Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы при температурной адаптации рыб

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы при температурной адаптации рыб"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ РЫБ

03.00.13 - физиология человека и животных 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РГ8 ОД I ДЬК 1998

На правах рукописи УДК 577.3

ПЕРСИКОВ Антон Валерьевич

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Института биологии развития им. Н.К. Кольцом Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических мук Н.Д. Озернюк

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б.Н. Манухин доктор физико-математических наук, профессор С.И. Аксенов

Ведущее учреждение:

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 11 ноября 1998 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан 3 октября 1998 года. Ученый секретарь Диссертационного сов(

кандидат биологических наук

Е.В. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение физиологических и биохимических особенностей адаптации пойкилотермных животных к разным температурам имеет важное значение для понимания регуляторных механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность этих организмов в различных условиях среды. Важное место в приспособлении пойкилотермных к разным температурным условиям занимают ферменты, обеспечивающие метаболические перестройки при изменении температуры. В то время, как механизмы эволюционных приспособлений к различным температурным условиям детально исследованы (Александров, 1975; Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Holland et al., 1997 и др.), онтогенетические температурные адаптации, формирующиеся на протяжении нескольких недель или месяцев, изучены фрагментарно (Клячко и др., 1993; Ozemyuk et ai., 1994; Vetter, Buchholz, 1997). Изменение функциональных и структурных, свойств белков при адаптациях к различным температурам обитания определяется, с одной стороны, аминокислотными заменами, а с другой -взаимодействием белков со стабилизирующими факторами (катионами, коферментами, мембранами, пептидами) (Argos et al., 1979; Jaenicke, 1991; Fields, Somero, 1997).

Изменения, претерпеваемые белками при кратковременных температурных адаптациях (акклимациях) и сезонных адаптациях, изучены недостаточно. Особенно важным представляется изучение структурных изменений в белках при температурных акклимациях пойкилотермных животных, поскольку эти изменения лежат в основе функциональных особенностей белков.

Для изучения структурных и функциональных изменений в белках при температурной акклимации был выбран фермент углеводного обмена - лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Известно, что этот детально изученный фермент проявляет высокую степень полиморфизма и чувствительность к различным воздействиям. В связи с этим можно ожидать, что изучение структурных и функциональных особенностей данного фермента н различных температурных условиях может служить адекватной моделью для исследования молекулярных механизмов адаптации ферментативных процессов.

з

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение влияния температуры на функциональные и физико-химические свойства ЛДГ из мышц вьюнов. Конкретно было необходимо изучить следующие вопросы:

1) Анализ кинетических свойств ЛДГ при температурных акклимациях.

2) Сравнение устойчивости ЛДГ к температурным воздействиям при адаптации рыб к разным температурам.

3) Термодинамический анализ изменений в молекуле ЛДГ при температурных акклимациях.

Научная новизна.

Впервые показано, что активность ЛДГ из скелетных мышц рыб, адаптированных к низким температурам, обладает более высокой стабильностью, чем при адаптации к высоким температурам.

Впервые исследовано влияние температурной акклимации на структурную стабильность ЛДГ из скелетных мышц рыб. Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии показано, что температурная акклимация вьюнов влияет на термодинамические свойства мышечной ЛДГ. Энтальпия денатурационного перехода и свободная энергия Гиббса выше для фермента из мышц рыб, адаптированных к высоким температурам, по сравнению с акклимацией к низким температурам. Впервые установлено, что ЛДГ из мышц рыб, адаптированных к низким температурам, обладает более высокой удельной теплоемкостью, чем при акклимации к высоким температурам.

Проведен компьютерный анализ трехмерной структуры М4-ЛДГ и доказано наличие в молекуле этого фермента специфических участков допускающих связывание ионов цинка.

Впервые методом рентгеноспектралыюй флуоресценции, показано различие в содержании ионов цинка в ЛДГ при акклимации рыб к низким и относительно высоким температурам. Содержание цинка в молекуле этого фермента из мышц вьюнов, адаптированных к низким температурам, в 3-4 раза выше. Полученные различия в содержании цинка в ЛДГ служат одной из причин функциональных и структурных различий этих форм фермента при температурной акклимации рыб.

Практическая значимость работы.

Полученные результаты являются важным звеном в понимании молекулярных механизмов регуляции метаболизма пойкилотермных животных при температурных акклимациях. Термодинамический анализ изменений в молекуле ЛДГ из мышц рыб позволяет объяснить структурные перестройки этого фермента в различных температурных условиях. Исследованная модель температуркой акклимации ферментов открывает возможность более глубокого анализа молекулярных механизмов адаптационных процессов.

Апробация результатов.

Основные материалы диссертации докладывались на конференциях ИБР им. Н.К.Кольцова РАН (1995, 1997 гг.), на всероссийском симпозиуме «Возрастная и экологическая физиология рыб», Борок, 1998 г., на международных симпозиумах: «Stability and Stabilization of Biocatalysts», Cordoba, Spain, April, 1998; «Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects», Moscow, Russia, June, 1998; «Twelfth Symposium of the Protein Society», San Diego, California, USA, July, 1998.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Изложена на 121 странице машинописного текста, содержат 20 рисунков и 7 таблиц. Список литературы содержит 168 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе были использованы взрослые самцы и самки вьюна Misgurnus fossilis. Для изучения температурных адаптации рыб в течение 25 суток содержали при низкой (5°С) и относительно высокой (18°С) температурах среды.

Очистку ЛДГ проводили методом дробного высаливания сульфатом аммония (Place, Powers, 1984; Лущак, 1990) с некоторыми модификациями и последующей очисткой с помощью хроматографической системы FPLC на колонке monoS. Очищенный

фермент хранили в сульфате аммония при 5°С. Непосредственно перед экспериментом проводили диализ раствора белка против соответствующего буфера. Концентрацию ЛДГ определяли по ультрафиолетовому поглощению при 280 нм.

Активность ЛДГ определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности НАДН (Cahn, 1964).

Исследование термодинамических свойств ЛДГ проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4А с объемом ячейки 0,468 мл (Институт биологического приборостроения РАН) в интервале температур 10-110°С, при скорости сканирования 2,0°С/мин и избыточном давлении 4 атм. При изучении кинетических параметров денатурации ЛДГ, скорость сканирования варьировали в пределах 0,5-4,0°С/мин. Анализ полученных зависимостей проводили по методу П.Л.Привалова (Privalov, 1979,1986).

Измерение теплоемкости нативной формы ЛДГ проводили в 1 ОтМ натриевом фосфатном буфере, рН 7,0, при концентрации белка 0,7-5,5 мг/мл. Теплоемкость денатурированной формы ЛДГ измеряли в ЮтМ натриевом фосфатном буфере с лимонной кислотой, рН 3,0. Для сравнения теплоемкость развернутой формы белков вычисляли из аминокислотного состава по аддитивной схеме предложенной П.Л.Приваловым и Г.И.Махатадзе (Privalov, Makhatadze, 1990; Makhatadze, Privalov, 1995).

Анализ деконволюции зависимостей избыточной теплоемкости от температуры был проведен с использованием программы CpCalc Versión 2.1 (Copyright 1995-1996, Applied Thermodynamics).

Кинетический анализ температурной денатурации ЛДГ по данным дифференциальной сканирующей калориметрии проводили по методу Санчес-Руиса (Sanchez-Ruiz et al., 1988; Sanchez-Ruiz, 1992).

Количественный элементный состав изучаемых препаратов ЛДГ проводили с помощью рентгеноспектрального флуоресцентного анализа. Рентгеновские спектры и численные значения интенсивностей аналитических линий цинка получали на спектрометре VRA-30 (Kari-Zeiss).

Компьютерному анализу подвергали известную структуру молекулы тетрамера М4-ЛДГ из мышц собачьей акулы Squalus acanthias (Abad-Zapatero et al., 1987). Файл был получен из базы данных «Brookhaven Protein Data Bank», код в базе - 1LDM.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Измерение активности ЛДГ. Температурный оптимум ферментативной реакции.

Для характеристики функциональных особенностей двух форм ЛДГ из мышц вьюнов, адаптированных к низким (5°С - «холодный» фермент) и относительно высоким (13°С - «теплый» фермент) температурам, ранее были проведены эксперименты по измерению удельной активности фермента, определению температурного оптимума активности, инактивации мочевиной с последующей реактивацией (Клячко и др., 1992, 1993; Ozernyuk et al., 1994). В этих работах был обнаружен ряд различий в функциональных свойствах «холодной» и «теплой» форм ЛДГ. Прежде всего, положение минимума константы Михаэлиса для пирувата соответствовало температуре акклимации. Удельная активность «холодной» формы фермента была выше по сравнению с «теплой» формой. Однако, полученные различия исчезали в результате воздействия на эти две формы ЛДГ мочевины и последующей реактивации.

Как и во многих других случаях, связанных с сезонной температурной адаптацией ферментов (Dittrich, 1992; Vetter, Buchholz, 1997; Feller et al., 1997; Fields, Somero, 1997), изменение активности ЛДГ при воздействии низких температур носит компенсаторный характер, заключающийся в повышении эффективности ферментативной реакции, необходимой для поддержания нормального функционирования организма при низких температурах.

При сравнении активности ЛДГ из скелетных мышц вьюнов, акклимированных к низким и высоким температурам в возрастающем диапазоне температур от 20°С до 55°С, нами была определена температурная зависимость протекания этой ферментативной реакции. Инкубацию образцов фермента при тех или иных температурах проводили в течение 30 мин и при этой же температуре измеряли ферментативную активность. Температурный оптимум данной ферментативной реакции как для «холодной» так и для «теплой» форм ЛДГ не отличался и находился в пределах 40-42°С. По-видимому, изменения, происшедшие в молекуле ЛДГ во время температурной акклимации, не настолько существенны, чтобы произошло смещение температурного оптимума активности фермента.

2. Кинетика температурной инактивации ЛДГ.

При изучении кинетики термоинактивации фермента из скелетных мышц вьюнов, акклимированных к 5°С и к 18°С, были выявлены определенные отличия. Для всех исследованных температур инактивации (66, 68, 70, 72°С) изучаемы формы фермента отличались степенью устойчивости к нагреванию. «Холодная» форма ЛДГ обладала более высокой термостабильностью по сравнению с «теплой» формой (рис. 1).

Ш ^Л/0) о

ч

-0,5

-0.5

-1.0

66 С

68 °С

70 °С

Рис. 1. Кинетика термоинактивации ЛДГ из скелетных мышц вьюнов, адаптированных к 5°С (в) и к 18°С (О)-

Следует отметить, что процесс термоинактивации ЛДГ имеет в большинстве случаев двухфазный характер (рис. 1), что свойственно

ферментам с четвертичной структурой: быстро протекающей предстационарной фазы и сравнительно медленнбй стационарной. Двухфазный характер термоинактивации фермента выявляется при приведении полученных данных в полулогарифмических координатах скорости реакции 1п(\7У0) от времени, где У0 - скорость реакции в начальный момент времени, V - скорость реакции в момент времени (.

Термоинактивацию фермента характеризовали константой инактивации кин, которую вычисляли из зависимостей 1п(\7Уо) от времени (табл. 1). Как видно из таблицы, величина к„„ для «теплого» фермента выше по сравнению с «холодным» ферментом при всех изученных температурах.

Таблица I. Константы инактивации (кш) для «холодной» и «теплой» формы ЛДГ га скелетных мышц вьюнов.

Форма ЛДГ 66°С 68°С 70°С 71°С

«холодная» 0 0,0101±0,0007 0,0110±0,0004 0,072±0,004

«теплая» 0,0030±0,0003 0,0142±0,0003 0,0272±0,0011 0,091±0,006

Изображенная на рис. 1 зависимость дает основания предположить, что инактивация ЛДГ протекает по диссоциативному механизму. Простейшая кинетическая схема в этом случае имеет вид: N4 <->4М-»40,

где О - продукт необратимого изменения субъединиц белка, а N4 и N -соответственно тетрамерные и мономерные формы.

Эта схема учитывает обратимую диссоциацию активной тетрамерной структуры на четыре неактивные субъединицы, которые претерпевают необратимое изменение до состояния О. Представленные на рис. 1 кинетические кривые можно условно разделить на два участка:

1. 0<1<т - диссоциация тетрамеров на мономеры до положения равновесия при данной температуре, где I - время инактивации, т - время изменения характера кинетической кривой.

2. 1>х - сравнительно более медленное необратимое изменение мономерных единиц при сохранении установившегося равновесия тетрамеров и мономеров.

Была определена зависимость максимальной скорости реакции (Ущах) от температуры в координатах Аррениуса и рассчитана энергия

активации (Еа) ферментативного процесса для «холодной» и «теплой» форм ЛДГ. В интервале температур от 3 до 28°С, кривые Аррениуса (1п Утах от 1/Т) были линейными, что говорит об отсутствии конформационных переходов молекулы фермента. Для «холодного» и «теплого» ферментов энергия активации не отличалась в пределах экспериментальной ошибки и была равна 47,4±1,8 кДж/моль и 49,2± 1,8 кДж/моль, соответственно.

3. Термодинамические параметры денатурации ЛДГ.

Для характеристики термодинамической стабильности двух форм ЛДГ было проведено изучение их температурной денатурации методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Кривые плавления «холодной» и «теплой» ЛДГ в диапазоне рН от 4,0 до 8,5 содержали один достаточно узкий пик теплопоглощения, соответствующий фазовому переходу молекулы из нативной в денатурированную форму (рис. 2).

1000

800

л 600

с;

о

О

400

200

20

40

60

т, °с

80

100

Рис. 2. Температурные зависимости избыточной теплоемкости «холодной» и «теплой» форм ЛДГ. Измерения при рН 7,0.

Температура денатурации (Т,„) для обеих форм фермента не отличалась при всех используемых скоростях нагрева и значениях рН. Ныли определены калориметрическая (Д1Г'1") и эффективная (АН"1"1') энтальпии переходов, а также рассчитан индекс кооперативное™ (г). Термодинамические параметры при всех изученных значениях рН приведены в табл. 2. Калориметрическая энтальпия перехода ЛДГ из нативного в денатурированное состояние (определяемая площадью под пиком теплопоглощения) во всех экспериментах была выше для «теплой» формы, чем для «холодной». Другими словами, для разрушения нативной структуры фермента, выделенного из мышц рыб, адаптированных к высоким температурам, необходимо зэтраппь большее количество энергии, че < при адаптации к низким температурам. Это, по-видимому, связано с образованием дополнительных водородных связей в молекуле «теплой» ЛДГ, т.к. при экстраполяции ДНкал к 110°С величина энтальпии перехода «теплой» формы фермента выше энтальпии «холодной» формы (Рпуа1оу, КИесЫпазИуШ, 1974).

Таблица 2. Термодинамические параметры денатурации ЛДГ из скелетных мышц вьюнов, адаптированных к 5 и 18°С при разных значениях рН.

рН Форма ЛДГ т„„ °с ДИ™, кДж/моль ДНэфф, кДж/моль г

4,0 «холодная» 69,2 1842 728 2,5

«теплая» 69,2 1988 795 2,5

4,5 «холодная» 76,8 2829 906 3,1

«теплая» 76,8 2867 960 3,0

5,0 «холодная» 78,7 3212 1013 3.2

«теплая» 78,7 3311 1163 2,9

5,6 «холодная» 79,1 3388 1153 2,9

«теплая» 79,1 3612 1336 2,7

6,5 «холодная» 78,8 3473 934 3,7

«теплая» 78,8 3656 1061 3,5

7,0 «холодная» 77.3 3360 854 3,9

«теплая» 77,3 3570 952 3,8

7,2 «холодная» 75,3 3210 "773 4,1

«теплая» 75,3 3408 844 4,0

8,0 «холодная» 71,4 2982 777 3,8

«теплая» 71,4 3192 781 4,1

8,5 «холодная» 70,0 2917 754 3,9

«теплая» 70,0 3124 758 4,1

4. Анализ деконволюции кривых плавления «холодной» и «тснлои»

ЛДГ.

При анализе полученных температурных зависимостей избыточной теплоемкости было показано, что индекс кооперативности процесса тепловой денатурации ЛДГ (г) был больше единицы (табл. 2). Это говорит о том, что течение процесса денатурации не соответствует модели двух состояний. Полученный результат ставит вопрос о том, каким структурным единицам белка соответствуют кооперативные единицы.

В связи с этим вопросом была проведена декоиволюция полученных калориметрических кривых плавления «холодной» и «теплой» форм ЛДГ.

Прежде всего, практически во всем диапазоне рН, денатурационный переход для обеих форм ЛДГ состоит из трех независимых переходов, каждый из которых происходит по принципу «все или ничего», т.е. отвечает модели двух состояний (рис. 3). Полученные результаты согласуются с рентгеноструктурными данными для М4-ЛДГ из мышц собачьей акулы Squalus acanthias (Bventofï et al., 1977), в соответствии с которыми в молекуле ЛДГ можно выделить три структурных единицы: субъединичную организацию тстрамера М4-ЛДГ и двухдоменную структуру каждой из субъединиц (НАД-связывающий и каталитический домены). С другой стороны, этот результат согласуется с данными по термоинактивации фермента, изложенными выше.

Не явилось неожиданностью * то, что температуры Тт', соответствующие серединам соответствующих переходов, практически не отличаются для «холодного» и «теплого» ферментов во всем диапазоне рН, а также то, что энтальпия второго и третьего переходов (как и полная энтальпия денатурации АНкал) имеют максимум вблизи рН 6,0 и во всех случаях выше для «теплого» фермента. На фоне этих результатов динамика первого перехода имеет одну особенность. При увеличении р!1 энтальпия первого перехода растет практически монотонно. Если при рН 4,0 вклад первого перехода в ДНкал практически равен нулю, то при рН 7,2 энтальпия первого перехода составляет 22% от величины полной энтальпии (690 кДж/моль и 761 кДж/моль для «холодной» и «теплой» формы, соответственно).

В некоторых работах предполагается, что температурная денатурация ЛДГ проходит через стадию диссоциации тстрамера на мономеры (Кубе и др., 1987). В этом случае можно отождествить первый

"холодный" фермент "теплый" фермент

Т. "С Т. °С

Рис. 3. Декоиволюция кривых ДСК «холодной» и «теплой» форм ЛДГ

переход с диссоциацией тетрамера ЛДГ. При рН 4,0 первый переход в деконволюции практически не наблюдается. Если учесть, что понижение уровня рН может приводить к диссоциации субъединичных белков, то можно утверждать то при рН 4,0 эта диссоциация происходит уже при нормальной температуре (25°С). Два других перехода можно отождествить с независимым разрушением структуры НАД-связывающего и каталитического доменов диссоциированных субъединиц ЛДГ.

5. Конформационная стабильность ЛДГ.

Свободная энергия Гиббса денатурации белка (ДО) определяет его конформационную стабильность и весьма удобна при сравнительном исследовании.

Расчет свободной энергии Гиббса не выявил значительных различий в характере температурной зависимости АС для «холодной» и «теплой» форм ЛДГ. Наблюдаемый максимум Дв (при температурах около 40-50°С) соответствовал области максимальной стабильности ЛДГ по данным измерения активности фермента при разных температурах. Однако, при физиологических температурных условиях (ниже 20°С), величина ДО была выше для ЛДГ выделенной из мышц вьюнов адаптированных к 18°С. Известно, что для эффективного функционирования белка его структура должна быть строго определенной в широком интервале условий и не должна легко нарушаться. Энергия стабилизации структуры должна быть достаточной для обеспечения постоянного относительного расположения всех его элементов и значительно превосходить ЯТ, т.е. Дв должна быть порядка нескольких десятков кДж/моль. С другой стороны, для обеспечения эффективного функционирования системе необходима подвижность и она не должна быть слишком жесткой для реализации малых конформационных изменений без существенных энергетических затрат (Пфайль, Привалов, 1982). По этой причине, при физиологических температурах «холодный» вариант ЛДГ имеет несколько меньшие значения Дв, чем «теплый», т. е. обладает несколько большей подвижностью структуры, что обеспечивает его более высокую удельную активность по сравнению с «теплым» ферментом.

6. Определение теплоемкости «колодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме.

Один из результатов данной работы - различие удельной теплоемкости нативной формы ЛДГ из мышц рыб адаптированных к разным температурным условиям. Эта величина была равна 1,39±0,03 Дж г'К'1 для «холодной» формы фермента, а для «теплой» формы на 20% меньше - 1,14±0,05 Дж г"'К"'. Теплоемкость нативной формы белка определяется вкладом трех составляющих: 1) теплоемкости полипептидной цепи и боковых групп аминокислотных остатков в газовой фазе (они равны для «холодной» и «теплой» формы ЛДГ, поскольку нет значимых различий их аминокислотного состава), 2) теплоемкости внутримолекулярных взаимодействий в белковой глобуле (которая отличается не более, чем на 10% для белка в нативном состоянии и в состоянии расплавленной глобулы), 3) теплоемкости гидратации белковой молекулы (МакЪатаёге, Рпуа1оу, 1990; Рпуа1оу, МаМшасЬх, 1990, 1992). Поэтому можно предполагать, что полученные различия в величинах теплоемкости определяются различиями в теплоемкостях гидратации «холодной» и «теплой» форм ЛДГ, вызванных информационными изменениями белка. Такое большое изменение теплоемкости, по-видимому, связано с большим количеством доступных растворителю неполярных групп «холодного» фермента по сравнению с «теплым» (Рпуэ1оу, Мак!шас1ге, 1992). Данный вывод согласуется с тем положением, что по мере снижения температуры сила гидрофобных взаимодействий уменьшается.

Разница в теплоемкости двух форм ЛДГ означает, что «холодный» фермент при той же температуре, что и «теплый», имеет большее теплосодержание. Другими словами, конформационная подвижность «холодной» формы ЛДГ становится выше по сравнению с «теплой» и эта подвижность достаточна для осуществления ферментативной реакции при меньших температурах среды, что обеспечивает его более высокую удельную активность по сравнению с «теплой» формой фермента.

Известно, что теплоемкость гидратации нативных глобулярных белков меньше денатурированных за счет меньшей площади экспонированной поверхности белка растворителю и меньшего количества гидрофобных аминокислотных остатков, доступных растворителю (Рпуа1оу, МаЫ^аЛге, 1992). В связи с этим представлялось

важным измерение теплоемкости денатурированной формы «холодной» и «теплой» ЛДГ.

Измерение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в денатурирующих условиях (рН 3,0) не выявило различий в денатурированном состоянии двух форм фермента (2,05±0,06 Дж г"'К'' и 2,06±0,06 Дж г'К"1 для «холодной» и «теплой» ЛДГ, соответственно). Экспериментально полученные данные согласуются с расчетными значениями теплосмкостей развернутой формы «холодной» и «теплой» ЛДГ, вычисленных по методу П.Л.Привалова и Г.И.Махатадзе (Privalov, Makhatadze, 1990, 1992; Makhatadze, Privalov, 1990, 1995).

Таким образом, различия в величине теплоемкости между двумя сравниваемыми формами фермента наблюдаются для нативных белков и исчезают при их денатурации.

7, Особенности необратимого характера температурной денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ.

Зависимость термодинамических параметров денатурации ЛДГ от скорости нагрева (сканирования), а также необратимость процесса тепловой денатурации ЛДГ, регистрируемая отсутствием конформационных переходов при повторном сканировании, ставит вопрос о применимости равновесной термодинамики к анализу полученных результатов. Речь идет о расчете эффективной энтальпии переходов, свободной энергии Гиббса и др. Дополнительный анализ, проведенный по методу Санчес-Руиса, помогает разрешить этот вопрос (Galisteo et al., 1991; Sanchez-Ruiz, 1992).

Если процесс денатурации белка необратим из-за метастабильности начального состояния молекулы, уравнения термодинамики равновесных процессов неприменимы к его анализу. Однако, наблюдаемая необратимость разрушения структуры белка может являться следствием дополнительных сопутствующих процессов, происходящих относительно медленно и с относительно небольшим вкладом в энтальпию по сравнению с огромными конформационными изменениями (Privalov, Potekhin, 1986).

Ряд экспериментальных данных позволяет рассматривать изучаемый процесс в рамках модифицированной модели Ламри-Эйринга для необратимой денатурации субъединичного белка (Lumry, Eyring, 1954; Klibanov, Ahem, 1987; Sanchez-Ruiz, 1992; Jaenicke, 1991, 1993).

Необратимая денатурация субъединичного белка должна происходить по крайней мере в три этапа: диссоциация на субъединицы, обратимое разворачивание нативных субъединиц (Ы) и необратимая перестройка развернутой формы (Ц) в финальное состояние (Р), из которого белок уже не может перейти в нативное:

Характерная зависимость заселенности состояний белка в процессе тепловой денатурации ЛДГ представлена на рис. 4.

Т, °С

Рис. 4. Температурная зависимость заселенности состояний для «теплой» формы ЛДГ при скорости сканирования 1°С/мин.

Из рис. 4 видно, что при температурах, близких к Тт, заселенность конечного состояния достаточно мала, а при температуре завершения денатурационного перехода практически весь белок уже перешел в конечное состояние. Из литературных данных известно, что в этом случае калориметрическая зависимость незначительно отличается от кривой

обратимого перехода и применение методов равновесной термодинамики не приводит к значимым ошибкам (Galisteo et al., 1991; Sanchez-Ruiz, 1992). По этой причине вполне обосновано применение равновесных методов к данному сравнительному анализу.

8. Кинетический анализ температурной денатурации ЛДГ.

Изучаемый процесс денатурации ЛДГ можно также подвергнуть кинетическому анализу как двухстадийный эндотермический переход из нативного (N) в денатурированное (D) состояние (необратимый переход двух состояний) по схеме:

Константа скорости этой реакции кден меняется при изменении температуры согласно уравнению Аррениуса. Из калориметрических кривых, был проведен расчет константы кдсн. (рис. 5).

2 -,

¿S

Константы денатурации при скоростях сканирования: □ -1 "С/мин О - 2'С/мин Д - 4°С/мкн (результат экспериментов ДСК)

Q - константа инактивации (результат измерения аетианости ЛДГ)

2.85

2 90 2.95

1000ГГ, К"1

3 00

Рис. 5. Константы денатурациошюго перехода «теплой» формы ЛДГ при разных скоростях сканирования в координатах Аррениуса. Для сравнения показаны константы инактиааиии ЛДГ (©),

Было проведено сравнение полученных результатов с данными по температурной инактивации фермента. Из рис. 5 видно, что при всех скоростях сканирования константа кдсн хорошо коррелирует с константой температурной инактивации kViB. Хорошая корреляция между к,м и кден при всех скоростях сканирования говорит о том, что процесс денатурации ЛДГ удовлетворительно описывается необратимой моделью двух состояний (Conejero-Lara et al., 1991).

Сходные случаи, когда для анализа полученных результатов подходят как равновесные, так и кинетические методы, описаны а литературе (Manly et al., 1985; Sanchez-Ruiz, 1992).

9. Изучение возможности связывания попов цинка молекулой ЛДГ.

Выявленные различия в функциональных и термодинамических свойствах «холодной» и «теплой» форм ЛДГ ставят вопрос о механизмах или причинах этих различий. Одна из предполагаемых причин - участие лиганда в регуляции температурной адаптации этого фермента. Другая причина - образование в процессе сворачивания М^-ЛДГ при разных температурах различных конформационных вариантов - «конформеров» с различной стабильностью и функциональными свойствами (Fields, Somero, 1997). Следует отметить, что впервые предположение о том, что при разных температурах среды сворачивание одного и того же белка (в данном случае ЛДГ) может протекать по-разному и приводить к формированию различных конформаций фермента, было сделано ранее (Ozemyuk et al., 1994).

Известно, что ЛДГ относится к группе ферментов, не содержащих металлы (Pesce et al., 1967). Однако, появляющиеся в последнее время литературные данные (Биркая и др., 1990; Киладзе и др., 1996) позволяют говорить о возможности связывания цинка с молекулой ЛДГ. Также было описано воздействие цинка на активность ряда ферментов (Tsuruta et al., 1998). Для связывания ионов Zn2+ с белком в его аминокислотной последовательности должны содержаться «цинковые пальцы» - две пиры цистеинов или гистидинов, удаленные друг от друга на несколько аминокислот (Vallee, Auld, 1990; Vallee et al., 1991).

Был проведен поиск «цинковых пальцев» в аминокислотной последовательности М4-ЛДГ. Поскольку информация о первичной структуре этого фермента из мышц вьюна отсутствует, были использованы данные для М4-ЛДГ из мышц собачьей акулы Squalus

acanthiits, полученные в лаборатории Россмана (Abad-Zapatero et al., 1987).

ATLKDKLIGg LATSQEPRSY NXITWGVGA VGMApAISIL MKDLADEVAL vdvmsdklikg cle-alqbgsl flfltakivsg kdy3v3agsk lwitaotirq QSGSSRLNLV QKWVíüFItFI IPNIVKHSPD CIILWSHPV DVLTYVATjKL SGLFMgRIIG SGONLDS AP.F RYLKGERLGV HSCSCHGHVI GERGDSVPSV VÍSGMHVASIK L§PELGTMKD KQDVÍKKLKKD WDSAÍEVIK LKGYTSWAIG LSVADLAETI ШЗШ^аУЕРУ STMVKDFYGI KDHVFLSLPC VUiDHGXSMI VIO-SÍLKPDEK QQLQKSATTL, VmiQKDLKF

Pite. 6. Аминокислотная последовательность субьедшшцы М4-ЛДГ из мышц собачьей акулы Squalus acanthias. Цисгеины и гистидины выделены серым цветом, возможные цинк-связывающие мотивы подчеркнуты.

Как видно из рис. 6, в первичной структуре молекулы ЛДГ можно выделить три участка полипептидной цепи, имеющих хзрактер цинк-пальцевой последовательности. Следует отметить, что один из этих участков включает в себя область активного центра (His 193). Не

т 2+

вызывает сомнения, что возможное связывание иона Zn с этим участком не может не влиять на функциональные свойства фермента.

Рентгеноспектральный флуоресцентный анализ элементного состава образцов «холодной» и «теплой» ЛДГ не выявил различий в содержании кальция и фосфора. Однако, содержание цинка в препарате «холодной» формы ЛДГ было примерно в 3-4 раза выше, чем в «теплой» форме.

Опираясь на литературные данные об увеличении конформационной стабильности белков (Conejero-Lara et al., 1991), а также данные о повышении активности некоторых ферментов (De Francesco et al., 1996) при связывании цинка, можно говорить, что полученный результат и является одной из причин наблюдаемых различий функциональных и структурных свойств «холодной» и «теплой» форм ЛДГ.

выводы

1. Лактатдегидрогеназа из белых скелетных мышц вьюнов, адаптированных к низким температурам («холодная» форма фермента), обладает большей термостабильностью по сравнению с ЛДГ из мышц рыб, адаптированных к относительно высоким температурам («теплый» фермент).

2. Температуры денатурационных переходов (Тт) для «холодной» и «теплой» ЛДГ не отличаются, однако «теплая» форма фермента обладает большей энтальпией перехода (АН""1) по сравнению с «теплой» формой.

3. При физиологических температурах изменение свободной энергии Гиббса, характеризующее стабильность белка, меньше у «холодной» формы фермента по сравнению с «теплой».

4. Удельная теплоемкость при 25°С выше для «холодной» ЛДГ по сравнению с «теплой», что свидетельствует о большей конформационной подвижности «холодной» формы фермента. Различия в величине теплоемкости двух форм ЛДГ исчезают после их денатурации.

5. Денатурация ЛДГ во всем изученном интервале рН представляет собой трехстадийный переход, учитывающий начальную диссоциацию фермента на субъединицы и двухетадийную денатурацию субъединиц.

6. Обнаружена хорошая корреляция кинетических данных, полученных методом дифференциальной сканирующей калориметрии, с результатами по кинетике термоинактивации фермента.

7. Выявлены места возможного связывания ионов цинка молекулой ЛДГ. «Холодная» форма ЛДГ содержит в 3-4 раза больше ионов цинка, чем «теплая» форма. Предполагается, что эти различи служат одной из причин изменения функциональных и структурных свойств фермента при температурной адаптации.

Список статей опубликованных по теме диссертации:

1. Клячко О.С., Полосухина Е.С., Персиков А.В., Озернюк Н.Д., Кинетические различия лакгатдегидрогеназы из мышц рыб при температурной адаптации. Биофизика, ¡995, т.40, №3, с. 513-517.

2. Даниленко А.Н., Персиков А.В., Полосухина Е.С., Клячко О.С., Есипова Н.Г., Озернюк Н.Д., Термодинамические свойства лактатдегидрогеназы из мышц рыб Misgurnus fossilis, адаптированных к разным температурам среды. Биофизика, 1998, т.43, №1, с. 26-30.

3. Персиков А.В., Даниленко А.Н., Клячко О.С., Озернюк Н.Д., Сравнительное изучение конформационной стабильности лактатдегидрогеназы из мышц вьюнов, адаптированных к разным температурам среды, по данным дифференциальной сканирующей микрокалориметраи. Биофизика, 1998, т.43, №6, с.

4. Персиков А.В., Изменения конформационной стабильности мышечной лактатдегидрогеназы при температурных адаптациях вьюна Missgurnus fossilis. Известия РАН, серия биологическая, 1999, (в печати).

Тезисы докладов:

1. Ozemyuk N.D., Persikov A.V., Zassedateleva О.А., Danilenko A.N., Bazhulina N.P., Klyachko O.S., Esipova N.G., Structural and kinetic stability of lactate dehydrogenase from muscles of fish adapted to different environmental temperatures. Abstracts from the International Symposium on Stability and Stabilisation of Biocatalysts, Cordoba, Spain, April 19-22, 1998, p. 86.

2. Персиков A.B., Влияние температурной адаптации на стабильность лактатдегидрогеназы из скелетных мышц вьюна. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Возрастная и экологическая физиология рыб», Борок, 1998, с. 84-85.

3. Persikov А.V., Danilenko A.N., Conformational stability of lactate dehydrogenase from skeletal muscles of fishes adapted to different environmental temperatures. Abstracts from International Symposium «Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects», Moscow, Russia, June 22-26, 1998, p. 136.

4. Persikov A.V., Ozernyuk N.D., Kinetic study of the irreversible temperature denaturation of lactate dehydrogenase by differential scanning microcalorimetry. Abstracts from Twelfth Symposium of the Protein Society, San Diego, California, USA, July 25-29, 1998.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Персиков, Антон Валерьевич, Москва

/

/ ? /О /"> еэ К» »« --V

чУУ - ^ /ь ^ оУ.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 577.3

ПЕРСИКОВ Антон Валерьевич

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ РЫБ

03.00.13. - физиология человека и животных 03.00.02 - биофизика

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Н.Д. Озернюк

Москва - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ.................................................................................................2

1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................7

2.1. Температурные адаптации белков.........................................................7

2.1.1. Физиологический уровень адаптаций: как перестраивается метаболизм в ответ на изменение температуры.......................................7

2.1.2. Воздействие температуры на функциональные и структурные свойства ферментов....................................................................................8

2.2. Строение лактатдегидрогеназы............................................................15

2.2.1. Структурам свойства лактатдегидрогеназы.................................15

2.2.2. Строение активного центра ЛДГ...................................................18

2.2.3. Воздействие температуры на функциональные и структурные свойства ЛДГ.............................................................................................19

2.3. Термодинамические свойства белков при температурной денатурации и механизмы их термостабильности....................................22

2.3.1. Денатурация небольших глобулярных белков.............................24

2.3.2. Денатурация сложных белков........................................................28

2.3.3. Взаимодействие белков с лигандами............................................31

2.3.4. Анализ необратимых переходов в белках....................................35

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................................40

3.1. Краткая характеристика объектов.......................................................40

3.2. Выделение лактатдегидрогеназы из мышц рыб.................................40

3.3. Определение активности ЛДГ.............................................................41

3.4. Определение максимальной скорости реакции..................................43

3.5. Термоинактивация ЛДГ........................................................................43

3.6.Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.....................44

3.9. Деконволюция кривых ДСК.................................................................45

3.8. Измерение абсолютной величины теплоемкости нативной и денатурированной формы ЛДГ...................................................................46

3.9. Кинетическое исследование температурной денатурации...............48

3.10. Определение содержания ионов цинка в ЛДГ методом рентгеноспектрального флуоресцентного анализа...................................49

3.11. Компьютерный анализ трехмерной структуры молекулы м4-ЛДГ.49

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................51

4.1. Влияние температуры на активность ЛДГ.........................................51

4.1.1. Температурный оптимум ферментативной реакции...................51

4.1.2. Кинетика температурной инактивации ЛДГ................................52

4.1.3. Определение термодинамических параметров ферментативной реакции для «холодной» и «теплой» ЛДГ..............................................56

4.2. Микрокалориметрическое исследование температурной денатурации ЛДГ..........................................................................................58

4.2.1. Температурная зависимость избыточной теплоемкости ЛДГ.... 58

4.2.2. Изменение термодинамических параметров денатурации ЛДГ при разных рН раствора............................................................................60

4.2.3. Анализ деконволюции калориметрических кривых....................65

4.2.4. Вычисление температурной зависимости изменения свободной энергии Гиббса при денатурации............................................................70

4.3. Определение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме.........................................................................70

4.3.1. Измерение теплоемкости ЛДГ в нативной форме при 25°С.......70

4.3.2. Измерение теплоемкости денатурированной формы ЛДГ при 25°С.............................................................................................................73

4.3.3. Вычисление теплоемкости денатурированной формы ЛДГ по аминокислотному составу........................................................................74

4.4. Кинетические особенности температурной денатурации ЛДГ........75

4.5. Исследование возможности связывания ионов цинка молекулой ЛДГ................................................................................................................79

4.6. Измерение содержания цинка в молекуле «холодной» и «теплой» форм ЛДГ......................................................................................................81

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................87

5.1. Функциональные свойства ЛДГ из мышц вьюна при адаптации к разным температурам...................................................................................87

5.1.1. Температурный оптимум ферментативной реакции ЛДГ...........87

5.1.2. Кинетика термоинактивации фермента........................................89

5.1.3. Термодинамические параметры ферментативной реакции для «холодной» и «теплой» ЛДГ....................................................................91

5.2. Микрокалориметрическое исследование температурной денатурации ЛДГ..........................................................................................91

5.2.1. Анализ температурной зависимости избыточной теплоемкости ЛДГ. Калориметрическая энтальпия денатурации ЛДГ........................91

5.2.2. Влияние рН на термодинамические параметры тепловой денатурации ЛДГ......................................................................................93

5.2.3. Анализ деконволюции кривых плавления «холодной» и «теплой» ЛДГ............................................................................................94

5.2.4. Температурная зависимость изменения свободной энергии Гиббса при денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ.........................96

5.3. Определение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме.........................................................................97

5.4. Особенности необратимого характера температурной денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ.......................................................................98

5.4.1. Доказательство применимости термодинамики обратимых процессов к анализу денатурации ЛДГ...................................................98

5.4.2. Кинетический анализ температурной денатурации ЛДГ..........100

5.5. Изучение возможности связывания ионов цинка молекулой ЛДГ. 100

6. ВЫВОДЫ...................................................................................................103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................104

1. ВВЕДЕНИЕ

Изучение физиологических и биохимических особенностей адаптации пойкилотермных животных к разным температурам имеет важное значение для понимания регуляторных механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность этих организмов в различных условиях среды. Важное место в приспособлении пойкилотермных к разным температурным условиям занимают ферменты, обеспечивающие метаболические перестройки при изменении температуры.

В то время, как механизмы эволюционных приспособлений к различным температурным условиям детально исследованы (Александров, 1975; Хочачка, Сомеро, 1988; Holland et al., 1997 и др.), онтогенетические температурные адаптации, формирующиеся на протяжении нескольких недель или месяцев, изучены фрагментарно (Клячко и др., 1993; Ozernyuk et al., 1994; Vetter, Buchholz, 1997). Изменение функциональных и структурных свойств белков при адаптациях к различным температурам обитания определяется, с одной стороны, аминокислотными заменами, а с другой - взаимодействием белков со стабилизирующими факторами (катионами, коферментами, мембранами, пептидами) (Argos et al., 1979; Jaenicke, 1991; Fields, Somero, 1997).

Изменения претерпеваемые белками при кратковременных температурных адаптациях (акклимациях) и сезонных адаптациях, изучены недостаточно. Особенно важным представляется изучение структурных изменений в белках при температурных акклимациях пойкилотермных животных, поскольку эти изменения лежат в основе функциональных особенностей белков.

Для изучения структурных и функциональных изменений в белках при температурной акклимации был выбран фермент углеводного обмена - лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Известно, что этот детально изученный

фермент проявляет высокую степень полиморфизма и чувствительность к различным воздействиям. В связи с этим можно ожидать, что изучение структурных и функциональных особенностей данного фермента в различных температурных условиях может служить адекватной моделью для исследования молекулярных механизмов адаптации ферментативных процессов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Температурные адаптации белков.

2.1Л. Физиологический уровень адаптаций: как перестраивается метаболизм в ответ на изменение температуры.

Влияния экологических факторов на функциональные и структурные особенности белков и ферментов, в частности, в последние годы является предметом интенсивных исследований. При этом, наибольший интерес вызывает температура, поскольку у пойкилотермных животных этот фактор среды меняет температуру тела и, следовательно, скорость реакций метаболизма. Однако, влияние температуры на скорость метаболических процессов - не единственный вид температурных воздействий.

В литературе обсуждается несколько возможностей регуляции метаболизма при температурной акклимации пойкилотермных животных. Так, в частности, Шакли с сотрудниками (81шк1ее е! а1., 1977) рассмотрели несколько основных механизмов, в соответствии с которыми может регулироваться суммарный поток метаболитов:

1) изменения концентрации субстратов и/или продуктов метаболического пути (либо прямой, либо обратной реакции);

2) изменения концентрации модуляторов, которые влияют на каталитическую активность ферментов;

3) конформационные изменения ферментов, приводящие к изменениям в Км, Утах и др.;

4) изменения количества ферментов, которые катализируют отдельные реакции в рамках данного метаболического пути;

5) изменения изоферментных спектров.

Все эти типы регуляции были рассмотрены (8Ьак1ее ег а1., 1977) при анализе более десяти ферментов углеводного и окислительного

метаболизма в процессе температурной акклимации к низким и высоким температурам зеленой солнечной рыбы Leponis cyanellus. V

Все пять вышеупомянутых механизмов в различной степени влияют на динамику регуляции метаболизма в период температурной акклимации. Анализу первых трех механизмов посвящен ряд работ (Moon, Hochachka, 1971* 1972; Somero, 1975; Dittrich, 1992; Vetter, Buchholz, 1997 ; Holland et al., 1997; Pierce, Crawford, 1997 и др.).

В цитированной выше работе (Shaklee et al, 1977) рассматриваются механизмы изменения количества ферментов, а также изменения изоферментных спектров. Следует отметить, что все перечисленные механизмы в разной степени играют регулирующую роль для различных органов и тканей тех или иных видов рыб при температурных адаптациях.

2.1.2. Воздействие температуры на функциональные и структурные

свойства ферментов.

Анализ механизмов температурной адаптации ферментов предполагает изучение их кинетических свойств при разных температурах среды. Так, отличительной особенностью адаптации ферментов к низкой температуре является их более высокая каталитическая эффективность, которая компенсирует неизбежное падение скорости химической реакции при понижении температуры (Хочачка, Сомеро, 1988). Эта оптимизация каталитических параметров определяется высокой гибкостью структуры этих белков, обеспечивающей повышенную способность подвергнуться конформационным изменениям в процессе катализа при низких температурах.

Молекулярное моделирование трехмерной структуры адаптированных к холоду ферментов показывает, что только тонкие конформационные изменения в ферменте, связаны с их адаптацией (Feller et al., 1997). Наблюдаемые структурные особенности включают: 1) сокращение числа слабых взаимодействий, вовлеченных в стабильность нативной структуры, таких как солевые мостики, слабо

полярные взаимодействия между ароматическими группами, водородные связи, содержание аргинина и дипольные взаимодействия в а-спиралях;

2) понижение уровня гидрофобности гидрофобных кластеров, формирующих ядро белковой глобулы;

3) стирание или замена пролиновых остатков в петлях или поворотах, соединяющих вторичные структуры;

4) усиление солевых связей с гидрофильной поверхностью посредством экспонирования дополнительных заряженных участков;

5) смещение глициновых кластеров ближе к функциональным областям молекулы;

6) изменение констант связывания ионов металлов, в частности Са+2.

Не существует общего правила наблюдаемых изменений в разных случаях. Каждый фермент принимает собственную стратегию адаптации, используя одно или комбинацию этих изменений. Следует отметить, что у термофильных ферментов наблюдаются такие же типы структурных особенностей, поэтому можно говорить об общности в стратегии адаптации белков к температуре (Feller et al., 1997).

Известно, что основной кинетической характеристикой ферментов принято считать константу Михаэлиса (Км), численно равную концентрации субстрата, при которой скорость данной реакции составляет половину от максимальной. Чем больше фермент-субстратная аффинность, тем меньшая концентрация субстрата требуется для достижения максимальной скорости реакции, и следовательно, тем меньше будет численное значение Км. Таким образом , величина Км обратна степени сродства фермента к субстрату. При избытке субстрата изменение Км мало отразится на скорости реакции. Поскольку концентрация субстратов в клетке низкая, изменение Км служит регулятором скорости ферментативной реакции. Величина Км зависит от температуры в самом широком смысле, т.е. от температуры обитания вида, температуры акклимации и от температуры опыта (Holland et al.,

1997; Jagdale, Gordon, 1997; Vetter, Buchholz, 1997; Zietara et al., 1997 и

др.)-

Обычно выделяют эволюционный и онтогенетический уровни адаптаций ферментов пойкилотермных животных к температуре среды (Александров, 1975; Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Argos et al., 1979; Клячко и др., 1992, 1993; Ozernyuk et al., 1994). Остановимся подробнее на примерах эволюционных температурных адаптаций ферментов.

Исследование взаимосвязи температуры обитания и функциональных свойств ферментов у пойкилотермных животных наиболее основательно проведено Хочачкой, Сомеро и их сотрудниками (Хочачка, Сомеро, 1977, 1988). Из этих работ следует, что у большинства изученных ферментов пойкилотермных животных наблюдается зависимость Км от температуры обитания вида, от температуры акклимации и температуры опыта.

В исследованиях по зависимости кинетических свойств ферментов от температуры среды минимальная величина Км обнаруживается при температуре, близкой к температуре обитания вида. Например, минимальное значение Км для глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы камчатского краба, средняя температура обитания которого около 7°С, находится при 5°С (Somero, 1969). Было показано, что пируваткиназа в мышцах камчатского краба существует в двух различных формах: фермент, адаптированный к низким температурам, имеет минимум Км при 5°С, а при адаптации к относительно высоким - минимум при 12°С. «Холодный» фермент активен лишь при температуре ниже 10°С, а «теплый» - при температуре выше 9°С (Somero, 1969).

Из изложенных выше данных, следует, что у животных, обитающих в различных температурных условиях, положение температурного минимума Км различается и соответствует в общем температуре обитания вида (Хочачка, Сомеро, 1988). Причиной этих различий могут являться аминокислотные замены в участках полипептидной цепи вдали от активного центра. Эти замены могут независимо влиять как на кинетические свойства, так и на

термостабильность ЛДГ (Hewitt et al, 1997; Holland et al., 1997; Pretsch et al, 1998).

Подробное изучение этой проблемы было проведено в лаборатории Дж. Сомеро (Holland et al, 1997) на МрЛДГ из мышц шести видов барракуд (семейство Sphyraena). Анализ первичной структуры м4-ЛДГ (на основе секвенирования кДНК) показал, что для гомологов из трех видов: самого северного - S. argentea, субтропического - S. lucas ana и самого южного - S. idiastes, выявляются четыре аминокислотные замены: в позициях 8, 61, 68 и 223. Показано, что замены 61 и 68 аминокислотных остатков приводят к различию в величинах Км между S. argentea и S. lucasana. Различия в позиции 8, в свою очередь, являются причиной разной термостабильности гомологов м4-ЛДГ из S. argentea, S. idiastes и S. lucasana.

Следует отметить, что у животных, обитающих в различных температурных условиях и отличающихся степенью эвритермальности, может меняться темп изменения Км при разных температурах опыта (Хочачка, Сомеро, 1988; Coppes, Somero, 1990).

Если механизмы эволюционных адаптаций ферментов к температурным условиям детально исследованы, то онтогенетические температурные адаптации (акклимации), формирующиеся на протяжении нескольких недель, изучены недостаточно. В ряде работ установлено, что функциональная активность ферментов может модифицироваться относительно кратковременными (несколько недель) температурными воздействиями (Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Dittrich, 1992; Клячко и др., 1993; Ozernyuk et al., 1994). Температурная акклимация, приводящая к изменению функциональных и структурных свойств ферментов, в некоторых случаях связана с синтезом новых изоформ ферментов. В других случаях синтеза новых изоферментов при изменении температ