Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белок-белковые взаимодействия альфа-2-макроглобулина человека и их функциональные последствия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белок-белковые взаимодействия альфа-2-макроглобулина человека и их функциональные последствия"

РГБ ОД

На правах рукописи

ДОРОФЕЙКОВ Владимир Владимирович

Белок-белковые взаимодействия альфа-2-макроглобулина человека и их функциональные последствия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Специальность 03.00.04 - биохимия

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (ректор - чл.-корр. РАМН, профессор Н.А. Яицкий).

Научный консультант: д.м.н. профессор И.Г. Щербак

Официальные оппоненты:

Д.м.н. академик РАМН, профессор И.П. Ашмарин Д.м.н. чл.-корр. РАМН, профессор B.C. Гайцхоки Д.м.н. засл. деят. науки РФ, профессор С.С. Михайлов

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита состоится в час 23 марта 2000 года на заседании диссертационного совета Д 001.23.01 при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, С.Петербург, ул. акад. Павлова 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (С.-Петербург, ул. акад. Павлова 12)

Автореферат разослан февраля 2000 года

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук JI.B. Пучкова

Введение

Актуальность проблемы. До недавнего времени была хорошо известна роль a-2-макроглобулина (МГ) как регулятора систем свертывания крови и фибринолиза, чистильщика крови от малоспецифичных протеиназ. Исследованиями последних 10 лет была показана возможность взаимодействия этого универсального эндогенного ингибитора протеолитических ферментов с некоторыми иммунными пептидами, в том числе цитокинами. В 1987 - 89 г. профессором И.Г. Щербаком была выдвинута гипотеза о возможности сорбции на а-2-макроглобулине белково-пептидных ингибиторов протеиназ и получены первые экспериментальные свидетельства этого феномена. Эти не связанные между собой поначалу данные и явились предпосылками настоящего исследования.

Уникальность a-2-макроглобулина заключается в способности связывать протеиназы всех четырех известных классов, а так же в особом механизме взаимодействия с этими ферментами. Являясь наиболее высокомолекулярным эндогенным ингибитором и одним из самых крупных белков в организме (молекулярная масса 720 кДа), МГ состоит из четырех полипептидных цепей, образующих две идентичные субъединицы. Каждая из них содержит участок, подходящий для атаки большинством известных протеиназ. Согласно теории Алана Барретта (1979-86 гг.), в результате гидролиза одной из пептидных связей в этом «приманочном» участке (bait region) в молекуле МГ открывается особая ловушка, куда «проваливается» протеиназа. Оказавшись «в плену», фермент не теряет полностью свою способность гидролизовать пептидные связи. Однако, субстратная специфичность протеиназы сужается. Фермент сохраняет способность гидролизовать относительно небольшие молекулы, а большинство крупных белковых субстратов становится для него недоступными.

Одним из существенных моментов в функционировании МГ является наличие в каждой из субъединиц так называемой тиол-эфирной петли, образованной радикалами цистеина и глутамата. Такой участок встречается крайне редко в молекулах белков и обнаружен в СЗ- и С4-компонентах комплемента и белке беременности, которые поэтому были отнесены к семейству макроглобулинов. При гидролизе тиол-эфирной связи, например, под действием первичных аминов или после взаимодействия с молекулой фермента, упомянутая выше ловушка закрывается, и МГ теряет способность дополнительно связывать

протеиназы. Электрофоретическая подвижность МГ с гидролизованными тиолэфирными связями несколько выше, чем у нативного, поэтому они получили название соответственно F (fast)- и S (slow)-^opM. В последние годы показано, что F-формы МГ связываются с LRP-рецепторами на поверхности гепатоцитов и всех клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а затем поглощаются внутрь клеток.

Особая роль таких природных полипептидных молекул, как цитокины, заключается в том, что они обеспечивают взаимосвязи между иммунокомпетентными клетками, влияя на процессы пролиферации, дифференцировки и функциональную активность клеток. В условиях in vivo не встречается случаев изолированной продукции индивидуальных цитокинов, что позволяет говорить о существовании цитокиновой сети. Биологические эффекты цитокинов, как правило, дозозависимы. При массивном выбросе этих пептидов к местным эффектам присоединяются системные. Так, повышение концентрации фактора некроза опухолей альфа приводит к резкому расширению сосудов, повышению их проницаемости с развитием картины эндотоксического шока. Развитие системных эффектов провоспалительных цитокинов связано с попаданием в кровь и транспортированием этих пептидов ею. Таким образом, вопрос изучения механизмов транспорта, возможности связывания и деградации иммуноцитокинов приобретает огромную важность и для клинической медицины.

В исследованиях иммунологического плана в начале 90-х годов на феноменологическом уровне показана возможность взаимодействия таких пептидов как фактор некроза опухолей, интерлейкины 1, 2, 6 и дефензинов в крови с одной из форм a-2-макроглобулина. В одних случаях - это нативный макроглобулин, в других - макроглобулин, обработанный метиламином. Однако, в физиологических условиях такой модифицированной формы макроглобулина не существует, а результаты таких модельных экспериментов лишь частично отражают свойства макроглобулина, комплексированного с протеиназами. В большинстве работ, выполненных в иммунологических лабораториях, использовали белково-пептидные молекулы с радиоактивной меткой, не обладающие функциональной активностью. Более того, такая процедура может оказывать существенное влияние на комплексирование с белковыми молекулами, в том числе с а-2-макроглобулином.

Т. о., механизмы взаимодействия a-2-макроглобулина с биологически активными белково-пептидными молекулами, его биологическая и патофизиологическая роль пока остаются неизвестными. Интересной представляется и потенциальная возможность элиминации

провоспалительных цитокинов с использованием различных форм макроглобулина. Попытки удаления цитокинов из плазмы крови и модельных растворов с использованием иммобилизованных моноклональных антител неоднократно предпринимались, однако, удовлетворительных результатов достигнуто не было.

Целью работы явилось выявление взаимосвязи между антипротеиназной функцией а-2-макроглобулина и его способностью к взаимодействию с пептидными молекулами, а также изучение механизмов и биологической роли такого взаимодействия. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Разработать новую методику выделения а-2-макроглобулина из плазмы крови человека с максимальным сохранением его нативных свойств

2. Изучить механизмы взаимодействия между иммунноцитокинами (фактор некроза опухолей а, интерлейкины 1 и 2) и а-2-макроглобулином, предварительно комплексированным с протеиназами различной специфичности.

3. Исследовать возможность конкуренции между отдельными белково-пептидными молекулами за связывание с а-2-макроглобулином.

4. Изучить способность малоспецифичных прогеиназ, комплексированных с макроглобулином, разрушать цитокины с утратой их биологической активности.

5. Исследовать способность высокоспецифичных протеиназ, комплексированных с а-2-макроглобулином, к сорбции и транспорту пептидных молекул; способность макроглобулина влиять на биологическую активность цитокинов, возможность их "маскировки".

6. Изучить возможность влияния 'различных форм а-2-макроглобулина на комплемент- и токсин-зависимый лизис эритроцитов.

7. Разработать метод получения препаратов иммобилизованного макроглобулина человека, пригодного для элиминации туморнекротизирующего фактора а из биологических жидкостей.

Научная новизна исследования состоит в следующем: изучено влияние различных форм а-2-макроглобулина на биологически активные человеческие туморнекротизирующий фактор альфа, интерлейкины 1р и 2. Показано, что комплексы туморнекротизирующего фактора а с макроглобулином обладают существенно более высокой биологической активностью, чем свободный цитокин, вызывая "кэпинг" специфических рецепторов на поверхности клегок-мишеней. Получены доказательства сорбции белково-пептидных молекул на поверхности а-2-макроглобулина

в плазме крови. На основе полученных результатов сформулированы новые представления о роли а-2-макроглобулина как полифункционального протеина, в частности о существенном вкладе его антипротеиназной функции в реализацию избирательного взаимодействия с неферментативными белково-пептидными молекулами.

Научно-практическое значение работы. Работа имеет как теоретическое, так и прикладное значение. Разработана новая, "мягкая" методика выделения и очистки а-2-макроглобулина человека из плазмы крови человека, включающая повторную гель-хроматографию, диализ и ультрафильтрацию; эта методика позволяет максимально сохранить нативные свойства ингибитора.

С помощью разработанных новых модификаций методов определения макроглобулина и его комплексов с протеиназами в сыворотке крови показано, что в условиях гипертермии у человека изменения уровней этих показателей коррелируют с типом регуляции вегетативной нервной системы, тепловой устойчивостью организма и выраженностью острофазного ответа. Разработан метод получения аффинного сорбента на основе высокоочищенного а-2-макроглобулина и подобраны оптимальные условия для элиминации туморнекротизирующего фактора а из растворов и сыворотки крови при патологических состояниях. Сорбент, метод его получения и способ удаления туморнекротизирующего фактора из растворов и биологических жидкостей Государственным Комитетом по Изобретениям и Открытиям РФ признаны изобретениями и выданы соответствующие Патенты (Патент 1Ш N 2123860 и патент 1Ш N 2112553). Прикладное значение имеют и ряд других методических разработок, в том числе газохроматографический способ определения эстеразной активности протеиназ (Патент 1Ш N2027764) и средство для стерилизации и отмывания от биологических жидкостей (Патент 1Ш N2077890).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. а-2-макроглобулин человека является важнейшим фактором транспорта, элиминации и модификации биологической активности провоспалительных цитокинов.

2. Биологическое действие сложных надмолекулярных комплексов макроглобулин-протеиназа-цитокин определяется как специфичностью протеиназы, так и физико-химическими и биологическими свойствами самого пептида и его рецепторов.

3. В результате исследования белок-белковых взаимодействий МГ обнаружена способность ингибитора отменять токсин- и комплемент-зависимый гемолиз.

4. Препараты иммобилизованного на носителе модифицированного макроглобулина эффективно сорбируют туморнекротизирующий фактор а из растворов и биологических жидкостей, а также снижают активность и совокупную емкость комплемента крови человека.

5. Разработанные методики определения a-2-макроглобулина и его комплексов с протеиназами могут быть использованы для изучения функционального состояния ингибитора при различных патологических состояниях.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Третьем Международном конгрессе по иммунным механизмам травмы, шока и сепсиса в Мюнхене (1994), Международном конгрессе по шоку в Токио (1995), Второй и Третьей научных конференциях с международным участием "Дни иммунологии в С.-Петербурге"(1998 и 1999), на 8-ом международном конгрессе Европейского общества аллергологов и иммунологов (Стокгольм, 1994), на IV симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 1997), на II съезде Всероссийского биохимического общества (Москва, 1997), на заседании С.-Петербургского отделения биохимического общества (1997), на заседаниях Научного Совета С.-Петербургского Государственного медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова (1998 и 1999). По теме диссертации опубликовано 30 работ в отечественных и зарубежных научных изданиях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 6 глав собственных результатов исследований, главы «Обсуждение результатов» и выводов. В работе 27 таблиц и 21 рисунок; список литературы включает 285 источников, в том числе 40 - на русском языке.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Для выделения и очистки МГ, его комплексов с протеиназами и пептидами применяли приборы, которые входят в состав полной хроматографической системы фирмы LKB (Швеция): колонки, коллектор фракций LKB 2112 Redirac, перистальтический насос LKB 2120 Varioperpex II pump. Непрерывную регистрацию оптической плотности элюата в процессе хроматографии осуществляли с помощью

двухканального самописца-потенциометра LKB 2210, соединенного с LKB 2138 Uvcicord S.

Ионообменную хроматографию осуществляли с помощью системы Ultrograd Gradient Mixer LKB. Электрофоретические исследования были проведены с помощью прибора для электрофореза фирмы "Reanal" (модель 73) и источника питания LKB 2103 (Швеция).

Определение активности МГ производилось с помощью энзимологических методик на СФ-46 (ЛОМО) в термостатируемой кювете. Концентрирование белковых препаратов проводили с использованием ячейки для ультрафильтрации ФМ-02 производства Олайнского завода хим. реактивов. Ультрафильтрацию проводили под давлением 0.6 МПа. Использовали мембраны с диаметром пор 10 кДа (Халипор-4-64ч) и 80 кДа (Халипор-3-64ч).

В качестве субстратов протеиназ использовался N-бензоил-Ь-аргинин-паранитроанилида гидрохлорид (Sigma), N-a-карбобензокси-Ь-лизина паранитрофениловый эфир (синтезирован доцентом химического факультета СПбГУ Сорочинской Е.И.) и N-бензоил- L-аргинина этиловый эфир (Reanal, Венгрия).

Раствор трипсина: 5.0 мг кристаллического трипсина (Spofa, Чехия) растворяли в 5.0 мл водного раствора, содержащего 0.0001М HCl и 25% СаС12. Данный раствор хранился в течение 5 дней при температуре +4°С без существенного изменения активности. Из этого основного раствора готовили рабочие растворы трипсина разбавлением 0.05 М трис-НС1 буфером 1:10. Раствор соевого ингибитора трипсина готовили перед экспериментом путем растворения навески препарата в том же буфере. 2 мМ раствор субстрата БАПНА готовили путем растворения навески этого субстрата в воде при постоянном перемешивании и нагревании не выше 70°С. С-реактивный белок был любезно предоставлен JI.K. Берестовой (НИИ вакцин и сывороток, С.-Петербург). Протеин был выделен из асцитной жидкости больных опухолями яичников с помощью ИОХ. Концентрация электрофоретически и иммунохимически гомогенного белка составляла 1 мг/мл по Лоури. Так же использовали рекомбинантный человеческий туморнекротизирующий фактор а производства "Ферментас" (Литва) с активностью 1.7*107 Ед. Кроме того, в работе использовали пептидные фрагменты молекулы ТНФ, предоставленные ст. научным сотрудником Института иммунологии (Любляны, Московская обл.) A.B. Майоровым. Антитела против a-2-макроглобулина получали гипериммунизацией кроликов нативным МГ в дозе 8 мг с 1 мл адьюванта Фрейнда с последующей реиммунизацией той же дозой через 4 недели. Через 10 дней после второй иммунизации сыворотку крови исследовали в

реакции НПГЛ с эритроцитами, нагруженными МГ. Титр специфических антител составлял от 1/16384 до 1/32768.Из пулированных сывороток кроликов выделяли иммуноглобулины класса G (Ig) повторным □саждением сульфатом аммония и гель-фильтрацией на колонке с гелем TSK-60F.

В качестве источника МГ использовали кровь здоровых доноров, полученную в донорском пункте при СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Была использована кровь 120 доноров женского пола. Все процедуры фракционирования плазмы крови осуществляли в холодной комнате при температуре от 0 до +4°С. Плазму крови хранили в холодильнике при +4°С не более двух суток. Препараты МГ хранили без стерилизации не более 3 :уток или в течение 10 суток после ультрафильтрации через эактериальные фильтры фирмы "Амикон" (Франция) в стерильных флаконах. Кроме того, в работе использовали предоставленную к.м.н. A.B. Банниковым венозную кровь 27 молодых мужчин в возрасте 19-21 года -курсантов BMA (Санкт-Петербург). В качестве ТНФ-содержащих :ывороток использовали индивидуальные сыворотки крови детей в возрасте 2-8 лет (15 образцов), находившихся на лечении в эеанимационном отделении НИИ детских инфекций (С.-Петербург) с диагнозом септический шок (предоставлены проф. Э.К. Цибулькиным).

Биологическую активность ТНФ в стандартном цитотоксическом гесте определял научный сотрудник отдела иммунологии НИИ ИЭМ И.Э. эондарев под руководством чл.-корр. РАМН проф. И.С. Фрейдлин. Им же шполнялась флюоресцентная микроскопия. Клетками-мишенями ТНФ служили мышиные фибробласты линии L929 в присутствии актиномицина D при окраске кристалвиолетом. За 1 Ед (U) активности принимали дозу ГНФ, вызывавшую половину полного лизиса клеток-мищеней. Препараты )екомбинантных ИЛ-1 и ИЛ-2 с концентрацией активных цитокинов 1 лг/мл были любезно предоставлены д.м.н. A.C. Симбирцевым (НИИ ОЧБ, ^.-Петербург), и им определена их биологическая активность (в ¡тандартизованном биотесте костимуляции пролиферации тимоцитов шшей) и концентрация цитокинов иммуноферментным анализом до и юсле хроматографических и других процедур, выполнявшихся на :афедре биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

В экспериментах по исследованию возможного влияния препаратов АГ на систему комплемента использовали современные кинетические 1етоды определения классического (КПК) и альтернативного пути :омплемента (АПК), разработанные на кафедре биохимии СПбГМУ им. [кад. И.П. Павлова.

С целью оценки чистоты препаратов МГ и эффективности процедур очистки в работе использовали диск-электрофорез и иммунодиффузию. Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле (5% Т) проводили в щелочной буферной системе (рН 8.6). Окраску гелей после процедуры ЭФ проводили красителем амидочерным 10В с последующей отмывкой избытка красителя 7% уксусной кислотой. Радиальная иммунодиффузия в агарозном геле была выполнена с применением наборов фирмы "Беуас" (Чехия) для иммунохимического определения МГ в соответствии с рекомендациями производителя. Количество МГ, содержащегося в очищенных препаратах, определяли по калибровочной кривой, построеной с помощью приложенного к набору фирмы коммерческого препарата МГ.

В работе применяли следующие статистические методы: вычисление средних, квадратичного отклонения, доверительных интервалов. Достоверность различий между группами (Р) оценивали по N критерию Стьюдента.

Результаты исследований

Начиная выделение и изучение свойств какого-либо белка, исследователь сталкивается с проблемами надежной регистрации биологической активности, а так же контроля сохранения его нативных свойств в ходе манипуляций и хранения препаратов. Для такого сложно устроенного белка, как МГ, обладающего целым рядом биологических свойств, это является непростой задачей. Исходя из твердо установленной роли МГ быть важнейшим регулятором активности протеолитических энзимов, большинство исследователей тестируют препараты МГ по его способности взаимодействовать с трипсином с регистрацией эстеразной или гидролазной активности таких комплексов. Мы использовали синтетический субстрат трипсина >}-а-бензоил-Ь-

аргининпаранитроаншшд (БАПНА), который гидролизуется трипсином с образованием окрашенного в желтый цвет паранитроанилина. В отличие от высокомолекулярных субстратов, например, протамин-сульфата, скорости гидролиза БАПНА комплексами МГ-трипсин и свободным трипсином достоверно не различаются. Однако, часть трипсина связывается с МГ по внеловушечному механизму, и при этом фермент полностью теряет всякую активность. Основываясь на этих твердо установленных фактах, мы разработали свои модификации энзимологического метода, которые позволяют оценить по отдельности способность МГ взаимодействовать с трипсином по "ловушечному"

механизму и ингибировать активность протеиназы в отношении низкомолекулярных субстратов.

Достаточно высокая мутность цельной плазмы крови является препятствием для кинетической регистрации гидролиза БАПНА или аналогичного низкомолекулярного синтетического субстрата непосредственно в термостатируемой кювете спектрофотометра. Для того, чтобы избежать этих трудностей, мы модифицировали известный метод П. Гэнрота (1971). После добавления в инкубационную смесь трипсина, плазмы и соевого ингибитора трипсина мы вносили подогретый до 37° С субстрат и после быстрого перемешивания измеряли экстинцию при 405 нм. Затем инкубационную смесь помещали в термостат на 30 или 60 мин. и спустя указанное время снова измеряли экстинцию. Т.о., величина прироста экстинции не зависела от мутности образца плазмы крови, а количество субстрата было вполне достаточно для линейного хода ферментативной реакции (обычно гидролиз субстрата составлял за 60 мин. не более 5 % от его количества в инкубационной смеси в начальный момент времени). Разработанная модификация позволила избежать этапа осаждения и последующего отделения белкового материала, который обычно используют исследователи МГ. Помимо двукратного выигрыша во времени, это позволило повысить чувствительность методики, так как светопоглощение нитроанилина в кислой среде (например, после добавления к инкубационной смеси НС1 или трихлоруксусной кислоты) на 30-40% ниже, чем при рН 7.8-8.0, т.е. тех значениях, при которых проводят энзимологическое определение МГ.

В ответственных опытах с использованием высокоочищенных препаратов МГ мы использовали непрерывную регистрацию хода ферментативной реакции, помещая инкубационные смеси в термостатируемые кюветы спектрофотометра. В некоторых опытах после добавления трипсина и МГ вносили субстрат и регистрировали скорость реакции в течение нескольких минут, сравнивая ее со скоростью реакции тем же количеством трипсина (объем инкубационной смеси 2.9 мл). Затем в эту же кювету добавляли соевый ингибитор трипсина в количестве, достаточном для связывания свободного трипсина (объем 0.05 мл), и продолжали измерять скорость реакции. Т.о., разведение инкубационной смеси было незначительным, а применение данной модификации позволило в одном опыте определить и способность препарата МГ угнетать гидролазную активность трипсина, и способность МГ образовывать с энзимом комплексы, активные в отношении низкомолекулярных субстратов.

Содержание МГ, его комплексов с протеиназами и антитриптической активности и уровень провоспалительных цитокинов мы определили у группы практически здоровых лиц (27 мужчин) в возрасте 19-21 года при состоянии выраженной гипертермии в сочетании с физической нагрузкой. В зависимости от типа вегетативного регулирования отмечались различия в фоновом уровне интерлейкина-1р (ИЛ-1) и туморнекротизирующего фактора альфа (ТНФ). Показано, что парасимпатическому типу регуляции вегетативной нервной системы (ВНС) соответствует более высокий исходный уровень провоспалительных цитокинов, а доминирующему симпатическому типу регуляции ВНС - более низкий уровень ИЛ-1 и ТНФ. Выявлено два типа острофазного ответа: у лиц с симпатическим типом регулирования ВНС уровень ИЛ-1 и ТНФ повышался, что сочеталось с более высоким уровнем тепловой устойчивости. У людей с парасимпатическим типом регулирования ВНС отмечалась низкая тепловая устойчивость, а уровни изученных цитокинов при гипертемии понижались. Острофазный ответ при воздействии высокой температуры и физической нагрузки характеризовался как однонаправленным (уровни ИЛ-1, ТНФ), так и разнонаправленным (уровни ТНФ и МГ, комплексированного с протеиназами; нативной формы а-2-макроглобулина и БАПНА - гидролазной активности сыворотки) изменением исследуемых показателей. Повышение уровня МГ, комплексированного с протеиназами, является наиболее характерной острофазной реакцией организма человека на гипертермию.

Разработка "мягкого" метода очистки а-2-макроглобулина.

Анализ литературы свидетельствует о высокой чувствительности очень большой, сложно устроенной молекулы нативного МГ к варьированию условий среды. Исследованиями последнего десятилетия доказано, что такие широко применявшиеся ранее приемы, как полиэтиленгликоль-преципитация, высаливание и т.п. процедуры приводят к необратимой утрате части нативных свойств ингибитора. По этой же причине обычно предпочитают применять минимальное число процедур очистки, используя резкое отличие размеров молекулы МГ от величины молекул почти всех остальных белков плазмы. С учетом всего этого была предпринята попытка разработать новую методику выделения МГ из плазмы крови доноров, используя стандартные процедуры.

Литературные данные показали, что наиболее эффективным и, практически не оказывающим влияния на структуру белка методом

выделения МГ является процедура гель-фильтрации, тогда как другие приемы часто способны вызывать полимеризацию и фрагментацию молекулы ингибитора.

Для оценки хроматографического процесса были определены и проанализированы основные хроматографические параметры для колонок с различными современными гелями (Sephacryl-S300 HR - N=4986 теоретических тарелок, с приемлемым разрешением Rs=l можно разделить п= 15 веществ; TSK HW-60 - N=3612 теоретических тарелок, п=13 веществ; ультрагель АсА 22 - N=1700, п=9). Учитывая вышеприведенные преимущества, для выделения МГ была использована гель-фильтрация свежей плазмы на колонках геля Sephacryl-S300 HR. Пример результатов хроматографии приведен на рис. 1. Как видно из рисунка, активность МГ обнаруживается в виде довольно узкого пика во фракциях элюата, соответствующих известной молекулярной массе этого белка. Объединенные фракции этого пика, объемом 35-39 мл анализировали для оценки эффективности очистки и использовали в дальнейших экспериментах. Как правило, степень очистки на данном этапе находилась в диапазоне от 8.5 до 10.0. Выход препарата составлял (85 ± 10)% от активности МГ в плазме.

Рехроматографию проводили также на колонке геля Sephacryl-S300 HR. Активность МГ обнаруживали во втором белковом пике. Первый пик являлся примесью IgM (молекулярная масса около 900 кДа). Таким образом, рехроматография дает возможность отделить данный протеин от МГ. Обычно степень очистки на данном этапе находилась в диапазоне от 11 до 14. Выход препарата составлял (55 ±5)% от активности МГ в плазме.

Так как одно из требований к выделяемому препарату - отсутствие примесей IgM, для его осаждения был использован методический прием диализа, используемый рядом исследователей в методиках очистки. Количество белка, выпавшего в осадок после диализа и скоростного центрифугирования, составило около 1% от исходного. Следовательно, предыдущие процедуры очистки являются достаточно эффективными для отделения IgM от МГ.

Концентрирование препарата МГ проводили методом ультрафильтрации под давлением 0.6 атм через мембраны с порами, пропускающими белки 10 кДа или 80 кДа. В ходе работы было выявлено, что данный прием приводит к значительному повышению степени очистки МГ, особенно для высокоочищенных препаратов. Так, степень очистки после ультрафильтрации препарата, полученного в результате первой гель-фильтрации, возрастала на 10-13 % по сравнению с

Рис. 1. Гель-фильтрация на колонке геля Sephacryl-S300 HR

(2.6*79.5см) свежей плазмы донорской крови.------ активность

МГ, определяемая по скорости гидролиза БАПНА комплексом этого белка с трипсином (Е405 )• предыдущим этапом. Причем выход препарата МГ снижался незначительно (на 8-10%). После ультрафильтрации препарата, полученного в результате рехроматографии и диализа, степень очистки возрастала на 70-80 %, при этом потери МГ также были в пределах 8-10%. Этот эффект оказался более выражен для высокоочищенных препаратов МГ. В фильтрате, полученном в ходе данной процедуры, было установлено наличие пептидов (массой меньше 10 кДа), часть из которых является ингибиторами трипсина, (регистрировали по угнетению БАПНА-гидролазной активности трипсина после инкубации с полученным фильтратом). Результаты одной из очисток приведены в таб. 1. При анализе фильтрата было установлено, что белок не является МГ, т.к. инкубация с трипсином не приводила к сохранению БАПНА-гидролазной активности фермента в присутствии соевого ингибитора трипсина. При обработке фильтрата метиламином угнетающая активность в отношении трипсина сохранялась. Возможность проникновения этих ингибиторов трипсина через мембрану 10 кДа говорит о низкомолекулярной природе этих молекул. Обнаруженный в нашем исследовании феномен сорбции на молекулах МГ низкомолекулярных ингибиторов ранее не описан, хотя предположения о возможности такого взаимодействия в плазме крови

Таблица. 1

Эффективность разработанной методики очистки а-2-макроглобулина из

донорской плазмы крови

Этап Объем препарата, мл Концентрация белка, мг/мл Активность, цюнит/мл Удельная активность, рюнит/мг Степень очистки Выход, % Общая активность препарата, цюнитах

Плазма 10.0 78.8 33.3 0.42 1 100 333

1. Гель-фильтрация 37.0 2.17 8.0 3.63 8.7 89 296

2. Ультрафильтрация 12.0 5.53 22.4 4.05 9.65 80.8 269

3. Гель-фильтрация 21.0 1.61 7.92 4.92 11.7 50 166.5

4. Диализ 20.0 1.3 8.16 6.27 14.9 49 163.2

5. Ультрафильтрация 6.0 2.01 22.2 11.04 26.3 40 133.2

высказывали ряд исследователей. Можно предположить, что в более ранних исследованиях этот феномен сорбции не был обнаружен в связи с использованием в ходе очистки ингибитора таких жестких процедур, как высаливание сульфатом аммония, осаждение МГ органическими растворителями. Даже такой широко используемый в ходе выделения (фракционирования) МГ из плазмы крови прием, как полиэтиленгликоль-преципитация приводит к разрушению гидратной оболочки ингибитора, изменению его конформации в результате осаждения с помощью скоростного центрифугирования, а затем растворения осадка в буферном растворе. В ходе последней процедуры исследователю приходится в центрифужном стакане механически стеклянной палочкой перемешивать препарат МГ, находящийся на дне, в течение нескольких минут. Такое грубое воздействие не может не оказывать влияния на конформацию ингибитора и его тонкие взаимодействия с белково-пептидными молекулами.

Совместно с сотрудниками кафедры органической химии С.-Петербургского государственного Университета (руководитель - доцент Сорочинская Е.И.) мы попытались охарактеризовать фракции, получаемые после ультрафильтрации препаратов МГ. Однако в результате ВЭЖХ получали многочисленные, плохо разделяемые фракции с очень низким содержанием пептидного материала. Возможно, пептидные молекулы, сорбированные на МГ, являются продуктами протеолиза, которые в клинико-биохимических исследованиях называют «средними молекулами». О биологической роли сорбции ингибиторов трипсина и, возможно, других ингибиторов протеиназ говорить сложно. В работе И.Г. Щербака и Г.М. Боголюбовой (1989) было высказано предположение о возможной десорбции ингибиторов протеиназ с молекулы МГ в ходе его взаимодействия с протеиназами в сосудистом русле. Проверить такое предположение в условиях, как модельных опытов, так и in vivo методически пока не представляется возможным. В то же время можно высказать предположение о том, что молекула МГ выполняет функцию «дворника», собирая самые разные пептидные молекулы и убирая их из кровотока после связывания с протеиназами.

Чистота и гомогенность препаратов, полученных в ходе разработанного метода очистки, оценивали методом иммунодиффузии по Манчини. При этом чистота препарата МГ составляла выше 95%. Результаты электрофореза в 5 % Т ПААГ также не выявили существенных количеств других белков или F-форм МГ.

Изучение взаимодействий различных форм а-2-макроглобулина и цитокинов

Основным цитокином, использованным в работе, был человеческий туморнекротизирующий фактор альфа (ТНФ). Выбор именно этого цитокина был определен его центральной ролью в процессах воспаления, регуляции метаболизма и функций иммунокомпетентных и других клеток, а также возможностью его надежного тестирования как иммуноферментным анализом так, что особенно важно, по биологической активности. Именно независимое и параллельное использование биологического и иммунохимического методов тестирования цитокинов (ТНФ и ИЛ-1) позволило безболезненно отказаться от использования радиоиммунных методов, используемых многими исследователями.

Нативный МГ и препараты МГ в Р-форме (комплексированные с катепсином, гшазмином и трипсином) инкубировали с ТНФ в течение 1 часа при 37° С, после чего инкубационную смесь подвергали гель-хроматографии на колонке Сефакрид 200Н11. Высокомолекулярные фракции (ВФ), соответствующие пику выхода МГ, объединяли и определяли их цитотоксическую активность. Низкомолекулярные фракции (НФ) также объединяли и определяли их цитотоксическую активность. Результаты этих опытов представлены в таблице 2.

Контрольные эксперименты продемонстрировали отсутствие влияния всех используемых форм МГ на жизнеспособность клеток-мишеней ТНФ (фибробластов линии Ь-929). При хроматографии инкубационных смесей, содержащих нативный МГ и ТНФ, высокомолекулярные фракции не обладали цитотоксической активностью, а НФ содержали все количество цитокина, нанесенное на колонку.

Как после гель-хроматографии инкубационных смесей, содержащих МГ, обработанный МА (в дальнейшем МГ-МА), так и содержащих МГ, комплексированный с плазмином, цитотоксическая активность ТНФ распределилась между ВФ и НФ.

Дальнейшие аналогичные эксперименты с варьированием количественных соотношений в инкубационных смесях между МГ и ТНФ подтвердили, что эти формы ингибитора способны к связыванию цитокина. Однако, при любых исследованных соотношениях МГ и ТНФ, цитотоксическая активность НФ была выше таковой ВФ. Для дальнейшего изучения комплексообразования высокомолекулярные фракции, полученные после инкубации МГ-МА с ТНФ, подвергли рехроматографии на той же колонке. Исходная цитотоксическая активность нанесенного на колонку препарата составляла 2500 Ед. После

Таблица 2.

Цитотоксическая активность пулов высокомолекулярных (ВФ) и низкомолекулярных (НФ) фракций после гель-фильтрации инкубационных смесей 10000 Ед ТНФ с различными формами сх-2-

Форма и количество а-2-макроглобулина Цитотоксичес Ед кая активность в М±ш)

Пулов ВФ Пулов НФ

Нативный МГ, 700 нМ 0 9204 ±325

МГ, обработанный трипсином, 700 НМ 0 0

МГ, обработанный катепсином В, 700 нМ 0 0

МГ, обработанный плазмином, 700 нМ 4564 ± 803 4269 ±750

МГ, обработанный метиламином, 700 нМ 2423 ± 426 7314+ 1287

рехроматографии наблюдали снижение цитотоксической активности ВФ до 600 Ед, в тоже время цитотоксическая активность НФ составила 1800 Ед. Таким образом, результаты рехроматографии комплексов позволили подтвердить предположение в. \Volenberg (1991) о нековалентном характере взаимодействия МГ с ТНФ.

Для уточнения количественных соотношений при взаимодействии ингибитора и цитокина МГ, обработанный метиламином (МГ-МА), и МГ, комплексированный с плазмииом, инкубировали в различных соотношениях с ТНФ. После гель-фильтрации ВФ объединяли и определяли их цитотоксическую активность. Результаты этих экспериментов представлены на рисунках 2 и 3 соответственно. Из них видно, что при инкубации одного и того же количества ТНФ с возрастающими количествами МГ-МА прирост цитотоксической активности ВФ происходил до тех пор, пока уровень молярных соотношений МГ-МА и ТНФ не достигает 1:2. В случае МГ, комплексированного с плазмином, это соотношение составляло 1:1. Вероятно, именно при этих молярных соотношениях белково-пептидных молекул МГ связывает весь ТНФ, находящийся в реакционной смеси. Значительно меньшая цитотоксическая активность ВФ после гель-фильтрации по сравнению с активностью добавленного ТНФ может быть связана с распадом большинства комплексов МГ-ТНФ в ходе этой процедуры и выходом освободившегося ТНФ в составе НФ.

125С

625

312

О 44 88 175 350 700 1400 2800 Рисунок 2. Цитотоксическая активность пулов высокомолекулярных фракций после гель-фильтрации инкубационных смесей а-2-макроглобулина, обработанного метиламином, и ТНФ при различных молярных соотношениях.

По оси абцисс - концентрация МГ в нМ, по оси ординат -цитотоксическая активность ТНФ (при концентрации ТНФ 350 нМ в инкубационной смеси). Выделенный столбец соответствует молярному соотношению МГ/ТНФ 1:2 2500

1250

625

312

0 44 88 175 350 700 1400 2800 Рисунок 3. Цитотоксическая активность пулов высокомолекулярных фракций после гель-фильтрации инкубационных смесей а-2-макроглобулина, обработанного плазмином, и ТНФ при различных молярных соотношениях.

По оси абцисс - концентрация МГ в нМ, по оси ординат -цитотоксическая активность ТНФ (при концентрации ТНФ 350 нМ в

инкубационной смеси). Выделенный столбец соответствует молярному соотношению 1:1.

На основании анализа количественных соотношений ингредиентов сделано заключение, что 1 молекула МГ-МА может связать 2 молекулы ТНФ, а 1 молекула МГ, комплексированного с плазмином, - 1 молекулу ТНФ. Эти пропорции наводят на мысль о том, что МГ связывает ТНФ с помощью своих модифицированных реактивных центров, так как известно, что метиламин модифицирует оба реактивных (ловушечных) центра, но молекула МГ захватывает в ловушку не более одной молекулы плазмина. Более высокий уровень ТНФ в ВФ после гель-фильтрации инкубационных смесей МГ-плазмин-ТНФ, по сравнению с МГ-МА-ТНФ, свидетельствует о более прочном связывании этой формы ингибитора с цитокином.

С целью изучения влияния препаратов МГ на биологическое действие ТНФ (в цитотоксическом тесте) мы инкубировали все вышеописанные формы МГ с цитокином (молярное соотношение МГ-МА/ТНФ составляло 1:2, МГ-плазмин/ТНФ - 1:1 и, наконец, МГ-трипсин или МГ-катепсин/ТНФ - 1:2) в течение 30 мин при 37 "С. После этого инкубационные смеси без предварительной гель-фильтрации исследовали в цитотоксическом тесте.

Экспериментальные данные свидетельствуют, что ТНФ, находящийся в комплексе с МГ-МА, обладает значительно более высокой цитотоксической активностью по сравнению таковой исходного цитокина. Комплексированный с плазмином МГ свойством усиливать биологическое действие ТНФ не обладал.

Для выяснения механизма усиления цитотоксического действия ТНФ в составе комплексов с МГ-МА фибробласты линии L929 обрабатывали комплексами ТНФ-МГ с включенной в состав МГ флюоресцентной меткой. При микроскопии через 15 минут после нанесения препарата наблюдали "кэпинг" флюоресцентной метки на полюсах клеток. Был сделан вывод, что поскольку действие ТНФ на клетки опосредуется специфическими рецепторами, то усиление активности ТНФ в составе комплексов с МГ-МА может объясняться "сшиванием" стимулированных ТНФ-рецепторов на плазматических мембранах клеток-мишеней с помощью бивалентных по отношению к этому цитокину молекул МГ-МА. Т. о., эти данные являются независимым подтверждением нашего предположения о количественных соотношениях при взаимодействии ТНФ и МГ-МА.

Не менее интересны результаты опытов с препаратами МГ, которые обрабатывали такими известными «разрушителями» белков, как

трипсин и катепсин. Даже находясь в ловушке МГ, они оказались способны к разрушению ТНФ, о чем свидетельствует полное исчезновение цитотоксической активности ТНФ после инкубации с ними. В контрольных экспериментах после получасовой инкубации ТНФ с этими энзимами, без добавления МГ, в цитотоксическом тесте цитокин также не проявлял своей обычной биологической активности.

В работах последних лет была показана возможность связывания модифицированного метиламином МГ с ИЛ-1 и ИЛ-2. Для ответа на вопрос о механизме связывания МГ с этими цитокинами мы инкубировали 700 нмоль МГ, модифицированного метиламином, с различными количествами ИЛ-1 или ИЛ-2 при 37° С в течение 30 мин. Затем добавляли во все инкубационные смеси 350 нмоль ТНФ и подвергали их гель-хроматографии. Высокомолекулярные фракции объединяли и определяли в них цитотоксическую активность ТНФ. Было показано, что ИЛ-1 и ИЛ-2 конкурируют с ТНФ за участки связывания на молекуле МГ в Р-форме.

В предварительных опытах было установлена достаточно высокая устойчивость ИЛ-1 к протеолитическому действию трипсина ( 2 мкг активного трипсина не влияли на биологическую активность ИЛ-1, определенную после 30-минутной инкубации при 37°С с последующим добавлением СИТ для прекращения действия энзима). Вероятно, в отличие от ТНФ ИЛ-1 является неподходящим субстратом для сериновых протеиназ. Первым результатом при инкубации ИЛ-1 с препаратами МГ было заметное снижение выявляемого цитокина иммуноферментным анализом как при добавлении МГ в Б-, так и в Р-форме. В то же время по результатам биотеста МГ в Б-форме достоверно не влиял на биологическую активность цитокина.

Из литературных данных известно, что ЙЛ-1 сорбируется на а-2-макроглобулине, модифицированным метиламином, или даже на Б-форме ингибитора, после обработки сыворотки комплексами АГ-АТ. Основным выводом, который можно сделать на основании проведенных экспериментов с биологически активным цитокином, является обнаружение феномена нековалентного комплексирования ИЛ-1 с обеими формами МГ.

Элиминация цитокинов с помощью иммобилизованого альфа-2-макроглобулина

Ключевая роль ТНФ в развитии септического шока не вызывает сомнения (Фрейдлин И.С.,1998). При этом состоянии концентрация ТНФ в плазме крови может возрастать в десятки раз, вызывая целый комплекс негативных эффектов. Т.о., выведение провоспалительных цитокинов из сосудистого русла становится важной клинической задачей. Попытки использования препаратов антител против ТНФ предпринимались в различных лабораториях, но оказались недостаточно эффективными.

Способность комплексов МГ-Трипсин инактивировать ТНФ и способность модифицированного метиламином МГ (МГ-МА) связывать этот цитокин навели на мысль об использовании этих форм МГ, иммобилизованных на носителе, для очистки растворов и биологических жидкостей от избытка ТНФ.

Совместно с сотрудниками С.-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера мы предприняли попытку создания аффинного сорбента на основе полученных нами препаратов МГ. Окончательный вариант методики, запатентованный нами как изобретение, включает следующие шаги:

активация сефарозы CL 4В бромцианом по известной методике с тщательной промывкой дистиллированной водой на фильтре Шотта конъюгация нативного МГ на активированной сефарозе блокировка активных групп сорбента глицином заполнение колонки МГ-сефарозой и перевод протеина в F-форму.

В экспериментах использовали препараты МГ только в S-форме (контроль с помощью электрофореза в ПААГ) с концентрацией белка 2-3 мг/мл в 0.02 М трис-соляная кислота буфере рН 7.9, содержащем 0.15 М хлорида натрия. Активированную бромцианом и отмытую сефарозу добавляли к равному объему препарата МГ. Инкубацию смеси проводили в течение 120 мин. при 18-20 °С при тщательном перемешивании на роторной мешалке. Затем инкубацию продолжали в холодной комнате при +4 °С в течение 12 часов также при постоянном перемешивании.

Полученный таким образом сорбент помещали на фильтр Шотта (диаметр пор 160 мкм) и многократно промывали гель буферным раствором. В промывочном буфере определяли концентрацию белка микробиуретовым методом, что позволяло судить о количестве ковалентно связавшегося МГ. Затем проводили блокировку оставшихся активных групп сорбента 0.5 М глицином в 0.15 М фосфатном буфере с 0.5 М NaCl (рН7.9). Процедура занимала 120 мин при постоянном

перемешивании на роторной мешалке. Окончательную отмывку сорбента осуществляли на фильтре Шотта, попеременно пропуская по 200 мл буферных растворов: вначале 0.1 М глицин-соляная кислота буфер рН 3.0, а затем 0.15 М фосфатный буфер рН 7.9, содержащий 0.5 М NaCl. Смену указанных буферов проводили 5 раз и готовый сорбент переводили в 0.2 М фосфатный буфер рН 7.2.

Эта методика отличается от стандартных, используемых для иммобилизации других белков, более мягкими условиями "посадки" протеина [25, 39]. Правильность этого тезиса подтверждается следующими экспериментами. Аликвоты полученного сорбента объемом по 2 мл помещали в микроколонки. Одну колонку промывали раствором трипсина (100 мкг/мл) в течение 10 мин. со скоростью 20 мл/час при комнатной температуре. Затем сорбент промывали 20-кратным объемом буфера С для удаления избытка трипсина, не связавшегося с МГ. Чтобы убедиться в том, что иммобилизованный МГ связал энзим (трипсин попал в "ловушки" ингибитора) через колонку пропускали 2 мМ раствор БАПНА со скоростью 10 мл/час. Гидролиз субстрата регистрировали фотометрически при 405 нм, собирая элюаг в пробирки объемом по 3 мл (температура 20° С). Прирост экстинции при 405 нм в опытах составлял 0.120-0.150, что прямо подтверждало, что до пропускания трипсина МГ находился на колонке в функционально активной форме (S-форме). В качестве контроля пропускали БАПНА через колонку, не обработанную трипсином. В контрольных экспериментах гидролиз субстрата не был зарегистрирован.

Следующим шагом был перевод иммобилизованного МГ в F-форму путем обработки протеина метиламином или растворами протеиназ. Аналогично вышеописанным опытам с трипсином проводили обработку сорбента коммерческим препаратом «фибринолизин» с контролем активности комплексов по гидролизу синтетического субстрата - И-а-карбобензокси-Ь-лизин паранитрофенилового эфира (в 0,02 М ацетатном буфере рН 5,5). Обработку МГ метиламином проводили непосредственно в колонке, пропуская 0,5 М раствор метиламина в течение 30 мин при 20° С. Затем колонку в течение 30 мин. промывали забуференным физиологическим раствором рН 7.2 для полного удаления непрореагировавшего метиламина.

Полученные таким образом три вида сорбентов использовали для элиминации ТНФ из различных растворов. На микроколонки объемом 2 мл наносили образцы, содержащие цитокин, и вели элюцию со скоростью 20 мл/час 0.85% раствором хлорида натрия вплоть до полного выхода не

связавшегося с сорбентом ТНФ (объединенные фракции обозначили как фильтрат). От сорбированного на колонках белкового материала освобождались промывкой 0,9 М раствором хлорида натрия (обозначены как элюат). При фильтрации со скоростью 20 мл/час 0.85% раствора хлорида натрия с растворенным в нем рекомбинантным ТНФ (10000 Ед) через каждый из сорбентов происходило более чем двукратное снижение количества ТНФ в фильтратах. При этом биологическая активность ТНФ в собранном и объединенном эпюате особенно резко падала в случае фильтрации ТНФ через МГ, обработанный трипсином. По-видимому, это свидетельствует в пользу предположения о доступности ТНФ как субстрата небольшой молекулярной массы для протеолитической атаки трипсином, комплексированным с МГ.

Сходные данные были получены в следующей серии экспериментов, когда ТНФ был растворен не в растворе 0,85 % хлорида натрия, а в донорской сыворотке крови. Однако, было отмечено, что при повторном использовании колонок с иммобилизованным МГ-трипсином (после отмывки 0.9 М раствором хлорида натрия и уравновешивания сорбента забуференным раствором 0.85 % хлорида натрия) для очистки сывороток от ТНФ их эффективность резко снижалась. Возможно, это связано с угнетением трипсина в составе комплексов МГ-трипсин низкомолекулярными ингибиторами протеиназ, которые содержатся в сыворотке крови.

Напротив, колонки с иммобилизованным МГ-МА показали высокую эффективность по удалению ТНФ из сывороток при повторном использовании (с промежуточной промывкой колонок 0,9 М раствором ЫаС1). С целью выяснения влияния скорости фильтрации на эффективность сорбции ТНФ хроматографию ТНФ-содержащих жидкостей проводили при скорости 10, 20 и 40 мл/час. Двукратное увеличение скорости фильтрации относительно стандартной (20 мл/час) снижало эффективность сорбции ТНФ примерно в 1,2 раза. Напротив, двукратное снижение скорости фильтрации увеличивает эффективность сорбции более чем на 10%

Для того чтобы увеличить эффективность сорбции ТНФ на колонках МГ-МА, после нанесения ТНФ-содержащей жидкости на колонку мы замкнули хроматографическую систему так, чтобы жидкость двигалась по кругу, возвращаясь на колонку. Для этого конец трубки, выходящей из перистальтического насоса, соединили с трубкой для подачи образца на колонку, таким образом, замкнув систему. Зная объем нанесенного на колонку образца ТНФ и скорость работы насоса, можно рассчитать

сколько раз цитокин полностью прошел через сорбент. Отбирая аликвоты через определенные промежутки времени, определяли цитотоксическуго активность ТНФ в этих образцах.

Полученные данные подтверждают, что концентрация цитокина достоверно и существенно снижается после первого и второго цикла фильтрации. Дальнейшая циркуляция ТНФ в системе не изменяет его концентрации в фильтрате. При изменении скорости фильтрации сохраняется закономерность, при которой эффективность элиминации ТНФ выше при нескольких циклах фильтрации, чем при одном.

С целью количественной оценки реальной способности колонки с иммобилизованным МГ-МА, сорбировать ТНФ, фильтрацию ТНФ-содержащих жидкостей проводили через колонки с двукратно уменьшающимися количествами ингибитора. Объем колонок был во всех случаях одинаков. Уменьшения количества МГ на колонках достигали разбавлением геля с иммобилиизованным МГ неактивированным гелем (Сефароза СЬ-4В). При снижении количества иммобилизованного МГ-МА на колонке эффективность сорбции ТНФ постепенно снижалась и на колонке с содержанием МГ 125 мкг/мл геля при скорости фильтрации 20 мл/час сорбировалось около 50 % от всего ТНФ, нанесенного на колонку.

Несмотря на достаточно высокую эффективность сорбентов МГ-фибринолизин по элиминации ТНФ, в дальнейших опытах мы отказались от использования такой формы МГ. Основными причинами этого явились следующие соображения. Выпуск препарата "фибринолизин" в настоящее время прекращен, а его чистота по данным электрофореза в ПААГ не превышает 20-40 %. При контакте сорбента с кровью (сывороткой, плазмой) возможна активация фибринолиза, гидролиз фибриногена и другие трудно прогнозируемые эффекты. Стабильность высокомолекулярных комплексов МГ-плазмин не превышала 7 суток (по гидролизу Ы-карбобензокси-Ь-лизин паранитрофенилового эфира). Напротив, при хранении в холодной комнате сорбента МГ-МА (при добавлении в качестве антибактериального агента 0.01% раствора азида натрия) снижения емкости колонок по сорбции ТНФ не происходило в течение 20-30 суток (5 наблюдений).

В развитие этих экспериментов мы провели попытку удаления эндогенного ТНФ из сывороток крови больных с верифицированным диагнозом септический шок (5 наблюдений) и с исходной активностью ТНФ от 4,1 до 14,5 Ед/мл. Использовали микроколонки объемом 2 мл, с содержанием МГ-МА 1 мг/мл. Во всех опытах после пропускания сывороток через сорбенты цитотоксическая активность ТНФ в фильтратах не определялась.

Мы проверили антикомплеменгарное действие препаратов МГ, полученных из плазмы крови человека, а также иммобилизованного МГ. Эти эксперименты были проведены при содействии сотрудников кафедры биохимии профессора Л.В. Галебской и к.б.н. И.Л. Соловцовой.

В большинстве случаев (при использовании препаратов МГ, выделенных из разных образцов донорской плазмы), достоверного влияния на скорость лизиса и емкость комплемента отмечено не было, что согласуется с данными В. Серхана (1989). Сложность трактовки результатов таких опытов заключается в том, что любая цельная сыворотка крови уже содержит МГ в достаточно высокой концентрации. Поэтому повысить концентрацию ингибитора в инкубационной смеси более чем в 3-4 раза не удается. Кроме того, мы попытались оценить влияние препаратов МГ, иммобилизованных на сефарозе СЬ 4В, на систему комплемента донорских сывороток крови человека.

Смешанные сыворотки элюировали через сорбенты (объем геля 2 мл) с нативным и обработанным метиламином МГ в одинаковых концентрациях (1 мг/мл) при скорости 5-20 мл/час и с остановкой процесса элюции на 30 мин после нанесения образца на сорбент для усиления процесса взаимодействия. Эксперименты проводили при 4°С и комнатной температуре (20'С). В качестве контроля фильтровали образцы тех же сывороток через колонки того же объема, содержащие сефарозу СЬ 4В.

Было показано, что препараты иммобилизованного МГ снижают скорость комплементзависимого лизиса (клетки-мишени - эритроциты барана или кролика ) в среднем на 60-80% с учетом разведения сывороток в процессе хроматографии, а также емкость системы комплемента. Температура проведения хроматографических процедур не имела существенного значения, что свидетельствует в пользу предположения о сорбции некоторых компонентов комплемента на МГ.

Препараты МГ, и нативные, и после обработки метиламином, примерно одинаково эффективно угнетают комплемент. Вероятно, это объясняется взаимодействием МГ с фактором СЗ, однако, это предположение, высказываемое нами вслед за И. Ве11о1 (1991), требует дальнейшего изучения.

Влияние специфических антител па антипротеииазную функцию а-2-макроглобулина и его взаимодействие со стрептолизином О.

При большинстве острых инфекционных и других воспалительных заболеваниях в плазме крови возрастает концентрация белково-пептидных молекул, получивших название «реактанты острой фазы». Центральную роль в группе этих молекул занимает С-реактивный белок. Мы попытались изучить возможность взаимодействия МГ и С-реактивного белка с белковым экзотоксином, продуцируемым патогенными стрептококками, - стрептолизином О, в модельных системах. Для изучения гемолитической активности стрептолизина О (коммерческий препарат НИИ вакцин и сывороток, С.-Петербург) было проведено определение его гемолитического титра.

Было показано, что С-реактивный белок дозозависимо угнетает токсин-зависимый гемолиз. 50%-ное угнетение лизиса соответствовало конечной концентрации С-реактивного белка 2.3 мкг/мл (Я7 1.5*1(Г8 М). Во второй серии экспериментов с препаратом нативного МГ получили так же дозозависимое угнетение гемолиза, вызываемое стрептолизином О. 50%-подавление гемолиза соответствовало конечной концентрации МГ 16 мкг/мл. Т. о., сопоставляя результаты этих экспериментов, можно сделать вывод, что оба протеина обладают антитоксическим, антигемолитическим действием. По-видимому, главную роль в предотвращении гемолиза в сосудистом русле играет макроглобулин, так как его концентрация в плазме крови на несколько порядков выше, чем в наших модельных опытах. Концентрация же С-реактивного белка в плазме крови редко достигает 2-10 мкг/мл и только при острых воспалительных заболеваниях или травмах, через некоторое время после развития патологического состояния. В экспериментах с препаратом МГ, обработанным метиламином, с последующим диализом, наблюдали торможение гемолиза при значительно более высоких концентрациях протеина (50% угнетение гемолиза соответствовало концентрации ингибитора 0.5 мг/мл). Этот белок является одним из наиболее полно изученных экзотоксинов цитолитического действия. Однако, механизм вызываемого им повреждения мембран до конца не известен. Считается, что прочное связывание олигомеров О-стрептолизина с холестерином мембраны дезорганизует билипидный слой мембраны и инициирует полимеризацию токсина на поверхности клетки с образованием доступных электронной микроскопии кольцевых структур, определяющих диаметр и форму мембранных пор, аналогично действию полиеновых антибиотиков.

Можно предположить, что механизм антитоксического действия С-реактивного белка и МГ сводится к гидрофобно-электростатическим взаимодействиям этих белков с олигомерами О-стрептолизина, в результате чего блокируется фиксация токсина на эритроцитах и/или прерывается образование кольцевых структур, формирующих поры в эритроцитарной мембране. Схожесть механизмов действия МГ и С-реактивного белка на стептолизин-зависимый гемолиз подтверждается и близкими молярными концентрациями протеинов, которые замедляют гемолиз и выявленная конкуренция между этими белками.

При некоторых аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка) в крови обнаруживают аутоантитела к МГ. Для изучения влияния специфических антител (^ О) на антипротеиназную функцию МГ был поставлен ряд экспериментов, описанный ниже.

Из литературных данных известно, что молекула МГ способна к связыванию двух молекул небольших ферментов, например, трипсина, но только одной молекулы плазмина. Этот феномен объясняют близостью расположения реактивных центров в молекуле МГ. В серии экспериментов изучали способность ^ блокировать реактивные центры МГ. При постоянной концентрации МГ добавляли возрастающие количества ^ и через 30 минут вносили в инкубационную смесь количество трипсина, достаточное для связывания препарата МГ. Избыток трипсина инактивировали добавлением ингибитора трипсина из бобов сои. Образование комплексов МГ-трипсин регистрировали по гидролизу И-а-бензоил-Ь-аргинин паранитроанилида

спектрофотометрически. При молярном соотношении МГ/1§, соответствующему максимуму преципитации (регистрировали иммунохимической фотометрией при 450 нм), связывание МГ с трипсином уменьшалось не более чем на 10 %. При дальнейшем увеличении концентрации ^ связывание МГ с энзимом пропорционально уменьшалось вплоть до 15 % от исходного. В то же время, добавление 1§ к уже сформированным комплексам МГ-трипсин не влияло на гидролазную активность этих комплексов.

Таким образом, при иммунизации животных препаратом МГ человека синтезируются АТ как против реактивных центров МГ, так и против других участков его молекулы. Несмотря на значительные размеры оба реактивных центра МГ, по-видимому, способны к одновременому связыванию антител. Такое связывание приводит к существенному ослаблению антипротеиназной функции МГ.

Заключение

Анализ результатов нашей работы и последних данных других лабораторий позволяет сформулировать несколько положений, описывающих результаты взаимодействия МГ и пептидных молекул.

Нативиый МГ способен к нековалентному связыванию небольшого числа пептидов, поступающих в кровеносное русло (ИЛ-6, трансформирующий фактор роста ß2). Выполняя транспортную функцию, он защищает их от действия малоспецифичных протеиназ. Таким же образом МГ взаимодействует и с некоторыми протеинами, например, ключевым ферментом катаболизма липидов липопротеинлипазой (Vivella 1994). Таким образом, можно предполагать, что комплексирование цитокинов с нативным МГ in vivo может усиливать их биологическое действие за счет: во-первых, - предохранения их от разрушения малоспецифичными протеиназами и во-вторых, за счет уменьшения почечной фильтрации (клиренса) свободных пептидов. В клеточных культурах нативный МГ не оказывает существенного влияния на цитокиновую активность.

Известно, что плазменная трансглутаминаза (фактор XIII системы свертывания крови) и менее изученные тканевые трансглутаминазы ускоряют включение первичных аминов в белковые субстраты за счет образования изопептидных связей. Эти ферменты катализируют инкорпорацию первичных аминов и пептидных молекул внутрь МГ. Именно в момент образования F-формы МГ способен ковалентно связывать некоторые ростовые факторы и инсулин с утратой их биологической активности. Такие комплексы должны быстро выводиться из кровотока за счет связывания с LRP-рецепторами плазматических мембран гепатоцитов и других клеток. Можно предположить, что по такому же механизму происходит взаимодействие некоторой части других пептидов с МГ в кровеносном русле, где постоянно происходит активация протеолитических каскадных систем, а следовательно и взаимодействие протеиназ с S-формой МГ и его переход в F-форму. Этим можно объяснить данные некоторых авторов (J. Bonner (1992) и др.) о «частично» ковалентном характере взаимодействия МГ с некоторыми пептидными молекулами, а также данные о «некотором снижении» биологической активности цитокинов в составе комплексов с МГ. Возможно, цитокины, способные комплексироваться с S-формой МГ, более предпочтительно будут ковалентно связываться с ингибитором в момент разрыва тиолэфирной петли под действием протеиназ, чем другие молекулы. Это предположение, однако, требует тщательной проверки. В то же время не

вызывает сомнения, что судьба ковалентно связанных с МГ пептидных молекул предрешена: вместе с белком-носителем (МГ) они будут захвачены внутрь лизосом гепатоцитов или макрофагов и в результате тотального протеолиза превратятся в набор аминокислот для дальнейшего строительства белковых молекул.

В большинстве своем пептиды, по-видимому, способны к нековалентному взаимодействию с Р-формами МГ. Однако, механизмы таких взаимодействий существенно различаются, а влияние комплексообразования на биологическую активность цитокинов однозначно определить не представляется возможным. С одной стороны, это обусловлено широтой спектра действия цитокинов. С другой стороны, МГ способен взаимодействовать с протеиназами различной специфичности. Полученные нами данные о взаимодействии ТНФ и ИЛ с различными формами МГ позволяют сформулировать следующее положение: биологическое действие таких сложных надмолекулярных комплексов, по-видимому, определяется как специфичностью протеиназы, комплексированной с молекулой МГ, так и физико-химическими и биологическими свойствами самого пептида и его рецепторов. Другим обстоятельством, которое необходимо учитывать при оценке влияния МГ на биологическое действие пептидов, является наличие или отсутствие экспрессии Ы1Р-рецепторов на клетках-мишенях цитокинов. Бивалентные по отношению к ТНФ молекулы МГ-МА усиливают цитотоксическое действие цитокина. Одним из возможных механизмов этого усиления может служить "сшивание" стимулированных ТНФ-рецепторов на поверхности клеток-мишеней.

Конкретные результаты комплексообразования в значительной степени зависят от концентрации МГ и других сывороточных ингибиторов протеиназ, протеолитических ферментов, а также количественного и качественного состава лимфоретикулярных клеток в микроокружении. Следует заметить, что существует большое количество нормальных и патологических состояний, при которых уровень МГ резко повышен. К ним можно отнести высокий уровень МГ в процессе развития плода, у детей и беременных. Значительное повышение уровня МГ наблюдается при диабете, атопических дерматитах, нефритах и других заболеваниях.

В настоящем исследовании впервые было показано, что МГ, иммобилизованный на активированной бромцианом сефарозе, сохраняет присущую ему биологическую активность ингибитора протеиназ (на примере ингибирования трипсина). Переведенный в Р-форму непосредственно на колонке, МГ приобретает способность связывать

ТНФ. При сравнительном изучении метиламина и трипсина в качестве «активаторов» МГ были показаны преимущества метиламина в случае пропускания через колонку сыворотки крови, содержащей ТНФ. Возможно, что низкомолекулярные ингибиторы протеиназ, находящиеся в крови, связываясь с МГ-трипсином, блокируют возможность фермента разрушать пептидные молекулы.

В нашей работе впервые показано, что с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным МГ-МА можно снизить содержание ТНФ в биологических жидкостях в два и более раз. При двух циклах фильтрации ТНФ-содержащих жидкостей через колонки с иммобилизованным МГ-МА по замкнутому циклу уровень ТНФ уменьшался более чем на 90% от исходного (10000 Ед/мл). Проведенные расчеты показывают, что эффективность сорбции ТНФ на предложенных нами колонках не ниже, чем у колонок для иммуноаффинной хроматографии с использованием моноклональных антител (10-20% от теоретически возможной).

Другим важным свойством сорбента, содержащим препарат человеческого МГ, является обнаруженная нами его способность угнетать систему комплемента. С общебиологической точки зрения трудно объяснить смысл взаимодействия макроглобулина и компонентов этой протеолитической системы. Считается доказанным, что МГ не угнетает отдельные звенья протеолитического каскада комплемента. Однако, это не исключает возможности влияния МГ на комплемент-зависимый гемолиз. Впервые это было продемонстрировано в экспериментах с макроглобулином крыс. Механизм этого твердо установленного феномена до настоящего времени остается неизвестным. Полученные нами данные об угнетении скорости комплементзависимого лизиса эритроцитов и емкости системы комплемента препаратами иммобилизованного МГ позволяют предположить, что при использовании таких сорбентов для элиминации цитокинов из крови больных можно рассчитывать и на иммунносупрессивный эффект, что в некоторых случаях может быть весьма полезным для пациентов.

Завершая обсуждение полученных результатов, мы попытаемся сформулировать несколько новых положений относительно белок-белковых взаимодействий а-2-макроглобулина, которые могут иметь предсказательную силу. Специфичность связывания МГ с биологически активными белково-пептидными молекулами подтверждается фактами различного сродства Б- и Р-форм МГ по взаимодействию с ними. В своей нативной конформации МГ связывает пептидные молекулы непрочно, нековалентно. В то же время эти взаимодействия, по нашему мнению,

могут играть важную роль для транспорта этих молекул и в предотвращении их токсического действия на клетки организма. Способность Б-форм МГ взаимодействовать с белково-пептидными молекулами непосредственно зависит от его ангипротеиназной функции, которая без сомнения остается главной, ведущей функцией этого протеина. Проведенные исследования показывают, что комплексированный с протеиназами МГ в сосудистом русле - это не просто минорный компонент плазмы, не «мусор», который убирают макрофаги, а важный фактор транспорта, модификации активности, а в некоторых случаях и элиминации цитокинов и других белково-пептидных молекул. Можно предположить, что несущий на себе сорбированные молекулы МГ выполняет функцию посредника между внеклеточным протеолизом (в сосудистом русле) и внутриклеточным протеолизом, который, без сомнения, играет важную роль в организме. Изучение дальнейшей судьбы молекул, транспортируемых МГ к рецепторам, находящимся на клеточных мембранах, особенно после их проникновения внутрь клеток, представляется актуальной задачей энзимологии, цитологии, иммунологии и других смежных отраслей науки.

Выводы

1. Разработана новая, "мягкая" методика выделения и очистки а-2-макроглобулина человека из плазмы крови человека, включающая повторную гель-хроматографию, диализ и ультрафильтрацию; эта методика позволяет максимально сохранить нативные свойства этого белка.

2. Установлено, что препараты нативного а-2-макроглобулина не связывают человеческий туморнекротизирующий фактор а (ТНФ), в то время как комплексированный с малоспецифичными протеиназами макроглобулин инактивирует этот цитокин.

3. Макроглобулин, комплексированный с плазмином или подвергнутый модификации метиламином, нековалентно связывает ТНФ в молярном соотношении соответственно 1/1 и 1/2.

4. ТНФ и интерлейкины 1 и 2 конкурируют между собой за обладание сайтами на поверхности а-2-макроглобулина, экспонированные после его перехода в Р-форму.

5. Комплексы туморнекротизирующего фактора а с макроглобулином обладают существенно более высокой биологической активностью, чем свободный цитокин, вызывая "кэпинг" специфических рецепторов на поверхности клеток-мишеней.

6. Подобно С-реактивному белку, a-2-макроглобулин снижает скорость гемолиза, вызываемого О-стрептолизином.

7. Разработан метод получения аффинного сорбента на основе высокоочищенного a-2-макроглобулина и подобраны оптимальные условия для элиминации ТНФ а из растворов, а также из сыворотки крови больных людей.

8. Препараты иммобилизованного a-2-макроглобулина способны снижать скорость комплементзависимого лизиса эритроцитов и емкость комплемента сыворотки крови человека.

9. С помощью разработанных методов определения макроглобулина и его комплексов с протеиназами в очищенных препаратах и в сыворотке крови показано, что в условиях гипертермии у человека изменение уровней этих показателей коррелирует с типом регуляции вегетативной нервной системы, тепловой устойчивостью организма и выраженностью острофазного ответа.

10. На основе полученных результатов сформулированы новые представления о биологической роли a-2-макроглобулина как полифункционального протеина, в частности о существенном вкладе его антипротеиназной функции в реализацию избирательного взаимодействия с белково-пептидными молекулами.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. Бурейко A.C., Дорофейков В.В., Щербак И.Г. Газохроматографический способ определения эстеразной активности протеолитических ферментов с помощью непрерывной газовой экстракции. // Вопр. мед. xhmhh.-I994.-t.40,-N3.-C.57-58

2. Цыбулькин Э.К., Бондарев Н.Э., Фрейдлин И.С., Дорофейков В.В., Жебрун A.B., Кузнецов С.И., Резник Л.В., Фрейдлин Т.С., Щербак И.Г. Новые стратегические подходы к лечению септического шока. // Международные медицинские обзоры - 1994,- N5.- C.3S 1-355

3. Фрейдлин И.С., Бондарев Н.Э., Дорофейков В.В. Взаимодействие фактора некроза опухолей альфа с активированной формой альфа-2-макроглобулина. // Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний.- С.-Пб., BMA, 1993.- С. 175

4. Галебская Л.В., Щербак И.Г., Бельтюков П.П., Дорофейков В.В. Структура и свойства внеклеточных белковых регуляторов протеолитической фазы активации системы комплемента. // Биохимия- 1995,- т.60, N5.-C. 668-677

5. Дорофейков В.В., Савинов И.П., Ситкевич Р.В., Петрова H.H. Протеолитическая и антипротеолитическая система крови у больных хроническим панкреатитом. // Весгаик хирургии,- 1988.-Nll,-C.30-33

6. Бондарев И.Э., Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С., Бондарев Н.Э. Улучшенный способ выделения альфа-2-макроглобулина из плазмы крови человека с использованием геля

TSK-60. // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. С-Пб., ВМА,-1994.-Вып,25,-С.12

7. Фрейдлин И.С., Бондарев И.Э., Дорофейков В.В., Бондарев Н.Э. Быстрый и простой способ исследования комплексообразования между фактором некроза опухолей и альфа-2-макроглобулином. // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. С-Пб., ВМА,-1994.-Вып.25,- С.94

8. Бурейко A.C., Дорофейков В.В., Щербак И.Г. Способ определения эстеразной активности протеолитических ферментов. // Бюлл. изобретений и открытий,- 1995.- N3- С. 160.-Патент RU N2027764

9. Субботина ТФ., Дорофейков В.В., Бондарев И.Э., Бондарев Н.Э. Быстрый и чувствительный способ определения активности очищенных препаратов цистеиновых катепсинов. // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике, С-Пб., ВМА-1994,-Вып.25,- С.85

10. Бондарев И.Э., Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С., Фрейдлин И.С., Щербак И.Г. Цитотоксическая активность комплексов, образующихся при взаимодействии туморнекротизирующего фактора а с а-2-макроглобулином // Бюлл. эксп. биологии и медицины,- 1996,- т. 121, N6.-C. 673-676

11. Бондарев И.Э., Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С., Фрейдлин И.С., Щербак И.Г., Цыбулькин Э.К., Жебрун А.Б., Кузнецов С.И. Аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли и способ его получения. Н Бюлл. изобретений н открытий,- 1998, N36.-C. 298,-Патент1Ш N 2123860.

12. Бондарев И.Э., Дорофейков В.В., ФрейдлинТ.С., Фрейдлин И.С., Щербак И.Г., Цыбулькин Э.К., Жебрун А.Б., Кузнецов С.И, Способ удаления туморнекротизирующего фактора из жидкой среды. // Бюлл. изобретений и открытий.- 1998, - N16,-С. 265,- Патент RU N2112553.

13. Дорофейков В.В., Щербак И.Г. Средство для стерилизации и отмывания от биологических жидкостей. // Бюлл. изобретений и открытий,- 1998, - N 12,- С. 52,-Патент RU N2077890.

14. Дорофейков В В., Фрейдлин Т.С. Этимологические методы определения альфа-2-макроглобулина и антитриптической активности плазмы крови. // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии,- С.-Пб,-1998, т.2,- С.537-543

15. Бондарев И.Э., Дорофейков В В., Фрейдлин И.С. Конкуренция интерлейкина 1 и шггерлейкина 2 с туморнекротизирующим фактором альфа за связывание с альфа-2-макроглобулином в F-форме. //Сборник научных работ 1 факультета ВМА.-1995,-С.23

16. Дорофейков В.В. Использование современных хроматографических материалов в очистке альфа-2-макроглобулина человека. // Актуальные проблемы внутренней медицины и стоматологии,- С.-П6.-1997, ч.2,- С.67

17. Дорофейков В.В., Афанасьева М.В. Влияние гипертермин на общую протеолитическую активность и активность эндогенных ингибиторов протеиназ плазмы крови человека. // Актуальные проблемы внутренней медицины и стоматологии.- С.-Пб,-1997, ч,2,- С.62

18. Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С. О взаимодействии эндогенного ингибитора протеиназ альфа-2-макроглобулнна и фактора некроза опухолей.// IV Симпозиум по химии протеолитических ферментов.-Москва,-1997,- С.18

19. Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С., Бондарев И.Э., Кузнецов С И,, Фреидлин И.С., Галсбская Л.В., Соловцова И J1. О свойствах иммобилизованного альфа-2-макроглобулина

тааека. И Материалы Второго съезда биохимического общества РАН,- Москва,- 1997,-U9

20. Банников Л.В., Дорофейков В.В., Фрейдами Т.С. Зависимость острофазного ответа моделированную у людей гипертермию от тала нервной системы. // Иммунояогия,-1998,->,-С.11-12

21. Дорофейков В.В., Фрейдлин Т.С. Альфа-2-макроглобулин хак острофазный белок азмы крови. // Актуальные вопросы клинической диагностики и лечения,- С.-Пб.-ВМА, 99, ч.2,- С.447-448

22. Дорофейков В В., Косицкая Л.С., Фрейдлин Т.С., Щербак И.Г. Взаимодействие а-2-яроглобулина со специфическими антителами. // Медицинская иммунология.-1999, тЛ, К-С.12-13

23. Кузнецова С.А., Косицкая Л.С., Колосков А.В., Дорофейков В.В., Фрейдлин И.С. иукция провоспалитсльных цитокинов in vitro иммунными комплексами, выделенными из [азмы крови больных ревматоидным артритом. П Медицинская иммунология .-1999,- т.1, К-С. 17

24. Банников А.В., Дорофейков В.В., Фрейдом Т.С., Фрейдам« И.С., Шустов Е.Б., Щербак И.Г., Ястребов Д.Ю. Особенности острофазного ответа у людей с различным типом гуляции вегетативной нервной системы при моделированной гипертермии. // Российский виологический журнал им. И.М. Сеченова,- 2000.-г.8б, №1С.4) -45

25. Дорофейков В.В., Щербак И.Г., Фрейдлин Т.С., Фрейдлин И.С. Белок-белковые аимодействия альфа-2-макроглобулина и их функциональные последствия. // Ученые писки,-2000,-т.7, N1,- С.75-77

26. Галебская Л.В., Дорофейков В.В., Субботина Т.Ф., Фрейдлин Т.С., Смирнов Д.А. ктивность некоторых протеолигических белков и эндогенных ингибиторов протеаз ловеческой крови у больных с ишемической »ндотоксемией. // Актуальные проблемы рдечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии.-1999, -СПб,- С.33-34

27. Дорофейков В В., Щербак И.Г., Фрейдлин Т.С. a-2-макроглобулин как главный ггокинсвязывакнций белок плазмы крови. // Медицинская иммунология,-1999,- N5.- С.5-12

28. Doropheikov V. V., Freidlin T.S., Scherbak I..G. TNF-a binding by a-2-macroglobulin as i antiinflammatory or proinflammatory mechanism. // Intensive Care Medicine-1994,- V.20.-jpl.l.-P. 239

29. Doropheikov V.V., Bondarev I.E. Complex formation between TNF-alpha and alpha-2-acroglobulin, cytotoxic activity of these complex. // 801 International Congress of Europian >ciety of allergology and immunology ,-Stocholm.-l994, P.231

30. Kouznetsova S., Kosytskaja L., Doropheikov V., Freidlin I. In vitro induction of cytokint cretion by immune complexes isolated from plasma of pathions with revmatoid arthrities. // юск.-2000,- V. 7,-Supl.l.-P. 72