Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к инсульту на фоне гипертонической болезни

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к инсульту на фоне гипертонической болезни"

005020059

На правах рукописи

у*

г/

ВЯЛЫХ Екатерина Константиновна

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИНСУЛЬТУ НА ФОНЕ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ

03.02.07-генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 ДПР 2012

Белгород-2012

005020059

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет" Минздравсоцразвития России

Полоников Алексей Валерьевич

доктор медицинских наук, профессор

Петрин Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий

Прощаев Кирилл Иванович

доктор медицинских наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», профессор кафедры внутренних болезней №2

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «2012 г. в/^^часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь совета по защите дикторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цереброваскулярная патология занимает второе место среди главных причин смертности и инвалидазации населения экономически развитых странах, что определяет её как одну из важнейших медико-социальных проблем [Беленков, и др., 2003]. Хорошо известно, что гипертоническая болезнь является ведущим фактором риска развитая мозгового инсульта [Goldstein LB et al, 2011].

Гены, в отношении которых на сегодняшний день установлены ассоциации с развитием инсульта, относятся к разным генетическим системам: гены ренин-ангиотензиновой системы, системы гемостаза, местной регуляции сосудистого тонуса, гены, кодирующие метаболизм гомоцистеина и липидов, гены программированной клеточной гибели и многие другие [Скворцова и др., 2003]. К настоящему времени уже имеется достаточно большое число доказательств, что окислительный стресс, возникающий в результате генетически детерминированных нарушений баланса между накоплением высоко реактивных свободных радикалов и процессов их обезвреживания антиоксидантаой системой, играет ключевую роль не только в развитии артериальной гипертензии [Ohta К. et al, 2003; Dolan С. et al, 2003; Moreno M.U. et al, 2003,2006; Zhou X.F. et al, 2005; Yamada Y. et al, 2007; Rodrigo R. et al, 2007; Marinho C. et al, 2007; Naganuma T. et al, 2008], но и в развитии ишемического и геморрагического инсультов [Sugawara Т, Chan PH., 2003; Zimmermann С. et al, 2004; Aygul R. et al, 2006; Amantea D. et al, 2009; Nanetti L. et al, 2011]. В частности, у больных, перенесших инсульт, обнаружены изменения параметров функционирования анпюксвдангной системы: снижение активности ферментов АОС (каталазы, супероксиддисмутазы), снижение уровня окисленного и восстановленного глутатиона, а также повышение уровня продуктов перекисного окисления липидов [Zimmermann С. et al, 2004; Трофимова С.А. с соавт.,2010].

Антаоксидантная система включает в себя большое количество звеньев, но генетически детерминированными являются антиоксидантные ферменты, которые в популяции характеризуются выраженными межиндивидуальными различиями в ферментативной активности, благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей. В литературе имеется незначительная часть исследований в которых изучена роль отдельных полиморфных вариантов генов АОС в развитии мозгового инсульта. До настоящего времени комплексного изучения вклада полиморфных генов ферментов АОС в формирование предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни не проводилось, как в России, так и за рубежом. Выше изложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования. Провести комплексный анализ вовлеченности генов ферментов АОС в формирование предрасположенности к развитию мозгового инсульта, развивающегося на фоне гипертонической болезни.

Задачи исследования.

1. Исследовать ассоциации полиморфизмов генов ферментов АОС: GPX4 Т718С, GSTPJ 110 W, PON2 S311С, FM03 Е158К, САТ А20Т, CYP1A11462V, +/del GSTTJ и +/dd GSTMI с риском развитая мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью с учетом полового диморфизма и возраста манифестаци и заболевания.

2. Изучить роль взаимодействия между генами ферментов АОС в формировании наследственной предрасположенности к мозговому инсулыу на фоне гипертонической болезни.

3. Выявить особенности генно-средовых взаимодействий и их значение для развития мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью посредством оценки совместного влияния полиморфизма изучаемых генов и средовых факторов риска заболевания.

4. Исследовать взаимосвязь полиморфизма генов АОС с клиническими проявлениями нарушения мозгового кровообращения и разработать критерии вероятностного прогнозирования риска развитая инсультов у больных ГБ.

Научная нопизна исследования. Впервые проведен комплексный анализ ассоциации 8 полиморфных вариантов генов ферментов АОС: GPX4 Т718С, GSTP11105V, PON2 S311C, FM03 Е158К, САТ А20Т, CYP1A11462V, +/del GSTT1 и +/del GSTMI с щгедрасположенностью к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни. Впервые изучен характер взаимодействия между полиморфными вариантами генов АОС и установлен их вклад в формировании генетической компоненты подверженности мозговому инсульту у русских жителей Центрального Черноземья. Охарактеризован половой диморфизм предрасположеннсюти мозговому инсульту на фоне ГБ, детерминированный комплексом генов ферментов АОС. Впервые проведено моделирование межгенных взаимодействий в системе редокс-гомеостаза, связанных с развитием инсульта у больных ГБ, методом MDR. Впервые исследованы взаимодействия генотип-среда, формирующие предрасположенность к мозговому инсульту на фоне ГБ.

Научно-нрактическая значимость исследования. В результате исследования на основе тестирования полиморфных генов ферментов АОС в сочетании с другими факторами риска были разработаны статистические регрессионные модели вероятностного прогнозирования риска развития мозгового инсульта на фоне ГБ. Практическое использование моделей дает возможность врачам-генетикам, кардиологам, терапевтам и неврологам формировать среди пациентов с ГБ группу повышенного риска развития инсульта, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений регуляции АД, которые направлены на предупреждение развития сосудистых мозговых катастроф. Результаты исследования могут использоваться при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, шггофизислогии, неврологии, терапии, кардиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Личный вклад диссертанта в выполнение данной работы. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведено выделение ДНК у 667 больных.

Диссертант принимал непосредственное участие в проведении медико-генетического тестирования, статистической обработке полученных данных и анализе результатов исследования. Подготовлены основные публикации по теме выполненной работы. Лично участвовала в апробации результатов исследования.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационного исследования доложены на V-й международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2010), II-й Всероссийской научно-пракшческой конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии" (Курск 2011 г.), на конференции Европейского общества генетиков - ESHG (Амстердам, 2011) на итоговых научных сессиях ГЪОУ ВПО "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2009-2011),

По материалы диссертации опубликовано 13 печатных работ, в т. ч. 4 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Положения, выносимые на защиту

1. Полиморфизмы генов ферментов антиоксидантной системы являются важной генетической составляющей предрасположенности к мозговому инсульту, а также модификатором возраста его манифестации у больных, страдающих гипертонической болезнью.

2. Во взаимосвязях полиморфных вариантов генов ферментов ангаоксидантной системы с риском возникновения мозгового инсульта при ГБ наблюдается отчетливый половой диморфизм, характеризующийся наибольшим вкладом исследованных генов в детерминацию риска развитая мозгового у женщин, а также качественными различиями между мужчинами и женщинами в спектре ассоциированных ДНК-маркеров.

3. Генетическую основу предрасположенности к мозговому инсульту при гипертонической болезни составляют сложные взаимодействия между генами ферментами А ОС аддитивного и эпистатического характера, которые на фенотипическом уровне могут объяснять имеющийся дисбаланс в системе редокс-гомеостаза и усиление проявлений окислительного стресса - ключевых патогенетических механизмов развитая мозгового инсульта.

4. Взаимосвязи полиморфных вариантов генов ферментов АОС с риском возникновения мозгового инсульта у больных ГБ модифицируются под влиянием разнообразных по природе средовых факторов, большая часть которых является известными факторами риска развития гипертонической болезни и мозгового инсульта.

5.Полиморфизмы генов ферментов АОС взаимосвязаны с клиническими проявлениями нарушений мозгового кровообращения и в сочетании с дугами факторами риска являются значимыми предикторами в прогнозировании вероятности возникновения мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и метод, собственных результатов, общего обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 150

страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 4 рисунками. Список литературы включает 220 источников: 60 отечественных и 160 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для ихледования послужила выборка неродственных больных ГБ русской национальности, проживающих в Цешральной России общей численностью 657 человек. Диагноз ГБ устанавливался после исключения всех вторичных артериальных пнпертензий с помощью клинических, лабораторных и клинико-инстру ментальных методов. Диагноз инсульта подтверждался магнитно-резонансной томографией головного мозга. Больные находились на стационарном лечении в неврологических и кардиологических отделениях Курской областной клинической больницы и городской больницы скорой медицинской помощи г. Курска И:; 306 пациентов с диагнозом мозговой инсульт (группа ГБ-МИ) геморрагический инсульты перенесли 25 пациентов, с ишемический инсульт - 281 больной ГБ. Контрольную группу в количестве 361 человека составили больные ГБ, не имевшие в анамнезе острых нарушений мозгового кровообращения. Группы больных ГБ и больных, перенесших инсульт, на фоне ГБ были сопоставимы, как по полу, так и по возрасту (р>0.05). Для проведения молекулярно-генетических исследований: у всех обследуемых проводился забор венозной крови. Выделение геномной ДНК осуществляли из венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции. Пациентам проводилось генотипирование 8 полиморфизмов генов ферментов АОС GPX4 Т718С, САТ-21А>Т, FM03 Ё158К, CYP1A1 I462V, PON2 C311S, GSTP11105V, GSTM1 del/+ и GSTTI del/+ методами ПЦР и рестрикционного анализа по методикам, опубликованным в литерэтуре.

Ддя оценки соогветствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Е!аинберга и для сравнения распределений частот генотипов и атлелей в выборках больных ГБ и контрольной группе использовали критерий х2 и отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI). Межгенные взаимодействия изучали двумя различными подходами. Первый подход был реализован посредством сравнительного анализа парных комбинаций генотипов между группами и расчета отношения шансов с целью оценки тенденций в накоплении функционально неполноценных сочетаний генотипов генов АОС среди больных ГБ, перенесших инсульт, в отличие от контроля. Второй подход - был реализован с помощью метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), предложенного Ritchie M. D. et al [2003]. Анализ взаимодействий генотип-среда проводился; путем сопоставления величин отношения шансов (OR), рассчитанных для индивидуальных генотипов в группах, сформированных по критерию наличия или отсутствия средового фактора риска [Pearce N., 1993].

Метод логистической регрессии использовался для оценки влияния полиморфных генов АОС на риск развития МИ у больных ГБ, клинические симптомы и особенности течения болезни [Hosmer D. W., Lemeshow S., 2000]. При оценке уравнений регргссии использовался метод пошагового включения предикторов, который ранжировал признаки в соответствии с их вкладом в модель. В качестве критерия согласия реального распределения наблюдений использовались показатели чувствительности и специфичности. Статистическая

обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 8.0 ("StatSoft") и MS Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Распределение частот аллелей и генотипов ферментов антиоксидантной

системы в исследуемых группах больных гипертонической болезнью

Для большинства полиморфизмов генов А ОС частоты генотипов находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга. Отклонения частот генотипов от РХВ установлено для полиморфизма А20Т гена CAT в группе больных ГБ, перенесших инсульт и для полиморфизма S311C гена PON2 в группе больных ГБ без ОНМК. Для двух полиморфизмов (GPX4 Т718С и PON2 S311C) установлены статистически значимые различия в частотах аллельных вариантов между группами. Так, вариантные аллели 718С гена GPX4 (OR=l,53 95%С1 1,23-1,90) и 311С гена PON2 ассоциировались с повышенным риском развития МИ у больных ГБ.

Установлено, что дефицит генотипа 718ТТ гена GPX4 сопряжено с повышенным риском возникновения МИ у больных ГБ (OR=2,12 95%С1 1,423,16). Генотип 718СС GPX4 также ассоциировался с повышенным риском развития МИ (OR=l,51 95%С11,09-2,09). Генотип 20АА гена СЛГ был связан с пониженным риском развитая МИ у больных ГБ (OR=0,69 95%С10,47-1,01). Генотип del/del гена GSTT1 также был ассоциирован с повышенным риском развития МИ. Дефицит гомозиготного генотипа дикого типа 311SS гена PON2 был сопряжен с повышенным риском развития инсульта (OR=l,95 95%С1 1,42-2,69). Генотип 311SC гена PON2 также увеличивал риск возникновения МИ у пациентов, страдающих ГБ (OR=l,77 95%С1 1,30-2,41). В отношении других локусов статистически значимых различий между группами не наблюдалось.

Половые различия в ассоциациях генов ферментов антиоксидантной системы с риском развития МИ и роль исследуемых генов в возрастной манифестации инсульта у больных гипертонической болезнью

Стратифицированный по полу анализ ассоциации генотипов АОС с риском развития МИ у больных ГБ позволил выявгаъ различия в характере взаимосвязей изучаемых генов с формированием предрасположенности к поражению головного мозга при артериальной гипертензии. Так, дефицит генотипа дикого типа 718ТТ гена GPX4 ассоциировался с высоким риском возникновения инсульта, как у мужчин (OR=l,92 95%Ci 1,12-3,30), так и у женщин (OR=2,46 95%С1 1,34-4,51), страдающих ГБ. Протекгивный эффект в отношении риска возникновения инсульта у мужчин установлен для носителей генотипа 20АА гена CAT (OR=0,57 95%CI 0,33-0,99), тогда как у женщин данной ассоциации не обнаружено. В отличие от мужчин, у женщин носигельство гетерозиготного генотипа 4621V гена CYP1A1 увеличивало более чем в 2 раза риск развития МИ (OR=2,23 95%С1 1,18-4,21), Дефицит генотипа дикого типа 462II гена CYP1A1 также ассоциировав с повышенным риском инсульта только у женщин (OR=l,86 95%С1 1,02-3,40). У женщин, в отличие от мужчин, выявлена выраженная ассоциация генотипа 311SC PON2 с риском развития МИ (OR=2,63 95%С1 1,68-4,10). Кроме того, дефицит генотипа 311SS гена PON2 ассоциировался более чем с 3-кратным увеличением риска мозгового инсульта у женщин, страдающих ГБ OR=3,l 1 (95%С1 1,94-4,98).

Далее представлены результаты анализа ассоциации генотипов ферментов АОС с риском возникновения МИ в раннем (до 60 лет) возрасте. Установлено, что отсутствие генотипа 718ТТ гена GPX4 было сопряжено почта с 2-кратным увеличением риска раннего развития МИ у больных гипертонической болезнью (OR=l,92 95%С1 1,13-3,27). Носительство генотипа 718СС гена GPX4 также увеличивало риск развития раннего инсульта у больных ГБ (OR=l,52 95%С1 1,00232). Также было установлено, что гипертоники-носители гомозиготного генотипа 158КК по вариантному аллелю гена FM03 имели повышенный риск развития МИ (OR=l,56 95%С1 1,00-2,42). Отсутствие генотипа 31 ISS (OR=2,12 95%С1 1,36-3,26) и наличие генотапа 311SC (OR=l,75 95%С11,17-2,62) гена РОЮ ассоциировались с ранним развитием мозгового инсульта у больных ГБ. Почти 2-кратное увеличение риска раннего развития МИ установлено для носителей генотипа del/del гена GSTTI (OR=l,83 95%С1 1,22-2,74). Однако носительство генотипа del/del гена GSTT1 ассоциировалось с ранним развитием МИ только у мужчин-гипертоников (OR=l,86 95%С1 1,08-3,23). Дефицит генотипа 718ГГ гена GPX4 был ассоциирован с повышенным риском развития раннего МИ у женщин (OR=2,63 95%С1 1,06-6,52). Гомозиготный генотип 158КК гена FM03 почта в 2 раза увеличивал риск развития раннего инсульта у женщин (OR=l,87 95%С1 0,98-3,55). Отсутствие у женщин генотипа 311SS гена PON2 увеличивало риск развитая раннего МИ в 4,5 раза (OR =4,51 95%С1 2,15-9,44). Носиягельсгво генотапа 311SC гена PON2 бьшо также ассоциировано с повышенным риском МИ до 60 лет у женщин-гипертоников (OR=2,73 95%С11,48-5,02).

При рассмотрении результатов стратифицированного анализа ассоциации генотипов ферментов АОС с риском возникновения инсульта после 60 лет, установлено, что дефицит генотапа 718ТТ гена GPX4 более чем в 2 раза увеличивал риск позднего развития мозгового инсульта у мужчин-шпершников (OR=2,16 95%С1 1,07-4,35). В отношении других локусов генов ферментов АОС статистически значимых ассоциаций с поздней манифестацией МИ у мужчин с ГБ не выявлено. Протективный эффект генотапа 20АА гена CAT был установлен в отношении риска позднего развития инсульта у гипертоников (0R=0,64 95%С1 0,41-0,99).

У мужчин с ГБ установлено, что дефицит генотипа 718ТТ гена GPX4 более чем в 2 раза увеличивал у них риск позднего развития мозгового инсульта (OR=2,16 95%CI 1,07-4,35). В отношении других локусов генов ферментов АОС статистически значимых ассоциаций с поздней манифестацией МИ у мужчин с ГБ не выявлено. Недостаток генотипа 718ТТ гена GPX4 был ассоциирован с повышенным риском развития позднего МИ у женщин (OR=2,29 95%С1 1,12-4,67). Дефицит генотипа 462II гена CYP1AI у женщин был связан почта с 2-кратным увеличением риска МИ позднего возраста начала (OR=l,94 95%С1 0,99-3,78). Кроме того у женщин носительство генотипа 4621V гена CYP1AI бьшо также сопряжено с повышенным риском возникновения позднего МИ (OR=2,25 95%С1 1,11-4,52). Генотип 311SS гена PON2 почти в 2 раза увеличивал у женщин риск развития МИ поздней манифестации (OR=2,45 95%С1 1,43-4,18). Кроме того, носительство гетерозиготного генотипа 311SC гена PON2 увеличивало риск возникновения мозгового инсульта у женщин, страдающих ГБ (OR=2,29 95%С1 1,37-3,81).

Анализ взаимодействия генов ферментов антиоксидантной системы у

больных гипертонической болезнью и их значение для формирования предрасположенности к мозговому инсульту

Посредством анализа парных межгенных сочетаний генотипов были изучены взаимодействия между полиморфными вариантами генов ферментов АОС при ГБ, осложненной мозговым инсультом, с учетом выявленного полового диморфизма. Всего 16 парных сочетаний генотипов ферментов АОС были статистически значимо ассоциированы с предрасположенностью к мозговому инсульту у мужчин, страдающих ГБ. Наиболее патогенетически значимыми для развития инсульта у мужчин были взаимодействия следующих генов: GPX4 С718Т, CAT -21А>Т, CYP1A1 I462V, FM03 158ЕК и GSTTI +del. Наиболее мощные ассоциации (0,4<OR>2,0) мозгового инсульта у мужчин больных ГБ наблюдались с полиморфными вариантами генов АОС, такими как GPX4 С718Т, CAT -21А>Т, FM03 158ЕК, PON2 311SC и GSTTI +del, для которых нами были установлены ассоциации их аллелей и генотипов на предыдущих этапах работы. В отличие от мужчин, у женщин, страдающих ГБ, обнаружено 35 парных сочетаний генотипов ферментов АОС, статистически значимо ассоциированных с предрасположенностью к мозговому инсульту. Наиболее патогенетически значимыми для развития инсульта у женщин были взаимодействия следующих генов: GPX4 С718Т, PON2 311SC, GSTP1 I105V, CYP1A1 I462V и FM03 158ЕК. Наиболее мощные ассоциации (0,4<OR>2,0) мозгового инсульта у мужчин больных ГБ наблюдались с полиморфными вариантами генов АОС, такими как GPX4 С718Т, CAT -21 А>Т, FM03 158ЕК, PON2 311SC, GSTP1 I105V и GSTTI +del. В целом, как у мужчин, так и у женщин, перенесших МИ, наблюдалась отчетливая тенденция в накоплении генотипов, функциональные варианты которых характеризуются избыточной активностью ферментов прооксидантного действия и/или пониженной активностью антиоксидантных ферментов.

Для оценки межгенных взаимодействий методом MDR использовался алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive), который оценивал все возможные комбинации ДНК-маркеров в отношении риска развития МИ. В случаях, когда данный алгоритм не позволял выявить статистически значимую модель, мы использовали алгоритм Forced (Forced search algorithm), на основании которого для создания и-локусных комбинаций маркеров вручную выбирались генные локусы, которые на предыдущих этапах анализа показали ассоциации с риском развития инсульта. На рисунке 1 представлены взаимодействия между данными генами в пределах полученной модели взаимодействующих генов. Выраженный синергизм наблюдался между полиморфизмами генов FM03 Е158К и GSTP1 I105V, а также между CAT -21А>Т и PON2 S311C (последний SNP не был представлен в наилучшей четырехлокусной модели). Умеренной силы антагонизм в отношении влияния на риск развития МИ у мужчин выявлен для вариантов С718Т гена GPX4, CAT -21А>Т и PON2 S311C. Как видно из рисунка 1 (нижняя часть рисунка), именно для локуса GPX4 С718Т наблюдался наиболее выраженный фенотипический эффект в отношении риска развития мозгового инсульта у мужчин. Применение алгоритма всестороннего поиска у женщин была выявлена трехлокусная модель взаимодействия генов FM03 Е158К х PON2 S311С х GSTP1 I105V, показавшая наилучшую воспроизводимость (100%) и точность предсказания

(64%). После 1000 симуляций был установлен минимальный эмпирический уровень значимости взаимодействия между данными генами р=0,001.

Рисунок 1

Структура межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов антиоксидантной системы при мозговом инсульте у мужчин (вверху -кластерный анализ, снизу - граф, отражающий силу взаимодействий между локусами)

- УМОЗ Е158К

-азгрцюяу

:—-------—----------———-——--------------------- 0'57:г// +((е1

- арх-:п\?х:

- атл:от

РОЫ2 S311С-

GSTP1 I10SV GSTM1 del

0,17% ' 0,26%

Примечание.

Цвет пиний отражает характер взаимодействия между генами: красный -выраженный синергизм в отношении влияния на фенотип, оранжевый -умеренный синергизм, синий - выраженный антагонизм в отношении влияния на фенотип, зеленый - умеренный антагонизм, коричневый - аддитивное взаимодействие генов. % отражает силу и направленность фенотипического эффекта взаимодействия генов (% энтропии).

На рисунке 2 представлены графические отображения взаимодействий между данными генами в пределах полученной модели взаимодействующих генов. Выраженная степень синергизма наблюдалась между полиморфными вариантами генов FM03 Е158К и CAT -21А>Т (последний SNP не был

представлен в наилучшей модели), а также между PON2 S311С и GSTP1 I105V. Как видно из рисунка 2, для локусов РОЮ S311C (5,5%) GPX4 С718Т (2,1%) наблюдался наиболее выраженный фенотипические эффект в отношении риска развития мозгового инсульта у женщин, как было оценено на основе величин положительной энтропии во взаимодействии между данными полиморфными генами АОС. Таким образом, взаимодействия между генами АОС, отличающиеся у мужчин и женщин, по всей видимости играют важную роль в детерминации предрасположенности больных гипертонической болезни к развитию мозгового инсульта.

Исследование роли генно-средовых взаимодействий в развитии мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью

Нами был проведен стратифицированный анализ влияния генотипов АОС на риск развития МИ у больных ГБ в зависимости от наличия тех или иных средовых факторов риска болезни. Данный анализ проводился в объединенных выборках пациентов, а случае обнаружения ассоциаций с каким-либо маркером - раздельно у мужчин и женщин. Изучалась взаимосвязь полиморфизмов генов АОС с риском развития МИ у больных ГБ в зависимости от влияния 6 средовых факторов, таких как курение, употребление алкоголя, уровня физической активности, наличия хронических стрессов, солевого аппетита и уровня употребления свежих овощей и фруктов. Нами было установлено большое число статистически значимых взаимодействий генотип-среда, связанных с риском развития МИ у больных ГБ, у мужчин и женщин. Причем многие генотипы АОС оказывали влияние на риск развития МИ при участии средовых факторов различной природы. В качестве примера можно привести несколько генно-средовых взаимодействий. Так, носительство вариантных генотипов (718ТС+718СС) GPX4 ассоциировалось с повышенным риском развития инсульта у больных ГБ независимо от пола и статуса курения, но для курильщиков обладателей указанных генотипов риск возникновения инсульта был значительно выше, чем для некурящих пациентов (р=0,03). Носительство указанных генотипов GPX4 у больных ГБ с умеренным или низким употреблением алкоголя увеличивало риск развития МИ более чем в 2,5 раза р<0,0001).

Рисунок 2

Структура межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов антиоксидантной системы при мозговом инсульте у женщин-гипертоников (вверху - кластерный анализ, снизу - граф, отражающий силу взаимодействий между локусами)

Г

- roN: sine

- О.ЧТР! MOiV

P0N2 S311C^_Ti55r^_GSTP1 1105V 5,48% "USA« 0,24%

Примечание.

Цвет линий отражает характер взаимодействия между генами: красный -выраженный синергизм в отношении влияния на фенотип, оранжевый -умеренный синергизм, синий - выраженный антагонизм в отношении влияния на фенотип, зеленый - умеренный антагонизм, коричневый - аддитивное взаимодействие генов. % отражает силу и направленность фенотипического эффекта взаимодействия генов (% энтропии).

Курильщики, носители генотипа 20 A A CAT, имели повышенный риск развития инсульта, тогда как некурящие пациенты не имели риска развития данного осложнения. Кроме того, мужчины с генотипом 20АА CAT, злоупотребляющие алкоголем, имели 5-кратное увеличение риска развития МИ (р=0,04). При высокой или умеренной физической активности мужчины с генотипом 20АА CAT имели, наоборот, пониженный риск развития МИ (р=0,02). При низкой физической активности протективный эффект данного генотипа в отношении риска развития МИ не выявлялся. Протективный эффект генотипа 20АА CAT также установлен у мужчин, которые не отмечали

хронических стрессов в жизни (р=0,02). У носителей генотипа 20АА CAT выявлен повышенный риск возникновения МИ при умеренном или низком солевом аппетите (р=0,05). В то же время у мужчин носителей генотипа 20АА CAT при повьшенном употреблении свежих овощей и фруктов выявлен пониженный риск развития МИ (р=0,04). В целом, говори о природе установленных нами генно-средовых взаимодействий., следует отметить, что данные взаимодействия, по-видимому, представляют собой проявление неспецифического адаптивного механизма у индивидов с раачичными генотипами к разнообразным и сопряженным в своих действиях на организм средовым влияниям, являющихся неотъемлемыми элементами современной цивилизации.

Связь полиморфизма генов ферментов антиоксиданткой системы с клиническими проявлениями мозгового инсульта. Прогнозирование риска возникновения инсульта у больных гипертонической болезнью с использованием комплекса ДНК-маркеров и срсдовых факторов риска

Для мужчин, перенесших МИ установлено, что полиморфизм А20Т гена CAT ассоциировался с такими клиническими, проявлениями как головокружение (р=0,02), тошнота (р=0,01) и нарушение температурной чувствительности (р=0,01). Полиморфизм Е158К гена FM03 был связан с поражением мягкого нёба (р=0,05), наличием асимметрии сосудов мозга (р=0,05) и тошнотой (р=0,04) у мужчин, перенесших инсульт. У мужчин, перенесших инсульт, также было выявлено, что полиморфизм S31IC гена PON2 связан с нарушением зрения (р=0,03), а полиморфизм I105V ген GSTP1 -с нарушением слуха (р=0,03). Для женщин, перенесших мозговой инсульт установлено, что полиморфизм А20Т гена CAT оказывает влияние на такие клинические проявления как нарушение речи (р=0,04), тремор конечностей (р=0,001) и опущение углов рта (р=0,02). Кроме того, у женщин обнаружены ассоциации полиморфизма Е158К гена FM03 с развитием нистагма (р=0,03), изменением голоса(р=0,02), фонацией мягкого неба (р-0,004), а также нарушением функций тазовых органов (р=0,05). Полиморфизм С718Т гена GPX4 ассоциировался с тошнотой у пациенток, перенесших МИ (р=0,05). Полиморфизм S311C гена PON2 был связан с нарушением ориентации у женщин(р=0,01). Делеционный полиморфизм гена GSTT1 ассоциировался с нарушением двигательной функции(р=0,003), онемением конечностей (р=0,05) и рвотой (р=0,02). Таким образом, для отдельных полиморфных вариантов генов АОС нами были установлены взаимосвязи с клиническими характеристиками у пациентов-гипертоников, перенесших мозговой инсульт.

Нами была осуществлена оценка влияния полиморфных вариантов генов ферментов АОС в сочетании с другими факторами риска на вероятность развития инсульта у больных ГБ. Использовался метод бинарной логистической регрессии, который позволял построить статистическую модель для прогнозирования вероятности инсульта [Hosmer D.W., Lemeshow S., 2000]. Учитывая половой диморфизм выявленных ассоциаций исследуемых кандидатных генов, моделирование проводилось раздельно у мужчин и у

женщин. У мужчин (таблица 1) была установлена логистическая регрессионная модель прогнозирования риска развития МИ наибольшей прогностической значимости на основе следующих предикторов: БИРб СРХ4 Т718С и РОШ 83II С, а также курения, наличия у больного ИБС, наличия у больного сахарного диабета и стадии ГБ. Среди всех оцененных статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития инсульта у женщин, страдающих ГБ (таблица 2), была модель, включающая следующие предикторы: СРХ4 Т718С, РОШ 8311С, наличие у больной ИБС, стадия гипертонической болезни и степень АГ.

Таблица 1

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения мозгового инсульта у мужчин с гипертонической болезнью, разработанная на основе данных генотипирования полиморфизмов генов антиоксидантной системы и других факторов риска

Независимые (объясняемые) признаки (А'/) и их градации Регрессионные коэффициент Ы, 6,- Уровень значимости (р) для Ъ,

0. Интерцепт (константа) -2,874 0,02

1. вРХ4 Т718С (1,2,3) 0,630 0,003

2. РОШ БЗПС (1,2,3) -0,383 0,05

3. Курение (0,1) -1,781 0,0000001

4. Наличие у больного ИБС (0,1) -2,120 0,000002

5. Наличие у больного сахарного диабета (0,1) -1,179 0,03

6. Стадия гипертонической болезни (1,2,3) 1,261 0,002

Параметры лог-регрессионной модели: Уровень значимости модели в целом р=0,000001 (х2=92,42; 4/^6, (Ж=13,03); Чувствительность - 88%, специфичность - 64%.

Таблица 2

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения мозгового инсульта у женщин с гипертонической болезнью, разработанная на основе данных генотипирования полиморфизмов генов антиоксидантной системы и других факторов риска

Независимые (объясняемые) признаки (X,) и их градации Регрессионные коэффициенты, ь, Уровень значимости (р) для 6/

0. Интерцепт (константа) -4,753 0,0003

1. ОРХ4 Т71&С (1., 2,3) 0,809 0,0001

2. РОШ БЗ11С (1., 2,3) 0,621 0,001

3. Наличие у больного ИБС (0,1) -2,689 0,000001

4. Стадия гипертонической болезни (1,2,3) 1,739 0,000003

Параметры лог-регрессионной модели: Уровень значимости модели в целом р=0,000001 (х2=74,03; <#=5, (Ж=6,92); Чувствительность - 75%, специфичность - 70%.

С целью проверки работоспособности модели нами были обследованы двое пациентов Курской областной клинической больницы в отношении указанных факторов риска развития инсульта.

1. Пациент с ГБ мужчина А: генотип 718ТТ GPX4 (значение X¡=\), генотип 311СС PON2 (значение Х2=Ъ), пациент курит (значение Х3=\), пациент также страдает ИБС (значение Х/=\), пациент не страдает сахарным диабетом (значение Х5=0), больной имеет 2 стадию ГБ (значение X¿=2). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим: Y = -2,874 + (0,630 х 1) + (-0,383 х 3) + (-1,781х 1) + (-2,120 х 1) + (-1,179 х 0) + (1,261 х 2) = -4,772, соответственно Р = 2,12<1П1 (1+2,724772) или (1/2,724'772) / 1+ (1/2,724'772) = 0,01, т.е. вероятность риска возникновения МИ у мужчины А., страдающего ГБ, чрезвычайно мала и составляет всего 1%.

2. Пациентка с ГБ женщина Б: генотип 718СС GPX4 (значение X¡=3), генотип 311SC PON2 (значение X¡=2), пациентка не страдает ИБС (значение Х3=0), больная имеет 2 стадию ГБ (значение X¿=2) и 2 степень АГ (значение Xj=2). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим: У = -4,753 + (0,809 х 3) + (0,621 х 2) + (-2,689 х 0) + (1,739 х 2) + (-0,955 х 2) = 0,482, соответственно Р = 2,720'482/ (1+2,720,482) = 0,62, т.е. вероятность риска возникновения мозгового инсульта у женщины Б., страдающей ГБ, крайне высока и составляет 62%.

Таким образом, учитывая достаточно высокую прогностическую ценность моделей в отношении риска развития мозгового инсульта при ГБ, как у мужчин, так и у женщин, разработанные статистические модели могут использоваться для формирования среди гипертоников группы риска развития инсульта и проводить лечебно-профилактические среди них мероприятия по предупреждению развития цереброваскулярных катастроф.

Выводы

1. Аллели и генотипы полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы ассоциированы с предрасположенностью к мозговому инсульту у больных гипертонической болезнью. В наибольший степени на риск возникновения мозгового инсульта оказывали влияние полиморфизмы Т718С гена GPX4 и S311С гена PON2.

2. Установлен половой диморфизм в ассоциациях генов ферментов антиоксидантной системы с риском развития мозгового инсульта при гипертонической болезни: у мужчин в детерминации предрасположенности к инсульту важную роль играли полиморфизмы генов Т718С GPX4 и А20Т CAT, у женщин - Т718С GPX4,1462V CYP1A1 и Т718С PON2.

3. Возрастная манифестация мозгового инсульта при гипертонической болезни определяется влияниями полиморфизмов различных генов ферментов АОС и характеризуется отличиями у мужчин и женщин. Ранняя манифестация мозгового инсульта ассоциируется с полиморфизмами +/del гена GSTT1 у мужчин и Т718С гена PON2 и Е158К гена FM03 у женщин, тогда как поздняя манифестация

инсульта связана с влиянием полиморфизма Т718С гена GPX4 у мужчин и генов Т718С гена GPX4,1462V CYP1A1 и Т718С PON2 у женщин.

4. В формировании предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни значительная роль принадлежит взаимодействию между генами ферментов АОС. У мужчин наиболее патогенетически значимыми в развитии мозгового инсульта являются полиморфные варианты GPX4 С718Т, САТ-21А>Т, CYP1A11462V," FM03 158ЕК и GSTTI +/del, у женщин - GPX4 С718Т, РОЮ 311SC, GSTP11105V, CYP1A11462V и FM03 Е158К.

5. Выявлены генно-средовые взаимодействия, которые играют важную роль в возникновении мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни. Такие средовые факторы как курение, злоупотребление алкоголем, хронические стрессы, гиподинамия и недостаточное употребление свежих овощей и фруктов в сочетании генотипами паюшорфных вариантов генов GPX4 С718Т, CAT -21А>Т, РОЮ 31 ISC, GSTTI +/del и GSTM1 +/del вносят наиболее огцугамый вклад в предрасположенность больных ГБ к развитию мозгового инсульта.

6, Логистический регрессионный анализ позволил установить, что полиморфные варианты генов ферментов АОС являются прогностически ценными предикторами при расчете вероятности возникновения мозгового инсульта при ГБ. У мужчин наибольшее значение имеет влияние сочетания таких предикторов как полиморфизм ы GPX4 Т718С и РОЮ S311C, курение, наличие у пациента ИБС и сахарного диабета, а также стадия ГБ, у женщин наиболее ценными предикторами, увеличивающими риск мозгового инсульта являются GPX4 Т718С и РОЮ S311C, наличие у пациенток ИБС, стадия ГБ и степень артериальной гипертензии.

Практические рекомендации

3. Рекомендовать для внедрения в практику медико-генетических консультаций в семьях больных гипертонической болезнью генетическое тестирование полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с целью вероятностного прогнозирования возникновения мозгового инсульта и разработки лечебно-профилактичестмх мероприятий по предупреждению его развития.

2. При медико-генетическом консультировании пациентов, страдающих гипертонической болезнью, с целью оценки вероятности развитая мозгового инсульта рекомендуется использовать разработанные уравнения логистической регрессии с учетом пола и прогнозировать риск развитая МИ на основе комплекса диагностически ценных признаков: у мужчин - полиморфизмы GPX4 Т718С и РОЮ S311 С., курение, наличие у пациента ИБС и сахарного диабета, а также стадии. ГБ, у женщин - полиморфизмы GPX4 Т718С и РОЮ S311C, наличие у пациенток ИБС, стадию ГБ и степень артериальной гипертензии.

3. При проведении генетико-эпидемиологических исследований, направленных на поиск генов-кандидатов предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни, и в частности при тестировании ассоциаций генов с риском развитая данной патологии необходимо учитывать возможные средовые факторы риска болезни с целью установления патогенетически значимых для развития инсульта генно-средовых взаимодействий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Комплексная оценка влияния генов регуляторов водно-солевого обмена, сосудистого гомеостаза и сигнальной трансдукции на развитие мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни / A.B. Полоников, A.M. Шесгаков, Е. К. Вялых и др. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008; Т.7 № 22. Приложение 1: С. 296а-297.

2. Связь полиморфизма 1166А>С гена рецептора 1 типа ангиотензина-11 с предрасположенностью к гипертонической болезни у русских жителей Центрального Черноземья . / Е. К. Вялых, Д.В. Ушачев, A.M. Шестаков и др. // Материалы конференции «Молодежная наука и современность». Курск, 2009 - С. 64.

3. Анализ ассоциации полиморфизма -463 G>A гена миелопероксидазы с предрасположенностью к эссенциальной гипертензии в Центральном Черноземье / Е. К. Вялых, Д.В. Ушачев, А. М. Шестаков и др. И Вестник РГМУ.- 2010; специальный выпуск №2,- С. 465.

4. Промоторный полиморфизм -2620Т гена каталазы и риск возникновения гипертонической болезни у русских жителей курской области / Е. К. Вялых, В. А. Кабанина, ИВ. Булгакова, О. А. Петрова и др. // Вестник РГМУ.- 2010; специальный выпуск №2,- С. 495.

5. Защитный эффект полиморфизма GLY272SER гена GNB3 в развитии гипертонической болезни и его взаимосвязь со средовыми факторами риска развития заболевания / В.П. Иванов, A.B. Полоников, Е. К. Вялых и др. // Тер. архив.-2011; №4. С. 55-60.

6. Полиморфизм Gly460Trp гена альфа- аддуцина и предрасположенность к гипертонической болезни. Значение генно-средовых взаимодействий для возникновения заболевания в русской популяции. / A.B. Полоников, В.П. Иванов, Е. К. Вялых и др. // Кардиология. - 2011; № 10. С. 33-38.

7. Анализ ассоциации полиморфизма А21Т гена CAT с риском возникновения ишемического инсульта у больных гипертонической болезнью / Полоников A.B., Карасева Е. И., Е. К. Вялых и др. // Материалы конференции «Молодежная наука и современность» - Курск, 2011 - С. 61-62

8. Влияние полиморфизма C311S гена PON2 на риск развития ишемического инсульта на фоне гипертонической болезни. / A.B. Полоников, Е. К. Вялых, Тевс Д.В. и др. // Материалы научной конференции сотрудников КГМУ, Центральночерноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, 2011 г. том 1, С. 229.

9. Исследование взаимосвязи полиморфизма Е158К гена FM03 с риском развития ишемического инсульта на фоне гипертонической болезни. / В.П. Иванов, A.B. Полоников, Е. К. Вялых и др. // Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии". Курск, 2011., С.43.

10. Тестирование ассоциаций комплекса генетических маркеров с риском развитая ишемического инсульта у больных гипертонической болезнью./ A.B. Полоников, Е. К. Вялых, A.M. Шестаков и дрУ/ Материалы 2-й Всероссийской

научно-практческой конференции с международным участием "Медико-биологичежие аспекты мультифакториальной патологии". Курск, 2011., С.88.

11. Прогекгивный эффект полиморфизмов гена gp22phox Субъединицы НАДФ-оксидазы в отношении риска развития гипертонической болезни. / А.В. Полоников, Е. К. Вялых, Д.В. Ушачев, А.М. Шестаков, Бушуева О. Ю., Кабанина В. А., Булгакова И. В. и др. // Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции с между11ародным участием "Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии". Курск, 2011., С.101.

12. Анализ ассоциации полиморфизма А4582С гена минералкортикоидного рецептора (MLR) с предрасположенностью к гипертонической болезни у русских жителей Курской облаете. /А.В. Полоников, Е. К. Вялых, В.П. Иванов, Бушуева О. Ю., Кабанина В. А, Булгакова И. В. и дрЛ Материалы 2-й Всероссийской на^шо-гфакшческой конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии". Курск, 2011., С.118.

13. Polymoiphism IIel05VaI of the GSTP1 gene is a predictor for ischemic stroke in patients with essential hypertension in Russian population /1. Bulgakova, A. Polonikov, E. Vyalykh, et al. // European Journal of Human Genetics -2011/ Vol.19, Suppl 2, p296.

(Список используемых сокращений

CAT- каггалаза

CYPlAl - цигохром P-4.50 1A1

FM03 - флании содержащая монооксигеназа

GPX4 - глутапюнпероксидаза 4 типа

GSTMI- глутатаон S-трансфераза Ml

GS7T1 - глугаион S-трансфераза Т1

GSTP1 - глутатион-Б-трансферазы Р1

PON2 - парао1сс«наза 2 тана

АГ- артериальная гшгертензия

АД - артериальное давление

АОС - антиоксидангная система

ГБ - гипертоинчеасая болшнь

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ПЦР - полимеразшш цепная реакция

РХВ - равновесие Харди-Е1айнберга

MDR - Multifactor Dimensionality Reduction

OR - odds ratio, отношение шансов

SMP - single nucleotide polymorphism (однонуклеотцдный полиморфизм) CI - доверительный интервал

ВЯЛЫХ Екатерина Константиновна

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСВДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИНСУЛЬТУ НА ФОНЕ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 16.03.2012 г. Усл. печ.л. 1,0. Заказ 46. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Учитель», г. Курск, ул. Садовая, 31.