать транскрипционные слияния исследуемых промоторов с геном lacZ. Полученные варианты гибридных плазмид, содержащие ген lacZ под контролем регуляторной зоны гена отрС дикого типа и мутанта ButR были перенесены с помощью трансфор-

мации в реципиентные клетки штамма ТБ22 ДlacZ и у полученных трансформантов определяли активность (3-галактозидазы. Культуры выращивали на минимальной среде Адамса при 37°С. Пробы для определения активности (3-галактозидазы отбирали начиная с ранней и кончая поздней логарифмической стадией роста {Рис. 13).

Как следует из данных рисунка 13, у штамма Т832, содержащего регулятор-ную область гена отрС родительского штамма в процессе роста наблюдается постепенное нарастание удельной активности р-галактозидазы, которое достигает максимума к поздней логарифмической стадии роста (2 часа).

Рисунок 13. Зависимость активности р-галактозидазы у транскипцион-

ных слияний, содержащих регулятор-РготрС\л/( _ „

ную область гена отрС дикого типа и

РготрСВ|ЛЯ мутанта ВШЯ от времени инкубации при 37°С (измерения проводились в минимальной среде Адамса).

10 20 30 60 90 120 150 Время, мин

Кривая зависимости удельной активности р-галактозидазы под контролем мутантного промотора ВиЖ от стадии роста бактерий штамма Т835 имеет совершенно иной характер. Во-первых, базальный уровень экспрессии промотора ВиЖ существенно ниже контрольного. Во-вторых, увеличение активности в ходе роста бактерий происходит значительно медленнее. Эти данные согласуются с результатами электрофореза {Рис. 11), где мы наблюдали явное снижение экспрессии основных мембранных белков ОтрС и ОтрР в мембранной фракции штамма ТЭ11. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что снижение экспрессии порина ОтрС у мутанта ТБИ ВиЖ обусловлено присутствием выявленных нами трех нуклеотидных замен в регуляторной области гена отрС. Исходя из установленной нами локализации этих замен в сайтах связывания белков ОтрЯ и СрхЯ, представляется весьма вероятным, что полученные мутации снижают эффективность связывания этих белков-активаторов, результатом чего является наблюдаемое нами уменьшение базального уровня экспрессии гена отрС в мутанте ВиЖ.

3.3. Влияние бутанола на характер экспрессии гена отрС

В следующей серии экспериментов мы изучили влияние бутанола на характер экспрессии гена отрС у мутанта ВиЖ и контрольного штамма. Экспресиия гена отрС возрастает под действием температуры \Lutenburg В., 1976], поэтому эксперименты по измерению активности (3-галактозидазы проводились в двух температурных режимах: при 30°С и 37°С (Рис. 14).

Показано, что изменение температурного режима не приводит к значительному увеличению активностей как у мутанта, так и у контроля. Однако, добавление бутанола в случае контрольного штамма приводит к 2-х кратному увеличению уровня экспрессии гена отрС при 30°С и более чем к 3-х кратному увеличению при 37°С. У мутанта ВиШ активирующее действие бутанола выражено еще сильнее: при 37°С активность |3-галактозидазы под контролем промотора В1й11 возрастает более чем на порядок (Рис.14).

Рисунок 14. Влияние температуры и бутанола на экспрессию гена отрС у штамма Т832, содержащего репортерный ген 1асХ под контролем регуляторной области гена отрС дикого типа и у штамма Т535, содержащего репортерный ген 1ас1 под контролем мутантного промотора ВшЯ.

|_0РготрСиЛ I ¡аРготрСВ^И

1ВС00

| 16030 С

■ 14000

: 12000 1

| 10000

ГС 30° 37°

Добавка вщ Виг

На следующем этапе работы мы решили выяснить, зависит ли увеличение уровня экспрессии гена отрС под действием бутанола от регуляторных белков ОгпрЯ и СрхЯ. С этой целью в геном штаммов ТБ32 и Т835 были внесены инсер-ции отрЯ\:КтЯ и и у полученных штаммов Т832-0, Т835-0, Т832-С и

Т835-С определяли активность р-галактозидазы (Рис. 15).

Результаты, представленные на рисунке 15 показывают, что в случае регуляторной области дикого типа, увеличение экспрессии гена отрС под действием бу-

танола опосредуется белком-активатором ОшрЯ. В случае мутантного промотора ВиШ уровень индукции р-галактозидазы бутанолом остается высоким, несмотря на инактивацию гена отрЯ, однако не достигает максимума, наблюдаемого на фоне интактного гена отрЯ. Несколько иной эффект на индукцию экспрессии гена отрС бутанолом вызывает инактивация гена срхЯ. В случае регуляторной области дикого типа инактивация гена срхЯ приводит к примерно 2-х кратному увеличению ба-зального уровня экспрессии гена отрС, причем добавление бутанола не вызывает дополнительного возрастания его активности.

Рисунок 15. Влияние инсерций в генах отрК и срхЯ на экспрессию отрС.

Генотип Дикий тип йотрЯ АсрхИ

Добавки - Вт • Вт - вт

У мутанта В^Я на фоне инактивированного гена срхЯ базальный уровень экспрессии гена отрС также повышается, однако добавление бутанола приводит примерно к 3-х кратной индукции р-галактозидазы и примерно соответствует уровню экспрессии, который наблюдается в случае инактивации гена отрЯ (Рис. 15). Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что для максимальной индукции бутанолом экспрессии как мутантного, так и дикого промотора гена отрС необходимо присутствие в клетке интактных белков ОтрЯ и СрхЯ. Очевидно, что содержащиеся в регуляторной области гена отрС нуклеотидные замены у мутанта ВиЖ влияют на нормальное и, по всей видимости, конкурентное взаимодействие регуляторных белков ОтрЯ и СрхЯ с перекрывающимися мишенями. Вместе с тем, в случае мутантного промотора в клетке, по-видимому, реализуется и независимый от действия этих регуляторных белков механизм индукции экспрессии гена отрС бутанолом.

Выводы

1. Осуществлено генетическое конструирование штамма Е.соП А/ас1Я, асИгЕ, ШоС, Р1еГа1оВ, АШИА, способного продуцировать бутират. Тем самым впервые показана возможность обращения этапов процесса р-окисления жирных кислот в Е.соП и использование этого процесса для биосинтеза бутирата - предшественника бутанола.

2. Методом направленной микроэволюции получен штамм Е.соП Мй1655 ВиЖ, способный расти в присутствии 1.5% бутанола в питательной среде.

3. Впервые показано, что содержание в мембранной фракции клеток Е.соП белка ОшрС зависит от присутствия в среде такого гидрофобного агента, как бутанол. У мутанта ВиЖ существует прямая корреляция между уровнем экспрессии гена отрС и содержанием порина ОтрС в мембранной фракции клеток.

4. В регуляторной области гена отрС у мутанта ВиЖ выявлены три нук-леотидные замены, которые локализуются в перекрывающихся сайтах связывания белков-активаторов ОтрИ. и СрхЯ. Присутствие этих мутаций в регуляторной области гена отрС у мутанта ВиЖ обусловливает снижение уровня экспрессии гена отрС в нормальных условиях роста, однако обеспечивает более высокий уровень синтеза порина ОтрС при добавлении бутанола.

5. Определен ряд фенотипических характеристик штамма МС1655 ВиЖ (устойчивость к этанолу и изопропанолу, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом, устойчивость к сурфактину, измененный состав жирных кислот, а также гиперчувствительность к осмотическому шоку), свидетельствующих о структурных перестройках клеточных мембран, затрагивающих, как липидную, так и белковую компоненты.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Т.А. Серегина, P.C. Шакулов, В.Г. Дебабов, А.С.Миронов. Конструирование штамма E.coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов. // Биотехнология. 2009. № 6. Стр. 24-35.

2. Т. А. Серегина, Г. А. Осипов, Р. С. Шакулов, А. С. Миронов. Получение и фено-типическая характеристика мутантов E.coli, толерантных к бутанолу. // Микробиология. 2012. Том 81. № 2. Стр. 227-235

3. Т. А. Серегина, Г. А. Осипов, Р. С. Шакулов, А. С. Миронов. Фенотипические свойства мутанта E.coli, толерантного к бутанолу. Материалы 16-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология Наука XXI века» Пу-щино, 16-21 апреля 2012 г. С. 145.

4. Т. А. Серегина, Р. С. Шакулов, А. С. Миронов. Бутанол как фактор регуляции экспрессии гена отрС в клетках E.coli. II Генетика. 2012. Том 48. №11. Стр. 19.

Подписано в печать:

29.10.2012

Заказ № 7766 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серегина, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микробиологический синтез бутанола.

1.1.1. Биосинтез бутанола в клетках Clostridium acetobutilicum.

1.1.2. Ферменты, участвующие в ABE ферментации.

1.1.3. Генно-инженерный инструментарий для модификации метаболизма клостридий.

1.1.4. Стратегии увеличения продукции бутанола у клостридий.

1.1.5. Альтернативный путь биосинтеза бутанола и других спиртов.

1.1.6. Альтернативные штаммы-продуценты бутанола.

1.1.7. Потенциальные возможности биосинтеза бутанола в клетках E.coli.

1.1.8. Путь /?-окисления жирных кислот в клетках E.coli.

1.1.9. Ферменты пути /?-окисления жирных кислот.

1.1.10. Рост Е. coli на этаноле и бутаноле, как источниках углерода.

1.2. Проблема устойчивости бактерий к бутанолу.

1.2.1. Уровни толерантности к бутанолу у различных микроорганизмов.

1.2.2. Стрессовое воздействие бутанола.

1.2.3. Механизмы устойчивости к бутанолу у клостридий.

1.2.4. Устойчивость E.coli к органическим растворителям.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Фенотипические характеристики культур штаммов Е. coli.

2.3.1. Определение устойчивости к бутанолу стационарных культур штаммов Е. coli.

2.3.2. Определение осмотической толерантности.

2.3.3. Определение устойчивости к антибиотикам.

2.3.4. Определение состава жирных кислот целых клеток.

2.3.5. Суперэкспрессия белков холодового шока.

2.4. Манипуляции с ДНК.

2.5. Выделение фракции белков внешней мембраны.

2.6. Конструирование транскрипционных слияний.

2.7. Измерение активности ß-галактозидазы.

2.8. Мутагенез.

2.9. Получение делеций целевых генов.

2.10. Амплификация фрагментов для Red-зависимой рекомбинации.

2.11. ПЦР.

2.12. Red-зависимая рекомбинация ПЦР-фрагментов.

2.13. Электропорация.

2.14. Выщепление CmR маркера.

2.15. Секвен ирование.

2.16. Определение метаболитов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Конструирование штамма E.coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов.

3.1.1 Инактивация гена fadR.

3.1.2. Инактивация гена aceF.

3.1.3. Получение adhE мутантов E.coli, способных расти на этаноле в аэробных условиях.

3.1.4. Идентификация мутаций в гене adhE.

3.1.5. Получение мутантов, растущих на бутирате и бутаноле, как единственных источниках углерода.

3.1.6. Восстановление функционального аллеля гена aceF.

3.1.7. Подстановка гена atoB под контроль промотора Ptet.

3.1.8. Инактивация генов IdhA и pta, ответственных за синтез побочных продуктов при ферментации глюкозы в бутират и бутанол.

3.1.9. Содержание продуктов ферментации глюкозы в кулътуралъной среде.

3.2. Фенотипические свойства бутанол-толерантного мутанта.

3.2.1. Направленная микроэволюция штаммов в средах, содержащих бутанол.

3.2.2. Устойчивость к бутанолу культур E.coli в стационарной фазе.

3.2.3. Устойчивость к спиртам.

3.2.4. Чувствительность к антибиотикам.

3.2.5. Оксидативный стресс.

3.2.6. Чувствительность к осмотическому шоку.

3.2.7. Различия в липидном составе мембран штаммов MG1655 ButR и MG

3.2.8. Влияние ионов Са2+ на устойчивость к бутанолу.

3.2.9. Влияние суперэкспрессии белков холодового шока на устойчивость к бутанолу.

3.3. Бутанол как фактор регуляции экспрессии генаотрС в клетках E.coli.

3.3.1. Композиция белков внешней мембраны у бутанол-толерантных мутантов.

3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности генов отрС и отрЯ у мутанта ВшЯ.

3.3.3. Определение уровня экспрессии гена отрС в бесклеточных экстрактах мутанта ВшЯ.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола"

Актуальность темы

Одним из основных видов биотоплива являются спирты, прежде всего этанол, который может быть добавлен к бензину, как для его экономии, так и для улучшения его некоторых параметров. Однако, у этанола есть сильный конкурент - бутанол, который полностью заменяет бензин для двигателей автомобилей. Бутанол может использоваться как в смеси с бензином, так и выступать в качестве ко-растворителя в дизельной топливной смеси. Возможность получения бутанола из биомассы была открыта еще в ранние 1900-е. В течение двух Мировых Войн заводы по производству биобутанола были построены в США, России, Китае, Индии, Южной Африке и т.д. Однако, с развитием нефтяной индустрии, производство бутанола микробиологическим путем отошло на второй план из-за потери рентабельности (7).

3). Такой двухстадийный процесс обеспечивает клетки АТФ как во время интенсивного роста культуры, так и при подготовке к споруляции, однако значительно затрудняет промышленное производство бутанола и делает его нерентабельным, по сравнению с производством из нефтяного сырья. Кроме того, С. acetobutylicum является строгим анаэробом и обладает низкими показателями роста, что приводит к его низкой продуктивности. Недостаточно изученная генетическая система и физиология Clostridia затрудняют модификацию метаболических путей, необходимую для эффективной продукции бутанола (4). Известны многочисленные попытки конструирования рекомбинантных штаммов на основе различных микроорганизмов, содержащих чужеродные клостридиальные гены биосинтеза бутанола (2, 3, 5-7). Использование E.coli в качестве реципиента генов клостридий позволяет применить разработанную методологию конструирования рекомбиниантных штаммов. Однако конструирование промышленных продуцентов бутанола предполагает не только высокий уровень экспрессии клонированных генов, но и высокую устойчивость культуры к бутанолу, - качество, которым известные штаммы E.coli и многие другие реципиенты не обладают.

Попытки конструирования продуцентов бутанола путем клонирование генов клостридий в различных микроорганизмах не привели к созданию эффективных штаммов, более того, в результате возникли существенные правовые ограничения в использовании генов клостридий для создания рекомбинантных продуцентов бутанола. Поскольку процесс биосинтеза бутанола может быть представлен как инвертированный процесс |3-окисления жирных кислот, возникло предположение о возможном биосинтезе бутанола в клетках E.coli без использования чужеродных генов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выяснение возможности биосинтеза бутанола культурой E.coli без использования чужеродных генов посредством обращенного пути (3-окисления жирных кислот. Кроме того, целью настоящей работы было получение штамма E.coli, обладающего повышенной толерантностью к бутанолу и исследование его фенотипических характеристик.

Для достижения указанных целей были сформулированы следующие задачи:

2. Оптимизация метода получения бутанол-толерантного мутанта E.coli MG1655 ButR;

3. Проведение экспериментов по изучению различных фенотипических свойств полученного в ходе направленной микроэвалюции мутанта MG1655 ButR;

Научная новизна и практическая ценность работы

В силу хорошей изученности, способности роста как в аэробных, так и в анаэробных условиях, Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов для конструирования рекомбинантных продуцентов бутанола. В геноме E.coli присутствуют гены, потенциально способные осуществить все этапы биосинтеза бутирата и бутанола. В рамках настоящего исследования была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола на основе естественного метаболического пути (38 окисления жирных кислот. Впервые была показана возможность обращения этого процесса с целью получения продуцентов бутирата и бутанола. Тем не менее, E.coli обладает высокой чувствительностью к таким токсическим факторам как органические растворители и в частности к бутанолу. Таким образом, вторым не менее важным направлением исследования является решение проблемы толерантности E.coli к бутанолу. В процессе селекции был получен штамм E.coli, толерантный к бутанолу и обладающий рядом фенотипических особенностей: гиперчувствительность к осмотическому шоку, устойчивость к этанолу и изопропанолу, устойчивость к сурфакцину, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом. Определен липидный состав мембраны бутанол-толерантного мутанта. Установлено, что бутанол является фактором регуляции экспрессии основных мембранных белков -поринов. Экспрессия гена отрС, кодирующего порин ОтрС, возрастает под действием бутанола. Нуклеотидные замены, обнаруженные в регуляторной области гена отрС мутанта ButR, обуславливают более низкий уровень экспрессии в нормальных условиях и обеспечивают более высокий уровень синтеза в присутствии бутанола. Выявление основных механизмов и ключевых генов, задействованных в повышении толерантности клеток к органическим растворителям, позволит оптимизировать создание штаммов-продуцентов бутанола и других органических растворителей и сделать более рентабельным их производство.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Серегина, Татьяна Александровна

выводы

1. Методом направленной микроэволюции получен штамм E.coli MG 1655 ButR, способный расти в присутствии 1.5% бутанола в питательной среде.

2. Впервые показано, что содержание в мембранной фракции клеток E.coli белка ОтрС зависит от присутствия в среде такого гидрофобного агента, как бутанол. У мутанта ButR существует прямая корреляция между уровнем экспрессии гена отрС и содержанием порина ОтрС в мембранной фракции клеток.

3. В регуляторной области гена отрС у мутанта ButR выявлены три нуклеотидные замены, которые локализуются в перекрывающихся сайтах связывания белков-активаторов OmpR и CpxR. Присутствие этих мутаций в регуляторной области гена отрС у мутанта ButR обусловливает снижение уровня экспрессии гена отрС в нормальных условиях роста, однако обеспечивает более высокий уровень синтеза порина ОтрС при добавлении бутанола.

4. Определен ряд фенотипических характеристик штамма MG1655 ButR (устойчивость к этанолу и изопропанолу, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом, устойчивость к сурфактину, измененный состав жирных кислот, а также гиперчувствительность к осмотическому шоку), свидетельствующих о структурных перестройках клеточных мембран, затрагивающих, как липидную, так и белковую компоненты.

5. Осуществлено генетическое конструирование штамма E.coli AfadR, adhE, atoC, Ptet-atoB, AldhA, способного продуцировать бутират. Тем самым впервые показана возможность обращения этапов процесса ß-окисления жирных кислот в E.coli и использование этого процесса для биосинтеза бутирата - предшественника бутанола.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серегина, Татьяна Александровна, Москва

1. Huang, H., Liu, H., and Gan, Y. R. (2010) Genetic modification of criticalenzymes and involved genes in butanol biosynthesis from biomass, Biotechnol Adv 28, 651-657.

2. Qureshi, N., Ezeji, Т. C., Ebener, J., Dien, B. S., Cotta, M. A., and Blaschek, H. P. (2008) Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I: use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber, Bioresour Technol 99, 5915-5922.

3. Lee, J. Y., Yang, K. S., Jang, S. A., Sung, В. H., and Kim, S. C. (2010) Engineering butanol-tolerance in escherichia coli with artificial transcription factor libraries, Biotechnol Bioeng, 28.

4. Gu, Y., Jiang, Y., Wu, H., Liu, X., Li, Z., Li, J., Xiao, H., Shen, Z., Dong, H., Yang, Y., Li, Y., Jiang, W., and Yang, S. (2011) Economical challenges to microbial producers of butanol: feedstock, butanol ratio and titer, Biotechnol J 6, 1348-1357.

5. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. В., and Keasling, J. D. (2012) Microbial engineering for the production of advanced biofuels, Nature 488, 320-328.

6. Zheng, Y. N., Li, L. Z., Xian, M., Ma, Y. J., Yang, J. M., Xu, X., and He, D. Z. (2009) Problems with the microbial production of butanol, J Ind Microbiol Biotechnol 36, 1127-1138.

7. Inui, M., Suda, M., Kimura, S., Yasuda, K., Suzuki, H., Toda, H., Yamamoto, S., Okino, S., Suzuki, N., and Yukawa, H. (2008) Expression of Clostridium acetobutylicum butanol synthetic genes in Escherichia coli, Appl Microbiol Biotechnol 77, 1305-1316.

8. Atsumi, S., and Liao, J. C. (2008) Metabolie engineering for advanced biofuels production from Escherichia coli, Curr Opin Biotechnol 19, 414419.

9. Rutherford, B. J., Dahl, R. H., Price, R. E., Szmidt, H. L., Benke, P. I., Mukhopadhyay, A., and Keasling, J. D. (2010) Functional genomic study of exogenous n-butanol stress in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 76, 1935-1945.

10. Keis, S., Bennett, C. F., Ward, V. K., and Jones, D. T. (1995) Taxonomy and phylogeny of industrial solvent-producing Clostridia, Int J Syst Bacteriol 45, 693-705.

11. Dabrock, B., Bahl, H., and Gottschalk, G. (1992) Parameters Affecting Solvent Production by Clostridium pasteurianum, Appl Environ Microbiol 58, 1233-1239.

12. Vasconcelos, I., Girbal, L., and Soucaille, P. (1994) Regulation of carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutral pH on mixtures of glucose and glycerol, J Bacteriol 176, 14431450.

13. Yan, R. T., Zhu, C. X., Golemboski, C., and Chen, J. S. (1988) Expression of Solvent-Forming Enzymes and Onset of Solvent Production in Batch Cultures of Clostridium beijerinckii ("Clostridium butylicum"), Appl Environ Microbiol 54, 642-648.

14. Maddox, I. S. (1989) The acetone-butanol-ethanol fermentation: recent progress in technology, Biotechnol Genet Eng Rev 7, 189-220.

15. Maddox, I. S., Steiner, E., Hirsch, S., Wessner, S., Gutierrez, N. A., Gapes,

16. J. R., and Schuster, K. C. (2000) The cause of "acid-crash" and "acidogenic88fermentations" during the batch acetone-butanol-ethanol (ABE-) fermentation process, JMol Microbiol Biotechnol 2, 95-100.

17. Hartmanis, M. G., and Gatenbeck, S. (1984) Intermediary Metabolism in Clostridium acetobutylicum: Levels of Enzymes Involved in the Formation of Acetate and Butyrate, Appl Environ Microbiol 47, 1277-1283.

18. Ballongue, J., Amine, J., Masion, E., Petitdemange, H., and Gay, R. (1986) Role of acetate and butyrate in the induction of NADH: rubredoxin oxidoreductase in Clostridium acetobutylicum., Biochimie 68, 575-580.

19. Wiesenborn, D. P., Rudolph, F. B., and Papoutsakis, E. T. (1989) Phosphotransbutyrylase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in acidogenesis, Appl Environ Microbiol 55, 317-322.

20. Sullivan, L., and Bennett, G. N. (2006) Proteome analysis and comparison of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and SpoOA strain variants, J Ind Microbiol Biotechnol 33, 298-308.

21. Papoutsakis, E. T., and Bennett, G. N. (1993) Cloning, structure, and expression of acid and solvent pathway genes of Clostridium acetobutylicum, Biotechnology 25, 157-199.

22. Welch, R. W., Rudolph, F. B., and Papoutsakis, E. T. (1989) Purification and characterization of the NADH-dependent butanol dehydrogenase from Clostridium acetobutylicum (ATCC 824), Arch Biochem Biophys 273, 309318.

23. Wiesenborn, D. P., Rudolph, F. B., and Papoutsakis, E. T. (1989) Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the uptake of acids, Appl Environ Microbiol 55, 323-329.

24. Jones, D. T., and Woods, D. R. (1986) Acetone-butanol fermentation revisited, Microbiol Rev 50, 484-524.

25. Bahl, H., Gottwald, M., Kuhn, A., Rale, V., Andersch, W., and Gottschalk, G. (1986) Nutritional Factors Affecting the Ratio of Solvents Produced by Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 52, 169-172.

26. Mermelstein, L. D., Welker, N. E., Bennett, G. N., and Papoutsakis, E. T. (1992) Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Biotechnology (N Y) 10, 190-195.

27. Green, E. M., and Bennett, G. N. (1996) Inactivation of an aldehyde/alcohol dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Appl Biochem Biotechnol 57-58, 213-221.

28. Green, E. M., Boynton, Z. L., Harris, L. M., Rudolph, F. B., Papoutsakis, E. T., and Bennett, G. N. (1996) Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Microbiology 142 (Pt 8), 2079-2086.

29. Harris, L. M., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (2002) Northern, morphological, and fermentation analysis of spoOA inactivation and overexpression in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, J Bacteriol 184, 3586-3597.

30. Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., and Minton, N. P. (2007) The ClosTron: a universal gene knock-out system for the genus Clostridium, J Microbiol Methods 70, 452-464.

31. Feustel, L., Nakotte, S., and Durre, P. (2004) Characterization and development of two reporter gene systems for Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 70, 798-803.

32. Quixley, K. W., and Reid, S. J. (2000) Construction of a reporter gene vector for Clostridium beijerinckii using a Clostridium endoglucanase gene, J Mol Microbiol Biotechnol 2, 53-57.

33. Lee, S. Y., Park, J. H., Jang, S. H., Nielsen, L. K., Kim, J., and Jung, K. S. (2008) Fermentative butanol production by Clostridia, Biotechnol Bioeng 101, 209-228.

34. Senger, R. S., and Papoutsakis, E. T. (2008) Genome-scale model for Clostridium acetobutylicum: Part I. Metabolic network resolution and analysis, Biotechnol Bioeng 101, 1036-1052.

35. Tummala, S. B., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (2003) Design of antisense RNA constructs for downregulation of the acetone formation pathway of Clostridium acetobutylicum, J Bacteriol 185, 1923-1934.

36. Jiang, Y., Xu, C., Dong, F., Yang, Y., Jiang, W., and Yang, S. (2009) Disruption of the acetoacetate decarboxylase gene in solvent-producing Clostridium acetobutylicum increases the butanol ratio, Metab Eng 11, 284291.

37. Baer, S. H., Bryant, D. L., and Blaschek, H. P. (1989) Electron Spin Resonance Analysis of the Effect of Butanol on the Membrane Fluidity of Intact Cells of Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 55, 2729-2731.

38. Chen, C. K., and Blaschek, H. P. (1999) Acetate enhances solvent production and prevents degeneration in Clostridium beijerinckii BA101, Appl Microbiol Biotechnol 52, 170-173.

39. Rao, G., and Mutharasan, R. (1987) Altered Electron Flow in Continuous Cultures of Clostridium acetobutylicum Induced by Viologen Dyes, Appl Environ Microbiol 53, 1232-1235.

40. Yan, Y., and Liao, J. C. (2009) Engineering metabolic systems for production of advanced fuels, JInd Microbiol Biotechnol 36, 471-479.

41. Atsumi, S., Hanai, T., and Liao, J. C. (2008) Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels, Nature 451, 86-89.

42. Smith, K. M., Cho, K. M., and Liao, J. C. (2010) Engineering Corynebacterium glutamicum for isobutanol production, Appl Microbiol Biotechnol 87, 1045-1055.

43. Chen, X., Nielsen, K. F., Borodina, I., Kielland-Brandt, M. C., and Karhumaa, K. (2011) Increased isobutanol production in Saccharomyces cerevisiae by overexpression of genes in valine metabolism, Biotechnol Biofuels 4, 21.

44. Higashide, W., Li, Y., Yang, Y., and Liao, J. C. (2011) Metabolic engineering of Clostridium cellulolyticum for production of isobutanol from cellulose, Appl Environ Microbiol 77, 2727-2733.

45. Atsumi, S., Higashide, W., and Liao, J. C. (2009) Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde, Nat Biotechnol 27, 11771180.

46. Huo, Y. X., Cho, K. M., Rivera, J. G., Monte, E., Shen, C. R., Yan, Y., and Liao, J. C. (2011) Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux, Nat Biotechnol 29, 346-351.

47. Li, H., Opgenorth, P. H., Wernick, D. G., Rogers, S., Wu, T. Y., Higashide, W., Malati, P., Huo, Y. X., Cho, K. M., and Liao, J. C. (2012) Integrated electromicrobial conversion of C02 to higher alcohols, Science 335, 1596.

48. Atsumi, S., Cann, A. F., Connor, M. R., Shen, C. R., Smith, K. M., Brynildsen, M. P., Chou, K. J., Hanai, T., and Liao, J. C. (2008) Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production, Metab Eng 10, 305-311.

49. Steen, E. J., Chan, R., Prasad, N., Myers, S., Petzold, C. J., Redding, A., Ouellet, M., and Keasling, J. D. (2008) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol, Microb Cell Fact 7,36.

50. Nielsen, D. R., Leonard, E., Yoon, S. H., Tseng, H. C., Yuan, C., and Prather, K. L. (2009) Engineering alternative butanol production platforms in heterologous bacteria, Metab Eng 11, 262-273.

51. Berezina, O. V., Zakharova, N. V., Brandt, A., Yarotsky, S. V., Schwarz, W. H., and Zverlov, V. V. (2010) Reconstructing the clostridial n-butanolmetabolic pathway in Lactobacillus brevis, Appl Microbiol Biotechno I 87, 635-646.

52. Lan, E. I., and Liao, J. C. (2012) ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria, Proc Natl Acad Sei USA 109, 6018-6023.

53. Clark, D. P., and Rod, M. L. (1987) Regulatory mutations that allow the growth of Escherichia coli on butanol as carbon source, J Mol Evol 25, 151158.

54. Clark, D. P., and Cronan, J. E., Jr. (1981) Bacterial mutants for the study of lipid metabolism, Methods Enzymol 72, 693-707.

55. Overath, P., Pauli, G., and Schairer, H. U. (1969) Fatty acid degradation in Escherichia coli. An inducible acyl-CoA synthetase, the mapping of old-mutations, and the isolation of regulatory mutants, Eur J Biochem 7, 559574.

56. Overath, P., and Raufuss, E. M. (1967) The induction of the enzymes of fatty acid degradation in Escherichia coli, Biochem Biophys Res Commun 29, 28-33.

57. Pauli, G., and Overath, P. (1972) ato Operon: a highly inducible system for acetoacetate and butyrate degradation in Escherichia coli, Eur J Biochem 29, 553-562.

58. Binstock, J. F., Pramanik, A., and Schulz, H. (1977) Isolation of a multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli, Proc Natl Acad Sei USA 74, 492-495.

59. O'Brien, W. J., and Frerman, F. E. (1977) Evidence for a complex of three beta-oxidation enzymes in Escherichia coli: induction and localization, J Bacteriol 132, 532-540.

60. Pawar, S., and Schulz, H. (1981) The structure of the multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli, J Biol Chem 256, 3894-3899.

61. Pramanik, A., Pawar, S., Antonian, E., and Schulz, H. (1979) Five different enzymatic activities are associated with the multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli, JBacteriol 137, 469-473.

62. Klein, K., Steinberg, R., Fiethen, B., and Overath, P. (1971) Fatty acid degradation in Escherichia coli. An inducible system for the uptake of fatty acids and further characterization of old mutants, Eur J Biochem 19, 442450.

63. Clark, D., and Cronan, J. E., Jr. (1980) Escherichia coli mutants with altered control of alcohol dehydrogenase and nitrate reductase, J Bacteriol 141, 177-183.

64. Baer, S. H., Blaschek, H. P., and Smith, T. L. (1987) Effect of Butanol Challenge and Temperature on Lipid Composition and Membrane Fluidity of Butanol-Tolerant Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 53, 2854-2861.

65. Borden, J. R., and Papoutsakis, E. T. (2007) Dynamics of genomic-library enrichment and identification of solvent tolerance genes for Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 73, 3061-3068.

66. Vollherbst-Schneck, K., Sands, J. A., and Montenecourt, B. S. (1984) Effect of butanol on lipid composition and fluidity of Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Appl Environ Microbiol 47, 193-194.

67. Knoshaug, E. P., and Zhang, M. (2009) Butanol tolerance in a selection of microorganisms, Appl Biochem Biotechnol 153, 13-20.

68. Desmond, C., Fitzgerald, G. F., Stanton, C., and Ross, R. P. (2004) Improved stress tolerance of GroESL-overproducing Lactococcus lactis and probiotic Lactobacillus paracasei NFBC 338, Appl Environ Microbiol 70, 5929-5936.

69. Fiocco, D., Capozzi, V., Goffin, P., Hols, P., and Spano, G. (2007) Improved adaptation to heat, cold, and solvent tolerance in Lactobacillus plantarum, Appl Microbiol Biotechnol 77, 909-915.

70. Matsumoto, M., Mochiduki, K., and Kondo, K. (2004) Toxicity of ionic liquids and organic solvents to lactic acid-producing bacteria, J Biosci Bioeng 98, 344-347.

71. Tomas, C. A., Beamish, J., and Papoutsakis, E. T. (2004) Transcriptional analysis of butanol stress and tolerance in Clostridium acetobutylicum, J Bacteriol 186, 2006-2018.

72. Ingram, L. O., and Buttke, T. M. (1984) Effects of alcohols on microorganisms, Adv Microb Physiol 25, 253-300.

73. Kabelitz, N., Santos, P. M., and Heipieper, H. J. (2003) Effect of aliphatic alcohols on growth and degree of saturation of membrane lipids in Acinetobacter calcoaceticus, FEMS Microbiol Lett 220, 223-227.

74. Bowles, L. K., and Ellefson, W. L. (1985) Effects of butanol on Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 50, 1165-1170.

75. Ingram, L. O. (1990) Ethanol tolerance in bacteria, Crit Rev Biotechnol 9, 305-319.

76. Sikkema, J., de Bont, J. A., and Poolman, B. (1995) Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons, Microbiol Rev 59, 201-222.

77. Doremus, M. G., Linden, J. C., and Moreira, A. R. (1985) Agitation and pressure effects on acetone-butanol fermentation, Biotechnol Bioeng 27, 852-860.

78. Liyanage, H., Young, M., and Kashket, E. R. (2000) Butanol tolerance of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 associated with down-regulation of gldA by antisense RNA, J Mol Microbiol Biotechnol 2, 87-93.

79. Alsaker, K. V., Spitzer, T. R., and Papoutsakis, E. T. (2004) Transcriptional analysis of spoOA overexpression in Clostridium acetobutylicum and its effect on the cell's response to butanol stress, J Bacteriol 186, 1959-1971.

80. Narberhaus, F., Giebeler, K., and Bahl, H. (1992) Molecular characterization of the dnaK gene region of Clostridium acetobutylicum, including grpE, dnaJ, and a new heat shock gene, JBacteriol 174, 3290-3299.

81. Hermann, M., Fayolle, F., Marchal, R., Podvin, L., Sebald, M., and Vandecasteele, J. P. (1985) Isolation and characterization of butanol-resistant mutants of Clostridium acetobutylicum, Appl Environ Microbiol 50, 1238-1243.

82. Aono, R., Tsukagoshi, N., and Yamamoto, M. (1998) Involvement of outer membrane protein TolC, a possible member of the mar-sox regulon, in maintenance and improvement of organic solvent tolerance of Escherichia coli K-12, J Bacteriol 180, 938-944.

83. Aono, R., and Kobayashi, H. (1997) Cell surface properties of organic solvent-tolerant mutants of Escherichia coli K-12, Appl Environ Microbiol 63, 3637-3642.

84. Bae, W., Xia, B., Inouye, M., and Severinov, K. (2000) Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators, Proc Natl AcadSci USA 97, 7784-7789.

85. Zingaro, К. A., and Terry Papoutsakis, E. (2012) GroESL overexpression imparts Escherichia coli tolerance to i-, n-, and 2-butanol, 1,2,4-butanetriol and ethanol with complex and unpredictable patterns, Metab Eng.

86. Atsumi, S., Wu, T. Y., Machado, I. M., Huang, W. C., Chen, P. Y., Pellegrini, M., and Liao, J. C. (2010) Evolution, genomic analysis, and reconstruction of isobutanol tolerance in Escherichia coli, Mol Syst Biol 6, 449.

87. Reyes, L. H., Almario, M. P., and Kao, К. C. (2011) Genomic library screens for genes involved in n-butanol tolerance in Escherichia coli, PLoS One 6, el7678.

88. Миллер, Д. (1979) Эксперименты в молекулярной генетике, Мир.

89. Osipov, G. A., Parfenov, A. I., and Bogomolov, Р. О. (2001) Comparative study of chromatography-mass spectrography of microorganism's chemical markers in blood and intestinal mucosa bioptats., Ross Gastroenterol Zh, 5469.

90. Sambrook, J., E.F., F., and Т., M. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual 2nd ed ed., Cold Spring Harbor Lab, New York.

91. Datsenko, K. A., and Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc Natl AcadSci USA 97, 6640-6645.

92. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467.

93. Horton, С. E., and Bennett, G. N. (2006) Ester production in E. coli and C. acetobutylicum, Enzyme and Microbial Technology 38, 368-376.

94. Nunn, W. D., Giffin, K., Clark, D., and Cronan, J. E., Jr. (1983) Role for fadR in unsaturated fatty acid biosynthesis in Escherichia coli, J Bacteriol 154, 554-560.

95. Salanitro, J. P., and Wegener, W. S. (1971) Growth of Escherichia coli on short-chain fatty acids: nature of the uptake system, J Bacteriol 108, 893901.

96. Vanderwinkel, E., Furmanski, P., Reeves, H. C., and Ajl, S. J. (1968) Growth of Escherichia coli on fatty acids: requirement for coenzyme A transferase activity, Biochem Biophys Res Commun 33, 902-908.

97. Kaga, N., Umitsuki, G., Clark, D. P., Nagai, K., and Wachi, M. (2002) Extensive overproduction of the AdhE protein by rng mutations depends on mutations in the era gene or in the Cra-box of the adhE promoter, Biochem Biophys Res Commun 295, 92-97.

98. Lutz, R., and Bujard, H. (1997) Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Il-I2 regulatory elements, Nucleic Acids Res 25, 1203-1210.

99. Causey, T. B., Shanmugam, K. T., Yomano, L. P., and Ingram, L. O. (2004) Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate, Proc Natl Acad Sei USA 101, 2235-2240.

100. Eiteman, M. A., and Altman, E. (2006) Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations, Trends Biotechnol 24, 530-536.

101. Hiraoka, S., Matsuzaki, H., and Shibuya, I. (1993) Active increase in cardiolipin synthesis in the stationary growth phase and its physiological significance in Escherichia coli, FEBS Lett 336, 221-224.

102. Asako, H., Nakajima, H., Kobayashi, K., Kobayashi, M., and Aono, R. (1997) Organic solvent tolerance and antibiotic resistance increased by overexpression of marA in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 63, 1428-1433.

103. Hayashi, S., Aono, R., Hanai, T., Mori, H., Kobayashi, T., and Honda, H. (2003) Analysis of organic solvent tolerance in Escherichia coli using gene expression profiles from DNA microarrays, J Biosci Bioeng 95, 379-383.

104. Nikaido, H. (2003) Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited, Microbiol Mol Biol Rev 67, 593-656.

105. Farr, S. B., and Kogoma, T. (1991) Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Microbiol Rev 55, 561-585.

106. Trent, M. S. (2004) Biosynthesis, transport, and modification of lipid A, Biochem Cell Biol 82, 71-86.

107. Zhu, K., Zhang, Y. M., and Rock, C. O. (2009) Transcriptional regulation of membrane lipid homeostasis in Escherichia coli, J Biol Chem 284, 3488034888.

108. Ames, G. F., Spudich, E. N., and Nikaido, H. (1974) Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhimurium: effect of lipopolysaccharide mutations, JBacteriol 117, 406-416.

109. Koplow, J., and Goldfine, H. (1974) Alterations in the outer membrane of the cell envelope of heptose-deficient mutants of Escherichia coli, J Bacteriol 117, 527-543.

110. Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria, Microbiol Rev 57, 655-682.

111. Lugtenberg, B., Peters, R., Bernheimer, H., and Berendsen, W. (1976) Influence of cultural conditions and mutations on the composition of the outer membrane proteins of Escherichia coli, Mol Gen Genet 147, 251-262.

112. Ensign, S. A. (2006) Revisiting the glyoxylate cycle: alternate pathways for microbial acetate assimilation, Mol Microbiol 61, 274-276.

113. Kim, Y., Ingram, L. O., and Shanmugam, K. T. (2007) Construction of an Escherichia coli K-12 mutant for homoethanologenic fermentation of glucose or xylose without foreign genes, Appl Environ Microbiol 73, 17661771.

114. Bermejo, L. L., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (1998) Expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 genes in Escherichia coli for acetone production and acetate detoxification, Appl Environ Microbiol 64, 10791085.

115. Kidwell, J., Valentin, H. E., and Dennis, D. (1995) Regulated expression of the Alcaligenes eutrophus pha biosynthesis genes in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 61, 1391-1398.

116. Sato, S., Nomura, C. T., Abe, H., Doi, Y., and Tsuge, T. (2007) Poly(R)-3-hydroxybutyrate. formation in Escherichia coli from glucose through an enoyl-CoA hydratase-mediated pathway, JBiosci Bioeng 103, 38-44.

117. Dellomonaco, C., Clomburg, J. M., Miller, E. N., and Gonzalez, R. (2011) Engineered reversal of the beta-oxidation cycle for the synthesis of fuels and chemicals, Nature 476, 355-359.

118. Bond-Watts, B. B., Bellerose, R. J., and Chang, M. C. (2011) Enzyme mechanism as a kinetic control element for designing synthetic biofuel pathways, Nat Chem Biol 7, 222-227.

119. Forst, S., and Inouye, M. (1988) Environmentally regulated gene expression for membrane proteins in Escherichia coli, Annu Rev Cell Biol 4, 21-42.

Информация о работе

Серегина, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы