Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная экспрессия потенциальных кольцевых каналов нейронов больших пiекуль мозга та мозочку щурiв в ооцитах Xenopus laevis

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная экспрессия потенциальных кольцевых каналов нейронов больших пiекуль мозга та мозочку щурiв в ооцитах Xenopus laevis"

РГб од

АКАДЕШЯ НАУК УКРА1К1

ШСТИТУТ Ф1310Л0ГП 1 м. О. О.БОГОМОЛЬЩ

-.»■с»

На правах рукспису УЗШ 577.352.5

ЛЮБАНОВА Ольга Петр1вяа

5УЕЩ1СШШ>М ЕЯСПРЕС1Я ПОТЕЩШВАЛЕКИИХ !ШЬЦ1еВИХ КАНАЛВ НЕЯРОН1В ВЕЛ2П!Х П1КШЪ МОЗКУ ТА 1Ю30ЧКУ ЦУР1В В ООЦНТАХ Хстрия 1гс-.чг,

Спец1альн1сть: ф13юл0пя людини та тварин - 03.00.13

Автор' е ф-е р а г дисертаци на эдобуття наукового ступени . кандадата бюлопчних наук

Ки1в - 1903

Робота вжонана б Институт! ф1зюлогП 1м.О.О.Богомольца АН УкраШг. Науковий кер1вник - академ1к Костюк П.Г.

0фЩ1йн1 опоненги:

академк. АН УкраПш „ Скок В.1.

доктор 61олог1чних наук Бурдига Ф.В.

ПроЕ1дна установа - 1нститут ф131ологп Кк1вського УШверситету

1м. Тараса' Шевченка

" 19эЗр.

Офщший захист дисертацП в1дбудеться на зас1данн! спец1ал1зоЕано! ради Д-016.15.01 при 1нститут1 ф1з1олог11 1м.О.О.Богомольця АН Укра1ни за адресою м. Ки1в, вул. Богомольца, 4.

3 дисертац1ею можна познайомитися в б1бл1отец1 1нституту ф1з1олог11 2м.0.0.Богомольца АН Укра1ни.

Автореферат роз 1 маний

, . 19эЗ).

Ечений секретар спец1ал1зовано1 ради доктор бюлолчних наук

3.0.0орокхнаЫар1на

ЗЛГЛШ>НЛ ХАРА11ТЕ?ЯСТША РСБОТИ "'

АКТУАЛЫПСТЬ ПРОБЛЕМ!. В результат! дссл1д*ень останШх рок!в було виявлено три тши кальШевих кгяал!Е, так зван! каяаля Lv N. та Т тип1в (Fox 87). Нещодавно це с!мейство канал!в було доповнено яовим представником' - Р каналом,. який мае в!днссно високкй;по-тенц!ал активацП та переваяно зустр!чаеться в нейронах Пурк1н'е та в гранулярких кл1тинах мозочку ссавЩв (LÍinas 89, Bertollno 92). Головною характеркоэ рйсою Р-типу каналу" е йоГо• "високз ст1йк1сть до таких ефективних кальШевих антагонист 1 в я!с дипдрошридикн та w-кояотокснн, 1 в той же час специфична чут-лив1сть до окремих фракц!й токсину павука Ag-élenop^is aperta:.'

0станн1ми рокащ на меж1 молекулярног ' 61олог1i, -бюхШП, мем0ранко1 б1оф1зики та кл1тишго1 нейроф1о1олог11 народився "нозий перспективна напрямок у вивченн1 юняих какал1в, який базуеться на програмованому синтез! 61лк1в з ооцитах Xenopus за допомогою еукарютичних РНК,. одержаних з р1зноман1тяих орган1зм1вв1д рослин до ссавЩв. Цей метод, вперае описаний Гьордсном на початку 70-х рок1з (Gurdcn 71), в наш час е яайефекглвя12мУ: засобом -досл^женяя функцюнальноГ експреси б1лк!в. За допомогою кього зхе вивчено функцюнальну екепрес!ю рецептср1з та канал1в з р1зних тканин. Одним 1з зассб1в тестування 61олог1чно1 активност1 б!лк1в р_лептор1в та Юняих канал1в, як! вбудован! в мембрану кл!тжи, е метода електроф1г1олог1чно1 реестрацп !нте?ральких еле'-трнчних с'трук1в та CTpyi-íiB м1крод1~лянок мембраяи (петч-клемп). :3 другого беку, при використанн! екслресованих з мембран1 соцкт!в б1лк!в', як моделей Юнкях какалi в та рецептор1в, можна Еивчати техн1чно складя! питания електроф1зюлог11 у Ясному зв'язку з проблемами бюгенезу цих б 1лков/ос-структур. Для EHpimeHHH фундаментальних питань б1оге-незу. юнких канал1з. а саме 1 - механ!зм експресП гешв та II pe-гулящ я', трансляЩя та посттрансляц1йн! модиф1кац11, вбудова ка-нальних б!лк1в у мембрану - не без yenixy використовувались 51ох1м1чн1 та молекулярнсб!олог1ч1 п1дходи (Catteral 83, Rossio 87, Pinchuk 89, Малишеза 89), але найб1льш перспективним в цьему план1 виявляеться метод експресП чу*ер!дно1 геяетичио1 1нформац!1 в ооцитах, особливо тепер, колй стало можливим зд1йснюьати в них

синтег мутантних б1ж!в .п1сля 1н'ёкц11 клрнованих ДНК, як1 бул) П1ддан1 ..генегачшш тн!пуляшям 80)..

Вкб 1 р теми натах досл№ень був зумозлений тим, цо одн!ею ! недостатньо визчених галузой з'функШснальна екслреспя потенЩал-'занекких калъщевих: канал!в. Зокрема, надзвичайно вагливими вкяв-ляэхьск питания про; причини гомогенное?1 популяЩй каная1в, щ< екепресуються, та про мзялкв'сть незалежнег експресП р1зних типИ калыЦевпх канал ¡з," про механизми б'.огенезу, а такоя про моя-лие1сть використанкя таких ''кивих моделей" канал1в для б1лыа детального вивчення 1х структури, елекч'рофШолопчких властивосте* та 1х фармаколог 1чно1 модуляцп. .

2Ш роботи яолягали в тому, цоб: 1/ з'ясувати мохлив1ст£ дифферент йовако! експресП в ооцитах Хс-пориэ кзльЩевих канал!в, цс керуюгься потенц!алсм з. нейрон!б великих Швкуль мозку- та мозочк$ щур1в; ■

2/ показати, що кальц1ев1 какали Г типу, як1 не1нактизуються та м* ють високий пог'г актизацП, являить собою окремий, гекеткчнэ обу-мовленяй тип канал!"в.

:ЗАВДА1НЯ.роботи: 1.Вид!лення двох препарат1з функционально активно! сумарноI ыатричко! РНК з великих Швкуль головного мозку Тс мозочку иур1в.

2. 1ндукування задояомогою мРКК експресП потскЩалзалежних , кальЩявих канал!в в.мембран 1 ооцит1в ХопориБ. '

3. 11ор1вняльне - досл!дкекня електроф1зюлог1чш:х та фармаколог 1чнкх властивостей експресованих кальц1евих какал!в з р1зни> структур-головного мозку шур1з. :

НДУКОВА .НОВИЗНА.- Показано, цо сумарна РНК головного мозку цур!в, п1сля фракцЮнування в градиент! сахарози, приводить до по-яви в мембран! ооциПв потенЩалзалежних калыЦеэих канал1в, амшЦтуда струшв через ^як1 досягае 1 мкА, в той чао як п1сля 1н'екци 1ндив!дуальних та полКА)-:- мРНК амгштуди струм1в, що експресуються буди в 5-10 раз!в мекли СМэг! 91, Герасименко 91). Цей факт змушуе по новому п1д1йти до гштанкнл про молекулярну структуру кальшевих канал 1 в та функщ сяальку роль окремих' субоди-ниць.

- о - <

Вперше встаноЕлено, що- в результат! 1н'екцп препарат!в РНК, шд1лених з р1зних структур мозку, в мембрая1 оодит!в з1д6увавться Шфференц1йозана експрес1я кальШевих канал!в за концент->ац1йно-залежнкм "механ1змом. При иьому 1н'екц1я мозочково1 РНК ¡ризводить до появи в осцитах канал1в, як1 за сео1ми зластивостями )лизьк1 до Р типу-, а 1н'екц1я РКК великих Швкуль - до появи ка-;ал 1 в, близьких до N типу-кальщевих канал 1 в кейрональних мембран.

Експресозан1 кальц1ев1 капали мозочку не виявляють чутл»-?Е0ст1' ю днг1дрол1ридкн1в та w-конотоксику, ала пригн1чузоться FTX -рракшею отрути павука Agelenopsis aperta, а експресован1 сальц!ев1 .каната великих швкуль проявляють ет1йк1сть до ШГ!дроп!риднн1в та FTX, але пригшчуються w-конотоксином.

Представлен!" результат! дають можливють ствррдяувати, що з1докреилення особливого Р-типу кальШеЕИх канал!в • е генетичко збумовлеяим.

ПРАКТИЧНА ЩННГСТЬ РОШТИ. Сдер.тлн! дан! виосять суттешгй ;!слад з розвиток уявлень про бЮгенез мембранних 1о;ших*ка:1ал1в та Ix молекулярну структуру.

Боки ма-зть фундаментадьне значения для досл1дясеккя питань ipocTopoBol функц!овально1 гетерогенное?! мекбрашшх 1онних ка-¡ал!в в ШС.

. Представлен! результата можуть бути вккористан1 аул досл!джен-13 та 1нтерпретац! I слецкф1чних йармзколопчнкх вшшв1в и? нейро-;альн1 процесса, як1 задежать в!д кальцио.

АПРОБАЩЯ РОЕОТИ. Матер 1аш диссертацП допов!дались та обгово-.эязались ка зас!данн! сектору нейроф1зюлог11 Ihct:i .ту ф1з1олог!I LH. O.Q. Богомольца Ali Укра1ни, на радянс ько-кiмгцькому сиипоз!уШ 'Збудлив1 иеибрани" (1991 р., Ки!в), представлен! у вигляд! стен-iosol допов1д! ка. ы!кнгродл1й роботй нарад! "Механ1зш кальЩево-го гоыеостаау кл1тин, як! збудяугггьеа" (1933 р., Kala), а такоя ^одноразова допов!далися та обгсворювзлися ка загально1нститутсь-сому сем!нар1 з иолекухярно! ф!з!ологп.

OB* Ш ТА СТРУКТУРА ЛИССБРТАШ!. Диссер7?.ц!я екгздаетьей 3 введения, л1тературного огляду, описания метод1в та експеринентальноГ ?астини, обговорекня, 8 виснсвк1в та списку лиератури з 193 каЯ-«енуваиь. Робота викладека на 104 стор!нкзх друкованого текст/ Сбеэ мзлшк!в), 1ллюстрована 23 >,алшкзмл та 1 таблицею.

За матер!алаш дксергацИ олублИсовано 5 роб!т.

К2ТЩИКА ДСОЛЩЕНЬ .

Експреош г.оте^Шасзалекн'лх . каяыпевих канал1 в ' викликали Ih'skuKs сумар>ю1 РНК, ягл була ЕИдЫека за однЛею з кодиф1кац1й метода- Агффрел (Aufr"rayv PO) та Стародуба (Стародуб 86) з внко-ристакпям хлористого л1т1п та сечсвинк. Для одержання .РНК вико-. риетовували гюредшй мозок (близ.ько о г) та мозочок (близькс 3 г) трмтижкевчх шурят. Кочснкй препарат окрено гомэген!зували на льсду протягсм £0 секунд в десятикратному oC'ewl охолоджекого до -10 С розчину: GM LiCl та 6!1 сечй'пчгл. Гоногекат ьптримували 16 гсдан при температурi -10 С, п1еля чего цен?ри$угували ГО хвилнн при 16 тис {■ на иек?рифуз1 К-24. Осад дв!ч1 депрэтеШзували фенолом. Шсля иъого ?ЛК переосадаузали тр:-!Ч1 70% етанолом (Clemens 84). "£йх1д cy.vapHOI РНК, як правило, становиз близько 0,1% в{д маси ви-користаноI тканини.

К-лькклъ та чистоту препарату РНК ощкюьали на спектрофотометр! СФ-23 за його поглинанням при 260 та 2S0 км. Поглинання розчину 1 мг/мл PI . дортнгое 23 одиницям оптичкого поглинання при 260 нм, незабрудненз РКК мае вШюлення пог.яинань при 250 та 280 т/. 2.0 (Clemens 84).

Шсля видЫелня сумарно! РНК було проведено розд1лекня II за роамхром'в град1ент| щ!льнсст1 сахарози (Clemens 84). Град1ент сахарози 10-25% створювали за долсмогою ьмигувача ф!рми "Pharmacia" та пер1отальтичких насос1в. Розчини сахарози готувалк на буфер1: 10 Ш трю-хлор; 0,1% меркаптоетанол; 10 мМ ЕДТА, 0.17., лаур1л -саркозил СрН 7,5). Головна проблема при Фракцюнуванн1 полягае в тому, цоби укккнути агрегат I РЖ п1д час проходження через саха,-розу. Агрегац!ю можла зробити Шн1мальною, якщо прогр1ти РНК перед фраку1онуванням. Для цього 0.5 мл буферу, склад якого вказано вице, 1 в яксыу м1сгиться 400 мкг мРНК, прогр1вали 90 с при температур 1 +65.С, шви.тко охолоджували до к1мнатно1 температури та наша-ровували на градиент. За мзркери бралася РНК з мозку шур1в, яка BMlmye велику к1льк1сть 28 3 та 18 S р!босомальних ГНК. Центрифу-гуезли за доиомогою центрифуги "Becnan Spinco", ротор SV-40, про-тягом 12 годин при 32 ООО об/хв та температур! 15 С. Шсля цього град is нт роз дышл: ка фракцч з об'еулом 0.2 ил, вЦбираючи м1крошпеткою е!д менюку, та осагжували етанолом ка протлз1 16 годин. Поглинання виы1рювали за дэпомого» спектрофотометру ОФ -23.

__ .- • . . ' ' '• - 5 - • 1

Для шЧкцП ми в1дбирали фракцП 20-25 S и 30-40 S;-. як так1 що. найб1лыд в1дпов!дають мРНК висскопорогозих кальц'1евих канал1в (Micami 83). • -"' •

■ В досл1дах використовувались дсросл! самки Xenopus laevís, як1' мають Олизько 30 ООО крупних ооцит1в з д1аметром б1льше як 1 мм. 1золяц1ю, культивуваиня та 1н'екц1ю ооцит1в проводили за методом Колмена (Colmen 84). 3 -метою тривалого збер!гання життездатноси ооцит 1 в, фрагмента я1чника ретельно промивали у модиф1кованому сольовому розчин1 Барта, який вм1щуе антибютики, одразу Шсля одержання 1х з жабн та розд1ляли на окрем! ооцити. На наступкий день ооцити обробляли ферментшм розчином: 0,21 колагенази ("Sigma", Туре 1) та 0,1% 1нгиб1тору трипсину ("Reanal") на про-тяз1 1 години при температур1 34 С з метою вив!льнення 1х в!д шару фол!кулярних кл1тин. Дал1 кл!тини культивузали протягом 7-10 дн1в в чашках Петр! з1 щ!льн)стю приблизно 30 кл!тин на 5 мл розчину Бэрта е 1нкубатор1, який п1дтркмуе температуру 18-20 С. Для м1кро1н'екц1й mFHK використоБувалася ориПнальна установка з пнев-матично» подачею дозованого об'ему РНК в ооцити.

Електроф1з1олог1чн1 експерименти проводилась нз п'йтий-сьомий день Шсля !н'екцП мРНК з використакням стандартноI методики дво-хелектродно1 ф-!ксац11 потенц!алу. Потенц1алький електрод виготов-лявся з скляних трубок Pirex, мав onip 2-3 МОм, заповнювався 3 М розчином КСГ. Струмовий м1кроелектрод зиг-отовлявся з боросШкат-ного скла, мав onlp 0,5-0,3 Мом 1 заповнювався розчином такого складу: ( в Шлл1 молях на 1 л1тр ): CsCL -500, ТЗА-ОН - 100, ЕГТА

- 10, HEPES- 10 (рН 7.3). Натр1 ев! струш реестг'^ались в роэчин! Р1нгеру. Струми через кальд!ев! канали вим1р»вались у безхлор^ому розчин1, який вм1щував Юни бар1ю ( в м!лл1молях на 1 л!тр): КаОН-50; Ва(ОН) - 40; КОН - 2; HEPES - 10; значения рН 7,3 доводили ме-тансульфокислотою ("Signa",США). 3 метоя усуненкя иатр1евих струм!в до наведенного розчину додавали 1 мгс,юль/л тетродотоксину (ТТХ) або екв!молярко зам1навали НзОН Пдроксндом тетраетиламон!»

- ТЗА-ОН ("Siena",США). ' ' ...

- б"У'-' " '..... ..

РЕЗУЛЬТ/ÍBÍ дош&шнь. * : На перята.гу етап! роботи наше завдання полагало в одер>анн! двох препарат!в функцЮнально ачтизноI. IhvsktkoI румарно! РНК великих п!вкуль мазку та ыозсччу (в нодалыпому РНКп та РНК>. в1дпов1дно). §ракцюнування обох препаратiв .РНК в галехност1 ви розм1ру нами було проведено в Град!ент1 концентрат! сахарозя. Денситограмма розд1лення вказуе на те, цо препарат вмИцуе.як 18 £ 1 28 S рибосомальп! РНК, так í велику к1лькють !нзих РНК, а саг.;-; - багато вжокоуолекулярнях мРНК разгром б!льзг як 30 S! Низькомо-лекуляряа дифуэна &сна продукт!в розладу РНК практично Б1деуткд. Так! результата фракцЮяувакня св!дчать про те, цо ка>£Г. булл вид 1 лен 1 пропарати функцЮнальво ачтизно! сугзрно! РШ С FHKn к РККм), як1 за данши пвядк1сного еоналького ультрацектрифугування в. сахарозно:^- градюнт! структурно ШлЮтн! 1, в!дпов!дно, задс-воаьняють вишгш до препарат!в мРНК, як! вризвачей1 для tn'euull в ооцнти Xenopus laevis а штозо ефгктивкого сшизау Оушоиоаальких Юанях канал!в.

й.Елксгро51г$сж>г1»ай siaonisocri скспрзсогакжс líaEbUicKat ssaasiE

Як було показано ран!ве,- нативний яе1н*ековаяил esa-ir Xenopis laevis у в1дпоз1дъ на деполяризад]ю мембрадо генеруа три кошопеа-ти трансмембранного струму - вх1дккй кзлыхЮвйй, та ekxIü-ii : гг-лезздай вЗд Са хлорний та каг1евий (B&rísh 83, Mlledl 84, Герасименко 31). При подтримуючому г,;е*5ранксыу потенц!гл! (Vh) -80 ыЗ в нормальному розчнн! РШгеру деполяркзац!я ысмбраю: до +10 иВ шпульсоы довг.а-1Ноз 1 с ы:кликала струы Биг1дяого каприыку, якнЗ .екладазться з основного компоненту, ьэ 1нактиБуеться, виштуяа його дор1вш>вала 200 нА. та невеликого стацЮнаркого - компонент/. Ц! компонент« внхздкого струму формувться в1глов1дво Са-эажеашш . хлорниы струмом та каглевям етруцоу. ягЛ ыаскують зкачно иенлий за а?Л1Л1тудою кальц!евий струы яротилежного ьааряыку (шл.1). Екда-генний калыиевкй струм ыожна виявити при гашн! розчкну Р!нгеру , на бар1евий розчин, в якоыу 3он:: хлору замшен! ка иетилсулъфснат. В результат! тако! зам]ни вих1днкй струы еуттево аштаузався, цо давало моклив!сть виявити струы, який глаз досить "поыльну" :;!ке-тику 1 незначну ашштуду, яка не персвицувала 30. нА, вц? зб!гаеться 8 лиературними данями. Оск!лькк юня барш иокуть пе-реноскти струм т!льки через кальц!ез1 канали, тему ней вэадкяй струм, ио залишиЕся, швидше за все, е проявом актаБацíI Еласних

Шпяег

100

пА I_

200 та

+10

В

Ва 4СшМ

-за

О <-;

-13

пЛ I

200 газ

-63 -за

го ее?

~'Л1 7

ню

Ва 40тМ

__ -30

*___-10

+ 30

200 пА

<-20

200 то

Ва 4СтаМ

200

р

200 та

ПО -СО 30

ОхаШШ ■

□ ваННЛе

• '/й

Ж.

и

1(пЛ)

Г

-1.2

V. ;

Нал.1. ТрайС!.;ембранн1 струми та 1х вольтамперШ характеристики. А. В, С - коятрольШ ооцати.О г ооцити, 1н'екован1 мРКК з великих . п1вкуль (тпШЗА П. Е- ооцити, 1н'екован1 мРНК з козочку (шНИА с), Р - вольташерн! характеристики т'екованих ооцит!в.

- s -

кадьШевих какал!б нативлих oouhtib. Середня ампл1туда вх1дного с груму, який переноситься Юнами бар1ю в котрольяих ооцитах, скла-дала "б f 10 нА (п-25). Власний глльц!евий струм характеризуемся высоким порогом актиьацП (-40 мВ), а максимуму досягае приблигно 1три +10 мВ. -

Для ооцит!в, як1 1н'еков&к! РНКп та РЯКм, картина CTpy¡riiB, як! рееструються в розчин! Р!нгеру сута-евс зм1 ковалась. На 3-5-ий день у в1дп<)в1дь на деполяризуюч1 сшщеккя мембранного потэншалу до -50 мВ модна було спостер!гатк шзидкии вх 1 днли струм, який св1дчить про експрсс]ю додатксрих канал1в, як1 ефектикно блоку-ю-гся ТТХ (10 ммоль/л), цо збП'аеться з нагими попередк!ми даними, як! буж одержан! на струмах,. индуксЕаннх мРКК цЬтого мозку (Герасименко ¿1). Водночас ь ьиннкненням евидксго ТТХ-чутливого натр'евого струьу в осцятах п!сля 1н'екц!1 мРНК сностер!гаься суттевий spicï амнл1туди вих1дного хлорного струму, то иеирямим чином ce iдчило про зб1льшення входу гзозн! 1он!в кальцис в социт при деполярл'зацЗ! мембрап«. При сам1к! pcw.tr/ Р!arepa на бар!евий розчин (Ьэ 40мМ). ш спостер!гали почву значного за акотл1тудол пов1льного входного стругу. В обох трупах 1н'екованих оощиЧв амплНуди бар1евих струм!б перевищувади в1дпов1дн1 амгштуди контрольных ооцлт!ь у 40-50 раз!в. Ни рщнювали ц& як поязу в мембран! ооциту ношх кальц1евих канад1в. Причому, експрес!я кальц1евих каналов завздн Суда присутня прл екслресП пвидких матр!евих ка-нал'в. Зкачних в!дм1кностей у значекк! еьшл1т/ди Capiesoro струму мы. групами ооцнт i в, ин'ековзних РНКп и FKKm не було виявлено: для FIIKn -ьикликаких струм!в амшптуда Оула 300 + '¿50 на (п=24), а для РНКм-викликавих струм1в - 700 + 200 нА (п=32).

Мл такой' не в1дзиач;ш5 суггевих- Ыдм1нностей в обох трупах в к1кетйц! макроетруму та потенц!алзалсхност1 Гюго активацп, цо видно з вольтачпернкх характеристик кальц1евих струы!в, як! 1иду-коес.к1 РНКп та РНКы (тривал1сть деполяризуемого зм1щення по-тенц!аяу 1000 не). Июля аналюу вэльтамперних характеристик, мк Д1йшли впсноБку, що ôapieBi cïpy®;, як! були 1ндукован! РНКп та FIÜLm, активувадисъ, починавди з мембранного потекиic^sy б.тазько -¿0+ 5 мВ ! дэсяг&ли максимального значения при +15 мВ. Под&пьший рост деполяризац!I призводиз до зминьення вх!дного струму. Реверс1я йо-го в 1 дбувалася при потентат -60 мВ, що найбьчыв ймешрно зв'яза-но з непоаним уеуненняы вих1дногс струму. На Шдсгав! цих даних як ц!, так 1 !ни! експресован! струми буди в!днесен! нами до високо-

' 9 - ' ■

порогового типу. 4 .

В1домо. до кальшева пров1дн1сть мембрани,кл1тин, забегле-чуеться функц]орувакням дёйлькох тишв канал!в, як! в!др1зняютьея sa своею-к1 нетикоя, залежнЮтю в1д потеншалу, та фармаколог 1 ею (Bean 89.. Fox 87b, Limas 89,92). Таким чином, при введеш-;1 в ооцит як сумэрноI íKKn, так I сумарно1 РНКм, молено було б чекати од^ ночасно1 експресП a Kboxjy кальц1евих какал1в р1зркх тип*в, тим б!льше, що в кейронах тих д1лякок мозку, з яких ик одержугзли наа! зразки РЖ, було показано прксутн1сть поруч з високопорогогими каналам! ккзькоперогових кальЩевих канал1в. Так у робот1, проведен irt на нативних нейронах Пурк1н*е ыозочку '1-3-гижневих шур!в (Regan 91), показано, що частика клЗтин >.íae кальц!ев::й етрум, под!бкий Т-струму-перифер!чних нейрон!в, вс! Пурк!н'е клгтини мають високопорогов! кальшев! стр-ц, як! пов!ль:ю 1нактиву>я"ься та. ■.не виявлякть чутлквост! до дипдроп1ридин1в, 1 т!льки неьеликий компонент •високопорогового струму проявляв чутл.ив1сть до Bay К 8644 та н!трендия!ну.

Лля оц!нки ймов1рно! гетерогеннсст! екелресованих нами в ооцй-тах Xenopus кальЩевих канал!в, 5ула проведена сер!я експери-мент!в, з яких дег.оляризац1я мембрани здШекювглась в!д р!зних plBHlB .Мдтрлыуючого потенШалу (Vh) в диапазон! в1д -100 до -30 мЗ. Така методика иирско використсвуеться для розд!лення трансмембранних сгрум1з, як! мають р!зн! пороги ачхивацН та етацюк?.р:гз1 !нактевац!I, i для визначення цих параметр!в. Анал!з вольтамперних характеристик бар!евого струму, индукованого РНКп, показуа, щ,о, при ьисоких г1перполяризумчих значениях Vh на НИСХ1ДНИХ- диянках ВДХ нам не здалося виявити характерного зл^му, який звичайно в1дпов!дае актизаци киськопорогових кальц1ввих какал! з, zp C3í";'4ii?b про ексягеош в мембран! ооцита г!лькл кальЩевих клналгв. як! меагь Е;:сакйй нор!г актизацП. 3! зеувем Шдтримуючого потекц1алу в б!к делсляризаШГ молша було cnocrepirani зменшення п!ко?о1 ам^-йтуди бзр!евого стру><у, незкач-не спов1льнення к!нетики його спаду в ход! триззкчо! деполяри-зацп. В той же час максимум ЕАХ практично не зм1щувазся. Ана^о-ГИЧН1 результата були сдерган l i для ßaplesoro струну, кндуко.-анс-го PERM. Таким чинам, акалiз 1ктеграяьккк струм'в, як! переноситься юнами барк» через кадьц1е31 кашли. експресовак! в мембран! ооцит!в у в!дяов!дь на 1и'скц1в сумарних РККп та РНКм. дозво-лле зробити висноеск про однор!дн1сть пояуляцН них канал!в, От.'.е,

; • . - ю - • ;

одеуяаш' значения залежност1 в1дноено! ашл1туди бар1евого струм у вшошдь на ф1ксовану деполяриааЩю ыд ртш шдтримукчог мембранного патенталу ыо:*на розглядати як крив! стационарно 2иактивйЦИ' гомогэнно] популяцП висскопорогових кальЩевих ка нал1в. ЕксперименталыП. значения зйдовиыю вгладаютьоя на теоре тпчну кр.'^ву стацюнарно! !нактивацп, од-ер-гану з. формул« Болыыан 1/1 - П+ехр((У - V )/к)3 , де V - потенщал половинно! 1накта виц!Г, а к - фактор крутое?1 . Розрахунки показали, що найкрая; сп»вв1дношенння для каяьЩ.вих канал1в, индукованих РНКи моке бут одержано пои V »>32 ¡V© та к - 28 мВ, в той час як для канал!в индукованих РНКм, Щ значения складають -16 ыВ та 16,6 м в1дпов1дно (мал.2).

Нал.2..А - вольтамперн1 характеристики бар1евих струм!в оощтв, Шдуковаиих РНКп (а - ¡гКПА Г) та РНКм (Ь - тННА с), та.Е1дноз1дн! крив! стац!онарно1-!нактивац!1 (В).

А

а

Ъ

■ тКНЛ(1)

• -1Е0 О -СО И -40 . - 0 -10 1 . . . » . . у .1 > 1 ■ . 1.

'• -ВО —10 - О • 40 80 V (И»)

' 1»

л V/ :

• -12« У

О -50 - к/

О -40 ',

О -10 ... 1 ■.. 1

.-80 -40 О 40 во

: V (тУ)

-120 -ПО -40 0 40

Пе<11пк ро1сиММ (т**)

-'и ' •

2. Фармакологin екелресовшшх ¡-гга.ив.

0ц1нити фармаколог1чну чутлив 1 оть кальц!езих -канала, експресованих в ооцитах, ми гмогли з допомогою ряду кальц1евих ефектор1в, як1 мають специфику д!ю на р1зн! тмпи кальц!?вих канал^: 1они кадм!ю, юни к1келэ, диПдроШридиновкй ангагенют н1тр9ндип1н та aroHic? Bay К 8544, та природш токеини: пептидний блокатор w-CgTx з мороького равлика Conus geografus, цJ льна отрута американского пазука Agolenopsis aoerta та одна а його фракц1й -FTX. .

В1дсмо, що юни кадм1ю е ефективкими неорган1чнкми блокаторами високопорогових кальЩевнх какал1в (ïsien 88). 1х.блокуюча д!я та-K03S проявляется 1 на експресованих в ооцитах Xonopus кальц1евих каналах кард1ом1оцит!з (Lory PQ) та нейрон 1 в мозку (Герас1менко Si). В процес! нашо! роботи ?.гл зивчалл впив 1он1в кад>.:1юд ка-експрееован1 кальц1ев! канали перэдкього мозку та мозочку. Вияви-лось, що када1й припПчуе бар1евий струм як в ооцитах, 1н'скованна РККп, так 1 в ооцитах, Ы'екойанйх РНКм, хоча ефектившсть блоку-вання при цьому з обох трупах р1эна. Kd для РЫКп-вккликаного струму складало 20 мкМ, а для РНКм-Еикликаного струму зсього лиз 0,1 мкМ (мал.З). 1они кадм1ю в концентратI 100 мкМ познютю прлгн!чу-вали бар1евий струм через експресован1 канали в обох трупах оо-цит! в, що використовувалось нами для його повного в1докремлення Ыд залишковмх струм1в, як1 перекоситься через 1нш типи каналiз. Це зд1йснювалос-ь шляхом в1дн1мання ст'йкого до кадаЛга струмового компоненту, яккй рееотруеться п1сля додаванкя 100 мкМ 1 он 1 в кадм!ю в бар1евий розчин, в!д струму , одерханого у в1дсутност! кадм.ш. Bel наведен! на/л реестрацн бар1евого струму одержан! з результат! такого з1дн1мания. . ;

Кат 1 они н1келю нав1ть в ко.яцетроцП 300 мкМ, практично не впливали на индукован1 РНКп та РНКм кальц1ев! струми. Хоча показано що' Ni ефективно ( Kd - S2 мкМ, макс. доза 300 мкМ) блокуе кальц1ев1 струми нативнкх гл i тин мозочку, приблизно 30% яких протпсае по низькопороговим каналам, под1бним Т-каналам пери-фер1чних нейрон1в (Regan 91). Тагам чином, ми маемо змогу зробити висновок про те, ¡до експресован1 мозечкоз! канали на два порядки б1льи чутлив1 до катюн1в кадм1ю, експрееокан! какали переднь-ото мозгу щур1в. Проте як т1, так 1 1нш1 канали не виявляють чут-ливост! до катюн!в н!келю.

; '- iz - :... •' .. / '

. • Огк1лыси екепресо'ван! нами в обох трупах- ооцнтta капали вияв-'ллли '-себе як такг.що мають високий пор!г гктивац11 та слабо,-так-тйвулться, ми поставили 'за. мету доел1дили 1х ,реакц1ю.на , речознни-31галрояДридянового• ряду, так! як. Вау К 8644 (10 ыкмоль/л), ;калм!евий.йгон:ст, va н!трендип1н, (50 мкмоль/л) кзльц!е^ий анта-■TOHsJr,.як!, добре в!дом1 за своею д!ею л.а -L.-тип• кальц!евих.канал 1 в ' лерифгр1'чнкх нейрон1в (Novycky 85 a,b; Fox 87 а,b). Приготування розчину.- якай вмГиу® ' и1тр?ндипш, а також досл!ди з його вико-ристанням приводились при слабкому осв!тленн1. "рёестрацИ струм 1 в зд1йснювЬд1\сь на максимум! вольт-амперно1_ характеристики в контрольному .poá-jjíHl.. та через 10 с п!сля прикладання фармаколог i чних агент!в. На чутлив!сть.до н1треьдишну нами-було переварено по 17, а на чутдиз1еть до Бау К 8644 - по 15 кл1тин з кокно! групп. В результат! експеримент1в було встановлено, що експресован1 нами, РККп- та PIIKm-1ндукован1 високопорогов1 кальц1св1 капали, вияви-лись нечутливими до диг1дроп1ридин1в, що дозБолае виключити !х на-лежн1сть до L-типу кальцiевих канал1в.

. ' Мал.З. Вялив кадмНо та н!трендип!ну на бар1ев1 струми, ' ' . !ндукован! мРНК в великих п!вкуль (А) та мозочку (В) шур!в.

А

3Г

« i О I

mRNA(f)

Cd

J00M«

В

mRNA(c)

гоо ш>

nitrendipine

30 дН c«ntl«l

í

ы

ts*

nitrendipine

conlr«!

, ,. . ' 13 - • -

• Для зизначеннл належност1 експресованих кальш'ёвпх канал!в до • другого, N-типу; високопороговпх канал 1 в, ми вивчали Д1ю на них vf-CgTx - ефективного блокатора N-струму в перпфер!чних нейронах . (McCleskey 87). , Апл1кац1я w-конотоксину в камеру зд1йснювалась на максимум1 вольтамперно1 характеристики, ефект реестрували через 10 с п1сля початку ашпкацп, з р1вними пром1жками часу на лротяз1 30-40 хвилин. Д1я w-CgTx на 1ндуков?н1 РККп та РНКм кальц1ев1 капали значно в!др1знялась. Токсин в концентратI 10 мкМ шяк не впливав на кальЩев! канали ооцит1в, ИГекованих РНКм, що виключае можливЮть в1днесення цих канал 1 в до N-типу (мал.4).

Мал.4. Вплив w-конотоксину, A.aperta токсину та FTX на бар1ев1 струми, Шдукоьаш мРНК з великих п!куль (А) та мозочку (В) цур!в.

А ..

Í

mRW*(£)

(O-CgTx

В

а

mrna(c) ш-CgTx

ir

- A. aptrta

/

. Д eptru 4c«ntr«l

b

ír W

A. apena

K.ftr» mlral

rrx

Г

M

M W

FTX

•ТО •■A

mt ••ih Cftlktrvl

.«Mil

. ' . - 14 - " ■ - :

В ооцктах не, 1н'екованих РККп, цей пептидной блокатор■з концент- , рац11 1 мкмоль/л приппчуе кальШевий струм.на протяз1 20 хвилин до р1вня 33+12% (п-12) в1д контрольного значения амлл1туди. Залкш- ] ковий компонент струму виявився досить ст1йким, не дивлячись на • зб'льшэння концентрат I токсину. Шсля гЛдмивки в!дновлення струну не в!дбувалось. Висока чутлив1сть РНКп.-1н'екованих ооцит1в до w-CgTx-дае п1дстави для в1днесення кальШевого струму, експресова-ного в них, до М-типу. B"îcyTHloïb чутливоси РНКм-1ндукованих -струм1в до , w-CgTx виключле можлив1сть в1днесення IX до N типу калыЦевих канал1в.

Як було показано в ряд1 роб1т (Carbone, Svandulla 89; Adams 89; Bindokas 89) нёйротоксини з отрут павук1в являються мояливими л1гандами прэсинаптичних та дендр1тних високопорогових калыпевих канал1в, в зв'язку з циы вони широко використовугаться для вид1лен-ня да канал1в в чистому вигляд1. 3 отрути павука Agelenopsis aperta одержано дек1лька токсинових фракц1й, як1 з р1зною ефек-тивн!стю 1нгиб1рують високопорогов1 кальц1ев1 канали в р1зних об'ектах (Lin 90, Llirtas 89, Mints 92 a, Mint.z 92 b, Venerra 92). Проведен1 за останн1 дек!лька рогЛв роботи в ц1й област1 св1дчать про те, що найб1льш специф1чно токсини цього павука впливають на високопорогов1 кальц1ев1 канали Р-типу (Llinas 89, Mori 91). Ми вивчали дш ц1л1сно! отрути та одн1е1 з II фракц1й - FTX - на експресован1 в ооцитах високопорогов1 кальц1ев! канали. При цьому Д1я ц1л1сно1 отрути та FTX на канали, 1ндукован1 РНКп та PHKih, ви-явилась протилежною д11 w-CgTx. Ц1л1сна отрута використовувалась нами у розведенн1 1:10000. Вока не Епливала на струм, 1ндукований РНКп, але пригн1 чувала бар1евпй струм, викливаний 1н'екц)ею РНКм. Остантй зменшувався в присутност1 отрути до р!вня 20 + 8% (п-15) в1д свого контрольного значения. Нечутливий до отрути компонент, що залишався, був достатньо стаб1лышм. П1сля 20 хв в!дмивання струм в1дновлювався до р1вня 50% початково1 велкчини. Сл1д в1дзна- ' чити, що при б1льш високих концентраЩях д1я отрути моке бути менш спецификою . Так, при розведенн1 1:1000 вона блокуе 65% стру-• • му через ка~-ц1ев1 канали, 1ндукованого 1н'екц1ею мРНК всього мозку' (Lin 90). При прикладалн1 нами FTX в концентрац)! 0,5 мкмоль/л бар1евий струм, 1ндукований РНКм, пригн1чувався на 80%. П1сля в1дмивання на протяз1 20 хвклин струм в!дновлювався до р!вня 40% контрольной ампл1туди. Зсуву максимум!в вольтамперних характеристик при цьому не в1дбувалось. На РНКп-1ндуковаиий струм ефекту

- 15 - • . .

практично не опостер1Тапось, що сШвпадае з результатам , одержанной нами при робот! з цЬИсною отрутою. Прозеден1 досл1дження . Шдтверджують дзн1 про'те,, цо токсшш отрути павукл Agelenopsls aperta виявляють специф1чну д1ю при блокуванн! як- калыд1евих ка-нал1в ííji 1 тин нативного мозочку (Llinas 89, • Bertollno 92), так i : !сальц!езих канал!в, експресованих в результат! 1н'екц11 мо~очково1 РКК (Мог! 91). Виб1ркова чутлив 1оть РНКм-индукозаних високопорого-вих кальц1евих канал!в до токсин1в павука A. " aperta дозволяе зро-бити пркпущення про ïx найб1льи в!рог1дну приналежнЮть до Р-типу кальц1евих канал 1в. - ,.•

ОБГОВОРШОИ РЕЗУЛЬТАТА.

Предстазлен1 дан1 , п!дтверджують вгдомий висновок про те, що РНК. вид 1,пена з мозку, здатна ефективно транслюватися в оощ!тах Xenopus, цо призводить до синтезу 1 вбудовуванню в 1х мембрану по-тенц1алзалежих Юнних канал1в (Dascal 85, Kaneko 87, Lester 88, Snatch 90, Lin SO). ' .

Нам вдалоея вид!лити два препарата функцЮнально активноI су-ыарно! РНК потенталзалекяих калыиевих канал1в характерних для нейрон1в великих и!вкуль мозку та мозочку щур1в. Одержання експресП !онних канал1в, 1ндуковаш:х природном РНК, не s простою задачею. Шляхом вар1юзання умоз вид1ленкя РНК нам вдалоея зкэниитп ступень впливу ногатквних фактор1в. Був змениений, каск'льки це можлиео, час . в1д початку дЮтавання мозку щур!з до його гемо-ген1зац11 в розчиш, яки? !нгкб!руе нуклеази.- На протяз! EClel процедури вид!лення РНК знаходилась п1д захистом сильних 1нгиб1тор1в нуклеаз,' серед них б1лков1 - гепарин та РНКазин ' (1нгиб1тор рибонуклеаз з' плаценти людини, "'Sigma"). При вико-ристанн! фенольнчх метод1в вид!лення| РНК була депроте1н!зована сум 1 ul'eo (1:1:1) фенола, хлороформа та кал1й-адетатного буферу (рН "5.0); при цьому втрати РНК в 1нтерфаз1 зкачно 'зменшувались. Мае значения те, що нами використовувалась для !н'екц1й скарна РНК, розд!лена в сахарозному градиент1. В1дбирались фракцП розм1ром 20-25 S 1 30-40 S, як1 найб1льш в1дпов1дазоть мРНК високопороговпх кальц1еЕих каналов (Micamí 88). Таким чином, Bel застосован! заходи призвели до одеряання яайб!лыз як!сного 1н'екц!йного препарату.

Пор1внюючи результат!! uieï роботи с нашими попередн'ми досШдженнями з викосистанням пол!(А)+ мРНК з мозку велико! рога-

toI худоби та щур1в (Федулова 88. Герао!менко,91). можка'зробити висновок, що процеси, 'як1 призводятъ до експрес!I нових тишв юннкх канал1в в ооцит1 у в1дпов!дь на введения сумарних РНК, розд1лёних в сахарозному град1ент1, !дуть б!льш Штенсивно. Ней висновок вит1кае перш за все з пор!вняння ампл1туд бар!евих вх1дних струм1в. Зареестрован1 в представленШ робот1 амплитуда струм1в досягали значения 800-1000 на. в -то час як 1ндукован1 пол1(А)+ мРНК струми не -еревкаували 400 НА. Шсля 1н'екцП .1ндив1дуальних мРНК оуоодиниць кальц1евих какал!в L -типу ампл1туди струм1в досягали 1000 нА (Dascal 86). Ця величина ыэже бути пор1вняна з величиною струму, одержаного нами, не дивлячись на те що в наш1й сумарн1й РНК кокцентраи1I специф!чних мРНК су-бодиниць кальц!евих канал!в на три порядки нжч!, н!ж в преларат1 1ндив1дуальноI РНК L-каналу. Так1 результат« св!дчать про те, цо наша сумарна,. фракц1оновака в градиент! сахарози РНК, вм1щуе кр!м 1ндив1дуальних РНК кальц'евих каяал1в где як1сь фактори, природу яких ще треба встановити, але як1 бездонно позитивно впливають на ефективнють експресП канальних б1лк!в.

Щкаво сп1вставити наш1 результати по експресП сумарко1 РНК мозочку з даними п!сля 1н"екц1] мРНК, одержаноI за допомогою кЛНК кальц1евого каналу кл1тин Пурк!н'е та гранулярких кл!тин мозочку кролика (висначеного як BI) (Mori 91). Експресозанкй ВI. канал бпя-вився високопороговим,. потекц!алзалекним, нечутливим до н!федкп1ну та w-конотоксину, токсин A.aperta пригн1чував його приСлизно на 40Z. Максимальна ампл1туда бар!евого струы/ через ней канал не пе-ревищувала 30 нА. Однак п1д час сп!льно1 1н'екц11 мРНК та субоди-ниць L-каналу скелетних м*яз1в кролика. ассоц!йованих з ДГП-рецеп-тором, , ампл1туда струму зб!лынидася в 200 раз!в, при цьому пара-• метри макроструму та фармаколог 1чна чутливЮть каналу не змеились. Механ'зм, який лежить б oceobi ефекту сп!лыю1 експресИ нев1домий. Можна припустити, що та субодиниц! зЫлыцують експрес!» BI кальщевого каналу шляхом стабшзаци б1лку абэ полегщуючи його Ебудовування в мембрану.

Ц1кзвт ! з точки эору бюгенезу канал!в язляетьс'я питания, як1 властивост! канал 1 в визначаються' 1х 1ндиз!дуадьнимп РНК, а як! РНК тих субодиниц, як1 у р!зш:х какал!в cxcxi 1 не е кана-лоспециф:чними. 3 приведених л!тератургшх даних видно, что "х!мерний" кальц!евий канал, одержаний япокськими вченими, схожий за сво1ми фармаколог 1чнкш1 властиЕостями з кальшезим каналом.

1ндукованим нааою РНК з\моз6чку. 3 цього 'вит!кае що," певно, 1ндив1дуальна РНК зумовлюе сугубо специф1чн1 властивост1 експреео-ваного'Р-каналу, в основному фармакологичн!, з той час як РНК неспециф1чних субодиниць лиш п1дсилюють ix проявления. Дан! японських автор!в св1дча™ь про те, что мозок, очевидно, вм1щуе б1лки гомолог1чн} або 1дечтичн1 и субодинщям кальц1евих канал!в скелетнкх м'яз!в. Мабуть, р!зноман1тн! типи потенц1алзалежних кальц1евих канал!в з р1зних тканин проявляють под1бн1сть структури на p'.BHl субодиниць. Кшцева в1дпов!дь на це питания безумовно потреоуе подальсих досл1декень.

Не дивлячись на те. що канали, експресован! в каш)й робот1, 1ндукован 1 мРЕК з р1зних в1дд1л1в мозку, вони проявляють схожу потеши алзалешисть активаци, яка дозволяе классиф!кувати 1х як BHcoKonoporoBl. На п!дстав1 в!дведення Штегральних струм1в ми схильн! вваглти, що експресован! кальц1ев1 канали в koxhi.I rpynl не гетерогенн!. В той же час в!домо, що б!льа!сгь тип!з централь-них нейрон1 в ссавЩв таку гетерогенн!сть мають. Дивним е те, що m не спостер1гали експресП низькопорогових каналib, як.1, керуються потентатом (Т-тип), хоча цей тип канал1 в достатньо поскрений 1 в великих п1вкулях мозку, 1 в мозочку (Bean 89), а наша еумарна РНК не могла не гмИцувати компонента, 'як! кодують б1лки цих каналЛв. }'o:.aia припустйти, що в ооцит1 Е1дбуваеться концентратйко-заледний виб1р (з мРНК, присут.ч1х з препарат1, що вккористовуеться для 1н'екц!й) на користь експресП одного з тип1в кадьц1евих канал!в, який найб1льп попирений в Шй тканин 1. Мокливо це зв'язано з тин, що ендогеян! кальц1ев1 какали осцита язляюхься вксокояороговими, причсму ix субсдпнищ схох! з субодиницями потенщалзалеяних кальЩевих канал1в L-типу нейрональних мембран (Singer-Lahat 92). Власн1 механизма трансляцП ооциту, а такоа екдогенн1 фактора, як1 забезпечують транспорт та вбудовузання в мембрану синтезованих 61лк1в, не мо;хуть не впливзти на результата експресП-. В литератур! не зустр1чаеться далих про експрес'ю з ооцитах низькопорогових канал!в.

На п!цстав1 електроф!з1олог!чних досл1дкень, високопорогоз1 кальц1ев1 канали нейрон1в ЦНС розпод!ляють на три ochobhî типи -N.L и Р (Kostyuk 83, Tsien 88, Llinas 89). Одержан! в представлен 1й робот1 дан! вказук'ть на те, що, хоча експресован! в наших експериментах високопорогов! кальц!ез! канали нейрон!в велюгих

¡Швк; зь ira ¡мозсгаху шроявзшютъ багато схожих рис. sa декотримя Ха-грактвристнками ¡вши в1др1нкяют1>ся, зцо дае момизЮть в!дяести - IX ■ до дшох рЗ-аних ;дшз.1в кавал1в, Щ в1дм1нност1 стосуються саме пара-ít«íeirplB стацашарноЗ аяактивацИ Спотенц1ал половиняо! 1нактивац11 та фактор вдотстО. цри сдночасн1й под1бност1- Ix вольташерних жарактвршгшЕк. В ШлыШ mlpa з1дм1нност1 mIjs двома групаш ка-шалив ираязлЕються в 12 фаршкалоПчних властивостях. .

АкалТзувзи напП- результата, можна зробити * висновок, цо в зв'язку з. тем, до asi канали, 1ндукован1 РНЕп, ani 1ндуковэн1 " IRHKm. aie виявляють чутливост! до диг1дроп1ридия1в, ысжливють зГднэсти их до L типу кальц1евих канал!в виключаеться. Зареестро-ванкй лаки tàapisEEft струн л!сля 1н'екц11 препарату суыарно1 РНК ¡великих зИвкуль СНКп) за своею потекц1алзалежн!стю та фармаколог! ею вагадуе високопороговий СЕШ або K-типу) кальц1евий струм :нейронзльной злеыбрани, який 1вактивуеться.. Так, аяалог1чно ЕШ ■струму (Kpstyuk S3, Bean 89) :в1н виявився нечутливиы до таких ■■ в1домих ,ефектор1в кальц1сво1 пров!дкоет1 як н1трендип1н та Bay К J3644- Ней струм яе виявляв такса: чутливост 1 до катюн!в н1кэл» . ЗПри цьому jäi'H вкявляв високу чуттшсть до кат Гон ¡в кадм!ю та до •w-CgTx - ефективному блокатору високопорогових кальц1евих канал!в яейронально1 мембрана (Gray 88.) -, н!як не реагуючи при цьому на ¡цШстний токсин яавука A.aperta та FTX. В робот! (Unibach 87) було показано,., до еядогенк! кальц1ев1 канзли ооцита явллаться ст1йкмш jo w-CgTX, ось чоцу непрьне блокування бар1евого струму 1н'екова-яих ociarais ш зв'язуемо.э присутяютю в ньому ендогеняого компоненту,, ашШтуда £кого для р1зних ооциив коже покатко вар1юватк. В той .же vac ексшресовгккй нами струм за своею стацюнарною 1как-. шваЩею з1др12кяэться Bis природного ВП1 струму: -. ми одержали для РЖп-андукованого . струну ¥1/2 - - 32 кВ и M - 28 мВ. а для кальцдезого струму M зжцу в1хпов!дн1 значения, вим1рян1 в розчин!, ... жий вмйдуе 10 зиЫ калыщз, .. дор1внтать -70 мВ и 12,5 ыВ (Fox 87). Ми щрщускашо, що ál 'BlsalEBocri mis нативниш! кейрояальниш навалами та каналами, як! експресувться в ооцитах, ыояяа пояснита ■й.езпосередя1м тливш власвэ! система трансляцИ ооцита на процесс екшф.ес11 fîlsiKlB калшйевих канал 1в.

Тожсшою в1данашк>в рисою кальцî евих каяал1в, 1ндукованих РНКм явлшегьса Ix ЕечутдизЮТь до iw-CgTx 1 в той же час специф1чяа чут-лпШсть да Ä-aperia рзрути та ¥¥Л. Експресован1 канали Ще1 групи шиявились нечутливиш , також до н1треядип1цу " , Bay К 8544 1

icairioHiB Hi кеда . Така фармаколог i я- дозволяе в шести Гг до-Р-типу jcajimlesnx канал 1 в, притаманниг гаптияам nypjcia's та гранулярким хитинам мазочку (Llinas 09).

HpiM pisHor чутливост! 1ндукогшЙ1Г РЗКп та РНКЯ' ка.ныт1евих га-нал! в до w-CgTx та FTX , ми вияепли bUwIeedctI в стащонарШй 1нактизац11 та ефективкост! блокуванкя. гошкет кадмНт.. Крива етац1окарно1 1какт$зац1Г для експресовашх танал1в- исзошсу булгг мена крутою (к - 16,5- мВ) 1 мала зеув. в 61к б}лъш позитазних- зо-тенц!ал!з ( Y 1/2 - - 15 кВ) пср1впяяо з кривею для канал!з па-реднюго Заоэку (к - 28 мВ, VI/ 2 - -1*2: мВ). Важс- э. штевненГято сказгти. чл в!дсбра;-куз крива стааюнарйу *йа!стквгц12г оряхтналвнюг. кальШевях канал 1 в в оСох вкпадкаг, чи; представляй- гластавоот!'' стацюнараоГ 1кактивзл1 Г модифпсозаяигг в- результат!: трзнеляци: в: оошпч калщ1«вкх какая IB-. oattwat для. яриродних: мсюсчковях кл!тян, як! яе мають кнзкгспороговжЕ кзяыйевих: струшв,, каши;, нечутлив! до д:!г1дроп1ридин!в та w-кскотоксину „ при- VfT. — »Б> в резчин!, so ы1стсть о мИ Ба, вдаовш! величкни: доргвпшть:: R;~ 14,7+2,1 мВ» V1/2 - -45,8+3,1 xS (Regan: 91) .. Щй> стосуетвся; блоку-2Э.-:ЛЛ iCb*a.'-2i ЙЗДМ1Ю - В1ДСМО, ЩО' ВОШГ 3- ЕНСОКОЙ/ Слетглачою; ефзк-?!!2я1ст2? вплнвають на експресозан! вг соцкг!" гсашцевЕ каяали-.. нвг ззлекно з1-д типу тклшппг-дхерела мЕЖ ■ (Lestesr Ш„ iiesfcstr 89;. lirtach 87, Dascai 86), Наш l дан.!' П1'дтвердаух.тв.-.цей' виотяюк; при-v.c.4j, експресонан! в ссади моаочкеи]' гсаналв: выявились на. два- по.-рялта б1льа чутлизима до юн!в кадмио,, а1ж капали; перелнього: мовку;

Так;::? чешом, щдкпм достоверно ми; меяемо- заключили; ню калыЦез! канак;, гндуксвак1 з: ссщгдах: Xe-ncpus-сумарними. РЖ. но-20Ч5чг та переднвого мозк? щур1в„ налкхатв дег- явок; plsrax: тгапв-» и-на Шдетаз! 1х р.1зноыан1тяо1- чутливостд да нрирсдних: токсин^ (FIX и w-CgTx) шхуть Сутсг. ГдентифГковаюши; як: какали. F 1; М! тпшз (з!дпов1дно), (дг53'.. таблиц» 17_ Ней; викговог в1лобраиуег. яй; факт-;. № мэзочеге 'та передни! мозок: язляюгься! тинл; струг^турами; моз!?у; ссаяив „ неЯрони. якнг переваана; експресуюта силе:- ц|1 потенЩалзагт-тяшх калшевшг канал im, хеш-. !• iuurli титл канал 1 В; тут; присути!.. В1дзначн1 риси',, одерхшш тзп чаш пор15шянн5г; експресоваг-вих канал in в; дата трупах' оощ1Т.Ш„ дрзвшаштн; робйтя: Ш!Сновки:про: генетлчьт об^овленнють онреми; тап!3! кальц1евз1Х' канал1В:. По-далыа! „ Q'1'лъш; глкбокИ дпелгд^ення; на;- piBHii ыокуЕання^ЛНК1,, як! - ко-дуитв. б!'лки; каназьниж суйоднкицв-,. ддщкгаь шхеивИэтУ) ррзшжЩЕатй структуру- ргзних: тип!» калШ'евих; каназищ, дел эуюбйтьь гарзипк класиф1кац!!П каиал1в; бглыз: певнот.

' Таблиц» l

Електроф1 з i ojjor i чн t паракетр" • РНКп-Iидукзван« канал" РНКи-Iидукован« канали

Порог активац!! -43 кБ -35 нВ

Максимальна ангштуда 800 ? 250 нА 700 * 200 нА

Потенц1ал при Анакс + 15 HB + 15 нВ

Стац. 1нактивац1я:

V 1/2 -32 нВ -16 нВ

к ' 28 нВ 16.6 нВ

Блокування Cd 2+ (Kd> 20 нг.К 0.1 нкМ

Д1я tii 2+<Э00 ккМ) неблокуе не блокуе

Чут-пив'сть до

ДИГ » дроп1ридин1о:

Bay К 8644 (10 нкМ> в iдсут"я «идсутня

н1трендип!н (50 нкИ) в1дсуткя в iдсутня

Дta ш-CsTx блокуе обратимо не д'с

1 нкН 10 нкМ

Чут-яизЮть до - блокуе.

токсин ib павука »«Дсутия частково обратино .

Agelenopsis aperta FTX-0.5 нкМ

ВЙСЙОВКН.

1. Вид1лен1 та охарактеризован! два препарати .1нтактно1, фушаЦопально активно!, розд1лено1 в град1ент1 сахарози сумарко! РНК з великих швкуль мозку та козочку дур1в.

2. Вперше продемонстрована диференЩйована експрес1я р!зних гип1в кальЩевих каналов, як1 керуються потенщалом, в результат1 1н'екц1I сумэ^них фракцюнованих РНК з р1зних д!лянок мозку дур!в.

3. За допомогов методу двохелектродно! ф1ксад11 потенЩалу на мембрак1 досл!дкено електроф1з!олог1чн! та фармаколог 1чн! власти-вост! експрессваких потенщалзалежнлх кальЩевих каналов в ооцита>: каби Хепориз 1аеУ1з п1сля ПГекцП в них сумарких РНК великих Швкуль мозку та мозочку щур!в (РНКп и РНКм).

4. При проведенн1 пор1вняльного ан-гя!зу Естановлено, що 1нду-кован1 РНКп та РНКм кальц1ев1 канали мають схожу потенщалза-лежн1сть активаци та залехк!оть в!д часу параметра 1нактивац!1, цо дозволяв в!днести 1х до вигокопорогового типу~потенц!алзалежних кальЩевих канал!в.

5.. Показано, що крив! стацюнарно! 1нактивац11 обох експресо-ваних кэпьЩзвих канал!в пом1тно В1др1зкяються, при цьому кохна з них задов1лько описуеться фор«{улою Больцмана. Значения потенциалу полов!:нно1 1нактивац11 та фактору крутост1 для канал!в великих Швкуль дор1внюють -32 мВ 1 28 мВ, а для канал1в мозочку в1дпов1дно -16 мВ и 16,6 мВ.

6. Встановлено, що за сво1ми фармаколог1чними та електроф1з1 олоНчними характеристика).«:

... а/«-конотоксинчутливий кальЩевий канал, експресований в ооцитах в результат! 1н'екц11 сумарног РНК великих Швкуль, найб!льш близький до високопорогового кальЩевого каналу, що 1нак-тиивуеться, тобто N типу;

б/ ПХ-чутлиеий кальшевий канал, експресований в резуль-- тат! 1н'екц11 сумарног РНК мозочку, найб1льш близький до високопорогового каналу Р типу.-

7. Б1дм1нност1 в результатах 1н'екц11 РНКп та РНКм дають шжтазк для шдтвердаення присутност1 в нейрональн1й мембран! ок-ремого, генетично обумовленого типу високопорогових кальЩевих ка-нал!в - Р типу.

' '■ Л ' ' - 22 -

8. Одержан1 дан1 являються основою для досл1дкення бюгенезу ' та npocTopoBol функционально I гетерогенност! мембранних Юнних ка- • ' нал1в в.ЦНО за допомого» системи трансляцП ооцит!в Xenopus, 1 мо-• жуть бутк використач1 для вивчення специф!чних фармаколог1чних вплив1в на кальц1йзалежн1 нейрональн1 процеси.

Перелое роб1т, олублковгних за тематикою диссертант.

•1. Герасименко 0.В., Костюк П.Г., Любанова О.П., Федулова O.A., Шуба Я.Ы. Входящие нотенциалуправляемые токи експрессировакные в ■ . ооцитах Xenopus в ответ на введенние мозговой мРНК.//' Нейрофизио-; ЛОГИЯ, 1991, т.23, N 3, с. 344-353.

2. Герасименко О.В., КостюкП.Г., Любанова О.Л., Федулова С.А., Шуба Я.Ы. Экспрессия w-конотоксинчувствктельных потенциалуправляеыих

i кальциевых каналов в ооцитах ксенопус после инъекции мРНК из мозга крыс. // Тезисы докладов на рабочем совещании по программе "Клеточная сигнализация и ее использование для управления функцией клетки и клеточной биотехнологии", Москва» . февраль 1991.

3. Герасименко О-В., КостюкП.Г., Любанова О .П., Федулова O.A., Шуба Я.М. Экспрессия потенциалуправляемых ионных канатов в ооцитах Xenopus laevis после инъекции мРНК из мозга крыс. // Бкол. мембр., 1991, т. 8, N11. с. 1130-1131.

'4. Любанова О.П., Герасименко О.В., Джура И.А., Герасименко Ю.В. Щуба Я.М. Интенсификация експрессии потенциалуправляемых кальциевых и натриевых каналов я ооцитах лягушки Xenopus, инъецированных суммарной РНК из мозка EyplB. 7/ Нейрофизиология, -1993,К 6. ,5. O.V.Gerasymenko, P.G.Kostyuk, O.P.Ly'Jbanova, I.A. Dahura, Ya.M.Shuba. Differential expression of calcium channels from rat cerebellum and forebrain in Xenopus oocytes. // Neui-osciense, 1993, in press.