Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные и биохимические характеристики спермиев человека при криоконсервировании в условиях сверхбыстрого охлаждения

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Функциональные и биохимические характеристики спермиев человека при криоконсервировании в условиях сверхбыстрого охлаждения"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

КУЧКОВ ІГОР МИКОЛАЙОВИЧ

УДК: 615.361.013.11.014.413

Функціональні і біохімічні характеристики сперміїв людини прп кріоконсервації в умовах понадшвидкого охолодження

ОЗ.ООД^- кріобіологія і кріомедицнна

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі кріофізіолопї клітини Інституту проблем кріобіолог і кріомедицини НАН України Наукоаий керівник:

академік НАН України ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, Гордієнко Є.О. зав. відділом низькотемпературн консервації інституту проблем кріобіолог il і кріомеднцини ІІАН України

доктор біолоіічнпх наук, професор, Гладкова А.І., зав. лабораторк репридуктивної ендокринології (Український НДІ фармакотерапії ендокринні захворювань ім. В.Я. Данилевськото)

Провідна установа; Харківський державний медичний університет, кафедра біології л

Захист відбудеться /'ОЛ^'ГИ 2000 року о____'{tf '____годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. при Інституті проблем кріобіології і кріомеднцини НАН України,

310015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКІК НАН України 310015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий '^я/ûc/f .2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради докт, кед. наук, професор

Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність тема. Репродукція людини має загальну з всією органічною прнродою біологічну основу. На відміну від тваринного і рослинного миру це біологічне начало в людському суспільстві опосередковано соціальними чинниками. Серед чинників, що впливають на демографічні процеси, нарівні з віково-половою і шлюбною структурою населення, важлива роль відводиться проблемі неродючості.

Забезпечення умов для збереження репродуктивного здоров'я є одним з найважливіших критеріїв стратегії стійкого розвитку суспільства. Демографічні показники [Іванюта Л.І. 1996] свідчать про формування в Україні стійкої тенденції до старіння населення, зростання в його структурі питомої ваги людей немолодого і старечого віку. Ці тенденції в поєднанні з підвищенням нинішніх вимог до рівня якості життя загалом і статевого життя зокрема зумовлюють високу актуальність вивчення проблеми неродючості у чоловіків.

Прогрес в лікуванні вказаної патології в останнє десятиріччя в певній мірі пов'язаний із застосуванням кріометодів в терапії цього захворювання. Саме тому кріохонсервація репродуктивних клітин людини стала зараз однією з актуальних проблем сучасної кріобіології. Організація кріобанків сперми людини вирішує проблему народження повноцінних дітей при зайнятості батьків в небезпечних галузях виробництва науки і техніки, пов'язаних з можливістю променевої поразки, хімічної інтоксикації, загибеллю і іншими несприятливими впливами. Инсемінація кріоконсервованою спермою використовується також при хірургічних операціях на статевих органах, що вимушено або спеціально (стерилізація) приводять до неродючості. Кріобанкн сперми дають також можливість контролю якості еякулятів, що має актуальне значення в зв'язку із збільшенням зон підвищеної радіації і епідеміологічною ситуацією, що гіршає. Незважаючи на прогрес, в проблемі низькотемпературного зберігання сперми людини, засоби кріоконсервації, які традиційно застосовуються для цих кліток недостатньо ефективні. Тим часом результати понадшвидкого охолоджування зразків сперми, дозволили авторам побачити певні перспективи в плані поліпшення якості відігрітого матеріалу по ряду морфо-

логічних і біохімічних показників [Грищенко В.И.,Калугин Ю.В., Лучхо H.A. 1994]. Потрібно зазначити, що метод понадшвидкото охолодження дозволяє піддавати кріоконсервації сперму прн деяких видах патології (астеноспермія, олігоастеноспермія). , '

Астеноспермія, що характеризується низьким рівнем рухливості сперміїв в еякуляті, є сьогодні однією з головних причин, що прнводять до неродючості у чоловіків. Кількість безплідних шлюбів, зумовлених астеносперніею зростає з кожним роком.

У зв'язку з цим надзвичайно актуально дослідити стан біохімічного метаболізму сперміїв, що перенесли кріиоконсервування в умовах понадшвидкого охолоджування, і можливість його коректувати за допомогою хімічних агентів. Доцільним представляється стимулювати клітини прн нормоспермії і астенос-пермії. Серед запропонованих стимуляторів рухливості сперміїв особлива увага приділяється сьогодні похідним иетилксантина (кофеїн, теофілін, пентоксифілін) [Shen M.R., Chiang Р.Н. 1991 Yovich J.L. 1993]. Однак дія цих біологічно-активних речовин на спермії людини після їх кріоконсервації вивчена недостатньо [Hammit D.G. BediaE 1989, Hellstrom W.J.G., Sikka S.C. 1989]. Роботи по дослідженню впливу похідних иетилксантина на спермії людини прн їх кріоконсервації в умовах по-надшвидких швидкостей охолоджування наданий момент повністю відсутні. Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт за темою: «Вивчити механізми підвищення фертильності гамет та стійкості фетальних клітин людини та тварин при дії низьких температур в поєднанні з іншими физичними та хімічними факторами» (шифр - 2.6.66.), затвердженої президією НАН України, де автор виконував самостійний розділ.

Мета і задачі дослідження:

Метою даної роботи є стимуляція біологічно-активними речовинами деяких фізіологічних та біохімічних параметрів сперміїв людини в нормі і при астенос-пермії до і після кріоконсервації.

з

Об'єкт дослідження. Спермії і еякулят людини, вплив понадшвидкого охолодження та похідних метилксантина па біохімічні зміни в сперміях після відігріва.

Предмет дослідження. Визначення стану фруктоліза та вмісту макроергичних сполук в сперміях людини прн їх охолодженні в умовах надшвидкого охолодження і присутності похідних метилксантина в середовищі інкубації.

Відповідно до поставленої мети роботи малося намір вирішити наступні задачі:

1. Визначити мінімальні концентрації кофеїну і пентоксифіпіну, необхідні для стимуляції натннних і хріоконсервованих сперміїв людини в нормі і при астеноспермії.

2. Дослідити вплив стимулюючих факторів на вміст АТФ і креатннфосфату в сперміях людини в нормі і прн астеноспермії до та після кріоконсервації з використанням понадшвидких скоростей охолодження.

3. Дослідити вплив кофеїну і пентоксифіліиу на динаміку утилізації фруктози сперміями людини в нормі і прн астеноспермії до та після кріоконсервації з використанням надшвидких швидкостей охолодження.

Наукова повнзна отриманих результатів. Вперше показана можливість використання метилксантинів як стимуляторів рухливості для нормальних і астенічних сперміїв людннн, кріокопсервованих в умовах понадшвидких швидкостей охолоджування з метою підвищення їх біоенергетичних характеристик.

Вперше доведені принципові відмінності в динаміці споживання фруктози і концентрації макроергичних сполук в нативннх і кріоконсервованнх сперміях людини, инкубованих в розчинах що містять кофеїн і пентохсифілін.

Вперше показана модулююча дія понадшвидких швидкостей охолоджування на морфофункціонапьні характеристики сперміїв при астеноспермії, що приводить до зниження ефективної концентрації пентоксифілінав середовищі інкубації.

Експериментально обгрунтована доцільність використання стимуляторів рухливості сперміїв після відігріву. Обговорені можливі перспективи створення

кріобанка клітин при патоспермії і шляху їх практичного використання для програй штучної інсенінації і запліднення in vitro.

Практичне значення отриманих результатів. Використані нові підходи до вивчення патоспернії, шляхом аналізу змін біоенергетичних параметрів сперміїв у відповідь на стимулюючий вплив.

Потрібно зазначити, що використання біостимуляторів по відношенню до сперміїв людини можливо здійснювати вже на етапах їх підготовки до заморожування аж до включення в склад кріозахисної середи. Дана перспектива, треба вважати, дозволить значно збільшити сумарний позитивний ефект біостимуляторів і збільшить шанси запліднення яйцеклітини. Комплексні дослідження по вивченню морфофункціональних властивостей репродуктивних клітин підданих глибокому заморожуванню в умовах їх стимуляції після відігріву можуть служити основою для створення високоефективних і простих в реалізації способів їх кріоконсервації для клінічної практики.

.. Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, які стосуються теми дисертації, відображають результати загального планування експериментів і підготовки матеріалів до друку.

Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки до роботи.

Випробування результатів дисертації Основні матеріали дисертаційної роботи докладалися і обговорювалися на Конференції молодих вчених ІПКіК НАН України (1999 p., Харків).

Публікації. По матеріалах дисертації опубліковано 4 роботи, 3 з яких в центральних фахових журналах, отринан один патент на винахід.

Об'єм і структура дисертації. Матеріали викладені на 139 сторінках друкарського тексту і містять: введення, огляд літератури (1 розділ), матеріали і методи досліджень (2 розділ), результати досліджень і їх обговорення (3 розділ), висновки. Матеріали дисертації проілюстровані 32 малюнками і 5 таблицями (37

сторінок). Список літератури складається з 186 джерел (20 сторінок), які включають 57 вітчизняних і 129 зарубіжних робіт.

ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна методика і основні методи дослідження. Якість сперми до і після заморожування визначали за допомогою мікроскопа МБй-10 із збільшенням Х400 шляхом аналізу характеру рухливості 100 клітин в кожній пробі і виражали в процентах жвавих кліток, рухомих прямолінійно, поступально. Вплив розчинів, що містять кофеїн і пентоксифілін на спермії визначали по фіксуванню максимальної рухливості гамет при варіюванні вмісту похідних метилксантинав суспензії клітин. Оптимальну робочу концентрацію розчинів кофеїну і пентоксифіліну по відношенню до сперміїв людини визначали шляхом оцінки їх рухливості після інкубації при 37°С в середовищі кріоконсерванта прн включенні в ного склад похідних метилксантина, що вивчаються. Кількість АТФ і креатинфосфату визначали ферментативним методом використовуючи глюкозо-6-фосфат дегідрогеназу, гексокіназу, креатинфосфокіназу на спектрофотометрі Shimadzu QV-50 (Японія) [Асатиани B.C. 1969].

Визначення концентрації фруктози і динаміки її утилізації сперміями проводили фотоколорииетрнчним методом в основі якого лежить реакція Селіванова на фруктозу з резорцином в кислому середовищі використовуючи прилад КФК-3 при 520 нм. Понадшвидке охолоджування зразків сперми, що заморожуються здійснювали за допомогою методу, розробленого співробітниками ІПКіК НАН України [Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко H.A., 1998]. Абсолютний показник живучості визначали за В.К. Міловановим [Малованов В.K., 1959]. Статистичну обробку результатів проводили по методу Стьюдента-Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив кофеїну і пентоксифіліну на кінетичну активність сперміїв людини до і після кріоконсервапії

Штучна стимуляція функціональної активності нативннх і кріоконсервованих сперміїв людини вимагає ретельного визначення ефективної концентрації біостннулятора в середовищі інкубації. У разі використання інгібіторів фос-фодіестерази цей аналіз ускладнений тією обставиною, що рухливість сперміїв починає змінюватися при наявності мінімальних доз метилксантннів в зразку.

У зв'язку з цим нами були поставлені експерименти, що стосуються вивчення зміни кінетичних характеристик сперміїв при їх інкубації в розчинах, що містять кофеїн і пентоксифіпін в широкому діапазоні нілімолярних концентрацій. Зокрема, нами було досліджено вплив вказаних похідних метилксантяна на рухливість нормальних і астенічних сперміїв після відтавання з метою виявлення можливого впливу процесу заиорожування-відігріва на цей інтегральний показник. Встановлено, що інкубація нативннх сперміїв людини до і після кріоконсервації протягом б годин в розчинах що містять кофеїн в концентрації від 2 до 12 мМ з кроком 2 мМ приводила до максимальної рухливості кліток при концентрації стимулятора 6 -8 мМ (рис 1).

80 * 60

I 40 І 20 <С о

& 80 ¡3 60

1_і Кофеїн 2 мМ 80 п 60 - О Кофеїн 4 мМ

і-і-І ■Л' Т- ■■. рЬ-ь -'Г г-ї-|

20 -

0 - і ^ ґ 1 Г -і Ґ ' і 0=1

0 і 2 4 5 6

Г^Т Г*1 иі ІСофсївбмМ

рІ-

1 и

0 2 з л 5 б

80

60

ґ*п □ Кофеїн 8 нМ

г-ї-к Г-ї-І

•! Д-1г-Г^

г ^ г 4 к.

-т-----т------

1 2 3 4 5 6

Час, год

Рис. 1 — Динаміка впливу кофеїну на рухливість нативннх сперміїв людини при нормоспермії; сірий колір - контроль.

о

о

Таким чином цитотокснчність кофеїну почала виявлятися при його виісті в середі більше за 8 мМ. Внаслідок проведених досліджень встановлено, що доцільним представляється використати для стимуляції сперміїв людини кофеїн в концентрації 7 ± 1 мМ.

Вплив ПФ на спермії людини до і після кріоконсервації була вивчена аналогічно і оцінювалася по характеру і тривалості рушення сперміїв. Встановлено, що ПФ в концентраціях 2-4 мМ не надає цитотоксичного ефекту на спермії людини при їх інкубації протягом 6 годин (рис 2).

§ 80 £ 60 І 40

І 20 IV о

- □ПФ2мМ -

-3“ ¿1

о і

* 80

о ПФ б мМ

Г І

0 1 2 3 4 5 6

Час, год

0 1 2 3 4 5 6

Час, год

Рис. 2 — Динаміка впливу пентоксифіліну на рухливість нативних сперміїв людини при нормоснермії; пряма лінія - контроль.

Збільшення вмісту ПФ в суспензії гамет вище за4 мМ спричиняло достовірне зниження рухливості і тривалості життя сперміїв в порівнянні з контролем. Аналіз результатів експериментів, в яких використовувався пентохсифілін показав, що при астеноспермії після відігріву спостерігалося достовірне збільшення кінетичної активності кліток при вмісті цього стимулятора в середовищі інкубації 2 мМ (рис 3).

Час, год Час, год

Рис. З — Динаміка виливу пентоксифіліну на рухливість заморожеио-відігргпц сперміїв люднви при астеноспермії

Внаслідок проведених досліджень встановлено, що доцільним представляється використати для стимуляції сперміїв людини пентоксифілін в концентрації 3 ± 1 мМ.

Концентрація АТФ і креатішфосфата в натнвиих і кріоконсервованих сперміях при наявності кофеїну і пентоксифіліну в середовищі інкубації

Порушення бар'єрної функції цитоплазматичної мембрани сперміїв людини є головним виявом ушкоджуючої дії заморожування-відігріва. Виникаючий при цьому вихід внутрішньоклітинних метаболитів у зовнішню середу є, на думку ряда авторів [Белоус А.М., Грищенко В.И. 1986, Bosman Е., du Toit D., 1994], вирішальним чинником по якому можна судити про збереження норфо-функціонального статусу клітин після кріоконсервації.

Основним джерелом енергії для поступального рушення сперміїв є АТФ. Загальний пул АТФ необхідний також для функціонування основних іонних градієнтів він є також субстратом для синтезу цАМФ. Таким чином досліджуючи вміст АТФ в сперміях можна судити про стан метаболізму цих кліток, порушення цілісності цитоплазматичних мембран, стійкість до процесів заморожування-відігріваі, в кінцевому результаті, про запліднюючу здатність.

Результати визначення АТФ при нормоспермії і астеноспермії представлені в таблиці 1. Як видно з даних таблиці, достовірно низький вміст АТФ при астеноспермії - 2,5 ± 0,7 нмоль/108 клітин, в порівнянні з нормою - 4,7 ± 0,64-нмоль/10* клітин, свідчить про можливе переваження ТІ розпаду над синтезом, або порушення здатності сперміїв синтезувати АТФ при цій патології. Після відігріву кліток достовірних змія концентрації АТФ для нормо- і астеноспермії в порівнянні з контрольними значеннями до заморожування, не виявлено. Цей результат свідчить про високе збереження цитоплазматичних мембран сперміїв людини, що перенесли кріоконсервування в умовах понадшвидкого охолоджування.

Таким чином; незважаючи на збільшення рухливості сперміїв, стимульованих із застосуванням похідних метилкеантина, вміст АТФ, в них залишається на постійному рівні. Наші дослідження показали, що вміст в сперміях креатянфосфату (КФ) в шість разів вище, ніж кількість АТФ. При астеноспермії, до заморожування, рівень креатинфосфата був нижчим і складав - 11,04 + 0,85 нмоль/Ю* кліток, що однак також перевищує вміст АТФ при цій патології. Після відігріва сперміїв, рівень КФ в них підвищувався, що на нашу думку пов'язано з активацією енергетичного обміну клітки для репараційних процесів після стресу. ;

Як показали експерименти, при астеноспермії, для якої характерне зниження біоенергетичних показників сперміїв, насамперед змінюється вміст КФ. Причому, після кріообробки і стимуляції сперміїв пентоксифіпіном, концентрація КФ в них була значно вище в порівнянні з клітками, що зазнали стимуляції без заиоро-жування-відігріва. Є основи вважати, що причиною змін в рухливості і вмісті мак-роергичних сполук є знижена базальна активність фосфодіестерази в клітинах при астеноспермії.

Таблиця 1

Вміст АТФ і креатинфосфята (нмоль /10* кліток) в сперміях людини до и після кріоконсервації з використанням похідних метиліссантнну в середовищі Інкубації (М± га, п=б)

Еякулят Стимулятор Нативна суспензія Кріоконсервована суспензія

АТФ КФ Рухливість, % АТФ КФ Рухливість, %

Нормоспер мія , контроль 4,7 ±0,6 28,8 ±0,6 52 ±4,0 4,0 ±0.3 30,9 ± 0,4і 47 ±3,0

б мМ кофеїн 4,7 ±0,7 33,3 ± 0,4 69 ±7,0 4,6 ±0,4 36,3 ± 0,5і 55 ± 4,0

3,5мМПФ 4,9 ±0,4 42,2 ± 0,3 70 ±9,0 4,7 ± 0,2 41,6 ±0,2 60 ±3,0

Астеноспер мія контроль 2,5 ± 0,72 11,0 ±0,82 36 ±5,0 2,1 ± 0.12 12,2 ±0,42 33 ± 2,0

6 мМ кофеїн 3,0±1,1г 13,9 ± 0,6 50 ±6,0 2,8 ± 0,32 17,6 ±1,1' 43 ± 5,0

3,5мМПФ 2,7 ± 0,9г 16,4 ± 0,3 53 ±3,0 2,7 ±0,12 23,1 ± 0,4і 57 ±6,0

Достовірність відмін по відношенню до: 1 - штивної суспензії кліток; 2 - контрольних значень при нормоспермії; р <

0.05.

и

Концентрація фруктоза в спсрмальпій рідині при інкубації сперміїв в нчннах які містять кофеїн і псіггокснфілін до і після заморожування

До теперішнього часу є достатній об'єм експериментальних даних, які ідчать про те, що в сперміях людини, кріо консервованих по загальноприйнятих :жинах заморожування, може порушуватися цілісність цитоплазматичної мем-іани, в зв'язку з чин знижується рівень енергетичного обміну, що в свою чергу іиводнть до зниження рухливості і запліднюючої здатності сперміїв і створює вві труднощі при їх клінічному використанні з лікувальною метою [Грищен-В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А.].

У ході досліджень гліколітичної функції сперміїв встановлено, що найбільше оживання фруктози нативними сперміями в нормі і при астеноспермії збувалося в перший час інкубації. Динаміка споживання фруктози протягом дру-го часу інкубації так само показала відсутність достовірних змін у швидкості зпаду фруктози для обох груп клітип. Такни чином для астеноспермії потрібно знати відсутність кореляції між низькою рухливістю клітин і вмістом фруктози в куляті.

Після кріоконсервування кількість фруктози в спермаяьній рідині достовірно змінилася, оскільки обмінні процеси в заморожених сперміях були відсутні, одк споживання П знизилося як в нормі, так і при астеноспермії. Внаслідок прове-них досліджень нами було визначено, що максимальний фруктоліз при інкубації ;рміІв в розчинах, що містять 6 мМ кофеїна спостерігався в нативних зразках при геноспермії в перший час інкубації і в нормоспермічннх зразках після відігріву, 5 у другий час інкубації. Досліджуючи споживання фруктози в присутності 3,5 М пентоксіфиліна ми знайшли, що ПФ підтримував утилізацію фруктози іоконсервованими сперміями протягом двох часів інкубації, на відміну від на-іних зразків, де до кінця другої години він знижувався до рівня відповідного уктолізу клітинами до стимуляції (рис. 5,6).

□ Контроль ІЗ Кофеїн 6 мМ

□ Контроль |-| 0ПФЗ,5ыМ

□ Контроль ШШФ3.5 ыМ

Час, год

Час, год

Рис. 5 — Вплив кофеїну і пентокснфіліну ва швидкість розпаду фруктози на-тнвнимн сперміями людини при нормоспермії (А) і асгеноснермП (Б)

100

80

60

40

20

0

□ Контроль ИКофсінбмМ

□ Коїпроль

А ВПФЗ,5мМ

ЯЖкгїІй

ші _г-~

> и^ЧгЯ'ІУт II жіззікн І Й

Час, год

□ Коїпроль Ш Кофан б мМ

Час, год

Рис. б — Вплив кофеїну і пентокснфіліну ва швидкість розпаду фруктози кріоконсервоааннмн сперміями людини при нормоспермії (А) і астенос-пермії (Б)

висновки

У дисертації наведен новий підхід до кріоконсервації сперміїв люднни в умовах понадшвндкого охолодження з застосуванням нохіднях метилксантина в якості стимуляторів біохімічних процесів на етапі відігріва клітин. Після заморожування сперміїв з швидкостями біля 3000 °С/хвл, коли виникаючі морфофункціональні порушення мінімальні, додавая похідні нетилксаптина після відігріву дає змогу змінюючи функціональний стан біоенергетики підвищ іти рухливість сперміїв, що сприяє запліднюючед здатності гамет.

1. Спермії людини кріоконсервовані з використанням режиму надвисоких (біля 3000 °С/хв) швидкостей охолоджування не змінюються морфологічно і практично не втрачають функціональної активності, що вказує на збереження мембранних структур і ключових біохімічних процесів.

2. Отримані в роботі результати показують доцільність застосування режиму надвисоких швидкостей охолоджування для кріоконсервації сперми людини і використання похідних метілксантина для реабілітації відігрітих астенічних і нормальних сперміїв.

3. Встановлені мінімальні рівні концентрацій інгібіторів цАМФ-фосфодіестерази - кофеїну (7 ± 1 мМ) і пептоксафіліну (3 ± 1 мМ), при яких ці речовини надають максимальний стимулюючий ефект на функціональну активність нативних сперміїв люднни.

4. Встановлено, що для стимуляції відігрітих сперміїв мінімальна концентрація пентокснфіліну може бути знижена в два рази в порівнянні з тією, що визначена для нативних кліток.

5. Показано зростання кількості креатинфосфату в сперміях при доданні похідних метілксантина на фоні стабільної кількості АТФ при нормо- і астеноспермії.

6. Похідні метілксантина підвищують швидкість утилізації фруктози астенічними сперміями до рівня номоспермії і збільшують швидкість утилізації фруктози нормальними сперміями.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Лучко Н. А., Кучков И. Н. Влияние производных метилксантина на некоторые биоэнергетические параметры спермиев человека до н после криоконсервации// Пробл. Криобиол. - 1998. - № 4. - С. 48-53.

2. Лучко Н А, Кучков И.Н. Влияние кофеина и пентоксифнллина на гликолитиче-скую функцию спермиев человека, криоконсервированных в условиях сверхбыстрых скоростей охлаждения//Пробл. Криобиол. - 1999 - № 4. - С. 8-13.

3. Грищенко В.И., Чуб Н.Н., Крамар М.И., Терпячая И.В., Тодоров П.Т., Черепано-ваТ.А., Кучков И.Н. Морфофункциональные характеристики спермиев человека, хранившихся при низких положительных температурах// Пробл. Криобиол. -1998 - № 4. - С. 63-64.

4. Патент № 98126350 Украяна, МПК 6 А61К31/52, АОШ1/02 Спосіб підвищення рухливості сперміїв людини / Лучко Н.А., Грищенко В.И., Кучков И.Н., Калугин Ю.В. Інститут Проблем Кріобіології і Кріонедицини НАИ України, Заявлено 01.12.1998. - Решение о выдаче патента 12.11.99

АННОТАЩЯ

Кучков І.М. «Функціональні і біохімічні характеристики сперміїв людини при кріоконсервації в умовах понадшвидкого охолодження». - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріонедицини НАН України, Харків 2000.

Дисертація присвячена вивченню вплива надвисоких (біля 3000 °С/хвл) швидкостей охолоджування сперміїв людини на стан фруктоліза, вміст АТФ і креа-тинфосфата, а так само рухливість сперміїв при наявності кофеїну і пентоксифіліна в середовищі інкубації. Отримані в роботі результати дозволяють зробити висновок про те, що стан фруктоліза, атак само вміст АТФ і креатинфосфата в сперміях

до і після хріоконсервації знаходиться на високому рівні про що свідчить здатність сперміїв відповідати на стимулюючу дію иетнлксантннів. ’

Ключові слова: рухливість сперміїв, понадшвидке охолоджування, АТФ, креатинфосфат, кофеїн, пентоксифілін.

АННОТАЦИЯ

Кучков И.Н. «Функциональные и биохимические характеристики спермнев человека при криоконсервировании в условиях сверхбыстрого охлаждения» - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков 2000.

Сперыни являются унихалыюй моделью для изучения процессов криоповреждения и криозащиты, так как любые нарушения, вызванные действием химических факторов или понижением температуры, влекут за собой изменение их основных функций. Такая высокая чувствительность к изменяющимся условиям среды (осмотическое давление, pH, температурный шок), в сочетании с легкостью наблюдения и фиксации происходящих изменений, сделало спермин классическим обьектон криобиологических исследований.

Диссертация посвящена изучению влияния сверхбыстрых (около

3000 °С /мин) скоростей охлаждения спермиев человека на состояние фруктолиза в них, содержание АТФ и креатинфосфата, атак же подвижность гамет при наличии кофеина и пентоксифнллина в среде инкубации. Объектом исследования служили спермин и эякулят полученные от доноров при нормоспермии и астеноспермни.

В нашей работе для криоконсервации спермы был применён щадящий метод сверхбыстрого замораживания. Кроне того, для реабилитации использовали биологически-яктивные химические соединения из ряда метилксантинов,

способные, по данным литературы, увеличивать естественный уровень

энергетического метаболизма большинства видов клеток животных. Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о той, что искусственная стимуляция

функциональной активности даже нативных сперматозоидов требует тщательного определения эффективной концентрации биостимуляторов в среде инкубации.

Реакцию сперннев на холодовый стресс нам удалось зафиксировать только по данным содержания креатннфосфата, содержание которого достоверно возрастало как при нормоспермии, так и при астеносперннн. Следовательно, процесс замораживания-отогрева приводит к некоторой мобилизации биоэнергетических процессов в спермнях, что выражается в увеличении синтеза АТФ и накоплении в сперыиях креатннфосфата. Наши исследования показали, что эффект стимулирования активности сперинев ингибиторами цАМФ-фосфодиэстеразы проявляется как в норме, так и при патологии сперматогенеза Изучение закономерностей стимулирующего действия метилксантинов на активность сперинев до н после криоконсервации позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что астенические спермин, возможно, обладают изначально повышенной базальной активностью цАМФ-фосфодиэстеразы. Это предположение основывается ва полученных данных о повышении содержания макроэргических фосфатов и кинетической активности спермиев до уровня этих показателей в нативных клетках при инкубации с ингибиторами цАМФ-фосфодиэстеразы.

Содержание фруктозы в семенной плазме при нормоспермии составляло в среднем 300 »1%, что почти на треть превышало ее содержание в плазме при астеноспермни (210 мг%). Высокая скорость утилизации фруктозы в течение первого часа была отмечена нами также при использовании 3,5 мМ пентоксифиллнна для стимуляции сцермиев как при нормо- так и при астепоспермии. В течение второго часа инкубации гамет с ПФ только у нормальных спермнев продолжала расти скорость утилизации фруктозы, в то время как у астенических спермиев наблюдалось её уменьшение. Проведенная нами оценка динамики скорости утилизации фруктозы спермияни до и после криоконсервации показала, что потребление этого моносахарида после отогрева снизилось как при норцо- так и при астеноспермни. Кофеин и пентоксифиллин увеличивали интенсивность фруктолизав спермиях после отогрева до уровня нативных гамет, а в некоторых случаях и выше этого уровня. После отогрева замороженных клеток

мы наблюдали в них отличную от нативных образцов динамику скорости утилизации фруктозы. В частности, при добавлении ПФ и кофеина у нативных спермиев увеличение распада этого сахара в течение первого и второго часа инкубации, было достоверно выше, чем у крноконсервированных сперниев, причём отогретые спермин сохраняли высокую скорость утилизации фруктозы только при добавлении кофеина. Для суспензия спермиев, инкубированных с 3,5 нМ пентоксифнлляна, интенсивность скорости потребления фруктозы не снижалась на протяжении двух часов.

Ключевые слова: подвижность спермиев, сверхбыстрое охлаждение, АТФ, креатинфосфат, кофеин, пентоксифиллин.

SUMMARY

Kuchkov I.N. «Functional and biochemical characteristics of human sperm on their cryopreservation under the superfast cooling». - Manuscript.

The thesis for scientific degree of a candidate’s biological sciences on speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2000.

The thesis is devoted to the study of influence of superfast (3000 K/min) cooling speeds on human sperm fructolysis, ATP and creatine phosphate content, and sperm motility under caffeine and pentoxifylline presence in the incubation medium. The results obtained allow to suggest that, fructolysis rate and ATP and creatine phosphate content in sperm before and after cryopreservation are on the high level which is testified by the ability of the sperm to answer the stimulation by methylxantines.

Key words: sperm motility, superfast cooling, ATP, creatine phosphate, caffeine, pentoxifylline.