Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональное состояние системы и терморегуляции в условиях действия ингибиторов протеиназ альфа 4-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние системы и терморегуляции в условиях действия ингибиторов протеиназ альфа 4-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ ПАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

РГб од

»

УДК 612.55 : 577.151.03.042 СЕН 7!1П!Т ' *

САНДАКОВ Дмитрий Борисович

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ «1 -АНТИТРИПСИНА И а2-МЛКРОГЛОЬУЛШ1Л

^ 03.00.13 - Физиология человека ч животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск, 2000

Работа, выполнена е Институте физиологии НАН Беларуси

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Оппонирующая организация:

кандидат оиологических наук, Гурии А.В.

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент НАМ Беларуси Кульчицкий 1}.А.

' доктор медицинских наук, профессор Висмокт Ф.Н.

кандидат биологических наук, Буланова К.Я.

Институт биомсдицинской химии Российской акадеглйи медицинских наук (Москва, Россия) }

Защита состоится «¿5 » цюиЯ-_ 2000 г. в 15~ часов на заседании совета

-по защите диссертаций Д 01.36.01. при Институте физиологии НАН Беларуси (220072, Минск, ул. Академическая, 28, тел. 284-28-79).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии ПАН Беларуси.

Автореферат разослан «<?3 » _2000 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат биологических наук

© Институт физиологии НАГ: Беларуси, 2000

ем /¿¿у я

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Функциональная система терморегуляции представляет собой совокупность эффекторов теплопродукции, теплоотдачи и нейрогуморальных механизмов, обеспечивающих их координированную деятельность [Анохин, 1968, 1970; Гурии, 1980, 1993]. Выяснение особенностей работы этой системы в различных условиях является важной задачей физиологии, поскольку открывает перспективы поиска средств фармакологической коррекции температурного гомеостаза организма. К настоящему времени достигнуты существенные успехи в изучении механизмов терморегуляции в условиях высоких и низких температур; выяснена роль в этих процессах отдельных нейромедиаторов [Зефиров и др., 1974; Гурии, 1980, 1993; Stitt, 1986; Gourine, 1995; Gerstherger, 1999], нейропептидов [Clark et al, 1983; Lipton et al, 1986]. Особое внимание исследователей привлекают механизмы развития гипертермии при действии пирогенов, поскольку данная проблема имеет важное значение для клиники. Важным результатом этого направления исследований явилось выяснение роли интерлейкина-lß, интерлейкина-6, фактора некроза опухолей [Гурин, 1993; Dinarello, 1991; Kluger, 1991], кининов [Katori et al., 1989; Vandekerchkove, 1991; Ferreira et al., 1993] и протеолитических ферментов [Висмонт, 1989, 1990] в нейрогуморальных механизмах регуляции температуры тела в условиях действия в организме пирогенных веществ. Развивается представление о роли в этих механизмах ингибиторов протеиназ [Висмонт, 1999].

В течение последних десятилетий накоплен обширный экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что ингибиторы сериновых протеиназ, вырабатывающиеся в печени, могут оказывать выраженное влияние на биохимические процессы, вовлеченные в регуляцию системных функций организма. Показано, что такие ингибиторы, как агантитрипсин и сс2-макроглобулин, обладают способностью тормозить активность протеолитических ферментов, участвующих в процессах продукции и инактивации цитокинов, кининов [Nierhorster et al., 1990; Nortier et al, 1991; Tilg et al., 1993]. Предполагается, что ссг-макроглобулин является белком-протектором, который защищает ИЛ-б и другие цитокины от протеолитической инактивации [Matsuda et al, 1989; Kurdowska et al, 1997]. Имеются сведения о том, что эффекты ингибиторов протеолиза могут реализовываться и рецепторным путем — в последние годы обнаружено несколько типов клеточных рецепторов к комплексам арантитрипсин-фермент [Perlmutter et al, 1990; Joslin, 1992] или а2-макроглобулин-фермент [Seo et al, 1997; Misra et al, 1998]. Вероятно, ингибиторы протеиназ имеют особое значение для формирования терморегуляторных реакций организма на пирогенные вещества, поскольку показано, что в этих условиях происходит существенное повышение концентрации некоторых из них в крови [Schreiber et al, 1989; Patterson, 1991] и головном мозге [Hignchi et al., 1994; Li et al., 1994]. Обилие фактического материала о действии ингибиторов сериновых протеиназ на биохимические

процессы лишь подчеркивает важность исследования их влияния на терморегуляцию и другие физиологические функции. Изучение влияния ингибиторов сериновых протеиназ на температуру тела позволило бы получить данные, важные для понимания роли этих ингибиторов в механизмах регуляции температуры тела и других системных функций организма, а также определить пути создания новых средств фармакологического контроля температурного гомеостаза.

Связь работы с научными программами, темами. Диссертация является одним из разделов плана научно-исследовательских работ Института физиологии HAH Беларуси по теме «Изучение взаимодействия возбуждающих и тормозных механизмов в центрах терморегуляции, периферических нервных и гормональных процессов в разных температурных условиях и при лихорадке» (регистр. Лг° 1996426). Некоторые разделы диссертации выполнялись в рамках гранта Национального института здоровья США «Role of protease inhibitors in lipopolysaccharide-induced fever» («Роль ингибиторов протеолиза в механизмах эндотоксиновой лихорадки») (регистр. № 1 R03 TW00992-01).

Цель исследования. Целью ¡ настоящей работы явилась экспериментальная проверка гипотезы, согласно которой ингибиторы сериновых протеиназ сц-антитрипсин и аг-макроглобулин оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции.

Задачи исследования.

1. Выяснить особенности изменений температуры тела у мышей и крыс в термонейтральных условиях после введения в организм ссрантитрипсина и <Х2-макроглобулина.

2. Исследовать влияние а2-макроглобулина, введенного внутривенно, на изменения температуры тела мышей, вызываемые действием в организме эндотоксина.

3. Изучить влияние осрантитрипсина и аг-макроглобулина, введенных в кровоток, на активность интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей в крови у мышей.

4. Изучить влияние агантитрипсина и аг-макроглобулина на продукцию интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей мононуклеарными клетками крови in vitro.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования служили взрослые самцы белых крыс и мышей линии Свисс-Вебстер, кролики обоего пола, мононуклеарные клетки крови крыс. Предметом исследования явились температура тела, потребление пищи и двигательная активность животных, а также активность цитокинов интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей в

крови у мышей, уровень продукции этих цитокинов культивируемыми мононуклеарнымн клетками крови.

Гипотеза. Ингибиторы сериновых протеиназ ai-антитрипсин и аг-макроглобулин оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции. Посредниками такого влияния могут служить цитокины интерлейкин-6 и фактор некроза опухолей.

Методология и методы исследования. В работе изучали влияние СС|-антитрипсина и аг-макроглобулина на температуру тела и поведение животных в термонейтральных условиях, а также влияние а2-макроглобулина на выраженность терморегуляторкых реакций, вызываемых действием в организме пирогенов. Изучаемые ингибиторы вводили внутривенно или в боковой желудочек головного мозга. Регистрацию глубокой температуры тела у крыс и мышей осуществляли при помощи биотелеметрической установки, позволяющей измерять глубокую температуру тела у неиммобилизованных животных. Параллельно с регистрацией температуры тела проводили измерение двигательной активности и потребления пищи. Полученные результаты сопоставляли с данными об изменении активности цитокинов интерлейкина-б и фактора некроза опухолей в крови после введения ингибиторов сериновых протеиназ. Влияние ar антитрипсина и аг-макроглобулина на продукцию этих цитокинов мононуклеарнымн клетками крови изучали in vitro.

Научная новизна и значимость полученных результатов. В настоящей работе впервые охарактеризовано влияние ингибиторов сериновых протеиназ a 1 -антитрипсина и о^-макроглобулина на температурный гомеостаз у разных видов млекопитающих в термонейтральных условиях. Показана способность этих ингибиторов вызывать гипертермическую реакцию как при внутривенном введении, так и при введении в желудочки мозга.

Установлено, что вызываемая ингибиторами сериновых протеиназ гипертермия не сопровождается развитием комплекса поведенческих реа*т,ий (снижение локомоторной активности, угнетение потребления пищи), характерных для действия эндотоксина.

В работе впервые показано влияние а2-макроглобулина на выраженность терморегуляторных реакций организма на пирогены. Показано, что внутривенное введение аг-макроглобулина ослабляет изменения температуры тела, вызываемые эндотоксином (гипертермия) или интерлейкином-1(3 (гипотермия).

Впервые продемонстрировано, что введение в кровоток аг-макроглобулина или ai-антитрипсина приводит к значительному повышению в крови активности цитокинов интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей.

В опытах in vitro выявлено, что ai-ангитрипсин и а2-макроглобулин в физиологических концентрациях усиливают продукцию цитокинов интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей мононуклеарными клетками крови.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют и дополняют существующие представления о механизмах температурного гомеостаза и закономерностях развития терморегуляторных реакций организма на пирогенные вещества.

Результаты работы открывают перспективы изыскания новых средств и способов фармакологической коррекции системных функций организма при состояниях, связанных с действием пирогенов: бактериальной инфекции, эндотоксемии.

Результаты работы имеют прикладное значение также в связи с практическим использованием ингибиторов протеолиза животного происхождения. Полученные данные о влиянии ингибиторов протеолиза на вегетативные функции организма и на продукцию цитокинов следует учитывать при анализе эффектов фармакологических средств, действующих как ингибиторы протеолиза или влияющих на содержание ингибиторов протеиназ в организме. .

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Ингибиторы протеиназ арангитрипсин и аг-макроглобулин оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции, что проявляется в термонейтральных условиях повышением температуры тела в ответ на введение в организм этих ингибиторов.

2. Ингибитор протеиназ а2-макроглобулин ослабляет выраженность гипертермической реакции, вызываемой действием в организме эндотоксина.

3. Ингибиторы сериновых протеиназ ai-антитрипсин и ar макроглобулин модулируют активность цитокинов интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей в крови и стимулируют продукцию этих цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro.

Личный вклад соискателя. Основные экспериментальные данные, включенные в настоящую работу, получены непосредственно автором. Эксперименты по изучению влияния ингибиторов сериновых протеиназ на содержание цитокинов в плазме крови у мышей проведены совместно с научным руководителем и сотрудниками лаборатории термофизиологии НИИ дыхания (г. Альбукерке, США). В диссертации не были использованы результаты исследований соавторов совместных публикаций. Научный руководитель и научный консультант участвовали в определении целей и задач исследования, а также в обсуждении и оценке полученных результатов.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены и обсуждены на заседании лаборатории физиологии функциональных систем Института физиологии НАНБ (Минск, 1998), заседании лаборатории термофизиоло:ии (НИИ дыхания, г. Альбукерке, США, 3998), коллоквиуме "Sinnesbiologie" (Биологический институт при Университете им. А.Гумбольдта, Берлин, Германия, 1997), заседании Минского отделения Белорусского физиологического общества (Минск, 1999), заседании Британского физиологического общества (Лидс, Великобритания, 1996), международных симпозиумах "Thermoregulation and temperature adaptation" (Минск, 1995), "Temperature control in health and disease" (Минск, 1996), "Recent advances in thermal biology" {Минск, 1999), "Pharmacology of thermoregulation" (Севилья, Испания, 1999), научной конференции "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1999).

Опубликоваиность результатов. Результаты диссертации изложены в 9 печатных работах, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях. Из них 2 статьи в журналах, 5 - в сборниках, 2 тезисов научных конференций. Общее количество страниц - 41,7.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста (исключая иллюстрации, таблицы, приложения и список использованных источников - 61 стр.) и состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав, содержащих изложение результатов исследования, обсуждения, заключения и списка литературы, включающего 318 источников (37 на русском и 281 на иностранных языках), иллюстрирована 21 рисунком, содержит 3 таблицы и 7 приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования

Опыты выполнены на 180 мышах-самцах линии Свисс-Вебстер (массой 3040 г), 80 белых крысах-самцах (массой 200-250 г) и 12 беспородных кроликах обоего пола (массой 2,5-3,5 кг). Белые крысы и кролики выращены в виварии Института физиологии НАН Беларуси, мыши поступили из питомника Taconic Farms Inc. (США).

Все эксперименты проводили в специально оборудованном помещении с постоянной температурой воздуха (30+1 °С для мышей, 26±1 °С для крыс и 22±1 °С для кроликов), постоянным вентиляционным и световым режимом (12 часов день, 12 часов ночь). Животные получали полноценный пищевой рацион в соответствии с нормами питания лабораторных животных.

Регистрацию температуры тела у крыс осуществляли при помощи биотелеметрической установки «MiniMitter» (США), подсоединенной к компьютеру. За 10 дней до эксперимента животным имплантировали в брюшную полость температурный датчик. Электрическая схема датчика постоянно генерирует электромагнитные импульсы, частота которых изменяется при колебаниях температуры чувствительного элемента датчика. Крысу с имплантированным датчиком помещали в стандартную индивидуальную клетку, которую устанавливали на приемник сигналов, передающий поступающую информацию в компьютер. Установка обеспечивает измерение температуры тела с точностью ±0,1 °С, а также регистрацию двигательной активности животных. Температуру тела у кроликов измеряли при помощи электротермометра ТПЭМ-1 в прямой кишке на глубине 6 см. Интенсивность теплоотдачи оценивали по общепринятой методике -измерению температуры кожи ушной раковины у кроликов или кожи основания хвоста у крыс.

Пищевое поведение крыс и мышей оценивали по изменению массы тела и количеству потребленной пищи. Для изучения исследовательского поведения крыс применяли стандартный тест «открытое поле» [Коплик и др., 1995; Walsh et al„ 1976]. -1

Перегревание крыс осуществляли в;термокамере при 37,0±0,5 °С в течение 180 мин, а охлаждение - в емкости с водой при температуре 25±1 °С в течении 30 минут. Эндотоксин (липополисахарид) Escherichia coli (Sigma, L2630) вводили мышам внутрибрюшинно, ot]-антитрипсин (аАТ) (Sigma, А6150), а2-макроглобулин (аМГ) (Sigma, Мб 159) и интерлейкин (ИЛ-1(3) (Immunex) - в боковую вену хвоста.

Для осуществления внутрижелудочкового введения ингибиторов сериновых протенназ (СП) крысам не позднее чем за 3 дня до эксперимента имплантировали направляющую канюлю (длина 8 мм, наружный диаметр 0,8 мм) по координатам Р1,0 Ll,5 Н2,5 (атлас Paxinos & Watson, 1986). Инъекцию осуществляли при помощи системы, состоящей из микрошприца "Hamilton" (25 мкл), соединенного через гибкий катетер с инъекционной канюлей (длина 9 мм, наружный диаметр 0,5 мм). Крысам препараты вводили в объеме 5 мкл, скорость введения - не более 1 мкл/10 с. Кроликам в желудочки мозга препараты вводили аналогичным способом в объеме 10 мкл, с той же скоростью.

Для выделения мононуклеарных клеток крови (МКК) использовали гепаринизированную кровь крыс, которую разбавляли 1:2 фосфатным буфером и центрифугировали в градиенте фикола в течение 20 мин при 2800 об/мин. Отбирали фракцию, содержащую МКК, трижды промывали полученные клетки в фосфатном буфере и ресуспензировали их в среде RPMI-1640 из расчета 2x106 клеток/мл.

Среду, содержащую МКК, разливали в лунки объемом 3 мл (24-луночная планшетка) из расчета 0,5 мл среды (1x106 клеток) в лунку, немедленно добавляли 450 мкл среды, содержащей различные концентрации ингибиторов

протсолиза. Через 1 час вносили 50 мкл среды, содержащей 1 мкг эндотоксина или 50 мкл чистой среды (контроль). Чашки помещали на 24 часа в термостат при температуре 37 °С, содержании СО2 5%, влажности 98%. После 24 часов инкубации среду, содержащую МКК, центрифугировали для отделения клеток, замораживали и хранили при температуре -20 СС.

Определение активности интерлсйкина-б (ИЛ-6) и фактора некроза опухолей (Ф110) проводили по общепринятой методике [Klir et al., 1993; Liao et al., 1995]. Для определения активности ФИО образцы плазмы (культуральной жидкости) разбавляли средой RPMI-1640 (содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глута.мина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). После разведения плазму вносили в трех повторах в 96-луночные плоскодонные планшеты в количестве 100 мкл/лунку. В каждую лунку добавляли 100 мкл суспензии клеток линии WEHI 164 (субклон 13), взвешенных в среде RPMI-1640, дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (1%), L-глутамнном (2 мМ), пенициллином (100 ед/мл), стрептомицином (100 мкг/мл), из расчета 50х104 клеток/мл. Инкубирование проводили в течение 18-20 часов при температуре 37 °С, влажности 9Ь%, в атмосфере, содержащей 5% СО2, после чего в каждую лунку добавляли 20 мкл 3-(4,5-диметнлтиазол)-2,5-дифенилтстразолиум бромида (5 мг/мл). Через 4 часа отбирали из каждой лунки 150 мл супернатанта и добавляли 100 мкл 10% раствора дуодецилсульфата натрия в 0,01н НС1. Планшеты оставляли на ночь при комнатной температуре. Оптическую плотность образцов определяли при длине волны 570 нм (опорная длина волны бЗОнм).

Для определения активности ИЛ-6 использовали ИЛ-б-зависимую клеточную линию В9. Образцы плазмы разбавляли средой IMDM (содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Разведения плазмы вносили в трех повторах в 96-луночные плоскодонные планшеты в количестве 100 мкл/лунку. Клетки В9 взвешивали в среде, дополненной гепарином (10 ед/мл), из расчета 5x104 клеток/мл, в каждую лунку вносили 100 мкл клеточной суспензии. Планшеты инкубировали 64-68 часов при температуре 37 °С, влажности 98%, в атмосфере, содержащей 5% СОг- Затем добавляли в каждую лунку 20 мкл 3-(4,5-диметилтиазол)-2,5-дифенилтетразолиум бромида (5 мг/мл). Через 4 часа инкубации отбирали из каждой лунки 150 мл супернатанта и добавляли 100 мкл 10% раствора дуодецилсульфата натрия в 0,01н НС1. Планшеты оставляли на ночь при комнатной температуре. Образцы фотометрировали при длине волны 570 нм (опорная длина волны бЗОнм).

Полученные данные обрабатывали с использованием общепринятых методов вариационной статистики при помощи программы Microsoft Excel 97. Достоверность различий между сериями определяли с помощью i-тсста Стыодента.

Влияние ингибиторов серииовых протенназ аАТ и аМГ на процессы терморегуляции н поведение животных в термонейтральиых условиях

Опыты на мышах показали, что введение в кровоток аАТ или аМГ приводит к развитию непродолжительной гипертермии. Через 2 часа после внутривенной инъекции аАТ в дозе 5 мг/кг и 25 мг/кг температура тела животных повышалась на 0,51 °С (Р<0,05) и 0,58 °С (Р<0,05), соответственно. Внутривенное введение мышам другого ингибитора протеолиза, аМГ, в дозе 25 мг/кг сопровождалось повышением температуры тела через 2 и 4 часа на 0,57 °С (Р<0,05) и 0,76 °С (Р<0,01), соответственно (рис. 1). После введения в кровоток аАТ и аМГ в меньших дозах изменений температуры тела у мышей не отмечалось. Внутривенная инъекция мышам гетерологичного белка (^в овцы) в дозе 25 мг/кг не приводила к измененшо температуры тела животных.

-0,20

аАТ(5 мг/кг) аАТ (25 мг/кг) аМГ(5мг/кг) аМГ (25 мг/кг)

Рис. 1. Изменение температуры тела у мышей (по отношению к контролю) после внутривенного введения схАТ или аМГ в дозе 5 и 25 мг/кг. *, ** - изменение температуры тела достоверно по отношению к контролю (введение физиологического раствора), Р<0,05 и Р<0,01, соответственно.

Согласно данным литературы при действии в организме чужеродных веществ отмечается повышение уровня ингибиторов СП не только в крови, но и в головном мозге \Gutteberg е/ а1, 1986; Н'щисЫ е? а1., 1994; Рагас1ошк1 е( а1, 1995]. В связи с этим представляло интерес изучить изменения температуры тела животных, наступающие после введения ингибиторов протеиназ в желудочки головного мозга.

Эксперименты показали, что у крыс инъекция в боковой желудочек мозга аАТ в дозе 10 и 100 мкг сопровождалась повышением температуры тела, которое спустя 4 часа составило 1,13 °С (Р<0,00'1) и 1,83 °С (Р<0,001), соответственно. Возвращение температуры тела к исходному уровню отмечалось не ранее чем спустя 8 часов после введения препарата. В отдельной

серии экспериментов было показано повышение систолического АД на 11,2 % (Р<0,05) и 18,9% (Р0,05) через 60 и 90 мин после внутрижелудочкового введение схАТ в дозе 100 мкг.

Известно, что у мелких млекопитающих (крысы, мыши) доминирующими являются процессы «химической» терморегуляции, в то время как у более крупных животных (кролики, собаки) поддержание температурного гомеостаза происходит преимущественно за счет сосудистых реакций - т.н. «физической» терморегуляции [McEwen et al., 1973; Gordon, 1990]. Представляло интерес выяснить, какое влияние будет оказывать аАТ на температуру тела у животных с преобладанием физической терморегуляции.

Опыты показали, что у кроликов введение в боковой желудочек мозга аАТ приводит к развитию гипертермической реакции, сходной с таковой у крыс. Так, через 4 ч после внутрижелудочковой инъекции аАТ в дозе 10 и 100 мкг подъем температуры тела составил, соответственно, 1,05 °С (Р<0,01) и 1,19 °С (Р<0,001). Повышение температуры тела сопровождалось выраженной вазоконстрнкцией сосудов кожи уха в фазу подъема температуры тела, о чем свидетельствовало снижение температуры кожи уха на 1,63 °С и 4,53 °С (Р<0,01) через 1 ч после внутрижелудочкового введения аАТ в дозах 10 и '00 мкг, соответственно.

Повышение температуры тела в условиях действия в организме пирогепов обычно сопровождается стереотипным комплексом поведенческих реак.дш, который включает ограничение двигательной активности и количества потребляемой пищи, угнетение исследовательского поведения [Hart, 1938; Dantzer et al,, 1998]. Представляло интерес выяснить, развиваются ли соответствующие поведенческие реакции в условиях действия ингибиторов СП.

Опыты показали, что внутривенное введение мышам аАТ или аМГ в дозах 5 и 25 мг/кг не сопровождается достоверными изменениями двигательной активности животных. Количество потребляемой пищи и масса тела животных в течение 24 часов после введения в кровоток аАТ в дозах 5 и 25 мг/кг или аМГ в дозе 5 мг/кг не отличались от таковых у контрольных животных. Внутривенная инъекция мышам аМГ в дозе 25 мг/кг сопровождалась снижением суточного потребления пищи на 0,6 г (Р<0,05).

Анализ поведения животных в тесте «открытое поле» показал, что на 3-м часу гипертермии, вызванной эндотоксином (100 мкг/кг, внутрибрюшинно), у крыс отмечается снижение двигательной активности на 68,0% (Р<0,001), количества вертикальных стоек -на 88,1 % (Р<0,01), посещаемости средних и центральных секторов поля - на 79,9 % (Р<0,01) и 98,4 % (Р<0,05) по отношению к контролю. После внутрижелудочкового введения аАТ в доз:; 100 мкг статистически достоверных изменений указанных показателей не отмечалось. Согласно существующим критериям [Маркель, 1981; Котик и др., 1995; Walsh et al., 1976] полученные данные свидетельствуют об угнетении исследовательского поведения животных в условиях действия эндотоксина, но не аАТ.

Представленные данные свидетельствуют о том, что ингибиторы СП аАТ и аМГ оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции. Повышение в организме количества ингибиторов сериновых протеиназ (в результате их внутривенного или внутрижелудочкового введения) проявляется в термонейтральных условиях повышением температуры тела у разных видов млекопитающих. Особенностью ответной реакции организма на действие изученных ингибиторов является то, что они не вызывают развития комплекса поведенческих реакций, характерного для действия эндотоксина. Учитывая данные литературы о повышении уровня ингибиторов протеиназ в крови в условиях действия в организме пирогенов [Schreiber et al., 1989; Patterson, 1991], можно предполагать, что ингибиторы протеиназ оказывают влияние на формирование терморегуляторных реакции на пирогенные вещества.

Влияние ингибиторов сериновых протеиназ аАТ и аМГ на изменения температуры тела, вызываемые эндотоксином, высокой или низком окружающей температурой

Анализ данных литературы показывает, что среди известных ингибиторов СП аМГ является наиболее вероятным кандидатом на роль модулятора терморегуляторных реакций организма, развивающихся при действии в организме пирогенных веществ. Так, известно, что аМГ является белком-переносчиком цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-б, ФНО [Matsuda Т., et al., 1989; Kurdowska А., et al, 1997]; показано влияние аМГ на развитие септического шока [Van Vugt Н„ et al, 1986; Khan M., et al, 1994 Kambara Т., et al, 1995]. В связи с этим в опытах по изучению влияния ингибиторов СП на изменения температуры тела, вызываемые эндотоксином, был использован аМГ. Для адекватного анализа результатов во всех экспериментах с совместным введением аМГ и эндотоксина (или интерлейкина) аМГ вводили в такой дозе (5 мг/кг), которая сама по себе не оказывает влияния на температуру тела, двигательную активность и потребление пищи у мышей.

Опыты на мышах показали, что предварительное (за 1 мин) введение в кровоток аМГ в дозе 5 мг/кг практически полностью устраняет повышение температуры тела, вызываемое эндотоксином (100 мкг/кг, внутрибрюшинно). Максимальный подъем температуры тела через 245 мин после инъекции эндотоксина составил 0,95 °С по сравнению с контролем (Р<0,01). После совместного введения аМГ и эндотоксина повышение температуры тела к этому времени составило 0,24 °С по отношению к контролю и не было статистически достоверным (рис. 2а).

Из литературы известно, что изменение температуры тела в ответ на введение чужеродных веществ опосредуется через усиление продукции эндогенных пирогенов, главным из которых является ИЛ-lß. Представляло

интерес выяснить, будет ли аМГ оказывать влияние на терморегуляторные реакции организма в ответ на введение ИЛ-1р.

Опыты показали, что через 90 мин после внутривенного введения мышам ИЛ-1Р в дозе 25 мкг/кг температура тела животных снижалась на 2,03 °С. При одновременном введении в кровоток ИЛ-1 р и аМГ в дозе 5 мг/кг падение температуры тела было на 42,3% меньше (Р<0,05) и составило 1,17 °С (рис. 26).

36,0 1-111111-1->-1 1 I

-2 -1 0123456789

Время от момента введения (часы)

-3 -2 -1 0123456789 Время от момента введения (часы)

Рис. 2. Влияние аМГ (5 мг/кг, внутривенно) на изменение температуры тела у мышей, вызываемое эндотоксином (100 мкг/кг, внутрибрюшинно) или ИЛ-1 р (25 мкг/кг, внутривенно).

Стрелка показывает момент введения препаратов. Данные в виде М ± т. * - разница между сериями «физ. раствор + ЛПС» и «аМГ +ЛПС» (А) или «физ. раствор + ИЛ-1Р» и «аМГ + ИЛ-1р» (Б) достоверна, Р<0,05.

Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что ингибитор протеолиза аМГ обладает способностью ограничивать терморегуляторные реакции организма, вызываемые эндотоксином или ИЛ-1(3. Представляло интерес выяснить, оказывает ли аМГ влияние на поведенческие реакции, развивающиеся в условиях действия в организме этих пирогенных веществ.

В опытах на мышах было установлено, что предварительное внутривенное введение аМГ в дозе 5 мг/кг не оказывает достоверного влияния на изменения потребления пищи и двигательной активности, вызываемые действием в организме эндотоксина (100 и 2500 мкг/кг) или ИЛ-1Р (25 мкг/кг).

Учитывая полученные данные о влиянии ингибиторов СП на терморегуляцию в термонейгральных условиях, можно было предположить, что эти ингибиторы способны оказывать влияние на температуру тела и при действии на организм холода или тепла. Для проведения соответствующей серии экспериментов был выбран аАТ, поскольку он присутствует в крови в довольно высокой концентрации, которая изменяется при стрессах различного происхождения[Раиегьоп, 1991]. Эксперименты показали, что ни внутривенное (2,5 мг/кг), ни внутрижелудочковое (100 мкг) введение аАТ не оказывает влияния на прирост температуры тела крыс в условиях действия высокой внешней температуры (37°С). При ' остром охлаждении и последующем саморазогревании крыс предварительное внутрижелудочковое введение аАТ в дозе 100 мкг также не сказывалось на динамике температуры тела животных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибитор протеиназ аМГ оказывает влияние на функциональное состояние системы терморе1уляции, которое проявляется ослаблением терморегуляториых реакций организма на эндотоксин и ИЛ-1 р. На основании анализа данных литературы наиболее вероятным механизмом реализации терморегуляторных эффектов ингибиторов протеиназ представлялось изменение уровня цитокинов ИЛ-6 и ФНО в крови. Для проверки этого предположения нами были проведены эксперименты по изучению активности ИЛ-б и ФНО в крови у мышей после введения в кровоток аАТ и аМГ.

Изменение активности ИЛ-6 и ФНО в крови у мышей в условиях действия

ее AT и аМГ

Опыты показали, что внутривенная инъекция мышам аАТ в дозе 25 мг/кг приводит к повышению активности ИЛ-6 и ФНО в крови. Спустя 1 час после инъекции аАТ активность ИЛ-6 в крови у мышей составляла 14657,54 МЕ/мл (р<0,001), активность ФНО - 106,36+1,20, что было достоверно (р<0,001) выше, чем у контрольных животных (3,24±1,11 и 6,54±1,20 ME/мл, соответственно). Через 4 часа активность ИЛ-6 и ФНО в крови у мышей, получивших инъекцию аАТ, несколько уменьшилась и превышала таковую у контрольных животных на 2620,36 (р<0,001) и 30,27 ME/мл (р<0,001), соответственно.

Введение в кровоток аМГ в дозе 25 мг/кг вызывало у мышей сходные изменения уровня цитокинов в крови. Активность ИЛ-6 через 1 час после инъекции возрастала на 8307,73 ME/мл (р<0,01), через 4 часа - на 3265,75 ME/мл (р<0,001) по отношению к контролю. Активность ФНО при этом увеличивалась на 97,38 (р<0,001) и 31,37 ME/мл (р<0,001) спустя 1 и 4 часа после введения, соответственно.

Таким образом, можно предположить, что подъем температуры тела, вызываемый внутривенным введением аАТ и аМГ, опосредуется через вызываемое этими ингибиторами повышение в крови активности ИЛ-6, который по современным представлениям является одним из главных компонентов пиретической системы организма [Kluger, 1991]. Наблюдаемый в наших экспериментах уровень активности ИЛ-6 в крови, вероятно, достаточен для того, чтобы вызвать повышение температуры тела, поскольку соизмерим с таковым при эндотоксиновой гипертермии.

В предыдущем разделе главы представлены данные, свидетельствующие о том, что предварительное внутривенное введение аМГ ограничивает развитие гипертермической реакции, вызываемой эндотоксином. Опыты показали, что при совместном введении аМГ (5 мг/кг, внутривенно) и эндотоксина (100 мкг/кг, внутрибрюшинно) активность ФНО в крови у мышей составила 220,52±52,87 ME/мл, что существенно выше, чем при действии только эндотоксина (113,42±21,28 ME/мл). Активность ИЛ-6 в серии «аМГ+эндотоксин» была несколько ниже, чем в серии «физиологический раствор+эндотоксин» - 12543,91+3279,23 и 19710,051699,37 МЕ/мл, соответственно.

В настоящее время ФНО считается скорее антипиретическим, нежели пирогенным фактором [Kluger, 1991]. Показано, что нейтрализация активности ФНО усиливает гипертермическую реакцию, вызываемую эндотоксином [Long et al., 1990]. Таким образом, антипиретический эффект аМГ может быть связан с его способностью повышать активность ФНО в крови.

Действие аАТ и аМГ на продукцию цптокинов ИЛ-6 и ФНО мононуклсарнымн клетками кропи in vitro

Приведенные выше данные дают основания предполагать, что влияние ингибиторов протеиназ аАТ и аМГ на систему терморегуляции реализуется через вызываемое этими ингибиторами повышение активности ИЛ-б и ФНО в крови. Одним из путей повышения активности этих цитокинов в крови может быть усиление их продукции иммунными клетками крови. Для экспериментальной проверки этого предположения in vitro изучали продукцию ФНО и ИЛ-6 МКК в присутствии аАТ или аМГ в физиологических концентрациях. Опыты показали, что аАТ и аМГ усиливают продукцию ФНО и ИЛ-6 культивируемыми МКК (табл.). Ингибитор протеиназ аМГ преимущественно усиливает продукцию ФИО: отношение активности ФНО к активности ИЛ-6 в культуральной жидкости в при действии аМГ в изученных концентраций в среднем составило 7,4, при действии аАТ - 1,6.

Таблица

Активность ФНО и ИЛ-6 в культуральной жидкости через 24 часа инкубации МКК с ингибиторами СП.

Контроль ai-аититрипсии аг-макроглобулнн

3,0 мг/мл 6,0 мг/мл 2 мкг/мл 0,2 мг/мл

ФНО (МЕ/мл) 11,6 ±1,6 (4=16) 667,4 ±42,4*** (п=3) 1500,9 ±139,3*** (п=3) 21,7 +3,8* (п=3) 336,0 ±18,6*** (п=3)

ИЛ-6 1,2 520,4 793,3 2,1 74,9

(МЕ/мл) ±0,1 ±45,2*** ±23,9*** ±0,1** ±7,7***

(п=1б) (п=3) (п=3) (п=3) (п=3)

*,**,**- изменения достоверны по отношению к контролю, р<0,05, р<0,01 и р<0,001, соответственно.

Полученные при выполнении этой серии исследований данные свидетельствуют о том, что продукция интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей иммунными клетками крови подвержена модулирующему влиянию аАТ и аМГ. Можно предполагать, что уровень ингибиторов протеиназ в крови является одним из факторов, регулирующих выраженность терморегуляторных реакций организма на пирогены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Ингибиторы сериновых протенназ о^-антитрипсин и макроглобулин оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции, что выявлено в опытах по изучению динамики температуры тела животных после введения в организм этих ингибиторов. Внутривенное введение о^-антитрипсина или а2-макроглобулина приводит к кратковременному повышению температуры тела животных. Центральное действие ссх-антитрипсина сопровождается развитием выраженной и длительной гипертермии [1,4, 5, 8].

2. Ингибиторы протеиназ оказывают влияние на формирование терморегулягорных реакций организма на эндотоксин, но не на действие высокой или низкой температуры окружающей среды. Введение в кровоток а2-макроглобулина ослабляет гипертермическую реакцию, вызываемую эндотоксином. Ингибитор сериновых протеиназ ссх-антитрипсин не оказывает заметного влияния на терморегуляторные реакции, развивающиеся при действии на организм холода и тепла. Эти данные свидетельствуют о возможной роли а.2-макроглобулина в механизмах регуляции температуры тела в условиях действия в организме пирогенных веществ [2,3, 9].

3. Особенностью ответной реакции организма на введение ингибиторов сериновых протеиназ а.1-антитрипсина и а.2-макроглобулина является то, что вызываемая ими гипертермия не сопровождается развитием комплекса поведенческих реакций, характерного для действия эндотоксина. Эго подтверждается тем, что ссг-макроглобулин и а]-антнтрипсин, вводимые внутривенно, не оказывают достоверного влияния на локомоторную активность мышей. Гипертермия, развивающаяся у крыс в условиях центрального действия а.1-антитрипсина, не сопровождается угнетением двигательной активности и исследовательского поведения животных. [6, 9].

4. Ингибиторы сериновых протеиназ модулируют активность цитокинов интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей в крови. Введение в кровоток аг антитрипсина или аг-макроглобулина сопровождается повышением активности интерлейкина-б и фактора некроза опухолей в крови у животных. Системное действие аг-макроглобулина потенцирует вызываемое эндотоксином повышение активности фактора некроза опухолей в крови. Это свидетельствует о том, что влияние ингибиторов сериновых протеиназ на систему терморегуляции может реализовываться через изменение активности цитокинов интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей в крови [9].

5. Ингибиторы протеиназ aj-антитрипсин и а^-макроглобулин стимулируют продукцию ннтерлейкина-6 и фактора некроза опухолей мононуклеарными клетками крови in vitro. Одним из механизмов повышения активности интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей в крови после внутривенного введения ai-антитрипсина или аг-макроглобулина является активация процессов образования этих цитокинов мононуклеарными клетками крови [7].

6. Ингибиторы сернновых протеиназ животного происхождения могут быть использованы для направленного влияния на температурный гомеостаз в условиях действия в организме пирогенных веществ [2, 5].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ

1. Sandakov D.B. Centrally applied al-antirtypsin alters body temperature in rats // In: Thermoregulation and temperature adaptation (edited by V.N.Gourine). -Minsk, 1995.-P. 137-139.

2. Sandakov D.B. Acute phase proteins - possible regulators of febrile response // In: Thermoregulation in health and disease (edited by V.N.Gourine). — Minsk, 1997. - P. 79-83.

3. Sandakov D.B., Gourine A.V. Thermoregulatory effects of intravenously applied (X|-antitrypsin in rats И In: Thermoregulation in health and disease (edited by V.N.Gourine). - Minsk, 1997.-P. 177-180.

4. Гурии B.II., Сандаков Д.Б., Гурнн A.B. Активность протеиназ головного мозга и мобилизация эндогенных ингибиторов протеолиза как факторы формирования функционального состояния организма // Физиология человека. - 1999. - Т. 25. - №1. - С. 71-77.

5. Гурии В.Н., Сандаков Д.Б., Гурии А.В. О значении ингибиторов протеиназ в процессах, обеспечивающих сопряжение деятельности функциональных систем организма. Ч Вестник РАМН. - 1999. - № б. - С. 25-29.

6. Сравнительный анализ поведенческих реакций крыс при действии эндотоксина и al-антитрипсина / Сандаков Д.Б., Ламан И.В., Кульчицкий В.А., Матюхин В.А. // В кн.: Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности (ред Гурин В.Н. я др.)-Минск: Полибиг, 1999.-е. 119-120.

7. The acute phase proteins, arantitrypsin and a.2-macroglobulin, induce production of cytokines by rat leukocytes in vitro / Sandakov D., Rudolph K., Gourine A., Gourine V., et al. // In: Recent advances in thermal biology (edited by V.N.Gourine).-Minsk: Polibig, 1999.-P. 89-92.

ТЕЗИСЫ

8. Sandakov, D.B., Gourine A.V., Gourine V.N. Alpha-1-antitrypsin induces hyperthermia in rats // Proceedings of the Physiological Society. University of Leeds meeting. - Leeds, 1996. - P. 92.

9. Acute phase proteins, cx2-macorglobulin and a 1-antitrypsin (serine protease inhibitors), induce acute phase response in mice and rats / Gourine V.N., Sandakov D.B., Gourine A.V., et al. // In: Pharmacology of Thermoregulation (abstracts of XII International Symposium). - Sevilla, 9-13 May 1999.

РЕЗЮМЕ

Сандаков Дмитрий Борисович

Функциональное состояние системы терморегуляции в условиях действия ингибиторов ссриновых протеиназ aj-антитриспина и а2-макроглобулина.

Ключевые слова: агантитрипсин, а2-макроглобулин, ингибитор протеиназ, эндотоксин, терморегуляция, гипертермия.

Объект исследования: мыши (п=180), крысы (п=80), кролики (п=12), культивируемые мононуклеарные клетки крови крыс.

Цель работы: Целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка гипотезы, согласно которой ингибиторы сериновых протеиназ ai-антитрипсин и а2-макроглобулин оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции.

Методы исследования: физиологический, фармакологичекий, иммунологический.

Использованная аппаратура:! биотелеметричекая установка для регистрации температуры тела («MiniMitter», США), электротермометр ТПЭМ, термокамера, термостат, центрифуга, спектрофотометр.

Изучали изменения температуры тела животных, активности у них в крови интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей после введения в организм ar антитрипсина или <х2-макроглобулина. Влияние этих ингибиторов на продукцию интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей мононуклеарными клетками крови исследовали in vitro.

Установлено, что (1) Ингибиторы протеиназ aj-антитрипсин и а2-макроглобулин оказывают влияние на функциональное состояние системы терморегуляции, что проявляется в термонейтральных условиях повышением температуры тела животных в ответ на введение этих ингибиторов; (2) Ингибитор протеиназ а2-макроглобулин ослабляет выраженность гипертермической реакции, вызываемой действием в организме эндотоксина; (3) Гипертермическая реакция, вызываемая ai-антитрипсином или а2-макроглобулином, не сопровождается развитием комплекса поведенческих реакций, характерного для действия эндотоксина; (4) Ингибиторы сериновых протеиназ ai-антитрипсин и а2-макроглобулин модулируют активность цитокинов интерлейкина-б и фактора некроза опухолей в крови и стимулируют продукцию этих цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro.

Область применения: научно-исследовательские лаборатории, теоретичекий курс по физиологии и патофизиологии в ВУЗах биологического и медицинского профиля.

РЭЗЮМЭ

Сандакоу Дзмпрый Барысав^ч

Функцыяиальны стан Ыстэмы тэрмарэгуляцьи ва умовах уздзеяння шпбггарау серынавых пратэшаз аганщтрыпсша i ссг-макраглабулша.

Ключавыя словы: ai-анцпрыпсш, аг-макраглабулш, ¡нпб1тар пратэшаз, эндатаксш, тэрмарэгуляцыя, Л1хаманка.

Аб'ект даследавання: мышы (п=180), пацум (п=80), трусы (п=12), культывуемыя монануклеарныя клети крьш пацукоу.

Мэта працы: Мэтай дадзенай працы з'явшася эксперыментальная праверка ппогэзы, згодна з якой ¡нпбггары серынавых пратэшаз а|-анц1трь;г.с'ш i а2-макраглабулш аказваюць уплыу на функцыянальны стан с!стэмы тэрмарэгуляцьи.

Метады даследавання: ф'шялапчны, фармакалапчны, ¡муналапчны.

Выкарыстаиая апаратура: б1ятэлеметрычная устаноука для рэпстрацьн тэмпературы цела («MiniMitter», ЗША), электратэрмометр ТПЭМ, тэрмакамера, тэрмастат, цэнтрыфуга, спектрафатометр.

Вывучал! змяненш тэмпературы цела жывелш, актыунасщ у ix у крыв! штэрлейкша-6 i фактара некрозу пухл in пасля увядзення у aprani3M ai-ашптрыпс1)[у ui а.2-макраглабулшу. Уплыу гэтых шпбггарау на прадукцыю штэрлейкша-6 i фактара некрозу пухлш монануклеарным! клеткам! крыв! даследвал! in vitro

Вызначана, што 1) 1нпб1тары серынавых пратэ'шаз аранц'ирыпсш i аг-макраглабулщ аказваюць уплыу на функцыянальны стан астэмы тэрмарэгуляцьи, што праяуляецца у тэрманейтрапьных. умовах павышэння тэмпературы цела жывелш у адказ на увядзенне гэтых iiiri6iTapay; 2) Inri6iTap пратэшаз осг-макраглабулш паслабляе выяуленасць ппертэрмшнай рэакцьп, якая выкл!каецца уздзеяннем у аргашзме эндатаксшу; 3) Гтертэрм1чная рэакцыя, якая выюнкаецца арапштрыпсшам qi а2-макраглабулшам, не суправаджаецца развщцем комплексу паводзшсгах рэакцый, яю характэрны ва умовах уздзеяння эндатаксшу; 4) [нпбпары серынавых пратэ!наз осг анцпрыпсш i а2-макраглабулш мадулююць актыунасць цытакпту штэрлейкша-6 i фактара некрозу пухл in у крьш i стымулююць прадукцыю гэтых цытакшау монануклсарнымi клеткам1 крьш in vitro.

Галша прымянення: навукова-даследчыя лабараторьн, тэарэтычны курс па ф!31ялоги i патаф^зюлогц у ВНУ «¡ялапчнага i медыцынскага профшо.

SUMMARY

Sandakov Dmitry Borisovich

Functional state of the thermoregulatory system upon action of the serine proteinase inhibitors ai-antitrypsin and a2-macrogIobulin.

Key words: ai-antitrypsin, a2-macroglobulin, proteinase inhibitor, endotoxin, thermoregulation, hyperthermia.

Objcct of studies: mice (n=180), rats (n=80), rabbits (n=12), cultured rat blood mononuclear cells.

Aim: Experimental substantiation of the hypothesis that the serine proteinase inhibitors ct|-antitrypsin and a2-macroglobulin affect the functional state of the thermoregulatory system.

Methods: physiological, pharmacological, immunological.

Instruments used: biotelemetric system for body temperature monitoring («MiniMitter», USA), electrothermometer, climate chamber, thermostat, centrifuge, spectrophotometer.

Changes in bode temperature, activity of interleukin-6 and tumor necrosis factor in blood after administration of ai-antitrypsin or a2-macroglobulin were studied. The effect of serine proteinase inhibitors on the interleukin-6 and tumor necrosis factor production by blood mononuclear cells was investigated in vitro.

It was found that: 1) Serine proteinase inhibitors ai-antitrypsin and a2-macroglobulin affect the functional state of thermoregulatory system, as it is evident from an elevation of body temperature after administration of these inhibitors; 2) Proteinase inhibitor a2-macroglobulin attenuates body temperature responses to endotoxin; 3) Hyperthermia produced by ai-antitrypsin or a2-macroglobulin is not accompanied by a "sickness behavior", typical for endotoxin-treated animals; 4) Serine proteinase inhibitors a i-antitrypsin and a2-macroglobulin modulate the activity of interleukin-6 and tumor necrosis factor in blood and stimulate the production of these cytokines by blood mononuclear cells in vitro.

Field of application: research laboratories, theoretical courses in physiology in biomedical higher school.