Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств"

На правах рукописи

Усачёв Евгений Валерьевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ.

03.00.03.-молекулярная биология ОЗ.ОО.Об.-вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской Академии Медицинских наук

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Алексей Геннадьевич Прилипов Доктор биологических наук, профессор Светлана Сергеевна Ямншсова

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович Доктор ветеринарных наук, профессор

Владимир Иванович Смоленский

Ведущая организация:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится « 5 » декабря 2005 г. в часов на заседании

диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан « 3 » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

Доктор медицинских наук Н. П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) широко распространен в различных регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в список наиболее важных патогенов. Несмотря на проведение повсеместной вакцююпрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием промышленного птицеводства это заболевание приобрело панзоотический характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную роль в этом процессе сыграл широкий международный обмен высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета эпизоотической ситуации в конкретных странах (Sonoda et al., 2000, Yu et al., 2001).

Вирус болезни Ньюкасла является оболочечным со спиральным строением нуклеокапсида. Геном вируса представляет собой однонитевую РНК негативной полярности протяжённостью более 1,5x104 н.о. и содержит шесть последовательно расположенных генов, кодирующих белки NP (нуклеопротеин), Р (фосфопротеин), М (матриксный белок), F (белок слияния), HN (гемагглютинин-нейраминидазу) и L (РЖ-зависимую РНК-полимеразу).

Стремительное накопление экспериментальных данных показывает

огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий

момент не существует общепринятой системы классификации вируса в

пределах рода Avulavirus (Mayo, 2002). Среди наиболее известных систем

классификации ВБН выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По

классификации, предложенной авторами Lomniczi et al. (1998), Alexander et al.

(1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al. (2001), Yu et al. (2001), Liang et al.

(2002) существует восемь основных линий (I-VIII). Другая система,

предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести

ОСНОВНЫХ ЛИНИЙ 1-6. В данной ряблте ппя у?тянпигтрнна . ГвНОТИПОВОЙ

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ i БИБЛИОТЕКА I

SFfSfr^

___

принадлежности исследованных штаммов ВБН мы основывались на второй системе классификации.

Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного числа штаммов ВБН по всему миру и определены основные генотипы, остаётся неясным вопрос - какие генотипы ВБН представлены на территории России и сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту написания работы в базе данных вепВапк были представлены частичные нуклеотидные последовательности гена Б только четырёх представителей субтипов За, ЗЬ и 4а, выделенных с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы (Грибанов с соавт., 1999; Манин с соавт., 2002). Однако совершенно не изучено разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких птиц.

Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны несколько ОТ-ПЦР систем. В основном, все они основаны на амплификации участка гена Р или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала (в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, из-за недостатка данных по распространению генотипов ВБН на территории России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для детекции РНК вируса БН, адаптированную к вариантам вируса, циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему выявления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим использованием амплифицированных фрагментов ДНК для секвенирования и выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с ранее известными.

Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту

такие данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных государств, отсутствуют. Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилась генетическая характеристика вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а также определение первичной структуры генома варианта вируса БН, наиболее распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести определение первичной структуры гена F или его участка "культуральных" штаммов вируса БН (всего 59), выделенных на территории России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.

2. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных GenBank.

3. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в 2004 г.

4. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных GenBank, с помощью филогенетического анализа.

5. Определить первичную структуру полную генома российского штамма Sterna/Astrakhan/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.

6. Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена F (374 н.о.) и результатов генотипирования по практически полному геному.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса БН.

2. Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.

3. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1,2, а также субтипам За, 5Ь и 5с1.

4. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5(1, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 -лентогенному характеру патогенности.

5. Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5Ь, 5с1 и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств.

6. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм 81ета/Ав1гакЬап/2755/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.

7. Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о. от начала открытой рамки считывания белка Р - по классификации А1ёош с соавт., 2003) и результатов генотипирования по практически полному геному показал высокую степень их корреляции (К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена Б

(374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени.

2. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена F (374 н.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 5d.

3. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц.

4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БН, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма Sterna/Astrakhan/2755/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.

5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена F и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена F (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (29.09.05).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (121 источник), содержит 8 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исследуемого материала были использованы штаммы ВБН, выделенные на территории России (11) и Казахстана (44), а также четыре штамма из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, изолированные на территории Украины и Белоруссии от домашней птицы.

Штаммы из России, исследованные в данной работе, были изолированы в Костромской обл., Астраханской обл. и в Приморском крае, как от диких (10), так и от домашних птиц (1). Штаммы, выделенные в Казахстане, были изолированы от домашних птиц за период с 1988-2004 гг. на территории Алматинской, Жамбылской и ТалдыкорганскоЙ областей.

Также в работе были исследованы 182 образца полевого материала (клоакальные смывы птиц) собранные на юге Приморского края в 2004 г. от диких (142) и домашних птиц (40).

Последовательность олигонуклеотидных праймеров подбиралась с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США) с использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВБН, доступных в базе данных GeneBank. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI

PRISM 3100, США). Для построения алайментов использовали пакет программ DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США). Построение филогенетических деревьев осуществляли на основе двух алгоритмов: "ближайшего соседа" или "UPGMA" в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 2.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах

Одной из задач данной работы было создание детекционной ОТ-ПЦР тест-системы для обнаружения геномной РНК вируса БН, совмещённой с определением генотиповой принадлежности ПЦР-положительных образцов на основе сюсвенса амплифицируемых фрагментов ДНК.

Для синтеза на матрице вирусной РНК комплиментарной ДНК был подобран праймер 614F. Место посадки этого праймера расположено в районе З'-конца гена М (рис. 1А). Для детекции вируса БН в пробах полевого материала с очень низким содержанием вирусной РНК применялся вариант "гнездовой" ПЦР: внешняя пара праймеров 614F/1356R (рис. 1С); внутренняя пара 1045F/601R (рис. 1D). Для амплификации фрагментов ДНК культуральных штаммов ВБН с целью их дальнейшего генотипирования применялся однораундовый или "полу-гнездовой" варианты ПЦР в зависимости от концентрации вирусной РНК в пробе. Однораундовый вариант ПЦР проводили с участием пары 614F/3232R (рис. 1В). В "полу-гнездовом" варианте ПЦР использовали пары праймеров: внешняя 614F/3232R (рис. 1В) и внутренняя пара 614F/1356R (рис. 1С).

Разработанная ОТ-ПЦР система была протестирована на культуральных штаммах вируса БН, а также образцах полевого материала (Приморский край, 2004 г.). Важно отметить, что в нашем распоряжении не было штаммов всех известных шести генотипов вируса БН (APMV-1) и штаммов других

парамиксовирусов птиц (АРМУ-2 - АРМУ-9), ввиду чего, не было возможности проверить универсальность и специфичность ОТ-ПЦР системы.

Однако, при анализе первичной структуры генома ранее охарактеризованных штаммов (вепБапк), можно сделать заключение о возможности использования предложенной нами ОТ-ПЦР системы для обнаружения всех известных к настоящему времени генотипов вируса БН в пределах рода Ауи1аутз.

геномная РНК

н Мд*пе | 1 ныд«м

А синтез кДНК

В ат*> 1-ы* раунд ПЦР 3239

С «иг 19ИВ 2-ой раунд ПЦР дпмфм 1-ый раунд

0 юп детекция 2-о* раунд ПЦР

ШШЯф^ АОНШ

1МЖ

^■^ЧМР' сехаакированне

мяк

Рисунок 1. Схематическое изображение ОТ-ПЦР тест-системы ВБН для проб с высоким и низким содержанием вируса (см. в тексте), а также стратегии секвенирования. А-Б - стадии ОТ-ПЦР тест системы. Е - стадия секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК. Стрелками обозначены направления олигонуклеотидных праймеров.

2. Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств 2.1. Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии

Вирусы, изолированные в Астраханской области

На основе филогенетического анализа по участку гена Б (по системе, предложенной АМоив с соавторами в 2003 г.) штаммы ВБН, изолированные в

Астраханской обл. в 2001 г., были отнесены нами к субтипу 5Ь (рис. 2) в составе европейского кластера. Исследуемые астраханские штаммы были выделены от диких птиц, являющихся основным резервуаром ВБН. По-видимому, циркуляция именно этого генотипа определяет современную эпизоотическую ситуацию на территории северо-западного Прикаспия. Вирусы, изолированные на территории Украины, Белорусии и Костромской области России

Для штаммов СЫскепЖлеуЛ 033/83, СЫскеп/Юеу/2082/83, Е)иск/икгате/376/87, СЫскеп/Ве1агш/1/86 и Оиск/Коз1г/25/86 была определена нуклеотидная последовательность целого гена Б (порядка 1700 и.о.). Филогенетический анализ этих штаммов по участку гена Р показал, что "украинские" штаммы принадлежат к второму генотипу, а штаммы из Белоруссии и Костромской области к первому (рис. 2). Нами было установлено, что штаммы СЫскеп/Ве1агиз/1/86 и Оиск/КоБй725/86 в пределах первого генотипа входят в состав западноевропейского кластера. Штаммы, изолированные в Приморском крае в 2001-2002 гг.

Для штаммов Оиск/РагЕаз1/2713/2001, Оиск/РагЕаз1/2686/2001, Шск/БагЕазг/2687/2001, Апаз/РагЕаз1/3658/2002, Апаз/РагЕаБУЗ638/2002 и Апаз/РагЕаэ^З652/2002, выделенных от диких птиц в Приморском крае в 20012002 гг., была определена нуклеотидная последовательность целого гена Р. На основе филогенетического анализа по участку гена Р эти штаммы были отнесены к первому генотипу. Следует отметить, что приморские штаммы вошли также как, и штаммы СЫскеп/Ве1агиз/1/86 и Е>иск/Козгг/25/86, в западноевропейский кластер.

2.2. Анализ штаммов ВБН, изолированных от домашних птиц в Казахстане в 1988-2004 гг.

Для штаммов ВБН, изолированных в птицеводческих хозяйствах Казахстана с 1988 по 2004 гг., была определена нуклеотидная последовательность протяжённостью 1083 и.о., охватывающая участок гена М

(100 а.о., С-конец белка М), расстояние между кодирующими последовательностями генов М и V и начало гена Р (206 а.о., №конец белка Р). Пятнадцать штаммов 1998 года, два штамма 2000 г. и три штамма 2001 г. были отнесены к субтипу 5Ь. Пять штаммов 2003 г. и столько же 2004 г. отнесены к субтипу 5с!. Десять штаммов более ранних лет изоляции отнесены к первому генотипу (1988 г. - 2 штамма, 1989 г. - 3 штамма и 1998 г. - 5 штаммов). Три штамма, выделенные в Жамбылской области (1 - 1988 г. и 2 - 1990 г.) были отнесены к субтипу За. Один штамм 2001 г. ПМВ-1/курица/Алматы/93/01 принадлежал к второму генотипу (рис. 2). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участка гена Р казахстанских штаммов в пределах субтипа 5Ь показал, что штаммы 1998-2001 гг. входят в состав европейского кластера. Штаммы, вошедшие в первый генотип, оказались генетически однородными и наиболее близкими к ранним изолятам: СЫскеп/Ве1аги!з/1/86 и Шск/Коз1г/25/86, принадлежащим к штаммам западноевропейского кластера. Исследуемые в данной работе "казахстанские" штаммы 2003-2004гг., по-видимому, образуют собственный кластер в пределах субтипа 5«1. Три казахстанских штамма, отнесённые к субтипу За, оказались наиболее близкими к штаммам ГАМ-61, \iukteswar и сингапурским штаммам -БССК99062 и -8(}СК99061 1999 г. Непатогенные или слабопатогенные варианты ВБН к настоящему времени в составе субтипов 5Ь и 5(1 не описаны.

Исходя из этого, можно предположить, что циркуляция высокопатогенных штаммов субтипов 5Ь и 5с) определяет современную эпизоотическую ситуацию на территории Казахстана. По-видимому, за последние 3-4 года произошла смена вариантов вируса БН субтипа 5Ь на субтип 5с1.

ПМВ> 1/курим/Алм*ты/2ДО8 ПМВ-1/куряца/Алияты/24/98 ПМВ-1/куряца/Алматы/26ДО ПМВ-1/куряца/Алматы/28Л> ПМВ-1/куряияМлматы/30/98 ПМВ-1/курш1а/Ал»шты/31/98 ПМВ-1/курти/Алматы/32/98 ПМВ-1/курица/Алиаты/34/98 ПМВ-1/курица/Алиаты/ЗбОД ПМВ-1/курши/Алшты/37/98 ПМВ-1/курнца/Алматы/38/98 ПМВ-1/куряця/Ал»Иты/39/98 ПМВ*1/куряпа/Алиаты/42/98 ПМВ-1/куриц1/Алыаты/43/98 ПМВ-1/куряца/Алмяты/52/98 ПМВ-1Леуряца/Алматы/55/00 ПМВ-1/куряца/Алматы/61/00 ПМВ-1/кур»па/Ко«ыр/ШЛ11 ПМВ-1/куриид/Коиыр/127/01 ПМВ-1/курпп/Ктыр/12М1

Sttrna/Ajtrakhin/2755/2001 Stcrna/AstraUiaa/2758/2001 CorBorant/AitrakJiaa/2751/200I Coot/Ailr.khin/2743/2001

ПМВ-1/курии«/1'аллыкорг«н/341Л)3 ПМВ-1/курнца/Гадаыкорга11/342Л}3 ПМВ-1/курнца/Галдыкоргян/343/03 ПМВ-1/курни1/Галдыкорг»н/344/03 ПМ1Ы/куряЦя/Талды1соргЯ11/34£Л)3 ПМВ-1/курнца/Алматы/540/О4 ПМВ-1/курнца/Алиаты/541/04 ПМВ-1/курнпа/Алматы/542/04 ПМВ-1/куряш/Алматы/ЯЗЛМ ПМВ-икурта/Ллжггы/MS/M

ПМВ-1/курица/Алматы/352/88 ПМВ-1/индюк/Жамбш1/536/90 ПМВ-1/курица/Жамбыл/353/90

Chiclien/Kiev/Í033/83 Chickeo/Kiev/2082/83 Oack/lfkraiBe/376/87 ПМИ/курица/АлматыЛЗЛП

Duck/FarEait/2713/2001 Diclc/FarEaft/2686/2001 DHck/FarEast/2687/2001 Aaaa/Far£Mt/3658/2002 Anaj/FarEast/3638/2002 Anai/FarEalt/3«52/M02

ПМВ-1/куряца/Алм*ты/244/88 ПМВ-1/куряца/Алматы/345/88 ПМВ- 1/кур*ца/Алматы/449/89 ПМВ-1/куряоа/Алматы/462/89 ПМВО/курнца/Ал маты/469/89 ПМВ- 1/куряца/Алм«ты/29Л8 ПМВ-1/курноа/Алматы/33/98 ПМВ-1/курица/Алматы/35/98 ПМВ-1/курица/Алматы/47/98 ПМВ-1/курнца/АстЯна/51/98 Chfcken/Bclanu/I/86 Dnclt/Koitr/25/М

Рисунок 2. Генотиповая принадлежность исследованных штаммов (в прямоугольниках). Овалами обозначены генетические группы. Генотипы обозначены цифрами от 1 до 6, а субтипы буквами от а до е. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей участка гена F длиной 374 н.о. проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 2,1).

3. Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких и домашних птиц в Приморском крае в

2004 г.

Полевой материал, собранный в Приморском крае в 2004 г., был исследован с помощью созданной ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК ВБН непосредственно в клоакальных смывах. Общая зараженность ВБН

диких птиц составила 7 /142 « 4.9 %. Общая зараженность домашних птиц -1 / 40 = 2.5 %. На основе филогенетического анализа по участку гена Р два образца из восьми положительных были нами отнесены к 1-му генотипу, один - к субтипу За, пять - к субтипу 5Ь.

Образцы, содержащие РНК ВБН первого генотипа (Ргш04-61-Р и Ргт04-64-Р), оказались генетически однородными и наиболее близкими к ранее описанным "казахстанским" штаммам первого генотипа, принадлежащим к штаммам западноевропейского кластера.

Анализ нуклеотидных последовательностей изолятов Ргш04-14-Р, Ргш04-22-Р, Ргт04-83-Р, Ргт04-94-Р и Ргт04-169-Р, отнесённых к субтипу 5Ь, показал, что первые четыре образца ближе всего к штаммам Казахстана 1998 г., входящим в состав европейского кластера. Последний образец также вошёл в европейский кластер, но в составе группы из "казахстанских" штаммов (2000 и 2001 гг.) и "астраханских" штаммов 2001 г.

Единственный образец Ргт04-129-Р, отнесённый к субтипу За, оказался наиболее близок к штаммам ПМВ-1/курица/Алматы/352/88, ПМВ-1/индюк/Жамбыл/536/90 и ПМВ-1/курица/Жамбыл/553/90, изолированным в Казахстане.

4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых изолятов ВБН в пределах генетических групп

Генотип 1.

Сравнение исследованных штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов, отнесённых к первому генотипу, с ранее описанными штаммами этого же генотипа по участку гена Р, позволило установить их более детальную дифференциацию. Исследованные штаммы Виск/Козгг/25/86 и СЫскеп/Ве1агиз/1/86, изоляты из Казахстана 1988-1998 гг., а также изоляты Приморского края (2004 г.) Ргт04-61-Р и Ргт04-64-Р образовали довольно однородную группу, удалённую от группы штаммов Приморского края 20012002 гг., в пределах западноевропейского кластера первого генотипа.

Установлено, что в популяциях диких птиц Приморского края циркулируют штаммы ВБН первого генотипа, по меньшей мере, двух вариантов. Генотип 2.

В пределах генотипа 2 рядом авторов выделяется четыре чётких кластера штаммов ВБН (Alexander, 2000; Давыдкин с соавт., 2001). Два из них -кластеры вакцинных штаммов, родоначальником первого является штамм LaSota, а второго - В1. Третий кластер представляют штаммы с велогенным и мезогенным характером патогенности. Четвёртый кластер составляют всего три штамма евразийского континента с лентогенным характером патогенности.

Из исследованных в данной работе штаммов к генотипу 2 нами были отнесены три штамма с Украины 1980-х гг. и один штамм Казахстана 1991 г., выделенные от домашней птицы. Более детальный анализ нуклеотидных последовательностей гена F или его участка позволил сделать вывод, что исследованные штаммы являются вариантами вакцинного штамма LaSota, широко применяющегося в птицеводческих хозяйствах и входят в состав кластера вакцинных штаммов ряда LaSota. Следует также отметить, что нами не были обнаружены варианты вакцинных штаммов второго генотипа в популяциях диких птиц, что, по-видимому, свидетельствует о низкой эффективности трансмиссии этих штаммов от дикой к домашней птице. Субтип За.

Субтип За составляют штаммы мезогенного и велогенного патотипов. Некоторые мезогенные штаммы этой группы используются в качестве вакцинных в птицеводческих хозяйствах. Исследованные штаммы и образцы (ПМВ-1 /индюк/Жамбыл/536/90, ПМВ-1/курица/Жамбыл/553/90, ПМВ-1/курица/Алматы/З52/88 и Prm04-129-P), отнесённые к этому субтипу, оказались наиболее близкими к сингапурским штаммам -SGCK99062 и -SGCK99061, а также к вакцинным аттенуированным штаммам Mukteswar (BINLA40166) и ГАМ-61. Можно предположить, что исследованные штаммы Казахстана и один из изолятов Приморского края 2004 г. могут быть

вариантами вакцинного штамма или эндемичными штаммами обследованных регионов. Отсутствие сведений об использовании вакцинных вариантов вируса БН в этих регионах не позволяет сделать заключение о возможности интродукции вакцинного варианта вируса субтипа За в популяции диких птиц. Субгип 5Ь.

Анализ исследованных штаммов ВБН и "ОТ-ПЦР положительных" образцов, отнесённых к субтипу 5Ь по участку гена И, позволил установить их более детальную классификацию в пределах генотипа. Рядом авторов субтип 5Ь считается генетически гетерогенным, и в его пределах выделяются четыре различных кластера (АЫош й а1., 2003). Первый кластер, состоит в основном из штаммов ВБН, изолированных в Европе в середине 1990-х гг. Второй кластер представлен штаммами, выделенными на африканском континенте также в середине 1990-х гг. Третий кластер (самый малочисленный) состоит из трёх португальских изолятов и одного болгарского (1993-1998 гг.). Четвёртый кластер представлен неклассифицированными (возможно

кластерообразующими) штаммами различного географического происхождения (Азия, Южная Америка и Европа) и сроком выделения с 1982 по 1994 г.

Исследованные штаммы ВБН и изоляты, отнесённые нами к субтипу 5Ь, вошедшие в состав европейского кластера, можно разделить на две отдельные генетические группы. В первую группу попали штаммы Казахстана 2000 и 2001 гг., штаммы Астраханской обл. 2001 г. и один ПЦР-положительный образец Приморского края 2004 г. Во вторую группу вошли казахстанские штаммы 1998 г. и четыре варианта вируса из Приморского края 2004 г.

Установлено, что в популяциях диких птиц Приморского края в 2004 г. циркулировали штаммы ВБН субтипа 5Ь, по меньшей мере, двух вариантов. Штаммы ВБН двух вариантов субтипа 5Ь были также изолированы на территории Казахстана во время эпизоотий с 1998 по 2001 гг.

Учитывая то обстоятельство, что на территории Казахстана в 1998 г. преобладали варианты вируса второй группы, а в 2000-2001 гг. варианты первой группы субтипа 5Ь, можно предположить, что в период с 1998 г. по 2000

г. произошла смена вариантов вируса БН субтипа 5Ь, циркулирующего среди домашней птицы на территории Казахстана. Субтип 5(1.

В состав субтипа 5с1 входят штаммы ВБН, изолированные в азиатской части Евразийского континента, и их разделяют на два кластера. В первый кластер входят штаммы, преимущественно выделенные в Тайване в период с 1998 г. по настоящий момент. Второй кластер составляют штаммы, изолированные в Китае и Средней Азии (АМоив Л а1., 2003).

Среди изученных нами к субтипу 5(1 были отнесены только казахстанские штаммы 2003 и 2004 гг. При построении филогенетического древа данные штаммы образовали отдельную ветвь, практически равноудалённую от ветвей двух ранее описанных кластеров этого субтипа. На основании этого можно предположить, что казахстанские штаммы образуют свой самостоятельный генетический кластер.

Исходя из представленных выше данных можно сделать вывод, что в период с 1998 г. по 2000 г. произошла смена вариантов вируса БН второй группы субтипа 5Ь на варианты вируса первой группы, а с 2001 г. по 2003 г. в популяции ВБН произошла интродукция вариантов нового кластера субтипа 5(1. Таким образом, совместная циркуляция штаммов ВБН субтипов 5Ь и 5<1 будет определять современную эпизоотическую ситуацию в Казахстане и на сопредельных территориях.

5. Анализ сайта расщепления белка Р исследуемых изолятов ВБН

Протеолитическое нарезание бежа Р0 является неотъемлемой и важной частью жизненного цикла вируса БН. Нарезание белка Р0 приводит к его активации (проявлению биологической активности), необходимой в процессе слияния вирусной и клеточной мембран. Как полагают, эффективность протеолиза белка Ро, опосредованная аминокислотной последовательностью сайта нарезания, является одним из главных маркеров инфекционности и патогенности вируса БН. Низкопатогенные и некоторые вакцинные штаммы

ВБН имеют следующую аминокислотную последовательность сайта расщепления F-протеина: 109SGGG(R/K)QGRLIG119, в то время как высокопатогенные штаммы содержат последовательность

109SGGRRQ(K/R)RF(V/I)G 119. Последняя включает пару основных аминокислот в положениях 115 и 116, фенилаланин в позиции 117 и аргинин в позиции 113, что обеспечивает эффективность расщепления клеточными протеазами и модулирует вирулентность на молекулярном уровне. Анализ аминокислотных последовательностей сайта протеолитического расщепления белка F исследованных изолятов позволил предположить, что все обследованные варианты ВБН 1-го и 2-го генотипов слабопатогенны и имеют последовательность сайта нарезания белка F0 [SGGG(K/R)QGRL1G], а вирусы субтипов За, 5Ь и 5d - высокопатогенны и содержат последовательность [SGGRRQRRFIG]. При этом необходимо отметить, что штаммы различной степени патогенности встречаются как у домашней, так и у дикой птицы.

б. Анализ первичной структуры полного генома штамма ВБН Sterna/Astrakhan/2755/2001

К началу проведения данной работы было известно 27 полноразмерных последовательностей вирусного генома ВБН, представителей генотипов 1, 2 и субтипов ЗЬ, Зс, 4а, 4Ь, 5а и 5d. В процессе выполнения данной работы стали известны ещё три последовательности практически полного генома представителей генотипа 6. Также нужно отметить, что в базе данных не было представлено ни одной полноразмерной нуклеотидной последовательности генома вируса, выделенного на территории России.

Для определения полной нуклеотидной последовательности генома был выбран штамм Sterna/Astrakhan/2755/2001. Принадлежность этого штамма к субтипу 5Ь по участку гена F была установлена нами ранее, что облегчило дальнейшую стратегию подбора праймеров для проведения реакций ОТ, ПЦР и секвенирования фрагментов генома. После реакций ОТ-ПЦР были получены три перекрывающихся фрагмента ДНК, составляющие вирусный геном.

Полученные фрагменты ДНК были использованы для определения полной нуклеотидной последовательности генома исследуемого штамма. Определённая нами нуклеотидная последовательность генома штамма 81егпа/АБ1гакЬап/2755/2001 длиной 15154 н.о. (без 39 3'-концевых н.о.) была депонирована в базе данных СепВапк (АУ865652).

Реальная картина филогенетических взаимоотношений изучаемых штаммов ВБН возможна лишь при анализе нуклеотидных последовательностей полного генома всех существующих вариантов вируса. Однако определение последовательности полного генома вируса является очень трудоёмким и дорогостоящим процессом. Поэтому исследователями для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса используются последовательности различных участков генома, так или иначе отображающих реальную картину филогении вируса. В связи с этим, нами была предпринята попытка сравнения результатов филогенетического анализа по практически полноразмерным последовательностям генома и аналогичного анализа по участку гена Р (374 и.о., согласно классификации АЫоив с соавторами, 2003 г.). Сравнение данных этих анализов по разным фрагментам генома показало их высокую степень корреляции (К=0,98), что позволяет сделать заключение о правомерности использования данного участка гена Р для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода и внутри основных генетических линий.

На основании анализа первичной структуры генома исследованного штамма 81егпа/АБ1:гакЬап/2755/2001 и штаммов с известными биологическими свойствами, а также молекулярно-генетических признаков патогенности (аминокислотный состав вирусных белков, последовательность сайта протеолитической активации белка Р0 и белка НИ, кратность геномной РЖ шести нуклеотидным остаткам, наличие биологически активного белка V) был установлен его велогенный характер патогенности.

Chickcn/N Ireland/!);

Isolate I-2progeri1or I»lMtl-2

Mixed species/U S7LBrgo^71

Anhmga/U S (FI)/44083/93

isolate 99-0655 bótale 99-1435 Isolate 99-0868k> Isolate 99-0868hi Isolate 99-1997PR-32 Isolate 91-1252 Isolate 02-1334 Isolate 98-1154 Isolate 98-1249 Isolate 01-1108

Ош*/1Ш154979-1/2001 Duct/US Л19535-1/2001 Chidcen/U S./101250-2/2001

Gamefowl/U S (САУ211472/02

Dove/Italy/273é/00

Chicken/US (CAyi083(Fontanay72

Stema/AstfBkhajt/2755/2001

Coclcatoo/Indonesia/14698/90

a

SOS

Рисунок 3. Филогенетическое древо штаммов с известным полным геномом. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей длиной 11902 н.о. проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 2.1). Разделение на генотипы и субтипы по участку гена F, основанное на системе Aldous с соавторами 2003 г.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что разработанный лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы является эффективным для детекции геномной РНК вируса болезни Ньюкасла (ВБН) разных генотипов в биологических образцах, включая полевые. С помощью разработанной системы, на основании анализа 59

штаммов ВБН, выделенных в различных географических регионах (Россия, Казахстан, Белоруссия и Украина) от домашних и диких птиц, были выявлены четыре из шести известных к настоящему времени генотипов.

2. Определена первичная структура участка гена Р (374 н.о.) для 67 изученных вариантов ВБН и выявлено генетическое разнообразие вирусов (генотипы 1, 2, 3 и 5), циркулировавших на территории России и сопредельных государств в период с 1983 по 2004 г.

3. На основе филогенетического анализа по участку гена Р установлена генотиповая принадлежность вирусов БН, циркулировавших в популяциях диких птиц на территории России: в Астраханской обл. выявлены представители субтипа 5Ь, в то время как в Приморском крае России обнаружены варианты вируса первого генотипа и субтипов За и 5Ь.

4. Установлено, что среди домашней птицы на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. циркулировали штаммы вируса БН генотипов 1 и 2, а также субтипов За, 5Ь и5ё.

5. Выявлены различия в аминокислотных последовательностях сайта протеолитической активации белка Р0 у исследованных вариантов ВБН разных генотипов. Последовательность [8СЮО(К/К)(Х}К1ЛО] вариантов вируса БН генотипов 1 и 2 соответствует лентогенному (слабопатогенному) характеру патогенности, тогда как последовательность [8СХ5Ш101и1РЮ] субтипов За, 5Ь и 5(1 ВБН характерна для велогенных (высокопатогенных) штаммов.

6. Впервые определена первичная структура генома (>1,5x104 н.о.) российского велогенного штамма ВБН 81егпа/Аз1гакЪап/2755/2001. Отсутствие данных о полной нуклеотидной последовательности генома других представителей субтипа 5Ь позволяет рассматривать его в качестве прототипного для этого субтипа.

7. На основе выявленной высокой степени корреляции данных филогенетического анализа по участку гена Р (374 н.о.) и данных

аналогичного анализа по фрагменту генома протяженностью II902 и.о. (К=0,98), сделано заключение о правомерном использовании указанной части гена F для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.

Список работ по теме диссертации.

1. Bogoyavlenskiy A., Berezin V., Prilipov A., Usachev Е., Lyapina О., Levandovskaya S., Korotetskiy I., Tolmacheva V., Makhmudova N., Khudyakova S., Tustikbaeva G., Zaitseva I., Omirtaeva E., Ermakova O., Daulbaeva K., Asanova S., Kydyrmanov A., Sayatov M., King D. Molecular Characterization of Virulent Newcastle Disease Virus Isolates from Chickens during the 19988 NDV Outbreak in Kazakhstan. // Virus Genes. - 2005. - V.31. - P. 13-20.

2. E.B. Усачёв, И.Т. Федякина, М.Ю. Щелканов, Д.Н. Львов, А.Г. Прилипов, С.С. Ямникова. Молекулярно-генетическая характеристика вируса болезни ньюкасла Sterna/Astrakhan/2755/2001 изолированного в России // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. - 2006. - №1. - в печати.

3. Bogoyavlenskiy A., Berezin V., Prilipov A., Usachev Е., Lyapina О., Levandovskaya S., Korotetskiy I., Tolmacheva V., Makhmudova N., Khudyakova S., Tustikbaeva G., Zaitseva I., Omirtaeva E., Ermakova O., Daulbaeva K., Asanova S., Kydyrmanov A., Sayatov M., King D. Частичные нуклеотидные последовательности гена F штаммов ВБН, депонированные в GenBank. AY847361, AY847360, AY847359, AY847358, AY847357, AY847356, AY847355, AY847354, AY847353, AY847352.

4. Usachev E.V. and Prilipov A.G. Нуклеотидные последовательности целого гена F штаммов ВБН, депонированные в GenBank. AY965079, AY965078, AY965077, AY972103, AY972102, AY972101.

л

1Р21 560

РНБ Русский фонд

2006-4 21992

Заказ №571. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Усачев, Евгений Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ф 1.1. Классификация возбудителя.

1.2. Молекулярно-биологическая характеристика вируса болезни Ньюкасла.

1.2.1. Структура вириона.

1.2.2. Геном вируса и кодируемые им белки.

1.2.2.1. ИР - нуклеокапсидный белок.

1.2.2. 2. Белки, кодируемые геном Р.

1.2.2.2.а. Фосфопротеин (Р). ф 1.2.2.2.Ъ. Белки

1.2.2.3. Белок М.

1.2.2.4. Белок Б.

1.2.2.5. Белок НЫ.

1.2.2.6. Белок Ь.

1.2.3. Протеолитическая активация белка слияния.

1.2.4. Адсорбция и проникновение вируса в клетку.

1.2.5. Репликация генома вируса БН.

1.2.6. Транскрипция мРНК вируса БН.

1.2.7. Сборка вирионов вируса БН. ф 1.3. Молекулярно-генетические основы патогенности вируса болезни

Ньюкасла.

1.4. Детекция и типирование штаммов ВБН.

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Анализируемые штаммы из базы данных ОепВапк.

2.2. Исследуемые штаммы.

2.3. Места сбора и объем полевых материалов в Приморском крае в * 2004 г.

2.4. Олигонуклеотиды использованные в экспериментах.

2.5. Выделение РНК.

2.6. Реакция обратной транскрипции (ОТ).

2.7. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.8. Определение 5'-концевой последовательности геномной РНК.

2.9. Электрофорез ДЕК.

2.10. Приготовления ДНК для секвенирования.

2.11. Секвенирование ДНК.

2.12. Построение алайментов и филогенетический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах.

3.2. Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств.

3.2.1. Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии.

3.2.2. Анализ штаммов ВБН, изолированных от сельскохозяйственных птиц в Казахстане в 1988-2004 гг.

3.3. Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких птиц и домашних в Приморском крае в 2004 г.

3.4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов в пределах генетических групп.

3.5. Анализ сайта расщепления белка F исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов.

3.6. Анализ полного генома штамма ВБН Sterna/Astrakhan/2755/2001.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств"

Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) или APMV-1 (Avian Paramyxovirus 1) принадлежит к семейству парамиксовирусов (Paramyxoviridae), подсемейству Paramyxovirinae, роду Avulavirus [70,71]. Семейство парамиксовирусов включает ряд вирусов, вызывающих опасные заболевания человека и животных, среди них особенно печально известны такие вирусы, как вирус кори {measles), респираторно синцитиальный вирус (RSV), вирус парагриппа {parainfluenza), вирус инфекционного паротита {mumps), вирус болезни Ньюкасла {NDV), вирус чумы рогатого скота {rinderpest).

Актуальность проблемы

Впервые вспышки болезни Ньюкасла (БН) среди домашней птицы были зарегистрированы на Индонезийском острове Ява и собственно в Ньюкасле в 1926 году [103]. На сегодняшний день вирус БН широко распространен в различных регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в список наиболее важных патогенов (лист А). Несмотря на проведение повсеместной вакцинопрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается самой массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием промышленного птицеводства это заболевание приобрело пандемический характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную роль в этом процессе сыграл широкий международный обмен высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета эпизоотической ситуации в конкретных странах [109, 120].

За последние 80 лет множество эпизоотических вспышек БН нанесли удар по птицеводческой индустрии многих стран, причём некоторые из них переросли в форму панзоотии. Полагается, что первая панзоотия началась в середине 1920-х гг. и утихла только в конце 1950-х гг., когда стала распространённой вакцинация. О развитии второй панзоотии имеются две версии. Согласно одной она началась на Дальнем Востоке в начале 1960-х гг. и распространилась до Европы через Ближний Восток. Другая версия предполагает, что вторая панзоотия имеет южноамериканское происхождение в результате импорта экзотических птиц (попугаев) в Европу и Северную Америку [11, 47, 69]. Инфекция почтовых голубей вариантом вируса БН (PPMV-1) в конце 1970-х гг. на Ближнем Востоке ознаменовала начало третьей панзоотии, которая к настоящему моменту охватила многие страны всего мира. В настоящий момент, несмотря на проведение вакцинации практически повсеместно, существует опасность возникновения новой панзоотии.

Лавинообразное накопление экспериментальных данных показывает огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий момент не существует общепринятой системы классификации вируса в пределах рода. Среди наиболее известных систем классификации ВБН выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По системе, предложенной авторами Lomniczi et al. (1998), Alexander et al. (1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al. (2001), Yu et al. (2001) существует восемь основных линий (I-VIII) [69, 15, 49, 50, 57, 120]. Другая система, предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести основных линий 1-6 [9, 10].

Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного числа штаммов ВБН по всему миру и определены основные генотипы, остаётся неясным вопрос - какие генотипы ВБН представлены на территории России и сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту написания работы в базе данных GenBank были представлены частичные нуклеотидные последовательности гена F только четырёх представителей генотипов За, ЗЬ и 4а, выделенных с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3, 6]. Однако совершенно не изучено разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких птиц.

В связи с повсеместно расширяющейся программой вакцинации, начавшейся в начале 1950-х гг. и увеличивающимся числом вакцинных вариантов вируса, возникает вопрос о возможности выплеска вакцинных штаммов в популяции диких птиц и об их дальнейшей судьбе.

Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны несколько ОТ-ПЦР систем. В основном, все они основаны на амплификации участка гена Б или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала (в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, из-за недостатка данных по распространению генотипов ВБН на территории России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для детекции РНК вируса БН адаптированную к вариантам вируса, циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему выявления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим использованием амплифицированных фрагментов ДНК для секвенирования и выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с ранее известными.

Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных государств, отсутствуют.

Цель и задачи исследования.

Целью, настоящего исследования явилась генетическая характеристика вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а также определение первичной структуры генома варианта вируса БН, наиболее распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести определение первичной структуры гена Б или его участка "культуральных" штаммов вируса БН (всего 59), выделенных на территории России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.

2. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных ОепВапк.

3. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в 2004 г.

4. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных ОепВапк, с помощью филогенетического анализа.

5. Определить первичную структуру полную генома российского штамма 81егпа/Аз1гак11ап/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.

6. Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о.) и результатов генотипирования по практически полному геному.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса БН.

2. Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.

3. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1, 2, а также субтипам За, 5Ь и 5<±

4. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5с1, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 - лентогенному характеру патогенности.

5. Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5Ь, 5(1 и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств.

6. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм 81ета/Аз1га1<±.ап/2755/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.

7. Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о. от начала открытой рамки считывания белка Б -по классификации АЫош с соавт., 2003) и результатов генотипирования по практически полному геному показал высокую степень их корреляции (К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена Б (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Ауи1ау1гиз и внутри основных генетических линий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени.

2. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Б (374 н.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 5с1.

3. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц.

4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БН, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма 81егпа/Аз1гакЬап/275 5/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.

5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена Б и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена Б (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода А\чйа\чгы8 и внутри основных генетических линий.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Усачев, Евгений Валерьевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди иарамиксовирусов птиц вирус болезни Ньюкасла (АРМУ-1) считается, пожалуй, самым распространённым и наносит огромный

• экономический ущерб народному хозяйству. К настоящему моменту известен факт четырёх панзоотий ВБН, причём четвёртая продолжается в настоящее время в популяциях голубей разных видов и вызвана циркуляцией вируса генотипа 4Ь.

Из всех известных классификаций вируса БН в пределах рода Ауи1ау1гш наиболее широко используемыми являются две, предложенные Ьотшсг1 et а1. (1998) и АШош а1. (2003). Они основаны на филогенетическом анализе участка гена Б. Накопление данных по

• нуклеотидным последовательностям различных участков генома разных штаммов ВБН происходит лавинообразно. Не вызывает сомнения очевидность необходимости типирования вновь охарактеризованных штаммов для создания более полной картины генетического разнообразия циркулирующих вариантов вируса на той или иной территории с целью проведения эффективной вакцинации. Однако проведению качественной вакцинопрофилактики в нашей стране мешают несколько факторов:

1. Отсутствие данных о циркуляции генетических вариантов вируса БН на территории России и стран, через которые пролегают пути миграции птиц, обитающих на территории России;

• 2. Отсутствие жёсткого контроля за закупкой кормов и племенной птицы;

3. Отсутствие контроля за применением вакцинных штаммов;

4. Отсутствие вакцинации домашней птицы в малых хозяйствах и подворьях.

К моменту выполнения данной работы в базе данных ОепВапк были представлены только четыре представителя генотипов За, ЗЬ и 4а л выделенные в России с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3,6].

В связи с этим была предпринята попытка типирования российских штаммов БН последних лет, выделенных на территории Астраханской области и Приморского края от диких птиц (главных точек пересечения путей миграции диких птиц), нескольких более ранних штаммов из музея вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, а также казахстанских штаммов от домашней птицы. Кроме культуральных штаммов были обследованы образцы полевого материала (клоакальные смывы 142 диких птиц и 40 домашних птиц), собранные в Приморском крае в 2004 г.

Для осуществления задуманного нами был создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР тест . системы. Для подбора олигонуклеотидных праймеров мы проводили сравнение различных участков генома разных штаммов ВБН, представленных в базе данных ОепВапк. Важно отметить, что к моменту выполнения данной работы в базе данных отсутствовали нуклеотидные последовательности представителей шестого генотипа. Поэтому разработанная ОТ-ПЦР система может не отличаться высокой универсальностью и специфичностью. Однако, теоретически, на основе алайментов нуклеотидных последовательностей, соответствующих местам посадки праймеров, можно предположить, что с помощью данной системы можно будет детектировать в вируссодержащих пробах представителей вируса БН, по меньшей мере, пяти генотипов из шести, известных к настоящему моменту.

С помощью созданной ОТ-ПЦР системы были получены фрагменты ДНК участка гена Б всех исследуемых российских и казахстанских штаммов. Кроме того, для большинства российских штаммов были получены фрагменты ДНК целого гена Б, а для всех казахстанских фрагмент ДНК длиной 1083 н.о., охватывающий участок гена М (100 а.о. С-конец), расстояние между кодирующими последовательностями генов М и Б и начало гена Б (206 а.о.). При анализе 182 образцов полевого материала, собранного в Приморском крае в 2004 г. был получен фрагмент ДНК участка гена Б вируса БН только для 8 образцов. Общая зараженность птиц вирусом

БН составила 4,4 %, а в частности диких - 4,9 %. Для последующего филогенетического анализа нами была определена нуклеотидная последовательность фрагментов ДНК штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов. Нуклеотидные последовательности практически всех российских штаммов были депонированы нами в базу данных ОепВапк.

На основе филогенетического анализа по участку гена Б в пределах рода Ал>и1атгт была установлена генотиповая принадлежность исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов. Российские штаммы были отнесены нами к генотипам 1, 2, и 5Ь. Разнообразие генотипов среди казахстанских штаммов оказалось несколько большим (генотипы 1, 2, За, 5Ь и 5(1). Среди ПЦР-положительных образцов Приморского края 2004 г. были обнаружены представители генотипов 1, За й 5Ь.

На основе филогенетического анализа по участку гена Б в пределах обнаруженных генотипов мы установили более подробные генетические взаимоотношения исследуемых штаммов. В пределах первого генотипа исследуемые изоляты были отнесены нами к западноевропейскому кластеру, причём приморские штаммы 2000-2001 гг. выделения образовали отдельную группу от группы казахстанских штаммов 1988-1998 гг. и приморских ПЦР-положительных образцов 2004 г. Поскольку этот генотип распространён по всему миру и среди него встречаются в основном лентогенные варианты, то можно считать исследованные изоляты эндемичными вариантами вируса БН, характерными для данных территорий.

Внутри второго генотипа исследуемые штаммы отошли к кластеру вакцинных штаммов ряда Ьа8о1а. Все эти штаммы были выделены от домашней птицы, и с большой вероятностью они являются генетическими вариантами широко применяющегося вакцинного штамма Ьа8о1а.

Среди представителей генотипа За невозможно было провести более подробную кластеризацию в виду малого количества известных штаммов. Однако исследованные казахстанские штаммы и один приморский образец оказались генетически однородными и довольно близкими аттенуированному вакцинному штамму ГАМ-61. Исходя из этого, можно предположить, что они могут быть вариантами этого вакцинного штамма или эндемичными штаммами обследованных регионов. Недостаток знания об использовании вакцинных вариантов вируса БН в этих регионах не позволяет сделать заключение о происхождении исследуемых штаммов, и идёт ли речь об интродукции вакцинного варианта вируса в популяции диких птиц.

История выявления представителей пятого генотипа насчитывает около двадцати лет на территориях почти всех континентов, кроме Австралии и Северной Америки. Существует опасность занесения представителей этого генотипа на территорию последних двух. Это может ознаменовать начало пятой панзоотии. Причём, вызвана она, может быть совместной циркуляцией всех субтипов этой генетической линии, но основная роль, по-видимому, будет за генотипом 5Ь.

Исследуемые штаммы и образцы, отнесённые нами к этому генотипу, вошли в состав европейского кластера, при этом разбившись на две отдельные группы. В первую группу вошли казахстанские штаммы выделения 2000-2001 гг., астраханские штаммы 2001 г. и один образец Приморского края 2004 г. Вторую группу образовали казахстанские штаммы 1998 г. и четыре образца Приморского края 2004 г. Все представители генотипа 5Ь, известные к настоящему моменту, имеют велогенный характер патогенности. Все исследуемые казахстанские штаммы этого генотипа были выделены в эпизоотические периоды от домашней птицы, а российские штаммы и образцы от дикой птицы. Из чего можно заключить, что преимущественно циркуляция вируса БН генотипа 5Ь в настоящее время определяет эпизоотическую ситуацию в данных регионах.

Интересным оказался факт интродукции эпизоотических штаммов ВБН генотипа 5с1 на территорию обследованных областей Казахстана в период с 2001 г. по 2003 г. В пределах этой генетической линии, исследованные штаммы, по-видимому, образуют собственный кластер среди ранее выделенных кластеров: 1 - штаммов из Китая и Ближнего Востока и 2 штаммов, выделенных на Тайване. Из чего можно заключить: на эпизоотическую ситуацию в Казахстане и близлежащих территориях России также будет иметь влияние циркуляция штаммов ВБН этого генотипа.

Молекулярно-генетический анализ главного маркера патогенности вируса БН - аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что все исследованные штаммы ВБН и ПЦР-положительные образцы, относящиеся к генотипам За, 5Ь и 5(1 имеют последовательность этого сайта соответствующую велогенному патотипу. Штаммы ВБН и ПЦР-положительные образцы, относящиеся к генотипам 1 и 2, имеют последовательность сайта активации, соответствующую лентогенному патотипу.

Следует отметить, что к началу данной работы было опубликовано всего 27 полноразмерных последовательностей вирусного генома представителей генотипов 1, 2, ЗЬ, Зс, 4а, 4Ь, 5а и 5с1. Позднее были опубликованы три последовательности практически полного генома представителей генотипа 6. Также нужно отметить, что в базе данных не было опубликовано ни одной полноразмерной нуклеотидной последовательности генома отечественного изолята. Для определения полной нуклеотидной последовательности генома российского изолята вируса БН был взят штамм 81егпа/Аз1гак11ап/2755/2001. Нуклеотидная последовательность полного генома первого российского штамма ВБН была зарегистрирована нами в базе данных ОепВапк [АУ865652].

Реальная картина филогенетических взаимоотношений изучаемых штаммов ВБН возможна лишь при анализе нуклеотидных последовательностей полного генома всех существующих вариантов вируса. Однако определение последовательности полного генома вируса является очень трудоёмким и дорогостоящим процессом. Поэтому исследователями для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса используются последовательности различных участков генома, так или иначе отображающих реальную картину филогении вируса. В связи с этим, нами была предпринята попытка сравнения результатов филогенетического анализа по практически полноразмерным последовательностям генома и аналогичного анализа по участку гена Б (374 и.о., согласно классификации АМош с соавторами, 2003 г.). Сравнение данных этих анализов по разным фрагментам генома показало их высокую степень корреляции (К=0,98), что позволяет сделать заключение о правомерности использования данного участка гена Б для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Ауи1см1гш и внутри основных генетических линий.

На основании анализа первичной структуры генома исследуемого штамма 81егпа/Аз1так]1ап/275 5/2001 и штаммов с известными биологическими свойствами, а также молекулярно-генетических признаков патогенности (аминокислотный состав вирусных белков, последовательность сайта протеолитической активации белка Бо и белка НИ, кратность геномной РНК шести нуклеотидным остаткам, наличие биологически активного белка V) был установлен его велогенный характер патогенности.

105