Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гаплоидные технологии в ускоренном создании исходных форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засухе и к Septoria nodorum Berk

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Гаплоидные технологии в ускоренном создании исходных форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засухе и к Septoria nodorum Berk"

4843884

/ у

БЕККУЖИНА САРА САБДЕНОВНА

ГАПЛОИДНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В УСКОРЕННОМ СОЗДАНИИ ИСХОДНЫХ ФОРМ И ЛИНИЙ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ЗАСУХЕ И БЕРТОША NODORUM ВЕПК.

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2011

1 /> ^Пг 2011

4843884

Работа выполнена в Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Калашникова Блена Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Поляков Алексей Васильевич

доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН

Зыкин Владимир Александрович

доктор сельскохозяйственных наук

Шмыкова Наталья Анатольевна

Ведущая организация: ГНУ Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока

Защита состоится 27 апреля 2011 г. в 14-30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д.49. Факс (499) 976-24-92.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан марта 2011 г. и размещен на сайте

http ://www. vak.edu. eov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета

JT.C. Большакова

Актуальность проблемы. Расширение генетического базиса методами селекции на уровне соматических и репродуктивных клеток с включением измененных вариантов, а также константных форм, полученных с помощью гаплоидных технологий в схему традиционной селекции, может обеспечить значительный успех в селекции яровой мягкой пшеницы. Комплексное применение отбора клеточных популяций в селективных условиях и методов гаплоидии повышает эффективность получения растений устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам (B.C. Шевелуха и др., 2008). Кроме того, ускоренное размножение дигаплоидных линий и их включение в различные схемы скрещиваний в настоящее время дает практические результаты.

Яровая мягкая пшеница —■ важнейшая зерновая культура для хлебных районов Северного Казахстана, урожайность которой в Казахстане за последние 10 лет не превышает 1 тонну с гектара, что значительно ниже средних мировых показателей. Это обусловлено почвенно-климатическими условиями Казахстана, сокращением водообеспеченности, засухой, появлением опасных возбудителей болезней, которые являются сдерживающими факторами повышения продуктивности пшеницы. В последние годы распространение болезней зерновых культур наносит значительный ущерб продуктивности и качеству зерна. В рамках сотрудничества Международного центра СИММИТ и сельскохозяйственных НИУ обследованы в северных регионах Казахстана ноля озимой и яровой мягкой пшеницы и ячменя, в результате чего установлено, что распространение особо опасных возбудителей болезней выглядит следующим образом: Tan spot - 10-36%, Septoria nodorum - 3-21%, Bipolaris sorokiniana - 5-9%, Septoria tritici - 7% (Duveiller, 2007). В регионе массовое заболевание септориозом посевов яровой мягкой пшеницы наблюдается в середине и в конце июля из-за заражения пикноспорами, заселяющих пожнивные остатки (Койшибаев, 2006).

Комплексное применение скрининга клеточных популяций в условиях селекции in vitro повышает эффективность отбора яровой мягкой пшеницы к биотическому стрессу.

Исходя из выше изложенного, работа по усовершенствованию схемы селекции пшеницы в условиях in vitro, включающей все звенья отбора клеток под действием различных селективных агентов является актуальной.

Цель и задачи исследования. Цель исследований — создание технологической цепи, включающей традиционные методы селекции и биотехнологические методы, путем усовершенствования эффективности гаплоидных технологий при отборе яровой мягкой пшеницы на устойчивость к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Berk. Задачи исследований:

- создать экспериментальную систему повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выяснить роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы;

- провести селекцию на уровне гамет и гаметоклональных вариантов на

толерантность к абиотическим факторам окружающей среды (водный стресс);

- выявить лучшие формы селективного агента для проведения селекции ш vitro к грибному патогену Septoria nodorum Berk. Провести отбор эмбриоидов и размножить полученные линии, устойчивые к экзометаболитам гриба S. nodorum;

- создать новые перспективные формы и линии яровой мягкой пшеницы с ценными хозяйственно-биологическими признаками на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов с последующим включением их в селекционные программы для облегчения и ускорения селекционного процесса и расширения генетического базиса селекции пшеницы;

- изучить возможность использования белковых и молекулярных маркеров для отбора перспективных форм яровой пшеницы в ранних поколениях. Научная новизна работы. Разработана технология, сочетающая

традиционные и биотехнологические подходы, обеспечивающие расширение генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы.

Создана экспериментальная система повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выявлена роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы. Установлено, что гормоны ауксинового типа действия - ПУК, 2,4-D при обработке растений-доноров, с учетом содержания эндогенного ИУК, стимулируют процесс андрогенеза in vitro. Выявлено, что при предобработке ИУК срезанных растений, эмбриоиды индуцируются из поздних стадий развития микроспор, возможно из пыльцевого зерна. Кроме того, установлено, что предобработка срезанных растений аконитовой кислотой приводит к 100% выживанию индуцированных эмбриоидов и формированию из них растений-рюгенерантов.

Впервые показана возможность разработки новой модификации технологии гаметной селекции, основанной на использовании активно растущего мужского гаметофита для повышения эффективности получения спорофитной генерации. Такой подход позволил получить новые линии яровой мягкой пшеницы, устойчивые к засухе.

Константные формы, а также гаметоклональные варианты включены в программу селекции пшеницы на устойчивость к водному дефициту. Линии-регснеранты превысили стандарт (сорт Акмола 2) по продуктивности и проявили устойчивость к засухе и к полеганию. Полученные линии, в сравнении со стандартом, отличались по своим анатомо-морфологическим признакам и по архитектонике.

Впервые для селекции клеточных колоний пшеницы in vitro, устойчивых к экзометаболитам гриба Septoria nodorum Berk, одновременно применен отбор на уровне репродуктивных и соматических клеток при поверхностном и глубинном выращивании каллусных культур.

Выявлены гибридные комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ

(малатдегидрогсназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.

С помощью RAPD-метода выявлены изменения в геноме потомства растений-регенерантов пшеницы, полученных в результате применения гаплоидных технологий. Определены генетические расстояния между дигаплоидной линией и исходным сортом, а также гаметоклональными вариантами, отражающие степень различия их геномов.

Практическая значимость работы. Отобранные в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы линии переданы селекционным учреждениям, расположенным в различных регионах Казахстана (НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, Карабалыкская СХОС, Актюбинский селекционный центр) для селекционной оценки и включения в гибридизацию. Перспективные линии будут переданы на ГСИ.

Разработанная нами технология получения перспективных форм и линий яровой мягкой пшеницы на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов селекции, может быть применена и к другим злаковым культурам.

Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведения лабораторно-пракгических занятий по курсу «Биотехнология растений» и «Биотехнология сельскохозяйственных культур» в Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина. Основные результаты исследований по гаметоклональной селекции растений вошли в учебник «8с'шд1К биотехнологиясы» (С.С. Беккужина, 2009), рекомендованный Министерством образования и науки PK для преподавания в биологических и агрономических факультетах ВУЗов.

В результате исследований разработан способ получения гаплоидных растений пшеницы с повышенным регенерационным потенциалом, на который получен инновационный патент (2007/0161.1.).

Основные положения, выносимые на защиту:

- Разработана экспериментальная система, способствующая повышению компетенции микроспор для эффективного использования гаплоидной технологии по расширению генетической основы яровой мягкой пшеницы. Баланс фитогормонов является одним из ключевых механизмов переключения микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. У растений-доноров с высоким эндогенным содержанием индолилуксусной кислоты при их дополнительной обработке экзогенной ИУК повышается эффективность пыльцевого эмбриогенеза.

- Создана схема селекции на уровне репродуктивных и соматических клеток, позволяющая отбирать клеточные линии, устойчивые к засухе используя АБК, как фактор, моделирующий водный дефицит. Для получения форм устойчивых к S. nodorum Berk, в качестве селективного агента целесообразно использовать водную форму фильтрата фитопатогенного гриба S. nodorum Berk.

- Создана технология, сочетающая традиционные методы селекции и методы биотехнологии для ускорения селекции яровой мягкой пшеницы по отбору ценных признаков на продуктивность и стрессоустойчивость. Включение потомства растений-регенерантов в схемы классической селекции выявило преимущества комплексного использования этих методов по выявлению линий, обладающих хозяйственно-ценными признаками.

- Белковые и молекулярные маркеры позволяют отбирать перспективные формы яровой мягкой пшеницы в ранних поколениях.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и представлены на различных международных, республиканских конференциях, симпозиумах и совещаниях, в том числе на Международном симпозиуме «Устойчивость растений к биотическим и абиотическим факторам» (Берлин, 2009); Международном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009); Международной научной конференции «Актуальные вопросы биологии в Байкальском регионе» (Иркутск, 2009); IX Конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Москва, 2008); Международной конференции, посвященной 40-летию ГосНИИгенетика (Москва, 2008); Российской конференции «Генетика микроорганизмов», посвященной 100-летию со дня рождения С.А. Алиханяна (Москва-Пущино-на-Оке, 2006); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию РГП «НПЦ ЗХ им. А.И.Бараева» (Шортанды, 2006); Международной конференции, посвященной 50-летию КазАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2007); Международной конференции «Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» (Астана, 2004);на Координационном совещании по Государственной программе 042 (Шортанды, 2001-2005).

Связь работы с крупными научными программами. Теоретические и экспериментальные исследования по диссертационной работе тесно связаны с выполнением Республиканских научных программ Министерства сельского хозяйства и Министерства образования и науки по проектам: - «Расширение генетического базиса яровой мягкой пшеницы с помощью DH-метода»;

-«Усовершенствование методов селекции пшеницы на уровне клеток, выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость к биотическим факторам в морфогенетическом цикле «клетка-растение-клетка».

Публикации Основные положения диссертации изложены в 55 печатных работах, включая научные статьи, тезисы докладов, учебник, учебное пособие, методические рекомендации, инновационный патент.

Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Института биологии и биотехнологии, центра биотехнологии Республики Казахстан, Института Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Института проблем

биологической безопасности, НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Карабалыкской СХОС. Авторство указано в списке опубликованных работ, приведенных в диссертации и в автореферате.

Формулировка идей, планирование экспериментов, обработка первичных данных, их статистико-математический анализ и теоретическое обобщение результатов выполнены диссертантом. Диссертационная работа полностью написана лично автором.

Обоснованность н достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 17 лет, с использованием общепринятых и современных методик, а также разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 3 глав: обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения (7 разделов), а также выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, содержит 46 таблиц, 72 рисунка. Список литературы вюпочает^^источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований использовали яровую мягкую пшеницу Triticum aestivum L.

Пшеницу выращивали на экспериментальном участке КазАТУ им. С.Сейфуллина на мелких делянках, а также в вегетационных сосудах. В исследованиях использованы сорта, линии и гибриды пшеницы (табл.1), предложенные селекционерами НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева.

Селекцию на уровне клеток проводили на сортах, устойчивых к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Berk, и на линиях, отобранных в культуре пыльников.

Селекционую оценку проводили в НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева для линий, индуцированных в культуре in vitro.

Для биохимических анализов и RAPD-анализа использовали перспективные линии и гаметоклональные варианты, полученные в культуре in vitro, а также гибриды яровой мягкой пшеницы.

Методы исследований. Исследования по культуре клеток и тканей растений проводили по общепринятой методике (Бутенко, 1999).

Культивирование пыльников проводили по методике Т.И. Дьячук и др. (1989), а также согласно нашим модификациям, описанным в методических рекомендациях по культивированию пыльников (Беккужина, 1999).

При предобработке срезанных растений пшеницы холодом использовали вещества гормональной природы, а также БАВ (феруловую и аконитовую кислоты). В качестве гормональных веществ изучали действие 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), индолилуксусной кислоты (ИУК), кинетика, гибберелловой кислоты (ГК) и абсцизовой килоты (АБК). Срезанные растения помещали в растворы гормонов и БАВ в концентрации 0,005 - 0,1% и

размещали в холодильной камере при температуре +4°С. Математическую обработку данных проводили по И.И. Елисеевой (2009), А.В.Смиряеву с соавторами (2007), Г.Ф. Лакину (1980) и др., рассчитывали уравнения регрессии и 112— коэффициент детерминации.

Таблица 1. Сорта, гибриды и линии яровой мягкой пшеницы, использованные в работе

Сорта Линии Гибриды

Акмола 2 I0580R'"Z"J К 6506 (США) * Ю 580 R"

Казахстанская раннеспелая' ЛГВ2-92-2'"" Grapp (Франция) * Ю 580 R2"4

Омская 32' ЛГВ1-92-21'" Fason (Германия) * Ю 580 R"

Ишимская 98' ЛГВЗ -692-3-5'"2"j Tantra (Норвегия) * Ю 580 R2"4

Целинная Юбилейная AR-45'_/ Dos х HXL'

Кач/Каиг^аг' 93с' ZelxDuk'

Кустанайская 1' 96 с' TJBx Ишимская'

Эритроспермум141 Лютесценс 164/88^ Cardinal (Германия) * Ю 580" R

Целинная Зс' Лютесценс 94/91-962 Bancuti 118 (Венгрия) * Ю2"4 580 R

Целинная Зс1 Лютесценс 157/882 WW 17260 (Швеция) * Ю" 580 R

Ишимская 92' Лютесценс 101/882 AR-45 * Ю 580 R''4

Достык' Лютесценс 9/89^ Л-16 ячменно-пшеничная линия (Новосибирская обл.) * Ю 580R2"4

Лютесценс 11-94-111" Ф-45 ячменно-пшеничная линия (Новосибирская обл.) *Ю 580R2"4

Л-29-943 Ю 580R * (Кенжегали * Скала)"

Лютесценс 381 М83 Гибриды Fi с 1 по 19 номера1

Шортандинская 25*Акмола 40) * Ю 580R2"4

Гибриды Fi с номерами 22/2000 40/2000, 46/2000,47/2000, 54/2000, 56/2000, 57/2000, 61/2000, 62/2000, 64/2000, 65/2000,76/2000,68/2000, 72/2000, 73/2000, 78/2000, 87/2000 20/2000,98/20002

Примечание: индексами отмечены объекты, использованные в экспериментальных исследованиях: ' - гаплоидные технологии;2 - биохимические и ДНК-анализы;3 - селекция in vitro на устойчивость к Septoria nodorum\4 — селекционная оценка.

Анализ микроспор и пыльцевых зёрен. Цитологические исследования проводили по общепринятым методикам (Паушева, 1970; Кихара, 1968). Работа выполнена в Национальном центре биотехнологии РК (НЦБ РК) в рамках совместной финансируемой научной программы в 2001-2005 годах (Беккужина, Созинова, 2009), в Институте биологии и биотехнологии.

Культивирование пыльников в стрессовых условиях на засухоустойчивость. При гаметной селекции на устойчивость к хлоридному засолению в индукционную питательную среду для культивирования пыльников добавляли в качестве стресс-фактора ЫаС1 в концентрациях 0,01; 0,05; 0,1%. Полученные в этих условиях эмбриоиды переносили на среду В1аус!ез, а часть доращивали на безселективной среде Ыб. Семенное потомство

линии I0580Ro размножали методом микроклонольнот размножения (МКР) и вновь вводили в культуру in vitro. В индукционные среды добавляли растворы NaCl, как и в первом цикле селекции. После И цикла селекции на уровне гамет получены растения-регенеранты (второе семенное потомство K)580Ri), которые вновь включали в III цикл селекции и получали третье семенное потомство I0580R2.

Для отбора эмбриогенных клеток, устойчивых к засухе через культуру пыльников, использовали АБК в концентрациях — 0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,5%. Схема селекции на засухоустойчивость отличается тем, что растения-регенеранты отбирали на средах, содержащих АБК, и размножали на среде без селективного фактора. Признак засухоустойчивости проверяли по количеству зародышевых корней и их длине по методике Г.С. Балык (1979), а так же по методическим указаниям по изучению мировой коллекции пшеницы ВИР (1985). Для отбора засухоустойчивых эмбриональных клеток использовали сорт пшеницы Эритроспермум 14, рекомендованный селекционерами НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева. Статистическую обработку проводили с применением компьютерной программы АРМ «Биометрия».

Единичные растения размножали методом МКР. Семена дигаплоидных растений проращивали на среде Мурасиге и Скуга (MS). Индукцию кущения у молодых проростков вызывали добавлением гибберелловой кислоты и кинстина. В последующем с помощью чередования гормональной и безгормоналыгой среды индуцировали образование дополнительных побегов, которые делили па 3 части: одну часть использовали для микроразмножения, вторую - для укоренения, третью - для тестирования.

Биохимические исследования. Определение запасных белков и ферментного комплекса ЦЦГ ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутаматоксапоацетат-аминотрансфераза).

Для характеристики аллельного состояния ппотенин кодирующих локусов проводили экстракцию глютенинов из индивидуальных зерен методом Galiii, Feldman (1983). Белковую пробу перед фракционированием алкилировали акриламидом. Разделение глютенинов в ДСН (додецилсульфат натриевом) полиакриламидном геле проводили методом Laemmli (1970) в модификации K.M. Булатовой (1985). Высокомолекулярные субъединицы идентифицировали по каталогу (Payne, 1987). Электрофорез запасного белка глиадина проводили по общепринятой методике на базе НИИ Земледелия и растениеводства.

Биохимический анализ ферментного комплекса МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) семян гибридных линии пшеницы F3 проводили по Lowiy (1951) и А.И. Ермакову (1972) в Институте молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина.

Определение суммы растворимых фенолъных соединений в изолированных зародышах и каллусных культурах пшеницы. Клетки зародышей или каллусную ткань экстрагировали 96%-ным этанолом в течение 1 часа, после чего к 0,5 мл этанольного экстракта добавляли 6,5 мл дистиллированной воды и

перемешивали. Прибавляли 0,5 мл реактива Фолина-Дениса, перемешивали, через 3 мин приливали 1 мл насыщенного раствора соды и доводили общий объем до 10 мл дистиллированной водой. Через 1 час определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений при длине волны 725 нм на спектрофотометре.

Определение содержания эндогенных гормонов в растениях пшеницы. Экстракция, очистка фитогормонов (ИУК - индолилуксусная кислота, АБК -абсцизовая кислота, ЦТК - цитокинины, ГК - гибберелловая кислота) выполнены по методике, разработанной в лаборатории регуляторов роста и развития растений РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.

Содержание ИУК, АБК и цитокининов определяли с помощью ВЭЖХ, используя систему приборов фирмы Biotronic. Определение биологической активности гиббереллинов (ГКз) проводили по росту гипокотилей салата сорта Берлинский. Количественно гиббереллины определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали гибберелловую кислоту (Россия).

RAPD-анализ исходного сорта, дигаплоидной формы и гамегоклопальных вариантов. Выделение ДНК и RAPD-анализ проводили по методике Е.З. Кочиевой и др., (1999) в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Определение количества и качества выделенной ДНК проводили на спектрофотометре BECKMAN К-100. Для полимеразной цепной реакции использовали наборы реактивов производства «Биомастер» и «Sigma». В работе использовали десятичленные праймеры, а также коммерческие стандартные олигонуклеотидные RAPD-праймеры серий OPA, OPD, OPE, ОРН, ОРК, OPN ("Operon Technologies", Alameda, California, USA). Всего для выявления полиморфизма между анализируемыми образцами ДНК линий пшеницы использовано 19 RAPD праймеров. На основании матриц с использованием формулы Жаккарда рассчитаны коэффициенты попарных генетических различий между образцами (Sneath et al, 1973). С помощью метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) построена дендрограмма (пакет программ TREECON) (Van de Peer et al.,1994).

Селекция in vitro на уровне соматических и репродуктивных клеток. Селекцию на уровне соматических клеток проводили по схеме Е.А. Калашниковой (2003) и селекцию на уровне репродуктивных клеток в культуре пыльников в соответствии со схемой разработанной автором.

В качестве селективного фактора использовали культуральный фильтрат (КФ) гриба Septoria nodorum Berk., выделенного из посевов пшеницы с опытных полей НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева. Фитотоксины получены из вышеприведенного КФ, а также из изолятов коллекции гриба S. nodorum Berk., которая любезно предоставлена Научно-исследовательским институтом проблем биологической безопасности (НИИПББ) Ш.С. Рсалиевым и М.Б.Орынбаевым.

Выделение и количественное определение фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, проводили в соответствии с методом, изложенным в методических рекомендациях (Кобыльский, Бочарова, 1990).

Экспериментальные работы по накоплению и выделению фитотоксинов проводили в НИИПББ. Принцип метода заключается в том, что фитотоксины, содержащиеся в культуральной среде и мицелиальной массе гриба, экстрагировали этилацетагом и разделяли на отдельные колонки с помощью тонкослойной хроматографии. Для наработки фитотоксичных метаболитов гриба S. nodorum Berk, экстракт разделяли методом препаративной ТСХ на пластинах с толщиной слоя 0,25 мм. Участки хроматограммы, на которых выделялись фитотоксины, изолировали и элюировали с помощью этилацетата (5:1) (Devys et al., 1980). В дальнейшем 5 фитотоксинов в комплексе добавляли в культуральную среду, предназначенную для культивирования зародышей и пыльников, а также в суспензионную культуру клеток пшеницы.

Полевые испытания лшшй-регенераитов и их использование в селекционных программах. Посев семян изучаемых образцов в питомнике конкурсного сортоиспытания проводили в оптимальные для зоны сроки сеялкой ССФК-7. Площадь делянок — 24-50м2 в четырехкратной повторности. Стандартом служил районированный сорт Акмола 2. Уборку проводили в сентябре комбайном Сампо 130.

Фенологические наблюдения, оценку и учет состояния растений по фазам развития проводили в соответствии с методическими указаниями Госкомиссии по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур.

Урожайность определяли весовым методом с пересчетом на 14% влажность.

Содержание белка определяли на анализаторе инфракрасном -Инфраматик 8620 А; содержание и качество клейковины - МОК-1М, ИДК-ЗМ; физические свойства теста (сила муки, отношение упругости к растяжимости Р/1) - на альвеографе; разжижение теста - на фаринографе; натура зерна - по ГОСТ ИСО-7971-2-2002 (ГОСТР ИСО 7971-2-99).

Математическая обработка данных проведена по методике Б.А. Доспехова (1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Повышение эффективности экспериментальной гаплоидии для расширения генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы

Сложность механизмов спорофитного пути развития микроспор и регуляция спорогенных клеток в условиях in vitro является важнейшей проблемой гапалоидных технологий. В компетенции микроспор наряду с другими можно выделить два основных фактора, определяющих переключение программы развития клетки с гаметофитного на слорофитный путь развития: 1) генотип растения-донора; 2) баланс эндогенных и экзогенных фитогормонов.

Вышеназванные и многие другие проблемы экспериментальной гаплоидии остаются открытыми, и это является сдерживающим фактором широкого практического использования дигаплоидных форм в селекционных программах.

1.1 Выяснение компетенции микроспор в культуре пыльников пшеницы

В результате исследований установлено, что эффективность пыльцевого

эмбриогенеза зависит не только от стадий развития микроспор, но и от процентного содержания микроспор, находящихся на оптимальной стадии развития в момент инокуляции пыльника.

Несмотря на то, что растения были срезаны в одинаковую фазу развития, микроспоры внутри пыльника находились на разных стадиях развития. Это можно объяснить, во-первых, тем, что пыльники фиксировали до синхронизации микроспор. Во-вторых, даже внутри одного пыльника микроспоры могут быть на разных стадиях развития, и их синхронизация холодовой обработкой является недостаточной. По литературным данным известно, что наиболее оптимальной стадией развития микроспор, которая может переключиться и развиваться по спорофитной программе, является сильновакуолизированная стадия, когда ядро находится напротив поры.

По результатам наших исследований, эффективность пыльцевого эмбриогенеза повышается только в том случае, когда доля микроспор, находящихся на 2-ой фазе развития, т.е. перед сильной вакуолизацией, составляет более 40 % (рис.1).

П №19

1,4(0.55-2.6) 5.7(4.8:7.8)

0.7(0,16 И.6)------I / 109(84-14,41

(4,0:8,1) —_ | Г .....

1.1(0.,37:3.2)_

0.3(0.21 : 1.5}

4,6(2.0:6.6} 6,7(4.7:5.1)-Л

20,4( 16.9 :23,9}

Ы'1 Ы 2 и'З Ы 4 Ьй 6

а

Р1 №5

7,0(4.9:9.4)

I .__13.0(10.2 : 16.0)

Й- ,

V'*' • •■,

Ы1 Ы2 УЗ Ы 4 ^ 5 ^16 М 7 б

Р1 №11

2,2(1,1+3,7) 3,8(2,3-5,6)

6,3(4,3+8,5)

т

37.6(33.4 :41,8) —

ш\

42.2(37.9:46.5) Ш 1 Ы 2 Ы4 Ы 5 и 6 £^7

В

2,3(1,2+3,8)-1,6(0,69+3,9)-

41,2(36,9+45,5) ууяк^*'-•-.- ЯЛЗЯ 7+46 П)

I 2 ..... 3 Е8 А И 5 ь - 6 , 7

Г

Рис. 1 Процентное содержание микроспор находящихся в пыльнике на разных фазах развития в момент срезки растений (гибриды К] яровой мягкой пшеницы): а - К] №3, б - Р, №19, в - Р, №5, г - К, №11

Примечание-И} №3, И] №19, Р] №5, №11-номера гибридов первого поколения. 1-7 фазы развития микроспор: 1-микроспора с невакуолизированной цитоплазмой с центральным ядром,2-передвижение ядра к противоположной поре прорастания, 3-силыювакуолизированная микроспора, 4-пыльцевое зерно после завершения первого митоза, 5,6-ранняя и поздняя фазы развития двухклеточного пыльцевого зерна,7-зрелое пыльцевое зерно.

Например, у гибрида F] № 3 доля микроспор в этой фазе развития составляет 66,5% и в этом случае выход гаплоидных структур отмечается в 8,4%, случаев, а у гибрида Fi №19 количество микроспор, находящихся на 2-ой фазе развития составляет 59,9% и пыльцевой эмбриогенез равен 6,6 %, в то время как у гибридов, где количество микроспор перед сильной вакуолизацией составляет 40% выход эмбриоидов в 2 раза ниже.

Кроме того, нами установлено, что пыльцевой эмбриогенез можно индуцировать из микроспор, находящихся на второй и третьей стадии развития при исключении дополнительных предобработок веществами гормональной природы. При этом процентное содержание микроспор на данных фазах развития должно составлять более половины от общего числа микроспор.

Таким образом, при повышении эффективности гапалоидных технологий на первом этапе основным моментом является регуляция спорогенных клеток в условиях in vitro. При этом наряду, с другими факторами, определяющими переключение программы развития клетки с гаметофитного на спорофитный путь развития, является синхронизация микроспор на оптимальной стадии развития в момент инокуляции пыльника.

1.2 Роль гормональных факторов и биологически активных веществ в индукции спорофитного пути развития микроспор пшеницы

Обсуждая роль фитогормонов в процессе эмбриогенеза in vitro, исследователи чаще всего говорят о содержании гормонов в индукционной среде. Однако эти данные малочисленны и совершенно отсутствуют сведения о применении предобработок растений-доноров биологически активными веществами и фитогормонами. Поэтому данное направление исследований представляет интерес. Известно, что обработка растений, срезанных на ранних этапах органогенеза, оказывает существенное влияние на спорофитный путь развития микроспор.

В работе изучали влияние факторов гормональной природы (кинетин, 2,4-D, ИУК), а также феруловой и аконитовой кислот на эмбриогенез в культуре изолированных пыльников пшеницы.

Установлено, что обработка колосьев гормонами в некоторых вариантах увеличивает частоту выхода эмбриоидов в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия. Например, кинетин в малых концентрациях повышает выход эмбриоидов. Однако увеличение концентрации данного гормона до 0,2 %, а для некоторых генотипов и до 0,3% снижает учитываемый показатель (рис. 2).

Ишимсга95

у - 6,0682х - 6,0744х + 0:4818 Я2 = 0,2467

1 *

а. 0,8

— О.Б * +

' 0,4 |»,2

Д 0 - * ♦

■0,2 0,02 ,04 0,06 0,0 0,1 0,12

концентрации кинетика

-Полиномиальный (Эмбриогенез, Я)

Целинная юбилейная Г М* ■ »,ТОх+!

И2 = 0,3467

0,1 0,12

концентрации кинетина

-Полиномиагьный[ (Эмбриогенез, %)

а б

Рис. 2 Индукция пыльцевого эмбриогенеза при обработке срезанных растений кинетином: а - Ишимская 98; б - Целинная-Юбилейная

При обработке срезанных растений гормонами ауксинового типа действия (2,4-0) выявлено, что повышение концентрации гормона увеличивает частоту выхода эмбриоидов у всех изучаемых генотипов (рис. 3). Например, частота образования эмбриоидов у линии Ю58(Ж в контроле составило 0,6%, а при обработке 0,04%-ным раствором 2,4-0 этот показатель повысился до 3%. Для сорта Целинная-Юбилейная при обработке срезанных колосьев 2,4-0 в концентрации 0,03% выход эмбриоидов составил 8%.

Результаты математической модели показывают, что параметр детерминации для всех сортов одинаково высокий, за исключением сорта Ишимская 98.

Казахстанская раннеспелая

0.04 О.Об 0.08

Концентрации 2,40, %

у = -831,59х + 8 1,939х + 1,0145 Я2 = 0,7685

« Эмбриогенез, %

(Эмбриогенез, °/о)

0,02 0.04 0,06 0,08 Концентрации 2,4Р

0,7451

|, %

эНЫЙ

3, %)

В

§ 1,5 а о,5

й о

-0,5

г

Рис. 3 Индукция пыльцевого эмбриогенеза при обработке срезанных растений 2,4-1): а -Казахстанская раннеспелая, б - ГО580К, в - Целинная-Юбилейная, г - Ишимская 98

Результаты экспериментальных исследований по предобработке колосьев ИУК представлены на рисунке 4. Как следует из результатов, частота образования эмбриоидов находится в прямой зависимости от концентрации ауксина. Исключение составили лишь линии Ю58011, ЛГВ 20/92-2, для которых повышение концентрации исследуемого вещества до 0,05% для Ю580Я и 0,04% для линии ЛГВ 20/92-2 приводит к резкому снижению частоты индукции эмбриоидов.

Предобработка срезанных растений аконитовой кислотой не оказала существенного влияния на частоту эмбриогенеза. Однако, эмбриоиды, полученные в этом варианте, проявили высокий морфогенетический потенциал, в результате чего в 100%) случаев из них формировались растения-регенеранты, что не было отмечено в других вариантах.

Ишимская

0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 концентрации 2,4П

у=273,97х2- 13,491 х + 0,0934 Я2 - 0,9886

♦ Эмбриогенез, %

-Полиномиальный

(Эмбриогенез. %),

концентрации ИУК

у = -760,45х + 48,918х + 1.2027 Я2 - 0,0709

1 1р 0,02 0,04 0,06 0,0в\ 0,1 0,12

♦ Эмбриогенез, %

!

I-Полиномиальный 1

[ (Эмбриогенез. %) \

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 концентрации ИУК

у= Ю2,38х" + 31,177х + 1,1826; Я2 = 0.8838

Эмбриогенез, %

- Полиномиальный (Эмбриогенез, %)

5 г 4,5 4

а" 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

Ишимская 98.

4 6

концентрации ИУК

■ у = 0,0845х" - 0,3964х + 1,8286 Я2 = 0,8843

Ряд1

10 -Полиномиальный:

I______(Ряд1)______ __!

ЛГВ 20/Э2-2

у -581,78х + 49.562Х «• 4,9332 Я2 = 0,103 7

0,02 0,04 0,06 0,08 концентрации ИУК

Эмбриогенез,

- Полиномиальный ^Эмбриогенез, %)

ЛГВ 1 /92-2

0.04 0,06 0,08

концентрации ИУК

у = 289,1 Ix -I- 32,729х + 1,9328 R2 = 0,9 I 93

Эмбриогенез, %

- Полиномиальный

(Эмбриогенез, %)

ЛГВ 6 /92-3-6

0,04 0,06 0,08 концентрации ИУК

у - 805,Обх2 + 36.291X + 1.441 R2 -0.9737

Эмбриогенез, %

-Полиномиальный j (Эмбриогенез, %),

Рис. 4 Влияние предобработки срезанных растений ИУК на пыльцевой эмбриогенез: а - I0580R, б - Акмола 2, в - Ишимская 98, г - ЛГВ2/92-2, д - ЛГВ1/92-2, е - ЛГВ6/92-3-5

При индукции пыльцевого эмбриогенеза одним из запусков сигнала спорофитного пути развития микроспор является определенное содержание эндогенной и экзогенной индолилуксусной кислоты (ИУК). Ответная реакция культуры пыльников при предобработке срезанных растений ИУК зависит от эндогенного содержания ИУК в момент инокуляции пыльника. Например, в работе В.Ю. Горбуновой (2000) показано, что экспланты с высоким содержанием эндогенных ИУК и АБК способны регулировать морфогенетические процессы в культуре пыльников пшеницы при отсутствии экзогенных гормонов. В то время как для сортов с низким содержанием ИУК, микроспоры не могут переключиться на спорофитный путь развития и для этого необходимо присутствие в питательной среде ауксина, в частности 2,4-D, в повышенных концентрациях.

Наши результаты согласуются с литературными данными. Однако в работе нами модифицирован регламент предобработки растений: срезанные растения обрабатывают ИУК в концентрации 0,005 - 0,1% в течение 7-10 суток с последующим культивированием пыльников на среде не содержащей ИУК.

После определения эндогенного содержания фитогормонов (табл. 2) установлено, что индукция андрогенеза in vitro находится в прямой зависимости от уровня гормонов в растениях. Обработка ИУК повышает частоту образования эмбриоидов у линии ЛГВ2/92-2. У данной линии эмбриогенная способность в контрольном варианте составляет 5,1%, а при

обработке растений 0,04%-ным раствором ИУК - до 8%.

Таблица 2. Эндогенное содержание фитогормоиов в надземной части растений

яровой пшеницы в фазе кущения

Варианты опыта ИУК, нг/г сухого веса ЦТК, мкг/г сухого веса ГК, нг/г сухого веса АБК, нг/г сухого веса

I0580R 18,50 ±1,2 2,26±0,40 44,98±2,8 290,9±2,8

ЛГВ 20/92-2 37±3,1 1,17±0,2 598,58±1,3 145,5±1,2

ЛГВ 6/92-3-5 18,5±1,5 3,35±1,1 364,68±3,9 872,7±1,9

ЛГВ 1/92-2 17,50±2,3 1,94±0,2 69,2±2,3 436,4±2,6

Таким образом, вариабельность концентраций гормонов является генотиизависимым показателем, и оптимизированные для одного генотипа условия культивирования не могут подходить для других гибридов, сортов и линий. Сложность изучения гормональной регуляции связана с интегральным характером морфогенетических процессов и их зависимостью от многих внешних и внутренних факторов (Бутенко, 1975).

Следующим этапом нашей работы был цитологический контроль пыльников, обработанных ИУК. На основе полученных данных мы предположили, что обработка ИУК вызывает аномалии, которые зависят от концентрации и продолжительности обработки. Например, результаты, полученные на сорте Ишимская 98, свидетельствуют о том, что при обработке колосьев 0,5 % ИУК в течение 10 суток возрастает количество аномалий в пыльце, которое составляет 7,3%, а выход эмбриоидов в этом варианте возрастает до 4,5%. У сорта Акмола 2 без применения обработки растений ИУК, аномалии в пыльце отсутствуют, и пыльцевой эмбриогенез составляет 1,4%. При обработке 0,01%-ным раствором ИУК процент аномальной пыльцы у этого сорта составляет 16,6% и частота выхода эмбриоидов повышается до 5,2%.

Установлено, что предобработка растений-доноров ИУК повышает интенсивность развития микроспор, что приводит к индукции эмбриоидов из поздних стадий развития микроспор и, вероятно, из аномальной пыльцы. Аномалии представлены в виде увеличения количества спермиев в пыльцевом зерне. Образование эмбриоидов из гамет теоретически возможный путь при андрогенезе in vitro, но изолирование спермиев методически очень сложно. Мы предполагаем, что эмбриоиды, индуцированные при обработке ИУК, имеют своё происхождение из спермиев. Данное предположение подтверждено кариологическим анализом растений.

1.3 Селекция пшепицы на устойчивость к абиотическим стрессам на

уровне гамет

Методы биотехнологии являются альтернативными методами изучения механизмов стрессоустойчивости и отбора осмотолерантных клеток. Особого внимания заслуживает клеточная селекция, позволяющая в условиях in vitro отбирать из миллионов клеток стрессоустойчивые клетки и получать из них растения-регенеранты.

Одной из возможностей использования гаплоидных технологий является индукция гаметоклональной вариабельности при селекции на уровне гамет.

Для отбора яровой мягкой пшеницы на солеустойчивость в культуре in vitro изолированные пыльники культивировали на среде, содержащей стресс фактор NaCl в концентрациях 0,01; 0,02; 0,05; 0,1%. Через 3 недели культивирования на растрескивающихся пыльниках наблюдали образование эмбриоидов и каллусной ткани.

Полученные эмбриоиды переносили на среду Blaydes без добавления соли (I цикл селекции на уровне гамет). Из спонтанных дигаплоидных растений, отобранных по морфологическим признакам, без обработки колхицином получено семенное потомство I0580R0.

Далее линия I0580Ro была размножена в условиях in vivo и вновь введена в культуру пыльников, где в индукционные среды добавляли так же, как и в первом цикле селекции NaCl в различных концентрациях.

При проведении II цикла селекции на уровне гамет, получены растения-регенеранты и их второе семенное потомство (K)580Ri), которое было вновь включено в цикл селекции (III цикл). В результате культивирования пыльников на селективных средах, получены единичные растения-регенеранты (табл. 3).

Таблица 3. Влияние условий засоления на пыльцевой эмбриогенез

Концентрации селективного агента-NaCl, % Количество посаженных пыльников, шт. Количество эмбриоидов, шт. Частота образования эмбриоидов, %

Целинная-Юбилейная — I цикл

Контроль 200 4 2,0 (0,96-4,30)

0.01 800 17 2,1 (1,0-3,50)

0.05 9 20 1,6 (1,00-3,50)

0,1 720 7 0,9 (0,26-1.90)

Ю580 R0 - II цикл

Контроль 480 14 2,9 (1,6-4,5)

0,01 510 16 3,1 (1,7-4,8)

0,05 723 19 2,6 (1,44-,2)

0,1 617 i 10 1,6 (0,69-2,9)

Ю580 R, - III цикл

0,01 500 17 3,4 (2.0-5,1)

0,02 160 9 4,2 (2.7-6.0)

0,05 500 12 2,4(1,20-3.9)

0,1 580 13 2,2(1,1-3,6)

Из растений-ргенерантов после III цикла селекции отобрана солеустойчивая линия I0580R2, которая была размножена in vitro и оценена в полевых условиях.

1.3.1 Ускоренное размножение устойчивых линий, их тестирование и

полевая оценка

Полученная нами в результате гаметной селекции линия 105801*2 в лабораторных условиях была размножена методом МКР, при этом использовали питательную среду, содержащую ЫаС1 в концентрации 1%.

Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что линии отобранные в стрессовых условиях, через культуру пыльников, более устойчивы к №С1. Например, по сравнению с исходным сортом при размножении линии Ю58(Ж| на среде с селективным агентом из 7 побегов образовалось 32 дополнительных побега. Необходимо отметить, что у линии Ю580Я|, способность к размножению была ниже, чем у 105801^ полученной после трех циклов селекции на солевой среде, где количество дополнительных побегов составляет 60 из 11 первоначальных побегов.

Таблица 4. Способность к дополнительному побегообразованию па солевой среде при _чередовании гормональной н безгормональной среды _

Сорта и варианты селективного фактора Количество побегов, шт Количество дополнительных побегов, тт Ср. коэффициент размножения, шт.

Целинная-Юбилейная — контроль 15 56 3,7±0,4

Целинная-Юбилейная -1%№С1 6 18 3,3±0,6

10580111 контроль 14 68 4,8±1,0

105 80Я, 1%ЫаС1 7 32 4,5±0,8

Ю580Г<2 контроль 15 80 5,3±1,1

Ю580К2 1% №С1 11 60 5,4±1,0

На питательной среде, содержащей селективный агент в концентрации 0,01; 0,05; 0,1% путем прямой регенерации отобраны гаметоклональные варианты и получено семенное поколение (табл. 5).

Таблица 5. Индукция эмбриоидов и регенерация растений в культуре пыльников при _солевом стрессе третьего семенного поколения линии 10580^_

Концентрация N30, % Количество пыльников, шт. Частота выхода эмбриоидов, % Регенерация растений, шт.

0,01 1562 1,4 (0,56-2,60) 20

0,05 1448 0,7 (0.16-1,60) 6

0,1 1949 0,7(0.16- 1,60) 1

На селективной среде содержащей №С1 в концентрации 0,1% отселектировано 1 растение, которое в дальнейшем будет именоваться, как ЛГВ1-92-2 (Лютесценс гаметоклональный вариант), на среде содержащей 0,05% ЫаС1 - 6 растений (ЛГВЗ-692-3-5), а на среде содержащей 0,01% №С1 -

20 растений (ЛГВ2-92-2).

Сорт стандарт Акмола 2 и линия IO58OR2, а также гаметоклональные варианты, отобранные на солевой среде из линии I0580R2l были оценены в полевых условиях (НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева) (табл. 6). Установлено, что полученные линии проявили устойчивость к засухе на уровне стандарта, и превысили стандарт по устойчивости к полеганию. Среди всех линий выделяется линия ЛГВЭ-692-3-5, которая в 2005 году превысила стандарт по засухоустойчивости.

ГТри проведении селекции растений in vitro на солеустойчивость проявление засухоустойчивости растений вполне объяснимо, так как признаки солеустойчивости и засухоустойчивости тесно связаны с механизмами осмоса. Окислительный стресс приводит к нарушению, например, структурных и ферментативных белков, липидов мембраны.

Таблица 6. Результаты полевых испытаний растений-регенсрантов линии 10580112 на устойчивость к засухе и полеганию по сравнению со стандартом Акмола 2 (баллы)

чх Годы \11сш.1ташш Линии 2004 г. Устойчивость 2005 г. Устойчивость 2006 г. Устойчивость

к засухе к полеганию к засухе к полеганию к засухе к полеганию

Акмола 2, st 9 7 7 7 9 7

I0580R2 9 7 7 9 9 7

ЛГВ1-92-2 9 9 7 9 7 9

ЛГВ2-92-2 9 9 7 5 7 9

ЛГВЭ-692-3-5 9 9 9 9 9 9

При проведении полевой оценки установлено, что линия K)580R2 обладает засухоустойчивостью, которая достигалась в основном за счет биологических свойств растений и характеризовалась удлиненным периодом «всходы-колошение» (45-46 суток). Как правило, такие сорта имеют несколько замедленные темпы роста в начальной стадии развития, следовательно, менее требовательны к влаге в период майско-июньской засухи и более эффективно используют июльские осадки. Засухоустойчивость линии подтверждена не только полевой визуальной оценкой, но и способностью растений формировать большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи. Линия I0580R2 по сравнению со стандартом (Акмола 2), отличалась анатомо-морфологическими признаками и общей архитектоникой.

Таким образом, нами разработана технология гаплоидной селекции пшеницы in vitro на микроспорах, предусматривающая проведение ступенчатой селекции на устойчивость к абиотическому стрессу с последующим тестированием полученных растений.

1.3.2 Отбор засухоустойчивых растений-регенерантов при проведении селекции на уровне гамет

Растения, подверженные недостатку влаги, претерпевают определённые биохимические изменения. Известны работы по изучению генных локусов у Trititicum aestivum, Hordeum vulgare, Seeale cereale, ответственных за устойчивость к обезвоживанию. Одним из биохимических путей, включающих ответ на уровне генов к недостатку влаги, является метаболизм, зависимый от концентрации абсцизовой кислоты.

В связи с тем, что АБК включает систему ответной реакции растений на стресс, целью данной серии экспериментов является отбор гаплоидных растений на засухоустойчивость через культуру изолированных пыльников. Для этого в питательную среду при культивировании пыльников добавляли АБК в концентрациях 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1% (табл. 7). В качестве исходного сорта использовали Эритроспермум 14.

Таблица 7. Влияние АБК на индукцию пыльцевого эмбриогенеза

Концентрация АБК, % Количество пыльников, шт. Частота образования эмбриоидов, %

Эритроспермум 14 — I цикл

Контроль 612 2,6 (1,30-И,20)

0,005 754 2,5 (1.304-,20)

0.01 500 2,4 (1,20-3,90)

0,02 750 2,2 (1,10-3.60)

0,05 418 1,4 (0,56-2.60)

0,1 480 0,8 (0,06-0,02)

0,5 413 0

Эритроспермум 14 Ro — II цикл

0,05 450 2,0 (0.96 -3,40)

0,1 347 1,4 (0,56-2,60)

0,5 603 1,4 (0,56-2,60)

Эритроспермум 14 R]— III цикл

Контроль 345 2,0 (0,96-3,40)

0,05 100 4,0 (2,4 -5,90)

0,1 801 1,9 (0,89-3,30)

0,5 145 2,0 (0.96-3,40)

В условиях селективного фактора индуцировано 111 эмбриоидов, которые в дальнейшем переносили на среду В1аус1е8 для регенерации растений. Семенное потомство единичных растений-регенерантов (АЯо45) использовали во втором цикле селекции (АБК присутствовала в среде в концентрации 0,05%, 0,1%, 0,5%). Из растений-регенерантов, отселектированных в этих условиях, получены растения второго семенного потомства (А11145), которые вновь вводили в культуру пыльников и проводили 3-й цикл селекции на средах, содержащих АБК. Растения, отобранные путём гаметной селекции, после 3-го

цикла названы АЯ245.

Регенерационный потенциал эмбриоидов, индуцированных в культуре пыльников на средах в присутствии АБК, показан в таблице 8.

Таблица 8. Регенерация растений из эмбриоидов в 3-х циклах селекции на средах,

Концентрации АБК, % Регенерация растений,%

I - цикл II - цикл III - цикл

Контроль 75,0 (78.7-71,2) 100 (99,8-100) 71,0 (74,9-67,0)

0,005 68,4 (72,4-64,3) 61,5(65,7- -57,2) -

0.01 100 (99,8-100) 75,0 (78.7- -71,2) -

0,02 52,9 (57,2-48,5) 50,0 (54,3- -45,6) -

0,05 50,0 (54,3-45.6) 40,0 (44,2- -35,7) 100 (99,8-100)

0,1 50,0 (54,3-45.6) 33,3 (37,4- -29,1) 81,2 (77,61-84,5)

Данные таблицы свидетельствуют о том, что на первом и на втором цикле селекции растения-регенеранты получены во всех вариантах селективных сред. Однако в процессе дальнейшего культивирования (3-й цикл селекции) пыльников на селективных средах частота эмбриогенеза резко снижалась. Исключение составили варианты питательных сред, в которых АБК присутствовала в концентрациях 0,05 и 0,1%. Регенерационный потенциал в этих вариантах составил 100 и 81,2%, соответственно. Можно предположить, что только устойчивые к водному дефициту клетки могли обладать способностью к регенерирации на селективных средах, содержащих повышенные концентрации АБК.

Таким образом, в результате селекции на уровне репродуктивных клеток получены линии, которые отличались по длине зародышевых корней и их количеству. Однако при статистической обработке по длине корней двух линий JI1, Л2 и исходного сорта Эритроспермум 14 разница между вариантами была не существенной.

Оценку устойчивости к засухе в лабораторных условиях проводили согласно методическим разработкам изучения мировой коллекции пшеницы ВИР (1985) по количеству зародышевых корней. Среди полученных растений отобраны образцы образующие по 5 и более корней, которые в дальнейшем размножали в условиях in vitro (рис 5). Полученным линиям дано общее название AR45 и эти линии переданы в НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева для использования их в селекционном процессе.

Во многих зерносеющих районах морфология листа является одним из важных признаков при получении растений, устойчивых к засухе. При полевой оценке, отобранная нами линия AR45, по сравнению со стандартом (Акмола 2), отличалась анатомо-морфологическими признаками и архитектоникой. У данной линии формировалась большая листовая поверхность и флаговый (верхний) лист располагался по отношению к стеблю под углом 45-55°С, что способствует меньшему испарению влаги в условиях засухи.

Рис. 5 Проростки, формирующие более 5 корней

При полевой оценке линия AR45 показала устойчивость к засухе поэтому в дальнейшем она была включена в гибридизацию по признаку засухоустойчивости. В настоящее время проводится отбор по хозяйственно-ценным признакам.

Таким образом, использование гаметной селекции имеет определённые преимущества, так как селекция мужского гаметофита может иметь позитивный эффект на появляющуюся в результате спорофитную генерацию. Разработанная нами схема селекции на уровне репродуктивных клеток позволяет получать осмотолерантные растения, о чём свидетельствует оценка полевых испытаний в течение нескольких лет.

1.4 Селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам фитонатогенпого гриба Septoria nodorum Berk, на уровне соматических и

репродуктивных клеток |

Целью данных исследований является усовершенствование схемы селекции in vitro, которая в отличие от классической схемы включает все звенья отбора клеток под действием различных форм селективных агентов. При селекции in vitro использовали: культуральный фильтрат (КФ), фитотоксины и водную форму грибного фильтрата (ВФГФ) S. nodorum Berk.

Токсинами гриба S. nodorum являются охрацин или меллеин, а также 3 производных дигидроизокумарина и микофеноловая кислота. 1

Для расширения генетической основы пшеницы по устойчивости к грибной инфекции необходимо проводить и гаметную селекцию в условиях in I vitro. Однако работы в этом направлении малочисленны. Во-первых, это связано 'i со сложностями методологического характера индукции пыльцевого эмбриогенеза. Во-вторых, мало изучен регенерационный потенциал гаплоидных структур и не ясны многие причины абортируемости пыльцевых | зародышей. В-третьих, формируются в большом количестве альбиносные растения.

В наших исследованиях изучали токсическое действие КФ как на уровне целого растения, так и на уровне клеток (рис. 6).

Токсичность.'л дни наблюдений 3-й

Рис. 6. Токсическое действие 50% КФ на прорастание семян

Примечание* Отклонение от средней арифметической на 50% КФ и контрольном варианте I Разница между вариантами существенна*: td>to5 Л 11-94-111 побеги 9,9>2,04*; корни 14,8>2,04* Л 29-94 побеги 15,4>2,04*; корни 3,45>2,04* 93 с побеги 9,6>2,04*; корни 12,8>2,04*

Полученные данные (рис. 6) свидетельствуют о том, что на 3-сутки культивирования токсичность КФ в концентрации 50% на уровне прорастания семян составляет около 60% для всех изучаемых генотипов. Данная концентрация КФ проверена и на уровне каллусных клеток. Установлено, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде снижается прирост I каллусной ткани для всех исследуемых генотипов.

Выделение и идентификация фитотоксичных метаболитов гриба Septoria nodorum и использование фитотоксинов в селекции in vitro 1 Согласно поставленным целям исследований, из накопленной биомассы

фитопатогенного гриба S. nodorum получен этилацетатный экстракт, который разделяли методом препаративной ТСХ. При хроматографировании с использованием реактива Фолина-Чикальто было выявлено присутствие 5-и фитотоксинов — ФТ-1, ФТ-2, ФТ-3, ФТ-4, ФТ-5, которые отнесли к классу фенольных соединений. Полученные данные подтвердили ранее выявленные Е.В. Бочаровой (1991) токсины фитопатогенного гриба S. nodorum и позволили отнести их к группе кумаринов и изокумаринов.

Таким образом, доказана идентичность фитотоксинов выделенных нами ! из культурального фильтрата и экстрактов, полученных из мицелия гриба S. nodorum.

Отбор клегок, на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum при поверхностном выращивании каллусной ткани

Для выявления эффективной формы селективного агента, выделенные 5 фитотоксинов смешивали и в комплексе добавляли в питательную среду MS в концентрациях от 0,01 до 0,05%, на которой индуцировали каллусогенез. На сортах пшеницы 381МС и Лютесценс 11-94-111 с помощью относительного расчета прироста каллусной ткани выявлено токсическое действие комплекса фитотоксинов (рис. 7). Для исследуемых генотипов характерна одинаковая

ответная реакция клеток на присутствие селективного агента в питательной среде. Установлена закономерность: с увеличением концентрации фитотоксинов в питательной среде уменьшается прирост каллусной ткани.

381MS

■у = -1290,Зх + 37.718 г =0,9766 R2 = 0,9538

относительный прирост

-Линейный (относительны й прирост)

концентрации токсина,

L-1194-111

у = -840,52х + 22,423 т = 0,9733 R'» 0,9474

Линейный (относительны й прирост}

Я б

Рис. 7 Зависимость интенсивности роста каллусной ткани от концентрации фитоксина гриба Septoria ttodorum в питательной среде: а- сорт 381MS; б - сорт Л-11-94-111

Полная реализация поставленной задачи по усовершенствованию клеточной селекции на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum требует включения в схему экспериментальных исследований получение морфологически выровненной суспензионной культуры.

Выявлено, что активный рост клеточной суспензии наблюдается на 7 сутки культивирования. Более длительное выращивание каллусных клеток в условиях глубинного культивирования приводит к некротизации и дальнейшей гибели клеток. Полученные клеточные колонии после II пассажа с хорошей пролиферативной способностью использовали в селекции in vitro.

В результате исследований установлено, что в стандартных условиях культивирования получена стабильная суспензионная культура, характеризующаяся присутствием одиночных клеток. В то время как при введении фитотоксинов в среду, клетки слипались и образовывали крупные агрегаты, а доля одиночных клеток при этом снижалась до 25%.

Выделение водной формы культурального фильтрата фитопатогенного гриба 5. nodorum и изучение его токсичности для селекции in vitro Цель данной серии экспериментов — модифицирование методики выделения фибного фильтрата. Для того чтобы приблизить селективный фактор к природным условиям, использовали не отдельную чистую культуру гриба, а возможные условия совместного культивирования гриба и семян пшеницы. Изучали токсичность данной формы фильтрата, выделенной при совместном культивировании, для проведения селекции in vitro.

Методика выделения грибного фильтрата. Чистую культуру патогена выращивали совместно с семенами пшеницы на воде с добавлением 3 % сахарозы в течение 5-30 суток. Затем суспензию гриба фильтровали через бумажные фильтры 2 раза, после чего полученный фильтрат в концентрации 30% и 50% добавляли в заранее проавтоклавированную питательную среду в качестве селективного фактора.

В результате проведённых исследований выявлено, что цвет водного

фильтрата, начиная с 30 суток с момента культивирования гриба в условиях in vitro, не менялся, что свидетельствует об окончании накопления токсинов в среде.

Полученный водный фильтрат гриба (ВФГФ) в дальнейшем был использован для определения его фитотоксичности. Работу проводили на семенах и хорошо пролиферирующей каллусной ткани.

Установлено, что при совместном выращивании семян с 50% ВФГФ наблюдается угнетение роста корней и надземной части проростков. Как показано на рисунке 8, токсичность данной формы фильтрата на 5-е сутки достигает более 85%, что в 1,5-2 раза выше по сравнению с ранее применяемой нами методикой (Беккужина, Калашникова, 2008), при которой токсичность КФ гриба, изменялась по сортам и составляла 37,1% - 64,8%.

29^94

Л- 1 I I I 1

-"ST-1—

■ & • - I

...... . ..У

——--

—-----.; ■.-,■■ ■ ~

Рис. 8 Токсичность 50% концентрации фильтрата на уровне проростков на 5-е сутки прорастания

В результате статистической обработки отмечена существенная разница токсичности ВФГФ на развитие корней и надземной части проростков. Далее ВФГФ использовали для определения его фитотоксичности на уровне каллусных клеток. При добавлении этого фильтрата (30%) в питательную среду прирост биомассы каллусной ткани не был отмечен (рис. 9 а).

L-29-94

у = 77,361с'

0S4 10» Ж 3»

концентрации ВФГФ,%

L-29-94

у=1497,if-738,2**77,121 г=0,99«

10% 2«-3(3%

концентрации ВФГФ, %

а б

Рис. 9. Относительный прирост каллусной ткани на водном фильтрате: а — I пассаж, б — II пассаж

При сравнительной оценке токсического действия комплекса фитотоксинов и ВФГФ на прирост каллусной ткани отмечено, что данная форма фильтрата является высокотоксичной, как и токсины фитопатогенного гриба S. nodorum. Относительный прирост каллусной ткани при 30% ВФГФ на II пассаже составляет около 10% (рис. 9 б).

Таким образом, в результате экспериментальных исследований выявлена оптимальная форма селективного агента для проведения клеточной селекции пшеницы на устойчивость к грибному патогену S. nodorum.

Гаметная селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk.

В индукционную питательную среду для культивирования пыльников добавляли фиготоксины в концентрации 0,01% и 0,02 %, а также ВФГФ в концентрациях от 0,5% до 3% (табл. 9, 10). При селекции использовали только эмбриональные ткани, которые были сформированы непосредственно из микроспор.

Таблица 9. Влияние фитотоксинов гриба Septoria nodorum на пыльцевой эмбриогенез в

культуре пыльников пшеницы

Сорта Концентрации токсина, % Кол-во пыльников, шт. Частота образования эмбриодов, % +- к контрол!

Лютесценс11-94-111 контроль 1700 5,8 (3,9-8,0 )

Лютесценс 11-94-111 0,01 1233 2,02 (0,96-3,40) -3,7

Лютесценс 11-94-111 0,02 1400 1,3 (0,50-2,50) -4,5

Актобе 33 контроль 1750 2,3 (1,20-3.80)

Актобе 33 0,01 1200 1,25 (0,50-2.50) -1

Актобе 33 0,02 1350 0,5 (0.07-1,30) -1,8

Полученные результаты исследований свидетельствуют о низкой эффективности частоты образования эмбриогенных структур на средах, содержащих комплекс токсинов.

Таблица 10. Влияние водного фильтрата па пыльцевой эмбриогенез (сорт Л 29-94)

Варианты концентраций фильтрата, % Количество пыльников, шт. Частота образования эмбриоидов, % +-к контролю

контроль 400 6,7(4,7-9,0) ■

0,5 500 4,2 (2,60-6,20) -2,55

1 500 2,8(1,50-4,40) -3,95

2 500 1,4 (0,55-2.60) -5,35

3 500 - -

Результаты исследований, представленные в таблице 10, свидетельствуют о том, что на среде с добавлением 0,5% ВФГФ образование эмбриоидов

составляет 4,2%, в то время как в варианте с присутствием ВФГФ в концентрации 3 % процесс эмбриогенеза нами не был отмечен.

Следовательно, можно заключить, что данные по проведению селекции на уровне репродуктивных клеток также подтверждают, что применение токсинов не является желательным по сравнению с применением водной формы фильтрата гриба.

Изучение регенерационного потенциала клеток в стандартных и стрессовых условиях. Известно, что пыльцевой эмбриогенез состоит из двух труднорегулируемых этапов. Первый - перепрограммирование микроспор и второй - регенерация зеленых растений из эмбриоидных структур. Кроме того, на каждом этапе андрогенеза in vitro половина индуцированных морфогенных структур может в дальнейшем не развиваться в растения-регенеранты.

Наши исследования показали, что после двух циклов селекции во всех вариантах питательных сред, содержащих изучаемые концентрации ВФГФ, получены растения-регенеранты из ранее индуцированных эмбриоидных структур. Однако частота формирования растений, как в контрольном варианте, так и в вариантах с присутствием ВФГФ составила всего лишь 29,6% и 14,2 -33,3%, соответственно (рис.10). Полученные растения-регенеранты в дальнейшем были размножены с помощью клонального микроразмножения за счет индукции образования адвентивных побегов (табл. 11).

35 30 25 20 15

Регенерация на ВФГФ

О о 0.5 1 2 3

и Р&г^нер^цс/я. &°/0 20. в 33.3 28.5 14,2 О

Рис. 10 Частота регенерации (%) растений после селекции in vitro па ВФГФ

Таблица 11. Клональное микроразмножение растений-регенерантов, полученных после

селекции in vitro

Генотип Ср. коэффициент размножения, шт.* Коэффициент размножения побегов из семян, шт.** Количество побегов, шт. Количество укоренившихся побегов, шт. Укоренение побегов, %

Л-И-94-ll 2,1±0,2 3,0±0,3 81 49 60,4

Л-29-94 2,5±0,2 2,6±0,2 96 78 81,3

Примечание - *коэффициент размножения побегов, полученных из каллусных тканей молодых соцветий, * *коэффициент размножения побегов из семян

При размножении растений-регенерантов на средах, содержащих селективный фактор (ВФГФ в концентрации 10-30%) установлено, что стресс-фактор приводит к существенному снижению морфогенетической активности клеток, что проявляется на уменьшении числа адвентивных почек на один эксплант (табл. 12).

Таблица 12. Тестирование растений-регенерантов в стрессовых условиях при

клональном микроразмножении

Сорта и варианты селективного фактора Количество побегов, шт. Количество непророс-ших побегов, шт. Количество дополнительных побегов, шт. Ср. коэффициент размножения, шт

Л 29-94-10% 16 0 42 2,6±0,2

Л29-94-20% 16 5 38 2,3±0,2

Л29-94- 30% 17 12 20 1,1±0,1

Л-11-94-11-10% 25 3 39 1,5±0,1

Л-11-94-11-20% 25 14 32 1,2±0,1

Л-11-94-11-30% 28 13 47 1,6±0,1

По результатам исследований можно сделать заключение, что признак устойчивости к экзометаболитам гриба 5. поЛогит, приобретенный на уровне клеток, сохраняется при переходе на уровень целого растения, о чем свидетельствует образование дополнительных побегов в стрессовых условиях.

При использовании в качестве селективного фактора КФ гриба в концентрации 75% были получены растения-регенеранты (сорт Л-11-94-111) из каллусной ткани. 8 растений-регенерантов дали семенное потомство.

Таким образом, в результате многоплановых исследований нами разработана система отбора репродуктивных клеток к абиотическим и биотическим условиям окружающей среды, которая позволила создать линии, устойчивые к изучаемым стрессовым факторам (рис. И).

I цикл селекции II цикл селекции III ци кл се лекции

Рис. 11 Схема селекции яровой мягкой пшеницы па уровне репродуктивных клеток

1.5 Изучение биологических и хозяйственно-ценных признаков линий, полученных методами биотехнологии и их использование в селекционных программах для создания перспективных форм пшеницы

Включение в программу селекции пшеницы линий, полученных методами селекции in vitro, позволяет ускорить отбор растений с хозяйственно-ценными признаками. Во втором поколении растений-регенерантов отмечается высокая наследуемость изменения различных физиологических, биохимических и других признаков (даты колошения, остистости, числа побегов, окраски зерен и колосковых чешуй, воскового налета, электрофоретических спектров запасных белков).

Для селекционной оценки использовали линии Лютесценс Ю580112, AR45, отобранные в результате трёх циклов селекции на уровне репродуктивных клеток, а также гаметоклональные варианты, полученные в культуре пыльников из линии Лютесценс 105 80R — ЛГВ1-92-2, ЛГВ2-92-2, ЛГВЗ-692-3-5.

Погодные условия в период 2001-2005 гг. отличались контрастностью. 2001, 2002, и 2005 годы были более влагообеспеченными. Количество выпавших осадков в эти годы варьировало от 177 до 194,9 мм. Превышение их над среднемноголетним показателем составило 43,3; 51,3 и 60,3 мм, соответственно. 2003, 2004 и 2006 годы характеризовались, как засушливые.

Изучение линий-регенерантов в контрастных погодных условиях позволило выявить варьирование продолжительности вегетационного периода и урожайности. Урожайность линии Лютесценс Ю580 в 2003 году составила 30,8 ц/га, что на 1,6 ц/га выше стандарта. Средняя урожайность перспективной линии за 2001-2003 гг. составила 29,6 ц/га, стандарта - 27,1 ц/га. Превышение линии над стандартом (сот Акмола 2) составило 2,5 ц/га.

В период вегетации 2004 года, несмотря на засушливые условия, большинство изучаемых линий сформировали хороший урожай. Урожайность линий-регенерантов варьировала от 25,6 до 29,6 ц/га (рис. 12).

120 100 80 -60 40 20 0

Акмола 2Ю-580Р 1/92-2 20/92-2 6/92-3-5 AFM5

Рис. 12 Урожайность линий в ц/га 2004-2006 г.:

Примечание - 2004 г. - НСР0,05 =1,1; 2005 г. - HCPo.os=1,2; 2006 г. - HCPo.os =1А

В условиях 2005 года для трех линий (I0580R, ЛГВ1-92-2, AR45) урожайность была незначительно выше стандарта. Превышение их над стандартом составило от 0,2 до 0,6 ц/га. (

Урожайность 2006 года линий-регенерантов варьировала от 25,6 до 29,6 ц/га. Линии AR45 и ЛГВЗ-692-3-5 показали достоверное превышение над стандартом на 2,9-3,6 ц/га. Эти линии в среднем за три года превысили стандартна 3,6-4,5 ц/га.

По продолжительности вегетационного периода эти линии можно отнести в группу среднепозднеспелых. Изучаемые линии-регенеранты обладали высокой засухоустойчивостью, которая достигалась в основном за счет ( биологических свойств. Все линии обладали удлиненным периодом всходы-колошение - 45-46 суток. Такие сорта имели несколько замедленные темпы роста в начальной стадии развития, а, следовательно, менее требовательны к ~ влаге в период майско-июньской засухи и более эффективно используют июльские осадки.

Особый интерес представляют линии ЛГВ 1-92-2, ЛГВ 3-692-3-5 и AR45, г которые подтвердили высокую засухоустойчивость не только полевой визуальной оценкой, но и способностью формировать большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи (рис. 13). |

* - ■

Рис. 13 Устойчивость линий-регенерантов к засухе и полеганию по результатам оценки 2006 года

I

Анализ технологического и биохимического качества зерна показывает, что изучаемые линии по крупности, натуре зерна и содержанию белка находятся на уровне или близки к стандарту. Линии Ю580R и ЛГВ 1-92-2 превосходят стандарт по натуре и содержанию белка. Индекс деформации клейковины (ИДК) свыше 75 единиц позволяет отнести их по качеству к 3 классу, а линии ЛГВ2-92-2 и AR45, у которых количество клейковины и ИДК ] находятся в оптимальном сочетании - к 2 классу. |

Несмотря на высокий ИДК, что вызывает разжижение теста, общая хлебопекарная оценка линий достаточно высокая и варьирует от 4,3 до 4,6

балла.

Линия Лютесценс 105 80R использована в качестве родительской формы при создании гибридного материала. Получено 26 комбинаций скрещиваний. В качестве родительских форм использованы сорта и гибриды местного экотипа, а также образцы из США, Европы, ячменно-пшеничные линии, полученные в Сибирском отделении РАСХН.

Линию AR45 использовали также в целенаправленной гибридизации с формами носителями генетического признака по засухоустойчивости, и создано 19 комбинаций скрещиваний.

Линии, превысившие стандарт по урожайности, а также гибридные комбинации (26+19) переданы в ТОО «Карабалыкская СХОС» для размножения и отбора перспективных форм. Из них в 2008-2010 годы в гибридных питомниках отобрано 44 400 элитных колосьев.

Таким образом, при селекционной оценке линий-регенерантов яровой мягкой пшеницы выявлены ценные признаки, которые могут быть использованы в селекционном процессе.

1.6 Использование белковых маркеров для отбора перспективных форм яровой мягкой пшеницы в рашшх поколениях

Для наиболее полного использования потенциала генетических ресурсов необходим мультидисциплинарный подход, умелое сочетание традиционных методов селекции с методами биотехнологии. В последние два десятка лет довольно ощутимы результаты использования генетических маркеров в практической селекции. Известны исследования, где установлена сопряженность генетических маркеров с целым рядом агрономических признаков пшеницы: качество муки, продуктивность и т.д.

Несомненный интерес в решении проблем адаптивной селекции представляет использование белковых маркеров, в частности, неслучайное распределение аллелей глиадинкодирующих локусов в сортах, созданных в различных эколого-географических зонах.

Задача наших экспериментов - перевод в гомозиготное состояние гибридов, показавших перспективность по спектрам запасных белков. С этой целью изучали эмбриогенную способность гибридов F; в культуре пыльников пшеницы.

Проведенные биохимические анализы гибридов Fi показали, что локус GLU 1А представлен одной аллелью, кодирующей биосинтез субъединицы 2*. Наиболее часто встречаемые субъединицы, контролируемые локусом GLU 1В: 7+9 (варианты с субъединицей 7 и 7*), тогда как аллели, ответственные за проявление субъединиц 17+18 встречалась лишь у единичных форм.

Субъединицы 17+18 высокоранжируются по вкладу в оценку хлебопекарного качества мягкой пшеницы. Получение константных форм из гибридных комбинаций с вышеназванными субъединицами и использование их в селекционных программах значительно облегчает работу создания ценных генотипов по качеству зерна. Из 19 гибридов Fi, предложенных селекционерами, гибридная комбинация (Fi №2) обладала высокой

эмбриогенной способностью, где частота выхода эмбриоидов составляет 22%.

Для сокращения сроков селекции пшеницы в следующей серии экспериментов изучали изменение активности ключевых ферментов азотного обмена в гибридных комбинациях раннего поколения, где в качестве одного из родителей использовали линию I0580R, полученную в культуре пыльников.

Известно, что ферментный комплекс МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) может служить информативным показателем для отбора ценных линий на устойчивость к абиотическому стрессу.

В результате исследований выявлены комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ по сравнению с родительскими формами: JI 16 ячмень - пшеничная линия х HD580R, (Шортандинский 25 х Акмола 40) х I0580R, (Шортандинский 125 х Омская 18) х I0580R, I0580R х Fasan. Необходимо особо отметить комбинации (Кенжегали х Скала) х I0580R х К-54975, где в гибридах активность МДГ-ГОАТ больше по сравнению с двумя родителями.

1.7 Молекулярное маркирование днгаплоидной линии и гаметоклональных вариантов, полученных в культуре пыльников

пшеницы

Анализ растений-регенерантов, полученных из культивируемых гамет, выявил изменчивость их геномов, которая была названа гаметоклоналыюй вариабельностью.

Для анализа изменений в геномах дигаплоидных линий используются различные молекулярные методы, в том числе и RAPD-метод (Random Amplified Polymorphic DNA), основанный на анализе полиморфизма длин фрагментов ДНК, амплифицируемых с помощью случайных праймеров.

Яровая мягкая пшеница Целинная-Юбилейная выбрана в качестве исходного сорта, из которой получена дигаплоидная линия I0580R, а из нее получены гаметоклональные варианты ЛГВ 3-692-3-5, ЛГВ2-92-2, ЛГВ1-92-2.

Наиболее похожие спектры амплифицировались у образцов Целинная-Юбилейная и I0580R. Спектры гаметоклонов ЛГВ 3-692-3-5, ЛГВ 1-92-2, ЛГВ2-92-2 также характеризовались присутствием специфических RAPD-фрагментов.

Для проведения статистического анализа были составлены бинарные матрицы, рассчитаны коэффициенты попарного сходства и определены генетические расстояния между дигаплоидной линией и исходным сортом, а также гаметоклональными вариантами, отражающие степень различия их геномов. Наименьшие геномные различия (0.02) наблюдались между сортом Целинная-Юбилейная и полученной из нее дигаплоидной линией I0580R.

Дигаплоид и гаметоклональные линии, полученные из нее, образуют один кластер с исходным сортом Целинная-Юбилейная, из культуры пыльников которой они были получены. Этот кластер подразделяется по степени сходства геномов анализируемых образцов на два подкластера (рис.14).

Tree Diagram for 7 venables Unweighted pair-group average Percent disagreement

0,00 0,02 0.04 o,oe o.oa 0,10 0,12 0.14

Linkage Distance

Рис. 14 Дендрограмма, отражающая генетические различия между образцами исходных сортов и дигаплондных линий пшеницы: 1 — Акмола 2; 2 — Ю580 R; 3 — Целинная-Юбилейная; 4 — ЛГВ1-92-2; 5 — ЛГВ2-92-2; б — ЛГВ 3-692-3-5

Первый подкластер составляют гаметоклональные линии ЛГВ 1-92-2 и ЛГВ2-92-2. Эти две линии значительно отличаются от остальных, и при этом геномные различия между ними существенны, что подтверждается как высотой точки ветвления, так и данными по определению генетических расстояний (0,09). Интересно то, что третий гаметоклон ЛГВ 3-692-3-5 попадает в другой подкластер вместе с исходным сортом Целинная-Юбилейная и дигаплоидной линией 10580R.

Таким образом, результаты исследований подтверждают, что гаплоидные технологии позволяют получать растения без существенных изменений в структуре генома и, следовательно, значительно ускоряют создание чистых линий. Кроме того, полученные в результате селекции гаметоклональные линии отличаются полиморфизмом генома, что является основой генетического разнообразия.

На основе проведенных исследований разработана технологическая схема (рис.15), позволяющая ускорить селекционный процесс яровой мягкой пшеницы. Умелое сочетание традиционных и биотехнологических методов может быть применено и к другим сельскохозяйственным культурам для улучшения их генетического базиса. Селекция на уровне гамет может достойно стать одним из ведущих направлений в поиске путей отбора растений к стрессовым воздействиям, не исключая при этом, методы классической селекции.

Гибридизация с формами,

«генетическими носителями» по признаку

засухоустойчивости и « использование в качестве одной из родительских форм особей, отобранных в_ условиях селекции in vitro на водный дефицит

Селекция in vitro на уровне репродуктивных и соматических клеток

Селекционный процесс

Отбор константных форм и их таметоклональных вариантов по признаку

устойчивости к водному дефициту »

Отбор гибридов в ранних поколениях по белковым маркерам на стрессоустойчивость (активность ферментного комплекса МДГ-ГОАТ)

ВДРБ-анализ ДНК для оценки уровня полиморфизма и межлинейных отличий генетического расстояния _

Рис. 15 Этапы технологии получения растений, устойчивых к абиотическому и биотическому стрессу

выводы

1. Разработана комплексная технология получения форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septorai nodorum Berk., на основе сочетания гаплоидной технологии и классических методов селекции.

2. Создана эффективная биологическая система, позволяющая переключать развитие микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития на основе предобработки срезанных колосьев гормонами ауксинового типа действия - ИУК, 2,4-D с учетом содержания эндогенного ИУК в растениях. Разработанный способ повышает эффективность пыльцевого эмбриогенеза до 8%.

3. Впервые при гаметоклональной селекции in vitro из трех форм селективного агента: кулыуральный фильтрат, фитотоксины и водная форма грибного фильтрата (ВФГФ) гриба Septoria nodorum Berk, выявлена эффективность отбора эмбриоидов на среде с ВФГФ. Данный селективный фактор обладал фитотоксичностью в 1,5 - 2 раза выше по сравнению с КФ.

4. Установлено, что в условиях in vitro на уровне репродуктивных клеток, при использовании абсцизовой кислоты и хлорида натрия, получены осмотолерантные клеточные линии. На основе морфогенетического цикла «клетка-растение-клетка» отобраны засухоустойчивые линии AR245,10580R2 и гаметоклон ЛГВЗ-692-3-5, которые проявили устойчивость к засухе при полевой оценке (7-9 баллов).

5. Линии, полученные в результате селекции на уровне гамет, отличались анатомо-морфологическими признаками и общей архитектоникой - большей листовой поверхностью, верхний лист по отношению к стеблю расположен под значительно меньшим углом (45-55°), что приводит к смещению фаз всходы-колошение на период лучшей влагообеспеченности. Растения формировали большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи.

6. Линии - регенеранты превысили стандартный сорт Акмола 2 по урожайности на 3,6-4,5 ц/га. Урожайность формировалась за счет высокой продуктивной кустистости, озерненности колоса и массы зерна с колоса. Хлебопекарная оценка линий варьирует от 4,3 до 4,6 балла. Высоким содержанием клейковины отличались линии I0580R и ЛГВ2-92-2 - 30,032,4%. Линии I0580R, AR45 использованы в гибридизации и на их основе при отборе получено 44 400 элитных колосьев.

7. При использовании белковых маркеров на ранних этапах гибридизации выявлены ценные гибридные комбинации по запасным белкам пшеницы. Константные формы с ценными аллелями по этим признакам переданы в селекционные центры. Выявлены гибридные комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ (малагдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.

8. RAPD анализ подтвердил наименьшие геномные различия (0.02) между исходным сортом Целинная-Юбилейная и дигаплоидной линии I0580R. При сравнении спектров дигаплоидной линии I0580R и полученной из нее гаметоклонов (ЛГВЗ-692-3-5, ЛГВ2-92-2, ЛГВ1-92-2) выявлено 13 полиморфных фрагментов.

9. Многолетние полевые испытания подтвердили наличие морфофизиологических показателей устойчивости растений пшеницы к засухе и полеганию. Показана перспективность комплексного применения методов биотехнолоши и традиционной селекции для отбора линии, обладающих хозяйственно-ценными признаками. Полученные перспективные линии яровой мягкой пшеницы готовятся к передаче на Государственное сортоиспытание.

Список опубликованных работ

1. Биотехнология. Генетикалык инженерия эдютерш ешмдш шаруашылыгында колдану.// Учебное пособие, Астана, 1999, 71с.

2. Разработка технологической цепи, включающей традиционные и нетрадиционные методы селекции яровой пшеницы.// Вестник науки ААУ, 2000, т.2, № 9, с 140-145.

3. Получение константных форм из гибридов и линий яровой мягкой пшеницы в культуре пыльников.// Материалы научно-практической конференции «Образование и наука в современных условиях развития Казахстана: опыт, проблемы и перспективы», Уральск, 2002, с. 131-133 (в соавторстве М.Ж. Каирова).

4. Использование DH - метода для индукции гаметоклональных вариации в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L.// Биотехнология. Теория и практика, 2003, т.1, с. 60-65 (в соавторстве Зеленский Ю.И).

5. Использование DH-метода для проведения гаметной селекции // Биология наука XXI века.7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых 1418 апреля, Москва, 2003, Сборник тезисов, с. 90.

6. Биотехнология в селекции пшеницы на севере Казахстана. Итоги и перспективы //Международная конференция «Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы». Астана, 2004, с. 354-360. (в соавторстве Зеленский Ю.И., Созинова Л.Ф., Любовцев В.В., Шек Г.О)

7. RAPD-анализ ДНК линий-регенерантов пшеницы // Методические рекомендации, Астана, 2005,17 с. (в соавторстве Е.З.Кочиева)

8. Селекционная оценка линий-регенерантов яровой мягкой пшеницы, отселектированных в условиях in vitro к водному стрессу // Современные проблемы почвозащитного земледелия и пути повышения устойчивого развития зернового производства в степных регионах. Международная научно-практическая конференция, посвященная 50-летию «НПЦ ЗХ им.

А.И.Бараева». Шортанды, 2006, с.135-139 (в соавторстве Р.Н.Оковитая).

9. Селекция на уровне гамет и молекулярно-генетическая оценка растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы // Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов», посвященная 100-летию со дня рождения С.А. Алиханяна. Москва-Пущино-на-Оке, 2006, с 33.

Ю.Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на рост изолированных зародышей пшеницы и прирост каллусной ткани // Международная конференция, посвященная 50-летию Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, Астана-2007, с. 187 (в соавторстве Калашникова Е.А.)

11. Оптимизация условий выращивания гриба Septoria nodorum для проведения селекции in vitro // Международная конференция, посвященная 50-летию Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, Астана, 2007, с. 204 (в соавторстве Е.А. Калашникова).

12.Эффективность мультидисциплинарного подхода в решении проблем селекции яровой мягкой пшеницы // Международная конференция, посвященная 50-летию Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина, Астана, 2007, с. 196 (в соавторстве И. Рахимбаев, К. Булатова).

13. In vitro жагдайында коздырылган андрогенез аркылы гамета жасушаиарын сдэыптаудыи мумкшшшп мен артьщшылыгы.// Сакен гагылымы-4 атты Республикальщ гылыми-теоретикалык конференцияныц материалдары. Астана, 2008, с. 99 (в соавторстве ЖД. Джардемалиев).

М.Фенолыше соединения как токсины фитопатогенных грибов Septoria nodorum Berk, их роль в каллусных тканях яровой мягкой пшеницы, подверженных стрессовому воздействию// Поиск, № 4, 2008, с 71-13.

|5' Селекция пшеницы на уровне клеток к культуральному фильтрату патогена Septoria Nodorum Berk.// Вестник КазНУ им. Аль-Фараби, №4 (39), 2008, с. 60-63 (в соавторстве Е.А. Калашникова).

16.Наработка токсинов фитопатогенного гриба Septoria nodorum В. для использования в схеме селекции in vitro II Вестник науки КазАТУ им.С.Сейфуллина. № 2 (49) Астана, 2008, с. 25-31 (в соавторстве М.Б. Орынбаев, Ш.С. Рсалиев., С.М. Мамадалиев.).

17.Сортовая специфика ответа яровой мягкой пшеницы при прорастании семян под действием экзометаболитов фитопатогенного гриба Septoria nodorum Н Материалы научно-теоретической конференции «Бараевские чтения», Астана, 2008, с. 31-33.

18.Использование селекции in vitro для индукции устойчивости к экзометаболитам фитопатогенного гриба S. nodorum Berk. // Агромеридиан 2(8). Алматы, 2008, с. 27-32.

19.0тбор стрессоустойчивых растений пшеницы на основе малатдегидрогеназного комплекса (Triticum aestivum L.) II Известия ТСХА, 2008, выпуск № 4, с. 115-117(в соавторстве Е.А. Калашникова).

20.Выделение фитотоксинов из культурального фильтрата и

фитопатогенного гриба Septoria nodorum В // IX конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Москва, 2008, с. 36.

2¡.Выявление лучших форм селективного агента для проведения селекции пшеницы к грибному патогену в условиях in vitro (Triticum aestivum L) // Международная школа-конференция, посвященная 40-летию ГосНИИгенетика. Москва, 2008, с. 21.

22.RAPD - маркирование для анализа полиморфизма дигаплоидной линии и гаметоклональных вриантов пшеницы (Triticum aestivum L.). // IX конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Москва, 2008, с. 34 (в соавторстве Е.З. Кочиева).

23.Molecular analysis of polymorphism in wheat régénérants plants offspring (Triticum aestivum L.) // Science review I (2) 2008, Journal S.Seifullin Kazakh Agro Technical University, Astana, Kazakhstan,с 51-57 (Elena Z.Kochieva).

24.Глубинное культивирование каллусных клеток пшеницы (Triticum aestivum L) в стандартных и стрессовых условиях // Вестник науки Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина. № 4 (51) Астана, 2008, с. 126-130 (в соавторстве Е.А. Калашникова, Джардемалиев Ж.К., Лесова Ж.Т., Егизбаева Т.К.).

25 .Изучение влияния фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, на прирост каллусной ткани яровой мягкой пшеницы // IX конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, Россия, 2008), с. 32.

26.Использование белковых маркеров и гомозиготизация ценных гибридных комбинаций пшеницы методами биотехнологии (Triticum aestivum L.) // Биологические науки Казахстана, №4,2008, с. 30-34.

27.Инновационный патент «Способ получения гаплоидных растений пшеницы с повышенным регенерационным потенциалом» 2007/0161.1.

28.Selection of Wheat for Resistance to the Fungal Pathogen Septoria Nodorum Berk, in an Isolated Anther Culture.// Russian Agricultural Sciences, 2009, Vol. 35, No. 4, pp. 215-217. © Allerton Press, Inc., 2009, (E. A. Kalashnikova).

29. Wheat double haploid lines with improved salt tolerance: in vitro selection and RAPD analysis // Crop Plant Resistance to Biotic and Abiotic factors: current Potential and Future Demands. Proceedings of the 3rd Inernational symposium on Plant Protection and Plant health in Europe, Berlin, Germany, 14-16 May 2009, p. 87-89.(Elena Z.Kochieva).

30.Влияние генотипа на пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.) // Материалы Международной научно-практической конференции Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения 26-28 мая, Ульяновск, 2009, с. 16-19.

31.Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum В. // Методические рекомендации. Астана, 2009,24 с.

32.Селекционная оценка линий, полученных в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). II Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана

№3 2009, ТОО издательство «Бастау», с. 11-14 (в соавторстве Зеленский Ю.И).

ЗЗ.Изучение биологических и хозяйственно-ценных признаков дигаплоидной линии, полученной в культуре in vitro {Triticum aestivum L.) // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина. № 1 (52), 2009, с. 8-13 (в соавторстве Р.Н. Оковитая).

34.Эффективность использования гаплоидных технологий для улучшения качества зерна пшеницы (Triticum ае stivum L.) // Актуальные вопросы биологии в Байкальском регионе. Материалы международной научной конференции. Выпуск 2, Иркутск 2009, с 79-83 (K.M. Булатова).

35.Ускоренное размножение в культуре in vitro растений-регенерантов (Triticum aestivum L) и оценка их устойчивости к экзометаболитам Seploria nodorum В. // Агромеридиан 1-2(11-12). Алматы, 2009, с. 18-22.

36.Использование дигаплоидных линий в селекционных программах яровой пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник науки Казахского

, агротехнического университета им. С.Сейфуллина. № 4 (52), 2009, с. 9195.

37.Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum В. // Методические рекомендации. Астана 2009, 24 с. (в соавторстве Е.А. Калашникова).

38.Влияние стадий развития микроспор на пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Научный журнал МОИ и PK: Поиск, №2, 2009, с 16-19 (в соавторстве Л.Ф.Созинова).

39.Выделение и идентификация фитотоксинов гриба Septoria nodorum В. // Вестник КазНУ им. Аль-Фараби, №1 (40), 2009, с. 94-97.

40.Использование БАВ в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник КазАТУ № 2 (53), 2009, с. 219-224 (в соавторстве Макашева А., Тойымбаева Д.)

41.Индукция гаплоидных структур в стрессовых условиях культивирования пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Иммунология. Аллергология. Инфектология, №1, т 1,2009, с. 65.

42.Размножение растений-регенерантов пшеницы (Triticum aestivum L.). устойчивостьк экзометаболитам фитопатогенного гриба Septoria Nodorum Berk. //Иммунология. Аллергология. Инфектология, №1,т 1, 2009, с. 66.

43.Селекция пшеницы на устойчивость к грибному патогену Septoria nodorum Berk, в культуре изолированных пыльников // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, № 4, 2009, с. 6-7.

44. Использование дигаплоидных линий в селекционных программах яровой пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник науки Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина. № 4 (52) Астана, 2009, с. 87-91.

45.0амд1к биотехнологиясы Учебник, Астана, 2009,115 с.

46.Детерминация спорофитного пути развития микроспор в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник СГУим.Шакарима,

№1,2009, с. 109-112.

47.Анализ геномного полиморфизма дигаплоидной линии и гаметоклональных вариантов, индуцированных в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Доклады HAH PK, 2010, № 2, с. 89-92 (в соавторстве Е.З. Кочиева).

48.Селекция in vitro на уровне репродуктивных клеток к водному дефициту (Triticum aestivum L.). II Естественные и технические науки, 2010. № 4, с. 101-105 (в соавторстве Е.А. Калашникова, В.С Шевелуха).

49.Использование DH-линий в схемах традиционной селекции пшеницы (Triticum aestivum L.). //Естественные и технические науки, 2010. № 4, с. 106-109 (в соавторстве Р.Н Оковитая, Каскарбаев Ж.А., Е.А.Калашникова).

50.Влияние индолилуксусной кислоты на компетенцию микроспор в культуре пыльников пшеницы. // Естественные и технические науки, 2010, № 4, с. 167-171 (в соавторстве Е.А.Калашникова, И.В. Скоробогатова, Н.П. Карсункина, B.C. Шевелуха, И. Рахимбаев).

51.Выделение водной формы культурального фильтрата гриба Septoria nodorum Berk, и изучение его токсичности для селекции in vitro. // Естественные и технические науки, 2010, № 4, с. 110-113 (в соавторстве Е.А Калашникова, И. Рахимбаев).

52.Оценка линий-регенерантов яровой пшеницы по хозяйственно-ценным признакам (Triticum aestivum L.). II Естественные и технические науки, 2010, № 5, с. 163-166 (в соавторстве Калашникова Е.А, Каскарбаев Ж.А.).

53.Индукция пыльцевого эмбриогенеза при солевом стрессе в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). II Естественные и технические науки, 2010, № 5, с. 154-157 (в соавторстве Е.А.Калашникова).

54.Роль ИУК в процессе андрогенеза in vitro яровой мягкой пшеницы // Естественные и технические науки, 2010, № 5, с. 158-162 (в соавторстве Е.А.Калашникова).

55.Влияние гормонального фактора на эффективность пыльцевого эмбриогенеза пшеницы (Triticum aestivum L.) II Физиолого-биохимические и генетико-селекционные исследования растений в Казахстане/ Сб. статей. Алматы, 2010, с. 95-102 (в соавторстве Макашева А., Рахимбаев И.)

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/1б. Усл. печ. л. 2,33. Тираж 100 экз. Заказ 147.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Беккужина, Сара Сабденовна

НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Эффективность использования гаплоидных технологий в селекционных программах.

1.2 Гормональная индукция андрогенеза in vitro.

1.2.1 Влияние физических и химических агентов на пыльцевой эмбриогенез.

1.3 Гаплоидные технологии и гаметная селекция.

1.3.1 Возможности использования гаметной селекции для отбора растений, устойчивых к абиотическому стрессу.

1.3.2 Отбор форм, устойчивых к биотическому стрессу с помощью селекции на уровне соматических и репродуктивных клеток.

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

II. 1 Объекты исследований.•.

11.2 Культивирование пыльников.

11.3 Биохимические методы исследований.

11.3.1 Определение запасных белков и ферментного комплекса МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутаматоксалоацетат аминотрансфераза).

11.3.2 Определение суммы растворимых фенольных соединений в изолированных зародышах и каллусных культурах пшеницы.

11.3.3 Определение содержания эндогенных гормонов в растениях пшеницы.

11.4 RAPD-анализ.

11.5 Селекция in vitro на клеточном уровне.

И. 6 Методика полевых испытаний.

III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1 Повышение эффективности экспериментальной гаплоидии для расширения генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы. 69 III. 1.1 Выяснение компетенции микроспор в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы.

III. 1.2 Роль гормональных факторов и биологически активных веществ в ндукции спорофитного пути развития микроспор пшеницы (Triticum aestivum L.J.

111.2 Селекция пшеницы на устойчивость к абиотическим стрессам на уровне гамет.

111.2.1 Получение гаметоклональных вариантов в культуру пыльников 105 при солевом стрессе.

111.2.2 Ускоренное размножение линий, полученных в стрессовых условиях при одновременном тестировании и их полевая оценка.

111.3 Отбор засухоустойчивых растений-регенерантов при проведении селекции на уровне гамет.

111.4 Селекция in vitro к биотическому стрессу.

III.4.1 Усовершенствование селекции пшеницы на устойчивость к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Berk в условиях in vitro.

III.4. 2 Биохимические изменения в экспланте и каллусных тканях, полученных в стандартных и стрессовых условиях.

111.4.3 Выделение и идентификация фитотоксичных метаболитов гриба Septoria nodorum Berk и их использование в селекции in vitro.

111.4.4 Выделение водной формы грибного фильтрата и изучение фитотоксичности гриба S. nodorum для селекции in vitro.

111.4.5 Изучение регенерационного потенциала каллусных клеток и эмбриоидов, индуцированных в стандартных и стрессовых условиях культивирования.

111.5 Изучение биологических и хозяйственно-ценных признаков линий, полученных методами биотехнологии и их использование в селекционных программах для создания перспективных форм пшеницы в НПЦ ЗХ им.А.И. Бараева.

III.5.1 Полевые испытания полученных линий и гибридов в

Карабалыкской сельскохозяйственной опытной станции.

111.6 Использование белковых маркеров для отбора перспективных гибридов в Fj и F3 поколениях.

111.7 Молекулярное маркирование дигаплоидной линии и гаметоклональных вариантов, полученных в культуре пыльников пшеницы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гаплоидные технологии в ускоренном создании исходных форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засухе и к Septoria nodorum Berk"

Казахстан является одним из крупнейших производителей зерна в мире. В северном регионе Республики сосредоточено 80% площадей основной хлебной культуры яровой пшеницы и в этой связи необходим постоянный поиск резервов повышения урожайности и качества зерна.

Одним из определяющих факторов эффективности современного земледелия в Казахстане, как и во многих странах мира, является сорт, вклад которого в формирование урожая может составить 30-70%. Рост значимости сорта в ближайшем будущем связан с выведением сортов с повышенными адаптивными свойствами к стрессовым абиотическим и биотическим факторам внешней среды.

На 2-й Центрально-Азиатской конференции по зерновым культурам подведены итоги селекции пшеницы за последние 50 лет и определены новые подходы по расширению генетического базиса селекции пшеницы.

В настоящее время широко обсуждается проблема использования биотехнологических методов в решении прикладных аспектов селекции. Известно, что основным методами биотехнологии, дающими значимые результаты в решении селекционных задач, являются гаплоидные технологии и молекулярные маркеры.

В популяции удвоенных гаплоидов, т.е. однородных гомозиготных линий легче проводить отбор по хозяйственно ценным признакам, чем в сложных популяциях первых гибридных поколений, в которых обычно проводится отбор. Известно, что эффективность отбора определяется соотношением компонент генотипической и средовой изменчивости в популяции. Фенотипическая изменчивость в популяциях удвоенных гаплоидов определяется аддитивными эффектами генов и условиями выращивания. В искусственно созданной популяции, состоящей из линий удвоенных гаплоидов, эффективность отбора приближается к 100%.

Актуальность проблемы. Расширение генетического базиса методами селекции на уровне соматических и репродуктивных клеток с включением измененных вариантов, а также константных форм, полученных с помощью гаплоидных технологий в схему традиционной селекции, может обеспечить значительный успех в селекции яровой мягкой пшеницы. Комплексное применение отбора клеточных популяций в селективных условиях и методов гаплоидии повышает эффективность получения растений устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам (B.C. Шевелуха и др., 2008). Кроме того, ускоренное размножение дигаплоидных линий и их включение в различные схемы селекции в настоящее время дает практические результаты.

Сочетание традиционных и биотехнологических методов селекции в настоящее время является эффективным в создании новых сортов с одновременным повышением продуктивности и устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам. Ускоренное размножение дигаплоидных линий и их использование в различных схемах селекции дает весомые практические результаты.

Урожайность яровой пшеницы в Казахстане за последние 10 лет не превышает 1 тонну с гектара, что значительно ниже средних мировых показателей. Это обусловлено особенностями резко континентальных, климатических условий Казахстана, прежде всего недостаточной водообеспеченностью, которые являются сдерживающими факторами повышения продуктивности пшеницы. Так в НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева в результате более 30 летнего изучения факторов внешней среды на урожайность пшеницы, выявлена высокая корреляционная зависимость продуктивности от влагообеспеченности (г = 0,645).

В Матералах II региональной научно-практической конференции «ГНУ НИИСХ Юго-Востока и Зональные особенности научного обеспечения сельскохозяйственного производства» отмечалось, что среди мер борьбы с засухой селекция растений должна занимать одно из ведущих мест (Н.С. Васильчук и др., 2010).

Академик РАСХН B.C. Шевелуха отмечает, что биотехнология может решать принципиально новые задачи, направленные на повышение урожайности сельскохозяйственных культур. Особенно это касается повышения устойчивости к биотическим факторам, так как около 30% урожая теряется из-за опасных болезней и вредителей. Сегодня используя биотехнологические подходы, можно создавать растения с комплексной устойчивостью (Шевелуха, 2001, 2003).

Преимущества использования клеточных биотехнологии для создания исходного материала и для ускорения селекционного процесса (методы эмбриокультуры, эмбриокультура в сочетании яровизацией in vitro, использование гаплоидных технологий), обсуждаются в работе Т.И. Дьячук (Дьячук и др., 2010)

В Северном Казахстане в последние годы распространение болезней зерновых культур наносит значительный ущерб продуктивности и качеству зерна. В рамках сотрудничества с Международным центром CIMMYT обследованы посевы озимой и яровой мягкой пшеницы. Было установлено, что распространение особо опасных возбудителей болезней выглядит следующим образом: Tan spot - 10-36% (Pyrenophora tritici-repentis), Septoria nodorum - 3-21%, Bipolaris sorokiniana - 5-9%, Septoria tritici - 7% (Duveiller, 2007). В регионе массовое заболевание септориозом посевов яровой мягкой пшеницы наблюдается в середине и в конце июля из-за заражения пикпоспорами, заселяющих пожнивные остатки (Койшибаев, 2006).

Септориоз пшеницы является острой проблемой мирового масштаба, о чём свидетельствуют материалы Международного симпозиума «Septoria и Stagonospora — болезни злаков», состоявшегося в Тунисе. На данном форуме ученые и практики детально обсудили традиционные и новые подходы к борьбе с болезнью, механизмы защитной ответной реакции растений, распространение септориальных болезней и объемы наносимого ущерба хлебным культурам в мировом масштабе (Zadokc, 2003).

Р.Г. Бутенко (1999) впервые подробно описала биотехнологические методы, которые позволяют повысить эффективность селекции, в частности, методы культуры изолированных клеток, тканей и органов растений. Основываясь на них, нами предпринята попытка усовершенствования схемы селекции in vitro, которая в отличие от традиционной схемы включает все звенья отбора клеток под действием различных селективных агентов.

Цели исследования. Цель исследований - создание технологической цепи, включающей традиционные методы селекции и биотехнологические методы, путем усовершенствования эффективности гаплоидных технологий при отборе яровой мягкой пшеницы на устойчивость к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Berk.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- создать экспериментальную систему повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выяснить роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы;

- провести селекцию на уровне гамет и оценить гаметоклональные варианты на толерантность к абиотическому фактору (водный дефицит);

- выявить эффективные формы селективного агента для проведения селекции in vitro к патогену Septorai nodorum Berk. Провести отбор эмбриоидов и регенерантов, размножить полученные линии, устойчивые к экзометаболитам гриба S. nodorum',

- изучить возможности использования белковых и ДНК маркеров для ускоренного отбора перспективных форм яровой пшеницы в ранних поколениях;

- создать новые перспективные формы яровой мягкой пшеницы с ценными хозяйственно-биологическими признаками на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов с последующим включением их в селекционные программы для облегчения и ускорения селекционного процесса и расширения генетического базиса селекции пшеницы.

Научная новизна. Разработана технология, сочетающая традиционные и биотехнологические подходы, обеспечивающие расширение генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы.

Создана экспериментальная система повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выявлена роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы. Установлено, что гормон ауксинового типа действия - ИУК, а также 2,4-D при обработке растений-доноров, с учетом содержания эндогенного ИУК, стимулируют процесс андрогенеза in vitro. Выявлено, что при предобработке ИУК срезанных растений, эмбриоиды индуцируются из поздних стадий развития микроспор, возможно из пыльцевого зерна. Кроме того, установлено, что предобработка срезанных растений аконитовой кислотой приводит к 100% выживанию индуцированных эмбриоидов и формированию из них растений-регенерантов.

Впервые показана возможность разработки новой модификации технологии гаметной селекции, основанной на использовании активно растущего мужского гаметофита для повышения эффективности получения спорофитной генерации. Такой подход позволил получить новые линии яровой мягкой пшеницы, устойчивые к засухе.

Константные формы, а также гаметоклональные варианты включены в программу селекции пшеницы на устойчивость к водному дефициту. Линии-регенеранты превысили стандарт (сорт Акмола 2) по продуктивности и проявили устойчивость к засухе и к полеганию. Полученные линии, в сравнении со стандартом, отличались по своим анатомо-морфологическим признакам и по архитектонике.

Впервые для селекции клеточных колоний in vitro, устойчивых к экзометаболитам гриба Septoria nodorum Berk., одновременно применен отбор на уровне репродуктивных и соматических клеток при поверхностном и глубинном выращивании каллусных культур.

Выявлены гибридные комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.

С помощью RAPD-метода выявлены изменения в геноме потомства растений-регенерантов пшеницы, полученных в результате использования гаплоидных технологий. Определены генетические расстояния между дигаплоидной линией и исходным сортом, а также гаметоклональными вариантами отражающие степень различия их геномов.

Практическая значимость работы. Отобранные в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы линии переданы селекционным учреждениям, расположенным в различных регионах Казахстана (НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, Карабалыкская СХОС, Актюбинский селекционный центр) для селекционной оценки и включения в гибридизацию. Перспективные формы и линии будут переданы на ГСП.

Разработанная нами технология получения перспективных форм яровой мягкой пшеницы на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов селекции, может быть применена и к другим злаковым культурам.

Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведения лабораторно-практических занятий по курсу

Биотехнология растений» и «Биотехнология сельскохозяйственных культур» в Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина. Основные результаты исследований по гаметоклональной селекции растений вошли в учебник «Ос1мдш биотехнологиясы» (С.С. Беккужина, 2009), рекомендованный Министерством образования и науки PK для преподавания на биологических и агрономических факультетах ВУЗов.

В результате исследований разработан способ получения гаплоидных растений пшеницы с повышенным регенерационным потенциалом, на который получен инновационный патент (2007/0161.1.).

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработана экспериментальная система, способствующая повышению компетенции микроспор для эффективного использования гаплоидной технологии по расширению генетической основы яровой мягкой пшеницы. Баланс фитогормонов является одним из ключевых механизмов переключения микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. У растений-доноров с высоким эндогенным содержанием индолилуксусной кислоты при их дополнительной обработке экзогенной ИУК повышается эффективность пыльцевого эмбриогенеза.

- Создана схема селекции на уровне репродуктивных и соматических клеток, позволяющая отбирать клеточные линии, устойчивые к засухе используя АБК, как фактор, моделирующий водный дефицит. Для получения форм устойчивых к Septoria nodorum Berk, в качестве селективного агента целесообразно использовать водную форму фильтрата фитопатогенного гриба S. nodorum Berk.

- Создана технология, сочетающая традиционные методы селекции и методы биотехнологии для ускорения селекции яровой мягкой пшеницы по отбору ценных признаков на продуктивность и стрессоустойчивость. Включение потомств растений-регенерантов в схемы классической селекции выявило преимущества комплексного использования этих методов по выявлению линий, обладающих хозяйственно-ценными признаками.

Белковые и молекулярные маркеры позволили отобрать перспективные формы яровой мягкой пшеницы в ранних поколениях.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и представлены на различных международных, республиканских конференциях, симпозиумах и совещаниях, в том числе на Международном симпозиуме «Устойчивость растений к биотическим и абиотическим факторам» (Берлин, 2009); Международном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009); Международной научной конференции «Актуальные вопросы биологии в Байкальском регионе» (Иркутск, 2009); IX Конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Москва, 2008); Международной конференции, посвященной 40-летию ГосНИИгенетики (Москва, 2008); Российской конференции «Генетика микроорганизмов», посвященной 100-летию со дня рождения С.А. Алиханяна (Москва-Пущино-на-Оке, 2006); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию РГП «НИЦ ЗХ им. А.И.Бараева» (Шортанды, 2006); Международной конференции, посвященной 50-летию Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина (Астана, 2007); Международной конференции «Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» (Астана, 2004); на Координационном совещании по Государственной программе 042 (Шортанды, 2001-2005).

Связь работы с крупными научными программами.

Теоретические и экспериментальные исследования по диссертационной работе были тесно связаны с выполнением Республиканских научных программ Министерства сельского хозяйства и Министерства образования и науки по проектам:

- «Расширение генетического базиса яровой мягкой пшеницы с помощью БН-метода»;

- «Усовершенствование методов селекции пшеницы на уровне клеток, выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость к биотическим факторам в морфогенетическом цикле «клетка-растение-клетка».

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 54 печатных работах, включая научные статьи, тезисы докладов, учебник, учебное пособие, методические рекомендации, инновационный патент.

Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Института биологии и биотехнологии, центра биотехнологии Республики Казахстан, Института Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Института проблем биологической безопасности, НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Карабалыкской СХОС. Авторство указано в списке опубликованных работ, приведенных в диссертации и в автореферате. Формулировка идей, планирование экспериментов, обработка первичных данных, их статистико-математический анализ и теоретическое обобщение результатов выполнены диссертантом. Диссертационная работа полностью написана лично автором.

Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 17 лет, с использованием общепринятых и современных методик, а также разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Беккужина, Сара Сабденовна

ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная технология получения форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septorai nodorum Berk., на основе сочетания гаплоидной технологии и классических методов селекции.

2. Создана эффективная биологическая система, позволяющая переключать развитие микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития на основе предобработки срезанных колосьев гормонами ауксинового типа действия - ИУК, 2,4-D с учетом содержания эндогенного ИУК в растениях. Разработанный способ повышает эффективность пыльцевого эмбриогенеза до 8%.

3. Впервые при гаметоклональной селекции in vitro из трех форм селективного агента: культуральный фильтрат, фитотоксины и водная форма грибного фильтрата (ВФГФ) гриба Septoria nodorum Berk, выявлена эффективность отбора эмбриоидов на среде с ВФГФ. Данный селективный фактор обладал фитотоксичностыо в 1,5-2 раза выше по сравнению с КФ.

4. Установлено, что в условиях in vitro на уровне репродуктивных клеток, при использовании абсцизовой кислоты и хлорида натрия могут быть получены осмотолерантные клеточные линии. На основе морфогенетического цикла «клетка-растение-клетка» отобраны засухоустойчивые линии AR245, K)580R2 и гаметоклон ЛГВЗ-692-3-5, которые проявили устойчивость к засухе при полевой оценке (7-9 баллов).

5. Линии, полученные в результате селекции на уровне гамет, отличались анатомо-морфологическими признаками и общей архитектоникой - большей листовой поверхностью, верхний лист по отношению к стеблю расположен под значительно меньшим углом (45-55°), что приводит к смещению фаз всходы-колошение на период лучшей влагообеспеченности. Растения формировали большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи.

6. Линии - регенеранты превысили стандартный сорт Акмола 2 по урожайности на 3,6-4,5 ц/га. Урожайность формировалась за счет высокой продуктивной кустистости, озерненности колоса и массы зерна с колоса. Хлебопекарная оценка линий варьирует от 4,3 до 4,6 балла. Высоким содержанием клейковины отличались линии I0580R и ЛГВ2-92-2 - 30,032,4%. Линии I0580R, AR45 использованы в гибридизации и на их основе при отборе получено 44 400 элитных колосьев.

7. При использовании белковых маркеров на ранних этапах гибридизации выявлены ценные гибридные комбинации по запасным белкам пшеницы. Константные формы с ценными аллелями по этим признакам переданы в селекционные центры. Выявлены гибридные комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.

8. RAPD анализ подтвердил наименьшие геномные различия (0.02) между исходным сортом Целинная-Юбилейная и дигаплоидной линии I0580R. При сравнении спектров дигаплоидной линии I0580R и полученной из нее гаметоклонов (ЛГВЗ-692-3-5, ЛГВ2-92-2, ЛГВ1-92-2) выявлено 13 полиморфных фрагментов.

9. Многолетние полевые испытания подтвердили наличие морфофизиологических показателей устойчивости растений пшеницы к засухе и полеганию. Показана перспективность комплексного применения методов биотехнологии и традиционной селекции для отбора линии, обладающих хозяйственно-ценными признаками. Полученные перспективные линии яровой мягкой пшеницы готовятся к передаче на Государственное сортоиспытание.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Успешное решение задачи по созданию ценного исходного материала, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, требует использования мультидисциплинарного подхода. Для этого мы попытались соединить несколько методов in vitro с методами классической селекции и создать технологическую цепь, включающую традиционные и биотехнологические методы селекции.

Теоретические разработки по выяснению компетенции микроспор позволили установить строгую зависимость эффективности пыльцевого эмбриогенеза от баланса эндогенных и экзогенных фитогормонов. Предполагается, что низкий выход гаплоидных структур у изучаемых генотипов связан с низким содержанием в них индолилуксусной кислоты, играющей важную роль в индукции андрогенеза in vitro.

Показано, что гормоны ауксинового типа действия — ИУК, 2,4-D при обработке растений-доноров с учетом содержания эндогенного ИУК способствуют повышению эффективности андрогенеза in vitro. Генотипы с низким содержанием эндогенного гормона необходимо обрабатывать растворами высоких концентраций ИУК.

Установлено, что обработка ИУК повышает появление аномальных микроспор. Например, у сорта Акмола 2 в контроле пыльцевой эмбриогенез составляет 1,4 %, где аномальные микроспоры не образуются. При повышении концентрации ИУК частота выхода эмбриоидов 5,2 %, аномальные микроспоры составляют 16,6 %. На сорте Ишимская 98 высокий процент аномалий наблюдали при обработке 0,5% ИУК в течение 10 суток, где также отмечен высокий выход эмбриоидов.

В результате экспериментальных исследований показано, что с помощью селекции in vitro на уровне репродуктивных клеток, используя селективный фактор, моделирующий водный дефицит можно отобрать засухоустойчивые линии. При отборе клеток на осмотолерантность через три цикла селекции in vitro создана линия I0580R2, обладающая способностью к дополнительному побегообразованию на 1% солевой среде.

Разработанная схема селекции in vitro на уровне репродуктивных клеток (рис. 72), показала свою эффективность при отборе засухоустойчивых растений, где в качестве селективного фактора использовали абсцизовую кислоту, участвующую в адаптивных реакциях на потерю воды клетками.

Линия AR245, отобранная согласно разработанной схеме, показала устойчивость к засухе при полевой оценке. Линия по сравнению со стандартом, отличалась анатомо-морфологическими признаками и архитектоникой. Обладала большей листовой поверхностью, причем листья относятся к эректоидному типу, что очень важно для эффективного поглощения ФАР. Верхний лист по отношению к стеблю расположен под значительно меньшим углом (45-55 С), что способствует меньшему испарению влаги с листовой поверхности в условиях засухи.

Таким образом, многолетние полевые испытания подтвердили морфофизиологические показатели устойчивости растений пшеницы к засухе и полеганию.

Для ускорения селекционного процесса проводилась гибридизация линий Ю580 R и AR45 с формами, являющимися донорами признака засухоустойчивости. Гибриды отбирали по активности ферментного комплекса МДГ-ГОАТ по сравнению с обеими родительскими формами.

Линии AR45, ЛГВЗ-692-3-5 достоверно превысили стандарт по урожайности на 2,9-3,6 ц/га. Линии, превысившие стандарт, переданы на размножение и испытание в ТОО «Карабалыкская СХОС».

Линия AR45 разложена на два биотипа по высоте растений и сроки созревания и высевается отдельно каждый в сравнении как со стандартом, так с исходной формой AR45. Проводится селекционный процесс, в котором осуществляется отбор F3 и F4 поколений гибридов, полученных с участием линий-регенерантов Ю580 R и AR45. В дальнейшем перспективные линии будут переданы на ГСИ.

Схема отбора селекции на уровне гамет применялась и для индукции пыльцевого эмбриогенеза при биотическом стрессе.

При использовании 3-х форм селективного фактора: культуральный фильтрат (КФ), фитотоксины и новая форма фильтрата фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk. Выявлено, что водная форма грибного фильтрата является более токсичной, чем КФ S. nodorum Berk. Отбор на токсинах не является эффективным. При использовании комплекса фитотоксинов в качестве селективного фактора установлено, что токсины гриба для отдельно растущих клеток являются высокотоксичными и растения-регенеранты на данной форме селективного агента не были получены. Растения-регенеранты, устойчивые к экзометаболитам гриба Septoria nodorum Berk., получены при поверхностном выращивании клеточных колоний, и в культуре пыльников. Получено семенное потомство Ro из растений-регенерантов через три цикла селекции на ВФГФ Septoria nodorum Berk.

Выявлено, что фитотоксины в КФ и в экстрактах, выделенных из мицелия гриба Septoria nodorum Berk, идентичны.

Используя RAPD-метод, определяли наличие изменений в геноме потомства растений-регенерантов пшеницы, полученных с помощью пыльцевого эмбриогенеза. В результате проведенного RAPD-маркирования, каждый из полученных спектров анализируемых гаметоклонов характеризуется уникальным набором амплифицированных фрагментов. Полиморфизм между анализируемыми гаметоклонами пшеницы составил 10,2%.

Наименьшие геномные различия (0.02) наблюдали между сортом Целинная-Юбилейная и полученной из нее дигаплоидной линией I0580R.

На основе проведенных исследований разработана технологическая схема (рис.72), позволяющая ускорить селекционный процесс яровой мягкой пшеницы. Умелое сочетание традиционных и биотехнологических методов может быть применено и к другим сельскохозяйственным культурам для улучшения их генетического базиса. Селекция на уровне гамет может достойно стать одним из ведущих направлений в поиске путей отбора растений, устойчивых к стрессовым воздействиям, не исключая при этом, методы классической селекции.

Предлагаемая нами схема состоит из следующих этапов:

I этап. Отбор перспективных форм методами традиционной селекции и их гомозиготизация в ранних поколениях с помощью культуры пыльников

II этап. Селекция in vitro на уровне репродуктивных и соматических клеток с отбором константных форм и их гаметоклональных вариантов по признаку стрессоустойчивости.

III этап. Гибридизация с сортами и линиями являющимися «генетическими носителями» по признаку засухоустойчивости и использование в качестве одной из родительских форм удвоенных гаплоидов, отобранных в условиях in vitro на водный дефицит.

IV этап. Использование белковых маркеров для отбора ценных гибридов в ранних поколениях на стрессоустойчивость. Оценка степени гетерозиса по активности МДГ-ГОАТ у гибридов по сравнению с родительскими формами. ч

V этап. RAPD-метод анализа ДНК для оценки уровня полиморфизма, межлинейных отличий, генетических расстояний исходных форм и форм, отобранных в культуре in vitro.

Технология создания перспективных форм яровой мягкой пшеницы на основе клеточных технологий, включая традиционные методы селекции

Традиционная селекция Биотехнология

Гибридизация с формами, генетическими носителями» по признаку засухоустойчивости и <г использование в качестве одной из родительских форм особей, отобранных в условиях селекции in vitro на водный дефицит

Селекционный процесс

Гомозиготизация перспективных форм в ранних поколениях (получение DH-линий)

Селекция in vitro на уровне репродуктивных и соматических клеток

Отбор константных форм и их гаметоклональных вариантов по признаку устойчивости к водному дефициту

Отбор гибридов в ранних поколениях по белковым маркерам на стрессоустойчивость (активность ферментного комплекса МДГ-ГОАТ)

1/

КАРБ-анализ ДНК для оценки уровня полиморфизма и межлинейных отличий генетического расстояния

Рисунок 72 — Этапы технологии получения растений, устойчивых к абиотическому и биотическому стрессу

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Беккужина, Сара Сабденовна, Астана

1. Аврова, А.О. Физиолого-биохимические особенности взаимодействия томатов с Alternaría solani и селекция in vitro на устойчивость к альтернариозу: автореф. дис. .канд. биол. наук / А.О. Аврова. ВИЗР. -1994. - 18 с.

2. Алипбекова, Ч. А. Биологическое особенности септориоза пшеницы и использование их в иммуноселекции: автореф. дис. .канд. сельскохоз. наук / Ч.А. Алипбекова. Алма-ата. - 1993. - 23 с.

3. Ахметов, К.А. АРМ «Биометрия» / К.А. Ахметов, Р.А. Асаев. Алматы. -2000.- 156 с.

4. Бавол, И.А. Использование методов клеточной селекции для повышения устойчивости пшеницы к корневой гнили / И.А Бавол // IX Конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Москва. - 2008. -С. 26.

5. Балашова, Н.Н. К вопросу о роли микрогаметофита в адаптации растений к эконише возделывания / Н.Н Балашова, З.Т Валеева, А.Н. Игнатова // С.-х. биол. 1994. - С. 59-64.

6. Бальвинская, М.С. Возможности использования многомаркерных дигаплоидных линий для картирования генома ячменя / М.С. Бальвинская, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. 2000. - Т. 34. - №6. - С. 42-49.

7. Батыгина, Т.Б. Методические рекомендации по исследованию морфогенетического потенциала пыльника яровой мягкой пшеницы / Т.Б. Батыгина, Н.Н. Круглова // ИБ УНЦ РАН. Уфа. - 2001. - 39 с.

8. Батыгина, Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза / Т.Б. Батыгина // Эмбриология цветковых растений: Терминология и концепция, Т.1. Мир и Семья. - Санкт-Петербург. - 1994. - С. 120-121.

9. Батыгина, Т.Б. Эмбриогенез злаков / Т.Б. Батыгина // Эмбриология цветковых растений: Терминология и концепция, Т.2. Мир и Семья. — Санкт-Петербург. - 1997. - С. 528-538.

10. Батыгина, Т.Б. Эмбриоидогения новый тип вегетативного размножения / Т.Б. Батыгина // Эмбриология цветковых растений: Терминология и концепция, Т.З. - Мир и Семья. - Санкт-Петербург. - 2000. - С. 334-349.

11. Беккужина, С.С. Селекционная оценка линий, полученных в культуре пыльников пшеницы {Triticum aestivum L) / С.С. Беккужина, Ю.И. Зеленский // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана, №3. ТОО издательство «Бастау». - 2009. - С. 11-14.

12. Беккужина, С.С. Использование DH-метода для проведения гаметной селекции / С.С. Беккужина // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых 14-18 апреля. Сборник тезисов. Москва. - 2003. - С. 90.

13. Беккужина, С.С. Селекция пшеницы на устойчивость к грибному патогену Septoria Nodorum Berk в культуре изолированных пыльников / С.С. Беккужина, Е.А. Калашникова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. № 4. - 2009. - С. 6-7.

14. Беккужина, С.С. Клональное размножение для селекции пшеницы / С.С. Беккужина // Вестник АСХИ. № 3. - 1996. - С. 105-111.

15. Беккужина, С.С. Влияние стадий развития микроспор на пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.) / С.С. Беккужина, Л.Ф. Созинова // Научный журнал МОН PK: Поиск. №2.2009.-С. 16-19.

16. Белякова, Г.А. Токсичность КФ грибов, вызывающих пятнистость на хлопчатнике / Г.А. Белякова, Б.С. Ермолинский, С.И. Свиридов // Вестник Московского ун-та, сер. № 16. - 1991. - С. 56-61.

17. Берестецкий, O.A. Определение фитотоксической активности культур микроскопических грибов / O.A. Берестецкий // В кн. «Методы экспериментальногой микологии». — Киев. 1973. - С. 165-175.

18. Богданова, Е.Д. Адаптационные морфологические признаки для повышения засухоустойчивости пшеницы Triticum aestivum L. / Е.Д. Богданова, Ф.А. Полимбетова // 1-я центрально-азиатская конференция по пшенице. 2003. - С. 175-181.

19. Бочарова, E.B. Фитотоксины гриба Septoria nodorum В. И их роль в патогенезе септориоза: дисс. канд. биол. наук. / Е.В. Бочарова // Гвардейский, 1991. 127 с.

20. Булатова, K.M. Глютениновые биотипы пшеницы Богарная 56. / K.M. Булатова // Вестник с.-х. науки Казахстана. №11. - 1985. - С. 37-38.

21. Бунин, М.С. Разработка методики повышения холодостойкости репы • японской с использованием мужского гаметофита / М.С. Бунин, В.А.

22. Степанов // В сборнике: Гетерозис сельскохозяйственных растений. Мат. докл. сообщ. Международного симп. 1997. - С. 96-97.

23. Бутенко, Р.Г. Биотехнология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко // М.: ФБК Пресс. 1999. - 159 с.

24. Бутенко, Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений / Р.Г. Бутенко // Гормональная регуляция онтогенеза растений. Москва. - 1984. - С. 42-54.

25. Бутенко, Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе / Р.Г. Бутенко // Мат. Всесоюзной конф. «Состояние и развитие с/х биотехнологии». -Москва. 1986. - С. 29-38.

26. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза / Р.Г. Бутенко // Москва. 1964. - С. 29-38.

27. Бутенко, Р.Г. Культура клеток и тканей растений в практической генетике и селекции / Р.Г. Бутенко // Докл. ВАСХНИЛ. Т . 7. - 1982. - С. 12-26.

28. Бутенко, Р.Г. Перспективы использования культивируемых клеток растений в биотехнологии / Р.Г. Бутенко // В кн. Биотехнология. Москва: Наука. - 1984. - С. 239-247.

29. Бутенко, Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений / Р.Г. Бутенко // М.: Наука. 1975. - 51 с.

30. Бхат Дж., Х.Н. Мурти регенерация гаплоидных растений в культуре из неопыленных семяпочек масличного нута / Х.Н. Бхат Дж. // Физиология растений. Т. 55. - №2. - 2008. - С. 262-267.

31. Васецкая, М.Н. Возбудители септориоза пшеницы / М.Н. Васецкая, Г.И. Борзионова // Вестн. с/х наук Казахстана, № 3. 1987. - С. 45-47.

32. Васильчук, Н.С. Роль сорта в повышении урожайности и качества зерна яровой твердой пшеницы / Н.С. Васильчук, С.Н. Гапонов // Матералы II региональной научно-практической конференции. Саратов. - 2010. - С. 18-30

33. Веселов, Д.С. Реакция растений на засоление и формирование солеустойчивости / Д.С. Веселов, И.В. Маркова, Г.Р. Кудоярова // Успехи современной биологии. Т. 5. - 2007. - С. 482-493.

34. Волощук, А.Д. Морфолого-биохимические характеристики каллусов пшеницы при культивировании с патогенными грибами / А.Д. Волощук // Докл. Российской академии сельскохоз. наук. — Москва. 2005. - 38 с.

35. Галиева, Э.Р. Феномен андроклинии и албинизм у злаков / Э.Р Галиева, Ф.М. Шакирова, H.H. Круглова // Успехи современной биологии -Т. 122. №4. 2002.-С. 342-352.

36. Гирко, B.C. Оценка устойчивости к действию КФ грибного патогена в культуре незрелых зародышей / B.C. Гирко, К.Г. Волощук // С.-х. биология, сер. Биология растений, №9. 1993. - С. 62-70.

37. Горбунова, В.Ю. Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы: диссертация. доктора биол. наук / В.Ю. Горбунова // Москва 2000. -378 с.

38. Горбунова, В.Ю. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы: баланс эндогенных и экзогенных фитогормонов / В.Ю. Горбунова, H.H. Круглова, С.Н. Абрамов // Изв. РАН Сер. Биол., № 1. -2001.-С. 31-36.

39. Грищенко, Е.И. Особенности эмбриогенного развития in vitro пыльцевых зерен Brassica napus / Е.И. Грищенко, Я.Б. Блюм. // Цитология и генетика, №5.-2001.-С. 65-73.

40. Турецкая, B.C. Роль биологически активных соединений в индукции гаплоидов в культуре пыльников / B.C. Турецкая // Тез. докл. междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология». Минск. - 1998. - С. 170-171.

41. Даниленко, Н.Г. Миры геномов органелл / Н.Г. Даниленко, О.Г. Давыденко // Мн.: Тэхналопя. 2003. - 494 с.

42. Джардемалиев, Ж.К. Исследование роста клеточных популяций различных видов пшеницы и эгилопса в суспензионной культуре / Ж.К. Джардемалиев, И.Д. Никифорова, Р.Г. Бутенко, М.К. Карабаев, М.А. Айтхожип // Вестник АН КазССР, №8. 1988. - С. 66-70.

43. Добровольская, JT.B. Андрогенез у пшенично-ржаных замещенных линий (Саратовская 29*Онохойская) и тритикале / JI.B. Добровольская // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: Тезисы междунар. конф. — Харьков. 2001. - 18 с.

44. Дорофеева, Ф.С. Методические указания по изучению мировой коллекции пшеницы / Ф.С. Дорофеевой // 3-е издание, переработанное. -Ленинград. 1977. - 28 с.

45. Дьячук, Т.И. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников / Т.И. Дьячук, П.А. Дьячук // М.: ВАСХНИИЛ -1989. С. 3-30.

46. Дьячук, Т.И. Технологические и селекционные аспекты гаплоидии (на примере пшеницы и ячменя): автореф. дис. доктора биол. наук / Т.И. Дьячук. Саратов, 2003. - 50с.

47. Дьячук, Т.И. Цитологическое подтверждение спорофитного развития микроспор в культуре пыльников тритикале без холодового воздействия / Т.И. Дьячук, О.В. Хомякова, Т.О. Дугина // Сельскохозяйственная биология. 2010. - № 5. - С.27-30

48. Драгавцев, В.А. К проблеме генетичекого анализа полигенных количественных признаков растений / В.А. Драгавцев // Научное издание: ООО Копи Р. С-Пегербург, 2003. - 35 с.

49. Евстратова, Л.П. О получении чистой культуры гриба Rhizoctonia solani / Л.П. Евстратова, Л.И. Груздева, Е.М. Матвеева // Вести Рос. акад. с/х наук, 1995, №4. -С. 47-49.

50. Ермаков И.П., Матвеева Н.П. / Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор //Вестн.Моск.ун-та.Сер.16, Биология. 1986, №3.-С. 28-40.

51. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений / К.Ж. Жамбакин // Алматы: Издательский центр «Интерлигал». — 2004. 184 с.

52. Жамбакин, К.Ж. Использование гаплоидной биотехнологии для селекции яровой мягкой пшеницы в Северном Казахстане / К.Ж. Жамбакин, Н.В. Терлецкая // 1-я Центрально- Азиатская конференция по пшенице. -Алматы, 2003. 114 с.

53. Жученко, A.A. Современные проблемы биотехнологии и биобезопасность / A.A. Жученко // Сельскохозяйственная биология, 2003, №1.

54. Зайцева, О.И. Показатели андрогенеза в культуре пыльников сортов и гибридов ярового триткале / Зайцева, О.И. // Четвертый Московский международный конгресс. Москва, 2007. - 240 с.

55. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения и методы их использования / М.Н. Запрометов // Биохимические методы в физиологии растений М.: Наука, 1971. С. 185-197.

56. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения / М.Н. Запрометов // М.:Наука, 1993.-272 с.

57. Иванников, A.B. Биометрия, учебное пособие / A.B. Иванников // Астана, 2006.- 115 с.

58. Инге-Вечтомов, С.Г. Метаболизм растений и защита стеринов // Соросовский образовательный журнал, 1997. №11. С. 16-21.

59. Исабаев, С.Я. Количество зародышевых корней как показатель засухоустойчивости яровой мягкой пшеницы / С.Я. Исабаев, Ж.Т. Калыбекова // 1-я Центрально-Азиатская конференция по пшенице. Алматы, 2003. 120 с.

60. Калашникова, Е.А. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к грибным болезням: дисс. доктора биол.наук / Е.А. Калашникова // Москва, 2003. 270 с.

61. Калашникова, Е.А. Получение in vitro клеточных и тканевых культур подсолнечника устойчивых к Sclerotinia Sclerotiorum I / Е.А. Калашникова // IX Конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Москва, 2008,-С. 158.

62. Карабаев, М.К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологичекие аспекты: автореф. дис. докт. биол. наук / М.К. Карабаев // Москва, 1994. 49 с.

63. Кихара, X. Цитоплазматическая мужская стерильность и селекция пшеницы / X. Кихара // В кн.: Гетерозис и практика.- JI. Колос,1968.- С. 87-102.

64. Кляченко, C.B. Получение гаплоидных растений Brassika napus в условиях in vitro / C.B. Кляченко // Четвертый Московский международный конгресс. Москва, 2007. 280 с.

65. Кобыльский, Г.И. Патогенность дейторомицетов (на примере возбудителя септориоза пшеницы-гриба Septoria nodorum (Berk) / Г.И. Кобыльский //Автореф. докт. биол. наук. Москва, 2005.- 45 с

66. Кобыльский, Г.И. Методика определения фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии / Г.И. Кобыльский, Е.В. Бочарова //Гвардейский, 1990. 20 с.

67. Койшыбаев, М. Интернет сайт-интервью / М. Койшыбаев // www net.kz, 2008.

68. Койшыбаев, M. Защита зерновых культур от болезней с воздушно-капельной инфекцией / М. Койшыбаев // Практическое руководство, Алматы, 2006. 30 с.

69. Койшыбаев, М. Болезни зерновых культур / М. Койшыбаев // Алматы. Бастау, 2002. 368 с.

70. Койшыбаев, М. Динамика болезни зерновых культур листостебельной инфекции в разных ландшафтных зонах / М. Койшыбаев // Стратегия земледелия растениеводства на рубеже 21 в, Алматы, 1999. С. 108-109.

71. Койшыбаев, М. Особенности развития и вредоносность септориоза в Казахстане / М. Койшыбаев, Э.Т. Исмаилова // Вестник с-х- науки Казахстана, 1991. С. 31-38.

72. Ковалева, JI.B. Гаметофитно-спорфитное взаймодействие в системе пыльца-пестик: диссер. на докт. биол. наук / JI.B. Ковалева // 1994.

73. Колючий, В.Т. Селекционная ценность аллелей глиадинкодирующих локусов озимой мягкой пшеницы в условиях лесостепи Украины: автореф. дис. канд. биол.наук. / В.Т. Колючий // Киев. 1989. 16 с.

74. Колючий, В.Т. Влияние естественного отбора на частоту аллелей глиадинкодирующих локусов и их ассоциаций в искусственно созданной гибридной популяции озимой пшеницы / В.Т. Колючий, A.A. Созинов // Цитология и генетика. 2000, Т.34, №2. С. 32-38.

75. Конарев, A.B. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства / A.B. Конарев, В.Г. Конарев, Н.К. Губарева, Т.И. Пенева // Цитология и генетика. 2000, Т.34, №2.- С. 91-103.

76. Копусь, М.М. О естественной геногеографии глиадиновых аллелей у озимой мягкой пшеницы / М.М. Копусь // Селекция и семеноводство. 1994. №4.-С. 9-14.

77. Кочиева, Е.З. Идентификация меж- и внутрисортового полиморфизма у томатов / Е.З. Кочиева, Т.П. Супрунова, С.К. Семенова // Генетика. 1999. Т.35. № 10.-С. 1386-1389.

78. Кошкин, Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур / Е.И. Кошкин // М.:2010. 638с.

79. Кравченко, А.Н. Методы гаметной и зиготной селекции томатов / А.Н. Кравченко, В.А. Лях, Л.Г. Тодераш // Кишинев,1988.

80. Круглова, H.H. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы / H.H. Круглова, Т.Б. Батыгина// М.: Наука, 2005. 99 с.

81. Круглова, H.H. Влияние концентрации 2,4-Д на начальные этапы эмбриоидогенеза в культуре пыльников яровой пшеницы / H.H. Круглова, В.Ю. Горбунова, H.H. Потапова //Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 2. Санкт-Петербург, 1993. С. 139.

82. Круглова, H.H. Морфогенез в культуре пыльников пшеницы: эмбриологический подход / H.H. Круглова // Уфа: Гилем, 2001. 203 с.

83. Кулаева, О.Н. Как регулирется жизнь растений / О.Н. Кулаева // Соросовский образовательный журнал, 1995, № 1. С. 20-27.

84. Кулаева, О.Н. Карликовые мутанты и их роль в «зеленой революции» /

85. Н. Кулаева// Соросовский образовательный журнал, том 6, № 8, 2000.

86. Кулаева, О.Н. Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов в сигнальных системах целого растения / О.Н. Кулаева//, 2009. С. 851.

87. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // Учебное пособие для биологических специальностей вузов — 3-издание переработ, и дополнен. М. Высш. Школа, 1980 293с

88. Ларченко, Е.А., Моргун В.В. / Сравнительный анализ наследственной изменчивости растений при мутагенной обработке генеративных клеток и семян кукурузы / Е.А Ларченко, В.В. Моргун //Цитология и генетика, 2000, Т. 34. №4.-С.16-20.

89. Левитес, Е.В., Свирщевская A.M. и др. / Удвоенные гаплоиды в изучении эпигенетической изменчивости сахарной свеклы / Е.В.Левитес, А.М Свирщевская. и др / Вестник ВОГиС, 2005. Т. 9, № 5. С. 512-517.

90. Джое, Л. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу / Л. Джое, Е.А. Калашникова // Сельскохозяйственная биотехнология, 2000, т.1, Избранные работы под редакцией B.C. Шевелухи. 262 с.

91. Лихачев, А.Н. / Использование жидких питательных сред для получения моноспоровых культур грибов / А.Н Лихачев // Микология и фитопатология, 1994. Т. 28, вып. 5. С. 14-16.

92. Лутова, Л.А, Левашина Е.А и др. / Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов/ Л.А. Лутова, Е.А Левашина и др. Генетика, 1999. Т. 28. №2. С.129-126.

93. Мараит, А. / Мараит Значение разнообразия патогенов в борьбе с желтой пятнистостью и ожогом листьев пшеницы в центральной Азии / А Мараит, Д. Меркадо Вергнес, М.Е. Ренард и др. // Агромеридиан 2006. 2.(3).-С 105-114.

94. Масленников, С.Е. / Получение устойчивых к корневым гнилям растений люцерны с использованием методов культуры каллусов и клеток / С.Е Масленников //Соврем. Достижения биотехнологии. Ставрополь, 1995. С. 24-25.

95. Матвеева, Н.П. /Физиология развития мужского гаметофита покрытосеменных растений / Н.П Матвеева, И. П Ермаков // Общая биология, 1999. Т. 60, № 3. С. 277-293.

96. Матвеева, Н.П. / Эмбриология растений: использование в генетике, селекции и биотехнологии растений / Н.П Матвеева // М.: Агропромиздат, 1990.-С. 335-370.

97. Методы биохимического исследования растений: Сборник под редакцией Ермакова А.И. Колос. 1972.

98. Методические указания. Отбор образцов на засухоустойчивость и продуктивность по корням / Сост.: Балык Г.С. JL, 1979. - 50 с.

99. Методические указания по изучению мировой коллекции пшениц / Сост. Градчанинова О.Д., Филатенко A.A., Руденко М.И.: Ред. Дорофеев В.Ф.-Л., 1985.-26 с.

100. Нгуен, Х.М. / Селекция in vitro на устойчивость к Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici у томатов / Х.М. Нгуен //Автореф. . канд.биол.наук, Минск, 1991.-21 с.

101. Ницше В. / Гаплоиды в селекции растений / Ницше В. Венце ль Т. II пер.с англ. Попова B.B. М.: Колос,1989. 127с

102. Носова, О.Н. / Использование раствора 2,4—Д для повышения эффективности получения гаплоидов в культуре пыльников тритикале / О.Н. Носова //Тез. докл. II Росс. симп. «Новые методы биотехнологии растений». Пущино, 1993. -160 с.

103. Олейник, A.A. / Некоторые особенности корневой системы сортов ярового ячменя / А.А Олейник // Селекция и семеноводство, садоводство и защита растений. — Целиноград, 1971.

104. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений/ З.П Паушева- М: Колос, 1970.-255 с.

105. Пирузян, Э. С. Основы генетической инженерии растений / Э. С. Пирузян, Москва, «Наука», 1988. 300 с.

106. Полевой, В.В. Фитогормоны / В.В Полевой // JL: Изд-во Ленингр. Унта. 1982. 248 с.

107. Поляков, A.B./ Размножение льна-долгунца/А.В Поляков // Москва,2008.

108. Поляков, A.B. /Биотехнология в селекции льна / A.B. Поляков //М: Форма, 2000. 179 с

109. Поляков, A.B. / Биотехнология в селекции льна / A.B. Поляков

110. Издание второе.- М: 2010. 202 с.

111. Поперля, Ф.А. / Блок компонетов глиадина GLD 1ВЗ как маркер гена, как маркер гена, обуславливающего устойчивость растений пшеницы к стеблевой ржавчине / Ф.А Поперля, Л.Г.Бабаянц //Докл. ВАСХНИЛ. 1980. №4. С. 4-7.

112. Поперля, Ф.А. / Электрофорез глиадина как метод идентификации пшениц, у которых 1в-хромосома полностью или частично замещена на 1к-хромосому ржи / Ф.А. Поперля, A.A. Созинов //Докл. ВАСХНИЛ, 1977. №2. С. 2-4.

113. Программа СИМИТ по улучшению пшеницы в Казахстане. Вместе в XXI веке. Астана, 2008. 55 с.

114. Пухальский, В.А. / Проблемы генетической теории селекции растений / В.А. Пухальский // Вестник ВОГиС, 2005. Т. 9, №3. С. 306-316.

115. Пыльнев, В.В / Коновалов Ю.Б.Дупацария Т.И. Частная селекция полевых культур/ В.В Пыльнев, Ю.Б. Коновалов, Т.И. Хупацария // М: Колос, 2005. 552 с.

116. Пшеничникова, Т.А. / На IX Международном симпозиуме по генетике пшеницы / Т.А Пшеничникова // Вестник ВОГИС, 1998. №5. С. 4-8.

117. Пшеничникова, Т.А / Институт цитологии и генетики СО РАН и Международные раучные программы по генетике пшеницы / Т.А Пшеничникова // Вестник ВОГИС, 2006. Т. 10. № 1. С. 203-206.

118. Пыжикова, Г.В., / Для снижения вредоносности септориоза / Г.В Пыжикова, Г.Ю. Тушинский // Защита растений, 1985. 39. С. 15-16.

119. Раджарам, С. / Потенциал урожайности пшеницы / С. Раджарам, X. Браун // Агромеридиан 2(3), 2006. С. 5-12.

120. Рахимбаев, И. / Биотехнология растений в мире и в Казахстане / И. Рахимбаев // Биотехнология теория и практика, 2006. С. 5-15.

121. Рахимбаев, И. / Культура репродуктивных клеток и гаплоидная биотехнология генетического улучшения растений /И. Рахимбаев// Биотехнология. Теория и Практика. №3. 1997. С. 1- 8.

122. Родева, В., Станчева И. / Биологичен эфект на културални филтрати от различии изопати на Alternaría solani върху растение доматени растение ш vitro/ В.Родева, И. Станчева //Биотехнология- 1990.Т. 4, № 3/4. С. 27-30.

123. Сайфуллин, Р.Г. Селекция яровой мягкой пшеницы в Саратове // Матералы II региональной научно-практической конференции / Р.Г. Сайфуллин, К.Ф. Гуриянова, В.А. Давыдова и др. // Саратов, 2010. С. 917.

124. Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. Т2., под редакцией Шевелухи В.С, «Евразия +», 2001, 404с.

125. Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. Т2. под редакцией Шевелухи В.С, «Евразия +», 2000. Т.1. -С. 3-14.

126. Семенов, О.Г. / Аллоцитоплазматическая пшеница. Биологические основы селекции / О.Г Семенов // Монография Ид-во РУДН: 2000. 208 с.

127. Скоробогатова И.В / Изменение содержания фитогормонов в проростках ячменя в онтогенезе и при внесении регуляторов, стимулирующих рост / И.В Скоробогатова, Н.П Карсункина, П.Б Курапов, Соркина Г.Л, Кислин Е.Н // «Агрохимия» 1999, N8. С. 49-53.

128. Смиряев, A.B. / Генетика популяций и количественных признаков / Смиряёв, A.B. A.B. Кильчевский. Учебник. Издательство «КолосС», 2007. 269 с.

129. Созинов, A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А.А Созинов // М: Наука, 1985. 272 с.

130. Созинов, A.A., Поперля Ф.А. / Полиморфизм глиадина и селекция /

131. A.А Созинов, Ф.А. Поперля // Вести с.-х. науки. 1979. 310. С. 21-34.

132. Созинов, И.А. /Полиморфизм аллельных состояний глиадинкодирующих локусов с урожаем и массой 1000 зёрен озимой пшеницы / И.А. Созинов // Экология генетики растений и животных: Тез. Докладов всесоюзн. Конференции Кишинев, 1981. ч.1. - С. 70-71.

133. Трошина, Л. Г. / Индкуция салициловой кислотой устойчивости пшеницы к Septoria nodorum Berk / Л. Г Трошина, А.Ш. Яруллина // Известия РАН, Серия биологическая, 2007. № 5. С. 545-550.

134. Тучин, C.B. / Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия / C.B. Тучин // Дисс. доктора биол.наук. 2000.- 277 с

135. Тырнов, B.C. Гаплоидия у растений: Научное и прикладное значение /

136. B.C. Тырнов // М.: Наука, 1998. 53 с.

137. Тырнов, B.C. Андрогенез // Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976.1. C. 87-89.

138. Угарова, C.B. / Селекция моркови с применением биотехнологических методов / С.В Угарова, A.A. Тесля // Тез. докл. «Пробл. Совета по растениеводству, селекции, семеноводству с/х культур Сибири», Новосибирск, 1994. С. 23-24.

139. Уразалиев, Р. А, Абсаттарова A.C. / Селекция за рубежом / Р. А Уразалиев, A.C. Абсаттарова //Вестник ВОГиС, 2005, Т. 9, №3. -С 415422.

140. Уразалиев, P.A. / Состав запасных белков озимой пшеницы регионального питомника ПАЗ / Р.А Уразалиев, К. M Булатова., М.А., Есимбекова К., Джиенбаев // Вестник региональной сети по внедрению сортов пшеницы и семеноводству № 2. Алматы, 2002. С. 70-74.

141. Уразалиев, P.A. / Состав высокомолекулярных глютенинов озимых мягких пшениц / P.A. Уразалиев, К. M Булатова., М.А. Есимбекова, С.Е Карбозов // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана № 6, 1997. -С. 54-58.

142. Холодова, В.П. / Характер адаптивных реакции ядерно-цитоплазматических гибридов яровой пшеницы на засуху / В.П. Холодова, Т.С.Бормотова, Вл.В.Кузнецов и др. www/neonet.

143. Хомякова, О. В./ Создание исходного материала для селекции тритикале на основе клеточных биотехнологий / О. В. Хомякова // Автореф. канд. биол.наук. Саратов, 2009. 27с.

144. Ху Даофень / Система пыльцегаплоидной селекции озимой пшеницы / Ху ДаофеньМ., 1992.

145. Шаяхметов, И.Ф. / Влияние фитотоксичных метаболитов Bipolaris sorokiniana на рост каллусной ткани и регенерацию растений пшеницы / И.Ф Шаяхметов, P.P. Асфандиярова // Физиология растений, 1991. № 2. -С. 399-405.

146. Шаяхметов, И.Ф. / Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез / И.Ф. Шаяхметов // Автореф. . доктора биол. наук, 2001. 45 с.

147. Шевелуха, B.C. / Сельскохозяйственная биотехнология / В.С Шевелуха, Е.А Калашникова, Е.С. Воронин // Учебник, 2-ое изд., перераб. и доп., М.:Высшая школа, 2003. -469 с.

148. Шевелуха, B.C. / Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха, B.C., Калашникова Е.А., Кочиева Е.З. и др. // М.: Высш.шк., 2008. 710с.

149. Шмыкова, Н.А. / Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур / Шмыкова, Н.А. // Автореф. дис.докт.с.-х.наук. ВНИССС)К-М.:2006.-20с.

150. Эконометрика. Учебник под редакцией И.И. Елесеевой, Москва. И. Проспект, 2009. 287 с.

151. Чистякова, В.Н. / Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидиплоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование / В.Н Чистякова // Москва, 2000. МАКС Пресс. 355 с

152. Amssa, М. / Origin of diploid plants obtained by in vitro culture of anthers of young wheat (Triticum aestivum L.) / J.De Buyser, Y.Henry // Cr Acad Sci DNat290: 1980 -P. 1095-1097.

153. Araujo, L.G. / RAPD analysis of blast resistant somaclones from upland rice cultivar IAC 47 for genetic divergence / L.G. Araujo // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2001, 67: P. 165-172.

154. Araujo, L.G. / Genetics analysis of leaf blast resistance in somaclones of rice cultivar Araguaia / L.G Araujo, A.S.Prabhu, M.C. Fillipi // Fitopatol. Bras., 1999. 24: -P. 182-184.

155. Araujo, L.G. / Variation for riceblast resistance in early somaclonal generations derived from / L.G.Araujo, A.S.Prabhu, A.B.Freire //Fitopatol. Bras., 1998.-P. 76-81.

156. Araujo, L.G. / Variacao somaclonalna cultivar de arroz IAC-47 para resistencia a brusone / A.S.Prabhu, A.B.Freire // Fitopatol. Bras., 1997 22: P. 125-130.

157. Araujo, L.G. / Variacao somaclonal em arroz com relacao a resistencia a brusone. Universidade Federal de Goias, Goiania. / L.G.Araujo // Tesede Mestrado,1994. P. 67-47.

158. Assani, A. Production of haploids from anther culture of banana Musa balbisiana {BB}. / A.Assani, F.Bakry, F.Kerbellec, R.Haicour et al. // Plant Cell Rep., 2003. 21: P. 511-516.

159. Baenziger, P.S. / Quantifung gametoclonal variation in wheat doubled haploids / P.S Baenziger, V.D Keppene // Cerealres. Comm., 1991. 19. N 1-2. -P.33-39.

160. Barinova, J. Regulation of developmental pathways in cultured microspores of tobacco and snap dragon by medium pH / J. Barinova, C. Clement, L. Marting, F. Baillieul et al. // Planta 219: 2004. P 141-146.

161. Barnabas, B. / In vitro androgenesis of wheat: from fundamentals to practical application / B. Barnabas, B. Szakacs,P. Pfahler. et al. // Euphituca, 2001. 119. -P.211-216.

162. Bennett, M.D. / Additional mitosis in wheat pollen induced by ethrel / M.D.Bennett, W.G.Hughes //Nature 240: 1972. -P. 566-568

163. Bird, P.M / The risistance of wheat to Septoria nodorum fungal development in relation to host lignifications / P.M.Bird, J.P. Ride // Physiol Plant Pathol. 1981, V 19. P. 289-299.

164. Blaydes, D.F. / Interaction of kinetin and various inhibitors in the growth of soybean tissues / D.F. // Physiol.Plant,1966. V.19. №3. P.748-753.

165. Blomstedt, C.K. / Generative cells of Lilium longiflorum possess translatable and functional protein synthers machinery / C.K Blomstedt, R.B Knox, M.B.Singh // Plant Mol. Biol, 1996, V31, N 5. P.1083-1086.

166. Bohus, O. / Colhicine induced embryogenesis in maize / O. Bohus, B. Barnabas // Plant Cel, Tissue Organ Cult, 2004. 77. P. 283-285.

167. Bojadjiev, P. / Cytological physiological studies of some varieties and F1 hyibrids of rice, Oruza sativa using the method of anther culture / P. Bojadjiev, Ph.V.Cuong Ph. // Bionatiury, 1988, V.8, №1. P. 89-56.

168. Bousquet, K.S. Isolement et mode d action d une phytotoxine produite en culture par Septoria nodorum Berk / K.S. Bousquet, M.Skajennikoff // Phytopathol. Z. 1974. V.80. №4. P.355-360.

169. Bucbanan, B. / Biochemistry and Molecular Biology of plants / B. Bucbanan, B.Gruissem, P.L.Jones // American Society of Plant Physiologists, 2000. Rockville Maryland.

170. Bueno, A., / Haploid Origin of Cork Oak Anther Embryos Detected by Enzyme and RAPD Gene Markers / A. Bueno, M.D Agundez, A. Gomez, M.J. Carrascosa, J.A.Manzanera // International Journal of Plant Sciences, 2000. V. 161, No. 3. P.363-367.

171. Chawala, H.S. / In vitro selection for fusaric acid resistanc barley plants / H.S.Chawala, G.Wenzel // Plant Breed, 1987. N 2. P. 159-163.

172. Chen, Y. / Inheritance of rust resistance genes and molecular markers in microspore-derived populations of flax /Y.Chen, P. Kenaschuk & Dribnenki // Plant Breeding, 120 (1). 2001. P.82-84.

173. Chen, Y. Dribnenki P. / Effect of genotype and medium composition on flax linum usitatissimum L. anther cultur / Y.Chen, P. Dribnenki // Plant Cell Rep., 2002. 21:-P. 204-207.

174. Cho, M. / Callus formation and plant regenerations in isolated culture of rise / M.Cho, F. Lapata // Plant Sei. 1988. №58. P.239-244.

175. Chowdhury, B. / Microspore embryogenesis and fertile platlet regeneration in a salt susceptible x salt tolerant rice hybrid / B. Chowdhury B, A.Mandal // Plant Cell Tessue Organ Cult, 2001, 65. P. 141-147.

176. Chy, C. / Establishment of efficient medium for anher culture of rice through comparative experiment of nitrogen sourses / C. Chy, C. Weng // Sei Sinica -1985.- №5. -P. 699-698.

177. Cordian, G. / Regeneration of anther — derived plants hyosccyamus niger L. / G. Cordian // Planta, 1975,V. 127, N1. P.27-36.

178. COST action 851 website http:// www.Scri.sari.ac.uk/assoc

179. Data, S., / Embryogenesis and plant regeneration from microspores of both "Indica" and "Japonica" rice ( Orisa s. ) / S. Data, I.Potrykus // Plant Sciense. 1990.67. P.83-88.

180. Devys, M. / Ochracine (melleine), phitotoxine insolee du millieu de culture Septofia nodorum Berk / M. Devys, J.F. Bousquet, M. Skajennikoff ,M. Barbier // Phytopathol.Z. 1974. V. 81. P.92-9.

181. Dictma, G. / Poliacrilamid Gel Electrophoresis: Reaction of acrilamide at alkaline pH with Buffer Components and Proteins / G. Dictma, J. Kruppa //Analitical Biochemistry (1997), 160, P. 184-191.

182. Dong-Woog, C. / Close Barley Cbf3 Gene Identification, Expression Pattern, and Map Location / C. Dong-Woog, M. Edmundo, Rodriguez, J. Timothy // Plant Physiol, 2009, Vol. 129. P.1781-1787.

183. Duncan, E.J. / Effect of temperature shock on nuclear phenomenain microspores of Nicotiana tabacum and consequently on plantlet production E J.Duncan, E. Heberle // Protoplasma, 1976, 90: P. 173-177.

184. Dunwell, J. / Role of sucrose in microspore embryo production in Brassica hapus ss poleifera / J. Dunwell J., N. Thurling // J Exp Bot, 36, 1985, P. 14781491.

185. Evenar, D. / Somaclonal variation in celery and selection by coculturing toward resistance to Septoria apicola / D. Evenar, E. Pressman,Y. Benyephet,

186. L.Rappaport // Plant Cell tissue and organ culture, 1994, №39. P.203-210.

187. Flavell, R. / Annu Structure and function of plant genomes / R. Flavell // Plenum press., 1982. P. 1-14.

188. Frascaroli, E. / Pollen genotype selection for a simply inherited qualitative factor' determining resistance to chlorsulfuron in maize /E. Frascaroli, D Songstad // TAG, 2001, 103. P.342-346.

189. Galili, G. / Genetic control of endosperm proteins in wheat / G. Galili, M. Feldman // Theor.Appl.Genet. 1983. - V.66. - P.77-86.

190. Gemes, J. Production of Doubled Haploid Breeding Lines In Case Of Paprika, Spice Paprika, Eggplant, Cucumber, Zucchini And Onion / J.Gemes, Venczel, G., Sagi et al.//Acta Hort., 2006. 725: - P. 845-854.

191. Gentile, A. / Nucellar callus of «Femminello» lemon, selected for tolerance to Phoma tracheiphila toxin, shows enhanced release of chitinase and glukanase ito the culture medium / A. Gentile // Theor Appl Genet 1993. 86. P.527-532.

192. Germana, M.A. / Improvement in Citrus Clementina ort.Ex Tan. microspore derived embryoids induction and regeneration / M.A. Germana, B. Chiancone //Plant Cell Rep 22: 2003. P. 181-187.

193. Guha, S. / In vitro production of embryos from anther of Datura / S.Guha, S. Maheshwari //Nature, 1964. V. 204. N 4957. 497 p.

194. Hammerschlag, F.A. / Selection of peach cells for insensivity to culture filtrates of Xanhtxomonas campestris pv pruni and regeneration of resistant plants / F.A. Hammerschlag // Theor Appl Genet, 1988. -P 76-81.

195. Hansen, N.J.P. / In vitro chromosome doubling with colchicines during microspore culture in wheat (Triticum aestivum L.) / N.J.P. Flansen, S.B.Andersen //Euphytica, 1998. 102:-P. 101-108

196. Heberle-Bors, E. / Experimental control of pollen development / HeberleBors, E. // Androgenesis and haploid plants (In memory of J.-P. Bourgin) Ed Y.Chupeau, M. Caboche, Y. Henry.-B.; Heidelberg; N.Y.: Springer, 1998. P. 38-53.

197. Heberle-Bors, E. / In vitro haploid formation from pollen: a critical review / E. Heberle-Bors // Theor. and Appl. Genet. 1985. 71. P. 361-374.

198. Heberle-Bors, E. / Enviromental control and evidence predetermination of pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum pollen / E. Heberle-Bors, J. Reinert // Protrplasma. 1981, V. 109. P. 249-255.

199. Hetberington, A.M. / Guard Cell Signaling / A.M. Hetberington / Cell. 2001. V. 107. -P.711-714.

200. Hoekstra, S. / The interaction of 2,4-D application and mannitol pretreatment in anther and microspore culture of Hordeum vulgare / S. Hoekstra S. Bergen, I. R.Brouwershaven, R. A. Schilperoort, F. L. Heidekamp //Plant Physiol., 1996. 148: P. 696-700.

201. Hofer, M. / In vitro androgenesis in apple-improvement of the induction phase / M. Hofer // Plant Cell Rep, 2004. 22. P. 365-370.

202. Huang, B. / Effects of culture dencity, conditional medium and feeder cultures on microspore embryogenesis in Brasica napus / Huang, B. // Topas Hlant Cell Rep, 1990. 8. P. 594-597.

203. Huang, B. / Temperature stress pretreatment in barley anther culture / B. Huang, N. Sunderland // Ann Bot-London, 1982. 49: P. 77-88

204. Huang, X.O. / High-frequency plant regeneration through callus initiation from anther of maize {Zea mays L.) / X.O. Huang, Z.M. Wei // Plant Cell Rep., 2004. V. 22. 11.-P. 793-800.

205. Hu, T.C. / A cytological study of pretreatments used to improve isolated microspore cultures of wheat (Triticum aestivum L.) / T.C. Hu, K.J. Kasha // Chris Genome, 1999, 42. P. 432-441.

206. Hu, H. / In vitro induced haploids in wheat. / H.Hu In: Jain S.M., Sopory S.K., Veilleux R.E. (eds) In vitro haploid production in higher plants // Kluwer, Dordrecht, 1997. P.73-97.

207. Hu, H. / Application of Pollen-derived Plants to Crop Improvement / H.Hu, B. Huang // International Review of cytology, 107, 1987, P.293-313.

208. Hu, H. /Anther pollen Culture in Cereals / H. Hu, C. Liu, X. Tan, Q. Zhou // Proc.of international symposium Wheat breeding prospects and future approaches, Albenia, 1990. P. 129-132.

209. Ikeda-Iwai, M. / Stress-induced somatic embryogenesis in vegetative tissues of Arabidopsis thaliana / M. Ikeda-Iwai, M.Umehara, S. Satoh, H. Kamada // The Plant J., 2003. 34: P. 107-114.

210. Imamura, J. / Effects of abscic acid and water stress on the embryo and plant of formation in anther cultures Nicotiana tabacum / J. Imamura, H.Harada // Z. Pflanzenphysiol, 1980. 100 P. 285-289.

211. Imamura, J. / Stimulatory effect of reduced atmospheric pressure on pollen embryogenesis / Imamura J., Harada H. // Naturwissenschaften, 1980b. 67: 357-358

212. Immonen, S. / Success in rye anther culture / S. Immonen, H. Anttila // Votr. Pflanzenzuchlg, 2006. 35. P. 237-244.

213. In: Grayson B.T. / PestManagement in Rice Elsevier / B.T. Grayson, M.b. Green, L.G Copping // Applied Science, London, 2011. P.514-536.

214. Ingram, H.M. / Microspore-derived embryo induction from cultured anthers of wheat / H.M. Ingram, J.B. Power, K.C.Lowe, M.R Davey // Plant Cell Tissue

215. Organ Cult, 2000. 60: P 235-238.th229. 16 International Symposium on Septoria and Stagonospora Diseases of Cereals. Desember 8-12, Tunis, Tunisia, 2003.

216. Jacobs, A.K. / Induction of different pathogenesis and related cDNAs in grapevine infected with powdery mildew and treated with ethephon /A.K. Jacobs, I.B. Dry, S.P. Robinson // Plant Physiol., 1999. 48. P. 325-336.

217. Jacquard, C. / Sangvan et al. Barley anther culture: effects of annual cucle and spike position on microspore embryogenesis and albinism / C. Jacquard, R. Asakaviciute, A. Hamalian, R. Sangvan // Plant Cell Rep, 2006. 26. P. 375381.

218. Jahne, A. / Cereal microcpore culture / A. Jahne, H. Lorz // Plant Sci, 109, 1995.-P.1-12.

219. Jain, M. / In vitro Haploid production in higher plants / M.Jain, S.K.Sopory, R.E.Veilleux // Kluwer Acad Press, 1996. V.2. P. 1-4.

220. Kasha K.J. / Chromosome doubling and recovery of doubled haploid plants / In: Palmer C.E., Keller W.A., Kasha K.J. // Biotechnology in Agriculture and Forestry, V. 56. Springer-Verlag, Berlin, 2005. -P. 123-152.

221. Keller, B. / Differential sensitivity of wheat embryos against extracts containing toxins of Septoria nodorum / B. Keller, H. Winzeler, M. Wunzeler, P. Fried // Phytopathology, 1994. V. 141. N 3. P. 233-240.

222. Kiviharju, E. / The effect of cold and heat pretreatments on anther culture of Avena sativa and A. Sterilis / E. Kiviharju E., E.Pehu // Plant Cell Tiss Org Cult 1998. 54:-P. 97-104.

223. Kiyosue, T. / Induction of somatic embryogenesis in carrot by heavy metal ions / T. Kiyosue, K.Takano, H. Kamada, H. Harada // Can J. Bot, 1990.68: P. 2301-2303.

224. Konieczny, R. / Two pathways of plant regeneration in wheat anther culture / R. Konieczny, A.Z. Czaplicki, H. Golczyk, L. Przywara // Plant Cell Tissue Organ Cult, 2003, 73:- P. 177-187.

225. Konzak, C.F. / Anther culture methods for double haploid production in wheat / C.F. Konzak, Zhou H. // Cereal Res. Comm. 1991. 19: P. 147-164.

226. Konzak, C. Methods for generating doubled haploid plants / C. Konzak, E.A. Polle // Int. patent Apllic PCT /US9919498/. 1999.

227. Kunz, C. / Assessment and improvement of wheat microspore derived embryo induction and regeneration / C. Kunz, S.M.S. Islam, J. Berberat, S.O. Peter, B. Buter, J.E. Stamp Schmid// Plant Physiol, 2000. 156: P. 190-196.

228. Kyo, M. / Control of the developmental pathway of tobacco pollen in vitro / M. Kyo, H. Harada // Planta, 1986. 168. P. 427-432.

229. Labbani, Z. / Chlorophyllian durum wheat plants obtained by isolated microspores culture: importance of the pretreatment / Z. Labbani, N. Richard, J. De Buyser, E. Picard // CR Biol. 2005. 328: P. 713-723.

230. Laemmli, U.K. / Clevage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage / U.K. Laemmli // Nature, 1970. T. 4. V. 277, N4. P. 178189.

231. Lawrence, G.J. / Dough quality of biotipes of eleven-Australian Wheat cultivars that oliffer in high molecular weight glutanin subunit composition / G.J. Lawrence, H.J. Moss, K.W. Shepherd, C.W. Wrigley // J.Cereal sci. 1987. 6,1.-P 99-101.

232. Layasankar, S. / In vitro selection of Vitis vinifera 'Chardonnay'with Elsinoe ampelina culture filtrate is accompanied by fungal resistance and enhanced secretion of chitinase / S. Layasankar // Planta, 2000. 211. — PL 2002008.

233. Legrand, M. / Biological function of pathogenesis- related proteins four pathogenesis-related are chitinases / M. Legrand, S. Kauffman, P. Geoffroy, B. Fritig // Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84. P. 6750-67-54.

234. Levites, E.V. / Variation at isozyme loci in cultured in vitro sugar beet regenerants of gynogenetic origin / E.V. Levites, A.M. Svirshchevskaya, S. Kirikovich // Sugar Tech. 2005. V. 7, N 1. P.71-75.

235. Leyser, O. / Molecular Genetic of Auxin Signaling / O. Leyser // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 377-398.

236. Liu, W. / Improving green plant production via isolated microspore culture in bread wheat (Triticum aestivum L.) / W. Liu, M.Y. Zheng, C.F. Konzak // Plant Cell Rep 2001. 20: P. 821-824.

237. Liu, W. / Improving green plant production via isolated microspore culture in bread wheat (Triticum aestivum L.) / W. Liu, M.Y. Zheng, C.F. Konzak // Plant Cell Rep, 2002. 20: P. 821-824.

238. Lowry, O.H. / O.H. Lowry // Journal Biol.Chem., 1951. 193. P.265-270.

239. Lu, D.B. / Increasing stress resistance by in vitro selection for abscisic insensitivity in wheat / D.B. Lu, R.G. Sears, G.M. Palsen // Crop Sci. 1989. 29, N4.-P. 939-943.

240. Maheshwari, S.C. / Haploids from pollen grains-retrospect / S.C. Maheshwari, A. Rashid, A.K. Tyagi // Amer.J.Bot. 1982. V. 69, N 5. P.865-879.

241. Maluszyncki, / Published protocols for e other crop plant species / Maluszyncki // In Doubled Haploid Production in Crop Plants, 2003. P. 309336.

242. Marciniak, K. / Surma MThe anther-culture response of triticale line ■ tester progenies / K. Marciniak, Z. Kaczmarek, T. Adamski, // Cell Mol Biol Lett 8: 2003. P. 343-351.

243. Mascarenhas, J. / Gene activity during pollen development / J. Mascarenhas // Annu. Rev.Plant.Physiol. Plant Mol. Biol., 1990. 41. P. 371-378.

244. Michal E. / Screening hibrid poplars in vitro for resistanse to leaf spot caused by Septoria masiva / E. Michal, E. Ronald, T. Kathleen, R. Robert // Plant disease, 1988. v. 72. N 6. P. 491-499.

245. Michalczuk, L. / Auxin levels at different stages of carrot somatic embryogenesis / L. Michalczuk, T.J. Cooke, J.D. Cohen // Phytochemistry 31: 1992a. P. 1097-1103.

246. Michalczuk, L. / Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures / L. Michalczuk, D.M. Ribnieky, T.J. Cooke, J.D. Cohen // Plant Physiology, 100: 1992b.-P. 1346-1353.

247. Miklas, P.N. / Use of patho gen filtrate to differentiale physiological resistance of dry bean to white molddisease / P.N. Miklas, K.F. Grafton, G.A. Secor// Crop. Sc., 1992. V. 32, № 2. P.310-312.

248. Moieni, A. / The effects of gibberllic acid phenyletthula mine, 2,4-D and genotypes with on androgenesis in hexaploid wheat (Trticum aestivum) / A. Moieni, A. Sarrafi // Cereal res. Common., 1996, V. 24, №2. P.139-145.

249. Mulcahy, D.L. / The rise of the Angiospermous: a genealogical factor / D.L. Mulcahy // Sci, 1979, 206. P. 20-23.

250. Mulcahy, D.L. / Further evidence that gametophytic selection modifies the genetic quality of the sporophyt / D.L. Mulcahy, G.B. Mulcahy, E. Ottaviano // Anny Bot, 1978. 125. P. 57-60.

251. Mulcahy, D. / The effects of pollen competition / D. Mulcahy, G. Mulcahy // Am. Sci, 1987. 75. P.44-50.

252. Mulcahy, D. / Biol, and implications for plant breeding / D. Mulcahy, E. Ottaviano // New York, 1983. P. 85-87.

253. Murashige, T. / A revised medium for rapid growth and bioassaya with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiologia Plantarum, 1962, V. 15, N3.-P. 473-497.

254. Nascaril, J. / Studies on Alternaría solani tuberosum in vitro interactions / J. Nascaril, M. Broggio // Riv. Agr. Subtrom. Trop., 1990. 84. N 3. - P. 445-499.

255. Nitsch, J.P. Haploid plants from pollen grains / J.P. Nitsch, C. Nitsch // Science. 1969. Vol. 163. P. 85-87.

256. Nitzche W. / Herstellung haploids Pflanzen aus festuca-Lolium Bastard // Naturewissenschaft., 1970, 57. P. 199-200.

257. Obert, B. / Colchicine induced embryogenesis in maize / B. Obert, B. Barnabas // Plant Cell Tiss Org Cult, 2004. 77. P. 283-285.

258. Ogawa, T. Induction of cell division of isolated pollen grains by sugar starvation in rice / T. Ogawa, H. Fukuoka, Y. Ohkawa // Breed Sci. 1994. 44: -P. 75-77.

259. Ouang, J.W. / Induction of pollen plants in Triticum aestivum / J.W. Ouang // Haploids in higher plants in vitro. — Hidelberg: Berlin, 1986. P. 26-41.

260. Palmer, C.L. / Mycosphaerella graminicola latents infection, crop devastation and genomics / C.L. Palmer, W. Skinner // Mol. Plant Pathol. -2002. V.3. -P.63-70.

261. Payne, P.I. / Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on Bread-marking quality / P.I. Payne // Ann. Rev. Plant physiol., 1987.-38: -P. 141-153.

262. Payne, P.I. / Wheat storage proteins: their genetics and their potential for manipulation by plant breeding / P.I. Payne, L.M. Holt, E.A. Jackson, C.N. Law // Phil.Trans.R.Soc.Lond B. 1984. 304. P. 359-371.

263. Peixe, A. / Induction morphogenic calluses from in vitro cultured anthers of Prunus Armeniaca cv. Harcot / A. Peixe, A. Barroso // Plant Cell Tissue Organ Cult, 2004. 77.-P. 35-41.

264. Peter, I.P. / The Relationship between HMW Glutenin Subunit composition and the Breat-marking Quality of british-grown Wheat Varieties / LP. Peter, A. Maple, F.K. Anatole, M. H. Linda // J. Sci. Food Agric. 1987. 40. P. 51-65.

265. Picard, E. Obtention de plantules haploids de Triticum aestivum L. a partir de cultures d'anthers in vitro / E. Picard, J. De Buyser // CR Acad Sci Paris 1973.277: -P. 1463-1466.

266. Picard, E. / The male gamete as a tool in the genetic improvement of cereals / E. Picard // Genome, 1989. 31. P. 1005-1013.

267. Pooler, M.R. / Aberrant transmission of RAPD markers in haploids, doubled haploids, and Fj hybrids of peach: observations and speculation on causes / M.R. Pooler, R. Scorza // Scientia Horticulturae, 1995. V. 64. P. 233-241.

268. Raghavan, V. / Role of the generative cell in androgenesis in Henbane. / V. Raghavan // Science, 1976.V.191. № 4225. P. 119.

269. Rasmusson, D.C. / Increasing Yield Potential in Wheat Breaking the barriers / D.C. Rasmusson // Gepmplasm is paramount In: M.P.Reynolds, S.Ragaram and A.McNab (eds.) Mexico D.F., CIMMYT, 1996. P. 28-35.

270. Redha, A. / Improvement of green plant regeneration by manipulation of anther culture induction medium of hexaploid wheat / A. Redha, T. Attia // Plant Cell Tiss O.C., 92. 2008. P. 141-146.

271. Ribarits, A. / Combination of reversible male sterility and doubled haploid production by targeted inactivation of cytoplasmic glutamine synthetase in developing anthers and pollen / A. Ribarits // Plant Biotechnol. J.5, 2007. P. 483-494.

272. Robinson, S.P. / A class IV chitinase is highly expressed in grape berries during ripening / S.P. Robinson, A.K. Jakobs, I.B. Dry // Plant Physiol, 1997. 114.-P.771-778.

273. Rose, J.B. / Anther culture of Sorghum bicolor (L) Maench. I. Effect of panicle pretreatment, anther incubation temperature and 2,4-D concentration / J.B. Rose, J.M. Dunwell // Plant Cell Tissue Organ culture, 1986.V. 6. №1. P. 15-22.

274. Sabehat, A. / Expression of small heat-shock proteins at low temperatures: a possible role in protecting against chilling injuries / A. Sabehat, S. Lurie, D. Weiss // Plant Physiology. 1998.117. - P. 651-658.

275. Sagi, R.A. / Evidence for cytoplasmic control of in vitro microspore embryo-genesis in the anther cultcure of wheat (Triticum aestivum L.) / R.A. Sagi // Theor. and Appl. Genet. 1989. 78. №6. - P .867-872.

276. Sunderland, N. / Cold-pretreatment of excised flower buds in float culture of tobacco anthers / N. Sunderland, M. Roberts // Ann Bot. 1979. 43. P. 405414.

277. Sunderland, N. / Shed pollen culture in Hordeum vulgare / N. Sunderland, Z.H. Xu // J Exp Bot. 1982.136. P. 1086-1095.

278. Sangvan, R.S. / Biochemical cytology of pollen embiyogenesis / R.S. Sangvan, B.S. Sangvan-Norrel // Intern.rev.Cytol.Orlando. 1987, V.107. -P.221-272.

279. Semagn, K. / Distribution of DArT, AFLP, and SSR markers in a genetic linkage map of a doubled-haploid hexaploid wheat population / K. Semagn, A. Bjornstad, H. Skinnes, A.G. Maroy, Y. Tarkegne, M. William // Genome, 2006. V. 49. P.545-555.

280. Shtereva, L.A. / Induced androgenesis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill). II. Factors affecting induction of androgenesis / L.A. Shtereva, N.A. Zagorska, B.D. Dimitrov, M.M. Kruleva, H.K. Oanh // Plant Cell Rep 1998. -18.-P. 312-317.

281. Shimada, T. /Anther culture of Japanese spring wheat Haruhikari and chapacterization of doubled haploid plants / T. Shimada, M. Otani, T. Koba // Bull. Res.Inst.Agr. Resour. 1995. N4. - P. 17-22.

282. Shinozaki, K. / Gene expression and signal transduction in water-stress response / K. Shinozaki, K. Yamaguchi-Shinozaki // Plant Physiol, 1997. 115:-P. 327-334.

283. Shoyama, Y. / Micropropagation of Panax notoginseng by somatic embryogenesis and RAPD analysis of regenerated plantlets / Y. Shoyama, X.X. Zhu //Plant Cell Reports, 1997. 16. P.450-453.

284. Sicbel, J. / A comparison of anther and microspore culture as a breeding tool in Brassica napus / J. Siebel, K.P. Pauls // Theor Appl Genet, 1989.V.78. -P.473-479.

285. Sneath, P.H.A. / Numerical Taxonomy — the Principles and Practice of Numerical Classification / P.H.A. Sneath, R.R. Sokal // San Francisco: Freeman, 1973.

286. Solid Future Annual report, CIMMYT Drought: Grim Reaper of Harvests and Lives, 2004-2005.

287. Sopory, S. / Anther culture in vitro: haploid Production in Higher Plants / S. Sopory, M. Munshi // Sci. Lett. v. 1, 1996. P. 145-176.

288. Stolarz, A. / Somatic embryogenesis, in vitro multiplication and plant regeneration from immature explants of hexaploid Triticale / A. Stolarz, H. Lorz // Ztshr.Pflanzenzucht.1996, 96. P. 353-362.

289. Sunderland, N. / Embryoid formation in pollen grains of Nicotiana tabacum / N. Sunderland, F.M. Wicks // J. Exp.Bot., 1971, V. 22, N 70. P.213-226.

290. Szarejko, I. / Anther culture for doubled haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). / I. Szarejko, M. Maluszynski, K. Kasha, B.P. Forster // A manual. Kluwer Academic, Dordrecht., 2003. P. 35-42.

291. Szarejko, I. / Doubled haploidy and indused mutation Euphytica DOI / I. Szarejko, B. Forster//200610 1007/s 10681-006-9241-1.

292. Takemori, N. / RAPD markers for confirmation of somatic hybrids in the dihaploid breeding of potato (Solarium tuberosum L.) / N. Takemori, K. Shinoda, N. Kadotani // Plant Cell Reports, 1994. V. 13. P. 367-371.

293. Tenhola-Roininen, T. / Rye doubled haploids as a research and breeding tool a practical point of view / T. Tenhola-Roininen, S. Immonen, P. Tanhuanpa // Plant Breeding, 2006. 125:6. - P. 584-590.

294. Toenniessen, G.H. / Rice biotechnology: progress and prospects / G.H. Toenniessen // Proc Natl Acad Sci. 1990. - P. 209-215.

295. Touraev, A. / Stress induced microspore embryogenesis from tobacco microspores: an optimized system for molecular studies / A. Touraev, A. Ilham, O. Vicente, E. Heberle-Bors // Plant Cell Rep. 1996 a 15. P. 561-565.

296. Touraev, A. / Pollen selection a transgenic reconstruction approach / A. Touraev, C.S. Fine, E. Stoger, E. Heberle-Bors // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. -P.12165-12169.

297. Touraev, A. / Efficient microcpore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperatures / A. Touraev // Sex. Plant reprod., 1996 b. 9. P. 209-215.

298. Tsunewaki, K. / Genetic diversity of the cytoplasm in Triticum and Aegilops. XX. The hexaploid triticale as an effective tester for plasma type distinction / K. Tsunewaki, M. Maekawa, H. Tsujimoto // Jpn. J. Genet. 1984. - Vol. 59 -P. 215-224.

299. Vagera, J. / Induced androgenesis in vitro in mutated populations of barley, Hordeum vulgare / J. Vagera, J. Novothy, L. Ohnoutkova // Plant Cell Tissand organ culture, 2004. 77. P. 55-61.

300. Van de Peer, Y. / TREECON for Windows: A Software Package for the Construction and Drawing of Evolutionary Trees for the Microsoft Windows Environment / Y. Van de Peer, R. De Wächter // Comput. Appl. Biosci., 1994, V. 10. P. 569-570.

301. Vijayan, K. / In vitro screening of mullberry (Morus spp) for salinity tolerance / K. Vijayan, S. Chakraborti // Plant Cell Rep., 2003. 22. P.350-357.

302. Wang, J.J. / Studies on increasing the induction frequency of pollen callus in wheat / J.J. Wang, D.F. Hu, H.M. Wang, Y.L. Tang // Hereditas (Beiging) 1981. 13. P. 28-29.

303. Wedzony, M. / Progress in doubled haploid technology in higher plants / M. Wedzony // Euphytica, 2008. P. 2517-2526.

304. Wedzony, M. / Protocol for doubled haploid Titicale by crosses with maize / M. Wedzony // In Doubled Haploid production in Crop Plants, 2003. P. 135140.

305. Weijers, D. / Auxin triggers transient local signaling for cell specification in Arabidopsis embryogenesis / D. Weijers, A. Schiereth, J.S. Ehrismann, G. Schwank, M. Kientz, G. Jürgens // Developmental Cell, 2006.10. P. 265-270.

306. Xie, J.H. / The effect of cool-pretreatment on the isolated microspore culture and the free aminoacid change of anthers in japonica rice (Oryza sativa L.) / J.H. Xie // J Plant Physiol, 1997. 151. P. 79-82.

307. Xu, Z.H. / Culture of barley anthers in conditioning media / Z.H. Xu, B. Huang, N. Sunderland // J Exp Bot. 1981. 32. P.767-778.

308. Xu, L. / Haploid and Doubled Haploid Technology / L. Xu, U. Najeeb // Advances in Botanical Research, 2007. V. 45. - P. 181-216.

309. Zadokc, J.C. / Two wheat septorias; two emerging diseases from the past / J.C. Zadokc //16 th International Symposium on Septoria and Stagonospora Diseases of Cereals. Desember 8-12, 2003. Tunis. - P. 1-9108.

310. Zamir, D. / Temperature effects on haploid selection of tomato microspores and pollen grains. Pollen: Biology and application for plant breeding / D. Zamir, E. Valligos //N.Y., 1982. P. 335-342.

311. Zhang, L.J. / An efficient method for the regeneration of wheat (Triticum aestivum) from anther cultures / L.J. Zhang, C. Anceau, P. Lepoivre, P. Seilleur, J. Semal // Bull Rech Agron Gembloux, 1987. 22. P. 301-314.

312. Zhao, J.P. / Induction of embryogenesis with colchicines instead of heat in microspores of Brassica napus L. cv. / J.P. Zhao, D.H. Simmonds, W. Newcomb // Topas Planta, 1996. 198. P. 433^139.

313. Zheng, M.Y. / Culture of freshly isolated wheat (Triticum aestivum L.) microspores treated with inducer chemicals / M.Y. Zheng, W. Liu, Y. Weng, E. Polle, C.F. Konzak // Plant Cell Rep 20: 2001. P. 685-690.

314. Zheng, M.Y. / Effect of 2-4-Dichlorphenoxyasetic acid on callus induction and plant regeneration in another culture of wheat {Triticum aestivum L.) / M.Y. Zheng, C.F. Konzak // Plant Cell Rep, 1999. P. 185-190.

315. Zheng, M.Y. / Microspore culture in wheat {Triticum aestivum) doubled haploid production via induced embryogenesis / M.Y. Zheng // Plant Cell Tissue Organ Cult, 2003. 73 - P. 213-230.

316. Zhou, H. / In fluence of genetic and enviromental factor anther culcure responsofiimat/ H. Zhou, C. Konzak // Appl. Genet. 38 (4). 1997. P. 393-406.

317. Zhou, W.J. / Incr easing embryogenesis and doubling efficiency by immediate colchicines treatment of isolated microspores in spring Brassica napus / W.J. Zhou, P. Hagbery, G.X. Tang // Euphytica, 2002. 128 P.27-34.

318. Zhou, H. / Osmotic potential of media affecting green plant percentage in wheat anther culture / H. Zhou, Y. Zheng, C.F. Konzak // Plant Cell Rep, 1991, 10. P. 63-66.

319. Ziauddin, A. / Improved plant pegeneraition from wheat anther and barley microspore culture using phenylacetic acid (PAA) / A. Ziauddin, A. Marsolais // Plant Cell Rep, 1992, 11.- P.489-498.

320. Zonia, L.E. / Lithium treatment of Nicotiana tabacum microspores blocks polar nuclear migration, disrupts the partitioning of membrane-associated Ca+2, and induces symmetrical mitosis / L.E. Zonia, , J. Tupy // Sex Plant Reprod, 1999.58: P. 152-160.