Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов

Патрушев, Максим Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов"

На правах рукописи

Патрушев Максим Владимирович

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2006

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Ушакова Т.Е.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Матвиенко Н.И.

доктор химических наук, профессор Брусков В.И.

Ведущая организация:

Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РЛН

Защита состоится в на заседании диссертационного совета

Д.002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Н1ДБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

Автореферат разослан 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук

Смолихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

За последние 20-30 лет сложились основные представления о структуре мтДНК, процессах ее репликации и транскрипции (Fernandez-Silva et al., 2003). В настоящее время установлено, что подавляющее большинство митохондриальных белков кодируется в ядре, синтезируется в цитоплазме в виде предшественников и импортируется в митохондрии (Ibona et al., 2004). Собственно митохондриальный геном кодирует лишь небольшое число пептидов-компонентов системы окислительного фосфорилирования, в процессе которого синтезируется АТФ (Attardi and Shatz, 1988). Митохондриальный геном заметно отличается от ядерного: мтДНК имеет кольцевую форму, несколько отличный генетический код, наследуемость по материнской линии, полиплоидность, и транскрибируется единым полицистронным блоком.

Несмотря на относительную автономность и изолированность этой макромолекулы, ядерный геном многих видов растений и животных содержит участки с полной гомологией к фрагментам мтДНК. Например, у человека найдено несколько тысяч митохондриальных псевдогенов, равномерно распределенных по всем хромосомам (Woischnik et al., 2002). Считается, что это следствие эволюционного процесса, в ходе которого шел перенос мтДНК в ядро. Более того, в настоящее время появились свидетельства того, что спонтанные вставки фрагментов мтДНК в ядерный геном могут привести к дисфункции генов (Turner et al., 2003).

К началу настоящего исследования в литературе практически не обсуждался факт выхода фрагментов мтДНК из митохондрий. Существовало лишь единственное предположение о возможности такого процесса, выдвинутое Д.Б. Зоровым [Zorov et al., 1997]. Тем не менее, было известно, что мтДНК, находясь в непосредственной близости от электрон-траспортной цепи, постоянно подвергается атакам сводных радикалов, приводящих к различного рода повреждениям митохондриалыгого генома. Такие повреждения выражаются, как правило, модификациями оснований, одно- или двунитевыми разрывами. Неэффективность систем репарации, постоянные атаки свободных радикалов приводят к тому, что в митохондриях возникают разные по размерам молекулы мтДНК, способные замыкаться в кольцо - явление гетероплазмии. Если такое кольцо содержит область регуляции транскрипции/репликации, то данная молекула, хотя и потеряла часть генома, способна к репликации и транскрипции. Образование делеций мтДНК показано огромным количеством авторов, однако до настоящего времени не изучен механизм их образования и, главное, не ясно, что происходит с фрагментами мтДНК, неспособными к функционированию.

Процессы репликации, транскрипции, степень фрагментации мтДНК в условиях окислительного стресса также все еще остаются недостаточно изученными, несмотря на то, что роль митохоидрий широко обсуждается в процессах программируемой клеточной гибели, клеточных патологий, в канцерогенезе. В связи с этим исследование функционирования мтДНК при действии генотоксических агентов - индукторов окислительного стресса (рентгеновское, у-облучение) является не только оправданным, но и чрезвычайно актуальным.

Цель исследования.

Целью настоящей работы является исследование функционирования митохондриальной ДНК клеток головного мозга и селезенки при действии генотоксических агентов.

Основные задачи исследования.

1. Исследование процессов репликации и транскрипции мтДНК клеток головного мозга и селезенки мышей в условиях окислительного стресса, вызванного рентгеновским и гамма - облучением, а также действием цитостатического антибиотика блеомицина.

2. Исследование процессов фрагментации мтДНК в клетках головного мозга при облучении мышей.

3. Выявление роли эндонуклеазы в при фрагментации мтДНК в условиях окислительного стресса.

4. Тестирование цитозольной фракции клеток головного мозга мышей и среды инкубации митохондрий в модельных системах на наличие фрагментов мтДНК.

5. Исследование процессов выхода фрагментов мтДНК из органеллы, сохраняющей свои нативныс физиологические характеристики.

Научная новизна работы.

Настоящее исследование существенно расширяет современные представления о процессах репликации, транскрипции и повреждении мтДНК в условиях окислительного стресса. В данной работе приведены количественные оценки изменений указанных процессов в разных по радиочувствительности тканях (головной мозг и селезенка) мышей при рентгеновском и гамма-облучении, а также при действии цитостатического антибиотика блеомицина. Обнаружено, что вне зависимости от радиочувствительности ткани, изменения транскрипции мтДНК в условиях окислительного стресса носят универсальный характер. На фоне активации процессов репликации и транскрипции мтДНК в данных тканях происходит резкое снижение «дозы гена», в частности гена п<14, в результате процессов фрагментации мтДНК и появления крупных делеций. Исследована

роль митохондриальной неспецифической эндонуклеазы G в процессах фрагментации мтДНК.

Впервые зарегистрирован факт выхода фрагментов мтДНК из митохондрий, сохраняющих все функциональные характеристики, при участии РТР, что само по себе играет исключительно важную роль, поскольку расширяет современные представления о процессах, происходящих в митохондриях.

Научно-практическая ценность.

Фрагментация мтДНК, снижение «дозы определенного гена», появление фрагментов мтДНК в цитозоле клеток может быть в перспективе использовано при оценке генотоксическго груза при радиационных авариях, проведении курса радио- химиотерапии онкологических больных, изучении нейродегенеративных болезней человека.

Способ количественной оценки экспрессии митохондриальных генов, с применением 2-х факторов нормализации: мРНК ядерных генов и собственно митохондриальных генов может использоваться при исследовании самых разнообразных научных проблем.

Апробация диссеутаиии.

Материалы диссертации были представлены на 8-ой и 10-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004, 2006 гг.); на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006 г.); на 35-ой конференции Европейского общества радиационных исследований (ERRS) (Киев, 2006 г.).

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 4 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссеутаиии.

Диссертационная работа изложена на страницах с использованием 31

рисунок и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 270 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все экспериментальные данные, описанные в работе, получены на мышах линий BALB/c и С57Ы, содержащихся в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН.

Облучение в дозах 3, 5, 8, 10 Гр проводили на установке ГУБЕ (Со), мощность облучения - 1.8 Гр/мин, и на установке РУТ 250-15-1, мощность облучения 2 Гр/мин. Через определенные сроки после облучения (10 минут, 1час, 5часов, 24 часа, 48 часов, 72

часа, 1 неделя, 3 недели) мышей декапитировали, извлеченные ткани (печень, мозг, селезенка) промывали холодным физ. раствором и использовали в экспериментах.

Митохондрии выделяли из головного мозга и селезенки мышей, согласно описанному методу [Brustovetsky and Dubinsky 1999], в среде выделения [СВ], содержащей: машгат- 225 мМ, сахароза- 75 мМ, ЭГТА-1 мМ, бычий сывороточный альбумин (БСА)-0.1 %, HEPES- 10 мМ, рН-7.4.

Измерения ДхР-т проводили с использованием флуоресцентного зонда Rhodamine 123 [Emaus et al 1986]. Длина волны возбуждения флуоресценции зонда составляет 488 нм, длина волны регистрации флуоресценции составляет 525 нм. Концентрация зонда - 1мкМ. При соотношении концентрации зонда 1 мкМ/1мг митохондриального белка/1мл наблюдается линейная зависимость изменений интенсивности флуоресценции зонда от изменений ДТ-гп на участке от 200 до 50 мВ и в таких концентрациях Rhodamine 123 абсолютно не влияет па параметры ОФ.

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение ДНК производили фенол-хлороформной экстракцией с последующим спиртовым осаждением. Выделение РНК осуществляли по методу, описанному Хомчинским и Сачи (Chomczynski and Sacchi, 1987).

Для точной количественной оценки содержания фрагментов нуклеиновых кислот использовали ПЦР-РВ (для оценки количества ДНК) и ОТПЦР-РВ (для оценки количества мРНК). ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ проводили с использованием систем для детекции ПЦР - продуктов в реальном времени- IQ5 (Bio-Rad). Система ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ включала технологию TaqMan, основанную на 5'-экзонуклеазной активности Та^-полимеразы. Зонды были помечены флуорофором на 5' конце и тушителем на 3' конце. Все реакции ПЦР-РВ проводились в буфере, содержащем ЮмМ Tris-HCl pH 8.3, 50 мМ KCl, 0,25 мМ dNTPs, 2,5 мМ Mg2\ 300 нМ каждого праймера (Таблица 1) и 150 нМ каждого зонда, 1,5 ед. Taq-полимеразы.

Таблица 1.. Праймеры и зонды для ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ

Назнание Последовательность б'-З'

ND4 FOR 10558 ATT ATT ATTA CCCGATGAGGGAACC

ND4 REV 10667 ATTAAGATGAGGGCAATTAGCAGT •

ND4 PROBE 10590 ROX-ACGCCTAAACGCAGGGATTTATTTCCTA-QUENCHER

СОХ2 FOR 7309 CATAGGGCACCAATGATACTGAA

COX2 REV 7408 TTCACCAGGTTTTAGGTCGTTT

COX2 PROBE 7342 Cy5-TACTGACTATGAAGACCTATGCTTTGAT-QUENCHER

ND6 FOR CCCAGCTACTACCATCATTCAAGT

ND6 REV GATGGTTTGGGAGATTGGTTGATGT

ND6 PROBF, R6G-GITGCCGCTACCCCAATCCCTCCTTCCAACA- QUENCHER

GAPDH For GTGAGGGAGATGCTCAGTGT

GAPDH Rev CTGGCATTGCTCTCAATGAC

GAPDH Probe FAM-TAAGAAACCCTGGACCACCCACCCC- QUENCHER

BETA-ACTIN FOR AGCCATGTACGTAGCCATCCA

BETA-ACTIN REV TCTCCGGAGTCCATCACAATG

BETA-ACTIN PROBE TexasRed-TGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCAC- QUENCIIER

Endo 1 - Rev AATGTGAGTCAGCCCATCTC

Endo 1 - For ATCAGTAGCGTCCTTGTCCT

Endo 1 Probe ROX-CAACCAGAATGCCTGGAACAACCTT-BHQ2

Для относительной количественной оценки мРНК использовался метод, предложенный M.W.Pfaffl. (M.W. Pfaffl, 2001): R — Е Лйс' где R - относительная экспрессия гена, AACt = ACtonbrr - ACtKOHTpOJIbj ACt = CtMliT кДНК - ACts кднк.

Определение нуклеазной активности митохондриального матрикса клеток головного мозга и селезенки мышей. Митохондрии, выделенные из контрольных и облученных животных, лизировали в буфере (10 мМ Tris НС1, рН 7.4). После осаждения нерастворившихся частиц при 10000 g в течение 10 мин, 10 мкл лизата инкубировали с 5 мкг высокомолекулярной ДНК тимуса теленка в течение 12 час при 37°С в буфере, содержащем ЮмМ Tris-HCl рН 7.4, 50 мМ КС1, 2мМ MgCl2, 2мМ СаСЪ. В присутствии 3 мМ ЭДТА нуклеазная активность митохондриального матрикса не проявлялась. Визуализация проводилась при помощи электрофоретического разделения в агарознем геле.

Активность цитратсинтазы определяли методом Срере [Srere, 1969].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Количество копий мтДПК в клетках головного мозга и селезенки контрольных

мышей.

На рис.1 приведены результаты исследования количества копий мтДНК в тканях контрольных мышей. Видно, что в клетках селезенки показатели разницы критических циклов ACt лежат в пределах 8,5 - 10,15, что составляет превышение мтДНК над яДНК в 103'2 - 103,4 копий, т.е., на 1 копию гена яДНК приходится, в среднем Ю33 , что соответствует 1995 копиям мтДНК. В клетках головного мозга, как можно видеть на этом же рисунке, количество мтДНК заметно ниже. Значения ACt, лежащие в диапазоне 2,5 - 4,5, соответствуют превышению генов мтДНК над генами яДНК на 101,35 - 102,2 молекул, соответственно, в среднем 101'77, иными словами, на 1 одноколейный ген яДНК приходится приблизительно 60 копий мтДНК. Учитывая тот факт, что все структурные гены мтДНК являются однокопийными, можно заключить следующее: в одной клетке селезенки содержится, в среднем, 2000 копий мтДНК, в одной клетке головного мозга -60 копий. Однако, учитывая гетерогенную популяцию клеток головного мозга, данное усреднение носит приближенный характер.

d «

s¿ X Ct

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2

селезенка

♦

головной мозг

Рис.1 Уровень мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей.

Амплификация фрагмента гена пс!6, нормализация по ёарМ.

Репликация мтДНК в клетках головного мозга и селезенки при гамма — облучении

мышей.

Известна чрезвычайно высокая степень повреждения мтДНК при действии ионизирующих излучений. В данной работе исследовались процессы репликации мтДНК в клетках головного мозга и селезенки мышей в условиях повреждения матрицы. На рис.2 приведены результаты исследования процессов репликации мтДНК клеток головного мозга и селезенки при гамма- облучении мышей в дозе 5 Гр.

Головной мозг

20 40 60 80 100120140160180 Время после облучения, ч

1.2-

1.0-

ч:

0) 0.8-

t- о 0.6-

ОС 0.4-

0.2-

0.0-

Селезенка

0 20 40 60 80 100120140160180 Время после облучения, ч

Рис. 2 Уровень репликации мтДНК в клетках головного мозга и селезенки мышей при облучении in vivo в дозе 5 Гр. R=1 - уровень репликации контрольных мышей.

Количество копий мтДНК в клетках головного мозга мышей после действия ИР в дозе 5 Гр резко возрастает: через 5 часов после облучения мы регистрируем уровень мтДНК в 500 раз, через 24 часа - более чем в 700 раз превышающий контрольный, к 72 часам уровень мтДНК снижается, но все еще в 200 раз выше контрольного, а через 168 часов приближается к норме (Рис.2).

После облучения большое количество копий мтДНК переходит в состояние так называемых миницирклей, т.е. после делеции фрагментов оставшаяся часть молекулы замыкается в кольцо. Можно предположить, что увеличение репликации мтДНК после облучения представляет собой компенсаторную реакцию на повреждение части копий митохондриального генома. Процесс репликации происходит эффективно еще и потому, что минициркли реплицируются намного быстрее, чем крупные молекулы мтДНК [Diaz et al. 2002]. Наблюдаемый нами эффект увеличения репликации мтДНК клеток головного мозга после воздействия генотоксических агентов коррелирует с представлениями о том, что в условиях повышенного содержания АФК индуцируется биогенез митохондрий [Gutsaeva et al. 2006].

В клетках селезенки наблюдается обратный процесс: через 5 часов после облучения уровень мтДНК снижен в 5 раз по сравнению с контролем, к 24 часам снижение количества копий мтДНК достигает порядковой величины, к 72 часам наблюдается небольшое восстановление числа копий, которое продолжается до 168 часов и к этому времени составляет 50% от контрольного уровня. В данном случае необходимо отметить, что при облучении млекопитающих в летальных дозах спленоциты очень быстро вступают в апоптоз: значительная часть клеток погибает уже через 3 часа, а максимальная гибель (80%) наблюдается через сутки после облучения. Таким образом, падение числа копий мтДНК в спленоцитах в течение первых суток после облучения связано с развитием программируемой клеточной гибели. В сохранившейся части клеточной популяции селезенки на 2-е - 3-е сутки после облучения начинается процесс восстановления количества копий мтДНК.

Транскрипция мтДНК в клетках головного мозга и селезенки пои гамма — облучении

мышей.

Мы исследовали транскрипцию трех митохондриальных генов: nd4, coIlYind6 в клетках головного мозга и селезенки облученных в дозе 10 Гр мышей. Следует отметить, что первые два гена, входят в состав тяжелой цепи (h-strand) мтДНК, a nd6 - структурный ген, кодирующийся легкой цепью.

Транскрипция мтДНК оценивалась по числу молекул митохондриальной мРНК через 5, 24, 48 к 72 часов после облучения мышей. Для нормализации количества внесенной матрицы использовались два housekeeping гена, кодирующихся ядерной ДНК: gapdh и beta - actin. На Рис. 2 представлены результаты исследования экспрессии митохондриального гена nd6.

Селезенка

Головной мозг

О 10 20 30 40 50 60 70 80

Время после облучения, ч

. 10 20 30 40 50 60 70 80

Время после облучения, ч

Рис. 3 Относительная экспрессия гена пйб в клетках головного мозга и селезенки облученных в дозе 10 Гр мышей. Для нормализации использовали амплификацию фрагмента гена gapdh. Л=1 - уровень транскрипции пЛ6 контрольных мышей.

Селезенка

1600

1400

SF 1200

X 1000

800

с£ 600

400

200

■200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Время после облучения, ч

Рис. 4 Относительная экспрессии гена coll в клочках головного мозга и селезенки облученных в дозе 10 Гр мышей. Для нормализации использовали амплификацию фрагмента гена beta - actin. R=1 - уровень транскрипции coll контрольных мышей.

Можно видеть, что как в селезенке, так и в клетках головного мозга облученных мышей количество транскриптов гена nd6 мтДНК изменяется уже в первые часы после облучения. В селезенеке в первые 5 часов после облучения количество транскриптов возрастает не более чем в два раза, однако, что удивительно, уже к 24 часам мРНК гена пс!б превышает контрольный уровень более чем в 1000 раз. Через 48 часов количество транскриптов данного гена резко падает до контрольного уровня и в более поздние времена практически не меняется.

Сходная картина наблюдается в клетках головного мозга облученных мышей. Через 5 часов, так же как и в спленоцитах, после облучения уровень мРНК nd6 возрастает в 2-3 раза, однако, по сравнению с селезенкой, дальнейшего увеличения числа транскриптов не происходит. Через сутки после облучения количество траенкриптов снижается в 2 раза, дальнейшие изменения транскрипции направлены на восстановление до контрольного уровня

мРНК >к16 в головном мозге, который достигается к 48 часам и далее остается постоянным в течение суток.

Результаты изменения транскрипции митохондриального гена coll (Рис. 4) обнаруживают поразительное сходство с результатами, полученными для гена nd6. Так же, как и в случае nd6, в селезенке количество мРНК гена coli, незначительно изменяется к 5 часам после облучения, а уже к 24 часам превышает контрольные уровень более чем в 1350 раз. 13 дальнейшем происходит резкое падение и через 72 часа уровень мРНК возвращается к контрольному.

Изменение транскрипции coll в клетках головного мозга также повторяет динамику изменения количества транскриптов nd6. Так, через 5 часов, уровень мРНК coll в этой ткани в 2.5 раза превышает контрольный, спустя сутки снижается до уровня в 2 раза меньше контрольного и этот уровень практически сохраняется в течение следующих двух суток.

Основная регуляция уровня траскрипции/репликации в митохондриях осуществляется несколькими транскрипционными факторами. В настоящее время в литературе обсуждается роль mtTFA в регуляции биогенеза мтДНК. Существует представление, что оверэкспрессия mtTFA приводит к индукции репликации мтДНК [Ekstrand et al. 2004]. с другой стороны аналогичные исследования показали, что роль mtTFA не существенна при репликации мтДНК [Maniura-Weber et al. 2004]. Но ни у кого не вызывает сомнения тот факт, что оверэкспрессия mtTFA приводит к увеличению транскрипции мтДНК. Оверэкспрессия mtTFA подконтрольна факторам NRF-1 и NRF-2 [Gleyzer et al. 2005], которые, в свою очередь, активируются повышенным уровнем свободных радикалов. Таким образом, увеличение общего количества транскриптов мтДНК может объясняться процессом активации экспрессии транскрипционных факторов.

1.2

1.0

Ч 0.8

О 0.6

к 0.4 0.2 0.0

Селезенка

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время после облучения, ч

1.21.1 1.0 5 0.9 I 0.8 О 0.7 {£ 0.6 0.5 0.4 0.3

Головной мозг

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Время после облучения, ч

Рис. 5 Относительная экспрессия гена пй4 в головной мозге н селезснки облученных в дозе 10 Гр мышей. 11=1 уровень транскрипции пй4 контрольных мышеи.

При исследовании уровня транскрипции гена пй4 (Рис. 5) были получены следующие результаты: уровень мРНК гена пй4 в селезенке облученных мышей через 5 часов после облучения снижается более чем в 5 раз, в дальнейшем каких-либо значимых отклонений в количестве мРНК данного гена не происходит. В головном мозге изменения количества транскриптов носят также отрицательный характер, однако кинетика снижения количества копий мРНК пс14 в данной ткани несколько иная: в течение трех суток происходит постепенное снижение и через 72 часа после облучения уровень транскриптов мРНК гена пс14 в клетках головного мозга мышей в 2 раза ниже контрольного уровня.

На основании анализа результатов, полученных при исследовании экспрессии трех митохондриальных генов, можно предположить, что в условиях окислительного стресса возникает крупная делеция мтДНК, включающая область гена п<14 (Рис. б)

N06

СОХИ"1

Фрагмент мтДНК содержащий гены пс!6 и со11_. а также область регупя транскрипции и репликации

Рис.б Деления мтДНК [4977 ± 3 п.н.]

Делеция размером около 5000 п.н., содержащая фрагмент гена пс14

Известно, что в случае удаления Р-петли из целостной структуры мтДНК как репликация, так и транскрипция невозможны [Тегпапс1ег-511уа й а1. 2003]. Таким образом, ген пс!4 не участвует в процессах репликации и транскрипции мтДНК, именно этим и объясняется снижение экспрессии данного гена на фоне увеличенной транскрипции других митохондриальных генов при облучении мышей. Более того, анализ транскрипции трех исследуемых генов позволяет считать, что и у контрольных мышей происходит потеря гена пс14 (в меньшей степени), по-видимому, из-за близости к электрон-транспортной цепи (Рис.7).

К ^

о.

н ^

<а

•

А А

• ♦

* 1 Ф ■ 2 V Т •

* Т 1 Ш

- ■

глй* „оо^

Рис. 7 Уровень экспрессии трех митохондриальных генов (nd4, coll, nd6) в клетках селезенки и головного мозга контрольных мышей, нормализация по генам gapdh и beta-actin.

Транскрипция митоходриальной ДНК при действии блеомицина.

Результаты исследования транскрипции трех митохондриальных генов: nd4, coll и nd6 в клетках головного мозга и селезенки мышей после инъекции блеомицина [1,5 мг/мышь] совпадают с результатами, полученными при действии облучения (Рис. 8). Известно, что принцип действия блеомицина основан на способности вызвать многочисленные одно- и двунитевые разрывы в структуре ДНК, подобно действию свободных радикалов, образующихся при облучении.

Нам представлялось интересным выяснить, что происходит с нефункциональными фрагментами мтДНК, образующимися при действии генотоксических агентов. Возможны 2 процесса, позволяющие утилизировать большие фрагмент мтДНК:

1 - фрагменты могут быть выведены за пределы органеллы и,

2 - фрагменты могут быть расщеплены эндонуклеазой G, локализованной в митохондриях. Не исключено, что оба этих процесса дополняют друг друга и являются частями целого механизма.

Головной мозг nd4 ' —Селезенка

Время после инъекции, ч

10 20 30 40 50 60 70 80 Время после инъекции, ч

1000

800

ч:

£ 600

0£ 400

200

ndß

-■-Селезенка | — Головной мозг j

О 20 40 60 80100120140160180 Время после инъекции, ч

Рис. 8 Изменение транскрипции генов nd4, coll nd6, мтДНК после введения блеомицина (l,f мг/мышь). R=1 уровень транскрипшн контрольных мышей.

Выход ДНК из митохондрий in vitro

Нами был поставлен модельный эксперимент, в котором митохондрии помещали в кювету микроспектрофлуориметра и измеряли функциональную активность митохондрий по изменениям ДТ-ш. Открытие РТР индуцировали добавлением ионов кальция в концентрации 50 мкМ. После индукции РТР, наблюдаемой по спаду ДТ-т, добавляли ингибитор РТР - циклоспорин А, который способствовал закрытию РТР и восстановлению ДЧ-"-т до исходного уровня. В контрольном эксперименте до внесения кальция был добавлен циклоспорин А, что предотвращало индукцию РТР. После этого суспензия отбиралась, помещалась в центрифужную пробирку, митохондрии осаждали при 12000 об\мин [Eppendorf 5415] и из супернатанта выделяли ДНК.

На рис.9 приведена схема эксперимента по открытию РТР и анализ фрагментов мтДНК, обнаруженных в среде после осаждения митохондрий до и после открытия РТР. Как видно из рисунка, при индукции РТР в среде инкубации митохондрий обнаруживаются

фрагменты ДНК, размером 10090 п.н., так же как и при ингибировании РТР циклоспорином А. Однако отчетливо видно, что при осуществлении предельных порядковых разведении ДНК, вносимой в реакцию, титр крупного фрагмента мтДНК, как минимум, на 1 порядок выше при индуцированной РТР, чем при ингибированной. Это свидетельствует о том, что при индукции РТР крупные фрагменты мтДНК выходят из митохондрий. Для того, чтобы снять все сомнения относительно разрушения митохондрий во время проведения эксперимента, параллельно измерению относительного количества фрагментов мтДНК в инкубационной среде, нами был измерен уровень внутриматриксного фермента митохондрий - цитратсинтазы, уровень которой в модельной системе свидетельствовал о целостности митохондрий (Рис.10).

м 1 2 3 4

12 3 4 М

ЯШ

Рис.9 Модельный эксперимент на изолированных митохондриях. Сверху слева -график измерения потенциала в присутствии циклоспорина А и 50 мкМ кальция. Снизу слева - график измерения потенциала в присутствии Циклоспорина А, который добавляли после индукции РТР. Сверху справа - электрофорез амплифицированных фрагментов мтДНК при закрытой РТР. Снизу справа -электрофорез амплифицированных фрагментов мтДНК при индукции РТР. М-маркер длин фрагментов ДНК; 1, 2, 3, 4 - соответственно, порядковые разведения количества ДНК в супернатанте после осаждения митохондрий.

О 100 200 300 400 500 G00 700

Время сек

Рис.10 Определения количества внутриматриксного фермента - цитратсинтазы. 1 — среда выделения после последней отмывки митохондрий. 2 — среда инкубации после осаждения митохондрий [добавление циклоспорина-А перед Са2+]. 3 - среда инкубации после осаждения митохондрий [добавление циклоспорина-А после Са2+]. 4 -разрушенные митохондрии в среде инкубации.

На рис.10 видно, что при индукции РТР в данных модельных экспериментах не происходит разрушения митохондрий, из этого следует, что увеличивающийся титр фрагментов мтДНК в среде инкубации митохондрий является прямым следствием индукции РТР. Следовательно, можно заключить, что индукции РТР является своеобразным триггером, обеспечивающим выход фрагментов мтДНК из митохондрий.

Выход фрагментов мтЛНК из митохондрий при облучении мышей in vivo.

Митохондриальная РТР индуцируется многими продуктами окислительно-восстановительных реакций и продуктами реакций, в которых образуются радикалы, как например, при облучении. [Constantini Р, et al., 1995, Kowaltowski ct al., 1995, Petrolini et al., 1994] Кроме того, облучение вызывает одно- и двунитивые разрывы ДНК и, таким образом, является наилучшей моделью для исследования процессов выхода мтДНК из митохондрий.

На рис. 11 представлено элекгрофоретическое разделение митохондриального фрагмента размером 1841 п.н. (область D-петли), обнаруженного в цитозоле клеток головного мозга.

1841 п.н.

Рис.11 Амплификация фрагмента митохондриальной ДНК размером 1841 п.н. из цитозольной фракции клеток головного мозга контрольных и облученных в лозе 5 Гр мышей.

Результаты амплификации фрагмента митохондриальной ДНК размером 1841 п.н. показывают, что при заданных параметрах амплификации в цитозоле клеток головного мозга контрольных животных визуализация амплифицированных фрагментов ДНК отсутствует. Однако, уже через 1 час после облучения в дозе 5 Гр в цитозоле клеток мозга наблюдаются фрагменты митохондриальной ДНК. Максимум количества фрагментов митохондриальной ДНК в цитозольной фракции клеток мозга достигается к 5 часам после облучения в дозе 5 Гр и сохраняется в течение 3 недель.

В описанных выше экспериментах уровень митохондриальной ДНК в цитозольной фракции клеток головного мозга после облучения мышей оценивался по амплификации одного митохондриального фрагмента размером 1841 п.н. В дальнейших экспериментах мы провели амплификацию различных по топологии и размеру участков митохондриальной ДНК от 316 п.н. до 10090 п.н. (рис. 12). Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что фрагменты митохондриальной ДНК, обнаруженные в цитозольной фракции клеток головного мозга облученных мышей, представляют собой практически всю структуру мтДНК.

Поразительно то, что в цитозоле клеток головного мозга облученных в дозе 5 Гр мышей присутствуют такие большие фрагменты как 10090 п.н.

Рис.12 Сводная схема электрофоретического разделения различных по топологии н размеру фрагментов мнтохондриальной ДНК в цитозоле мозга мышей, облученных в дозе 5 Гр.

При облучении мышей в дозах 3 Гр и 8 Гр в цитозоле клеток головного мозга также были обнаружены фрагменты мтДНК (рис. 13). Динамика появления мтДНК в цитозоле совпадала после облучения мышей в дозе 5 Гр и 8 Гр. При действии облучения в этих двух дозах амплификация фрагмента 10090 п.н. наблюдается через 5 часов. Амплификация того же фрагмента при облучении мышей в дозе 3 Гр происходит через 24 часа после облучения. При облучении во всех дозах фрагменты мтДНК находится в цитозоле по крайней мере в течение 3-х недель наблюдения.

3 Гр

5 Гр

8 Гр

Рис. 13 Схема электрофоретического разделения фрагмента мнтохондриальной ДНК размером 10090 п.н., выделенной из цитозольной фракции клеток головного мозга контрольных и облученных мышей.

Эксперименты на модельной системе, связанные с открытием РТР и выходом мтДНК из органеллы, позволяют провести некую аналогию с процессом появления мтДНК в цитозоле клеток головного мозга мышей после радиационного воздействия.

Предполагается, что в условиях in vivo быстрые кальциевые токи могут возникать только при кратковременной индукции РТР и пора в этом случае проявляет себя как индуцибильный кальциевый канал [Akerman К.Е., 1977, Bemardi Р., 1992, 1998, 1996]. Нами был поставлен эксперимент, в котором митохондрии тестировались на способность аккумулировать ионы кальция и сохранять при этом мембранный потенциал (рис.14). В течение первых семи суток после облучения в летальных дозах, когда происходит выход фрагментов мтДНК в цитозоль клеток головного мозга, мембранный потенциал не меняется. Тем не менее, физиологические параметры митохондрий облученных животных отличаются от контрольных, но в более поздние сроки (3 недели после облучения мышей в летальных дозах). Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что митохондрии, выделенные из клеток головного мозга через три недели после облучения мышей в дозе 5 Гр, сохраняют мембранный потенциал. Однако, митохондрии мозга облученных мышей по сравнению с контрольными более чувствительны к кальциевым нагрузкам. Добавка кальция в концентрации 50 мкМ приводит к практически полному сбросу ДЧ'-т. После добавки циклоспорина А Д'Р-т восстанавливался до уровня, составляющего приблизительно 80% от начального. Контрольные же митохондрии были менее чувствительны к кальциевым нагрузкам, и после добавки циклоспорина А практически полностью восстанавливали АТ-т.

Таким образом, физиологическое состояние изолированных митохондрий клеток головного мозга облученных мышей отличается от контрольных. Результаты показали, что для индукции РТР в митохондриях клеток головного мозга облученных мышей необходимы гораздо более слабые воздействия, чем в митохондриях контрольной группы. Это свидетельствует о том, что при облучении выход митохондриалъной ДНК из органеллы происходит с большей вероятностью

РССР

100 200 300 400 500 Время (сек)

100 200 300 400 500 Врел/ет (сек)

Са

бОгт^М

Г"ГУ

СэА /

РССР

"71

100 200 300 400 500 600 Время (сек)

зоо

Время (сек)

Рис. 14 Измерение потенциала в контрольных и облученных мышах через 3 недели noc.ii облучения в дозе 5 Гр. Измерение потенциала проводилось при помощи зонда Шюбапцпе 123 Открытие РТР индуцировали добавкой кальция. РТР ингибировалась циклоспорином А. А, ( - митохондрии клеток головного мозга мышей через 3 недели после облучения. В, И ■ митохондрии клеток головного мозга контрольных мышей.

Нуклеазная активность митохондриалыюго матрикса.

Нами была исследована нуклеазная активность лизатов митохондриального матрикса клеток головного мозга и селезенки контрольных и облученных в дозе 10 Гр мышей. Как следует из рис.15, ДНК при инкубации с лизатом контрольных мышей практически не подвергается деградации (дорожки 1 и 2). Лизат, полученный из митохондрий селезенки облученных мышей (дорожка 4), обладает значительно большей нуклеазной активностью по сравнению с лизатом митохондриального матрикса клеток головного мозга (дорожка 3).

Рис.15 Электрофореграммы ДНК тимуса теленка после ее инкубации с фракциями цитозоля из клеток головного мозга и селезенки контрольных и облученных мышей. Фракции цитозоля получали из тканей животных через 24 часа после облучения в дозе 5 Гр. [1,3] - фракции матрикса митохондрий из клеток головного мозга. [1]- контроль, [3]- облучение. [2,41 - фракции матрикса митохондрий из клеток селезенки. [2]- контроль, [4]- облучение.

Таким образом, очевидно, что ИР индуцирует нуклеазную активность митохондриального матрикса, что является дополнительным фактором появления двунитевых разрывов в мтДНК, накопления в матриксе делегированных фрагментов и возрастающего, вследствие действия ИР, уровня гетероплазмии. Если учитывать тот факт, что Эндо-G, как наиболее вероятный вследствие своей субстратной специфичности фермент, принимает активное участие во фрагментации мтДНК, то резонно возникает вопрос, - почему в нормальных физиологических условиях Эндо-G не фрагментирует мтДНК? Самым очевидным ответом может служить факт локализации данного фермента в межмембранном пространстве митохондрий, где он не имеет прямого доступа к субстрату. Кроме того, то, что в большей степени, Эндо-G проявляет нуклеазную активность по отношению к ДНК, содержащим модифицированные основания, индуцированные ИР, может свидетельствовать о том, что повреждения структуры ДНК и активация Эндо-G являются взаимосвязанными процессами.

Другим объяснением увеличивающейся, вследствие действия ИР, нуклеазной активности митохондриального матрикса может являться увеличение синтеза de novo

Эндс-О, тем более, известно, что ИР индуцирует транскрипцию большого числа белков. В связи с этим мы определяли уровень экспрессии ядерного гена endog (Рис. 16).

60"] Головной мозг

55- •

Селезенка

о: 20- /

15-! 105-

О 5 101520253035404550556065707580 Время после облученя, ч

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время после облученя, ч

Рис. 16 Уровень экспрессии гена endog в клетках головного мозга и селезенки облученных в дозе 10 Гр мышей относительно уровня экспрессии в тканях необлученных мышей. R=1 уровень транскрипции endog контрольных мышей.

Из рис.16 видно, что при облучении мышей происходит увеличение транскрипции гена endog. В клетках головного мозга уже через 5 часов после облучения в дозе 10 Гр резко^возрастает количество транскриптов данного гена. Спустя сутки уровень транскриптов возвращается к норме, а затем вновь повышается.. Иную картину мы можем наблюдать в селезенке. Можно видеть, что в первые часы после облучения уровень транскриптов изменяется крайне незначительно, однако, уже к 24 часам уровень транскриптов гена endog заметно возрастает, а затем возвращается к норме. В настоящее время в литературе широко обсуждается роль Эндо-G в апоптозе, а именно, ее участие в нуклеосомной деградации яДНК по каспаз-независимому механизму [van Loo et al., 2001, 2002; Davies et al., 2003]. Вместе с тем, сведения о вовлеченности этого фермента в деградацию мтДНК отсутствуют. Исходя из результатов, полученных при исследовании мтДНК клеток головного мозга, мы полагаем, что Эндо-G является ферментом, участвующим во фрагментации мтДНК и образовании делеций, как в условиях физиологической нормы, так и в условиях окислительного стресса. По-видимому, это связано с необходимостью удаления поврежденных участков мтДНК, возникающих в результате высокого уровня радикалов в митохондриях.

Сходную картину увеличения транскрипции endog мы наблюдали и после введения мышам блеомицина (Рис.17). Инъекция блеомицина в предельной дозе приводит к 9-порядковому увеличению количества траснскриптов endog в клетках селезенки (приблизительно в миллиард раз). В клетках головного мозга количество траскриптов этого гена увеличивается почти в 3 млн. раз.

Экспрессия endos при действии блеомицина

Селезенка

3000000

Головной мозг

3.00Е+008

4 2.50Е+008 0>

о 2.00Е+008

5 1.50Е+008

6 1.00Е+008

2500000

I 2000000

- 1500000

ас

1000000

5.00Е+007

500000

О 24 48 72

Время после инъекции, ч

0 10 20 30 40 50 60 70 80 время после инъекции, ч

Рис. 17 Транскрипция гена endog в головном мозге и селезенке мышей при введении блеомицина (1,5 мг/мышь). И=1 уровень транскрипции endog контрольных мышей.

Известно, что блеомицин, также как и облучение, индуцирует окислительный стресс. При действии блеомицина и при действии ИР мы наблюдаем схожие процессы изменения репликации мтДНК, транскрипции митохондриальных генов и ядерного гена ет!оё. Таким образом, ответ клеток на действие окислительного стресса является универсальным вне зависимости от природы генотоксического агента.

Митохондриальная ДНК млекопитающих - кольцевая двуцепочечная молекула, кодирующая 13 полипептидов дыхательной цепи. Поскольку мтДНК не содержит некодируемые последовательности, она транскрибируется как единый полицистронный блок и любые нарушения в ней являются патогенетическими. В настоящем исследовании установлено, что в условиях окислительного стресса, вызванного либо облучением, либо действием блеомицина, в мтДНК разных по радиочувствительности тканях (головной мозг и селезенка) возникает крупная делеция (около 5000 п.н.), т.е. практически треть всего мигохондриального генома не участвует в процессах репликации и транскрипции. Несомненно, что подобная дисфункция мтДНК, например: многократная утрата гена отразится на процессах окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ.

Само накопление фрагментов мтДНК в митохондрии является деструктивным процессом и выход фрагментов мтДНК из органеллы сокращает пул поврежденных молекул мтДНК. Вполне возможно, что при функционировании митохондрий в условиях нормы единичные поврежденные молекулы мтДНК также удаляются при участии РТР. В условиях же окислительного стресса, когда количество делеций многократно возрастает, наблюдается постоянный процесс выхода фрагментов мтДНК. Дозозависимое накопление фрагментов в

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

цитозоле клеток головного мозга при облучении мышей и сохранении их в течение нескольких недель увеличивает риск проникновения фрагментов мтДНК в ядро.

Процесс выхода фрагментов мтДНК из митохондрий коррелирует со временем увеличения числа копий мтДНК, однако, в большей степени происходит ущербное восстановление, поскольку огромная часть копий мтДНК представляет собой урезанный геном — минициркли.

В процессе фрагментации мтДНК под действием генотоксических агентов, по-видимому, участвует неспецифическая эндонуклеаза -С, так как и при облучении и при действии блеомицина происходит увеличение активности данного фермента и резко возрастает транскрипция гена епдод.

Таким образом, в условиях окислительного стресса, инициированного длействием генотоксических агентов, изменяются процессы репликации и транскрипции митохондриальных генов, нарушается целостность мтДНК, образуются фрагменты разной величины, крупные делеции фрагментов мтДНК выходят в цитозоль клеток, что представляет собой потенциальную угрозу стабильности ядерного генома.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что увеличение числа копий мтДНК в клетках головного мозга мышей при действии генотоксических агентов является компенсаторной реакцией митохондрий на уменьшение количества генов.

2. Обнаружено, что при действии генотоксических агентов механизмы регуляции транскрипции мтДНК являются универсальными для разных по радиочувствительности тканей (селезенка и головной мозг).

3. Действие генотоксических агентов инициирует процессы фрагментации мтДНК.

4. Впервые показано, что генотоксические агенты индуцируют транскрипцию эндонуклеазы в и увеличение нуклеазной активности митохондриального матрикса.

5. Впервые продемонстрировано, что фрагменты митохондриальной ДНК выходят из митохондрий при участии РТР.

6. Впервые зарегистрирован выход мтДНК из митохондрий клеток головного мозга облученных мышей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Patrushev M. Kasymov V, Patrusheva V, Ushakova T, Gogvadze V, Gaziev A. Mitochondrial permeability transition triggers the release of mtDNA fragments. // Cell Mol Life Sci., 2004, V.61, P. 3100-3103

2. Patrushev M. Kasymov V, Patrusheva V, Ushakova T, Gogvadze V, Gaziev AI. Release of mitochondrial DNA fragments from brain mitochondria of irradiated mice. // Mitochondrion. 2006 V.6 P. 43-47

3. Патрушев M.B.. Патрушева B.E., Касымов B.A., Евдокимовский Э.В., Ушакова Т.Е., Газиев А.И. Элиминация мтДНК из митохондрий и активация ее репликации в клетках тканей облученных мышей. // Цитология, 2006, том 48, вып. 8, стр. 684-695

Тезисы докладов

1. Патрушев М.В. . Зобова В.Е.. Касымов В.А.. Ушакова Т.Е.. Газиев А.И. Выход ДНК из митохондрий мозга гамма-облученных мышей. // Сборник тезисов VIII международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущипо, (17-21 мая 2004), изд. ПНЦ РАН, Пущино, стр.90

2. Касымов В.А., Патрушев М.В.. Зобова В.Е., Ушакова Т.Е., Исследование механизмов выхода митохондриальной ДНК в цитозоль. // Сборник тезисов VIII международной школы-копференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» Пущино, (17-21 мая 2004), изд. ПНЦ РАН, Пущино, стр.90

3. E.V. Evdokimovsky, M.V. Patrushev. Т.Е. Ushakova, A.I. Gaziev. Change in mtDNA replication and transcription in the blood cclls of mice after treatment with X-rays and bleomycin. // The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society, Kiev (22-25.08.2006)

4. Евдокимовский Э.В., Патрушев M.B.. Ушакова Т.Е., Газиев А.И. Нестабильность мтДНК в крови мышей при действии рентгеновского облучения и цитостатических антибиотиков // Сборник тезисов X международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино, (17-21 апреля 2006), изд. ПНЦ РАН, Пущино, стр.

5. Патрушев М.В.. Ушакова Т.Е., Губина Н.Е., Мерекипа О.С., Газиев А.И. Выход фрагментов МТДНК из митохондрий клеток мозга после облучения мышей. // Материалы V съезда по радиационным исследованиям «радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» Москва, (10-14 апреля 2006), изд. «11-й ФОРМАТ», Москва, стр.61-64

6. Евдокимовский Э.В., Патрушев М.В.. Ушакова Т.Е., Газиев А.И.. Исследование повреждающего действия рентгеновского облучения и антибиотика блеомицина на

фрагментацию и репликацию митохондриальной ДНК в крови мыши // Материалы V съезда по радиационным исследованиям «радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» Москва, (10-14 апреля 2006), изд. «11-й ФОРМАТ», Москва.

7. Patrushev M.V.. Evdokimovsky E.V., Gubina N.E., Merekina O.S., Ushakova Т.Е., Gogvadze V.G., Gaziev A.I.. Alterations of mtDNA functionality in brain and spleen after irradiation. // The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society, Kiev (2225.08.2006)

к исполнению 18/09/2006 Исполнено 18/09/2006

Заказ № 634 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56

www.autorefcrat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Патрушев, Максим Владимирович

Введение.

Часть I. Обзор литературы.

Глава 1. Структура, функции и физиология митохондрий млекопитающих.

1.1. Специфика генетической системы митохондрий.

1.2. Структура, содержание генов, и организация мтДНК млекопитающих.

1.3. Транскрипция мтДНК и процессинг РНК.

1.4. Репликация мтДНК .^

Регуляция экспрессии и репликации мтДНК.

1.5. Нуклеазная активность в митохондриях.

1.6. Митохондриальная РТР.

Глава 2. Дисфункция митохондрий и нестабильность мтДНК при действии генотоксичеких агентов (облучения и блеомицина).

2.1. Действие облучения.

2.2.Структура и принцип действия антибиотика блеомицина.

2.3. Апоптоз.

Роль митохондрий в апоптозе.'.

Глава 3. Происхождение и эволюция митохондрий.

Часть II Собственные исследования.

Глава I. Материалы и методы.

1.1. Лабораторные животные.

1.2. Облучение.

1.3. Выделение митохондрий мозга.

1.4. Измерение скорости потребления 02 в суспензии изолированных митохондрий мозга.

1.5. Измерение ДФ-т.

1.6. Выделение ДНК.

1.6.1. Выделение ДНК из митохондрий.

1.6.2. Выделение ДНК из цитозольной фракции (сорбция на магнинтых сорбентах).

1.7. Выделение РНК.

1.7.1. Выделение РНК с использованием тиоцианата гуанидина.

1.7.2. Выделение РНК на магнитных сорбентах.

1.7.3. Выделение мРНК из тотальной РНК.

1.8. Синтез первой цепи кДНК.

1.9. Полимеразная цепная реакция [ПЦР].

1.9.1. ПЦР в реальном времени.

1.9.1.1. Краткая теория метода ПЦР в реальном времени.

1.10. Определние нуклеазной активности.

1.11. Определение активности цитратсинтазы.

Глава 2. Результаты и их обсуждение.

2.1.Биогенез мтДНК в ответ на действие облучения и блеомицина.

2.1.1.Количество копий мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей.

2.1.2. Репликация мтДНК при действии ИР.

2.1.3. Транскрипция мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей.

2.1.4 Транскрипция мтДНК при действии ИР.

2.1.5. Транскрипция мтДНК при действии блеомицина.

2.2. Элиминация фрагментов мтДНК.

2.2.1. Выход ДНК из митохондрий in vitro.

2.2.2 Выход фрагментов мтДНК из митохондрий в тканях облученных мышей in vivo.

2.3 Функциональное состояние митохондрий тканей облученных мышей.

2.4. Эндонуклеаза-G и ее роль в фрагментации мтДНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов"

полимеразная цепная реакция

ПЦР в реальном времени рибонуклеиновая кислота рибосомальная РНК циклоспорин А-чуствительная пора среда выделения тиреоидные гормоны

Буферный раствор содержащий TrisHCl и

EDTA транспортная РНК

Этилендиаминтетрауксусная кислота эндонуклеаза G электронтранспортная цепь ядерная ДНК

Введение

Согласно эволюционной теории, предшественниками митохондрий являются альфа-протеобактерии, вступившие в симбиоз с эукариотической клеткой около 2 млрд. лет назад [Lang et al., 1999]. В процессе эволюции большинство генов предшественников современного митохондриального генома встроились в ядерные хромосомы. В 1940-е годы появились сведения о существовании цитоплазматического генетического элемента, невошедшего в ядро клетки [Ephrussi et al., 1949] и, наконец, в 1960-х годах была открыта митохондриальная ДНК (мтДНК) [Nass and Nass, 1963]. За последние 20-30 лет сложились основные представления о структуре мтДНК, процессах ее репликации и транскрипции [Femandez-Silva et al., 2003]. В настоящее время установлено, что подавляющее большинство митохондриальных белков кодируется в ядре, синтезируется в цитоплазме в виде предшественников и импортируется в митохондрии. Собственно митохондриальный геном кодирует лишь небольшое число пептидов-компонентов системы окислительного фосфорилирования, в процессе которого синтезируется ATP [Attardi and Shatz, 1988]. Митохондриальный геном заметно отличается от ядерного: мтДНК имеет кольцевую форму, несколько отличный генетический код, наследуемость по материнской линии, полиполидность. Специфичность организации макромолекулы определяет своеобразные процессы функционирования мтДНК.

Несмотря на структурную индивидуальность мтДНК, ядерный геном млекопитающих содержит участки со 100% гомологией фрагментам мтДНК. Более того, в настоящее время появились свидетельства того, что спонтанные вставки фрагемнтов мтДНК в ядерный аппарат клетки приводит к полной дисфункции генов [Turner etal., 2003].

К началу настоящего исследования в литературе практически не обсуждался факт выхода фрагментов мтДНК из митохондрий. Существовало лишь единственное предположение о возможности такого процесса, выдвинутое Д.Б. Зоровым [Zorov et al, 1997]. Тем не менее, было известно, что мтДНК, находясь в непосредственной близости от электрон-траспортной цепи, постоянно подвергается атакам сводных радикалов, приводящих к раличного рода повреждениям митохондриального генома. Такие повреждения выражаются, как правило, модификациями оснований, одно и двунитевыми разрывами. Неэффективность систем репарации, постоянные атаки свободных радикалов приводят к тому, что в митохондриях возникают разные по структуре молекулы мтДНК. Такое явление получило название «гетероплазмия» - одно из наиболее интересных свойств митохондриального генома. Известно, что делетированные фрагменты мтДНК могут замыкаться в кольцо. Если такое кольцо содержит область регуляции транскрипции/репликации, то данная молекула способна к репликации и транскрипции. Образование делеций мтДНК, неспособных к репликации и транскрипции, показано огромным количеством авторов, однако до настоящего времени не изучен механизм их образования и, главное, не ясно, что происходит с фрагментами мтДНК неспособными к функционированию.

Представленная работа посвящена исследованию функционирования мтДНК в условиях окислительного стресса, индуцированного ионизирующим излучением и действием цитостатического антибиотика блеомицина. Индукция окислительного стресса внешними физическими и химическими факторами рассматривается как модельная система, усиливающая процессы повреждения мтДНК.

Часть I. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Патрушев, Максим Владимирович

Выводы

3. Действие генотоксических агентов инициирует процессы фрагментации мтДНК.

5. Впервые продемонстрировано, что фрагменты митохондриальной ДНК выходят из митохондрий при участии РТР.

6. Впервые зарегистрирован выход мтДНК из митохондрий клеток головного мозга облученных мышей.

Заключение

Митохондрии - органеллы, имеющиеся практически во всех эукариотических клетках, главной функцией которых является синтез АТФ осуществляемый через систему окислительного фосфорилирования - более 1000 белков. Большинство из этих белков кодируются яДНК и после синтеза на эндоплазматическом ретикулуме импортируются в митохондрии. Несмотря на то, что мтДНК млекопитающих кодирует лишь 13 полипептидов - компонентов системы окислительного фосфорилирования, ее повреждения могут приводить к различным патологиям.

Считается, что фенотипическое проявление патогенетических изменений мтДНК возможно лишь, когда уровень поврежденных молекул мтДНК достигает, в среднем, 70%. Однако и у здорового организма уровень повреждений может быть достаточно высок. В большей степени повреждения мтДНК проявляются в виде гетероплазмии, наблюдаемой не только у разных индивидуумов, но и у разных клеток одного органа.

Митохондриальная ДНК млекопитающих - кольцевая двуцепочечная молекула. Поскольку мтДНК не содержит некодируемые последовательности, она транскрибируется как единый полицистронный блок и любые нарушения в ней являются патогенетическими.

В настоящем исследовании установлено, что в условиях окислительного стресса, вызванного либо облучением, либо действием блеомицина, в мтДНК разных по радиочувствительности тканях (головной мозг и селезенка) возникает крупная делеция (около 5000 п.н.), т.е. практически треть всего митохондриального генома не участвует в процессах репликации и транскрипции. Необходимо отметить, что образование данной делеции наблюдается и в условиях физиологической нормы, по-видимому, из-за локализации мтДНК в непосредственной близости от ЭТЦ митохондрий. При действии генотоксических агентов деструктивные процессы усиливаются, в результате этого количество утраченных генов увеличивается в 2 раза в клетках головного мозга и в 8 раз в клетках селезенки. Несомненно, что подобная дисфункция мтДНК, например: многократная утрата гена пс!4, отразится на процессах окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ.

Образование делеций является одним из показателей повреждений мтДНК. В уловиях повреждения матрицы показано увеличение репликации, в которую вовлечены как нативные копии мтДНК, так и минициркли. Увеличение процесса репликации можно рассматривать как компенсаторный ответ на множественные повреждения ДНК.

Однако репликация миницирклей вносит все больший дисбаланс в общий функциональный пул мтДНК. Потеря генов особенно очевидно проявляется при исследовании транскрипции мтДНК, так например: ген nd4 практически полностью утрачивается мтДНК и сохраняется в органелле в виде крупной делеции.

В процессах образования делеций, как мы полагаем, принимает активное участие и эндонуклеза G - единственная неспецифическая нуклеаза, обнаруженная в митохондриях. Ее функции в митохондриях в достаточной степени не изучены. Мы полагаем, что именно этот фермент ответственен за образование делеций, так как генотоксические агенты, в большинстве своем не обладают специфическим действием, а наблюдаемая нами делеция, судя по количественным параметрам, образуется в большей степени, чем другие. По-видимому, действие генотоксических агентов приводит к большей доступности мтДНК для эндонуклеазы G, а главное, множественные повреждения структуры превращают мтДНК в главный субстрат для этого фермента (ранее было показано, что эндонуклеаза G обладает большей специфичностью к модифицированным основаниям). В настоящее время установлено, что мтДНК и белки, принимающие участие в транскрипции и репликации мтДНК, образуют надмолекулярные структуры - митохондриальные нуклеоиды. При действии генотоксических агентов с большой вероятностью происходят разрывы ДНК-белковых комплексов, структура ДНК становится доступной для нуклеазной активности.

Для нас очевидно, что и само накопление фрагментов мтДНК в митохондрии является деструктивным процессом, а выход фрагментов мтДНК из органеллы сокращает пул поврежденных молекул мтДНК.

Нами впервые был продемонстрирован выход фрагментов мтДНК из органеллы, сохраняющей свои функциональные параметры как в модельных системах, так и в условиях in vivo. Вполне возможно, что при функционировании митохондрий в условиях нормы единичные поврежденные молекулы мтДНК также удаляются при участии РТР. В условиях же окислительного стресса, когда количество делеций многократно возрастает, наблюдается постоянный процесс выхода фрагментов мтДНК. Дозозависимое накопление фрагментов в цитозоле клеток головного мозга при облучении мышей и сохранении их в течение нескольких недель увеличивает риск проникновения фрагментов мтДНК в ядро.

Сам факт выхода фрагментов мтДНК позволяет объяснить наличие фрагменов яДНК, гомологичных мтДНК. Вполне возможно, что выход мтДНК при участии РТР является одним из звеньев эволюции митохондрий. Известно, что у более высших с точки зрения эволюции организмов размер митохондриального генома значительно сокращен по сравнению с более эвалюционно далекими организмами. Процесс транслокации фрагментов мтДНК в ядро с последующей их инсерцией в яДНК связан с возникновением некоторых патологий. В частности, известны случаи инсерции небольших фрагментов мтДНК в яДНК, фенотипически проявляющиеся как синдром Паллистера-Хола. В этом случае индуцируются регуляторные гены (вЫЗ), отвечающие за экспрессию семейства генов формирования скелета, которые молчат в постэмбриальном периоде развития. Несомненно, что риск возникновения таких патологий многократно увеличивается при действии агрессивных факторов физической и химической природы.

Таким образом, в условиях окислительного стресса, инициированного действием генотоксических агентов, изменяются процессы репликации и транскрипции митохондриальных генов, нарушается целостность мтДНК, образуются фрагменты разной величины, крупные делеции фрагментов мтДНК выходят в цитозоль клеток, что представляет собой потенциальную угрозу стабильности ядерного генома.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Патрушев, Максим Владимирович, Пущино

1. ADAM, P. A., AND R. С. J. HAYNES. Control of hepatic mitochondrial C02 fixation by glucagon, epinephrine, and Cortisol // J. Biol. Chem. 1969; V.244 P.6444-6450

2. Adams KL, Daley DO, Qiu YL, Whelan J, Palmer JD: Repeated, recent and diverse transfers of a mitochondrial gene to the nucleus in flowering plants // Nature 2000; V. 408 P.354-35

3. Akerman KE. Effect of Mg2+ and spermine on the kinetics of Ca2+ transport in rat-liver mitochondria // J Bioenerg Biomembr. 1977 Feb; V.9(l) P.65-72.

4. Alam TI, Kanki T, Muta T, Ukaji K, Abe Y, Nakayama H, Takio K, Hamasaki N, Kang D. Human mitochondrial DNA is packaged with TFAM.// Nucleic Acids Res. 2003 V. 15;31(6) P. 1640-5

5. Albring M, Griffith J, Attardi G. Association of a protein structure of probable membrane derivation with HeLa cell mitochondrial DNA near its origin of replication.// Proc Natl Acad Sei USA. 1977 V. 74(4) P.1348-1352.

6. Amalric F, Merkel С, Gelfand R, Attardi G. Fractionation of mitochondrial RNA from HeLa cells by high-resolution electrophoresis under strongly denaturing conditions.//! Mol Biol. 1978 V. Jan 5;118(1) P. 1-25

7. Andersson U & Scarpulla RC. Pgc-1-related coactivator, a novel, serum-inducible coactivator of nuclear respiratory factor 1-dependent transcription in mammalian cells // Mol Cell Biol. 2001; V. 21 P. 3738-3749.

8. Andreu A.L., Arbos M.A., Perez-Martos A., Lopez-Perez M.J., Asin J., Lopez N., Montoya J., Schwatz. Reduced mitochondrial DNA transcription in senescent rat heart // Biochem. Biophys. Res. Commun.1998; V.252 P.577-581.

9. Antoshechkin I & Bogenhagen DF. Distinct roles for two purified factors in transcription of Xenopus mitochondrial DNA // Mol Cell Biol. 1995; V. 15 P. 7032-7042.

10. Arcari P & Brownlee GG. The nucleotide sequence of a small (3S) seryl-tRNA (anticodon GCU) from beef heart mitochondria // Nucleic Acids Res. 1980; V. 8 P. 5207-5212.

11. Attardi G. Animal mitochondrial DNA, an extreme example of genetic economy // Int Rev Cytol. 1985; V. 93 P.683-711.

12. Attardi G & Schatz G. Biogenesis of mitochondria //. Annu Rev Cell Biol. 1988; V.4 P.289-333.

13. Backer J, M., Weinstein I.B. Induction of benzo a. pyrene and its dihydrodiol-epoxide derivative with nuclear and mitochondrial DNA in cell cultures //

14. Cancer Res. 1982; V. 42 P. 2764-02769.

15. Bai YD & Attardi G. The mtDNA-encoded ND6 subunit of mitochondrial NADH dehydrogenase is essential for the assembly of the membrane arm and the respiratory function of the enzyme // EMBO J. 1998; V. 17 P. 4848-4858.

16. BEATRICE, M. C., D. L. STIERS, AND D. R. PFEIFFER. Increased permeability of mitochondria during Ca2- release induced by t-butyl hydroperoxide or oxalacetate. The effect of ruthenium red // J. Biol. Chem.1982; V. 257 P. 7161-7171

17. Beckkman k.B., Ames B.N. Mitochondrial aging: open questions // Ann. N.Y. Acad. Sci.1998; V.854 P.l 18-128.

18. Bentley D. The mRNA assembly line, transcription and processing machines in the same factory // Curr Opin Cell Biol. 2002; V 14 P.336-342.

19. Bernardi P. Mitochondrial Transport of Cations: Channels, Exchangers, and Permeability Transition PHYSIOLOGICAL REVIEWS V. 1999; 79 (4)

20. Bernardi P., Vassanelli S., Veronese P., Colonna R., Szabo I., Zoratti M., Modulation of the mitochondrial permeability transition pore-effect of protons and divalent cations // J. Biol. Chem. 1992; V.267 P. 2934-2939.

21. Berg OG, Kurland CG: Why mitochondrial genes are most often found in nuclei//Mol Biol Evol. 2000; V.17 P.951-961

22. Bogenhagen DF, Applegate EF & Yoza BK. Identification of a promoter for transcription of the heavy strand of human mtDNA, in vitro transcription and deletion mutagenesis//Cell. 1984; V.36 P.l 105-1113.

23. Bogenhagen DF & Clayton DA. Mouse L cell mitochondrial DNA molecules are selected randomly for replication throughout the cell cycle // Cell. 1977; V.ll P. 719-727.

24. Brierley GP, Jurkowitz M, Jung DW. Osmotic swelling of heart mitochondria in acetate and chloride salts. Evidence for two pathways for cation uptake // Arch Biochem Biophys. 1978 Sep; V.190(l) P.181-92

25. BRIERLEY, G. P., M. JURKOWITZ, AND D. W. JUNG. Osmotic swelling of heart mitochondria in acetate and chloride salts. Evidence for two pathways for cation uptake//Arch. Biochem. Biophys. 1978; V.190 P. 181-192

26. Brown TA & Clayton DA. Release of replication termination controls mitochondrial DNA copy number after depletion with 2,,3,-dideoxycytidine // Nucleic Acids Res. 2002; V.30 P. 2004-2010.

27. Brown WM, George JM & Wilson AC. Rapid evolution of animalmitochondrial DNA// Proc Natl Acad Sei U S A.1979; V. 76 P. 1967-1971.

28. Calleja M., Pena P., Ufalde C., Ferreira C., Marco R., Garesse R. Mitochondrial DNA remains intact during Drosophilla aging, but the levels of mitochondrial transcripts are significantly reduced // J. Biol. Chem.1993; V.268 P.18891-18897.

29. Cantatore P, Polosa PL, Fracasso F, Flagella Z & Gadaleta MN. Quantitation of mitochondrial RNA species during rat liver development, the concentration of cytochrome oxidase subunit I (Col) mRNA increase at birth // Cell Differ. 1986; V.19 P.125-132.

30. Carmona MC, Iglesias R, Obregon MJ, Darlington GJ, Villarroya F & Giralt M. Mitochondrial biogenesis and thyroid status maturation in brown fat require CCAAT/enhancer-binding protein alpha // J Biol Chem .2002; V. 277 P.21489-21498.

31. Castora FJ, Lazarus GM & Kunes D. The presence of two mitochondrial DNA topoisomerases in human acute leukemia cells // Biochem Biophys Res Commun.1985; V. 130 P.854-866.

32. Castora FJ & Simpson MV. Search for a DNA gyrase in mammalian mitochondria // J Biol Chem.1979; V.254 P.l 1193-11195.

33. Chang DD & Clayton DA. Precise identification of individual promoters for transcription of each strand of human mitochondrial DNA // Cell. 1984; V.36 P.635-643.

34. Chang DD & Clayton DA (1986a). Precise asignment of the light strand promoter of mouse mitochondrial DNA: a functional promoter consist of multiple upstream domains. Mol Cell Biol 6,3253-3261.

35. Chang DD & Clayton DA. Precise asignment of the heavy-strand promoter of mouse mitochondrial DNA: cognate start sites are not required for transcriptional initiation // Mol Cell Biol.1986; V. 6 P. 3262-3267.

36. Chinnery PF, Turnbull DM. Mitochondrial DNA and disease //Lancet. 1999 Jul; V.354(l) P.I17-21.

37. Chinnery P.F., Thorburn D.R., Samuels D.C., White S.L., Dahl H.M.,Turnbull D.M., Lightowlers R.N., Howell N. The inheritance of mitochondrial DNA heteroplasmy: random drift, selection or both?// TIG.2000; V.16 P.225-236.

38. Chinnery PF, Turnbull DM. Mitochondrial DNA and disease //Lancet. 1999 Jul; V.354(l) P.I17-21.

39. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. 1987 V. 162(1) P. 156-9

40. Chomyn A & Attardi G. Recent advances on mitochondrial biogenesis // In Molecular Mechanisms in Biogenesis, ed. Ernster L, chap.1992; V.20 P. 483509. Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam.

41. Christiansen TW & Clayton DA. A tridecamer DNA sequence supports human mitochondrial RNA 3,-end formation in vivo // Mol Cell Biol. 1988; V. 8 P. 4502-4509.

42. Chung H.C., Kim S.H., Lee M.C.,Cho C.K., Kim T.H., Lee D.H., Kim S.S. Mitochondrial dysfunction by gammairradiation accompanies the induction of cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) in rat lever // Toxicology.2001; V. 161 P. 7991.

43. Clayton DA. Transcription and replication of mitochondrial DNA // Hum Reprod. 2000 Jul; V.15(l 2) P.l 1-7

44. Clayton DA. Replication of animal mitochondrial DNA // Cell .1982; V. 28 P. 693-705.

45. Clayton DA. Transcription and replication of animal mitochondrial DNAs // Int Rev Cytol.1992; V. 141 P. 217-232.

46. Connern CP,Halestrap AP. Purification and N-terminal sequencing of peptidyl-prolyl cis-trans-isomerase from rat liver mitochondrial matrix reveals the existence of a distinct mitochondrial cyclophilin // Biochem J. 1992 Jun 1; V.284 (2) P.381-5

47. Constantini A, Paci E, Zappa M. Letter// Epidemiol Prev. 1995 Jun; V. 19(63) P.225-6.

48. Cote J & Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease-G // Science. 1993; V. 261 P. 765-769.

49. Cummins J. Mitochondria potential roles in embryogenesis and nucleacytoplasmic transfer // Hum. Reprod. Update. 2001; V.7 P.217-228.

50. Cummins JM. Mitochondria: potential roles in embryogenesis and nucleocytoplasmic transfer // Hum Reprod Update. 2001 Mar-Apr; V.7(2) P.217-228.

51. Daga A, Micol V, Hess D, Aebersold R & Attardi G. Molecular characterization of the transcription termination factor from human mitochondria// J Biol Chem.1993; V. 268 P.8123-8130.

52. Diaz F, Bayona-Bafaluy MP, Rana M, Mora M, Hao H, Moraes CT. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control// Nucleic Acids Res. 2002 V. 30(21) P. 4626-33.

53. DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial DNA mutations in human disease // Am J Med Genet. 2001 Spring; v,106(l) P. 18-26.

54. Doda JN, Wright CT & Clayton DA. Elongation of displacement-loop strands in human and mouse mitochondrial DNA is arrested near specific template sequences // Proc Natl Acad Sei U S A. 1981; V. 78 P. 6116-6120.

55. Doersen CJ, Guerrier-Takada C, Altman S & Attardi G. Characterization of an RNase P activity from HeLa cell mitochondria. Comparison with the cytosol RNase P activity// J Biol Chem. 1985; V. 260 P. 5942-5949.

56. Dubin DT, Montoya J, Timko KD & Attardi G. Sequence analysis and precise mapping of the 3,-ends of HeLa cell mitochondrial ribosomal RNAs // J Mol Biol.1982; V.157 P. 1-19.

57. Duff R.J., Vroom E., Geluk A., Hecht S.M. Evidence for C-l' abstraction from modified oligonucleotides by Fe-bleomycin // J. Am. Chem. Soc. 1993;V. 115 P. 3350-3351.

58. Dyall SD, Johnson PJ: Origins of hydrogenosomes and mitochondria: evolution and organelle biogenesis // Curr Opin Microbiol. 2000; V. 3 P.404-411

59. Embley TM, Hirt RP: Early branching eukaryotes? //Curr Opin Genet Dev. 1998; V.8 P.624-629

60. England JM, Costantino P & Attardi G. Mitochondrial RNA and protein synthesis in enucleated African green monkey cells// J Mol Biol. 1978; V. 119 P. 455-462.

61. Enriquez JA, Fernández-Silva P, Garrido-Perez N, Lopez-Perez MJ, Perez-Martos A & Montoya J. Direct regulation of mitochondrial RNA synthesis by thyroid hormone// Mol Cell Biol. 1999; V. 19 P. 657-670.

62. Enriquez JA, Fernández-Silva P & Montoya J. Autonomous regulation in mammalian mitochondrial DNA transcription // Biol Chem. 1999; V. 380 P.737-747.

63. Enriquez JA, Fernández-Si Iva P, Perez-Martos A, Lopez-Perez MJ & Montoya J. The synthesis of mRNA in isolated mitochondria can be maintained for several hours and is inhibited by high levels of ATP // Eur J Biochem. 1996; V. 237 P.601-610.

64. Ephrussi B, Hottinguer H & Tavlitzki J. Action de l'acriflavine sur les levures. II. Etude génétique du mutant "petite colonie".// Ann Inst Pasteur 1949; V.76 P. 351-367.

65. Etten RAV, Bird JW & Clayton DA. Identification of the 3,-ends of the two mouse mitochondrial ribosomal RNAs// J Biol Chem. 1983; V. 258 P.10104-10110.

66. Falkenberg M, Gaspari M, Rantanen A, Trifunovic A, Larsson NG & Gustafsson CM. Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA // Nat Genet. 2002; V. 31 P.289-294.

67. Farr CL, Wang Y & Kaguni LS. Functional interactions of mitochondrial DNA polymerase and single-stranded DNA-binding protein. Template-primer DNA binding and initiation and elongation of DNA strand synthesis // J Biol Chem 1999;V. 274 P. 14779-14785.

68. Fernández-Silva P, Petruzzella V, Fracasso F, Gadaleta MN & Cantatore P. Reduced synthesis of mt RNA in isolated mitochondria of senescent rat brain // Biochem Biophys Res Commun.l991;V. 176 P.645-653.

69. Fernández-Silva P., Enriquez JA, Montoya J. Replication and transcription of mammalian mitochondrial DNA// Experimental Physiology 2003; V. 88.(1) P. 41-56.

70. Fisher RP & Clayton DA. A transcription factor required for promoter recognition by human mitochondrial RNA polymerase// J Biol Chem.1985; V. 260 P.l 1330—11338.

71. Fisher RP & Clayton, DA. Purification and characterization of human mitochondrial transcription factor III Mol Cell Biol. 1988; V. 8 P.3496-3509.

72. Fisher RP, Lisowsky T, Parisi MA & Clayton DA. DNA wrapping and bending by a mitochondrial high mobility group-like transcriptional activator protein // J Biol Chem. 1992; V. 267 P.3358-3367.

73. Fisher RP, Topper JN & Clayton DA. Promoter selection in humanmitochondria involves binding of a transcription factor to orientation-independent upstream regulatory elements // Cell. 1987; V. 50 P.247-258.'

74. Gadaleta MN, Petruzzella V, Fracasso F, Fernández-Silva P & Cantatore P. Acetyl-L-carnitine increases cytochrome oxidase subunit I mRNA content in hypothyroid rat liver// FEBS Lett. 1990; V.277 P. 191-193.

75. Gadaleta MN, Petruzella V, Renis M, Fracasso F & Cantatore P. Reduced transcription of mitochondrial DNA in the senescent rat. Tissue dependence and effect of L-carnitine // Eur J Biochem. T990; V.187 P.501-506.

76. Gaines G & Attardi G. Highly efficient RNA-synthesizing system that uses isolated human mitochondria, new initiation events and in vivo-like processing patterns // Mol Cell Biol.1984; V. 4 P.1605-1617.

77. Gaines G, Rosi C & Attardi G. Markedly different ATP requirements for rRNA synthesis and mtDNA light strand transcription versus mRNA synthesis in isolated human mitochondria // J Biol Chem.1987; V.262 P.1907-1915.

78. Garstka HL, Facke M, Escribano JR & Wiesner RJ. Stoichiometry of mitochondrial transcripts and regulation of gene expression by mitochondrial transcription factor A // Biochem Biophys Res Commun. 1994; V. 200 P.619-626.

79. Gaziev AI, Podlutskii Ala. Low efficiency of DNA repair system in mitochondria //Tsitologiia. 2003; V.45(4) P.403-17.

80. Ghivizzani SC, Madsen CS, Nelen MR, Ammini CV & Hauswirth WW. In organello footprint analysis of human mitochondrial DNA, human mitochondrial transcription factor A interactions at the origin of replication // Mol Cell Biol. 1994; V.14 P.7717-7730.

81. Gleyzer N, Vercauteren K, Scarpulla RC. Control of mitochondrial transcription specificity factors (TFB1M and TFB2M) by nuclear respiratory factors (NRF-1 and NRF-2) and PGC-1 family coactivators // Mol Cell Biol.2005 Feb; V.25(4) P. 1354-66

82. Goglia F, Moreno M & Lanni A. Action of thyroid hormones at the cellular level, the mitochondrial target // FEBS Lett. 1999; V.452 P.l 15-120.

83. Gordon JW, Rungi AA, Inagaki H & Hood DA. Effects of contractile activity on mitochondrial transcription factor A expression in skeletal muscle // J Appl Physiol. 2001; V. 90 P.389-396.

84. Graves SW, Johnson AA & Johnson KA. Expression, purification, and initial kinetic characterization of the large subunit of the human mitochondrial DNA polymerase // Biochemistry. 1998; V.37 P. 6050-6058.

85. Gray H & Wong TW. Purification and identification of subunit structure of the human mitochondrial DNA polymerase // J Biol Chem.1992; V.267 P.5835-5841.

86. Gray MW: Evolution of organellar genomes// Curr Opin Genet. 1999 Dev; V. 9 P.678-687

87. Graziewicz MA, Day BJ, Copeland WC. The mitochondrial DNA polymerase as a target of oxidative damage //Nucleic Acids Res.2002 Jul 1; V. 30(13) P.2817-24.

88. Gutsaeva DR, Suliman HB, Carraway MS, Demchenko IT, Piantadosi CA. Oxygen-induced mitochondrial biogenesis in the rat hippocampus// Neuroscience.2006; V. 137(2) P.493-504. Epub 2005 Nov 17.

89. Hanawalt P.C. Controlling the effeciency of excicion repair // Mutat. Res.2001; V.29 P. 2117-2126.

90. Haworth RA, Hunter DR. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site // Arch Biochem Biophys. 1979 Jul; V. 195(2) P.460-467.

91. Hevner RF, Wong-Riley MT. Mitochondrial and nuclear gene expression for cytochrome oxidase subunits are disproportionately regulated by functional activity in neurons // J Neurosci. 1993 May; V.13(5) P.1805-19

92. Hehman GL & Hauswirth WW. DNA helicase from mammalian mitochondria // Proc Natl Acad Sei USA. 1992; V. 89 P. 8562-8566.

93. Helm M, Brule H, Friede D, Giege R, Putz D & Florentz C. Search for characteristic structural features of mammalian mitochondrial tRNAs // RNA. 2000; V. 6 P.1356—1379.

94. Herzig RP, Scacco S & Scarpulla RC. Sequential serum-dependent activation of CREB and NRF-1 leads to enhanced mitochondrial respiration through the induction of cytochrome c // J Biol Chem. 2000; V. 275 P.13134-13141.

95. Hess JF, Parisi MA, Bennett JL & Clayton DA. Impairment of mitochondrial transcription termination by a point mutation associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies // Nature. 1991; V.351 P.236-239.

96. Hevner RF & Wong-Riley MT. Mitochondrial and nuclear gene expression for cytochrome oxidase subunits are disproportionately regulated by functional activity in neurons // J Neurosci. 1993; V.13 P. 1805-1819.

97. Hixson JE, Wong TW & Clayton DA. Both the conserved stem-loop and divergent 5,-flanking sequences are required for initiation at the humanmitochondrial origin of light-strand DNA replication // J Biol Chem. 1986; V.261 P.23 84-2390.

98. Hobbs AE, Srinivasan M, McCaffery JM & Jensen RE. Mmmlp, a mitochondrial outer membrane protein, is connected to mitochondrial DNA (mtDNA) nucleoids and required for mtDNA stability // J Cell Biol. 2001; V.152 P.401-410.

99. Hofhaus G & Attardi G. Efficient selection and characterization of mutants of a human cell line which are defective in mitochondrial DNA-encoded subunits of respiratory NADH dehydrogenase // Mol Cell Biol. 1995; V.15 P.964-974.

100. Hoke GD, Pavco PA, Ledwith BJ & Tuyle GCV. Structural and functional studies of the rat mitochondrial single-stranded DNA binding protein P16 //Arch BiochemBiophys. 1990; V. 282 P.l 16-124.

101. Holmes C.E., Abraham T.E., Hecht S.M., Florentz C., Giege R. Fe-bleomycin as a probe of RNA conformation // Nucleic Acid Research. 1996; V. 24(17) P. 3399-3406.

102. Holmes C.E., Carter B.J., Hecht S.M. Characterization of iron(II)-bleomycin-mediated RNA strand scission // Biochemistry. 1993; V. 32 P. 42934307.

103. Holt IJ, Harding AE, Petty RKH & Morgan-Hughes JA. A new mitochondrial disease associated with mitochondrial DNA heteroplasmy // Am J Hum Genet. 1990; V.46 P.428-433.

104. Holt I J, Lorimer HE & Jacobs HT.Coupled leading- and lagging-strand synthesis of mammalian mitochondrial DNA // Cell. 2000; V.100 P.515-524.

105. Hood DA, Zak R & Pette D. Chronic stimulation of rat skeletal muscle induces coordinate increases in mitochondrial and nuclear mRNAs of cytochrome-c-oxidase subunits // Eur J Biochem. 1989; V.179 P.275-280.

106. Howell N. Chinnery P.F., Ghosh S.S., Fany E., Turnbull D.M. Transmission of the human mitochondrial genome // Hum. Reprod. 2000; V.15 (1.2) P.235-245.

107. Hou J.H., Wei Y.H. The unusul structures of the hot-regions flanking large-scale deletions in human mitochondrial DNA // Biochem. J. 1996; V. 318 P.1065-1070.

108. Iborra FJ, Kimura H, Cook PR. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells// BMC Biol.2004 May 24; V.2 P.9

109. Izquierdo JM, Ricart J, Ostronoff LK, Egea G & Cuezva JM. Changing patterns of transcriptional and post-transcriptional control of beta-F-1-ATPase gene expression during mitochondrial biogenesis in liver // J Biol Chem. 1995; V.270,10342-10350.

110. Jacobs MA, Payne SR, Bendich AJ. Moving pictures and pulsed-field gel electrophoresis show only linear mitochondrial DNA molecules from yeasts with linear-mapping and circular-mapping mitochondrial genomes // Curr Genet. 1996 Jun; V.30(l) P.3-11

111. Jacobs HT, Lehtinen SK & Spelbrink JN. No sex please, we're mitochondria, a hypothesis on the somatic unit of inheritance of mammalian mtDNA // Bioessays. 2000; V.22 P.564-572.

112. Jansen RP, de Boer K. The bottleneck: mitochondrial imperatives in oogenesis and ovarian follicular fate // Mol Cell Endocrynol. 1998 Oct 25; V.145(l-2) P.81-88

113. Jenuth JP, Peterson AC & Shoubridge EA. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice // Nat Genet. 1997; V.16 P.93-95.

114. Kadenbach B, Possekel S, Huttemann M & Arnold S.Biochemical defects and genetic abnormalities in cytochrome c oxidase of patients with Leigh syndrome // Biofactors. 1998; V.7 P.273-276.

115. Kaufman BAj Newman SM, Hallberg RL, Slaughter CA, Perlman PS & Butow RA (2000). In organello formaldehyde crosslinking of proteins to mtDNA, identification of bifunctional proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 7772-7777.

116. Kaukonen J, Juselius JK, Tiranti V, Kyttala A, Zeviani M, Comi GP, Keranen S, Peltonen L & Suomalainen A.Role of adenine nucleotide translocator 1 in mtDNA maintenance // Science.2000; V. 289 P.782-785.

117. Knight JA. The biochemistry of aging // Adv Clin Chem. 2000; V.35 P. 1-62

118. Kosovsky M & Soslau G. Immunological identification of human platelet mitochondrial DNA topoisomerase-I // Biochim Biophys Acta. 1993; V.1164 P.101-107.

119. Kowald A. The mitochondrial theory of aging // Biol Signals Recept. 2001 May-Aug; V.10(3-4) P.162-175

120. Kowaltowski AJ, Castilho RF, Vercesi AE. Ca(2+)-induced mitochondrial membrane permeabilization: role of coenzyme Q redox state //Am J Physiol. 1995 Jul; V.269(l Pt 1) P.141-7

121. Kroemer G, Reed JC. Mitochondrial control of cell death // Nat Med. 2000 May;6 V.(5) P.513-9. Review

122. Kroemer G, Petit PX, Zamzami N, Vayssi'ere J-L, Mignotte B. The biochemistry of apoptosis // FASEB J.1995; V. 9 P.1277-87.

123. Kruse B, Narasimhan N & Attardi G. Termination of transcription in human mitochondria, identification and purification of a DNA binding protein factor that promotes termination // Cell. 1989; V. 58 P.391-397.

124. Kubota N, Hayashi J, Inada T, Iwamura Y. Induction of a particular deletion in mitochondrial DNA by X rays depends on the inherentradiosensitivity of the cells // Radiat Res. 1997 Oct; V. 148(4) P.395-8

125. Kurland CG, Andersson SGE: Origin and evolution of the mitochondrial proteome // Microbiol Mol Biol Rev. 2000; V. 64 P.786-820

126. Lang BF, Gray MW & Burger G. Mitochondrial genome evolution and the origin of eukaryotes //Annu Rev Genet. 1999; V.33 P.351-397.

127. Larsson NG, Wang JM, Wilhelmsson H, Oldfors A, Rustin P, Lewandoski M, Barsh GS & Clayton DA. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice // Nat Genet. 1998; V.l P.231-236.

128. Lecrenier N & Foury F. New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man // Gene. 2000; V.246 P.37^18.

129. Lee DY & Clayton D. Properties of a primer RNA-DNA hybrid at the mouse mitochondrial DNA leading-strand origin of replication // J Biol Chem. 1996; V.271 P.24262-24269.

130. Lefai E, Fernández-Moreno MA, Alahari A, Kaguni LS & Garesse R. Differential regulation of the catalytic and accessory subunit genes of Drosophila mitochondrial DNA polymerase // J Biol Chem. 2000; V. 275 P.33123-33133.

131. Lightowlers RN, Chinnery PF, Turnbull DM, Howell N. Mammalian mitochondrial genetics: heredity, heteroplasmy and disease // Trends Genet. 1997 Nov; V.13(ll) P.450-455.

132. Levin J.D., Demple B. In vitro detection of endonuclease IV-specific DNA damage formed by bleomycin in vivo// Nucleic Acid Research. 1996; V. 25(5) P.885-889.

133. Lim SE, Longley MJ & Copeland WC. The mitochondrial p55 accessory subunit of human DNA polymerase gamma enhances DNA binding, promotes processive DNA synthesis, and confers N-ethylmaleimide resistance // J Biol Chem. 1999; V.274 P.3 8197-3 8203.

134. Loguercio-Polosa P & Attardi G. Distinctive pattern and transcriptional control of mitochondrial protein synthesis in rat brain synaptic endings // J Biol Chem. 1991; V.266 P. 10011-10017.

135. Longley MJ, Nguyen D, Kunkel TA & Copeland WC. The fidelity of human DNA polymerase gamma with and without exonucleolytic proofreading and the p55 accessory subunit // J Biol Chem. 2001; V.276 P.38555-38562.

136. López-García P Moreira D: Metabolic symbiosis at the origin of eukaryotes // Trends Biochem Sei. 1999; V. 24 P.88-93.

137. Low RL, Gerschenson M. Endonuclease G isolation and assays.// Methods Mol Biol. 2002 V.197 P. 331-49.

138. McCulloch V, Seidel-Rogol BL & Shadel GS. A human mitochondrialtranscription factor is related to RNA adenine methyltransferases and binds s-adenosylmethionine // Mol Cell Biol. 2002; V.22 P.l 116-1125.

139. Madsen CS Ghivizzani SC & Hauswirth WW. Protein binding to a single termination-associated sequence in the mitochondrial DNA D-loop region //Mol Cell Biol. 1993; V.13 P. 2162-2171.

140. Marcelino LA, Thilly WG. Mitochondrial mutagenesis in human cells and tissues //Mutat Res. 1999 Jul 30; V.434(3) P.177-203

141. Marchington DR, Macaulay V, Hartshorne GM, Barlow D & Poulton J. Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease // Am J Hum Genet. 1998; V. 63 P.769-775.

142. Martin W, Herrmann RG: Gene transfer from organelles to the nucleus: how much, what happens, and why? Plant Physiol 1998,118:9-17

143. McFarland R, Clark KM, Morris AA, Taylor RW, Macphail S, Lightowlers RN, Turnbull DM. Multiple neonatal deaths due to a homoplasmic mitochondrial DNA mutation // Nat Genet. 2002 Feb; V.30(2) P. 145-6. Epub 2002 Jan 22

144. McHugh MM, Beerman TA. C-1027-induced alterations in Epstein-Barr viral DNA replication in latently infected cultured human Raji cells: relationship to DNA damage // Biochemistry. 1999 May 25; V.38(21) P.6962-70

145. Mehendale HM, Roth RA, Gandolfi AJ, Klaunig JE, Lemasters JJ. Novel mechanisms in chemically induced hepatotoxicity // FASEB J. 1994; V.8 P. 1285-95

146. Michikawa Y, Mazzucchelli F, Bresolin N, Scarlato G & Attardi G .Aging-dependent large accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication // Science. 1999; V.286 P.774-779.

147. Micol V, Fernández-Silva P & Attardi G. Isolation and assay of mitochondrial transcription termination factor from human cells // Methods Enzymol. 1996; V.264 P.158-173.

148. Micol V, Fernández-Silva P & Attardi G. Functional analysis of in vivo and in organello footprinting of HeLa cell mitochondrial DNA in relationship to ATP and ethidium bromide effects on transcription // J Biol Chem. 1997; V. 272 P.18896—18904.

149. Miyakawa I, Sando N, Kawano S, Nakamura S & Kuroiwa T. Isolation of morphologically intact mitochondrial nucleoids from the yeast, Saccharomyces cerevisiae // J Cell Sci. 1987; V. 88 P.431-439.

150. Montoya J, Christianson T, Levens D, Rabinowitz M & Attardi G. Identification of initiation sites for heavy strand and light strand transcription in human mitochondrial DNA // Proc Natl Acad Sci USA. 1982; V. 79 P.71957199.

151. Montoya J, Gaines GL & Attardi G. The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units // Cell.1983; V.34 P.151-159.

152. Montoya J, Ojala D & Attardi G. Distinctive features of the 5,-terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs // Nature. 1981; V. 290 P.465-470.

153. Montoya J, Perez-Martos A, Garstka HL & Wiesner RJ. Regulation of mitochondrial transcription by mitochondrial transcription factor A // Mol Cell Biochem. 1997; V.174 P. 227-230.

154. Moraes CT. What regulates mitochondrial DNA copy number in animal cells?// Trends Genet. 2001; V. 17 P. 199-205.

155. Moraes CT, Kenyon L & Hao HL. Mechanisms of human mitochondrial DNA maintenance, the determining role of primary sequence and length over function // Mol Biol Cell. 1999; V.10 P.3345-3356.

156. Morgan M.A., Hecht S.M. Iron(II)-bleomycin-mediated degradation of a DNA-RNA heteroduplex //Biochemistry. 1994; V. 33 P. 10286-10293.

157. Mutvei A, Kuzela S & Nelson BD. Control of mitochondrial transcription by thyroid hormone// Eur J Biochem. 1989; V.180 P.235-240.

158. Nagaike T, Suzuki T, Tomari Y, Takemotohori C, Negayama F, Watanabe K & Ueda T. Identification and characterization of mammalian mitochondrial tRNA nucleotidyltransferases // J Biol Chem.2001; V.276 P.40041-40049.

159. Nass MMK & Nass S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics // J Cell Biol. 1963; V. 19 P.593-629.

160. Newmeyer DD, Farschon DM, Reed JC. Cell-free apoptosis in Xenopus egg extracts: inhibition by Bcl-2 and require-ment for an organelle fraction enriched in mitochondria // Cell 1994; V. 79 P.353-64.

161. Nishino I, Spinazzola A & Hirano M. Thymidine phosphorylase gene mutations in MNGIE, a human mitochondrial disorder // Science. 1999; V. 283 P.689-692.

162. Ojala D, Montoya J & Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria // Nature. 1981; V.290 P.470-474.

163. Ostronoff LK, Izquierdo JM, Enriquez JA, Montoya J & Cuezva JM. Transient activation of mitochondrial translation regulates the expression of the mitochondrial genome during mammalian mitochondrial differentiation // Biochem J. 1996; V. 316 P.183-191.

164. Overly CC, Rieff HI & Hollenbeck PJ. Organelle motility and metabolism in axons vs dendrites of cultured hippocampal neurons // J Cell Sei.1996; V. 109 P. 971-980.

165. Ohsato T, Ishihara N, Muta T, Umeda S, Ikeda S, Mihara K, Hamasaki N, Kang D. Mammalian mitochondrial endonuclease G. Digestion of R-loops and localization in intermembrane space //Eur J Biochem. 2002 Dec; V.269(23) P.5765-70

166. Ozawa T. Genetic and functional changes in mitochondria associated with aging // Physiol. Rev. 1997; V.77 P.425-464.

167. Papa S, Sardanelli AM, Scacco S & Technikova-Dobrova Z. cAMP-dependent protein kinase and phosphoproteins in mammalian mitochondria. An extension of the cAMP-mediated intracellular signal transduction // FEBS Lett. 1999; V.444 P.245-249.

168. Parisi MA & Clayton DA. Similarity of human mitochondrial transcription factor 1 to high mobility group proteins // Science. 1991; V.252 P.965-969.

169. Patrushev MV, Patrusheva VE, Kasymov VA, Evdokimovski EV, Ushakova TE, Gaziev AI .The mtDNA Release and Activation of its Replication in Tissues of Irradiated Mice // Tsitologiia.2006; V. 48 (8) P.684-688.

170. Penta JS, Johnson FM, Wachsman JT & Copeland C. Mitochondrial DNA in human malignancy // Mutat Res. 2001; V.488 P.l 19-133.

171. Perez-Jannotti RM, Klein SM & Bogenhagen DF. Two forms of mitochondrial DNA ligase III are produced in Xenopus laevis oocytes // J Biol Chem. 2001; V.276 P.48978-18987.

172. Perez GI, Trbovich AM, Gosden RG, Tilly JL. Mitochondria and the death of oocytes //Nature. 2000 Feb 3; V.403(6769) P.500-1

173. Petrolini N, Vanelli M, Chiari G, De Fanti A, Boselli E, Cantoni S. Some clinical, psycho-emotional and cognitive aspects in insulin- dependent diabetic young patients at the end of educative camps Minerva Pediatr. 1994 May; V.46(5) P.239-43.

174. Pfaffl MW A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR //Nucleic Acid Research.2001; V. 29(9) P. 2002-2007

175. Philippe H, Germot A, Moreira D: The new phylogeny of eukaryotes // Curr Opin Genet.2000 Dev; V. 10 P.596-601.

176. Piko L, Hougham AJ, Bulpitt KJ. Studies of sequence heterogeneity of mitochondrial DNA from rat and mouse tissues: evidence for an increased frequency of deletions/additions with aging // Mech Ageing Dev. 1988 Jun; V.43(3) P.279-93

177. Pinz KG & Bogenhagen DF. Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes // Mol Cell Biol. 1998; V.18 P.1257-1265.

178. Prats E, Noel M, Letourneau J, Tiranti V, Vaque J, Debon R, Zeviani M, Cornudella L, Ruiz-Carrillo A. Characterization and expression of the mouse endonuclease G gene // DNA Cell Biol. 1997 Sep; V.16(9) P.l 111-22

179. Preiss T, Sang AE, Chrzanowska-Lightowlers ZM & Lightowlers RN.

180. The mRNA-binding protein COLBP is glutamate dehydrogenase // FEBS Lett. 1995; V.367 P.291-296.

181. Prieto-Martin A, Montoya J & Martinez-Azorin F. A study on the human mitochondrial RNA polymerase activity points to existence of a transcription factor B-like protein // FEBS Lett. 2002; V.503 P.51-55.

182. Puranam RS & Attardi G. The RNase P associated with HeLa cell mitochondria contains an essential RNA component identical in sequence to that of the nuclear RNase P // Mol Cell Biol. 2001; V.21 P.548-561.

183. Prats E, Noel M, Letourneau J, Tiranti V, Vaque J, Debon R, Zeviani M, Cornudella L, Ruiz-Carrillo A. Characterization and expression of the mouse endonuclease G gene // DNA Cell Biol. 1997 Sep; V.16(9) P.l 111-22

184. Raha S., RobinsonB. Mitochondria, oxygen free redicals, and apoptosis // Amer. J. Med. Genet.2001;V.106 P.62-70.

185. Ravagnan L, Roumier T, Kroemer G. Mitochondria, the killer organelles and their weapons.//J Cell Physiol. 2002 V. 192(2) P. 131-7.

186. Rossmanith W, Tullo A, Potuschak T, Karwan R & Sbisa E. Human mitochondrial tRNA processing // J Biol Chem. 1995; V.270 P. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. 12885-12891.

187. Richter C, Park JW, Ames BN. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive.//Proc Natl Acad Sei USA. 1988 V. 85(17) P. 6465-6467.

188. Scarpulla RC. Nuclear control of respiratory chain expression in mammalian cells // J Bioenerg Biomembr. 1997; V. 29 P.109-119.

189. Scarpulla RC. Nuclear activators and coactivators in mammalian mitochondrial biogenesis // Biochim Biophys Acta. 2002; V.1576 P.l-14.

190. Schultz RA, Swoap SJ, McDaniel LD, Zhang B, Koon EC, Garry DJ, Li K & Williams RS. Differential expression of mitochondrial DNA replication factors in mammalian tissues // J Biol Chem. 1998; V. 273 P.3447-3451.

191. Schwartz M & Vissing J . Paternal inheritance of mitochondrial DNA // N Engl J Med. 2002; V. 347 P.576-580.

192. Shadel GS & Clayton DA. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates // Annu Rev Biochem. 1997; V. 66 P.409-435.

193. Shang J & Clayton DA. Human mitochondrial transcription termination exhibits RNA polymerase independence and biased bipolarity in vitro // J Biol Chem. 1994; V. 269 P. 29112-29120.

194. Shay JW, Pierce DJ & Werbin H. Mitochondrial DNA copy number is proportional to total cell DNA under variety of growth conditions // J Biol Chem. 1990; V. 264 P. 14802-14807.

195. Shen EL & Bogenhagen DF. Developmentally-regulated packaging of mitochondrial DNA by the HMG-box protein mtTFA during Xenopus oogenesis // Nucleic Acids Res. 2001; V. 29 P.2822-2828.

196. Shoubridge EA . The ABCs of mitochondrial transcription // Nat Genet. 2002; V.31 P. 227-228.

197. Shoubridge EA. Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation // Hum Mol Genet. 2001 Oct 1; V. 10(20) P.2277-84

198. Shoubridge EA. Mitochondrial DNA segregation in the developing embryo // Hum Reprod. 2000 Jul;V.15 (1 2) P.229-234.

199. Shuster RC, Rubenstein AJ & Wallace DC. Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells // Biochem Biophys Res Commun. 1988; V. 155 P. 1360-1365.

200. Silva JP, Larsson NG. Manipulation of mitochondrial DNA gene expression in the mouse // Biochim Biophys Acta. 2002 Sep 10; V.1555(l-3) P.106-10

201. Steighner R.J., Povirk L.F. Bleomycin-induced DNA lesions at mutational hot spots: implications for the mechanism of double strand damage // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990; V. 87 P. 8350-8354

202. Stoneking M. Mitochondrial DNA and human evolution // J Bioenerg Biomembr. 1994; V. 26 P.251-259.

203. Sutovsky P, Moreno RD, Ramalho-Santos J, Dominko T, Simerly C & Schatten G. Ubiquitinated sperm mitochondria, selective proteolysis, and the regulation of mitochondrial inheritance in mammalian embryos // Biol Reprod. 2000; V. 63 P.582-590.

204. Sutovsky P, Moreno RD & Schatten G. Ubiquitin tag for sperm mitochondria //Nature. 1999; V.402 P.371.

205. Szabo I, Zoratti M. The giant channel of the inner mitochondrial membrane is inhibited by cyclosporin A // J Biol Chem. 1991 Feb 25; V.266(6) P.3376-9.

206. Taanman JW. The mitochondrial genome, structure, transcription, translation and replication // Biochim Biophys Acta. 1999; V.1410 P. 103-123.

207. Takamatsu C, Umeda S, Ohsato T, Ohno T, Abe Y, Fukuoh A, Shinagawa H, Hamasaki N & Kang DC. Regulation of mitochondrial D-loops by transcription factor A and single-stranded DNA-binding prote 2002

208. Takeshita M., Grollman A., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Interaction of bleomycin with DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978; V. 75 P. 5983-5987.

209. Tang YY, Schon EA, Wilichowski E, Vazquezmemije ME, Davidson E & King MP. Rearrangements of human mitochondrial DNA (mtDNA), new insights into the regulation of mtDNA copy number and gene expression // Mol Biol Cell. 2000; V.l 1 P.1471-1485.

210. Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease I I Science 1995; V. 267 P. 1456-62.

211. Turner C, Killoran C, Thomas NS, Rosenberg M, Chuzhanova NA, Johnston J, Kernel Y, Cooper DN, Biesecker LG. Human genetic disease caused by de novo mitochondrial-nuclear DNA transfer.// Hum Genet. 2003 V. 112 P. 303-9.

212. Vander Heiden MG, Chandel NS, Schumacker PT, Thompson CB. Bcl-xL prevents cell death following growth factor withdrawal by facilitating mitochondrial ATP/ADP exchange //Mol Cell. 1999 Feb; V.3(2) P.159-67/

213. Wallace DC. Mouse models for mitochondrial disease // Am J Med Genet. 2001 Spring; V. 106(1) P.71-93

214. Van Dyck E, Foury F, Stillman B & Brill SJ. A single-stranded DNA binding protein required for mitochondrial DNA replication in S. cerevisiae is homologous to E. coli SSB // EMBO J. 1992; V.l 1 P.3421-3430.

215. Vanltallie CM. Thyroid hormone and dexamethasone increase the levels of a messenger ribonucleic acid for a mitochondrially encoded subunit but not for a nuclear-encoded subunit cytocrome c oxidase // Endocrinology. 1990; V.127 P.55-62.

216. Van Loo The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet //Cell Death Differ. 2002 Oct; V.9(10) P.1031-42.

217. Walberg MW & Clayton DA. Sequence and properties of the human KBcell and mouse L cell D-loop regions of mitochondrial DNA // Nucleic Acids Res. 1981; V.9P.5411-5421.

218. Walberg MW & Clayton DA. In vitro transcription of human mitochondrial DNA, identification of specific light strand transcripts from the displacement loop region // J Biol Chem. 1983; V.258 P.1268-1275.

219. Wallace DC. Diseases of the mitochondrial DNA // Annu Rev Biochem. 1992; V.61P 1175-1212.

220. Wallace DC. Mitochondrial DNA in aging and disease // Sei Am. 1997; V. 277 P. 40-47.

221. Wallace DC, Brown MD & Lott MT. Mitochondrial DNA variation in human evolution and disease // Gene. 1999; V.238 P.211-230.

222. Weber K, Bruck P, Mikes Z, Kupper JH, Klingenspor M & Wiesner RJ. Glucocorticoid hormone stimulates mitochondrial biogenesis specifically in skeletal muscle // Endocrinology. 2002; V. 143 P. 177-184.

223. Wiesner RJ, Aschenbrenner V, Ruegg JC & Zak R. Coordination of nuclear and mitochondrial gene expression during the development of cardiac hypertrophy in rats // Am J Physiol. 1994; V. 267 P.229-235.

224. Wiesner RJ, Kurowski TT & Zak R. Regulation by thyroid hormones of nuclear and mitochondrial genes encoding subunits of cytochrome-c oxidase in rat liver and skeletal muscle // Mol Endocrinol. 1992; V.6 P.1458-1467.

225. Wiesner RJ, Ruegg JC & Morano I. Counting target molecules by exponential polymerase chain reaction, copy number of mitochondrial DNA in rat tissues // Biochim Biophys Acta. 1992; V. 183 P.553-559.

226. Wilkinson R., Hawks A., Peggy A.E. Methylation of rat liver mitochondrial DNA by chemical carcinogens and associated alterations in physical properties // Chem-Biol. Interact.1975; V.10 P.157-167.

227. Williams RS. Mitochondrial gene expression in mammalian striated muscle. Evidence that variation in gene dosage is the major regulatory event // J Biol Chem. 1986; V.261 P. 12390-12394.

228. Winderlich V., Tetzlaff I., Graffi A. Studies on nitrosodimethylamine: preferential methylation of mitochondrial DNA in rats and hamsters // Chem.-Biol. Interact. 1972; V. 4 P. 81-89.

229. Winderlich V., Schutt M., Bottger M., graffi A. Preferential alkylation of mitochondrial deoxyribonucleic acid by N-methyl-N-nitrosourea // Biochem.J.1970; V. 118 P.99-109.

230. Wolstenholme DR. Animal mitochondrial DNA, structure and evolution //IntRev Cytol. 1992; V.141 P. 173-216.

231. Wong TW & Clayton DA. In vitro replication of human mitochondrial

232. DNA, accurate initiation at the origin of light-strand synthesis //Cell. 1985; V.42 P.952-958.

233. Wong TW & Clayton DA. DNA primase of human mitochondria is associated with structural RNA that is essential for enzymatic activity // Cell. 1986; V.45 P.817-825.

234. Xu BJ & Clayton DA. Assignment of a yeast protein necessary for mitochondrial transcription initiation // Nucleic Acids Res. 1992; V. 20 P. 10531059.

235. Xu BJ & Clayton DA. RNA-DNA hybrid formation at the human mitochondrial heavy-strand origin ceases at replication start sites. An implication for RNA-DNA hybrids serving as primers // EMBO J. 1996; V.15 P.3135-3143.

236. Yaffe MP. Dynamic mitochondria // Nat Cell Biol. 2004 Oct; V.l(6) P. 149-50.

237. Yoza BK & Bogenhagen DF. Identification and in vitro capping of a primary transcript of human mitochondrial DNA // J Biol Chem.1984; V.259 P.3909-3915.

238. Zeviani M & Antozzi C. Mitochondrial disorders // Mol Hum Reprod. 1997; V.3 P.133-148.

239. Zhang HL, Barcelo JM, Lee B, Kohlhagen G, Zimonjic DB, Popescu NC & Pommier Y. Human mitochondrial topoisomerase I // Proc Nat Acad Sei U S A. 2001; V.98 P.10608-10613.

240. Zhou B.S., Elledge S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective //Nature.2000; V. 408 P. 433-439.

241. Zhou BB, Elledge SJ. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective // Nature. 2000 Nov 23; V.408(6811) P.433-9

242. Zhu W, Cowie A, Wasfy GW, Penn LZ, Leber B. Bcl-2 mutants with restricted subcellular localization reveal spatially distinct pathways for apoptosis in different cell types // EMBO J.1996; V. 15 P.4130- 41.

243. Zorov DB, Krasnikov BF, Kuzminova AE, Vysokikh MYu, Zorova LD. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria.// Biosci Rep. 1997 V. 17(6) P.507-20.

244. Список работ по теме диссертации1. Статьи

245. Patrushev M, Kasymov V, Patrusheva V, Ushakova T, Gogvadze V, Gaziev A. Mitochondrial permeability transition triggers the release of mtDNA fragments. // Cell Mol Life Sci., 2004, V.61, P. 3100-3103

246. Patrushev M, Kasymov V, Patrusheva V, Ushakova T, Gogvadze V, Gaziev AI. Release of mitochondrial DNA fragments from brain mitochondria of irradiated mice. // Mitochondrion. 2006 V.6 P. 43-7

247. Патрушев M.B., Патрушева B.E., Касымов B.A., Евдокимовский Э.В., Ушакова Т.Е., Газиев А.И. Элиминация мтДНК из митохондрий и активация ее репликации в клетках тканей облученных мышей. // Цитология, 2006, том 48, вып. 8, стр. 684-6951. Тезисы докладов

Информация о работе

Патрушев, Максим Владимирович
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы