Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова

Кафедра биохимии Биологического факультета и отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.И. Белозерского, МГУ

РГВ ОД

2 Д« 199?

На правах рукописи УДК 577.152.2

КОВИНА Марина Валентиновна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСТАТКИ ТИРОЗИНА ТРАНСКЕТОЛАЗЫ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ.

/ 03.00.04 - биохимия /

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.Б.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Г.А.Кочетов

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор А.А.Байков доктор биологических наук, профессор Н.Б.Гусев

Ведущее учреждение: Институт Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится "/Р" 1997г. в " часов на

заседании Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: г.Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

.9

в библиотеке

1997г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

М.В.Иванов

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Исследование механизма ферментативного катализа и структуры активного центра ферментов является центральной задачей энзимологических исследований. Транскетолаза (ТК) - димерный фермент, два симметричных активных центра которого расположены на границе идентичных субъединиц и формируются только в присутствии кофермента (Т®*) [Lindgvist et al., 1992, EMBO J., 1992, И, 23731. Субстраты ТК - кето- и альдосахара различной длины (используемые в работе 5-6-углеродные субстраты мы будем называть большими,- ,а трехуглеродные - малыми). ТК обратимо*4 отщепляет от кетосахара (субстрата-донора ТК-реакции) 2-х углеродный фрагмент, ("активный гликолевый альдегид") и присоединяет его к альдосахару среды (субстрат-акцептор), высвобождая в среду второй фрагмент субстрата-донора (аналогичный альдосахару среды). Методом химической модификации были определены следующие функциональные группы ТК: Trp, His, СООН, Arg. Позднее, с помощью РСА, почти все из-этих групп были идентифицированы как структурные составляющие активного-центрадолофермента. , ,

Идентификация аминокислотных остатков, небходимых для катализа и для связывания ТПФ, особенно продвинулась после получения и исследования мутантов по аминокислотам, консервативным согласно первичной и трехмерной структурам. Однако процессы связывания субстратов сопряжены с подвижностью структуры фермента и, к тому же, комплекс фермента с расщепляемым субстратом весьма нестабилен. По этим причинам каталитические и субстрат-связывающие остатки не всегда возможно идентифицировать методом РСА кристаллов фермента. •■ -

Таким образом, традиционный метод исследования функциональных групп - специфическая химическая модификация реактивных ами-

*Сокрашения: ТПФ - тиаминпироФоеФат; ТК - транскетолаза; Ф6Ф - Фруктозо-б-ФосФат; К5Ф - ксилулозо-5-фосфэт; ДОА - диоксиаце-тон; Oil - оксипируват (гидроксипируват); NAM - N-ацетилшидазол; ТНМ - тетранитрометан; НБД-хлорид - 7-хлор-4-нитробензо-2-ок-са-1,3-диазол; РСА - рентгеноструктурный анализ.

**3а исключением расщепления ОП. который необратимо декарбокси-лируется под действием ТК.

нокислотных остатков, исследование влияния лигандов на этот процесс и свойств модифицированного белка - не потерял своей актуальности в плане идентификации каталитических и субстрат-связыва-ющих остатков активного центра, не вступающих в непосредственный контакт с кофактором.

Цель исследования - с помощью метода химической модификации выяснить, нужны ли для функционирования ТК остатки тирозина, и, если нужны, определить их местоположение в структуре фермента и возможную роль в катализе.

Научная новизна. Впервые показано критическое значение целостности остатков тирозина для функционирования Тй.

Реактивные остатки локализованы в структуре фермента.

В ходе модификации обнаружен неизвестный ранее эффект полуцентровой реактивности ТК при связывании субстратов, что указывает на механизм "флип-флоп" взаимодействия ее активных центров в ходе катализа.

Проведено обзорное исследование структурных основ функциональной подвижности молекулы фермента в ходе катализа на основе сопоставления подученных в работе данных с результатами РСА, направленного мутагенеза и последних кинетических исследований ТК. Предложена подвижная модель функционирования фермента, удовлетворяющая этой совокупности результатов.

Практическая значимость. Локализация функциональных остатков тирозина в аминокислотной последовательности фермента дает возможность дальнейшего исследования их роли в механизме катализа методом направленного мутагенеза.

Разработаны оптимальные условия полного протеолиза фермента и разделения полученного гидролизата, что может быть использовано при дальнейших исследованиях структурных основ функциональности и регуляции фермента.

Предложен новый модификатор остатков тирозина - эквимоляр-ный комплекс НБД-хлорида с гидроксшшруватом. Такой комплекс более реакционноепособен и специфичен в отношении функциональных остатков тирозина апоТК, чем НБД-хлорид.

Получены указания на функциональность аминогрупп ТК, что

может составить тему отдельного исследования.

Предложенная подвижная модель функционирования фермента в режиме "флип-флоп" позволяет объяснить имеющиеся данные о спектральных и кинетических свойствах ТК и указывает на необходимость учитывать причинную связь механических и химических процессов при дальнейших исследованиях механизма катализа.

Полученные результаты углубляют представление о структуре фермента и могут быть использованы при чтении спецкурсов по энзи-мологии и в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов.

Апробация. Результаты работы доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ 29-го января 1996г, а также на У! Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского.", 1995г., 4.

Публикации. Результаты исследования изложены в 5 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, освещающего структурные основы функциональности ТК, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа содержит Ш. страниц^ машинописного текста, 1 таблицу и 30 рисунков. Список литературы включает 103 источника.

- 4 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы -

1. Определение активности ТК ■

В системе субстратов ксилулозо-5-фосфат + рибозо-5-фосфат -спектрофотометрически по скорости окисления NADH либо восстановления NAD в системах с сопрягающими ферментами. В системе субстратов оксипируват + рибозо-5-фосфат - спектрофотометрически по скорости убыли гидроксипирувата.

2. Определение степени связывания ТПФ и субстратов модифицированным ферментом - по изменению циркулярно-дихроичного поглощения ТК при 320нм в ответ на добавление лиганда.

3. Степень модификации ТК определяли спектрофотометрически, используя для расчетов коэффициент молярной экстинкции нитрофено-лят-иона Е425 = 4100М"1хсм"1 и значение разности коэффициентов молярной экстинкции N.O-ацетилтирозина и N-ацетилтирозина Е278=И60М"'1ХСМ"1.

4. Для получения ТК различной степени насыщения тиаминпирофосфа-

том в среду инкубации добавляли ТИФ до конечных концентраций 10 мкМ - для получения холоТК и 0,1-1 мкМ - для получения препарата, б котором 50-75£ активных центроЕ ТК содержат кофермент*. Отношение концентрации холоцентров к общей концентрации активных центров определяли по"отношению ТК-активности, измеренной в отсутствие и в присутствии ТПФ в кювете.

5. Протеолитический гидролиз белка проводили с помощью глутамино-вой протеиназы из Staphylococcus aureus (штамм V8). Транскетолазу предварительно денатурировали в 8М мочевине и обрабатывали 4-ви-юшшридином. Гидролизаты разделяли, а отобранные пики рехрома-тографировали на обратно-фазовых HPLC-колонках NUCLEOS IL С-18 ЮС и ULTRASPHER 0DS, соответственно.

6. Сиквенирование пептидов проводили по методу Эдмана на автоматическом газо-фазовом сиквенаторе фирмы "KNAUER".

*Далее холоцентром. или апоцентром мы будем называть активны! центр. . содержащий, или, соответственно, не содержащий ТПФ; а по-лухолоТК - такой препарат Фермента, значительная часть молекул которого содержит ТПФ лишь в одном из двух активных центров.

- о -

7. Работа с трехмерной структурой фермента осуществлялась с помощью программного пакета GENEBEE.

Рис. 1. Инактивация апоТК в присутствии NAM. а - Кинетика инактивации при" различных концентрациях ингибитора. На вставке - зависимость кажущейся константы скорости ингибирования от концентрации NM. NAM (мМ): 0 (1), 1,4 (2), 4,0 (3), 10 (4), 13(5), 27 (6), 45 (7); транске-толаза, 0,05 мг/мл; MOPS, 100 мМ, рН 7,0. б - рН-зависнмость константы скорости инактивации. Ш, 10 мМ; транскетолаза, 0,05 мг/мл; MES, 40 мМ (•), MOPS, 40 мМ (о), HEPES, 200 мМ (п).

Результаты и их обсуждение.

1. Контроль специфичности модификации.

Транскетолаза инактивируется необратимо и полностью под действием 3-х различных модификаторов с общей основной специфичностью (остатки тирозина) и различными спектрами побочной специфичности.

На рисунке 1а представлена кинетика инактивации ТК под действием одного из таких модификаторов, ацилирущего агента NAÍ. Кинетика инактивации однофазна (линейна) в полулогарифмических координатах, порядок реакции инактивации (вставка) - единица.

Эти данные свидетельствуют о том, что наблюдаемая инактивация является специфическим, относительно функциональности модифицируемых групп, процессом, т.е. обусловлена модификацией ограниченного числа аминокислотных остатков, модификация любого из которых вызывает полную инактивацию молекулы фермента.

Рядом показана рН-зависимость константы скорости инактивации (рис.16). Известно, что применять Ш для модификации остатков тирозина рекомендуется в слабокислой среде. При повышении рН может резко возрасти скорость ацетилирования аминогрупп. Напротив, при понижении рН скорость модификации лизинов должна падать до О. У нас при понижении рН ниже 7,0 скорость инактивации перестает уменьшаться. Следовательно, инактивация в этой области рН действительно обусловлена модификацией остатков тирозина.

Скорость инактивации ТК под действием ТНМ и НБД-хлорида также зависела от рН в соответствии с реакционноспособностью в отношении этих реагентов остатков тирозина.

На рис.2 показан спектр ТК, модифицированной ТНМ. ТНМ является наиболее удобным модификатором тирозинов, поскольку его производное - нитротирозин - обладает четким и интенсивным максимумом в видимой области спектра и собственное поглощение белка не мешает определению количества нитротирозинов. Положение максимума (425 нм), характер зависимости его экстинкции от рН аналогичны соответствующим данным о нитротирозине. Нитропроизводное тирозина моментально восстанавливается до аминопроизводного под действием восстановителей. Пик 425 нм при этом исчезает, как это показано нами и для нитроТК (нижняя кривая). Б то же время нитротриптофан весьма плохо взаимодействует с восстановителями и его спектр, практически, не зависит от рН. Следовательно, поглощение нитроТК в видимой области обусловлено поглощением остатков нитротирозина.

Остатки тирозина, ацетилированные по гидрокеильной группе, легко деацетилирртся, в отличие от ацетилированных аминогрупп, под воздействием гидроксиламина [Alexander et al., 1977, Biochem. Biophys. Acta, 493, 367]. После обработки гидроксиламином до 36% инактивированной в результате ацетилирования ТК приобретает ис-

- / -

400 I, нм

60 120 время, мин

Рис. 2. Спектры погдо- Рис.3. Инактивация апоТЕ в присутс-

щения нитроТК при различных значениях рН, а также после обработки

Ма23204» 20мМ; транске-толаза, 1 мг/мл; калий-фосфатный буфер, 150мМ.

твии'НБД-С! (1) с последующей реактивацией под'воздействием цистеина. Диметмсульфоксид, 307.; глицерин, 35%; НБД-С1, ЮмМ; ОП, ЮмМ; ТК, 0,2 мг/мл; калий-фосфатный буфер, ЮОмМ, рН 7,5. Контроль без ингибитора (2). Стрелкой указано время добавления 40мМ цистеина.

ходную активность (данные не приводятся).

Б аналогичном эксперименте, проведенном с ТК, инактивирован-ной НБД-хлоридом, была получена более значительная реактивация. Б качестве реагента, способного специфически отщеплять НБД-группу от НВД-тирозина, но не от НБД-производного аминогрупп иегчивоп а1., 1975, Еигор. 1. Вкх&ет., 54, 1171, был применен цистеин. Кинетика инактивации ТК НБД-хлоридом и последующей активации в присутствии цистеина представлена на рис.3. Из рисунка видно, что до 751 неактивного в результате модификации фермента восстанавли-

вает исходную активность после отщепления НБД-групп с помощью цистеина.

Итак, при обработке модифицированной ТК специфическими в отношении ацетил- и НБД-производных тирозина реагентами, гидрокси-ламином и цистеином, наблюдается значительное восстановление ее активности. Это дает основания считать, что значительная доля инактивации ТК И-ацетилимидазолом и НБД-хлоридом не связана с модификацией аминогрупп и вызвана, следовательно, модификацией остатков тирозина, что подтверждает выводы, сделанные выше.

Таким образом, о специфичности модификации (о функциональности и о природе модифицируемых групп) свидетельствуют:

- порядок реакции инактивации,

- соответствие рН-зависимости скорости инактивации и спектральных характеристик модифицированного фермента известным данным о модификации тирозина,

- значительная реактивация фермента после специфического отщепления химической метки.

О специфичности модификации свидетельствует также значительное сходство функциональных свойств ТК, модифицированной различными реагентами, что подробно рассматривается ниже.

Выводы о специфичности модификации были подтверждены прямой локализацией модифицированных остатков сиквенс-анализом (см.ниже).

2. Определение числа существенных для активности остатков тирозина на активный центр. Для этого мы сравнивали степени модификации и инактивации. Оказалось, что скорость ингибирования активностей ТК, определяемых с различными субстратами, кратно различается.

На рисунках 4 и 5 представлены корреляции между степенью инактивации фермента в системе субстратов К5Ф+Р5Ф и степенями его модификации (рис.4), либо инактивации в отношении других субстратов (рис.5) для ИМ (светлые символы) и ТНМ (темные символы).

Согласно Тсоу Чен-Лю, для классического случая полной необратимой инактивации фермента вследствие модификации числа 1 его существенных групп А-М1, где А - остаточная активность с тем или иным субстратом, 1 - число существенных для этой активности ос-

- у -

А

Mfc:

т

\

Рис.4. Корреляция между долей интактных остатков' тирозина"Щ) и остаточной ферментативной активностью (Л) для процессов нитрования ТК (в) и деацетшш-

ч

0,5-

41

О \

\

О

_i

1,0 0,5 м С

О рования ацетилТК (о).

1-3 - теоретические кривые за-

висимости А от М, рассчитанные для числа существенных для активности остатков i=l (1), i=2 (2), i=3 (3) и количества доступных остатков, равного 8 на мономер, в соответствии с методом Tcoy [Tsou C.-L. 1962, Scientia Sínica, 9, 15351.

татков и Ж - степень модификации, или, точнее, доля немодифициро-ванных остатков от всего числа способных модифицироваться.

Тогда зависимость А(М) будет линейной, если число существенных для данной функции остатков =1 и параболической, если > 1. На рисунке 4 пунктиром изображены алгебраические зависимости для Ы (ордината прямо пропорциональна абциссе), для i=2 (ордината пропорциональна квадрату абциссы) и i=3 (ордината пропорциональна кубу абциссы). Как светлые (ацетилирование апоТК), так и темные кружочки (нитрование апоТК) лежат гораздо ниже кривой 1=1 и выше кривой 1-3, хорошо укладываясь на кривую i=2. Это значит, что число "существенных для активности в системе К5Ф+Р5Ф остатков тирозина, подверженных 'как нитрованию, так и ацетилированию в апоТК, равно 2.

Зная число"1 для активности с К5Ф Uaks®), можно определить число i для взаимодействия с другими лигандами Целит) по корреляции между степенями нарушения этих функций фермента (рис.5). По оси ординат откладывается остаточная активность, определенная традиционным методом в системе К5$*Р5Ф (Дк5ф). Величина Вмг, откладываемая по оси абсцисс, равна степени сохранения функции, сопоставляемой с активностью (Акдф).

Рис. 5. Изменение способности апоТК взаимодействовать с различными лигандами (Влиг) относительно изменения ее активности в системе К5Ф*-Р5Ф (Лк5$) в ходе ацетилирования (светлые символы) и нитрования (темные символы), а, с анализом корреляций по методу Тсоу, б.

Аоа - остаточная активность с ОП (о,в);

Соп - остаточное связывание ОП (v,y); Влиг: Сдоя - остаточное связывание ДОА (А);

Стаф - остаточное связывание ТПФ (о,«);

Сфбф - остаточное связывание Ф6Ф (<>). Пунктиром изображены теоретические кривые зависимости /¡к5ф от Влиг, рассчитанные для различных соотношений значений 1Ак5ф и iRnnr (см. текст).

Связывание модифицированной ТК фруктозо-фосфата (в присутствии ТШ) изображено на рис.5а светлыми ромбиками. Видно, что способность ацетшшрованного фермента связывать Ф6Ф падает пропорционально остаточной активности фермента в системе ШН-Р5Ф: все точки с небольшим разбросом ложатся на диагональ. Очевидно, утрата трансферазной активности фермента в биеубстратной системе Ш1Н-Р5Ф обусловлена неспособностью фермента связывать подобные ксилулоэо-5-фосфату (т.е., большие асимметрические) субстраты-доноры ТК-реакции.

Связывание тиаминтрофосфата модифицированной Ш различных степеней инактивации изображено на рис.5а квадратами. Из рисунка видно, что, как в случае ацетилирования (светлые квадраты, кривая

- и -

3), так и в случае нитрования фермента (темные квадраты, кривая 2) его способность связывать ТПФ сохраняется дольше, нежели способность катализировать превращение субстратов в полной реакции: экспериментальные точки лежат ниже диагонали (линии 1). АцетилТК связывает ТПФ лучше, чем нитроТК, однако сродство ацетилТК к Т® понижено почти на два порядка относительно нативного фермента (данные не приводятся).

Взаимодействие модифицированной ТК с малыми (трехуглеродными) кетооубстраташ представлено на рис.5а треугольниками с вершиной вниз (относительное связывание ОП - Con), либо треугольниками с вершиной вверх (относительное связывание ДОА - Сдоя). Все треугольники укладываются на вогнутую кривую 2. Следовательно, значительная доля фермента, неактивного в системе К5Ф+-Р5Ф, сохраняет способность взаимодействовать не только с ТПФ, но и с ДОА, и ОП.

Нам удалось также зарегистрировать ферментативную активность модифицированного фермента в полной бисубстратной системе ОП+Р5Ф (Аоп). На рисунке она представлена кружочками. Светлые кружочки (ацетилирование), подобно треугольникам, ложатся на вогнутую кривую 2. Следовательно, ацетилТК способна не только однократно связать ОП, но и многократно превращать, его в- многоциклической бисубстратной системе. В то же время, темные кружочки расположены вблизи диагонали - инактивация ТК.относительно ОП в процессе, нитрования происходит параллельно с его инактивацией относительно К5Ф. Будет ли способен инактивированный относительно К5Ф фермент только связывать ОП, или, кроме того, превращать его в полном цикле трансферазной реакции, определяется, очевидно, типом модификации критического остатка тирозина.

Почему модифицированная по остаткам тирозина ТК, не способная к правильному связыванию К5Ф и Ш>, связывает (а ацетилиро-ванная и превращает) ОП и ДОА? Для ответа на поставленный вопрос необходимо допустить, что модифицируемые существенные остатки тирозина неоднородны по своим функциям. По-видимому, имеется часть остатков тирозина, модификация которых препятствует правильному связыванию больших субстратов, но не влияет на связывание малых. Тогда число i остатков тирозина, существенных для связывания ма-

лых субстратов (icon, 1Сдод)) должно быть меньше количества остатков тирозина, существенных для взаимодействия с большими субстратами (1дк5ф. 1сф6ф)•

Зная соотношение степеней инактивации некоторых двух функций и количество существенных для одной функции остатков (из числа подверженных модификации), можно определить число остатков, ин-тактность которых необходима для сохранения второй функции, исходя из следующего соотношения:

h - hil/iZ, (1) где А\ - Ак5ф, Аг=Влиг, 11-1ак5ф и 12-1влиг-При изображении зависимости Дк5ф от Вшг, экспериментальные точки должны лечь на параболу со степенью 1ак5ф/1Влиг-

На рисунок 56 нанесены экспериментальные точки, взятые из рис.5а, кривая 2, а также теоретические зависимости М>ф от Вшг, рассчитанные в соответствии с выражением (I) для следующих комбинаций значений 1дк5ф и 1влиГ: 1влиг - 1Ак5ф (прямая 1), 1влиг-1 и 1дк5ф=2 (кривая 3), 1Вдиг=1 И 1Ак5ф°3 (кривая 4), 1Влиг"2 и 1дк5ф=3 (кривая 2), 1Влиг=1 И 1ак5ф°4 (кривая 5), 1влиг=0,2 И 1Дк5ф"2 (кривая 6). Видно, что, практически, все экспериментальные точки укладываются на кривую 3 с разбросом, не выходящим за пределы кривых 2 и 4. Следовательно, экспериментальные данные удовлетворяют условию существования в структуре фермента только одного, необходимого для связывания с малыми кетосахарами, остатка тирозина:

^опМсог/Чсдоя-М. (2)"

Целостность лишь одного остатка из модифицируемых необходима также для связывания ТПФ нитротранскетолазой и активности аце-тилТК в системе ОП+Р5Ф:

1стпФп=1Аопа=1- * (3)

% - нитрование, а - ацетилюювание.

Количество же существенных остатков тирозина, необходимых для активности в системе К5Ф+Р5Ф равно, как минимум, двум:

1АК5Ф=2. (4)

Это соответствует выводу, полученному при анализе экспериментальных данных по методу Тсоу (рис.4). Очевидно, для связывания Ш также необходима интактность двух остатков тирозина на активный центр, поскольку величина Сфбф пропорциональна величине Ак5ф (ромбики на рис. 5а ложатся на диагональную прямую 1, которая соответствует пунктиру 1 рисунка 56):

1СФбФа=2. (5)

На диагональную прямую ложится также зависимость Ак5ф от Доп для нитроТК (темные кружочки), т.е.:

1аопп=2. (6)

Таким образом, ТК содержит не менее 2 существенных, остатков тирозина на активный центр. Один из них необходим для связывания и каталитического превращения кетосахаров любого типа. По-видимому, этот остаток и остаток, нитрование которого блокирует связывание ТПФ (icTn®n==l. выражение 3) - один и тот же, поскольку, потеряв способность связывать кофермент, нитроТК неминуемо теряет способность к связыванию любых кетосубстратов.

Ацетилирование этого же, по-видимому, остатка тоже блокирует связывание малых кетосахаров вследствие неких нарушений в связывании ТПФ. Но, в отличие от нитрования, эти нарушения проявляются лишь в понижении сродства к ТПФ ацетилированного фермента.

Еще, как минимум, один существенный остаток тирозина расположен в субстрат-связывающем участке и принимает непосредственное участие в связывании крупных кетосахаров, таких как Ф6Ф и К5Ф. Его модификация нарушает связывание больших субстратов и не нарушает связывание малых. Очевидно, он должен связывать большие субстраты по участку, отличающемуся (или отсутствующему) у малых субстратов. При этом его роль состоит в обеспечении функционального связывания большого субстрата, т.е. в обеспечении каталитически правильной ориентации его в активном центре фермента (поскольку связывание определялось как способность фермента изменять свою конформацию /оптическое вращение/ в ответ на добавление ли-

ганда - см. Методы). Собственно связыванию большого субстрата (повышению его локальной концентрации в активном центре) модификация этого остатка, практически, не препятствует (данные не приводятся) .

3. Влияние лигандов на скорость инактивации и модификации ТК.

Тиаминпирофосфат в присутствии Са++ вызывает заметное снижение скорости ингибирования ТК под действием N-ацетшшмидаэола (ср.кривые 1 и 2 на рис.ба) и тетранитрометана (то же на рис.66).

При ингибировании полухолофермента оказалось, что скорости инактивации холо- и апоцентров совпадают со скоростями инактивации, соответственно, холо- и апоТК (данные не приводятся). Таким образом, ТШ замедляет инактивацию обоих активных центров апоТК в равной мере.

Полученные данные хорошо согласуются с выводом из раздела 2.: один из необходимых для активности остатков тирозина участвует, прямо или косвенно, в связывании ТШ. ТПФ защищает этот остаток от модификации, а его модификация в апоТК блокирует катализ, препятствуя полноценному связыванию кофермента.

Ш оказывает незначительный защитный эффект при инактивации холоТК N-ацетилимидазолоы (ср. кривые 2 и 3 на рис. 6а). ОД, наоборот, заметно ускоряет инактивацию (ср. кривые 2 и 4). Остановимся на причинах столь различного влияния этих субстратов на скорость инактивации.

При связывании холоТК субстрата-донора структура фермента становится более рыхлой, и количество поверхностных (доступных растворителю) остатков тирозина увеличивается на три (при образовании холофермента из апоТК происходили обратные изменения -структура становилась более компактной, количество поверхностных остатков тирозина уменьшалось на три) [Усманов, Кочетов, 1978, Биохимия, 43, 17961.

Мы полагаем, что среди этих трех остатков имеются существенные для активности. В таком случае, возрастание скорости инактивации после связывания ОП объясняется экспонированием ингибитору тех остатков, которые были недоступными растворителю в холоТК. Почему же после связывания <®6Ф скорость инактивации уменьшается?

- ли -

время, мин время, мин

Рис. 6. Влияние дигандов на кинетику инактивации ТК

под действием N¿11 (а) и ТНМ (б). Кинетика инактивации ТК в отсутствие ТПФ: в, ♦ , в присутствии насыщающих концентраций ТПФ: о, о, О; кинетика инактивации в отсутствие субстратов: «,

в присутствии ОП: ♦, О, в присутствии Ф6Ф: о, кинетика инактивации полухолоТК в присутствии Ф6Ф: о. Инактивация апоТК (а также апоТК в присутствии Ф6Ф и полухолоТК в присутствии субстратов) - 1, холоТК - 2, холоТК в присутствии <ШФ - 3, холоТК в присутствии ОП - 4, контроль без ингибитора - 5. Ф6Ф, 10 мМ или ОП, 1 мМ; Ш, 25 мМ или ТНМ, 10 мМ.

Как Ф6Ф, так и ОП расщепляются в активном центре ТК с образованием "активного гликольальдегида", но расщепление ОП происходит необратимо [Усманов, Кочетов, 1983, Биохимия, 48, 550]. В то же время, компонент, отщепляемый от Ф6Ф, способен конденсироваться с "активным гликольальдегидом" в обратной реакции, и, следователь-

но, находится в активном центре ТК статистически большее время, нежели компонент, отцепляемый от ОП. Поэтому отщепляемый компонент $6Ф, в силу своей большей величины и длительности нахождения в активном центре, чем отщепляемый компонент ОП, защищает от модификации большее число экспонирующихся среде существенных остатков тирозина, что соответствует выводу из раздела 2.

Эффекты, оказываемые обоими субстратами на инактивацию транс-кетолазы тетранитрометаном, практически, одинаковы (ср. кривые 3 и 4 рис. бб). Как ОП, так и ФбФ вызывают резкое изменение кинетики инактивации холоТК: на уровне 40-50% остаточной активности инактивация прекращается, что не характерно для процессов инактивации апо- и холоТК в отсутствие субстратов (кривые 1 и 2). На инактивацию апоТК в отсутствие кофакторов субстраты влияния не оказывают (рис.66, 1, черные квадраты - апоТК, черные ромбики -апоТК+ОД, черные кружки - апоТК+ФбФ).

При инактивации полухолоТК в присутствии субстрата оказалось, что кинетика инактивации холоцентров лишена фазы плато (рис.66, прямая 1, черно-белые кружки). Причем скорость инактивации близка к скорости ингибирования холоТК в присутствии субстратов в быстрой фазе (а также к скорости инактивации апоТК). Субстрат связан именно холоцентрами, поскольку специфическое связывание субстрата апоцентрами невозможно: ни структурные характеристики [Усманов, Кочетов, 1978, Биохимия, 43, 17961, ни кинетика ТНМ-зависимой инактивации апоТК в присутствии субстрата-донора не меняется (рис.66, кривая 1, черные квадраты, ромбики, кружки).

Следовательно, "перелом" кинетики Ш-зависимой инактивации холоТК в присутствии субстратов на уровне обусловлен неэквивалентностью двух активных центров димерного фермента, проявляемой при связывании субстрата-донора. При взаимодействии димера холоТК с субстратом-донором ускоряется инактивация одного из ее активных центров до уровня, характерного для инактивации апот-ранскетолазы.. Этот центр содержит субстрат (в расщепленном либо нерасщепленном виде). Во втором центре, скорость инактивации которого падает, практически, до нуля, субстрат либо отсутствует, либо находится в другом состоянии. Таким образом, при модификации

холоТК тетранитрометаном в присутствии субстрата-донора выявился эффект полуцентровой реактивности фермента относительно связывания (расщепления) субстрата. По-всей видимости, этот эффект является отражением работы активных центров фермента в ходе катализа по механизму "флип-флоп"*.

*Каким образом тип модификации может определять различие в поведении фермента при ацетюшровании и нитровании одного и того же остатка тирозина?

С учетом механизма "флип-флоп" допустим, что в присутствии субстрата-донора "раскрывается" (экспонируется растворителю) лишь один из двух активных центров (содержащий субстрат). Тогда, если это необратимо декарбоксилирующийся оксипируват. вероятность модификации остатка тирозина, связывающего только крупные субстраты. увеличивается, а вели фруктозо-фосфат - уменьшается (но не до нуля, поскольку образующаяся при расщеплении Ф6Ф альдоза тоже может покидать активный центр). Далее. Ацетилированный остаток тирозина не способен связывать субстрат (появление громоздкого ацетильного заместителя на его гидроксиле должно понижать сродство к субстрату) и, следовательно, не препятствует выходу отщепляемой концевой части молекулы из активного центра. Выход отщепляемого альдозного компонента из первого активного центра влечет "раскрытие" второго, который в таком случае, будет демонстрировать ту же кинетику инактивации, что и первый. В то же время, нитротирозин имеет свободный гидроксил, депротонированный при Физиологических рН. в результате чего его нуклеофильность возрастает на несколько порядков. Вероятно, он будет связывать отщепляемый компонент субстрата гораздо более эффективно, нежели до модификации. Фиксация отщепляемого компонента, равно как малого, так и большого, в одном из активных центров предотвращает "раскрытие" второго и. следовательно, защищает его от модификации.

Фиксацией отщепляемого компонента 0П (С02. или угольной кислоты) на остатке нитротирозина хорошо объясняется в таком случае и отсутствие активности с ОП нитрованной по одному остатку тирозина ТК при сохранении связывании ОП. в то время как ацетилированная по одному остатку ТК может и связывать, и превращать ОП.

4. Локализация выявленных существенных остатков тирозина в

первичной структуре фермента. На рисунке 7а представлен профиль элюции протеолитического гидролизата нитроТК с обратно-фазовой НРЬС колонки. Только 4 максимума поглощения при 220нм (полоса поглощения пептидной связи) обладали также заметным поглощением при ЗбОнм (полоса поглощения нитротирозина). Эти 4 пика были отобраны для рехроматографии (рис.76) и секвенирования (рис.8). На рис.8 показаны профили элюции 7-ми элюатов, полученных на последовательных циклах отщепления, соответственно, первых семи И-концевых аминокислот основного нитро-содержащего пептида (№• 3). Аминокислоты, составляющие последовательность 1А1ШШ, отмечены жирным шрифтом. Эта последовательность единственная, для которой имеется идентичный отрезок в аминокислотной последовательности ТК (Не 181 - 61п 187). Длина целого пептида, согласно специфичности протеазы, 12 аминокислот. Пептид содержит единственный остаток тирозина (номер184). Это 4-я аминокислота пептида 181-192. Действительно, пик нитротирозина, идентифицированный согласно времени элюции ФТГ-нитротирозина в модельном эксперименте, появляется на 4-м цикле отщепления. Аналогично были идентифицированы в последовательности ТК остальные три нитросодержащих пептида:

1 - Уа1369 - 61и375 (УУМОЦРЕ),

2 - Аэр368 - 1_,еи373 (ОУЭД....),

3 - 11е181 - 61п187 (1АШЖ..),

4 - А1а209 - 61и213 (АУШЕ).

Таким образом, были идентифицированы три остатка тирозина, которые под действием ТНМ включали нитрометку: 184,210,370. Два из них (184 и 210) расположены в сравнительно консервативных участках молекулы, повторись в, соответственно, 7 и Зх различных ТК из 10, для которых в настоящее время известна первичная структура.

3 0 2 0 »0 ацетонитрил, %

4 0 3 0 2 0

ацетонитрил,%

Рис.7. Разделение протеолизата нитроТК (а) и рехроматография нитросодержащих пиков 1-4 (б) на обратно-фазовой НРШ-колонке.

ШУОО.М

Рис.8. Профили элюции семи последовательных циклов отщепления И-концевой аминокислоты пептида 3. Аминокислоты основного """^""Л/ (нитросодержащего) пептида выделены жирным шрифтом. Нижняя кривая - элю-ция стандартной смеси ФТГ -аминокислот. По горизонтали - время элюции (слева направо), по вертикали оптическая плотность при 269 нм (полоса погло-

щения ФТГ-аминокислот).

5. Сопоставление полученных данных с трехмерной структурой ТК.

Взаиморасположение идентифицированных реактивных остатков тирозина и известных функциональных участков молекулы холоТК изображено на рис.9.

Наиболее вероятным претендентом на роль субстрат-связывающего остатка является Туг184: из трех рассматриваемых остатков он самый близкий к кофактору (рис.9) и, кроме того, расположен в относительно пустом тоннеле, проходящем мимо Cz атома* тиазолового кольца ТИФ (рис.id").

Остаток же Туг370, по-всей видимости, стабилизирует подвижную в структуре апоТК петлю из остатков с 383 по 394, правильная ориентация которой в структуре холоТК необходима для реализации межеубъединичного взаимодействия и правильного формирования активного центра фермента при связывании ТПФ [Sundstrom et al., 1992, FEBS Lett., 313, 229; Meshalkina et al., 1996, "Biochemistry and Physiology of Thiamine Diphosphate enzymes", proceedings of the 4-th international meeting on the function of thiamine diphosphate enzymes. Eds. H.Bisswanger and A.Schellenberger, 5321. Взаиморасположение Туг370 с остатками этой петли Тгр391 и Asp393 указывает на наличие между ними плотного контакта (рис. if).

Остатки Туг210 расположены в самом центре димера холоТК, посередине между двумя активными центрами (рис.9). Их гидроксилы обращены в большой центральный канал (рис.1С$, ни сам факт наличия которого, ни его возможная функция в литературе не освещались. Вопрос о том, функционален ли остаток 210, остается открытым.

В ходе модификации фермента обнаружен, кроме того, еще один весьма важный для понимания механизма и регулирования транскето-лазного катализа эффект. Идентичные в отсутствие субстрата активные центры димерного фермента в присутствии субстрата-донора ста-

*К этому атому ковалентно присоединяется 2-х углеродный Фрагмент субстрата-донора в ходе катализа, образуя "активный гликоле-вый альдегид".

ч

РИС.9, Структура холоТК в проекции; перпендикулярной оси симметрии димера. Остатки разных субъединиц изображены разным цветом (либо со звездочкой и без неё); аминокислотные остатки 187-198 и 383-394 каждой субъединицы выделены жирной линией.

- -

Рис.10. Стерео-изображения участков холоТК, содержащих Туг184 <а), Туг370 (6), Туг210 (в).

новятся неэквивалентны. Полуцентровая реактивность фермента к тирозин-специфическому модификатору в присутствии субстрата подтверждает участие остатков тирозина в связывании субстрата и свидетельствует об индуцируемой субстратом альтернативной асимметрии активных центров (механизм межсубъединичного взаимодействия "флип-флоп"). По-всей видимости, второй активный центр способен связать кетосубстрат при условии, если в первом активном центре произошло расщепление первой молекулы кетосубстрата и отщепляемый компонент покинул активный центр. Отщепление альдозы во втором центре происходит при условии присоединения ее в первом центре с образованием кетозы. Таким образом, предлагаемый механизм функционирования ТК в режиме "флип-флоп" сопряжен с известным ранее двухтактным механизмом поочередного отщепления-присоединения активным центром кето- и альдосубстратов ТК-реакции [Пустынников и др., 1986, Биохимия, 51, 1003].

выводы

1. Методом химической модификации показано, что в молекуле транскетолазы пекарских дрожжей имеется, как минимум, два функциональных остатка тирозина.

2. Для связывания и превращения больших кетосахаров необходима целостность двух остатков тирозина, для правильного связывания ТШ и малых кетосубстратов - лишь одного.

3. В структуре транскетолазы, ииактивированной тетранитрометаном, определены модифицированные остатки тирозина в положениях 184, 210, 370.

4. В ходе модификации выявлено альтернативное связывание субстратов двумя активными центрами транскетолазы. Предложен механизм сопряженной работы активных центров фермента в режиме "флип-флоп".

Список публикаций по теме диссертационной работы:

1. Kuimov A.N., Kovina M.V., Kochetov G.A. (1988) Ingibition of transketolase by N-acetylimidazole. Biochem. Internat. 17, 517-521.

2. КовинаМ.В., Кушов A.H., Кочетов Г. A. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. I. Определение типа и количества существенных остатков. Биохимия, 58, 1330-1340.

3. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. (1993) Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. II. Исследование функции существенных остатков тирозина. Биохимия, 58, 1341-1350.

4. Kovina М., Viryasov М., BaratovaL., Kochetov Q.A. (1996) Localization of reactive tyrosine residues of baker's yeast transketolase. FEBS Letters. 392, 293-294.

5. Kovina M.V., Kuimov A.N., Virjasov M.B., Baratova L.A., Kochetov G.A Functional tyrosine residues of baker's,yeast transketolase and their localization in amino acid sequence of the enzyme. YI Международная конференция "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского". 1995, 4.