Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R

Полесская, Оксана Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R"

На правах рукописи

Полесская Оксана Олеговна

Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5НТ2А-Ы

03.00.26-Молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики Российской Академии Наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук Поляков Александр Владимирович Доктор биологических наук, профессор, Носиков Валерий Вячеславович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 22 декабря 2003 г. в 11 час. на заседании Диссертационного Совета Д. 001.016.01 при Государственном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН. Автореферат разослан / £ Ка 2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, д.б.н., проф. Л.Ф.Курило

'\f4\Y

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К сложионаслсдуемым заболеваниям относят такие важные и широко распространенные заболевания, как диабет, астма и большинство психических нарушений. Считается, что такие заболевания проявляюгся в результате патогенного сочетания часто встречающихся в популяции полиморфных вариантов кандидатиых генов в комплексе с воздействиями внешней среды. Функциональная значимость таких полиморфных вариантов может быть исследована на образцах тканей, функционально важных для изучаемого сложнонаследуемого заболевания. В заболеваниях со сложным рисунком наследования, как правило, не наблюдается ярко выраженного нарушения функции изучаемого гена. В случае молчащих замен это предполагает небольшие изменения в экспрессии гена. Для их выявления необходимо использовать высоко чувствительные методы измерения. Разработка таких методов является актуальной задачей современной молекулярной генетики. Ген 5НТ2А-Я является одним из главных кандидатных генов для такого распространенного и тяжелого сложнонаследуемого заболевания, как шизофрения. К настоящему времени можно считать установленной ассоциацию синонимического полиморфного варианта (102)С/(-1438)С (аллель С) с шизофренией. Однако механизм, лежащий в основе этой ассоциации, до сих пор неизвестен. Выяснение функциональной роли рецептора 5НТ2А в развитии шизофрении и механизма, лежащего в основе ассоциации названного полиморфного варианта с шизофренией, необходимо для выяснения биохимической природы заболевания и будет способствовать разработке более точной его диагностики и более эффективных методов лечения.

Цель работы: разработать методы измерения экспрессии аллельных вариантов гена, не связанных со структурными изменениями белка, на примере анализа полиморфных вариантов гена рецептора 5НТ2А у здоровых людей и при шизофрении.

Основные задачи:

1. Разработать методические подходы для определения уровня экспрессии гена в зависимости от его аплельного состояния.

2. Измерить уровень общей экспрессии гена 5НТ2А-11 в норме и при заболевании.

3. Изучить экспрессию аллельных вариантов гена 5НТ2А-Я в норме и при заболевании.

4. Разработать методы для определения степени метилирования как возможного механизма регуляции экспрессии метилирования полиморфных сайтов гена 5НТ2А-И

лени

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ [ БИБЛИОТЕКА С. Петербург | 09 ТОО>

!рч»г V"? 1 !

Новизна результатов исследования. 13 настоящем исследовании разработаны методические подходы, позволяющие с высокой точностью измерять экспрессию аллельных вариантов гена, а также уровень метилирования определенных сайтов у гетерозиготных индивидов. Также была разработана новая методика определения степени деградации РНК в аутопсийных образцах мозга. При помощи этих методов, а также модификаций стандартных методов в работе был проведен анализ функциональной роли разных аллелей гена рецептора серотонина типа 2А (5НТ2А-Я). Впервые в практике исследований этого рецептора была измерена экспрессия кодирующего его гена в аутопсийных тканях мозга пациентов, страдавших шизофренией, и здоровых индивидов. Впервые проведено измерение степени метилирования полиморфных сайтов аллеля С гена 5НТ2А-К. На основе данных, полученных в настоящей работе, предложена новая гипотеза, которая описывает один из возможных молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена 5НТ2А-Я, вовлеченных в развитие связанных с ним психических заболеваний.

Практическая значимость работы. Разработаны методические подходы к функциональному анализу полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям. Получены новые данные, раскрывающие функциональную роль рецептора серотонина 5НТ2А и его полиморфных вариантов в развитии шизофрении и, таким образом, проясняющие природу этого сложнонаследуемого заболевания. Поскольку рецептор 5НТ2А и серотониновая система в целом являются мишенями воздействия нейролептиков, полученные данные о дифференциальной экспрессии аллельных вариантов гена 5НТ2А-Я открывают возможности для разработки новых лекарств, а также оптимизации применения уже существующих препаратов в зависимости от генотипа пациента.

Положения, выносимые на защиту:

1. Новые методы, разработанные в данной работе, позволяют проводить измерение относительной экспрессии аллелей в гетерозиготных индивидах и определение общего уровня экспрессии гена 5НТ2А-Я в аутопсийных образцах мозга.

2. Общий уровень экспрессии гена 5НТ2А-Я снижен в тканях мозга больных шизофренией но сравнению со здоровыми индивидами.

3. Уровень экспрессии аллельного варианта 102С/-1438С гена 5НТ2А-Я ниже, чем уровень экспрессии аллельного варианта 102Т/-1438А.

4. Аллельный вариант 102С/-14380 обладает двумя дополнительными по сравнению с аллельным вариантом 102Т/-1438А сайтами метилирования. Эти сайты метилированы в ДНК клеток головного мозга.

Публикации. По материалам исследования опубликовано пять печатных

работ.

Личное участие автора. Все научные результаты, положенные в основу диссертации, получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Из работ, сделанных в соавторстве, в диссертацию вошли только те результаты, в получении которых автор принимал непосредственное творческое участие.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах Института молекулярной генетики РАН, на Ученом Совете Медико-генетического научного центра РАМН, на собрании American College of Neuropsyhopharmacology в 2000 году (Пуэрто-Рико) и на ежегодных конференциях Society of Biological Psychiatry в 2001 г. (Новый Орлеан, США) и 2002 г. (Филадельфия, США).

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы». Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 27 иллюстраций и 7 таблиц. Список использованной литературы содержит 239 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность работы, определены цель и задачи исследований, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, дано краткое изложение содержания работы.

В первой главе дан обзор современной литературы. В обзоре шизофрения рассматривается как сложнонаследуемое заболевание; на примере шизофрении обсуждаются методические подходы к поиску генов, вовлеченных в развитие сложнонаследуемых заболеваний. Рассматриваются подходы к диагностике, лечению и исследованию причин возникновения шизофрении; обсуждаются возникающие при этом методологические сложности и способы их разрешения. Рассматриваются сложившиеся к настоящему времени представления о роли серотониновой системы и различных ее компонентов в норме и при развитии психических заболеваний. Особое внимание уделяется функциональной роли рецептора 5НТ2А, ген которого является одним из основных кандидатных генов для шизофрении. Также дан обзор современных взглядов на эпигенетические механизмы, которые участвуют в обеспечении специфичности экспрессии генома и могут участвовать в развитии сложнонаследуемых заболеваний, рассматривается роль метилирования в регуляции экспрессии генов.

Во второй главе изложены материалы и методы, использованные при

выполнении работы; в третьей главе приводятся результаты исследований и их обсуждение в свете современных исследований. В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы тканей

Образцы тканей мозга человека. Использованы замороженные ткани мозга больных шизофренией (38 образцов) и здоровых людей (35 образцов), полученные из Института Мозга (Санкт-Петербург. Россия), Mount Sinai Schizophrenia Brain Bank (США) и Stanley Foundation Consortium (США). Условия взятия и хранения тканей, критерии постановки диагноза и демографические характеристики этих образцов были описаны в работах: Hernandez et a!., Neurosci. Res. 1997; Sokolov et al., Biol. Psych. 2000; Torrey, Webster et al., Schizoph. Res. 2000. Пациенты не являлись родственниками и относились к белой расе. Больные шизофренией были отобраны по стандартным диагностическим критериям DSM-IIIR, DSM-IV. Здоровые индивиды не имели психических расстройств в анамнезе.

Образцы мышиного мозга. Для модельных экспериментов на мышином мозге использовали самцов линии C57BL/J6 в возрасте трех месяцев. Животные умерщвлялись посредством дислокации шейных позвонков, целый мозг извлекался, ополаскивался в физрастворе и замораживался на бане из сухого льда (-70°С). Для изучения кинетики деградации РНК умерщвленные животные выдерживались при +4°С в течение различных периодов времени or 0 до 121 часа.

Выделение РНК, геномной ДНК и тотального белка. Получение кДНК.

ДНК и РНК выделяли из 200-500 мг ткани, используя TRI-Reagent (MRC, Cincinnati) в соответствии с протоколами изготовителя. 5 мкг тотальной РНК обрабатывали ДНКазой (Gibco BRL) и проводили обратную транскрипцию при помощи набора реактивов SuperScript System (Gibco BRL) по протоколу изготовителя. Белковый экстракт получали, гомогенизируя при комнатной температуре 100 мг ткани в 500 мкл буфера Лэммли. Полученный экстракт центрифугировали 10 мин при 15000 g, супернатант использовали для дальнейшего анализа.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 7.5% полиакриламидном геле на приборе Bio-Rad Minigel в течение 80 мин. при напряжении 70В. Гель окрашивали в 0,01% растворе красителя SYBR Green (FMC, Rockland, Maine) в течение 30 мин. Оптическую плотность полос в геле измеряли при помощи флуоресцентной денситометрии на сканере Storm 800 (Molecular Dynamics).

Генотипирование по полиморфизму С(102)Т проводили путем амплификации фрагмента гена 5HT2A-R длиной 327 нт при помощи стандартного набора реактивов PCR Gold (Gibco BRL). Условия проведения Г1ЦР: 20 нг ДНК в 10 мкл реакционной смеси, 25 циклов (94°С - 30 сек., 60°С - 30 сек., 72°С - 30 сек.). Специфичность продукта подтверждали секвенированием. Продукт амплификации расщепляли эндонуклеазой Hpall (New England BioLabs Inc.). В случае аллеля Т продукт амплификации оставался полноразмерным, а в случае аллеля С расщеплялся на фрагменты длиной 216 и 111 п.о. Аналогичным образом проводили генотипирование полиморфизма G(-1438)A: полноразмерный продукт 462 п.о. соответствовал А в положении (-1438), а фрагменты 219 и 243 п.о. - G.

Измерение содержания рРНК в образцах мозга проводили при помощи денситометрии (Storm 800, Molecular Dynamics) соответствующих полос рРНК после разделения 2мкг тотальной РНК в 1% агарозном геле и окрашивания бромистым этидием.

Амплификация фрагментов РНК в образцах мышиного мозга. Для амплификации использовали кДНК, полученную, как описано выше, из 5 нг РНК, выделенной из образцов ткани. ПЦР проводили в 10 мкл при помощи набора реактивов PCR Gold (Gibco BRL). Условия проведения ПЦР: 95°С 5 мин, затем 20-28 циклов: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с. Амплифицируемые гены и число циклов: синаптотагмин (24 цикла), фосфатаза РАС-1 (22 цикла), транскрипционный фактор CREM (28 циклов), рецептор серотонина 5НТ2А (28 циклов), фосфатаза РР1 (24 цикла), транскрипционный фактор TSC22 (24 цикла), бета-актин (20 циклов).

Измерение относительного количества мРНК гена 5HT2A-R, экспрессируемого аллелями Т и С в гетерозиготах проводили при помощи RT-ПЦР. кДНК, полученную из 20 нг тотальной РНК, подвергали тем же процедурам, которые были описаны для генотипирования. Отношение количества аллеля С к количеству аллеля Т вычисляли из отношения интенсивности рестрицированных продуктов амплификации кДНК 216 п.о. и 327 п.о., нормализуя его по соотношению таких же продуктов, полученных из геномной ДНК, где исходные количества аллелей заведомо равны.

Измерение количества мРНК гена 5HT2A-R проводили путем одновременной амплификации кДНК 5HT2A-R и бета-актина, как описано ранее (Hernandez, J. Neurosci. Res. 1997), с модификациями.

Вестерн-блотгинг. Тотальный белок (20 мкг/дор) разделяли в 10% ПААГ с 0,1% SDS 1,5 часа при 60 В при 4°С. Электроперенос на мембрану "Immun-Blot PVDF" (Bio-Rad) проводили в течение 1 часа при 300 мА и 4°С. Для детекции использовали антитела против 5НТ2А (Clontech) в разведении 1:2000.

Окрашивали при помощи набора реагентов Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot System (Bio-Rad) в соответствии с протоколом производителя.

Степень метилирования ДНК в гомозиготных (С/С) образцах определяли по соотношению продуктов амплификации ДНК, предварительно не обработанной и обработанной рестриктазой Hpall, чувствительной к метилированию. Геномную ДНК разводили в буфере для Hpall до конечной концентрации 6,7 мкг/мл, затем разделяли на две равные аликвоты, и в одну из них добавляли Hpall в концентрации 20 U/мкг, а в другую равный объем буфера. Обе аликвоты инкубировали 5 час. при 37 С, затем 10 мин. при 95°С. 20 нг обработанной таким образом ДНК амплифицировали в 10 мкл реакционной смеси: 95°С 5 мин, затем 26 циклов (94°С 30 е., 60°С 60 е., 72°С 50 е.), затем 72°С 5 мин. Продукты реакции разделяли электрофорезом в ПААГ. Определение степени метилирования в гетерозиготных (С/Т) образцах ДНК проводили так же, но после ПЦР проводили дополнительную обработку Hpall, чтобы различить аллели С и Т среди продуктов амплификации. Продукт амплификации аллеля Т не расщеплялся Hpall и служил внутренним контролем, по отношению к которому измеряли количество продукта амплификации аллеля С.

Статистический анализ результатов измерений проводили при помощи программы SPSS 8.0. При анализе данных использовали тест Стьюдента, дисперсионный анализ (ANCOVA), регрессионный и корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обзор имеющейся к настоящему времени литературы, посвященной изучению психических заболеваний, показывает, что большинство из них имеет сложную этиологию, включающую генетический компонент, и относится к сложнонаследуемым заболеваниям. Шизофрения, одно из наиболее распространенных и тяжелых психических заболеваний, является одним из центральных объектов изучения в течение многих лет, однако до сих пор остается невыясненным механизм наследования этого заболевания. Выявлены многочисленные кандидатные гены и их полиморфные варианты, обнаруживающие ассоциацию с заболеванием. В последнее время все большее внимание уделяется возможности эпигенетической регуляции генов, вовлеченных в развитие сложнонаследуемых заболеваний, чго помогает объяснить особенности их возникновения и наследования. Фармакологические и другие исследования свидетельствуют, что многие психические нарушения, в том числе шизофрения, могут быть связаны с серотониновой системой нейротрансмиссии и одним из ее ключевых компонентов - рецептором серотонина типа 2А (напр., Morand et al., Biol Psychiatry, 1983 и Soper et al., J Clin Psychopharmacol, 1990). Ранее было показано, что частота встречаемости аллеля

С гена этого рецептора повышена у больных, страдающих шизофренией (напр., Williams et al., Lancet, 1997 и Inayama et al., Am J Med Genet, 1996); связь с частотой встречаемости аллеля С была показана также для отдельных признаков, характеризующих шизофрению, например, для ранней манифестации заболевания и восприимчивости к лечению атипическими нейролептиками (Голимбет и др., Журн. Неврол. Психиатр, им. С.С. Корсакова, 2001). Ранее было показано также, что функция рецепторов серотонина типа 2А снижена в тканях мозга больных шизофренией (Агога et al., J Neural Gen, 1991).

В настоящем исследовании были разработаны методы, позволяющие проводить функциональный анализ полиморфных вариантов генов путем измерения количества транскриптов этих вариантов, а также измерять степень метилирования полиморфных сайтов. При помощи этих методов было проведено экспериментальное исследование экспрессии аллелей гена 5HT2A-R на аутопсийных образцах мозга здоровых людей и больных шизофренией, а также измерен уровень метилирования полиморфных сайтов.

Обоснование правомерности использования RT-ПЦР для измерения уровня экспрессии генов в аутопсийных образцах тканей

Молекулярно-биологические исследования, направленные на выяснение механизмов психических заболеваний, часто проводят на аутопсийном материале. Интерпретация результатов таких исследований осложняется тем, что часть молекул в аутопсийных образцах может быть разрушена, что затрудняет проведение количественных измерений. Сохранность РНК в образце зависит от многих факторов: условий и времени проведения аутопсии, условий хранения ткани, pH мозга и величины промежутка времени между моментом смерти и моментом замораживания образца, называемого постмортальным интервалом (ПМИ). До настоящего времени в литературе сосуществуют противоречивые мнения о воздействии вышеперечисленных факторов на деградацию РНК и об их влиянии на результаты измерений, однако многие авторы полагают, что ПМИ на степени деградации РНК сказывается наиболее сильно (Burke et al., Brain Res Mol Brain Res, 1991).

Чтобы разработать методическую базу использования аутопсийных образцов мозга для измерения РНК, необходимо было выяснить, каково влияние ПМИ на сохранность молекул РНК различной длины и как деградация РНК влияет на точность измерений. Для решения этих вопросов были проведены модельные эксперименты по оценке сохранности РНК в образцах мышиного мозга с различными ПМИ, построена математическая модель деградации молекул разной длины и проведена амплификация РНК различных генов из образцов мозга с разными ПМИ.

Анализ общей деградации РНК проводили на образцах мышиного и человеческого мозга. Степень сохранности РНК оценивали, измеряя содержание 28S и 18S рРНК. В модельном эксперименте умерщвленных самцов мышей оставляли при температуре +4°С на время от 0 до 121 часа. С увеличением ПМИ наблюдалось снижение количества обеих рРНК (рис.1, а, б), что свидетельствовало о наличии в мозге деградации РНК, связанной с ПМИ. Разница в скорости разрушения длинной 28S рРНК и короткой 18S рРНК позволяет использовать их соотношение как количественную характеристику сохранности РНК в образце. Экспериментально наблюдаемое снижение

содержания 28S рРНК, 18S рРНК и их соотношения (рис. 1, б, в) показывает высокую степень корреляции с ПМИ (г = 0.95, р = 0,0001 для 28S; г = 0.94, р = 0,005 для 18S рРНК; г = -0.854, р = 0.003 для соотношения 28S/18S). В образцах человеческого мозга была обнаружена значительная степень разрушения рРНК во всем диапазоне ПМИ (рис.1, в).

Рис. 1. (а) Тотальная РНК, выделенная из мозга мышей, разделенная в 1% агарозном геле. Над дорожками указаны ПМИ. (б) Количество 28S и 18S рРНК в образцах мышиного мозга в зависимости от ПМИ. (б) Соотношение 28S/18S рРНК в образцах мышиного и

человеческого мозга в зависимости от ПМИ.

Более быстрое разрушение РНК в образцах человеческого мозга по сравнению с образцами мышиного мозга может быть связано с различиями в процедуре отбора образца или с разной динамикой охлаждения ткани большого и малого объема. Заметим, что измеренная степень деградации РНК не коррелирует ни с pH мозга, ни со временем хранения замороженного образца.

Для расчета степени деградации молекул РНК, основанном на измерении соотношения 28S/18S, была разработана математическая модель деградации

| 8 S 8

S. у Т у

5 о -

Ï н У S л

т у У Т V

ы о

(ч V I. а п

5000нт 4000 нт —* 3000 HT —g. 2000 ИТ 1000 HT

> - ■*- 28S рРНК <1 Л «SpPHK

* JL

ïf Û. S

ES 25

• 28S pPHK О 18S рРНК

25 60 75 100

ПМИ, 4

со

Г4

v 15

8 05-

O мышиный мозг ф человеческий мозг

25 50 75 100

ПМИ, ч

молекул. Она основана на функции N = /V,, х , где - исходное число молекул данной длины, существовавшее в образце до начала распада; / - длина молекулы в нуклеотидах; q - вероятность разрыва на один нуклеотид, которая и является характеристикой сохранности РНК в образце, зависящей от ПМИ и других факторов, перечисленных выше. Эта модель было продемонстрирует, что эффект ПМИ в большей степени сказывается на длинных молекулах, чем на коротких (рис.2): при одной и той же вероятности разрыва q степень деградации длинных молекул намного выше, чем коротких. Выразив д через измеряемое соотношение Я = 288/188 : ? = (0.923 -1пД)/2844, можно рассчитать диапазон ц для использованных в работе образцов человеческого и мышиного мозга (рис. 2).

диапазон g для человеч. образце» (ПМИ от 7 до 62 часов)

диапазон q для мышиных образцов {ПМИ от 0 до 121 часа)

Рис. 2. Теоретическая зависимость доли неповрежденных молекул (N) разной длины от интенсивности деградации (q). Цифры возле кривых обозначают длину молекул в основаниях. Жирными линиями показаны диапазоны q, соответствующие измеренному соотношению 28S/18S в образцах мышиного и человеческого мозга.

Из этого рисунка видно, например, что в рассчитанном диапазоне для человеческих образцов деградирует от 3 до 15% молекул длиной 500 нт., и от 25 до50% молекул длиной 2000 нт. Из проведенных расчетов следует, что результаты количественного измерения коротких фрагментов молекул (например, при помощи RT-ПЦР) менее чувствительны к деградации образца, чем результаты измерения количества полноразмерных копий (например, при помощи Нозерн-блоттинга), и поэтому в большей степени пригодны для работы с аутонсийными образцами. Для проверки этого положения было при помощи RT-ПЦР измерено содержание коротких фрагментов нескольких РНК в образцах с разными ПМИ. В образцах мышиного мозга были амплифицированы фрагменты

мРНК бета-актина (длина фрагмента 221 нт), рецептора сероюнина 5НТ2А (218 нт), синаптотагмина (397 нт), фосфатаз РАС-1 (165 нт) и РР1 (383 нт), транскрипционных факторов CREM (277 нт) и TSC22 (276 нт). В образцах человеческого мозга были амплифицированы фрагменты мРНК бета-актина (583 нт), рецептора серотонина 5НТ2А (383 нт) и нетранслируемого гена PSZA (562 нт). Регрессионный и корреляционный анализ полученных данных подтвердили, что эффект деградации РНК в используемых в работе образцах мозга не сказывается на измерениях коротких фрагментов РНК. Таким образом, метод RT-ПЦР может быть применен для измерения количества мРНК гена рецептора 5НТ2А на изучаемой выборке.

Методы измерения экспрессии аллелей

Для исследования разницы в количестве транскрипта был разработан метод измерения сравнительной экспрессии аллелей в гетерозиготных индивидах (рис.3).

□¿г

3-АЛЛ

обратная транскрипция

«ДНК

пцр

ШЕ

OED □ ©3

рестрикция

Т/С

т{ 327 нт — 216нт —

Шит —

Ыёш ЬШ ш* «Ж mm

Htm

Генбмняя ^phw

днк мРИК

гяюмш ДНК

I ПЦР

сел

Т"

рестрикция

□3D □ (§3

Рис. 3. Схема измерения относительной экспрессии аллелей, полиморфных по сайту узнавания эндонуклеазы. Приведен фрагмент геля с рестрицированными продуктами амплификации гена 5НТ2А-Я (гетерозиготы).

В гетерозиготах оба аллеля экснрессируются в одной и той же клетке, что гарантирует одинаковые физические и биохимические условия экспрессии. Сравнение экспрессии двух аллелей в одном и том же образце мозга позволяет избежать возможной вариабельности, связанной с демографическими факторами, отбором образцов и неодинаковой да радацией РНК. Суть метода заключается в том, что измеряется отношение полос рестрицированных продуктов амплификации аллеля С и аллеля Т в мРНК, и затем нормируется по соотношению соответствующих полос, полученных из геномной гетерозиготной ДНК, что позволяет избежав артефактов, связанных с разницей в прокрашивании полос и в амплификации аллелей.

Для того чтобы оценить, насколько точными являются измерения количества вещества при помощи ПЦР, был проведен калибровочный эксперимент (рис. 4). Для амплификации использовали клонированные в плазмиде фрагмены аллелей С и Т гена 5НТ2А-11. Плазмидную ДНК, содержащую разные аллели, смешивали в соотношении от 0,5 до 2, затем подвергали ПЦР, обрабатывали рестриктазой Нра11 и измеряли соотношение фрагментов, соотвествующих аллелям С и Т. Данный эксперимент показал, что метод ПЦР позволяет с высокой точностью измерять соотношения аллелей в указанном выше диапазоне.

Исходное соотношение аллелей С и Т 05 07 09 10 1 1 1 3 1S 17 20 Mipupx

T { з27 нем ШтШШШшшЫ'т^ _ »»„„

* ^ЙК Л- е tea W bbd , — 200 П О f ^ *Т vr Ww ^ _ Топи

Г 216 л о— ' { 111 now

Исходное соотношение аллелей С и Т

Рис. 4. Калибровочный эксперимент для оценки аккуратности измерения соотношения аллелей при помощи ПЦР. (а) Фрагмент геля, на который нанесены продукты амплификации смеси аллелей после обработки Hpall. (б) Измерения соотношения оптической плотности полос 216 п. о. и 327 п. о., соответствующих аллелям С и Т.

Для измерения общего количества мРНК была использована модификация стандартного метода. Количество транскрипта гена рецептора серотонина измеряли относительно количества транскрипта гена бета-актина, амплифицировавшихся одновременно в одной реакции. Ген бета-актина является геном домашнего хозяйства, и его экспрессия не зависит or генотипа 5HT2A-R или диагноза. Поскольку мРНК рецептора серотонина представлена низким числом копий, была использована ступенчатая ПЦР.

Экспрессия гена 5HT2A-R у здоровых людей и у больных шизофренией

Из литературы известно, что функция рецепторов серотонина типа 2А снижена в некоторых областях головного мозга больных шизофренией. Нами было проведено сравнение экспрессии гена 5HT2A-R у здоровых людей и у больных шизофренией. Ранее была показана обратная корреляция между временным интервалом от последнего принятия нейролептиков до смерти и уровнем мРНК гена 5HT2A-R (Hernandez et al., J Neurosci Res, 2000). Чтобы исключить эффект терапии на измеряемый параметр, число взятых для эксперимента образцов было ограничено теми пациентами, которые никогда не принимали нейролептиков или не принимали их более 26 недель до смерти. Уровень мРНК гена 5HT2A-R, измеренный по отношению к бета-актину, среди больных шизофренией всех трех генотипов (С/С, С/Т и Т/Т) был ниже, чем среди контролей (р = 0.03) и составил 0,59+0,12 (рис. 5).

Рис. 5. Общая экспрессия гена 5НТ2А-Я у больных, страдающих шизофренией, снижена по сравнению со здоровыми контролями. По оси У отложено количество мРНК гена 5НТ2А-Я, нормализованное к количеству мРНК гена бета-актина. Показана стандартная ошибка измерений.

Заметим, что измерение отдельно для бета-актина не обнаруживает статистически значимых различий для больных шизофренией в сравнении с контролями, что свидетельствует о том, что выявленные различия действительно вызваны изменением экспрессии гена 5НТ2А-Я, а не бета-актина. Эти данные дают основания полагать, нто снижение функции рецепторов 5НТ2А у больных шизофренией обусловлено снижением количества транскрипта гена 5НТ2А^.

При сравнении общей экспрессии мРНК гена 5НТ2А^ среди здоровых индивидов с различными генотипами было обнаружено, что общий уровень мРНК снижается в ряду генотипов Т/Т < С/Т < С/С (рис. 6, а). Различия между гомозиготами С/С и Т/Т были статистически достоверны (р = 0,015). Подробный статистический анализ полученных данных показал, что найденные различия не являются результатом воздействия сопутствующих факторов - таких, как пол,

возраст, pH образцов и постмортальный интервал.

Дополнительный анализ экспрессии рецептора 5НТ2А на белковом уровне был проведен при помощи антител к N-концевой части белка 5НТ2А (рис. 6, б) Было выявлено такое же соотношение между генотипами (С/С < С/Т < Т/Т), что и при анализе количества мРНК. На основании того, что количество белка в образцах с разными генотипами изменяется пропорционально количеству мРНК, было сделано предположение, что транскрипция играет ключевую роль в механизме влияния аллельного состояния гена 5HT2A-R на его функцию.

Рис. 6. Сравнение уровней экспрессии гена 5НТ2А-Я для мРНК и белка в контролях с генотипами Т/Т, С/Т и С/С. (а) Количество мРНК гена 5НТ2А-Я, измеренное по отношению к мРНК бета-актина,, (б) Количество белка 5НТ2А, измеренное при помощи иммунофлуороесцентного окрашивания.

Относительная экспрессия аллелей С и Т гена 5НТ2А-1* у гетерозиготных индивидов

Существуют многочисленные данные об ассоциации между полиморфизмом С(102)Т гена 5НТ2А-Я и различными психическими заболеваниями, в первую очередь, с шизофренией. Этот полиморфизм является молчащей заменой, т.е. полипептиды, кодируемые обоими аллелями, идентичны. В настоящей работе выдвигается гипотеза о том, что аллели С и Т могут различаться по уровню экспрессии гена.

Для измерения относительной экспрессии аллелей была использована РНК из образцов мозга гетерозиготных (С/Т) индивидов (15 от здоровых людей, 16 от больных шизофренией) и геномная ДНК от 25 гетерозиготных индивидов (рис. 7). Чтобы учесть влияние нейролептиков на экспрессию гена 5НТ2А-11 в исследуемых образцах, пациенты были разделены на 2 группы: (1) менее 11

недель между последним приемом нейролептиков и смертью и (2) более 26 недель между последним приемом нейролептиков и смертью. Было обнаружено, что экспрессия аллеля С у здоровых индивидов и у больных шизофренией снижена приблизительно на 20% по сравнению с аллелем Т. Это снижение статистически достоверно (р< 0,001 для контролей, р < 0,001 для первой группы больных и р < 0,02 для второй группы больных)

1.2 •

0.8 •

о 04 -

Э 0.2 •

0.0 •

Геномная ДНК

V-

МРНК

ШШ Геномная ДНК dl Здоровые контроли

щц Больные шизофренией, не получавшие нейролептиков более 26 недель

__ Больные шизофренией, не получавшие нейролептиков менее 11 недель

Рис. 7. Измерение относительной экспрессии аллелей гена 5НТ2А-Н у здоровых индивидов и больных шизофренией. По оси У отложено соотношение аллелей С и Т, нормированное по геномной ДНК. Показана стандартная ошибка измерений.

Проведенные измерения не обнаружили статистически значимой корреляции между количеством мРНК гена рецептора 5НТ2А и такими факторами как возраст, постмортальный интервал, рН мозга и пол.

Таким образом, наши данные согласуются с предположением, что генетическая ассоциация аллеля С гена 5НТ2А-Л с шизофренией обусловлена сниженной экспрессией этого аллеля. В настоящей работе показано, что наличие аллеля С снижает транскрипцию гена 5НТ2А-Я, что, в свою очередь, вызывает снижение уровня белка. Известно, что снижение количества рецептора 5НТ2А является фактором риска для возникновения шизофрении и других психических нарушений. Следовательно, наличие аллеля С может быть фактором риска дл я развития заболевания. Таким образом, представленная работа предлагает подход, связывающий генотип с предрасположенностью к заболеваниям, который основан не на изменении структуры кодируемого этим геном белка, а на количественных изменениях в экспрессии гена.

Метилирование гена 5НТ2А-Я

Одним из механизмов избирательного снижения экспрессии аллеля С может быть дифференциальное метилирование этого аллеля. Известно, что полиморфизмы С(102)Т и С(-1438)А, специфичные для аллеля С, находятся в сцеплении. Сравнение нуклеотидных последовательностей аллелей С и Т выявляет две пары Срв, которые присутствуют в аллеле С, но не в аллеле Т (рис.8). Эти пары формируются в том случае, если в положении (+102) находится С, а в положении (-1438) находится О.

промотор экзон 1

'........... —\г

-1438 II +102 II

Аллель С -- II 1—г.г.аа—, '—васс—

Аллель Т -^- ,—стая—, -(ЗАСС

Рис.8. Схема различий между аллелями Т и С гена 5НТ2А-Я. в полиморфных сайтах А(-1438)С и Т(102)С. Жирным шрифтом выделены полиморфные замены. Подчеркиванием выделены СрС-пары, являющиеся потенциальными сайтами метилирования.

Поскольку пара Срй является мишенью для метилирования, аллель С обладает по сравнению с аллелем Т двумя дополнительными сайтами, которые могут быть метилированы. Известно, что метилирование ДНК тесно связано с транскрипционной активностью хроматина - как правило, с ее понижением. Поэтому можно ожидать, что аллель С, обладающий дополнительными метилированными СрО-сайтами, будет экспрессироваться в меньшей степени, чем аллель Т, не имеющий этих сайтов. В настоящей работе была определена степень метилирования пар СрО, специфичных для аллеля С в образцах геномной ДНК, полученных из тканей мозга здоровых людей и больных шизофренией.

К настоящему времени известно, что метилирование цитозинов как в островках СрО, так и в отдельно стоящих парах СрО, может быть тканеспецифично и влиять на транскрипционную активность генов, определяя компактизацию хроматина или связывание транскрипционных факторов.

Сообщается также, что метилирование отдельно стоящих пар Срв может послужить затравкой для распространения метилирования на соседние области. Сайт метилирования, формируемый полиморфизмом С(102)Т, расположен в первом экзоне гена 5НТ2А-Я, а сайт, формируемый полиморфизмом 0(-1438)А -в промоторной области (рис.8). Анализ последовательности показал, что оба сайта входят в состав отдельно стоящих пар Срв и не затрагивают сайтов узнавания основных известных на настоящее время транскрипционных факторов.

Методы измерения степени метилирования геномной ДНК в СрС-парах, специфичных для аллеля С

Для определения степени метилирования обсуждаемых Срв-пар была применена методика, основанная на использовании рестриктазы, чувствительной к метилированию. Схема экспериментального анализа приведена на рис. 9.

Данный метод основан на том, что Срв-пары,

специфичные для аллеля С, одновременно являются частью последовательности (СЧХЮ), узнаваемой эндонуклеазой НраИ, которая не расщепляет метилированную ДНК. Таким образом, при обработке геномной ДНК этим ферментом расщепляется неметилированный аллель С, а метилированный аллель С остается нерасщсплснн ым. При последующей ПЦР

амплифицируется только

продукт метилированного аллеля Рис. 9. Схема, иллюстрирующая метод с Таким 0бразом, уровень определения степени метилирования ДНК метилирования может быть в гомозиготах (генотип С/С). измерен как доля ДНК,

защищенная от разрезания НраН. В качестве контроля полноты рестрикции использовали заведомо неметилированный плазмидный клон гена 5НТ2А-Я, выделенный из Е.соН.

В гетерозиготных индивидах представляется возможность использовать

Неметилированный Метилированный

аллель С аллель С

ем«» спад а-иза) йюй

Д Рестрикция НраН Д Рестрикция НраИ

с—

_с ОДПЗ —хзрр-ё

» ®> ©

Цпцр £|пцр

Нет продукта амплификации

Продукты амплификации

аллель Т в качестве внутреннего контроля, относительно которого измеряется количество продуктов амплификации метилированного и неметилированного аплеля С. На этом основана впервые разработанная нами методика количественного измерения метилирования в гетерозиготах (рис. 10).

Рестрим*|я НраП

Геномная ДНК

,<81

Рестрикция ПЦР НраО

продукт ампл аллеляТ

продукт ампл метилироа аллеля О

£ Нет продукта амплификации

С-гг .

с •

-ССОО—« -ссто ■

Т -

—СС(Ж—

РеСТрМЩМЯ

ПЦР Нра11

С"» .

не добавлена

продукт ампл аллеляТ

продукт амлл аплеля С

Рис. 10. Схема, иллюстрирующая метод определения степени метилирования ДНК у гетерозиготных индивидов (на примере полиморфизма Т(102)С). Показаны аллель Т и два варианта аллеля С - метилированный и неметилированный. Полиморфный нуклеотид выделен жирным шрифтом.

Такой подход позволяет избежать погрешностей, вносимых ПЦР, так как реакции проходят параллельно в одной пробирке.

Измерение степени метилирования СрС-пар, специфичных для аллеля С

При помощи разработанных методов была измерена степень метилирования в обоих полиморфных сайтах, специфичных для аллеля С.

Для измерения в гомозиготах было использовано 3 образца, полученных от здоровых индивидов и в 2 образца, полученных от больных шизофренией (рис. 11). Было обнаружено, что обе пары Срв, специфичные для аллеля С, метилированы как у здоровых людей, так и у больных шизофренией.

С(-1438)

50 -

С(102)

50 -

| | здоровые

Ц| больные шизофренией

Рис. 11. Уровень метилирования Срй-пар, специфичных для аллеля С, у гомозиготных индивидов.(а) пара СрО, расположенная в промоторной области; (б) пара СрО, расположенная в кодирующей области. По оси У отложен уровень метилирования как доля ДНК, защищенная от разрезания НраН. Показана стандартная ошибка измерений.

Анализ степени метилирования у гетерозигот проводился на 7 образцах ДНК, полученных из мозга здоровых индивидов и 9 образцах из мозга больных шизофренией. Было обнаружено, что степень метилирования пар Срв, расположенных в промоторе, составляет около 100%, а в кодирующей области около 75% этих пар метилированы как у здоровых людей, так и у больных шизофренией (рис. 12). Эти различия статистически значимы (р = 0,0003 для здоровых и р < 0,0001 для больных шизофренией).

0(-1438)

С(102)

ив 100> Б 0> I

I! !

0 X X х

£в Й °

85 50

8.1

8 ¡й

с* йеЪ.

= гс£ 0

гЬ

о и

п= 7

| | здоровые

Д больные шизофренией

Рис. 12. Уровень метилирования Срб-пар, специфичных для аллеля С, у гетерозиготных индивидов. По оси У отложен уровень метилирования как доля ДНК, защищенная от разрезания НраП. Показана стандартная ошибка измерений.

Таким образом, в ДНК головного мозга наблюдается существенное метилирование пар СрО, специфичных для аллеля С, как у здоровых людей, так и у больных шизофренией. Эти результаты согласуются с изложенными выше нашими данными о том, что относительная экспрессия аллеля С у гетерозигот приблизительно одинакова для здоровых людей и больных шизофренией. Не было обнаружено статистически значимой корреляции между степенью метилирования двух изучаемых пар СрО, а также между степенью метилирования этих пар СрО и уровнем экспрессии аллеля С. Это может быть объяснено как действительным отсутствием зависимости, так и недостаточной выборкой или недостаточной чувствительностью методов измерения.

Суммируя полученные нами данные по метилированию аллельных вариантов гена 5НТ2А-11, можно заключить, что обнаруженное в настоящей работе дифференциальное метилирование аллелей этого гена может обуславливать различную экспрессию этих аллелей и таким образом объяснять причину генетической ассоциации полиморфного варианта С(102)/С(-1438) с шизофренией. Генетически определяемые различия в нуклеотидной последовательности аллеля С по сравнению с аллелем Т, приводят к возникновению двух дополнительных сайтов метилирования, что открывает возможность для эпигенетической регуляции экспрессии данного гена. Эта особенность наследования и регуляции одного из важнейших генов серотониновой системы может служить одним из объяснений сложного характера наследования основных психических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы для определения уровня экспрессии гена в зависимости от его аллельного состояния. Высокая чувствительность методов достигается за счет использования внутренних контролей при амплификации.

2. Разработана методика измерения и исследована динамика степени деградации РНК в аутопсийных образцах мозга. Показана возможность изучения экспрессии гена при помощи ЯТ-ПЦР в постмортальных образцах мозга при амплификации коротких (до 600 п.н.) фрагментов.

3. Проведено исследование уровня экспрессии гена 5НТ2А-И. у здоровых людей и больных шизофренией. Показано, что общий уровень транскрипта гена 5НТ2А-Я в аутопсийных тканях мозга больных шизофренией снижен по сравнению со здоровыми людьми. Предложена гипотеза, что известное снижение функции рецептора 5НТ2А у больных шизофренией связано со снижением количества транскрипта этого гена.

4. С помощью разработанных методов проведено изучение уровня

экспрессии аллельных вариантов гена 5HT2A-R. Выявлено снижение уровня экспрессии гена в случае аллельного варианта 102C/-1438G по сравнению с аллельным вариантом 102Т/-1438А. Предложена гипотеза, что известный из литературы небольшой вклад аллельного варианта 102C/-1438G в предрасположенность к шизофрении может быть опосредован обнаруженным в данной работе снижением количества транскрипта этого аллельного варианта.

5. Разработаны методы определения степени метилирования у гомозиготных и гетерозиготных индивидов для гена 5HT2A-R. При помощи этих методов определена степень метилирования пар CpG, специфичных для аллельного варианта 102C/-1438G. Обнаружено, что эти пары CpG частично метилированы в тканях мозга здоровых людей и больных шизофренией. Предложена гипотеза, что обнаруженное в настоящей работе снижение экспрессии аллельного варианта 102C/-1438G обусловлено метилированием специфичных для этого аллельного варианта пар CpG.

Основные результаты диссертации представлены в следующих работах:

1. Polesskaya О.О., Sokolov В.Р. Differential expression of the "С" and "T" alleles of the 5-HT2A receptor gene in the temporal cortex of normal individuals and schizophrenics." J. Neurosci Res. 2002.67(6). P.812-822.

2. Polesskaya O.O., Haroutunian V., Davis K.L., Hernandez I., Sokolov B.P. Novel putative nonprotein-coding RNA gene from llql4 displays decreased expression in brains of patients with schizophrenia. J. Neurosci Res. 2003 . 74(1). P.l 11-122.

3. Sokolov B.P., Polesskaya O.O. Mechanisms of differential expression of the "C" and "T" alleles of the 5-HT2A receptor gene. Possible role for allele specific methylation. Abstract. Society of Biological Psychiatry, 2002 Annual Meeting. Philadelphia7 PA7 May 16-18.

4. Polesskaya O.O., Sokoiov B.P. Low expression of the C(102) allele of the 5-HT2A receptor gene may underlie its association with schizophrenia. Society of Biological Psychiatry, 2001 Annual Meeting, New Orleans, LA, May 3-5, 2001, Biol. Psychiatry. 2001. P.49.

5. Polesskaya O.O., Sokolov B.P. Decreased expression of C(102) allele and a deficit in the 5-HT2A receptor gene expression in schizophrenia. Abstracts, 39th Annual Meeting of American College of Neuropsyhopharmacology, San Juan, Puerto Rico, 2000. Dec. 10-14.

, I

»Î94Î8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полесская, Оксана Олеговна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Серотониновая система нейротрансмиссии

1.1. Серотонин и серотонергические нейроны

1.2. Синтез и деградация серотонина

1.3. Рецепторы серотонина

1.4. Функции серотонина в центральной нервной системе

2. Шизофрения как комплексное заболевание

2.1. Классификация и симптомы шизофрении

2.2. Эпидемиология, патофизиология и этиология шизофрении

2.2.1. Эпидемиология заболевания

2.2.2. Патофизиологические изменения

2.2.3. Этиология шизофрении

2.3. Подходы к обнаружению генов, вовлеченных в развитие шизофрении

2.3.1. Геномные сканы

2.3.2. Изучение кандидатных генов

2.3.3. Генные чипы

2.4. Эпигенетические факторы в возникновении шизофрении

2.5. Биохимические нарушения при шизофрении

2.5.1. МАО

2.5.2. Норэпинефрин (норадреналин)

2.5.3. Ацетилхолин

2.5.4. Глутамат

2.5.5. ГАМК

2.5.6. Дофамин

2.5.7. Серотонин

2.6. Ассоциация полиморфизма Т(102)С в гене серотонинового рецептора 5НТ2А-11 с шизофренией

3. Дифференциальная экспрессия аллелей генов, вовлеченных в шизофрению и другие психические заболевания

4. Эпигенетическая регуляция транскрипции

4.1. Метилирование ДНК

4.2. Структурная организация ДНК

4.3. Порядок событий при ингибировании транскрипции

4.4. Способы анализа степени метилирования ДНК

4.5. Роль эпигенетической регуляции в экспрессии генов

4.5.1. Геномный импринтинг

4.5.2. Абберации в метилировании ДНК при психических нарушениях

5. Методические вопросы.

5.1. Обоснование использования височных долей коры головного мозга для исследования шизофрении

5.2. Методические сложности, связанные с изучением шизофрении

5.3. Влияние постмортального интервала (ПМИ) на сохранность РНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R"

Среди наследственных заболеваний людей особое место занимают сложнонаследуемые (комплексные) заболевания. Эти заболеваия характеризуются сложными рисунками наследования, для которых до сих пор не удалось найти таких генетических моделей, которые бы удовлетворительно их объясняли. К этому классу заболеваний относится значительное количество психических нарушений, в том числе шизофрения.

Исследование механизмов, лежащих в основе сложнонаследуемых заболеваний, и, в частности, шизофрении, является одним из приоритетных направлений современной медицины. В настоящее время полагают, что нарушения, приводящие к развитию комплексных заболеваний, происходят в результате небольших генетических, молекулярных и анатомических изменений, которые в совокупности приводят к развитию заболевания.

Современные подходы к изучению подобных заболеваний сочетают биохимические, молекулярно-генетические и геномные исследования. Благодаря этим исследованиям стало возможным выявление биохимических путей, кандидатных генов и отдельных участков генома, которые могут вносить вклад в развитие комплексных заболеваний.

В последнее время все больше внимания уделяется возможности вовлечения серотониновой системы нейротрансмиссии в патофизиологию многих психических заболеваний. Одним из ключевых компонентов этой системы является рецептор серотонина типа 2А. На основании фармакологических исследований ген этого рецептора (5НТ2А-К.) рассматривается как кандидатный ген для многих психических нарушений -шизофрении, маниакально-депрессивного психоза, гиперкинетического синдрома, депрессии, нарушений питания и других заболеваний. Была выявлена ассоциация полиморфизма С(102)Т, обуславливающего молчащую замену в кодирующей области гена 5НТ2А-11, и сцепленного с ним полиморфизма С(-1438)А с рядом различных психических нарушений, однако биохимический механизм, лежащий в основе этой ассоциации, до настоящего времени оставался неизвестным. Поскольку названные полиморфизмы не изменяют белковой структуры рецептора, логично предположить, что их ассоциация с заболеваниями может быть связана с различной экспрессией аплельных вариантов гена. До сих пор экспрессия аллельных вариантов этого гена не была детально изучена.

В то время как для генетических исследований достаточно иметь образцы крови пациентов, для изучения экспрессии генов необходимы образцы тканей, экспрессирующих эти гены. Трудность получения образцов мозга затрудняет такого рода исследования психических заболеваний. Изучение экспрессии генов в тканях мозга связана с рядом методологических проблем, среди которых - неодинаковая степень деградации РНК в образцах, хранившихся в разных условиях разное время. Требуется разработка молекулярно-биологических подходов, которые бы позволяли надежно измерять относительно небольшие изменения экспрессии генов в образцах аутопсийных тканей.

Нечеткий характер наследования, а также то обстоятельство, что на развитие психических заболеваний оказывают влияние такие факторы риска, как пол, время рождения, пренатальные осложнения и заболевания раннего детства, позволяют предположить, что эпигенетические события могут играть существенную роль в регуляции экспрессии генов, связанных с психическими нарушениями. В последнее время становится очевидной важная роль эпигенетической регуляции в экспресии разных генов. Для выяснения механизмов функционирования гена 5НТ2А-11 представляется важным изучить возможность его эпигенетической регуляции.

Изучение функциональной роли, которую играет рецептор 5НТ2А в развитии психических нарушений (на примере шизофрении), и механизма, лежащего в основе ассоциации упомянутых выше полиморфизмов с различными заболеваниями, является актуальным для развития более полного представления о возможных причинах возникновения психических заболеваний, для их более точной диагностики и для разработки специфичных и эффективных методов лечения. В связи с изложенным была сформулирована цель настоящей работы и поставлены основные задачи.

Основные задачи:

1. Разработать методические подходы для определения уровня экспрессии гена в зависимости от его аллельного состояния.

2. Измерить уровень общей экспрессии гена 5НТ2А-Я в норме и при заболевании.

3. Изучить экспрессию аллельных вариантов гена 5НТ2А-11 в норме и при заболевании.

4. Разработать методы для определения степени метилирования как возможного механизма регуляции экспрессии. Провести анализ степени метилирования полиморфных сайтов гена 5НТ2А-Я.

Новизна результатов исследования. В настоящем исследовании разработаны методические подходы, позволяющие с высокой точностью измерять экспрессию аллельных вариантов гена, а также уровень метилирования определенных сайтов у гетерозиготных индивидов. Также была разработана новая методика определения степени деградации РНК в аутопсийных образцах мозга. При помощи этих методов, а также модификаций стандартных методов в работе был проведен анализ функциональной роли разных аллелей гена рецептора серотонина типа 2А

5НТ2А-Я). Впервые в практике исследований этого рецептора была измерена экспрессия кодирующего его гена в аутопсийных тканях мозга пациентов, страдавших шизофренией, и здоровых индивидов. Впервые проведено измерение степени метилирования полиморфных сайтов аллельного варианта 102С/-1438С гена 5НТ2А-11. На основе данных, полученных в настоящей работе, предложена новая гипотеза, которая описывает один из возможных молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена 5НТ2А-К, вовлеченных в развитие связанных с ним психических заболеваний.

Практическая значимость работы. В работе предложены новые методы функционального анализа полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям. Получены новые данные, раскрывающие функциональную роль рецептора серотонина 5НТ2А и его полиморфных вариантов в развитии шизофрении и, таким образом, проясняющие природу этого сложнонаследуемого заболевания. Поскольку рецептор 5НТ2А и серотониновая система в целом являются мишенями воздействия нейролептиков, полученные данные о дифференциальной экспрессии аллельных вариантов гена 5НТ2А-Л открывают возможности для разработки новых лекарств, а также оптимизации применения уже существующих препаратов в зависимости от генотипа пациента.

Положения, выносимые на защиту:

1. Новые методы, разработанные в данной работе, позволяют проводить измерение относительной экспрессии аллелей в гетерозиготных индивидах и определение общего уровня экспрессии гена 5НТ2А-Л в аутопсийных образцах мозга.

2. Общий уровень экспрессии гена 5НТ2А-Я снижен в тканях мозга больных шизофренией по сравнению со здоровыми индивидами.

3. Уровень экспрессии аллельного варианта 102С/-14380 гена 5НТ2А-11 ниже, чем уровень экспрессии аллельного варианта 102Т/-1438А.

4. Аллельный вариант 102C/-1438G обладает двумя дополнительными по сравнению с аллельным вариантом 102Т/-1438А сайтами метилирования. Эти сайты метилированы в ДНК клеток головного мозга.

Публикации и апробация работы. По материалам исследований опубликовано пять печатных работ. Основные результаты работы докладывались на семинарах Института молекулярной генетики РАН, на Ученом Совете Медико-генетического научного центра РАМН, на собрании American College of Neuropsyhopharmacology в 2000 году (Пуэрто-Рико) и на ежегодных конференциях Society of Biological Psychiatry в 2001 г. (Новый Орлеан, США) и 2002 г. (Филадельфия, США).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Полесская, Оксана Олеговна

ВЫВОДЫ

3. Проведено исследование уровня экспрессии гена 5НТ2А-Я у здоровых людей и больных шизофренией. Показано, что общий уровень транскрипта гена 5НТ2А-11 в аутопсийных тканях мозга больных шизофренией снижен по сравнению со здоровыми людьми. Предложена гипотеза, что известное снижение функции рецептора 5НТ2А у больных шизофренией связано со снижением количества транскрипта этого гена.

4. С помощью разработанных методов проведено изучение уровня экспрессии аллельных вариантов гена 5НТ2А-Я. Выявлено снижение уровня экспрессии гена в случае аллельного варианта 102С/-14380 по сравнению с аллельным вариантом 102Т/-1438А. Предложена гипотеза, что известный из литературы небольшой вклад аллельного варианта 102С/-14380 в предрасположенность к шизофрении может быть опосредован обнаруженным в данной работе снижением количества транскрипта этого аллельного варианта.

5. Разработаны методы определения степени метилирования у гомозиготных и гетерозиготных индивидов для гена 5НТ2А-11. При помощи этих методов определена степень метилирования пар СрО, специфичных для аллельного варианта Ю2С/-14380. Обнаружено, что эти пары СрО частично метилированы в тканях мозга здоровых людей и больных шизофренией.

Предложена гипотеза, что обнаруженное в настоящей работе снижение экспрессии аллельного варианта 102С/-14380 обусловлено метилированием специфичных для этого аллельного варианта пар Срв.

6. Заключение

Для ряда комплексных генетических заболеваний до сих пор не найдены ни вызывающие их генетические дефекты, ни лекарства, которые бы специфически корректировали биохимические нарушения. Шизофрения в ряду подобных заболеваний занимает особое место: это заболевание весьма распространено (им страдает около 1% населения), оно имеет существенный генетический компонент (30-70%) и тяжело сказывается на жизни как больных, так и их окружения. Наблюдающийся в последние годы прогресс в секвенировании генома, расшифровке генов и регуляторных последовательностей, открытии эпигенетических механизмов регуляции генов, в сочетании с достижениями фармакологии и психиатрии, позволяет надеяться, что в скором будущем будут выявлены основные генетические и нейрохимические механизмы развития заболевания, что позволит разработать более специфические методы лечения. Уже сейчас очевидно, что нарушения в серотониновой системе нейротрансмиссии играют важную роль в развитии шизофрении. Как показывают фармакологические исследования, одним из ключевых элементов в этой системе является рецептор серотонина типа 2А (5НТ2А). До сих пор не удалось найти функциональной связи между полиморфизмами в гене этого рецептора и нарушениями его биохимической функции. Поскольку ни в один из полиморфизмов не нарушает последовательности белкового продукта, предполагается, что сцепленные с заболеванием полиморфизмы могут влиять на уровень и регуляцию экспрессии гена. В связи с этим представляется интересным изучить количественную экспрессию разных аллелей этого гена на аутопсийных образцах мозга больных шизофренией по сравнению со здоровыми людьми. При работе с выборками аутопсийного материала надо принимать во внимание такие факторы, как история болезни пациента, лекарственный статус и постмортальный интервал. В последнее время становится очевидным участие эпигенетических воздействий в нормальном функционировании генома и при развитии различных заболеваний. В связи с этим представляется важным изучить возможность участия эпигенетических механизмов в регуляции экспрессии гена рецептора серотонина 5НТ2А-Я.

На основании этого были сформулированы следующие цели и задачи диссертационной работы.

Основные задачи:

2. Измерить уровень общей экспрессии гена 5НТ2А-11 в норме и при заболевании.

3. Изучить экспрессию аллельных вариантов гена 5НТ2А-11 в норме и при заболевании.

4. Разработать методы для определения степени метилирования как возможного механизма регуляции. экспрессии. Провести анализ степени метилирования полиморфных сайтов гена 5НТ2А-Я.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

X. Образцы тканей

А. Образцы тканей мозга человека.

Для исследований были использованы замороженные ткани мозга больных шизофренией и здоровых людей, полученные из трех разных источников:

5. 10 здоровых контролен из Института Мозга, Санкт-Петербург;

6. 24 больных шизофренией и 10 контролей из Mount Sinai Schizophrenia Brain Bank (США);

7. 14 больных шизофренией и 15 контролей из Stanley Foundation Consortium (США).

Условия взятия и хранения тканей, критерии постановки диагноза и демографические характеристики этих образцов изложены в работах [90, 195, 212].

Таким образом, были использованы образцы мозга от 35 здоровых индивидов и 38 пациентов, страдавших шизофренией, из зоны В21 {рис. 7 и табл. 4).

Рис. 7. Зоны коры головного мозга по Бродману.

Все индивиды, участвовавшие в исследовании, не являлись родственниками и относились к белой расе. Данная выборка подробно охарактеризована в работах [52, 91, 195, 205]. Индивидуальная характеристика всех использованных образцов мозга представлена в I

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полесская, Оксана Олеговна, Москва

1. Филипенко М.Л., Бейлина А.Г., Алексеенко О.В., Белков В.В., Кудрявцева H.H. Увеличение экспрессии генов транспортера серотонина и моноаминоксидазы в мозгу индуцированых в самцах мышей. Биохимия. 2002. 67(4). С. 451-455

2. Щербатых Т.В., Голимбет В.Е., Орлова В.А., Каледа В.Г., Олейчик И.В., Абрамова Л.М., Тарантул В.З., Рогаев Е.И. Полиморфизм в гене серотонинового транспортера человека при эндогенных психозах. Генетика. 2000. №36. С. 1712-1715.

3. Терешкина Е.Б., Бокша И.С., Савушкина O.K., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетиза и подобный ей белок в лобной коре при шизофрении. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 2000. №7. С. 51-52.

4. Ahmad К. and S. Henikoff. Epigenetic consequences of nucleosome dynamics. Cell, 2002. 111 (3). P. 281 -284.

5. Akbarian S. et al. Distorted distribution of nicotinamide-adenine dinucleotidephosphate-diaphorase neurons in temporal lobe of schizophrenics implies anomalous cortical development. Arch Gen Psychiatry, 1993. 50(3). P. 178187.

6. Anderson C.L. and C.J. Brown. Variability of X chromosome inactivation. C. effect on levels of TIMP1 RNA and role of DNA methylation. Hum Genet, 2002. 110(3). P. 271-278. * 11. Archer S.Y. and R.A. Hodin. Histone acetylation and cancer. Curr Opin Genet

7. Dev, 1999.9(2). P. 171-174.

8. Arinami T. et al. A functional polymorphism in the promoter region of the dopamine D2 receptor gene is associated with schizophrenia. Hum Mol Genet, 1997. 6(4). P. 577-582.

9. Arnt J. Differential effects of classical and newer antipsychotics on the ^ hypermotility induced by two dose levels of D-amphetamine. Eur J

10. Pharmacol, 1995. 283(1-3). P. 55-62.

11. Arora R.C. and H.Y. Meltzer. Serotonin2 (5-HT2) receptor binding in the frontal cortex of schizophrenic patients. J Neural Transm Gen Sect, 1991. 85(1). P. 19-29.

12. Arranz M.J. et al. 5HT 2a receptor T102C polymorphism and schizophrenia. Lancet, 1996. 347(9018). P. 1831-1832.

13. Attwood J.T., R.L. Yung and B.C. Richardson. DNA methylation and theregulation of gene transcription. Cell Mol Life Sci, 2002. 59(2). P. 241-257.

14. Austin C.P. et al. Mapping of hKCa3 to chromosome lq21 and investigation of linkage of CAG repeat polymorphism to schizophrenia. Mol Psychiatry, 1999. 4(3). P. 261-266.

15. Baare W.F. et al. Volumes of brain structures in twins discordant for schizophrenia. Arch Gen Psychiatry, 2001. 58(1). P. 33-40.

16. Balciuniene J. et al. Investigation of the functional effect of monoamine oxidase polymorphisms in human brain. Hum Genet, 2002. 110(1). P. 1-7.

17. Barta P.E. et al. Auditory hallucinations and smaller superior temporal gy-ral volume in schizophrenia. Am J Psychiatry, 1990. 147(11). P. 1457-1462.

18. Bartholini G. GABA receptor agonists. C. pharmacological spectrum and therapeutic actions. Med Res Rev, 1985. 5(1). P. 55-75.

19. Barton A.J. et al. Pre- and postmortem influences on brain RNA. J Neurochem, 1993. 61(1). P. 1-11.

20. Baylin S. and T.H. Bestor. Altered methylation patterns in cancer cell genomes. C. cause or consequence? Cancer Cell, 2002. 1(4). P. 299-305.

21. Beaujean N. Fundamental features of chromatin structure. Cloning Stem Cells, 2002.4(4). P. 355-361.

22. Bennett J.P., Jr., et al. Neurotransmitter receptors in frontal cortex of schizophrenics. Arch Gen Psychiatry, 1979. 36(9). P. 927-934.

23. Berger P.A. Biochemistry and the schizophrenia. Old concepts and new hypothesis. J Nerv Ment Dis, 1981. 169(2). P. 90-99.

24. Berman K.F. et al. A relationship between anatomical and physiological brain pathology in schizophrenia. C. lateral cerebral ventricular size predicts cortical blood flow. Am J Psychiatry, 1987. 144(10). P. 1277-1282.

25. Blouin J.L. et al. Schizophrenia susceptibility loci on chromosomes 13q32 and 8p21. Nat Genet, 1998. 20(1). P. 70-73.

26. Bogerts B. et al. Hippocampus-amygdala volumes and psychopathology in chronic schizophrenia. Biol Psychiatry. 1993. 33(4). P. 236-246.

27. Book J.A. Schizophrenia as a gene mutation. Acta Genet. Statist. Med., 1953. 4. P. 133-139.

28. Bosse R. and T. DiPaolo. The modulation of brain dopamine and GABAA receptors by estradiol. C. a clue for CNS changes occurring at menopause. Cell Mol Neurobiol, 1996. 16(2). P. 199-212.

29. Bottlender R. et al. Deficit states in schizophrenia and their association with the length of illness and gender. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci, 2001. 251(6). P. 272-278.

30. Brehm A. et al. dMi-2 and ISWI chromatin remodelling factors have distinct nucleosome binding and mobilization properties. Embo J, 2000. 19(16). P. 4332-4341.

31. Bromet E.J. and S. Fennig. Epidemiology and natural history of schizophrenia. Biol Psychiatry. 1999. 46(7). P. 871-881.

32. Brzustowicz L.M. et al. Linkage of familial schizophrenia to chromosome 13q32. Am J Hum Genet, 1999. 65(4). P. 1096-1103.

33. Brzustowicz L.M., et al. Location of a major susceptibility locus for familial schizophrenia on chromosome Iq21-q22. Science, 2000. 288(5466). P. 678682.

34. Bunzel R., et al. Polymorphic imprinting of the serotonin-2A (5-HT2A) receptor gene in human adult brain. Brain Res Mol Brain Res, 1998. 59(1). P. 90-92.

35. Burke R.E. and D. Greenbaum. Effect of postmortem factors on muscarinic receptor subtypes in rat brain. J Neurochem, 1987.49(2). P. 592-596.

36. Burke W.J. et al. Effect of pre- and postmortem variables on specific mRNA levels in human brain. Brain Res Mol Brain Res, 1991. 11(1). P. 37-41. •

37. Burnet P.W., S.L. Eastwood and P.J. Harrison. 5-HT1A and 5-HT2A receptor mRNAs and binding site densities are differentially altered in schizophrenia. Neuropsychopharmacology, 1996. 15(5). P. 442-455.

38. Cannon T.D. Abnormalities of brain structure and function in schizophrenia. C. implications for aetiology and pathophysiology. Ann Med, 1996. 28(6). P. 533-539.

39. Cardno A.G. et al. A genomewide linkage study of age at onset in schizophrenia. Am J Med Genet, 2001. 105(5). P. 439-445.

40. Chen R.Y. et al. No association between T102C polymorphism of serotonin-2A receptor gene and clinical phenotypes of Chinese schizophrenic patients. Psychiatry Res, 2001. 105(3). P. 175-185.

41. Chen Y. et al. On the epigenetic regulation of the human reelin promoter.

42. Nucleic Acids Res, 2002. 30(13). P. 2930-2939.f

43. Chiavetto L.B. et al. Association between promoter polymorphic haplotypes of interleukin-10 gene and schizophrenia. Biol Psychiatry, 2002. 51(6). P. 480-484.

44. Chubakov A.R. et al. Effect of serotonin on the development of a rat cerebral cortex tissue culture. Neurosci Behav Physiol, 1986. 16(6). P. 490-497.

45. Chubakov A.R. et al. The effects of serotonin on the morpho-fiinctional development of rat cerebral neocortex in tissue culture. Brain Res, 1986. 369(1-2). P. 285-297.

46. Cigler T. et al. Novel and previously reported single-nucleotide polymorphisms in the human 5-HT(lB) receptor gene. C. no association with cocaine or alcohol abuse or dependence. Am J Med Genet, 2001. 105(6). P. 489-497.

47. Cross A.J., T.J. Crow and F. Owen. Gamma-aminobutyric acid in the brain in schizophrenia. Lancet, 1979. 1(8115). P. 560-561.

48. Crow T.J. Temporal lobe asymmetries as the key to the etiology of schizophrenia. Schizophr Bull, 1990. 16(3). P. 433-443.

49. Dann J. et al. A linkage study of schizophrenia to markers within Xpl 1 near the MAOB gene. Psychiatry Res, 1997. 70(3). P. 131-143.

50. Davidson M., et al. Alzheimer disease and related neurodegenerative diseases in elderly patients with schizophrenia. C. a postmortem neuropathologic study of 100 cases. Schizophrenia Bulletin, 1998. 24(3). P. 325-341.

51. Davis K.L. et al. Dopamine in schizophrenia. C. a review and reconceptualization. Am J Psychiatry, 1991. 148(11). P. 1474-1486.

52. Deakin J.F. et al. Frontal cortical and left temporal glutamatergic dysfunction in schizophrenia. J Neurochem, 1989. 52(6). P. 1781-1786.

53. Dean B. and W. Hayes. Decreased frontal cortical serotonin2A receptors in schizophrenia. Schizophr Res, 1996. 21(3). P. 133-139.

54. Dean B. et al. Changes in protein kinase C and adenylate cyclase in the temporal lobe from subjects with schizophrenia. J Neural Transm, 1997. 104(11-12). P. 1371-1381.

55. DeLisi L.E. et al. Search for linkage to schizophrenia on the X and Y chromosomes. Am J Med Genet, 1994. 54(2).-P. 113-121.

56. Denney R.M., H. Koch and I.W. Craig. Association between monoamine oxidase A activity in human male skin fibroblasts and genotype of the MAOA promoter-associated variable number tandem repeat. Hum Genet, 1999. 105(6). P. 542-551.

57. Dohrenwend B.P. et al. Socioeconomic status and psychiatric disorders. C. the causation-selection issue. Science, 1992. 255(5047). P. 946-952.

58. Dror V. et al. hKCa3/KCNN3 potassium channel gene. C. association of longer CAG repeats with schizophrenia in Israeli Ashkenazi Jews, expression in human tissues and localization to chromosome lq21. Mol Psychiatry, 1999. 4(3). P. 254-260."

59. Eastwood S.L. et al. Synaptophysin gene expression in human brain. C. a quantitative in situ hybridization and immunocytochemical study. Neuroscience, 1994. 59(4). P. 881-892.

60. Eaton W.W. Social class and chronicity of schizophrenia. J Chronic Dis, 1975. 28(4). P. 191-198.

61. Ehrlich M., X.Y. Zhang and N.M. Inamdar. Spontaneous deamination of cytosine and 5-methylcytosine residues in DNA and replacement of 5-methylcytosine residues with cytosine residues. Mutat Res, 1990. 238(3). P. 277-286.

62. Erlenmeyer-Kimling L., J.D. Rainer and F.J. Kallmann. Current reproductive trends in schizophrenia. Proc Annu Meet Am Psychopathol Assoc, 1966. 54. P. 252-276.

63. Falloon I.R. Family stress and schizophrenia. Theory and practice. Psychiatr Clin North Am, 1986. 9(1). P. 165-182.

64. Fann W.E. et al. Cholinergic suppression of tardive dyskinesia. Psychopharmacologia, 1974. 37(4). P. 101-107.

65. Fannon D. et al. Features of structural brain abnormality detected in firstepisode psychosis. Am J Psychiatry, 2000. 157(11). P. 1829-1834.

66. Flaum M. et al. Symptom dimensions and brain morphology in schizophrenia and related psychotic disorders. J Psychiatr Res, 1995. 29(4). P. 261-276.

67. Fowler J.S. et al. Inhibition of monoamine oxidase В in the brains of smokers. Nature, 1996. 379(6567). P. 733-736.

68. Frey U., H. Matthies and K.G. Reymann. The effect of dopaminergic D1 receptor blockade during tetanization on the expression of long-term potentiation in the rat CA1 region in vitro. Neurosci Lett, 1991. 129(1). P. 111-114.

69. Garbutt J.C. and'D.P. van Kämmen. The interaction between GAB A and dopamine. C. implications for schizophrenia. Schizophr Bull, 1983. 9(3). P. 336-353.

70. Geddes J.R. and S.M. Lawrie. Obstetric complications and schizophrenia. C. a meta-analysis. Br J Psychiatry, 1995. 167(6). P. 786-793.

71. Gill M. et al. Neurotrophin-3 gene polymorphisms and schizophrenia. С. no evidence for linkage or association. Psychiatr Genêt, 1996. 6(4). P. 183-186.

72. Gilmore J.H. et al. Postmortem stability of dopamine D1 receptor mRNA and D1 receptors. Brain Res Mol Brain Res, 1993. 18(4). P. 290-296.

73. Grigg G.W. Sequencing 5-methylcytosine residues by the bisulphite method. DNA Seq, 1996. 6(4). P. 189-198.

74. Гвоздев B.A. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК. Соросовский образовательный журнал, 1999. №10.

75. Haaf Т. The battle of the sexes after fertilization. C. behaviour of paternal and maternal chromosomes in the early mammalian embryo. Chromosome Res, 2001. 9(4). P. 263-271.

76. Haider M.Z. and M.A. Zahid. No evidence for an association between the 5-hydroxytryptamine 5-HT2a receptor gene and schizophrenia in Kuwaiti Arabs. Psychiatry Clin Neurosci, 2002. 56(4). P. 465-467.

77. Hakak Y. et al. Genome-wide expression analysis reveals dysregulation of myelination-related genes in chronic schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(8). P. 4746-4751.

78. Halberstadt A.L. The phencyclidine-glutamate model of schizophrenia. Clin Neuropharmacol, 1995. 18(3). P. 237-249.

79. Harrison P.J. Effect of neuroleptics on neuronal and synaptic structure., in Antipsychotic drugs and their side-effects, B. TRE, Editor. 1993, Academic Press. C. London. P. 99-110.

80. Harrison P.J. et al. The relative importance of premortem acidosis and postmortem interval for human brain gene expression studies. C. selective mRNA vulnerability and comparison with their encoded proteins. Neurosci Lett, 1995. 200(3). P. 151-154.

81. Hashimoto T. et al. Differential changes in serotonin 5-HT1A and 5-HT2 receptor binding in patients with chronic schizophrenia. Psychopharmacology (Berl), 1993. 112(1). P. S35-S39.

82. Hawi Z. et al. No association or linkage between the 5-HT2a/T102C polymorphism and schizophrenia in Irish families. Am J Med Genet, 1997. 74(4). P. 370-373.

83. Heils A. et al. Allelic variation of human serotonin transporter gene expression. J Neurochem, 1996. 66(6). P. 2621-2624.

84. Hendrich B. et al. Genomic structure and chromosomal mapping of the murine and human Mbdl, Mbd2, Mbd3, and Mbd4 genes. Mamm Genome, 1999. 10(9). P. 906-912.

85. Hendrich B. and A. Bird. Mammalian methyltransferases and methyl-CpG-binding domains. C. proteins involved in DNA methylation. Curr Top Microbiol Immunol, 2000. 249. P. 55-74.

86. Herken H. et al. T102C polymorphisms at the 5-HT2A receptor gene in Turkish schizophrenia patients. C. a possible association with prognosis. Neuropsychobiology, 2003. 47(1). P. 27-30.

87. Hernandez I. Abnormal expression of serotonin transporter mRNA in the frontal and temporal cortex of schizophrenics. 1997.

88. Hernandez I. and B.P. Sokolov. Abnormalities in 5-HT2A receptor mRNA expression in frontal cortex of chronic elderly schizophrenics with varying histories of neuroleptic treatment. J Neurosci Res, 2000. 59(2). P. 218-225.

89. Herve D. et al. Serotonin axon terminals in the ventral tegmental area of the rat. C. fine structure and synaptic input to dopaminergic neurons. Brain Res, 1987.435(1-2). P. 71-83.

90. Hill C. et al. Problem of diagnosis in postmortem brain studies of schizophrenia. Am J Psychiatry, 1996. 153(4). P. 533-537.

91. Holliday R. and J.E. Pugh. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Science, 1975. 187(4173). P. 226-232.

92. Holzman P.S. Eye movements and the search for the essence of schizophrenia. Brain Res Brain Res Rev, 2000. 31(2-3). P. 350-356.

93. Hovatta I. et al. A genomewide screen for schizophrenia genes in an isolated Finnish subpopulation, suggesting multiple susceptibility loci. Am J Hum Genet, 1999. 65(4). P. 1114-1124.

94. Huang Y.Y. et al. Substance abuse disorder and major depression are associated with the human 5-HT1B receptor gene (HTR1B) G861C polymorphism. Neuropsychopharmacology, 2003. 28(1). P. 163-169.

95. Imai H., D.A. Steindler and S.T. Kitai. The organization of divergent axonal projections from the midbrain raphe nuclei in the rat. J Comp Neurol, 1986. 243(3). P. 363-380.

96. Inayama Y. et al. Positive association between a DNA sequence variant in the serotonin 2A receptor gene and schizophrenia. Am J Med Genet, 1996. 67(1). P. 103-105.

97. Ishigaki T. et al. Intact 5-HT2A receptor exons and the adjoining intron regions in schizophrenia. Neuropsychopharmacology, 1996. 14(5). P. 339347.

98. Janowsky D.S. et al. Parasympathetic suppression of manic symptoms by physostigmine. Arch Gen Psychiatry, 1973. 28(4). P. 542-547.

99. Jellinger K. Neuropathologic findings after neuroleptic long-term therapy, in Neurotxicology, L. Roizin, Shiraki, H., Grcevis, N., Editor. 1977, Raven Press. C. New York.

100. Johnson S.A., D.G. Morgan and C.E. Finch. Extensive postmortem stability of RNA from rat and human brain. J Neurosci Res, 1986. 16(1). C. 267-280.

101. Jones P. and M. Cannon. The new epidemiology of schizophrenia. Psychiatr Clin North Am, 1998. 21(1). P. 1-25.

102. Jones P.A. DNA methylation and cancer. Oncogene, 2002. 21(35). P. 53585360.

103. Jones P.B. et al. Schizophrenia as a long-term outcome of pregnancy, delivery, and perinatal complications. C. a 28-year follow-up of the 1966 north Finland general population birth cohort. Am J Psychiatry, 1998. 155(3). P. 355-364.

104. Jones P.L. et al. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat Genet, 1998. 19(2). P. 187-191.

105. Jonsson E. et al. Schizophrenia and neurotrophin-3 alleles. Acta Psychiatr Scand, 1997. 95(5). P. 414-419.

106. Jonsson E.G. et al. Trend for an association between schizophrenia and D3S1310, a marker in proximity to the dopamine D3 receptor gene. Am J Med Genet, 1999. 88(4). P. 352-357.

107. Jonsson E.G. et al. Association between a promoter polymorphism in the dopamine D2 receptor gene and schizophrenia. Schizophr Res, 1999.40(1). P. 31-36.

108. Joo E.J. et al. Possible association between schizophrenia and a CAG repeat polymorphism in the spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) gene on human chromosome 6p23. Psychiatr Genet, 1999. 9(1). P. 7-11.

109. Joober R. et al. T102C polymorphism in the 5HT2A gene and schizophrenia. C. relation to phenotype and drug response variability. J Psychiatry Neurosci,1999. 24(2). P. 141-146.

110. Joyce J.N. et al. Serotonin uptake sites and serotonin receptors are altered in the limbic system of schizophrenics. Neuropsychopharmacology, 1993. 8(4). P. 315-336.

111. Kaiser R. et al. Dopamine D4 receptor 48-bp repeat polymorphism. C. no association with response to antipsychotic treatment, but association with catatonic schizophrenia. Mol Psychiatry, 2000. 5(4). P. 418-424.

112. Kaiser R. et al. Correlation between serotonin uptake in human blood platelets with the 44-bp polymorphism and the 17-bp variable number of tandem repeat of the serotonin transporter. Am J Med Genet, 2002. 114(3). P. 323328.

113. Kandel E.R., Schwartz J.H., Jessell T.M. Principles of Neural science. 4 ed.2000. C. McGraw-Hill.

114. Kaplan H.I., Sadock, B.J. Comprehensive textbook of psychiatry. Vol. 1. 1985, Baltimore/London. C. Williams & Wilkins.

115. Karlsson H. et al. Retroviral RNA identified in the cerebrospinal fluids and brains of individuals with schizophrenia. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(8). P. 4634-4639.

116. Kawanishi Y. et al. Novel polymorphisms of the AP-2 gene (6p24). C. analysis of association with schizophrenia. J Hum Genet, 2000. 45(1). P. 24-30.

117. Kelley J.J. et al. The effect of chronic haloperidol treatment on dendritic spines in the rat striatum. Exp Neurol, 1997. 146(2). P. 471-478.

118. Kendler K.S., A.M. Gruenberg and M.T. Tsuang. A family study of the subtypes of schizophrenia. Am J Psychiatry, 1988. 145(1). P. 57-62.

119. Kendler K.S., Diehl, S.R. Schizophrenia. C. genetics. In. C. Comprehensive Textbook of Psychiatry. VI ed, ed. H.I. Kaplan, Sadock, B.J. 1985, Baltimore. C. Williams and Wilkins.

120. Kouzmenko A.P. et al. 5-HT2A receptor polymorphism and steady state receptor expression in schizophrenia. Lancet, 1997. 349 (9068). P. 1815.

121. Lander E.S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001. 409(6822). P. 860-921.

122. Laruelle M. et al. Selective abnormalities of prefrontal serotonergic receptors in schizophrenia. A postmortem study. Arch Gen Psychiatry, 1993. 50(10). P. 810-818.

123. Levitan C., P.B. Ward and S.V. Catts. Superior temporal gyral volumes and laterality correlates of auditory hallucinations in schizophrenia. Biol Psychiatry, 1999. 46(7). P. 955-962.

124. Levitan M. Texbook of human genetics. 1988. C. Oxford University Press.

125. Lewis G. et al. Schizophrenia and city life. Lancet, 1992. 340(8812). P. 137140.

126. Li T. et al. No evidence of linkage disequilibrium between a CAG repeat in the SCA1 gene and schizophrenia in Caucasian and Chinese schizophrenic subjects. Psychiatr Genet, 1999. 9(3). P. 123-127.

127. Lieberman J.A. et al. Serotonergic basis of antipsychotic drug effects in schizophrenia. Biol Psychiatry, 1998. 44(11). P. 1099-1117.

128. Lin C.H. et al. No evidence for association of serotonin-2A receptor variant (102T/C) with schizophrenia or clozapine response in a Chinese population. Neuroreport, 1999. 10(1). P. 57-60.

129. Lin M.W. et al. Suggestive evidence for linkage of schizophrenia to markers on chromosome 13 in Caucasian but not Oriental populations. Hum Genet, 1997. 99(3). P. 417-420.

130. Lorincz M.C. et al. Dynamic analysis of proviral induction and De Novo methylation. C. implications for a histone deacetylase-independent, methylation density-dependent mechanism of transcriptional repression. Mol Cell Biol, 2000. 20(3). P. 842-850.

131. Lyko F., B.H. Ramsahoye and R. Jaenisch. DNA methylation in Drosophila melanogaster. Nature, 2000. 408(6812). P. 538-540.

132. Ma Y.J., M.E. Costa and S.R. Ojeda. Developmental expression of the genes encoding transforming growth factor alpha and its receptor in the hypothalamus of female rhesus macaques. Neuroendocrinology, 1994. 60(4). P. 346-359.

133. Ma Y.J. et al. Expression of epidermal growth factor receptor changes in the hypothalamus during the onset of female puberty. Mol Cell Neurosci, 1994. 5(3). P. 246-262.

134. Mancini D.N. et al. Site-specific DNA methylation in the neurofibromatosis (NF1) promoter interferes with binding of CREB and SP1 transcription factors. Oncogene, 1999. 18(28). P. 4108-4119.

135. Marcelis M. et al. Urbanization and psychosis. C. a study of 1942-1978 birth cohorts in The Netherlands. Psychol Med, 1998. 28(4). C. 871-879.

136. Marchuk L. et al. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon and cartilage. Biochim Biophys Acta, 1998. 1379(2). P. 171-177.

137. Martin S.D. et al. Brain blood flow changes in depressed patients treated with interpersonal psychotherapy or venlafaxine hydrochloride. C. preliminary findings. Arch Geri Psychiatry, 2001. 58(7). P. 641-648.

138. Ml.Maziade M. et al. Childhood/early adolescence-onset and adult-onset schizophrenia. Heterogeneity at the dopamine D3 receptor gene. Br J Psychiatry, 1997. 170. P. 27-30.

139. McCarley R.W. et al. Auditory P300 abnormalities and left posterior superior temporal gyrus volume reduction in schizophrenia. Arch Gen Psychiatry, ' 1993. 50(3). P. 190-197.

140. McCarley R.W. et al. MRI anatomy of schizophrenia. Biol Psychiatry, 1999. 45(9). P. 1099-1119.

141. McGinnis R.E. et al. Failure to confirm NOTCH4 association with schizophrenia in a large population-based sample from Scotland. Nat Genet, 2001. 28(2). P. 128-129.

142. Menon R.R. et al. Posterior superior temporal gyrus in schizophrenia. C. grey matter changes and clinical correlates. Schizophr Res, 1995. 16(2). P. 127135.

143. Meyer J. et al. A missense mutation in a novel gene encoding a putative cation channel is associated with catatonic schizophrenia in a large pedigree. Mol Psychiatry, 2001. 6(3). P. 302-306.

144. Meyer J. et al. Evolutionary conserved microsatellites in the promoter region of the 5-hydroxytryptamine receptor 2C gene (HTR2C) are not associated with bipolar disorder in females. J Neural Transm, 2002. 109(5-6). P. 939946.

145. Mimics K. et al. Molecular characterization of schizophrenia viewed by microarray analysis of gene expression in prefrontal cortex. Neuron, 2000. 28(1). P. 53-67.

146. Mita T. et al. Decreased serotonin S2 and increased dopamine D2 receptors in chronic schizophrenics. Biol Psychiatry, 1986. 21(14). P. 1407-1414.

147. Morand C., S.N. Young and F.R. Ervin, Clinical response of aggressive schizophrenics to oral tryptophan. Biol Psychiatry, 1983. 18(5). P. 575-578.

148. Morgan H.D. et al. Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. Nat Genet, 1999. 23(3). P. 314-318.

149. Morrow B.A. and R.H. Roth. Serotonergic lesions alter cocaine-induced locomotor behavior and stress-activation of the mesocorticolimbic dopamine system. Synapse, 1996. 23(3). P. 174-181.

150. Mortensen P.B. et al. Effects of family history and place and season of birth on the risk of schizophrenia. N Engl J Med, 1999. 340(8). P. 603-608.

151. Murray R.M., S.W. Lewis and A.M. Reveley. Towards an aetiological classification of schizophrenia. Lancet, 1985. 1(8436). P. 1023-1026.

152. Nan X. et al. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature, 1998. 393(6683). P. 386-389.

153. Nanko S. et al. Neurotrophin-3 gene polymorphism associated with schizophrenia. Acta Psychiatr Scand, 1994. 89(6). P. 390-392.

154. Nazarenko S. Impared epigenetic gene activity. Vestn Ross Akad Med Nauk, 2001.

155. Nicholls R.D. The impact of genomic imprinting for neurobehavioral and developmental disorders. J Clin Invest, 2000. 105(4). P. 413-418.

156. Oda Y. Choline acetyltransferase. C. the structure, distribution and pathologic changes in the central nervous system. Pathol Int, 1999. 49(11). P. 921-937.

157. Ohara K. et al. Cerebral ventricle-brain ratio in monozygotic twins discordant and concordant for schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 1998. 22(6). P. 1043-1050.

158. Okuyama Y. et al. A genetic polymorphism in the promoter region of DRD4-associated with expression and schizophrenia. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 258(2). P. 292-295.

159. Owen M.J. Molecular genetic studies of schizophrenia. Brain Res Brain Res Rev, 2000. 31(2-3). P. 179-186.

160. Pardue S., A.L. Zimmerman and M. Morrison-Bogorad. Selective postmortem degradation of inducible heat shock protein 70 (hsp70) mRNAs in rat brain. Cell Mol Neurobiol, 1994. 14(4). P. 341-357.

161. Patra S.K. et al. DNA methyltransferase and demethylase in human prostate cancer. Mol Carcinog, 2002. 33(3). P. 163-171.

162. Paulsen M. and A.C. Ferguson-Smith. DNA methylation in genomic imprinting, development, and disease. J Pathol, 2001. 195(1). P. 97-110.

163. Pearce B.D. Schizophrenia and viral infection during neurodevelopment. C. a focus on mechanisms. Mol Psychiatry, 2001. 6(6). P. 634-646.

164. Petronis A. Human morbid genetics revisited. C. relevance of epigenetics. Trends Genet, 2001. 17(3). P. 142-146.

165. Petronis A., Gottesman 1.1., Kan P.X., Kennedy J.L., Basile V.S. Paterson, A.D., Popendikyte, V., Monozygotic twins exhibit numerous epigenetic differences. C. clues to twin discordance? Schizophrenia Bulletin, 2003. in press.

166. Pohjalainen T. et al. The dopamine D2 receptor 5-flanking variant, -141C Ins/Del, is not associated with reduced dopamine D2 receptor density in vivo. Pharmacogenetics, 1999. 9(4). P. 505-509.

167. Poirier L.A. The effects of diet, genetics and chemicals on toxicity and aberrant DNA methylation. C. an introduction. J Nutr, 2002. 132(8 Suppl). P. 2336S-2339S.

168. Popendikyte V. et al. DNA methylation at the putative promoter region of the human dopamine D2 receptor gene. Neuroreport, 1999. 10(6). P. 1249-1255.

169. Pralong D. et al. Serotonin(2A) receptors are reduced in the planum temporale from subjects with schizophrenia. Schizophr Res, 2000. 44(1). P. 35-45.

170. Prescott C.A. and Gottesman II. Genetically mediated vulnerability to schizophrenia. Psychiatr Clin North Am, 1993. 16(2). P. 245-267.

171. Pulver A.E., J.W. Sawyer and B. Childs. The association between season of birth and the risk for schizophrenia. Am J Epidemiol, 1981. 114(5). P. 735749.

172. Rakyan V.K. et al. Transgenerational inheritance of epigenetic states at the murine AxinFu allele occurs after maternal and paternal transmission. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(5). P. 2538-2543.

173. Razin A. and H. Cedar. Distribution of 5-methylcytosine in chromatin. Proc Natl Acad Sci USA, 1977. 74(7). P. 2725-2728.

174. Read J. et al. The contribution of early traumatic events to schizophrenia in some patients. C. a traumagenic neurodevelopmental model. Psychiatry, 2001. 64(4). P. 319-345.

175. Recillas-Targa F. DNA methylation, chromatin boundaries, and mechanisms of genomic imprinting. Arch Med Res, 2002. 33(5). P. 428-438.

176. Reik W. et al. Imprinted genes and the coordination of fetal and postnatal growth in mammals. Novartis Found Symp, 2001. 237. P. 19-31; discussion 31-42.

177. Risch N. and M. Baron. X-linkage and genetic heterogeneity in bipolar-related major affective illness. C. reanalysis of linkage data. Ann Hum Genet, 1982.46(Pt 2). P. 153-166.

178. Rosoklija G. et al. Structural abnormalities of subicular dendrites in subjects with schizophrenia and mood disorders. C. preliminary findings. Arch Gen Psychiatry, 2000. 57(4). P. 349-356.

179. Rubin P. et al. Altered modulation of prefrontal and subcortical brain activity in newly diagnosed schizophrenia and schizophreniform disorder. A regional cerebral blood flow study. Arch Gen Psychiatry, 1991.48(11). P. 987-995.

180. Russo V.M. RA; Riggs, AD, Epigenetic mechanisms of gene regulation. 1996, New York. C. Cold Spring Harbor Laboratory.

181. Sabol S.Z., S. Hu and D. Hamer. A functional polymorphism in the monoamine oxidase A gene promoter. Hum Genet, 1998. 103(3). P. 273-279.

182. Shaw S.H. et al. A genome-wide search for schizophrenia susceptibility genes. Am J Med Genet, 1998. 81(5). P. 364-376.

183. Shenton M.E. et al. Abnormalities of the left temporal lobe and thought disorder in schizophrenia. A quantitative magnetic resonance imaging study. N Engl J Med, 1992. 327(9). P. 604-612.

184. Shenton. M.E. et al. A review of MRI findings in schizophrenia. Schizophr Res, 2001. 49(1-2). P. 1-52.

185. Singer J., J. Roberts-Ems and A.D. Riggs. Methylation of mouse liver DNA studied by means of the restriction enzymes msp I and hpa II. Science, 1979. 203(4384). P. 1019-1021.

186. Singh S.M., B. Murphy and R. O'Reilly. Monozygotic twins with chromosome 22qll deletion and discordant phenotypes. C. updates with an epigenetic hypothesis. J Med Genet, 2002. 39(11). P. e71.

187. Sklar P. et al. Association analysis of NOTCH4 loci in schizophrenia using family and population-based controls. Nat Genet, 2001. 28(2). P. 126-128.

188. Sokolov B.P. et al. Levels of mRNAs encoding synaptic vesicle and synaptic plasma membrane proteins in the temporal cortex of elderly schizophrenic patients. Biol Psychiatry, 2000. 48(3). P. 184-196.

189. Soper H.V. et al. Effects of fenfluramine on neuropsychological and communicative functioning in treatment-refractory schizophrenic patients. J Clin Psychopharmacol, 1990. 10(3). P. 168-175.

190. Spurlock G. et al. A family based association study of T102C polymorphism in 5HT2A and schizophrenia plus identification of new polymorphisms in the promoter. Mol Psychiatry, 1998. 3(1). P. 42-49.

191. Spurlock G. et al. European Multicentre Association Study of Schizophrenia. C. a study of the DRD2 Ser31 ICys and DRD3 Ser9Gly polymorphisms. Am J Med Genet, 1998. 81(1). P. 24-28.

192. Stanta G. and S. Bonin. RNA quantitative analysis from fixed and paraffin-embedded tissues. C. membrane hybridization and capillary electrophoresis. Biotechniques, 1998. 24(2). n. 271-276.

193. Stober G. et al. Parent-of-origin effect and evidence for differential transmission in periodic catatonia. Psychiatr Genet, 1998. 8(4). P. 213-219.

194. Sun H.F. et al. Association study of novel human serotonin 5-HT(lB) polymorphisms with alcohol dependence in Taiwanese Han. Biol Psychiatry, 2002. 51(11). P. 896-901.

195. Susser E.S. and S.P. Lin. Schizophrenia after prenatal exposure to the Dutch Hunger Winter of 1944-1945. Arch Gen Psychiatry, 1992. 49(12). P. 983988.

196. Szyf M. and S.K. Bhattacharya. Extracting DNA demethylase activity from mammalian cells. Methods Mol Biol, 2002. 200. P. 163-176.

197. Takei N. et al. Cities, winter birth, and schizophrenia. Lancet, 1992. 340(8818). P. 558-559.

198. Tcherepanov A.A. and B.P. Sokolov. Age-related abnormalities in expression of mRNAs encoding synapsin 1A, synapsin IB, and synaptophysin in the temporal cortex of schizophrenics. J Neurosci Res, 1997. 49(5). P. 639-644.

199. Thaker G.K. and W.T. Carpenter. Jr., Advances in schizophrenia. Nat Med, 2001. 7(6). P. 667-671.

200. Then Bergh F. et al. Comparison of nucleosome remodeling by the yeast transcription factor Pho4 and the glucocorticoid receptor. J Biol Chem, 2000. 275(12). P. 9035-9042.

201. Thome J. et al. Variants in neurotrophic factor genes and schizophrenic psychoses. C. no associations in a Spanish population. Psychiatry Res, 1997. 71(1). P. 1-5.

202. Tienari P. et al. The Finnish adoptive family study of schizophrenia. Implications for family research. Br J Psychiatry Suppl, 1994(23). P. 20-26.

203. Torrey E.F. et al. Birth seasonality in bipolar disorder, schizophrenia, schizoaffective disorder and stillbirths. Schizophr Res, 1996. 21(3). P. 141149.

204. Torrey E.F. et al. Seasonality of births in schizophrenia and bipolar disorder. C. a review of the literature. Schizophr Res, 1997. 28(1). P. 1-38.

205. Torrey E.F. et al. The Stanley foundation brain collection and neuropathology consortium. Schizophr Res, 2000.44(2). P. 151-155.

206. Torrey E.F. and R.H. Yolken. The schizophrenia-rheumatoid arthritis connection. C. infectious, immune, or both? Brain Behav Immun, 2001. 15(4). P. 401-410.

207. Tsuang M. Schizophrenia. C. genes and environment. Biol Psychiatry, 2000. 47(3). P. 210-220.

208. Tsuang M.T. and S.V. Faraone. The case for heterogeneity in the etiology of schizophrenia. Schizophr Res, 1995. 17(2). P. 161-175.

209. Turecki G. et al. Prediction of level of serotonin 2A receptor binding by serotonin receptor 2A genetic variation in postmortem brain samples from subjects who did or did not commit suicide. Am J Psychiatry, 1999. 156(9). P. 1456-1458.

210. Turker M.S. Gene silencing in mammalian cells and the spread of DNA methylation. Oncogene, 2002. 21(35). P. 5388-5393.

211. Van Os J. et al. Risk factors for onset and persistence of psychosis. Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol, 1998. 33(12). P. 596-605.

212. Vawter M.P. et al. Application of cDNA microarrays to examine gene expression differences in schizophrenia. Brain Res Bull, 2001. 55(5). P. 641650.

213. Wahlberg K.E. et al. Gene-environment interaction in vulnerability to schizophrenia. C. findings from the Finnish Adoptive Family Study of Schizophrenia. Am J Psychiatry, 1997. 154(3). P. 355-362.

214. Walker E. et al. Environmental factors related to schizophrenia in psychophysiological^ labile high-risk males. J Abnorm Psychol, 1981. 90(4). P. 313-320.

215. Wei J. and G.P. Hemmings. The NOTCH4 locus is associated with susceptibility to schizophrenia. Nat Genet, 2000. 25(4). P. 376-377.

216. Weinberger D.R., K.F. Berman and R.F. Zee. Physiologic dysfunction of dorsolateral prefrontal cortex in schizophrenia. I. Regional cerebral blood flow evidence. Arch Gen Psychiatry, 1986. 43(2). P. 114-124.

217. Weinberger D.R. Implications of normal brain development for the pathogenesis of schizophrenia. Arch Gen Psychiatry, 1987. 44(7). P. 660669.

218. Weiss B. et al. Assignment of a human homolog of the mouse Htr3 receptor gene to chromosome 1 Iq23.1-q23.2. Genomics, 1995. 29(1). P. 304-305.

219. Westerink B.H. et al. Antipsychotic drugs classified by their effects on the release of dopamine and noradrenaline in the prefrontal cortex and striatum. Eur J Pharmacol, 2001. 412(2). P. 127-138.

220. Wetzel D.M., M.C. Bohn and R.W. Hamill. Postmortem stability of mRNA for glucocorticoid and mineralocorticoid receptor in rodent brain. Brain Res, 1994. 649(1-2). P. 117-121.

221. Willeit M. et al. No evidence for in vivo regulation of midbrain serotonin transporter availability by serotonin transporter promoter gene polymorphism. Biol Psychiatry, 2001. 50(1). P. 8-12.

222. Williams J. et al. Association between schizophrenia and T102C polymorphism of the 5-hydroxytryptamine type 2a-receptor gene. European Multicentre Association Study of Schizophrenia (EMASS) Group. Lancet, 1996. 347(9011). P. 1294-1296.

223. Williams J. et al. Meta-analysis of association between the 5-HT2a receptor T102C polymorphism and schizophrenia. EMASS Collaborative Group.

224. European Multicentre Association Study of Schizophrenia. Lancet, 1997. 349(9060). P. 1221.

225. Williams N.M. et al. A two-stage genome scan for schizophrenia susceptibility genes in 196 affected sibling pairs. Hum Mol Genet, 1999. 8(9). P. 1729-1739.

226. Wolffe A.P., P.L. Jones and P.A. Wade. DNA demethylation. Proc Natl Acad Sei USA, 1999. 96(11). P. 5894-5896.

227. Wong D.J. et al. Progressive region-specific de novo methylation of the pi6 CpG island in primary human mammary epithelial cell strains during escape from M(0) growth arrest. Mol Cell Biol, 1999. 19(8). P. 5642-5651.

228. Wyatt R.J. et al. Reduced monoamine oxidase activity in platelets. C. a possible genetic marker for vulnerability to schizophrenia. Science, 1973. 179(76). P. 916-918.

229. Yan H. et al. Allelic variation in human gene expression. Science, 2002. 297(5584). P. 1143.

230. Zamorano P.L., V.B. Mahesh and D.W. Brann. Quantitative RT-PCR for neuroendocrine studies. A minireview. Neuroendocrinology, 1996. 63(5). P. 397-407.

231. Zschocke J. et al. Estrogen receptor alpha-mediated silencing of caveolin gene expression in neuronal cells. J Biol Chem, 2002. 277(41). P. 38772-38780.

Информация о работе

Полесская, Оксана Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.26

Диссертация

Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы