Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая дифференциация штаммов Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud, 1910 методом полимеразной цепной реакци

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая дифференциация штаммов Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud, 1910 методом полимеразной цепной реакци"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ САКСТ-ПЕТЕРБУРгаШП ШМЮ-ФЖШ^ВТИЧЕСШЙ ИНСТИТУТ

На правах рувопиои

1.Ю1СРОУСОБ Игорь Владиславович

ГЕ!ПЗТИЧЕСШ ДИФ^КРЕШДИАЦИЯ ШТАММОВ AUItEODASIDimi PUÜDIAW3 (DE ВДНХ) AR1IAUO, 1910

МЕТОДОМ ШЛИМЕРЛЗШЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 03,00,07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискакио ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1993

Работа выполнена в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П.Константинова Российской Академии науа и в Санкт-Петербургской Хишшо-фарыацевтическом институте Шпгастерства здравоохранения России.

Научные руководители: засл. деятель науки К}, доктор биологических наук, профессор Н.П„Елкнов| кандидат биологических наук, от.н.о. С.А.Еулг

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

М.М.Левитин;

кандидат биологичеоких наук, ст.и.о. Л.И.Слепян*

Ведущая организация - Санкт-Петербургский Государственный

Университет.

Защита состоится "30 "Ли^к. 1993 г. в У ^ чаоов на заседании специализированного совета К 084.63.01 в Санкт-Петербургском Химико-фармацевтическом институте по адреоу: 197022, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургскогс Химико-фармацевтического института.

Автореферат разослан "2.$" "сре^сщ 1993 г

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

Актуальность проблемы. Сложность таксономического анализа грибов обусловлена значительной изменчивостью широко используемых морфологических и биохимии оских признакоз. Особенно неясна систематика дейтеромицетов - искусственной группы грибов, объединенных по признаку отсутствия полового процесса. В этой связи оказывается неприменимым основной критерий биологического вида -скрещиваемость родительских культур-и фертильность потомства. Однако,, природные системы - биологические виды у дейтеромицетов

О

существуют к могут быть выявлены на основе анализа ДНК. Благодаря новому методу изучения геномов - полимеразной цепной реакции с универсальншш праймараш /УП-ПЦР//Булат и др., 1989/ - удается ампшфгцлровать in vitro фрагменты из множества локусав генома, которые поело разделения в голе представляют специфические ПЦР-паттерны» Перекрестная б.тот-гибриднзация аютлифицировашой ДНК показывает ее гомолопт и, выявляя таким образом генетическое единство штаммов, предлагается авторами метода в качество наи-.более общего критергш биологического вида.

Рибосомная ДНК является давно известный эволюционным маркером. В последние года, применение унивороалышх для грибов рДНК-прай-меров позволяет амплифицировать фрагменты рДНК ранее не изучавшихся грибоа для последующего филогенетического анализа.

Auraobaaidiun - дрояжэподобнкэ грибы, таксономия которых недостаточно ясна: выделяв? от I / Bills•1971/ до 14 видов / Harmssida o-liijhof ,1977/, соотавля^гуг; этот род, основываясь подчас на малых морфологических ига ¡экологических различиях. Геном этих грибов остается почти неизученный. В этой связи было актуально применить гфитор;:й рДИС и мотод УП-ПЦР для изучения генетической изменчивости штаммов A.pujitiiar-a , имеющего прак-гкчесгу« ^jbw1!' г» качества продуцента биологически активнкх

ВОЩйС

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в генетической дифференциации штаммов л.риХХиХело методом полимеразной цепной реакции геномной ДНК, Конкретные задачи были следущими: I,изучить изменчивость ачплифицированной рДНК{ 2,провести филогенетический анализ штаммов А«риХХиХопа на основе рДНК-подиморфизма компьютерными методами; 3,дифференцировать биологические вида АигеоЬаа1(11ша методом УП-ЩР; 4.изучить генетическу» изменчивость

ч

штаммов методом УП-ПЦР.

Научная новизна и практическая ценность работы. Подтверждена пригодность метода УП-ПЦР для генетической дифференциации биологических видов: на примере такономического вида А,ри11и1апа показано, что гомология амплифу '.ированной с универсальными праЯ-мерами ДНК, отражая генетическое единство штаммов, может служить наиболее общим критерием биологического вида, пригодным и для агамных организмов.

Впервые проведен филогенетический анализ штаммов л.риХ1иХапа основании;": на компьютерной обработке рестрикционного рДНК-поли-морфизма с помощью пакета Р1НЫР 3.3.

Показан сборный характер А.раХХиХапз , включающего, по крайней мере, три самостоятельных биологических вида АигооЪаа1й1ша. Пять штаммов А.риХХиХашз переопределено как Нопаопема пр.. Предложено использовать негативную Кза1- рестрикцию изученного фрагмента рДНК для диагноза таксономического вида А.ри1Хи1апв. Для быстрого корректного филогенетического анализа штаммов лигеоЪаз!(Иша на основе рДНК предложено использовать две рест-риктазы - А1иХ и ЦзрХ.

Положения, выносимые на защиту.I.Подтверждение пригодности метода УТЫГ^Р для идентификации биологических видов и дифференциации, штшлюв грибов рода АагеоЬао1й1шд . 2.Доказатзльство применимости компьютерные методов для филогенетического анализа

A.pullulant! на основа рЦНК-полиморфизма, 3,Обоснование на основа УП-ПЦР дивергентного состояния двух биологических видов, входящих в таксономический вид л.pullulas.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 15 Международном специализированной симпозиуме по дрожкам /Рига,1991/ и на заседаниях С.-Петербургского общества микробиологов и эпидемиологов /13,X,1992/ и кафедры микробиологии СПбХЭД,

.STpiVKrypa и объем диссертации» Диссертация состоит из введения, обзора литературы по тема исследования /3 главы/, экспериментального раздела, включаетцэго результаты собственных исследований и материалы: и методы /3 главы/, обсуждения полученных результатов и выводов.

Работа изложена на 157 с,„ содержит 40 рисунков и 7 таблиц. Список использованной литературы включает 285 названий.

Материалы и методы

Использованные иттмы, Использовали 45 штаммов л,pullulons /разного проиохрздония/, 2 штамма A.ralaroetiotun и взятые в качестве контроля штаьшц Иоюаоаош пас г строга F2452 /р°Д Ногтодеыа ближайш^гП к Auraoljaaldiua/' и UadaoaloUa niera F2137.

Полотенце клетсчшк лизатов. Методика подробно описана ранее /Булат и др,,.1'99Я/. Иицеяиальнуи пленку трехсуточной культуры суспендировали в лизируюцем буфера и инкубировали 3 часа, Дяя опиоткк и осаяд1ния /ДС использовали последовательно смесь хлоро-форм-октанол, изопропанол и этанол, Осадок, содержащий ДНК, рас-'„ зоряли в буфере ТЕ а РНКазой А и подученный лизат - грубый препарат ДНК - хранили при <4*С,

По л tn,r3 par.цегт-ля реакция. ПЦР проводили в 30 мкл буфера, . со^ержацегс Ш-йОО нг анализируемой геномной ДНК /0,1-1 нкл лизата/,

2-3 ед термостабильной ДНК-полимеразы^ь /Кабоев и др. ,1989/, по 40-100 нг праймеров. ПГДР /30 циклов/ осуществляли на термо-циклере /разработчики А.Н.Третьяков и Г.П.Левин, ГШФ РАН/ в режиме: денатурация - 92'С,50 сек; отжиг - 53*С /для универсальных праймеров/ или 64*С /для рДНК-праймеров/,70 сек; синтез -70*С, 60 сек. Использовали универсальные праймеры 21, 45, 223 и

3-2 /Булат и др.,1992/ и рДНК-праймеры 5.8S-R и ОД /Vilealya, Heater ,1990/ для амплификации фрагмента рДНК, включающего ген 5,8 з рРШ, спейсер и половину гена 26 s рРНК»

Гель-электрофорез ДНК. Разделение смеси амплифицированных фрагментов ДНК проводили в агарозном/ .1,734/ и полиакриламидном /5, гелях , которые окрашивали бромистым этидием и фотографировали на пленку "Микрат-300" в УФ свете /302 ш/. Подробное описание этих процедур - см. Маниатис и др.,1984..

Рестрикционный анализ ДНК. Рестрикцию амплифицированного фрагмента ДНК проводили с использованием 5 рестриктаз - Alul,J.iopl, TaqX, Real, Hin бт ; фрагменты рестрикции разделяли в

полиакриламидном /8/2/ геле /подробнее- см. Маниатис и др., 1984/.

Гибридизационныл анализ ДНК.Гомологию ДНК, амллифицированной с универсальными праймерами, выявляли блот-гибридизацией ПЦР-паттернов. Блотом служил нейлоновый фильтр Ну bond /Amoralion Inc./ с перенесенной на него ДНК паттернов разных штаммов; в качестве

Q9

зонда использовали Р-меченый амплификат одного из штаммов или один из мажорных фрагментов паттерна, предварительно элаированный из агарозного геля и реа\'.плиТмцкровашыл с тем л;е праймером. Эти процедура подробно описаны Маниатисом и др.,1984.

Компьютерная обработка рестрнкшонного полиморфизма.Отношения родства :.io:,vy штампами устанавливали путем сравнения паттернов рестрнцированного фрагмента рДНК по формуле: Д=1 - 21^/(Г^+Пу),

Таблица I

Матрица различий, основанная на сравнении р^НК-элентрофоретилов по пяти рсстриктазам /значегчя Д/

Класс РДНК Г 2 3 4 5 6 7 8 9

I 0,000

2 0,032 0,000

3 0,032 0,065 0,000

4 0,049 0,115 0,082 0,000

5 0,406 0,430 0,405 0,460 0,000

6 0,357 0,429 0,397 0,452 0,015 0,000

7 0,500 0,531 0,500 0,524 0,485 0,475 0,000

8 0,606 0,606 0,606 0.600 0,618 0,612 0,471 0,000

9 0,667 0,667 0,636 0,631 0,647 0,672 0,559 0,314 0,000

где Д - коэффициент различия, Пх,,- число общих фрагментов для

штаммов X п У, IX. л - суммарное число фрагментов з паттерна:'. j- i/

кавдого из ьтих штшй/ов /nibbot,vü6«lyts >1991/. Матрицу различий рассчитцзал!-. суммарно по всем пяти рэстриктазам /табл.1/. Эволюционные древа •• укорентные и неукоренелнно - строили с помощьк' компьютерного пакета ИКЫР 3.3 /j,rola¡-n3t4la ,1991//рисД/.

Изменчивое»* рибоссмной ДИ A.pullulanB,

Анализ рестрикций?нзго полиморфизма рДНК, Был проведен филогенетический анализ штйшсв A.pulluiora s основашнЛ на растрикци-онноа полиморфизме рДНК, Амшнфщироваияь':! фрагмент рДНК бил приблизительно равным /1,9 тпл/ у всех таапюв, не исключая представителе.! других ргкег, II.iiao¿oopora?2452 п íl.ai^ra F2137 „ Ярагазнты

рДНК штаммов были подвергнуты рестрикционному анализу о использованием 5 рестрлктаз. На основании сравнения рестрикционного полиморфизма в по таакриламидном геле все штамш были разделены на 9 классов независимо от их такономического отатуса /табл.2/. Штаммы огдеого класса имеют идентичные электрофоретипы по всем пяти рест-рйктазам. Различные классы различаются как по малой разнице в подвижности пары фрагментов, так и по большинству фрагментов по всем рестрлктазам. Например, при Alul- рестрикции рЦНК штамма FIII6 /класс 3/ один фрагмент имеет чуть меньший размер /из-за возможной делеции/ по сравнению с соответствующим ему фрагментом в паттернах штаммов F425 и 129/11/ /классы I и 2//рис.2/, В то же время, -:сли отличие классов 1-3 не связало' с разницей в количестве сайтов рестрикции, то рДНК-фрагмент класса 4 /II штаммов/ имеет на I Alul сайт меньше, чем предыдущие три класса /рис.2/.

Относившиеся к A.pullulans пять штаммов класса 5 оказалиоь близкими по типу их рЦНК к H.macroopora F2452 /класс 6/, различаясь лишь при Taql -рестрикции. Интерес вызывает обнаруженное отсутствие цва1 -сайтов рестрикции в рЦНК-фрагмеите большинства /40 из 45/ штаммов A.pullulans /классы 1-4/.

Оценка генетического родства штаммов на основе рДНК-полимор^изма Для оценки уровня дивергенции между установленными классами рДНК была рассчитана матрица различий и на ее основе построены эволюционные дрова /рис.1/ с помощь» компьютерного пакета p1klxp 3.3 • Как видно, классы 1-4 /40 штаммов a.pulluiano / сгруппировались в малоразличимый кластер, весьма далеко отстоящий от другого кластера - классов 5 /пять штаммов-A.pullulans / и б /н.шосговрога F2452/. Значительно удалены от этих двух кластеров штаммы F2455 и FI2I/A.nioroatiotun /» также далекие и друг от друга.

3 экспериментальной работе имеет значение быстрый филогенетический анализ 'неизвестных изолятов, основанный на рДНК-полиморризме

Таблица 2

Разбивка штаммов на классы по рестрикционному рДНК-полиморфизму

Класс РДНК

Количество штаммов

Типы рЦНК-полиморризма по реотриктазам: А1аХ Мар! Тач! Ева! Н1пб1

1

2

3

4

5

6 7

6 9

23 1

5

1

А„

а Са

Вп Сп

а

А.

А.

А.

Ь

Чх

В

А

А

А

t

Ь.

г

а

А

А

t

Г

Ъ

а

С

В

ь

в

Е

О

о

ь

ь

г

р

V

г

Г

л

Примечание. 01та\ащл,рц11и1сшэ с входящие в классы:

1 - В2 2241 2242 2243 2275 7331 136 ЗаШ 3а123 15 Р2479 Р2207

РП25 РН26 18 Р2202 237 16 4515 РГ.79 '/23 238 Р425

2 - 129/11/

3 - РШ6 17 Гидув-I Ридуз-2 Гидув-З

4 - I 1а 8 23 5 26 172 Р2204 Р2205 Р2275 Р122

5 - Р2836 Р2205 ь 34, 22

6 - н.паегс£рога Р24Й2

? - А.:л1сгозио1;ш1 . Р2455

8 ~ А.и1сгоа'Ь±с'!;1М Р121

9 - ц.п1ега

g II.nigra F2137

H.macrospora F2452

A.pullulana ^

■ (5штаммов )

P A.microstictum F121

19 A.microstictum F2455

3

A.pullulans (40 штаммов )

6.

-I

Ц

—3 —4

A.pullulana

(40 штаммов )

t5 A.pullulana (5 штаммов 5 H.macrosрога F2452

—7 A.microstictum J2455 —8 A.microstictum F121

—9 H.nigra P2137

60 50 40 30 20 10

0

% различия

Рис;I. Дендрограммш, основанные на рДНК-полиморфизме по пяти рестриктазам, построенные по программам: a.fitch и б.kitsch Ци-.тоы на концах ветвей - классы рДНК, цифры на ветвях -различия."

а

Клоссн рДНК ! 3 г ч 5 в 7 Я 3

Со ^ «О К. •о И ^ ч. ч

Д- СМ

«Ч ом "Ч

"о ^ и. Ч и. Н

Рис.2 Типы А1и1 -полиморфизма рДНК штаммов-представителей 9 классов. М - маркеры молекулярных весов,тпн /ДНК "лямбда" ЙГЙ /. 8* ПААГ.

Примечании. На рис.2-8 представлены схемы негативов гелей и схемы радиоавтографов, а не их фотографии.

Г (1

11

Но С^^о г^ »о к. £ Й £ . ^ ^ ^Г > а. <

аэ £ ч ч ^ ч и. а| V ч ч

■ис.З Перекрестная гибридизация ДР-паттернов штаммов-гредставителей ибридизационных групп 1-УШ праймер 45/. а.ПЦР-пзттерны штаы-ов; М - см. рис.й. б.Елот-гибриди-ация паттернов /см. а./ с меченым иплификатом штамма Р2755 Ы/. в .Блот-гибридизация паттернов /см. а./ с меченым амплифяк.атом гамма Р2452 /к/.

по меньшему числу рестриктаз. Мы проверили все 10 возможных комбинаций двух рестриктаз из пяти использованных /данные не приведены/ и установили, сравнивая топологию дендрограмм, что для быстрого корректного филогенетического анализа штаммов АигеоЬсш1с11шп на основе данного фрагмента рДНК достаточно использовать лишь две рес-триктазн - АХиХ и мор1.

Генетическая изменчивость А.ри11и1ш1в , выявляемая методом

полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами /УП-ПЦР/

ГибридизационныЛ анализ амплифицированной ЛНК. Для оценки гомологии амплифицированной о универсальными праймерами ДНК разных штаммов была проведена ее блот-гибридизация. В результате все изучавшиеся штаммы были разделены на восемь /1-УIII/ гибридизационных групп /табл.3/. В одну группу входят штаммы, ПЦР-паттерны которых гибридиэуются, т.е. гомология амплифицированной ДНК превышает 7Ш. Паттерны штаммов разных групп не гибридизовались вообще /рио.Заб/ или же показывали слабую /остаточную/ гибридизацию одного-двух фрагментов паттерна /рис.Зав/.

Следует отметить, что в УП-ПЦР исследованиях применяют праймеры, амплифициругацие разные локусы генома, и поэтому результаты, получаемые с разными праймерами, являются независимыми. Мы использовали три праймера /21,45,3-2/ и результаты, полученные с каждым из них, взаимно подтверждались.

Природа амплифицированной ДНК была изучена посредством гибридизации паттерна с радиоактивно меченым о>.дим из его мажорных фрагментов, На примере штаммов Р1П6, 8, Р2836 /рис,4/ и 15 была показана гибридизация всех фрагментов паттернов с такими зондами. На основании этого можно предположить, что амплифициро ванная с прай-мером 45 ДНК д.pu.lluic.na представляет собой ДНК-повторы.

Гибридизационные группы A.pullulons

Таблица 3 и штаммы, входящие в них

Группа Подгруппа Штаммы

1-1 В2 2241 2242 2243 2275 7331 136 15 ЗаПв 3aI23 F2479 F2207 FI 125 Fi 126 18 F2202 237

I 1-2 FI 116 17 Гидув-I Гидув-2 I'll дув-3 16 4515

1-3 FI79 м23

1-4 238

1-5 F425 .

II-I I la 8 23

II II-2 5 26

F2204 F2205 F2755 FI22 172

III 129/11/

и F2836 P2206 Ii 34 22

У H.maorospora P2452

И i A.niorootiotiua К455

УН A.microstiotua PI2I

УШ H.nigra F2I37

<

НН6

рте

Рис.4. а,в,д - ПЦР-паттерны /праймер 45/ штаммов. б,г,е - блот-гибридизации ПЦР-паттернов /см. а,в,д соответственно/ с мечеными их мажорными фрагментами /показаны —* /.

1-1 ъг г-з 1-5 и

I

¡е & 5 »о

«о

«О

К. N. >

VI «1 V "I

< I*. Ч СМ

Рис.5 Перекрестная гибридизация штаммов-представителей пяти подгрупп гибрадизационной группы I /праймер 21/. а.ГГр-паттерны штаммов; М-см. рис.3. б.Блот-гибридизация паттернов /см. а./ с меченым ачплификатом штамма ¡32 /х/.

Н 1-5 И 1-3 И

5 £

см од

«о N. СМ >

« Й -

Рис.6 ПЦР-паттерны штаммов гибридизационной группы I /по'(групшг 1-1 - Т-5-/ /прайм»р 3-2/, ПМГ. - см. рис.З,

- лГЗ -

i

Далее будут рассмотрены Гибридизационные группы, вычаленные в результате гибридизации паттернов в целом, а не их отдэлышх фрагментов.

Гибридизационная группа I состоит из 28 штаммов, Визуальное сравнение паттернов изолятов /праймеры 21 и 45/ разделяет ее на пять подгрупп /1-1 - 1-5/, в каждую из которых входят штаммы со сходными паттернами /рис.5а, табл.3/. Малосходные паттерны разных подгрупп гибридизуются, хотя и не по всем фрагментам, но достаточно, чтобы объединить все штаммы в одну гибркдизационную группу /рис.56/.

Гибридизационная группа II /II штаммов/ является болео с дно-родной, чем гетерогенная группа I /рис.За/. На радиоавтографе различия паттернов в агарозе нивелируются - паттерны гибр-дизопа-лись почти целиком /рис.35/.

Гибридизационная группа III включает один штамм - 129/11/.

Гибридизационная группа 1У состоит из пяти штаммов, ПЦР-пат-терны которых и в агарозном геле и на радиоавтографе были очнь сходными /паттерны в ПААГе - см, рис.9/, но утверждение о гомогенности данной группы не может быть окончательным по причин^3 малого количества штаммов.

Как было отмечено, гибридизационные группы выделяли по критерию отсутствия гибридизации между ними. Однако при рассмотрении результатов гибридизации паттернов ме:кду группами I-III и между группами IУ-У мы наблюдали явление остаточной гибридизации - слабой гибридизации по 1-2 фрагментам /рис.Зв/. Паттерны-^таммов F2336 /группа ГУ/ и F2452 /группа У/ слабо гибридизои^лнсь по одному /пра:"мер 21/ и двум /праЛмер 40/ фрагментам, причем только в случае, когда зондом служил паттерн F2452, но не Р2836/рис.3в/.

Также остаточная гибридизация паттернов наблюдалась между гру-

гшаш 1-1X1« хотя только по одному праЯмеру /21/, однако она была перекрестной, т.е. имела место при использовании в качестве зондов прадстазигелей всех трех групп. Являясь слишком слабой для объединения штаммов в одну гибрдцизационную группу, остаточная гибридизация показывает их определенное генетическое родство.

Основываясь на внутри- и межгрупповом гибридизационнои анализе, ыы полагаем, что обдим правилом является безусловная гибридизуемооть иходных паттернов и для доказательства принадлежности штаммов к однол гкбридизационной группе излишне проводить гибридизацию их ГГУ-паттерцов, если они сходны в геле, В случае же малого сходства паттернов /менее 50й общих фрагментов/ такая гибридизация представляется необходимой,

Анализ амплкфии и рованной ДНК /ПНР-паттернов/ методом гель-элек-Изменчивость ШЦ^-паттернэв внутри и между выделенными гибрлдизационныыи группами изучали на основе электрофореза в поли-акриламидном гело, позволяющем детально анализировать различия, Гио'ридизацлонлая группа I состоит из пяти подгрупп /табл.3/, различающихся в значительной степени /рис,6/. По праймеру 3-2 /рис.б/ паттерны штаммов разных подгрупп кажутся более сходными, чем в случае с праймерами 21 и 45 /данные не приведены/р; ¡впрочем и это сходство очевидно при сравнении средних частой паттернов.

Анализ П'Р-пат гернов /праймеры 21,45,3-2/ штемц п группы II выявляет две подгруппы идентичных штаммов - П-Г:11;'Д-2, наиболее

' 1 Г' '

удаленные друг от друга. Остальные пять штаммов по изменчивости расположены между ними /табл.3, рис,7/. Как видно;,; практически как-дый штамм им о от в своем паттерне мажорные фрагменты, отличающие ого ДРУИК« Лучше других праймеров показывая сходство штаммов, прай-мер 21,т.о., оказался консервативным для группы II,

{итали.к^ группы 1У да^е в ПААГе имеют очень сходные паттерны по четырем праймарам /21,45,3-2,223/, Чрезвычайной-сходство, почти

- 1Й -

и-!

!!-Е

<Х|

0 Од од

п <м к! см V «V V)

^ОоЧ. V и. Ч Л /ц

Рис. 7. ПЦР-паттерны /праймер 21/ штаммов гибридизационной групп;,; (I, 5,5^ ПЛАГ. М - см. рис.3.

Кг, <=4 «О

V) <х| и. м. -ч

м

^ ^ ^ 23

Кг> и. ч| ^ ^

О в, • С4 «М

ко «М ^ ЛЧ

Е1~

Рис.8 ПЦР-паттерш штаммов гибридизационной группы 1У /5,5;$ ПЛЛГ/. а.праЗмер 223. б.праПмер 21. в.праймер 45. - см. рис.З. П[{Р-поличорфизм показан стрелкой.

t

идентичность всех пяти шташов выявляет праймер 223 /рио,8а/, являющийся консервативный для этой группы, В роли вариабельного для группы 1У выступает прайиер 21, показывающий наиболее резкую разницу паттернов за о чет разновеликих мажорных фрагментов /рио,8б/.

Анализ межгрупповой изменчивости ПЦР-паттернов крайне затруднен по причине их значительной разнородности. Единственно реально обнаружить 1-2 мажорных фрагмента, общих в паттернах всех 8 гиб-ридазационных групп и поэтому любые утвервдения об определенном сходотве паттернов неизбежно будут грешить субъективностью,

3 целом, при оравнении паттернов ысшно было бы использовать компьютерную обработку, примененную нами для паттернов рестрикции, Однако, проблема заключается в сложности ПЦР-паттерноь и в сканировании гелей или гас негативов для последующей компьютерной обработки.

Обсуждение

В настоящем исследовании было применено два повода для изучения генетической изменчивости штаммов a,pullulons на уровне геномнс 1 .ДНК,

Первый подход ооотоит в изучении рэстрикц'-ошю ро полиморфизма фрагмента рибосомной ДНК. Мы полагаем, что на 'эсгроешшс денд-рограммах представлено пять родов /рис,1/, Ыохш шделить два кластера близкородственных штаммов - классы 1-4 У-îO шташов A,pullmans / и классы 5 /5 шташов A.puilulanB /' к о /н.паого-врога F2452/, Видимо, данные кластеры являютоя радами Aureoba-fitdium /классы 1-4/ и Ногиопета /классы 6-6/.

Очевидно, что штаммы F2455 и FI2I, исходя из их положения на древе, следует вывести из A.nioroetictuja к pc^aAiireobafildiuii вообще. При jtom их реальный таксономический отщуо остается

неизвестным. Штамм Р121 на древе хотя и является ближайшим к ц.п1его Р2137, но расстояние достаточно велико, сдобы отнести его в род Иай0оп1о11а ,

Гибридизационный анализ амплифицировашой 'с универсальнши праЯмерами ДНК позволяет разделить все изученные штаммы на в гибридизационннх групп, которые, по нашему мнению, представляют собой биологические виды. Следует отметить почти полное соответствие друг другу выделяемых классов . рДНК и гибридизационннх групп. Единственное несущественное исключение состоит в том, что пять штаммов, сформировавшие класс 3 из-за малого А1и1 рДМ£-полимор-физма, не были выделены в отдельную гибридизационнуга группу.

Установлено, что клас ер из 40 штаммов таксономического вида А,ри11а1апа /классы 1-4, малоразлич.шые по критерию рДНК' состоит из трехгибридизационных групп 1-Ш - трех биологических видов АигеоЬаа1(11шп .

Малое сходство паттернов штаммов, входящих в группу I, показывает, что они эволюционировали достаточно далеко друг от друга, чтобы иметь малосходные паттерны, но еще не вышли за пределы • одного биологического вида, т.к. их амплифицированная /|ДК. ещР не утратила гомологию. Это указывает на неоднородность группы и меняющуюся структуру генома изолятов, ее составляющгос. По-видимому, этот еще целостный биологический вид /группа I/ находится в состоянии дивергенции, а выделяемые подгруппы могут быть на-ровдащимися /постепенно отдаляющимися друг от друга/ новыми биологическими видами /рис,5/.

Умеренная внутрення неоднородность группы II показывает, что процессы дивергенции в этом биологическом видеАигооЬаз1сишп не зашли так далеко, как в гетерогенной группе I /рис.Заб,?/.

В целом, говоря о штаммах трех выделяемых биологических видов

лито оЪааШ.иа/группы I-III/, ш полагаем, что обнаруженное отсутствие сайтов нва! -рестрикциям в изученном фрагменте рДНК может быть диагностическим для данных видо/, очевидна, составляющих такономический вид А,ри1-.и1ап8 .

Выделяемый на основе гибридизационного анализа ПЦР-паттернов отдельный биологический вид - группа 1У включает пять штаммов, ранее относимых к таксономическому виду А.ра11и1апа* Эти штаммы, идентичные по пяти рестриктазам, были отличны только при Та<11-рестрикции рДНК отн.таоговрога • Гибридизационный анализ амплифи-¡щрованной ДНК разделяет данные пять штаммов л.ри11и1опа и Н.шаогоорога Р2452 на две'гибридизациошше группы - биологичеокио виды рода ногиоаека • На основании этого мы предлагаем определить группу 1У /пять штаммов А.ри11и1а1ш / как самостоятельный вид Ногиопааа вр . ПЦР-паттерны дакшх пяти иташов очень сходна, однако утверждение о генетической гомогенности и &волщиокной стабильности группы 1У нэ является безусловным из-за ее малочио-ленности /рис.8/,

Таким образом, кото говорить о наличии среди изученных штаммов таксономического вида А.риХХийтш /боз учета родоэой принадлея-ности/ о'иологических видов, дивергировавших значк-саньно /I/, уверенно /II/ и крайне незначительно /1У/,

Способность разных лраймеров вскрывать разг^зд ^гелеяь различий обусловлена, видимо, разной скоростью зеолк^л' гэдшгфицируошх 1Ш локусов. Это цокот быть причиной кг . пепохк-ж шбридизацтоншпс паттернов внутри одного вида /рис,5б/, так м слыЗнх сигналов остаточной гибридизации /рио.Зв/, аа-за тог:-, чго ф^нтабнги паттерна донного штамма, давшие сигнал па "блохе", сохрс!Шя;;, по причине "во&й болоз!>медлешой" ьволюции, частичну» гсшлогию о сооч,взт-ствуюциш фрагментами паттерна зоада« Остаточная гибридизация апплиф •¡цироьанной ДНК имеет мсето внутри ли * с cbaoidr.s-.-a /иозду

. - fc-

группами I-III/ и внутри Иогиопета /между грушами 1У-У/. Такая гомология паттернов недостаточна для утверждения о видовой идентичности, но,видимо, указывает на близость видов и их родство. Необходимы дальнейшие исследования с привлечением далеких видов одного рода для выяснения степени пригодности остаточной гибридизации ПЦР-паттернов выступать дополнительным критерием рода.

Учитывая рассмотренные ранее гетерогенные и в геле и ка радиоавтографе ПЦР-паттерны штаммов биологического вида I и учитывая перекрестную остаточную гибридизации видов I—III Auroobaoidiun /по праймеру 21/, возможно предположить, что в эволюционно нодазнеэ время все эти 40 штаммов составляли одну дивергирующуга груипу н взаимоотношения меаду ни.,.;! были подобны современным отношениям внутри неоднородного вида I, Сам яе вид I, возможно, включает нарождающиеся новые биологические виды - 'сейчас подгруппы I-I - 1-5. Группы II и III как самостоятельные виды возникли недавно и из-далеко эволюционировали как друг от друга, так и от возможно родительского вида I.

Разная скорость эволюции локусов кояет объяснять выявление'при

■ о

УП-ШЦ3 исследованиях консервативных и вариабельных npaihiopoa, которые позволяют вскрывать соответственно меньиуа или большую гетерогенность паттернов изучаемых штампов. В общем виде можно говорить о консерватизме /вариабельности/ праймера при сравнении ГЩР-пат-тернов и в геле и на "блоте" после гибридизации:.

Паттерны разных родов или видов столь ыалосходны или вообще несходны,, что для них выявить консервативный праймоу-'невозгдашо в принципе. Об относительном внутриродовом /межвидовск/ консерватизме праймера мояно говорить при сравнении гибрпдизационных паттернов. Так, праймеры 45 и 3-2 ясно разграничивают вида I—III /рис.Заб/, а праймер 21 показывает их остаточную гибридизацию и,

следовательно, го: родство и поэтому может считаться консервативным.

Только при анализе внутривидовых и внутрипопуляционных отношений при сравнении ЩР-паттернов в геле можно говорить о действительно консервативных и вариабельных праймерах , хотя и это касается достаточно однородных видов, Для вида 1У консервативным является праймор 223 /рис.Ва/, а вариабельным - праймер 21 /рис.8б/. 3 то не время праймер 21 кааетоя достаточно консервативны,: для айда II /рис.7/. Как видно,-один праймер монет играть разную роль для разных видов и в настоящее время проявление праймзра - его способность дифференцировать штамма - теоретически предсказать невозможно.

Малые различия сходных ПЦР-паттераов представляет1 собой ПЦР-пи.ншорфизм, маркером которого являются несовпадающие фрагменты /рис.Ов/. Теоретически такой полиморфизм может быть связан о про-исховдеии«« штатов, однако мы какой-либо корреляции с экологией и географией на выявил:!«

Выделяемые биологические виды I и Пл»гооЬс.в1й:.и:а I исходя из известных нам данных об ш: происхоэдании, могут бь.ть определены как . космополиты, хотя и несколько отличаются разма>К>м экониш: штаммы вида I были выделена на только из природа«?! источников -почвы, ила, растений, базидиоыицзгов /пак и штамма; мзда II/, но и с поверхности полимерных и металлических мат-онавез, Не исключено, что для вида II характерна относительная субстрат*дй специфичность.

Отдельно стоит вопрос о наименовании трех ьыд$лйоных видов А(ггеоЪаз1й1шли видацопаодеиа ер./группа ТУ/, который, возможно, будет разрешен применением традиционных методой таксономии н с n ь'.ап&иилеи типовых культур известных видовдцгооЬвакИип и Иогыопоаа • Вз всяком случае можно предположить» что А.риНиХатш д9£;с1чзит !ЛоК0 является одним из двух достаточяс ;шэгоч;;явзиш ->

видов - или I или II.

Мы сравнили наши результаты с известными данными по биохимии А,ри11и1гша /Блинов и др.,1989/. Морфолого-биохимический критерий позволил вывести за пределыдигооЪав1й1цт штаммы Р2455 и Р121, что согласуется и с нашими выводами. Однако, биологические виды 1-Ш / Аиг<зоЪаа1<1:1.ша / и 1У Аогаопепа / на основе бихими-ческих тестов были отнесены к одному виду л.раИШппа и только генетический подход дифференцировал их.

Мы полагаем, что не биохимический или морфологический, но, прежде всего, молекулярно-генетический подход наиболее адекватно вскрывает основу природных систем - биологических видов.

Выводы

1. Впервые на материале большой колтекции грибов родалигсоЬааД.сПип показано, что гибридизуемость УП-ПЦР-паттернов /гомология амплифнцированной ДНК/ выявляет генетическое единство штаммов

и может служить критерием биологического вида.

2. Впервые для А.ри11и1апз проведен филогенетический анализ штаммов, основанный на компьютерной обработке /пакет ккыр з.З / рестрикционного полиморфизма амплифицировашого фрагмента рибосомной ДНК /ген 5,33 рРНК - спейсер - половина гена 265 рРНК/.

3. Методом УП-ПЦР и на основе рДНК-полиморфизма: а. большинство /40 из 45/ изученных штаммов таксономического вида л.риНиХппа разделено на три самостоятельных биологических вида/ лигооЪааЗ.<Иии , два из которых находятся в состоянии значительной /вид I/ и умеренной /вид II/ дивергенции }

б. пять штаммов А.раНиХапа определено как самостоятельный биологический вид ногаолепа ар •

4» Па основе рДНК-полиморфизш штаты F2455 и PI2I, очень различные ыазду собой» выведены из'¿»mioroDtiotum и рода Aoreobaoidiua.

5. Отсутствие КваХ -сайтов рестрикции в изученном фрагменте рДНК является диагностический для выделенных трох биологи-у ческих видов Aureobaaidiura , очевидно характеризующих таксономический вид A.pullulans ,

6. Корректный быстрый филогенетический анализ штаммов Aureobaaidiu

возможен на основе рДНК-полиморфизт по двум реот-риктазам -Alia и uepl.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1, tiokrousov X«, Bulat S», Elinov Л», llirononko Ii,, Yurlova И, Riboaomal DHA Bi'LPs ia AurGotaaidiuns fun^i revealed by roct-riction analyain оt enzymatioally (polynorase chain reaction) aapliiied riboecsaal ША // Abstracto of tho 15 t Ii International specialised symposium on yeaste, Riga, 1991»тР»94.

2, Мокроусов И.В., Булат C.A, Различение биологических видов гриба Aurcobaoidiuu pullulena (Do Вагу) полимэразной цепной реакции с ушверсальнши прайморамл //t Геьзгшса, 1992. т.28, .'3 4. С. 31-38, .

3, Mokrousov I., Bui at ¡J.t Elinov II., Auroobasidiun phylo£..eny inl'errod froa гША polymorphism // Abatr. £>th lilt .Synp.i'es Atlanta, 1932.