Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНАХ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К СЛОЖНОНАСЛЕДУЕМЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ НА ПРИМЕРЕ ГЕНА 5HT2A-R
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНАХ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К СЛОЖНОНАСЛЕДУЕМЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ НА ПРИМЕРЕ ГЕНА 5HT2A-R"



На правах рукописи

Полесская Оксана Олеговна

Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5НТ2А-И

03.00.26—Молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 20(13 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики Российской Академии Наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук Поляков Александр Владимирович Доктор биологических наук, профессор, Носиков Валерий Вячеславович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В А. Энгелъгардта РАН

Зашита состоится 22 декабря 2003 г. в 11 час. на заседании Диссертационного Совета Д. 001.016.01 при Государственном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук по адресу; 115478, Москва, ул. Москворечье д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН. Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, д.б.п., проф. Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К сложиоиаследу емым заболеваниям относят такие важные и широко распространенные заболевания, как диабет, астма к большинство психических нарушений. Считается, что такие заболевания проявляются в результате патогенного сочетания часто встречающихся в популяция полиморфных, вариантой какдидатных генов в комплексе с воздействиями внешней среды. Функциональная значимость таких полиморфных вариантов может быть исследована на образцах тканей, функционально важных для изучаемого сложнонаследусмого заболевания. В заболеваниях со сложным рисунком наследования, как правило, не наблюдается ярко выраженного нарушения функции изучаемого гена. В случае молчащих замен это предполагает небольшие изменения в экспрессии гена. Для их выявления необходимо использовать высоко чувствительные методы намерения. Разработка таких методов является актуальной задачей современной молекулярной генетики. Ген 5HT2A-R является одним из главных канлидатных генов для такого распространенного и тяжелого сложнонаследусмого заболевания, как шизофрения. К настоящему времени можно считать установленной ассоциацию синонимического полиморфного варианта (102)C/(-1438)Ci (аллель С) с шизофренией. Однако механизм, лежащий в основе этой ассоциации, до енх нор неизвестен. Выяснение функциональной роли рецептора 5НТ2Л в развитии шизофрении и механизма, лежащего в основе ассоциации названного полиморфного варианта с шизофренией, необходимо для выяснения биохимической природы заболевания и будет способствовать разработке более точной его диагностики и более эффективных методов лечения.

Цель работы: разработать методы измерения экспрессии аллельных вариантов гена, не связанных со структурными изменениями банка, на примере анализа полиморфных вариантов гена рецептора 5НТ2А у здоровых людей н при шизофрении.

Основные задачи:

1. Разработать методические подходы для определения уровня экспрессии гена о зависимости от его аллелыюго состояния.

2. Измерить уровень обшей экспрессии гена 5HT2A-R в норме и при заболевании.

3. Изучить экспрессию ал цельных вариантов 1Сна 5NT2A-R в норме и ipit заболевании.

•4. Раз работать методы для определения степени метилирования как юзможлого механизма регуляции экспрессии. Провести анализ степени 1ети.н1 рован и я полиморфных сайтов шна 5TIT2A-R,

;г, мехл |

Новизна результатов исследовании. В настоящем исследовании разработаны методические нал ходы, позволяющие с высокой точное i [,10 измерять экспрессию аллель» ых вариантов гена, а также- уровень метилирования определенных сайтов у гетерошгогных индивидов. Также была разработана новая методика определения степени деградации РНК в аутопепйных образцах мозга. При помощи этих метод он, а также модификаций сгандаршых методов ts работе был проведен анализ функциональной роли разных аллелей шш рецептора серотонина тина 2Л (5HT2A-R). Впервые и практике исследований этою рецептора била измерена экспрессия кодирующего его гена в аутопепйных тканях мозги наииекто», страд анших шизофренией, и здоровых индивидов. Впервые проведено измерение степени метилирования полиморфных сайтов оллеля С гена 5HT2A-R, На основе данных, полученных в настоящей работе, предложена новая гипотеза, которая описывает один из возможных молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена 5HT2A-R, вовлеченных в развитие связанных с ним психических заболевании.

Практическая значимость раГюты. Разработаны методические подходы к функциональному анализу полиморфизмов в генах предрасположенности к сложи он аследуемым заболеваниям. Получены новые данные, раскрывающие функциональную роль рецептора серотонина 5НТ2А и его полиморфных вариантов н развитии шизофрении н, таким образом, проясняющие природу этого сложнонаследуемого заболевания. Поскольку реценгор 51 П"2А и серотониновая система в целом являются мишенями воздействия нейролептиков, полученные данные о дифферепнихи.ной экспрессии аллельных вариантов гена 5HT2A-R открывают возможности для разработки новых лекарств, а также оптимизации применения уже су шествующих препаратов в зависимости oí [енотина пациента.

Положения, выноелмме на зашнту:

1. Новые методы, разработанные в данной работе, позволяют проводить измерение относительной экспрессии аллелей в гетерози путных индивидах и определение общего уровня экспрессии mía 5HT2A-R в аутопсийных образна* мозга.

2. Обшин уровень экспрессии гена 5HT2A-R снижен в тканях мозга больных шизофренией по сравнению со здоровыми индивидами.

3. Уровень экспрессии атлельного варианта 102CM43KG гена 5HT2A-R ниже, чем уровень экспрессии алдельного варианта 102ТМ 43RA.

4. АллельныЙ вариант 102C/-1438G обладает двумя дополнительными по сравнению с аляелы)ым вариантом 102ТА1438А сайтами метилирования. От и сайты метилированы в ДНК клеток головного мозга.

Публикации. По материалам исследования опубликовано пять печатных

работ.

Личное участие автора. Все научные результаты, положенные в основу диссертации, получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Из работ, сделанных в соавторстве, в диссертацию вошли только те результаты, в получении которых автор принимал непосредственное творческое участие.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах Института молекулярной генетики РАН, на Ученом Совете Медико-генетического научного центра РАМН, на собрании American College of Neurop-sy ho pharmacology в 2000 году (Пуэрто-Рико) и на ежегодных конференциях Society of Biological Psychiatry в 2001 г. (Новый Орлеан, США) и 2002 г. (Филадельфия, США),

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты н обсуждение», «Выводы». Работа изложена на 1S3 страницах машинописного текста, содержит 27 иллюстраций и 7 таблиц. Список использованной литературы содержит 239 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во is веде нин показана актуальность работы, определены цель и задачи исследовании, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, дано краткое изложение содержания работы,

В первой главе дан обзор современной литературы. В обзоре шизофрения рассматривается как сложнонаследуемое заболевание; на примере шизофрении обсуждаются методические подходы к поиску генов, вовлеченных в развитие сложно! ¡аследуемых заболеваний. Рассматриваются подходы к диагностике, лечению и исследованию причин возникновения шизофрении; обсуждаются возникающие при этом методологические сложности и способы их разрешения. Рассматриваются сложившиеся к настоящему времени представления о роли ссротониновой системы и различных ее компонентов в норме и при развитии психических заболеваний. Особое внимание уделяется функциональной роли рецептора 5НГ2А, ген которого является одним из основных ка>1д платных генов для шизофрении. Также дан обзор современных взглядов па эй н генетически с механизмы, которые участвуют в обеспечении специфичности экспрессии генома и могу г участвовать в развитии сложжшаследуемых заболеваний, рассматривается роль метилирования в регуляции экспрессии генов.

Во второй главе изложены материалы и методы, использованные при

выполнении работы; в третьей i лаве приводится результаты исследования и их обсуждение и свете современных исследований. В заключении сформулированы основные результаты диссертационной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образны тканей

Образцы тканей мозга чел опека. Использованы замороженные ткани мозга больных шизофренией (38 образцов) и здоровых людей (35 образцов), полученные из Института Mona (Caíikt-Петербу рг, Россия), Mount Sinai Schizophrenia Brain Bank (США) и Stanley Foundation Consortium (США). Условия взятия и хранения тканей, критерии постановки диагноза и демографические характеристики этих образцов были описаны в работах: Hernandez et al., Neurosci. Res. 1997; Sokolov et al., Biol. Ps>ch. 2000; Torrey, Webster et al., Schizoph. Res. 2000, Пациенты не являлись родственниками и относились к белой расе. Больные шизофренией были отобраны по стандартным диагностическим критериям DSM-I1IR, DSM-IV. Здоровые индивиды не имели психических расстройств в анамнезе.

Образцы мышиного мозга. Для модельных экспериментов на мышином мозге использовали самцов линии C57BL/J6 в возрасте трех месяцев. Животные умерщвлялись посредством дислокации шейных позвонков, целый мол* извлекался, ополаскивался в физрастворе и замораживался на бане из сухого льда (-70°С). Для изучения кинетики деградации РНК умерщвленные животные выдерживались при -*-4°С в течение различных периодов времени от 0 до 121 часа.

Выделение РНК, геном u о ¡i ДНК н тотального белка. Получение кДНК.

ДНК и РНК выделяли нз 200-500 мг ткани, используя TRI-Reagent (MRC, Cincinnati) в соответствии с протоколами изготовителя. 5 мкг тотальной РНК обрабатывали ДНКазой (Gibco BRL) и проводили обратную транскрипцию при помощи набора реактивов SuperScript System (Gibco BRL) по протоколу изготовителя. Белковый экстракт получали, гомогенизируя при комнатной температуре 100 мг ткани в 500 мкл буфера Лэммли. Полученный -жстракт центрифугировали 10 мин при 15000 g, сулернатапт использовали для дальнейшем) анализа.

Электрофоретическос разделение фрагментов ДНК проводили в 7.5% и олп акрил »¡»дном i с л с на приборе ßio-Rad Minigel в течение КО мин. при напряжении 70В. Гель окрашивали в 0,0 По растворе красителя SYBR Green (FMC, Rockland, Maine) в течение 30 мин. Оптическую плотность полос в геле измеряли при помощи флуоресцентной деист ометрин на сканере Storm 800 (Molecular Dynamics).

Ген о тип про ванне по полиморфизму С( 102)Т проводили путем амплификации фрагмента гена 5HT2A-R длиной 327 нт при помощи стандартного набора реактивов PCR Gold (Gtbco BRL). Условия проведения ПЦР: 20 пг ДНК в 10 мкл реакционной смеси, 25 циклов (94°С - 30 сек., 60°С - 30 сек., 72°С - 30 сек.). Специфичность продукта подтверждали секвенированнем. Продукт амплификации расщепляли эндонуклеазой Hpall (New Engtand BioLabs Inc.). В случае аллеля Т продукт амплификации оставался полноразмерным, а в случае аллеля С расщеплялся на фрагменты длиной 216 и 111 п.о. Аналогичным образом проводили ген оптирован ие полиморфизма G(-1438)A: полноразмерный продукт 462 и.о. соответствовал А в положении (-1438), а фрагменты 219 и 243 и.о. - G.

Измерение содержания рРНК в образцах мозга проводили при помощи денситометрни (Storm 800, Molecular Dynamics) соответствующих полос рРНК после разделения 2мкг тотальной РНК в 1% агарозном геле и окрашивания бромистым эти днем.

Амплификация фрагментов РНК в образцах мышиного мозга. Для амплификации использовали кДНК, полученную, как описано выше, из 5 иг РНК, выделенной из образцов ткани. ПЦР проводили в 10 мкл при помощи набора реактивов PCR Gold (Gibco BRL). Условия проведения ПЦР: 95°С 5 мин, затем 20-28 циклов: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с. Лмплифицируемые гены и число циклов: синаптотагмин (24 цикла), фосфатаза РАС-1 (22 цикла), транскрипционный фактор CREM (28 циклов), рецептор серотонина 5НТ2А (28 циклов), фосфатаза РР1 (24 цикла), транскрипционный фактор TSC22 (24 цикла), бетэ-актпн (20 циклов).

Измерение относительного количества мРНК гена 5HT2A-R, экспресснруемого аллелями Т и С в гетерозиготах проводили нри помощи RT-ПЦР. кДНК, полученную из 20 иг тотальной РНК, подвергали тем же процедурам, которые были описаны для генопширования, Отношение количества аллеля С к количеству аллеля Т вычисляли из отношения интенсивности ресгрицированных продуктов амплификации кДНК 216 п.о. и 327 п.о., нормализуя его по соотношению таких же продуктов, полученных из геномной ДНК, где исходные количества аллелей заведомо равны.

Измерение количества мРНК гена 5HT2A-R проводили путем одновременной амплификации кДНК 5HT2A-R и Оета-актина, как описано ранее (Hernandez, J, Neurosci. Res. 1997), с модификациями.

Вестерн-блоттииг. Тотальный белок (20 мкг/дор) разделяли н 10% ПЛАГ с O.líó SDS 1,5 часа при 60 U при 4вС. Элсктроперснос на мембрану "Immim-Blot PVDF" (Bio-Rad) проводили в течение 1 часа при 300 мА и 4°С. Для детекции использовали антитела против 5НТ2А (Cloniech) в разведении 1:2000.

Окрашивали при помощи набора реагентов Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot System (Bio-Rad) в соответствии с протоколом произвол!¡теля.

Степень метилирования ДНК в гомозиготных (С/С) образцах определяли но соотношению продуктов амплификации ДНК, предварительно не обработанной и обработанной рестриктазой Hpall, чувствительной к метилированию. Геномную ДНК разводили в буфере для Hpall до конечной концентрации 6,7 мкг/мл, затем разделяли на две равные ал и квоты, и п одну из них добавляли Hpall в концентрации 20 U/мкг, а в другую равный объем буфера. Обе аликвоты инкубировали 5 час. при 37 С, затем 10 мин. при 95°С. 20 нг обработанной таким образом ДНК ам и л и фиии ро вали в 10 мкл реакционной смеси: 95°С 5 мин, затем 26 циклов (94®С 30 е., 60°С 60 с„ 72°С 50 е.), затем 72°С 5 мин. Продукты реакции разделяли электрофорезом в ПААГ. Определение степени метилирования в гетерозиготных (С/Т) образцах ДНК проводили так же, но после ПЦР проводили дополнительную обработку Hpall, чтобы различить аллели С и Т среди продуктов амплификации. Продукт амплификации аллеля Т не расщеплялся Hpall и служил внутренним контролем, по отношению к которому измеряли количество продукта амплификации аллеля С.

Статистический анализ результатов измерений проводили при помощи программы SPSS 8.0. При анализе данных использовали тест Стьюяента, дисперсионный анализ (ANCOVA), регрессионный и корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обзор имеющейся к настоящему времени литературы, посвященной изучению психических заболеваний, показывает, что большинство из них имеет сложную этологию, включающую генетический компонент, и относится к сложно наследуемым заболеваниям. Шизофрения, одно из наиболее распространенных и тяжелых психических заболеваний, является одним из центральных объектов изучения в течение многих лет, однако до сих пор остается невыясненным механизм наследования этого заболевания. Выявлены многочисленные кандидата ые i-ены и их полиморфные варианты, обнаруживающие ассоциацию с заболеванием. В последнее время все большее внимание уделяется возможности эпигенетической регуляции генов, повлеченных в развитие сложной ася еду ем ых заболеваний, то помогает объяснить особенности их возникновения н наследования. Фармакологические и другие исследования свидетельствуют, что многие психические нарушения, в том числе шизофрения, могут быть связаны с серотоннновой системой ней рот ране мисс ии и одним из ее ключевых компонентов - рецептором серогонина типа 2А (напр., Moranil et al„ Biol Psychiatry, 1983 и Soper et al., J Clin Psychopharmacol, 1990). Ранее было показано, что частот встречаемости аллеля

С гена этого рецептора повышена у больных, страдающих шизофренией (напр., Williams et al., Lancet, 1997 и Inayama el al„ Am J Med Genet, 1996); связь с частотой встречаемости аллеля С была показана также для отдельных признаков, характеризующих шизофрению, например, для ранней манифестации заболевания и восприимчивости к лечению атипическими ней рол егтти кам и (Голимбст и др., Журн. Неврол. Психиатр, им. С.С, Корсакова, 2001). Ранее было показано также, что функция рецепторов серотонина типа 2А снижена в тканях мозга больных шизофренией (Агога et al., J Neural Gen, 1991).

В настоящем исследовании были разработаны методы, позволяющие проводить функциональный анализ полиморфных вариантов генов путем измерения количества транскрнптов этих вариантов, а также измерять степень метилирования полиморфных сайтов, При помощи этих методов было провезено экспериментальное исследование экспрессии аллелей гена 5HT2A-R на аутонсийиых образцах мозга здоровых людей и больных шизофренией, а также измерен уровень метилирования полиморфных сайтов.

Обоснование правомерности использования RT-ПЦР дли измерения уровня экспрессии генов в аутопсий пых образцах тканей

Матекулярно-биологическне исследования, направленные на выяснение механизмов психических заболеваний, часто проводят па аутопсий ном материале. Интерпретация результатов таких исследований осложняется тем, что часть молекул в аутопсинных образцах может быть разрушена, что затрудняет проведение количественных измерений. Сохранность РНК в образце зависит от многих факторов: условий и времени проведения аутопсии, условий хранения ткани, pH мозга и величины промежутка времени между моментом смерти и моментом замораживания образца, называемого постморталышм интервалом (ГШИ). До настоящего времени в литературе сосуществуют противоречивые мнения о воздействии вышеперечисленных факторов на деградацию РНК н об их влиянии на результаты измерений, однако многие авторы полагают, что ИМИ на степени деградации РНК сказывается наиболее сильно (Burke et al., Brain Res Mol Drain Res, 1991).

Чтобы разработать методическую базу использования аутопенйных образцов мозга для измерения РНК, необходимо было выяснить, каково влияние ПМИ на сохранность молекул РНК различной длины и как деградация РНК влияет на точность измерений. Для решения этих вопросов были проведены модельные эксперименты но оценке сохранности РНК в образцах мышиного мозга с различными ПМИ, построена мате мат ичсская модель деградации молекул разной длины и проведена амплификация РНК различных генов из образцов мои-а с разными ПМИ.

Анализ общей лег рал a un и РНК проводили ла образцах мышиного и человеческого мозга. Степень сохранности РНК оценивали, измеряя содержание 28S и 18S рРНК. В модельном эксперименте умерщвленных самцов мышей оставляли при температуре +4°С на время от 0 до 12) часа. С увеличением ПМИ наблюдалось снижение количества обеих рРНК (рис.1, а, б), что свидетельствовало о наличии н мозге деградации РНК, связанной с ПМИ. Разнина ь скорости разрушения длинной 2SS рРНК и короткой 18S рРНК позволяет использовать их соотношение как количественную характеристику сохранности РНК в образце. Экспериментально наблюдаемое снижение

содержания 28S рРНК, J8S рРНК и их соотношения (рис. 1, б, в) показывает высокую степень корреляции с ПМИ (г - 0.95, р -0,0001 для 28S; г - 0.94, р = 0,005 для 18S рРНК; г - -0.854, р = 0.003 для соотношения 28S/18S). В образцах человеческого мозга была обнаружена значительная степень разрушения рРНК во всем диапазоне ПМИ (рис.1, в).

Pite. I. (а) Тотальная РНК. выделенная из мозга мышей, разделенная в ¡% агаромом геле. Над дорожками указаны ПМИ. (б) Количество 28S и 18S рРНК в образцах мышиного мозга в зависимости от ПМИ. (б) Соотношение 28S/I8S рРНК в образцах мышином и

человеческого мозга е зависимости от ПМИ.

образцах человеческого мозга по сравнению с образцами мышиного мозга может быть связано с различиями в процедуре отбора образца или с разной динамикой охлаждения ткани большого и малого обьема. Заметим, что измеренная степень деградации РНК не коррелирует пи е рП мозга, ни со временем хранения замороженного образца.

Для расчета степени деградации молекул РНК, основанном на измерении соотношения 28R/18S, была разработана математическая модель деградации

a lit M >HÜ i

î«- » » ; ï s

ЫХОн

3000«» 20ÛÛ l«9rl

~ 4- ÏBSpPHft IlSfPHK

lj ~ Èï

II"

• <ss грнк

о ISSFPHK

0 îi 50 TS 100

ПИИ. ч

О К Sí 75

ПМИ, 4

Более быстрое разрушение РНК в

молекул. Она основана на функции N » ,\'е * <г'и, где ЛГ„ - исходное число молекул данной длины, существовавшее в образце до начала распада; I - длина молекулы в нуклеотидах; </ - вероятность разрыла на един нуклеотид, которая и является характеристикой сохранности РНК в образце, зависящей от ИМИ и других факторов, перечисленных выше. Эта модель было продемонстрирует, что эффект ПМИ в большей степени сказывается на длинных молекулах, чем на коротких (рис.2): при одной и той же вероятности разрыва ц степень деградации длинных молекул намного выше, чем коротких. Выразив ц через измеряемое соотношение ^ 285/185 : ? = (0.923 -- 1п К)/2Ш, можно рассчитать диапазон ц для использованных в работе образцов человеческого и мышиного мозга (рис. 2).

Рис. 2, Теоретическая зависимость дат неповрежденных молекул (И) разной длины от интенсивности деградации (ф. Цифры возле кривых обозначают длину молекул в основаниях. Жирными линиями показаны диапазоны <), соответствующие измеренному соотношению 283/185 в образцах мышиного и человеческого мозга

Из этого рисунка видно, например, что в рассчитанном диапазоне для человеческих образцов деградирует от 3 до 1594 молекул длиной 500 нт., и от 25 до50% молекул длиной 2000 нт. Из проведенных расчетов следует, что результаты количественного измерения коротких фрагментов молекул (например, при помощи КТ-ПЦР) менее чувствительны к деградации образца, чем р'лультаты измерения количества нолноразмерных копий (например, при помощи Нозерн-блогтинга), и поэтому в большей степени пригодны для работы с аутопсий иыми образцами. Для проверки этого положения было при помощи ЯТ-Г1ЦР измерено содержание коротких фрагментов нескольких РНК в образцах с разными ПМИ. В образцах мышиного мозга были амплифицироваиы фрагменты

диенами ц для челоееч. образцов (ПМИ от 7 до В2 часов)

число разрывов на нук/дотад. 4

диапазон 9 для иышчных образцов (ПМИст0до121 часа)

мРНК бета-актина (длина фрагмента 221 нт>, рецептора серотонина 5НТ2Л (218 нт), сииаптотагмина (397 нт), фосфатиз РАС-1 (165 нт) и PPl (383 нт), транскрипционных факторов CREM (277 нт) и TSC22 (276 нт). В образцах человеческого мозга были амплифицированы фрагменты мРНК бета-актина (583 нт), рецептора серотонина 5НТ2А (383 нт) н нетранслируемого гена PSZA (562 нт). Регрессионный и корреляционный анализ полученных данных подтвердили, что эффект деградации РНК в используемых в работе образцах мозга не сказывается на измерениях коротких фрагментов РНК. Таким образом, метод RT-ПЦР может быть применен для измерения количества мРНК гена рецептора 5НТ2А на изучаемой выборке.

Методы измерения экспрессии аллелей Для исследования разницы в количестве транскрипта был разработан метод измерения сравнительной экспрессии аллелей в гетерозиготных индивидах (рнс.З).

1 f tnj*- | t4 ' ^ ' геноннн —1—<(jl-1-^ I ¡1--1 ДНК

а oüpmt* тряискрнлцр* т/ст/с I 4J HUP 1

*ДВК > ! & лцр I аш ЦЕП т{ 31Тнт — { цент — С i 111 ИТ — М м » ейв и&э | ^ fikCtpmuiiiit |

\ 1} рестрикция 1 [ЛИ □ Генами** „pifif ДИК ЩО _ □ <т

Рис. X Схема измерения относительной экспрессии аллелей, полиморфных по сайту узнавания эндонуклеазы. Приведен фрагмент геля с рестриуированнымы продуктами амплификации гена 5НТ2А-Н (гетерозиготы).

В гетерозиготах оба аллеля экспрессируются в одной и той же клетке, что гарантирует одинаковые физические и биохимические условия экспрессии. Сравнение экспрессии двух аллелей в одном и том же образце мозга позволяет избежать возможной вариабельности, связанной с демографическими факторами, отбором образцов н неодинаковой деградацией РНК. Суть метода заключается и том, что измеряется отношение полос рестрицированных продуктов амплификации аллеля С и аллеля Т в мРНК, и затем нормируется по соотношению соответствуют и м полос, полученных из геномной гетерозиготной ДНК, что позволяет избежать артефактов, связанных с разницей в прокрашивании полос и в амплификации аллелей.

Для того чтобы оценить, насколько точными являются измерения количества вещества при номошн ИЦР, был проведен калибровочный эксперимент (рис, 4). Для амплификации использовали клонированные в плазм иле фрагмены аллелей С и Т гена 5Н'1"2А-К. Плазмщщую ДНК, содержащую разные аллели, смешивали в соотношении ог 0,5 до 2, затем подвергали ПЦР, обрабатывали рсстриктазой НраИ и измеряли соотношение фрагментов, соотвествующих аллелям С н Т. Данный эксперимент показал, что метод ПЦР позволяет с высокой точностью измерять соотношения аллелей в указанном выше диапазоне.

а

Исходно* соотношение аллелей С и Т

о & ат а* 1 о

{Шоо— - гюп,

„ _ ^ ^ _ _ |Ш(1>

Исходное еотнсифни« дотлей С и "Т

Рис. 4. Калибровочный эксперимент для оценки аккуратности измерения соотношения аллелей при панощи П! 1Р. (а) Фрагмент геля, на который нанесены продукты амплификации смеси аллелей после обработки НраП. (б) Измерения соотношения оптической плотности полос 216 п. о. и 327 п. о, соответствующих аллелям С и Т.

Для измерения обшего количества мРНК была использована модификация стандартного метода. Количество транскрипта гена реиептора серотоннна измеряли относительно количества транскрипта гена бета-актина, амплифииировавшихся одновременно в одной реакции. Ген бета-актина является геном домашнего хозяйства, к ею экспрессия не зависит ог 1енотипа 5НТ2А-К или диагноза. Поскольку мРНК рецептора серотоннна представлена низким числом копий, была использована ступенчатая ПЦР.

13

Экспрессия гена 5HT2A-R у здоровых люден it у больных шизофренией Из литературы известно,' что функция рецепторов ссротонина типа 2Л снижена в некоторых областях головного мозга больных шизофренией. Нами было про везено сравнение экспрессии гена 5HT2A-R у здоровых людей и у больных шизофренией. Ранее была показана обратная корреляция между временным интервалом от последнего принятия нейролептиков до смерти н уровнем мРНК гена 5HT2A-R (Hernandez et al„ J Neurosci Res, 2000). Чтобы исключить эффект терапии на измеряемый параметр, число взятых для эксперимента образцов было ограничено теми пациентами, которые никогда не принимали нейролептиков или не принимали их более 26 недель до смерт. Уровень мРНК гена 5HT2A-R, измеренный по отношению к бета-актину, среди больных шизофренией всех трех генотипов (СУС, С/Т и Т/Т) был ниже, чем среди контролей (р - 0.03) и составил 0,59 ±0,12 (рис. 5).

Рис. 5. Общая экспрессия гена 5ПТ2А-Н у больных, страдающих шизофренией, снижена по сравнению со здоровыми контрояюли. По оси У отложено количество .иРНК гена 5НТ2А -Я, нормализованное к количеству мРНК гена бета-актина. Показана стандартная ошибка измерений.

Заметим, что измерение отдельно для бета-актина не обнаруживает статистически значимых различий для больных шизофренией в сравнении с контролями, что свидетельствует о том, что выявленные различия действительно вызваны изменением экспрессии гена SHT2A-R, а не бета-актина. Эти данные дакгг основания полагать, что снижение функции рецепторов 5НТ2А у больных шизофренией обусловлено снижением количества транскрипта гена 5HT2A-R. .

При сравнении обшей экспрессии мРНК гена 5HT2A-R среди здоровых индивидов с различными генотипами было обнаружено, чю общий уровень мРНК снижается в ряду генотипов Т/Т < С/Т < С/С (рис. 6, а). Различия между гомозиготами С/С и Т/Т были статистически достоверны (р - 0,015). Подробный статистический анализ полученных данных показал, что найденные различия не являются результатом воздействия сопутствующих факторов — таких, как пол,

возраст, рН образной и иостмортальный интервал.

Дополнительный анализ экспрессии рецептора 5НТ2А на белковом уровне был проведен при помощи антител к М-кониевой части белка 5НТ2Л (рис. 6, б) Было выявлено такое же соотношение между генотипами (С/С < С/Т < Т/Т), что и при анализе количества мРНК. На основании того, что количество белка в образках с разными генотипами изменяется пропорционально количеству мРНК, было сделано предположение, что транскрипция играет ключевую роль в механизме влияния аллель и ого состояния гена 5НТ2Л-К на его функцию.

р=0015

tft

CfT

с/с

п = 5 20 10

P>ooie

Г) = 4

Рис. 6. Сравнение уровней экспрессии гепа 5HT2A-R для мРНК и Селка в контролях с генотипами Т/Т, С/Т к С/С (а) Количество мРНК гена 5НТ2Л-И измеренное по отношению к мРНК бета-актшю,. (б) Количество белка 51ГГ2А, измеренное при помощи иимуно/р.туороссцентного окрашивания.

Относительная экспрессии аллелей СиТ гена 5HT2A-R у гетерозиготных индивидов

Существуют многочисленные данные об ассоциации между полиморфизмом С(102)'Г гена 5HT2A-R н различными психическими заболеваниями, в первую очередь, с шизофренией. Этот полиморфизм является молчащей заменой, т.е. полипептиды, кодируемые обоими аллелями, идентичны. В настоящей работе выдвигается гипотеза о там, что аллели СиТ могут различаться по уровню экспрессии reirá.

Для измерения относительной экспрессии аллелей была использована 1'НК из образцов мозга гетеро)иготных (С/Т) индивидов (15 от здоровых людей, 16 ог больных шизофренией) и геномная ДНК oí 25 гетерознплных индивидов (рис. 7). Чтобы учесть влияние нейролептиков на экспрессию гена 2HT2A-R в исследуемых образцах, пациенты были рамелены на 2 группы: (I) менее 11

недель между последним приемом нейролептиков и смертью и (2) более 26 недель между последним приемом нейролептиков и смертью. Было обнаружено, что экспрессия ад л ел я С у здоровых индивидов и у больных шизофренией снижена.приблизительно на 20% по сравнению с аллелем Т. Это снижение статистически достоверно (р< 0,001 для контролен, р < 0,001 для первой группы больных и р < 0,02 для второй группы бальных)

« 4 II

<-,-.

нРНК

ЯЯ Геномгда ДНК

□□ Здорсвыв «ритро.-и

Больны» шизофренией, ив голучтш* нвйролвятжва ворве 1в невв!»

Ьальн*« шиэофреи*4Йн ""и не погучвшив нейролвплчов меив» 11 недоль

Рис. 7. Измерение относительной экспрессии аллелей гена 5НТ2Л-И у здоровых индивидов и больных шизофренией. По оси V отложено соотношение аллелей С и Т, нормированное по геномной ДНК. Показана стандартная ошибка измерений.

Проведенные измерения не обнаружили статистически значимой корреляции между количеством мРНК гена рецептора 5НТ2А и такими факторами как возраст, постмортальный интервал, рН мозга и пол.

Таким образом, наши данные согласуются с предположением, что генетическая ассоциация аллеля С гена 5НТ2Л-К с шизофренией обусловлена сниженной экспрессией этого аллеля. В настоящей работе показано, что наличие аллеля С снижает транскрипцию гена 5НТ2А-К, что,, в свою очередь, вызывает снижение уровня белка. Известно, что снижение количества рецептора 5НТ2Л является фактором риска для возникновения шизофрении и других психических нарушений. Следовательно, наличие-аллеля С может быть фактором риска дл я развития заболевания. Таким образом, представленная работа предлагает подход, связывающий генотип с предрасположенностью к заболеваниям, который основан не на изменении структуры кодируемого этим геном белка, а на количественных изменениях в экспрессии гена.

Метилирование гена 5НТ2Л-К

Одним из механизмов избирательного снижения экспрессии аллеля С может быть дифференциальное метилирование этого аллеля. Известно, что полиморфизмы С(102)Т и С(-1438)А, специфичные для аллеля С, находятся в сцеплении. Сравнение нуклеогидных последовательностей аллелей С и Т выявляет две пары Срй, которые присутствуют в аллеле С, но не в алледе Т (рис.8). Эти пари формируются в том случае, если в положении (+102) находится С, а в положении (-1438) находится в.

гдонатар <--

I 1

А—.С —В^В-^СС"

Алл.льТ --С^^ТСб-,.

Рис.8. Схема рахтчий между аллелями Т и С гена 5НТ2Л-И в полиморфных сайтах А(-!438)0 и Т(!02)С. Жирным шрифтом выделены патиоргрные замены. Подчеркивание.» выделены СрО-пары, являющиеся потенциальными сайтами метилирования.

Поскольку пара СрО является мишенью для метилирования, аллель С обладает по сравнению с аллслем Т двумя дополнительными сайтами, которые могут быть метилированы. Известно, что метилирование ДНК тесно связано с транскрипционной активностью хроматина • как правило, с ее понижением. Поэтому можно ожидать, что аллель С, обладающий дополнительными метилированными СрС-сайтами, будет экспресс и роваться в меньшей степени, чем аллель Т, не имеющий этих сайтов. В настоящей работе была определена степень метилирования пар Срй, специфичных для аллеля С в образцах геномной ДНК, полученных из тканей мозга здоровых людей и больных шизофренией.

К настоящему времени известно, что метилирование цнтозинов как в островках СрО, так и в отдельно шояшнх парах СрО, может быть тканеспецифично и влиять на транскрипционную активность генов, определяя компактизашпо хроматина или связывание транскрипционных факторов,

17

Сообщается также, что метилирование отдельно стоящих нар СрО может послужить затравкой для распространения метилирования на соседние области. Сайт метилирования, формируемый полиморфизмом С( 102)Т, расположен в первом экзоне гена 5НТ2А-И, а сайт, формируемый полиморфизмом 0(-!438)А — в промогорной области (рис.8). Анализ последовательности показал, что оба сайта входят в состав отдельно стоящих пар СрО н не затрагивают сайтов узнавания основных известных на настоящее время транскрипционных факторов.

Методы измерения степени метилирования геномной ДНК в СрС-парах, специфичных для аллели С

Дтя определения степени метилирования обсуждаемых СрО-пар была применена методика, основанная на использовании рестриктазы, чувствительной к метилированию. Схема экспериментального анализа приведена на рис. 9.

Данный метод основан на том, что СрСг-пары, специфичные для аллсля С, одновременно являются пастью последовательности (ССйО), узнаваемой эндолуклеазой НраИ, которая не расщепляет метилированную ДНК. Таким образом, при обработке геномной ДНК этим ферментом расщепляется нсметилированный аллель С, а метилированный аллель С остается нерасщспленным. При последующей ПЦР

амшшфшшруется только

продукт метилированного аллеля Рис. 9. Схема, иллюстрирующая метод с Таким обр^ом, уровень определения степени метилирования ДНК МС1МЛ„роВання может быть вгачозиготах (генотип О'С). измерен как доля ДНК,

защищенная от разрезания НраН. В качестве контроля полноты рестрикции использовали запилом о нсметнлированный плазм иди ый клон гена 5НТ2А-Я, выделенный из Е. соИ,

В гетерозиготных индивидах представляется возможность использовать

Меметелмроба^ыа аллег^С Мвтнпированк^А алп«гьС

1 1 змия) 1 СПЯ}

-г—'

СчрС и*

л- СТ£ицц*«А ИМ!|

^—- (а>

Дпцг Длцр

ПРОДОЛЫ

аллель Т в качестве внутреннего контроля, относительно которого измеряется количество полутон амплификации метилированного и иеметнлированного алледя С. На этом основана впервые разработанная нами ме голика количественного измерения метилирования в гегерозиготах (рис. 10).

Рветрмщк» ЬрВ*!

ГеношмДнк

^ —— стад— ^

О-» —-

^ -Цйй».

ицч -ьем-—

Рис, 10. Cxe.ua. иллюстрирующая .метод определения степени метилирования ДНК у гетерозиготных индивидов (на примере попшар<ризма Т(102)С). Показаны алюль Т и два варианта шлем С - метилированный и неметияироеанный. Полиморфный нуклеотид выделен жирным шрифтом.

Такой подход позволяет избежать погрешностей, вносимых ПЦР, гак как реакции проходят параллельно в одной пробирке.

Измерение степени метилирования СрС-пар, специфичных для аллсля С

При помощи разработанных методов была измерена степень метилирования в обоих полиморфных сайтах, специфичных для алледя С.

Для измерения и гомозиготах было использовано 3 образна, полученных от здоровых индивидов и в 2 образца, [«.»лученных ог больны* шизофренией (рис. 11). Было обнаружено, что обе пары СрО, специфичные для алледя С, метилированы как у здоровых людей, так и у больных шизофренией.

Т --- "Т" Г---'--гфвдукт • '

1 „ Т

__^ с"--««л. .и*

I-у/ > - м*тмроа. »лп^лаС

-гч ^ '." г

И*ж сфодукт*

РвСПМВДШ

ПЦР Ирм

«« 100 1 Н

С(-1438) £

:5 ■

Зя^

б С<102)

100 и

50 ■

[3 моровые

больные шизофренией

п- 3

п- 3 2

Рис. II, Уровень метилирования СрО-пар. специфичных для аллеля С, у гомозиготных индивидоч, (а) пара Ср(3, расположенная в промоторной области; (б) пара СрО, расположенная в кодирующей области. По оси Г отложен уровень метитрования как дат ДНК, защищенная от разрезания НраЦ. Показана стандартная ошибка ихмерений.

Анализ степени метилирования у гетерозигот проводился на 7 образцах ДНК, полученных из мозга здоровых индивидов и 9 образцах из мозга больных шизофренией. Было обнаружено, что степень метилирования пар Срй, расположенных в промоторе, составляет около 100%, а в кодирующей области около 75% этих пар метилированы как у здоровых людей, так и у больных шизофренией (рис. 12). Эти различия статистически значимы (р - 0,0003 для здороных н р < 0,0001 для больных шизофренией)._

а С(-1438) б С(102)

3 «1 , * Э 1 ¡1 ! X = Г*1 1 100 Г1, Й | [ здоровые больные ш:гаофренией

«п £ 11 50 1 н

2Я о 2 Д* № 1*8* ! ]

п-" 7 9 п - _ 7 И. 9

Рис. 12. Уровень метилирования Срй-пар, специфичных для аллеля С, у гетерозиготных индшш)ов. По оси У отложен уровень метилированы как Ооля ДНК, защищенная от разрезания НраН. Показана стандартная ошибка измерений.

Таким образом, в ДНК головного мозга наблюдается су mecí пенное метилирование nap CpG, специфичных для аллеля С, как у здоровых людей, гак и у больных шизофренией. Эти результаты согласуется с изложенными выше нашими данными о том, что относительная экспрессия аллеля С у гетерозигит приблизительно одинакова для здоровых людей и больных шизофренией. Не было обнаружено статист чески значимой корреляции между степенью метилирования двух изучаемых (tap CpG, а также между степенью метилирования этих пар CpG is уровнем экспрессии аллеля С, Это может быть объяснено как действительным отсутствием зависимости, так н недостаточной выборкой нли недостаточной чувствительностью методов измерения.

Суммируя полученные нами данные по метилированию аллельных вариантов гена 5HT2A-R, можно заключить, что обнаруженное в настоящей работ« дифференциальное метилирование аллелей этого гена может обуславливать различную экспрессию этих аллелей и таким образом объяснять причину генетической ассоциации полиморфного варианта C(102)/G(-143J¡) с шизофренией. Генетически определяемые различия в нуклеотндной последовательности аллеля С по сравнению с шмелем Т, приводят к возникновению двух дополнительных сайтов метилирования, что открывает возможность для эпигенетической регуляции экспрессии данного гена. Эта особенность наследования и регуляции одного из важнейших генов серотониновой системы может служить одним in объяснений сложного характера наследования основных психических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы для определения уровня экспрессии гена в зависимости от его аллельною состояния. Высокая чу вствителмюсть методов достигается за счет использования внутренних контролей при амплификации.

2. Разработана методика измерения и исследована динамика степени деградации РНК в аугопсийных обрезпах мозга. Показана возможность изучения экспрессии гена при помощи RT-IILIP в постмортальных образцах мозга при амплификации коротких (до 600 п.и.) фрагментов.

3. Проведено исследование уровня экспрессии tena 5HT2A-R у здоровых людей и больных шизофренией. Показано, что общий уровень трапскрнига тепа 5HT2A-R в аугопсийных тканях мозга больных шизофренией снижен по сравнению со здоровыми людьми. Предложена гипотеза, чю известное снижение функции рецептора 5ПТ2А у больных шизофренией связано со снижением количества транскрипта этого гена.

4. С номошыо разработанных методов проведено изучение уровня

экспрессии аллельных вариантов гена 5HT2A-R. Выявлено снижение уровня экспрессии raía в случае аллельного варианта 102CAI438G но сравнению с аллельным вариантом 102ТА1438А. Предложена гипотеза, что известный из литературы небольшой вклад аллельного варианта 1Ü2CA1438G в предрасположенность к шизофрении может быть опосредован обнаруженным в данной работе снижением количества транскрипта этого аллельного варианта.

5. Разработаны методы определения степени метилирования у гомозиготных и гетерозиготных индивидов для гена 5HT2A-R. При помоши этих методов определена степень метилирования nap CpG, специфичных для аллельного варианта 102CA1438G, Обнаружено, что эти пары CpG частично метилированы в тканях мозга здоровых людей и больных шизофренией. Предложена гипотеза, что обнаруженное в настоящей работе снижение экспрессии аллельного варианта 102CA1438G обусловлено метилированием специфичных для этого аллельного варианта пар CpG.

Основные результаты диссертации представлены в следующих работах;

1. Polesskaya О.О., Sokolov В.Р. Differential expression of the "С" and T" alleles of the 5-HT2A receptor gene in the temporal cortex of normal individuals and schizophrenics." J. Ncurosci Res. 2002.67(6). P.812-822.

2. Polesskaya O.O., Haroutunian V., Davis K.L., Hernandez 1., Sokolov B.P. Novel putative nonprotem-coding RNA gene from 1Ц14 displays decreased expression in brains of patients with schizophrenia. J. Neurosci Res. 2003. 74(1).

3. Sokolov B.P., Polesskaya O.O. Mechanisms of differential expression of the "C" and "T" alleles of the S-HT2A receptor gene. Possible role for allele specific methyiation. Abstract. Society of Biological Psychiatry, 2002 Annual Meeting, Philadelphia. PA. May 16-18.

4. Polesskaya O.O., SoVoiov B.P. Low expression of the C(102) allele of the 5-H'I2A receptor gene may underlie its association with schizophrenia. Society of Biological Psychiatry, 2001 Annual Meeting, New Orleans, LA, May 3-5, 2001, Biol, Psychiatry. 2001. P.49.

5. Polesskaya O.O., Sokolov B.P. Decreased expression of C(102) allele and a deficit ¡n the 5-HT2A receptor gene expression in schizophrenia. Abstracts, 39" Annua) Meeting of American College of Neuropilhopharmneology, San Juan, Puerto Rico, 2000. Dec. 10-14.

P.1U-122.

Р194 П

Информация о работе
  • Полесская, Оксана Олеговна
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2003
  • ВАК 03.00.26
Автореферат
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНАХ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К СЛОЖНОНАСЛЕДУЕМЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ НА ПРИМЕРЕ ГЕНА 5HT2A-R - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации