Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модуляцiя збуджуючоi синаптичноi передачi в гiпокампi щурiв аденозиновими рецепторами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Модуляцiя збуджуючоi синаптичноi передачi в гiпокампi щурiв аденозиновими рецепторами"

РГ6 о

2 1 1Р " Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

На правах рукопису

Клітин Андрій Іванович

МОДУЛЯЦІЯ ЗБУДЖУЮЧОЇ СИНАПТИЧІЮ! ПЕРЕДАЧІ В ГІПОКАМПІ ЩУРІВ АДЕНОЗИНОВИМИ РЕЦЕПТОРАМИ

03.00.02 - Біофізика

' АВТОРЕФЕРАТ

дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1994

Роботу виконано у відділі фізмко-хімічиої біології клітинних мембран (завідуючий - чл.-кор. АН України О.А.Кришталь) Інституту фізіології ім.

0.0.Богомольця АН України

Науковий керівник: чл.-кор. АН України,

доктор біологічних наук О.А.Кришталь

Офіційни опоненти: доктор біологічних наук Ф.В.Бурдига,

доктор біологічних наук М.С.Веселовський

Провідна установа: Кафедра біофізики Київського Державного Університету

ім. Т.Г.Шевченка

Захист відбудеться ЗО березня 1994 року на засіданні Спеціалізованої ради Д-016.15.01 при Інституті фізіології ім. 0.0.Богомольця АН України (Київ, вул. Богомольця 4).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім.

0.0. Богомольця АН України

Автореферат розіслано "______“___________________ 1994 року

Нчений секретар Спеціалізованої ради доктор біологічних наук

З.О.Сорокіна-Марина

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність 'проблеми. Аденозин є одним з найбільш розповсюджених в організмі нейромодулягорів. У гіпокампі аденозин спроможний швидко та зворотньо блокувати синашичну передачу, виступаючи в ролі нейропротектора під час гіпоксії та різноманітних пошкоджень. Було виявлено, ідо аденозин регулює рівень внутрішньоклітинного cAMP (Van Calker ct al., J.Neurochem. 33:999, 1979; Londos & Wolff, Proc.Nall.Acad.Sci.USA 74:5482, 1977) і роботу, як мінімум, двох, потенціал-керованих іонних каналів: калієвого (Gerber et al., J.Physiol. 417:567, 19?9; Greene & Haas, J.Physiol. 366:119, 1985) та кальцієвого (Dolphin et alJ.Physiol. 373:47, 1986; Gross et al., J.Physiol. 411:585, 1989).

Аденозин не являється "класичннм" ненромедіатором .в ЦНС, бо звільнюється невезикулярним шляхом (Zimmerman, Neuroscience 3:87.7, 1978). Проте, похідні аденозину спроможні виконувати роль нейропередатчика. Наприклад, диаденозин-поліфосфати були виявлені в секреторних гранулах хромафінних клітин (Rodriguez del Castillo et al., J.Neurochem. 51:1696, 1988; Pintor et al., Life Sci. 48:2317, 1991), а також у пресинаптичшіх терміналах нейронів головного мозку щурів (Pintor et al., Neurasci.Lett. 136:141, 1992). Є ряд робіт (Castro et al., Br.J.Phamiacol. 106:833, 1992; Hoyle et al., Eur.J.Pharmacol. 174:115, 19S9; Pintor et al., Br.J.Pharmacol. 103:1980, 1991), в яких показано високу спорідненість диаценозин-поліфосфатів до Pj (АТР) рецепторів. З іншого боку, показана наявність АТР-рецепторів у ЦНС та обумовленої ними еннаптичмої передачі (Edwards et al„ Nature 359:144, 1992).

Гіиокамп як об'єкт дослідження синоптичної передачі був обраний нами тому, що, по-перше, в ньому, можливо морфологічно ідентифікувати різні структурні зони, і, по-друге, синаптична передача в гіпокампі може модифікуватися зовнішнім впливом (наявність пластичності) (Collingriijge & Singer, Trends PharmacoI.Sci. 11:290, 1990; Krishtal et al, Netirosci.Lett. . $5:82, 1988).

Висока кількість аденозиновнх рецепторів' саме в гіпокампі (Fastbom et аі., Neuroscience 22:813, 1987) обумовлює особливе значення з'ясування впливу аденозину та ного похідних на збуджуючу ецнаптичну передачу в цьому відділі мозку. . ' '

Зовсім недавно з'явилося перше повідомлення про спроможність аденозину та його похідних регулювати п гіпокампі співвідношення компонентні збуджуючого постсинаптичного потенціалу (de Mendonfa & Ribeiro, Drain Res'. 606:351, 1993). Пояснювався цей ефект відмінністю в- потенціал-керонаній провідності глутаматшіх рецепторів'та впливом аденозину на потенціал спокою постсинаптичної клітини. Але цей феномен потребує більш детального дослідження, яке можливе за допомогою реєстрації збуджуючих цостсинаптичних струмів окремих нейронів у зрізі. Ця методика дозволяє значно розширити можливості з'ясування таких питань; які рецептори і її якій мірі беруть участь у створенні ЗПСС; блокування якого типу рецепторів або іонних каналів веде до тої чн інші зміни постсинаптичного струму; як перерозподіляються функції між рецепторними структурами під час -індукції пластичних змін еннаптичної передачі в гіпокампі.

Мета роботи полягала в тому, щоб, шікористовуючн методику фікс.іиії

потенціалу, дослідши властивості збуджуючих ігостсішацтичішх струмів (ЗПСС) пірамідних нейронів гіпокампу щурів та вплив на ЗПСС аденозину, його похідних та блокаторі» аденозинових рецепторів.

З а п ач і до с л і лхеї і пя: ■ \

1) Досліди ги вплив аденозину, його агоністів та антаг оністів на властивості збуджуючої синаптичної передачі в гіпокампі. З'ясувати роль аденозинових рецепторів А| та Aj типу.

2) Вивчиш вплив аденозину на кожний з компонентів ЗПСС, дослідити регуляцію співвідношення компонентів ЗГІСС аденозином. З’ясувати роль різних аденозинових рецепторів в цій регуляції.

3) Дослідити роль днаденозіш-ноліфосфагів у регуляції синаптичної передачі в гіпокампі.

НаУкона новизна. Досліджено вплив на ЗПСС зовнішнього прикладення аденозину, його агоністів та антагоністів. Показано, що крім відомої раніше блокуючої дії аденозину, та недавно виявленого потенціюючого впливу низьких концентрацій (Nishimma et al., Brain Res. 525:165, 1990), аденозин спроможний регулювати внесок компонентів, обумовлених різними рецепторами, в сумарний ЗПСС.

Практичне значення роботи: Показана в роботі регуляція внеску різних компонентів в сумарний ЗПСС розширює уявлення про роль аденозинових рецепторів в модуляції синаптичної передачі. Тривалість индукованих змін дозволяє припустити причетність виявленого феномену до явищ синаптичної плас. ніч пості. Ця робота може бути початком вивчення механізмів названої регуляції.

Апцобапіи роботи. Матеріали дисертації доповідалися та обговорювалися на засіданні сектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця АН України, на загальноінститутському семінарі з молекулярної фізіології, на міжнародній робочій параді "Механізми кальцієвого гомеостазу збудливих клітин" (1993 p., Київ), на XIV конференції Міжнародного нейрохімічного товариства (Монпел'ер, 1993).

Об’єм та структура дисертації. Дисертація складається із вступу,

літературного огляду, описания методів, експериментальної частини,

обговорення, 8 висновків та списку літератури з 348 найменувань. Робота пиі.падена на 148 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 23 малюнками.

За матеріалами дисертації опубліковано дві роботи.

; МАТЕРІАЛИ І МЫ ОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проводились на зрізах гіпокампу щурів (товщина зрізів - 300-50(1 мікрон). Pet сіру вал п ся зошіішньоклітинниіі популяційний потенціал

(stiatnm pyramklale, ділянка САІ) та постсинаптичний струм у нейронах цієї ж зони. Ііксперимеїни проводились на молодих (віком від 18 до 23 днів) та дорослих щурах (18 місяців). .

Для дослідження синаптичної передачі в зрізах гіпокампу застосовувалися іакі методи:

1) приготування переживаючих зрізів гіпокампу; •

2) реєстрація популяційних постсинаптичних потенціалів та потенціалів дії у відповідь на електричне подразнення відповідних зон зрізу;

3) препарування зрізів за допомогою "водострумного ножа" з метою доступу до окремих нейронів ділянки САІ;

4) методика patch-clamp в конфігурації whole-cell з фіксацією мембранного потенціалу.

Зовнішньоклітиншііі розчин містив (у мілімолях/літр): NaCl - 138; КС1 - 2,7; СаС12 - 2,4; MgS04 - 0,5; NaH2P04 - 0,4; К2НР04 - 0,26; NaHC03 - 26; глюкоза - 15. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю (95% 02, 5% С02 - карбоген). pH розчину за таких умов підтримувався на рівні 7,4.

Стимулюючі електроди розміщували у зоні stratum radiatum ділянки САЗ (ортодромна стимуляція нейронів ділянки САІ). Тривалість стимулюючого імпульсу була 200-500 мксек, амплітуда досягала 15 Вольт. Частота стимуляції змінювалась у диапазоні 0,1-0,3 Гц. Електрод, реєструючий популяційний постсинаптичний потенціал і популяційний потенціал дії, розташовували у зоні stratum pyramidale ділянки САІ. Для вивчення електрофізіологічних властивостей окремих нейронів у зрізі (реєстрація постсинаптичного струму) використовувалась методика, розроблена раніше CGaraschuk et al., Neurosci.Lett. 135:10,1992).

Для реєстрації іонних струмів через мембрану досліджуваних нейронів використовували мікропіпетки з боросилікатного скла (1-2 МОм). Внутрішньоклітинний розчин містив (у мілімолях/літр): CsF 100; NaHjPO,} 40; HEPES-CsOH 10; Tris-Cl 10 (pH 7.3). Іони калію були вилучені з внутрішньоклітинного розчину з метою усунення калієвої провідності, на яку дуже впливає аденозин (Gerber et al., J.Physiol. 417:567, 1989). Фтор у

внутрішньоклітинному розчині застосовувався для зменшення витоку та підвищення стабільності струму, який реєстрували.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ Методика, яка була застосована для приготування зрізів гіпокампу з метою внутрішньоклітинної реєстрації, призводить майже до повної втрати інтернейронів ділянки САІ. В результаті цього втрачається обумовлена цими інтернейронами гальмівна синаптична передача, що підтвердили досліди з бікукуліном (10 мкМ), блокатором гальмівної синоптичної передачі в гіпокампі (Sloviter, Hippocampus 1:31, 199!). Це дозволяє одержати зручну модель для вивчення збуджуючої синаптнчної передачі (САЗ-СА1) в гіпокампі.

Трансмембранні струми, які реєструвалися при -60 мВ, мали амплітуду близько 10-100 пікоампер в залежності від сили стимуляції, загального стану синаптичнпх контактів, розміру клітини та розгалуджекості її дендритів. Струми мали характерну синаптичну затримку 2-4 мсек, тривалість фронту зростання 4-7 мсек (залежно від температури) і були потешгіалозалежні. Реєстрація проводилась на протязі тривалого періоду (біля двох годин).

Щоб з'ясувати, чи '.являється .зареєстрований ЗПСС полікомпонеіпнйм, досліджувався вплив селективних антагоністів NMDA (APV) Ta'He-NMDA

(CNQX) рецепторів у концентраціях 100 та 10 мкМ відповідно. Прикладення кожного з блокаторів призводило до часткового зменшення ЗПСС, а одночасне додавання двох блокаторів - до повного .зникнення ЗПСС. Беручії до уваги, ідо ми реєстрували виключно збуджуючий постсинаптлчний струм (що витікає з методики приготування зрізів) та моносинаптичний характер передачі у системі САЗ-СА1 (Andersen et al., J.PhysioI. 307:273, 1980), можна стверджувати, що постсинаптичний струм складався тільки з двох компонентів, обумовлених відповідно NMDA та не-NMDA рецепторами (NMDA- та ne-NMDA-компонентів).

Таким чином, та частка струму, яка залишалася при блокуванні синаптичної передачі за допомогою 100 мкМ APV, була виключно He-NMDA-компонентом. Струм, що являв різницю між струмами у контролі та в присутності APV, був, відповідно, NMDA-компонентом. Приклади реєстрацій наведені на мал. 1А- Як видно, He-NMDA-KOMnoneHT розвивався швидко і досягав свого максимуму в перші 10 мсек і швидко спадав (в наступні 20-30 мсек зменшувався на 90%); NMDA-компонент розвивався більш повільно (досягав максимуму за 20-40 мсек) і значно повільніше спадав (протягом 100 мсек зменшувався тількі наполовину). ,

-З Ом ІЗ

APV

о - це-NMDA • - NMJJA

100

1

г

W

200

-> -3-00 ЗІІСС(пА)

•І Оме

Мал. 1. Метод розподілу інтегрального ЗПСС на компоненти. На (А) наиодені накладені одии на одного сумарний ЗПСС (контроль), ЗПСС и присутності 100 мкМ АРУ (нс-ММОА-компоисіп) и рЬниим між ними ^МОЛ-коміюнснт, жирна лінія). Піптрнмушіннй. потенціал указам біля кожної кривої. На (В) наисдсні иольт-аммерні характеристики нікім N М О А- (•) и нс^МОА-етрумін (О). Тут. і далі: кожна кріпи • усередненії» чотирьох гіослілииніїх иіапопілсіі, іісрИікіип.ііа лінія - стандартна Помилка кимірюкшин.

На мал. 1Б наведені вольт-ампєрні характеристики піків обох компонентів ЗПСС. З малюнків можна бачити, що вольт-ампериа характеристика (ВЛХ) ,не-NШЛ-к'смпоненту лінійна у всьому діапазоні підтримуваних потенціалів з потенціалом реверсії біля +5'+■ +10 мВ, тоді як ВЛХ ИМ ИЛ-компоненту ЗПСС має чітко виражену нелшіііність в інтервалі -100 -г -ЗО мВ.

На протязі перших 7-Ю мсек після стимулу в інтегральному ЗПСС значно переважає не-ЫМОЛ-компонент, а в діапазоні понад 30-40 мсек, навпаки, -КМЭА-компонент. Отже, '’ранній" та "пізній" компоненти інтегрального ЗПСС можуть бути мірою не-ММОЛ- та ММОЛ-компопеїпш відповідно. Як видно з мал. 2, метод забезпечує цілхом прийнятну якість розподілу інтегрального' ЗПСС на компоненти. ' '

(О) та миттєвого значення сумарного-ЗПСС, вимірянного на 7-ій мілісекунді (д).

(Б) Накладені одна на одну кольт-амперні характеристики ЫМОА-компоненту (э) та миттєвих значень сумарного ЗПСС, еимірянних на 40-ііі (&) і 75-ііі (А) мілісскундах.

кожного з компонентів в інтегральний ЗПСС (а не їх амплітуди), можна обирати інші момеїггіі вимірювання струму (не тільки 7-у та 40-у мілісекунду).

Вплив аденозину на постснИаптичшш стпум. В наших експериментах аденозин завжди призводив до швидкого та ефективного пригнічення постсмнаптмчііоі відповіді, причому, як і очікувалося, популяційний потенціал дії (ППД) блокувався значніше, ніж ЗПСС. Так, прикладення аденозину в концентрації 5 мкМ зменшувало амплітуду ЗПСС приблизно наполовину і Практично повністю блокувало ППД. Як ППД, так і ЗПСС швидко відновлювалися під час вілміївки аденозину.

Було встановлено, що аденозин не тільки знижував амплітуду ЗПСС, але й значно змінював його кінетику - прискорював спад струму (мал. ЗЛ). Треба відзначити, що таке зміненім відносного внеску відбувалося не завжди (в трьох випадках з п'яти). Ми почали застосовувати відношення "пізнього” компоненту ЗПСС до "раннього" для того, щоб охарактеризувати кінетику ЗПСС. З

А

100

Б

100

-100 -50 0 50 -100

і .... І ... . . . і і .

-50

0

Ч -100

Ут(мВ)

-200

в- КМОЛ Д* 40мс А- 75мс

-200

ЗПСС(пА) -300

ЗПСС(ііА) "30°

Мал.2. (А) Накладені одна на одну вольт-амперні характеристики не-ЫМИЛ-компоненту'

Оскільки реальний інтерес представляють тільки змінення відносного внеску

А

Аденозин

Б

С 200

о

О

С 100

СО

<р

W

контроль

і час(хвил)

Мал.З. Вплив аденозину на ЗПСС.

Підтримуваний потенціал: -60 мВ. (А) Аденозин (5 мкМ) ефективно пригнічував амплітуду ЗПСС (верхні криви) і прискорював спад струму (нижні криви, лронормовані по піках). (Б) Верхній графік - зміна за часом миттєвих значень сумарного ЗПСС на 10-ій (О) та 40-ій (•) мілісскундах. Нижній графік - зміна за часом їх співвідношення. Чорний прямокутник відповідає інтервалу прикладення 5 мкМ аденозину.

нижнього графіку (мал. ЗБ) видно, що аденозин більш ефективно блокував пізній компонент. .

Отже, аденозин одночасно змінює як амплітуду, так і кінетику ЗПСС. Відомо, що пригнічення ЗГІСС у гшокампі під впливом аденозину пов'язано з активацією А| аденозинових рецепторів (Alzheimer et а\., Enr.J.Pharmacol. 196:313, 1991; Lee et al., brain Res. 260:156, 1983). Щоб з'ясувати які з рецепторів (А і чи Аг) беруть участь в регуляції кінетики ЗПСС, були проведені експерименти з використанням селективних агоністів аденозинових рецепторів.

Ш-пиклопентіладенозин (СРА), селективний агоніст А| рецепторів, викликав той самий ефект, що й аденозин. На мал. 4А приведені приклади зареєстрованих струмів при прикладенні 5 мкМ аденозину та двох різних концентрацій СРА (20 нМ, 750 нМ). На мал. 4Б приведені вольт-амперні характеристики "раннього" (ие-NMDA) та "пізнього" (NMDA) компонентів ЗІ1СС, шо були отримані з тієї ж "літний. З графіків видно, що ні аденозин, ні СРА не змінювали форм ітлі.т-амперних характеристик, а призволили тільки до непропорційного зменшення кожною з компонентів у псі,ому діапазоні пі.йричуиаїшх uou'tiui.riiu (мал! 4і?|-

Б

Vm=- ІОмІЗ

-100 “50

Ui-j-i-.-I

J-<-U4-1 І J« I ■ l_J,<

V*/ и / ■/

100/°

\j£

50

-J

Vm(Ml3) -100 , .

-200

-300

-400

-*-500

ЗГІСС(пА)

^CPA(750)

-100

t-J—L_

-50

v*-# ~ */

/P 4

9

100/$

'Ї 50

-100 -200 -300 -100 J -500

ЗПСС(пЛ)

-

100 к о У

75 © и СJ

50 с го

гь 5 »о

0 О о

-70 -CO -50 -40 -30 -20 -10 _

, Vm(MB) ”

Мая.4. CPA імітує дію аденозину.

(А) як аденозин (5 мкМ), так і СРА (20 та 750 нМ) пригнічували ЗПСС (верхні криви) і прискорювали спад струму (нижні криви, пронормовані по піках). (Б) Ні аденозин, пі СРА не змінювали форм вольт-амперйих характеристик кожного з компонентів ЗПСС, воші тільки непропорційно зменшували обидва компонента. О і Л - миттєвії значення ЗПСС в нормальному розчині на 10-ій та 75-ііі мілісєкундах відповідно. « і і • такі самі значення, але в присутності 5 мкМ аденозину (зліва) або 20 нМ СРА (справа). (В) 1 аденозин і СРА переважно пригнічували NMDA-компонент ЗПСС у всьому діапазоні підтримуваних потенціалів. На графіках наведені відношення миттєвих значень ЗПСС на 75-ііі і ІО-ій мілісєкундах. О - нормальний розчин, а - 5 мкМ аденозину (зліва) або 20 нМ СРА (справа).

CGS-21680, селективним агоні'ст Aj рецепторів, в концентрації 200 ііМ п наших експериментах не впливав ні на кінетику, ні на амплітуду ЗПСС.

Виходячи з результатів дослідів з цими двома аго)летами аценозинових рецепторів, можна зробити висновок, що за зміни як амплітуди, так і кінетики ЗПСС у СА1 нейронах гіпокампу відповідають тільки А1 адснозинові рецептори.

Дія аленозин-деамінази (ADAt і Н-никлопеитілтеосЬіліну (СРТ) на ЗПСС, Незважаючи на відмінність у кількісних оцінках, існує загальна думка, що в зрізі гіпокампу завжди присутня фонова концентрація ендогенного аденозину (близько 1 мкМ) (Fredholm et »!., Brain Res. 295:127, 1984). Ця базальна концентрація не постійна і в критичних випадках (наприклад, при ішемії або гіпоксії) може значно збільшуватися.

Такий рівень ендогенного аденозину дозволяє очікувати, що значна частина аденозинових рецепторів тонічно активована. Отже, всяка дія, яка призводить до зменшення зовнішньоклітинної концентрації вільного аденозину, повинна зумовлювати збільшення постсинаптичної відповіді. Для перевірки цього припущення ми вшсористували ADA. Дійсно, прикладення 0,5 од./мл ADA призводило не тільки до збільшення ЗПСС, але і до переважного зростання пізньго компоненту. Середнє збільшення швидкого компоненту складало 1,3±0,2 рази, повільного - 1,б±0,3 рази (п=3). ,

Мал.5. Вплив СРТ на ЗПСС.

ШлтрнмупаїніІІ потенціал: -50 мВ. Верхнії! графік - зміна за часом мнтгєшіх значень сумарного ЗПСС на 10-ііі (О) и 40-ііі (•) лілісскундах. Нижній графік - зміна за часом їх спіпнпношскня. Чорний прямокутник ишіавідас іиісрнилу прикладення 250 иМ СРТ.

До подібних результатів призводило прикладення селективного антагоністу А) рецепторів - СРТ. Правда, в цьому випадку збільшення струму було більш значним. Аплікація 250 нМ СРТ (мал. 5) призводила не тільки до помітного

135:10, 1992), але ґі до дуже сильного сповільнення спаду постсинаптичного струму. В присутності СРТ, після досягнення свого максимального значення, амплітуда ЗПСС починала повільно спадати (мал. 5Б, верхній графік), при цьому відношення амплітуд раннього компоненту ЗПСС до пізнього залишалося змінентшм навіть після відмивки СРТ (мал. 5Б, нижній графік). Дія цього антагоністу на ностсинаптИчннй струм у зрізах дорослого щура (18 місяців) виявилася аналогічною (2 експерименти). . .

Також цікаво, що на відміну від аденозину, СРТ завжди призводив до зміни співвідношення компонентів ЗПСС.

Чи являється ефект СРТ цілком антй-адеиозшіовим, чи включає в себе інші фармакологічні дії? Чи можливо, що дія СРТ пов'язана із зміною кінетики окремо взятого компоненту ЗПСС? Для відповіді на ці запитання була проведена серія дослідів по вивченню дії СРТ окремо на кожний з компонентів (мпл. б). Т'МОА-компонент усувався додаванням до зовнішньо клітинного розчину 100 мкМ АРУ. Прикладення 2,5 мкМ СРТ призводило до майже двократного збільшення не-ММОА-компоненту (мал. 6А, верхні криві). Пронормовані та Накладені одна на одну криві постсинаптичного струму виявили те (Мал. 6А, шіжііі криві), іі(о кінетика не-^МОА-компоненту не змінювалась під впливом СРТ. На мал. 6Б представлені дані експерименту з блокованим не-ИМІЗА-компонентоМ за. допомогою 10 мкМ CNQX. Результат шшвнвся таким самим: ММОА-компонент зростав, у той час, Як' його кінетика

збільшення амплітуди ЗІІСС, що зазначалося раніше (ОагаэсЬик еі аі., Иєшоїсі.ієП.

АРУ

■р

ЛРУ+СРТ

ЮОпА

50п А

50мс

50мс

1/

50мс

50 м с

Мал.6. Вплив СРТ окремо па кожний з компонентів ЗПСС. Підтримуваний потенціал: -50 мВ. Пояснення у тексті. .

залишалася незмінною. Усереднені величини потенціації ЗПСС такі: 1,9±0,3 (п=3) в присутності APV і 3,6±0,9 (п=3) в присутності CNQX. *

Отже, змінений кінетики сумарного ЗПСС під впливом аденозину пов'язано не із зміненням кінетики будь-якого з компонентів струму, а з неоднаковим зміненням відносного внеску кожного з компонентів.

Аденозин не поизводить по зміни магнієвого блоку. Нелінійність вольт-амперної характеристики NMDA-компоненту постсинаптичного струму викликана потенціал-залежним блокуванням цих каналів іонами магнію. Через те, що аденозин спроможний впливати на мембранний потенціал (модулюючи калієву провідність), а компоненти ЗПСС мають дуже різні форми ВАХ, відносні зміни компонентів ЗПСС під впливом аденозину можуть бути неоднаковими.. Так раніше і намагалися пояснити дію аденозину на співвідношення компонентів у сумарному постсинаптичному потенціалі (de Mendonifa & Ribeiro, Brain Res. 606:351, 1993). У нашому випадку аналіз ефектів, викликаних дією аденозину або СРТ, не дозволяє пов'язати їх з можливими змінами в ефективності магнієвого блоку:

1) відношення раннього та пізнього компонентів постсинаптичного струму під впливом аденозину або СРА змінювалось однаково у всьому діапазоні підтримуваних потенціалів (мал. 4В);

2) збільшення амплітуди NlylDA-компоненту ЗПСС супроводжується збільшенням нахилу вольт-амлерної характеристики (тобто провідності каналів) цього компоненту у "позитивному" діапазоні підтримуваних потенціалов (аж до +30 мВ), де магнієвий блок вже відсутній. Були проаналізовані зміни вольт-амперних характеристик під впливом 60 нМ СРТ у діапазоні підтримуваних потенціалів -10 + +20 мВ (п=3): крутизна вольт-амперної характеристики NMDA-компоненту зросла в 3,1±0,6 рази, не-NMDA-компоненту - в 2,0±0,4 рази.

У ряді експериментів використовувалися міні-зрізи гіпокампу з відокремленою ділянкою САЗ для того, щоб зменшити збуджуючий вплив САЗ-нейронів. За таких умов виявилось можливим знизити концентрацію зовнішньоклітинного магнію від 500 мкМ до 10 мкМ без виникнення епілептичної самогенерації у зрізі. Прикладення 125 мкМ СРТ призводило до таких самих результатів, що й у нормальному розчині.

Спільна ліи м-конотоксину та СРТ на ЗПСС. Відомо, що в нейронах гіпокампу аденозин (через Aj рецептори) блокує кальцієві канали N-типу (MacDonald et al., J.Physiol. 370:75, 1986; Gross et al., J.Physiol. 411:585, 1989). Тому ми провели ряд експериментів по дослідженню можливого впливу и-конотокснну GVIA (ш-СТХ) - специфічного блокатору цих каналів - на кінетику ЗПСС. Дані, приведені на мал. 7, показують, що пригнічуючи синоптичну передачу, м-СГХ (1 мкМ) зовсім не впливав на кінетику ЗПСС, проте, наступне прикладенни 250 їїМ СРТ демонструвало вже відоме переважне збільшення NMDA-компоненту ЗПСС. Поїтуне прикладення ш-СТХ (вже на фоні СРТ) ніяк Ке нплннало на синаитичну передачу, показуючи, шо збільшення ЗПСС піл впливом СРГ відбувалося не за рахунок активації додаткових кальцієвих каналів N-ишу. Проте, концентрації зоннішньоклітміїних іонів кальцію та

Ю' »

А

контроль

ш-СТХ

V—

шдмивка

СРТ

V

200пЛ

ЮОмс

V»» *“ — —|

1+2 у 1+3 1+4

Б

о

и

К

п

100

75 50 ' 25 О

/

о

ю

20 30 4 О

час (хвил)

50

_|

00

Мал.7. м-СТХ не змінює кінетики' ЗПСС і не перешкоджує змінам, що викликаються СРТ. Підтримуваний потенціал: -50

мВ. (А) Аплікація 1 мкМ м-СТХ пропорційно зменшувала обидва компоненти ЗПСС (верхні криви). Послідовне пркладення 250 нМ СРТ призводило до переважного зростання N МПЛ-компо-ненту. Нижні криви (гіронормо-вані по піках) демонструють однакову зміну компонентів ЗПСС під впливом га-СТХ і неоднакову - під впливом СРТ.

(Б) Повторне прикладення и-СТХ вже но вплітало на ЗПСС. Верхній графік - зміна за часом миттєвих значень сумарного ЗПСС на 10-ііі (О), и 40-ій (•) мілісекундах. Нижній графік -зміна за часом їх співвідношення. Білий прямокутник відповідає інтервалу прикладення 1 мкМ <о-СТХ, чорний - 250 нМ СРТ.

магнію сильно впливають на модуляцію співвідношення компонентів ЗПСС аденозином. Наприклад, ефект СРТ проявлявся значно слабше у розчині, шо містив 1,5 мМ Са2+ і 1,5 мМ ніж у "стандартному" розчині (2,5 мМ Са2+ і 0,5 мМ Мв2+). Це свідчить про те, що саме через іони кальцію (і магнію) обумовлений вплив Аі аденозинових рецепторів на кінетику ЗПСС.

Аденозин не впливає безпосередньо на канапи, шо активуються гяутпматом. В окремій серії експериментів ми дослідили можливий вглив аденозину та його' антагоністів на чутливість ізольованих нейронів до нейромедіатору (глутамату). Спільне прикладення 10 мМ аспартату і 10 мкМ гліцину призводило до виникнення струму через ММОА-кпнали, який повільно інактивупапся. Преаплікація (на одну хвилину раніше) 10 мкМ аденозину не впливала ні на амплітуду, ні на форму струму. Такі самі результати були отримані з преанлікацією 2 мкМ СРТ. Ми також з'ясували, що ні аденозин, ні СРТ ніяк

її

не впливали на струми через не-КМ ОА-клшіли (у відповідь на прикладення квіскволату).

Ці експерименти на ізольованих нейронах показали відсутність будь-якого безпосереднього впливу аденозину на КМОА- і нс-ЫМОА-рецептори.

Ми досліджували вплив диадеиозИн-поліФосФатіа.. (Дй^Л те>. Др^Д)—Яй

Основна частина експериментів була проведена з використанням АР5А, тому що у контрольних експериментах нам не вдалося виявити значних розбіжностей між діями Ap<jA і АР5А. Обидві речовини викликали пригнічення як ЗІІСС, так і ІШД. ' ,

Дії аденозину та Ар$А на амплітуду і кінетику ЗПСС були значно схожими. Трохи інша картина спостерігалась при реєстрації ППД. Практично завжди після відмивки АР5А ТТІІД короткочасно зростав відносно свого початкового значення на 10-20 96, хоча процес потенціації (часткового відновлення) починався ще на фоні АР5А (мал. 8). Цей ефект в наших експериментах ніколи не спостерігався при прикладенні аденозину, хоча схожа поведінка ГІГТД (постінгібіторна потенціація аденозином) вже раніше спостерігалася іншими дослідниками (Nishimuraet a!., Neurosci.Leit. 139:126,1992).

Існує ряд робіт, в котрих показано високу спорідненість дизденозиН-иоліфосфатів до Pj рецепторів, але іі досі залишалась нез'ясованою дія цих речовин на рецептори Pj типу (аденозинові рецептори). Зараз стало очевидним, що в гіпокампі зденозин-поліфосфати викликають пригнічення сйнаптичної передачі та, подібно аденозину, обумовлюють свою блокуючу дію через активацію А} рецепторів (додавашія 125 нМ СРТ до зовнішньоклітйшіого розчину повністю усувало це блокування). Також, подібно аденозину, АР5А

Мал.8. Вплив Ар3А на ППД.

Внизу - зміна за часом амплітуди популяційного спайку, зверху - приклади рсєструсміїх відповідей у моменти, шо показані цифрами на графіку. Чорний прямокутник відповідає інтервалу прикладення 5 мкМ Ар5А.

при додаванні цих речовин, у зовнішньоклітинний розчин.

1

W

з

-MfV—:

їмВ

50мс

II

є

Ар5А

“ з

<2 4

час(хвйл)

о

. 10

20 ЗО

ЗО

40

50

в -

t

1

О

час(хвил)

і

о

30

60

90

120

150

М*я.9. Зміна за часом амплітуди популяційного спайку. Чорний прямокутник відповідає інтервалу прикладення 5 мкМ Ар5А, білий - 2,6 мкМ стауроспорину.

може модулювати кінетику ЗПСС (знову ж через Аі рецептори).

Відмінними особливостями Ар5А була "часткове відновлення* ППД на фоні АР5А та "пост-інгібіториа потенціація" (мал. 8). В багатьох випадках ці ефекти блокувалися при інкубації зрізу в розчині, який містив 5 мкМ стауроспорину (мал. 9) або 0,1 мкМ сфінгозину (інгібіторів протеїн-кінази С).

Результати даної роботи показують, що в гіпокампі аденозин призводить до зменшення звільнення нейромедіатору і, до того ж, по-різному впливає на відносний внесок компонентів ЗПСС, обумовлених різними рецепторами збуджуючих амінокислот. Раніше було показано, що в гіпокампі NMDA-кбмпонент збуджуючого постсинаптичного популяційного потенціалу (порівняно з не-КМОА-компонентом) більш чутливий до пригнічуючої дії 2-хлоро-аденозииу (більш стійкого аналогу аденозину) (de Mendon<;a & Ribeiro, Brain Res. 606:351, 1993). Це явище пояснювали постсинаптичною дією:

гіперполярізація мембрани постсннаптичної клітини аденозином підсилювала магнієвий блок NMDA-каналів. Результати нашої роботи узгоджуються з даними, отриманими цими дослідниками, але змушують по-новому подивитись на цей феномен та шукати йому пояснення, яке відрізняється від запропонованого ними.

'Отриманий ефект не зв'язаний з нелінійністю вольт-ампер/юі характеристики NMDA-рецептор-кероваиих каналів.

Враховуючи розгалудженість дендритів САІ пірамідних клітин гіпокампу можна припустити, що.великий опір доступу призводив до помилки у фіксації потенціалу на постсимаптичній терміналі. З іншого боку, відомо, шо аденозин

ОБГОВОРЕННЯ

спроможний впливати на калієву провідність, що змінює потенціал спокою клітини і шунтує опір доступу. Це може привести до того, що помилка у фіксації потенціалу (отже і значення мембранного потенціалу в районі синапсу при фіксованому мембранному потенціалі на сомі СА1 нейрону) буде залежати від концентрації аденозину. Щоб позбавитися цієї залежності, калій у внутрішньоклітинному розчині був замінений на цезій, котрий блокує більшість типів калієвих каналів.

Результати всіх експериментів свідчать проти гіпотези "магнієвого блоку":

(1) зниження зовнішньоклітинної концентрації магнію (від 500 до 10 мкМ) не усувало ефекту зміни співвідношення компонентів ВПСТ під впливом СРТ;

(2) співвідношення компонентів змінювалось у всьому діапазоні підтримуваних потенціалів;

(3) поряд з переважною зміною амплітуди NMDA-компоненту також більше змінювався нахил його вольт-амперної характеристики (в області позитивних підтримуваних потенціалів, де немає "магнієвого блоку").

Зміни концентрації пейромедіатору в синоптичнії щілині.

Дуже просте пояснешш спостережуваного ефекту: аденозин і СРТ

призводять до зміни кількості медіатору, що звільнюється о синаптичну щілину, тобто до зміни ного концентрації. З цього можна зробити два висновки:

1) Оскільки різні рецептори збуджуючих амінокислот відрізняються спорідненістю до глутамату (NMDA-рецептори мають більш високу спорідненість) та кількістю місць зв'язування (не-NMDА-рецептори - одне, NMDA-рецептори - два), тому, можливо, вони мають досить відмінні форми кривих доза-ефект. Отже, при змінах кількості вивільненого медіатору зміни компонентів ЗПСС цілком можуть бути непропорційними.

2)3 іншого боку, виявлений нами ефект може бути обумовлений метаботропною дією глутамату, який при додаванні у зовнішньоклітинний розчин, викликає довготривале збільшення NMDA-компоненту ЗПСС в гіпокампі молодих щурів (Garaschuk et al., Neurosci.Letl. 151:29, 1993). Більш того, глутамат викликає збільшення частоти відкривання NMDA-рецептор' керованого каналу (Kovalchuk et al., Neuroscience 54:557, 1993).

Проте, найважливішим аргументом проти впливу концентрації пейромедіатору в синоптичнії щілині на форму ЗПСС являються досліди з со-СТХ. Відповідно до існуючої парадигми ш-СТХ виявляє свою пригнічуючу дію на синаптичну передачу через селективне блокування пресинаптичних кальцієвих каналів N-типу, зменшуючи, таким чином, кількість звільненого медіатору. Отже, в нашому випадку т-СТХ і аденозин повинні мати однакову дію на ЗПСС. Проте, при прикладенні ш-СТХ співвідношення компонентів ЗІІСС лишалося незмінним (мал. 7).

Отже, якщо зміна концентрації агоністу будь-як і впливає на кінетику ЗПСС, то воно не являється ключовою дією в ефектах, викликаних аденозином або СРТ.

и

Постсипаптична дія аденозину.

Іншим пояснениям вшіиденого ефекту може бути безпосереднії! ВПЛИВ аденозину (або аденознновлх рецепторів) на рецептори збуджуючих амінокислот на постсиїїгштичній мембрані. Якщо така взаємодія і має місце, то тільки з рецепторами безпосередньо в постсинаптичному закінченні, тому, що експерименти на ізольованих клітинах дали негативний результат. Якщо існує різниця між рецепторами і каналами, розташованими на сомі та постсинаптлчних закінченнях, то вона тільки кількісна, а не якісна. Отже, якщо ефект має постсинаптичну природу, то пін повинен виявлятися і на сомі, і на постсииаптичних закінченнях (хоча може й в різній мірі).

На жаль, инкорнстаиа методика швидкої аплікації агоністів не дозволяла застосувати короткочасні аплікації нейромедіаторів (тривалістю декілька мілісекунд), як це відбувається у реальному сннапсі. Тому, дані, які були отримані на ізольованих клітинах, не можуть цілком довести відсутність постсинантичного вкладу в ефект аденозину або СРТ.

Пресшиттична дія аденозину.

Щоб пояснити можливість пресннаптичіїої дії аденозину на кінетику ЗПСС можна припустити існування регуляції співвідношення глутамату і аспартату в загальній кількості звільненого пейромедіатору, що може призводити до зміни співвідношення компонентів ЗПСС, оскільки аепартат є агопістом тільки NMDA-рецепторів, а глутамат - агопістом обох типів рецепторів (NMDA і не-NMDA). Для такого припущення є ряд передумов (МсПеап & Roberts, Nature 291:593, 1981; Burger et al.. Neuron 3:715, 1989; Martin et al., J.Neurochem. 56:1647, 1991; Dickie et al., Neurosci.Lett. 138:145, 1992). .

З іншого боку, відомо, що аденозин спроможний збільшувати провідність мембрани клітини для іонів калію, що повинно призводити до зменшення трансмембранного калієвого градієнту і, тим самим, до зниження ефективності роботи глутаматного переносчика плазматичної мембрани (Barbour et al, Nature 335:433, 1988). Тгікий вплив на його роботу може збільшувати як час знаходження пейромедіатору у сіпіаптичній щілині, так і його рівноважну зовнішньоклітинну концентрацію. В свою чергу, можна припустити, що незмінна фонова концентрація глутамату в синаптичніи щілині може частково інактивуватп He-NMDA-рецептори, тим самим зменшуючи частку відкритих каналів, зв'язаних з цими рецепторами, під час викиду неііромедіатору. NMDA-рецептори, як відомо, практично не інактнпуютьсн. Таким чином, не виключена можливість непрямої модуляції кінетики ЗГІСС через регуляцію базальної концентрації зовнішньоклітніпіого глутамату.

Дія аденозину на кінетику ЗПСС обумовлена А / рецепторами.

Эксперименте з внутрішньоклітинною реєстрацією від САІ нейронів показали, шо більша частина але пози нового виливу на кінетику ЗПСС відбувалася у діапазоні фонових (базальних) концентрацій лдеіпмину, німу, шо прикладення СІЧ (порівняно t адсноіином) шіічаіпю нритопі к> до більш

И .

значних змін співвідношення NMDA- і ne-NMDA-компонентів. До того ж, в деяких випадках (приблизно в 40 %) додавання аденозину не впливало на це співвідношення. Це свідчить про те, що при базальній концентрації аденозину система, яка регулює співвідношення NMDA- і ne-NMDA-компоііентів ЗГІСС, насичена. Необхідно, правда, зробити поправку на зріст помилки у вимірюванні відношення компонентів при сильному Пригніченні ЗПСС високими концентраціями аденозину.

СРТ має константи зв'язування з Aj і А2 аденозиновими рецепторами 10,9 нМ і 1440 нМ відповідно (Bruns et аі., ШІ.ҐІшгтасоІ. 29:331, 1986). Отже, ефективність СРТ у десятипаномолярному діапазоні визначає, що саме Aj рецептори регулюють як (1) амплітуду ЗПСС, так і (2) відношення між NMDA-

і ne-NMDA-компонентами. В концентрації більшій, ні;;; 1 мкМ, СРТ блокує також і А2 рецептори. Проте, ефект СРТ практично насичувався при концентрації 60-100 иМ. Фармакологічна специфічність спостереженою феномену була також перевірена і в інших експериментах:

(1)СРА, селективний агоніст А] рецепторів, викликав такі ж самі ефекти, що іі

аденозин (мал. 4); . .

(2)селективний агоніст А2 рецепторів (CGS-21680, 20-300 нМ) був абсолютно

неефективним. .

Незворотність дії СРТ, певно, пов’язана з його гідрофобністю, що ускладнює його вимивання зі зрізу. Повільний спад Потенційованого ЗПСС також легко пояснити: ліквідування аденозинової блокади призводить до підвінценного викиду нейропередатчику (глутамату і аслартату), що, в свою чергу, призводить до збільшення входу кальцію в постсинаптичну клітину (через NMDA-каиали), тобто до кальцієвого токсикозу.

Роль кшьцієвих каналів в сішаптичнш передачі.

Викид нейромедіатору в синаптичну щілину може відбуватися кількома відносно незалежними шляхами. Було показано, що існують як. Са2+-залежНий (викликається входом кальцію через N-капали), так і Са2+-незалежнии шляхи викиду нейромедіатору (Kauppinen et al., Neuroscience 27:175, 1988). В останньому випадку глутамат і аспартат можуть звільнюватися за рахунок реверсії механізму зворотнього поглинання нейромедіатору (невезикулярний викид) (Szatkowski et al.. Nature 348:443, 1990). і

Якщо феномен неоднакові зміни NMDA- і iie-NMDA-компонентів ЗПСС дійсно має пресинаптичну природу, то поясненім йому треба шукати у впливі аденозину на механізми викнду нейромедіатору. Складність ситуації полягає в т^му, що аденозин спроможний впливати на всі вищезгадані шляхи викиду медіатору. Отже, будь-який з цих Механізмів потенційно може впливати на зміну процентного співвідношення глутамату і аспартату в загальній кількості звільненого нейромедіатору. Результати Цієї роботи показують,. що кальцієві канали N-типу (адепозин-.чутливі), які р гулюють викид медіатору, не впливють на це співвідношення (мал. 7).

Враховуючи різну специфічність переносчиків везикулярної та плазматичної

мембран (Маусох et al., Trends Neuroaci. 13:83, 1990), можна припустити, що співвідношення NMDA- і ne-NMDA-компонентів ЗПСС може регулюватися відносним внеском в загальний викид медіатору різних механізмів викиду: везикулярного (в основному, глутамат з везикул) та невезикулярного (і глутамат, і аспартат з прееинаптичної цитоплазми). В такому випадку необхідно також припустити, що нсвезикуляршш викид медіатору має більшу чутливість до аденозину і, мабуть, являється повністю заблокованим при базальнії! концентрації аденозину. Тому іноді додавання до зовнішньоклітинного розчину додаткового аденозину або м-СТХ може не призводити до змінення співвідношення компонентів ЗПСС.

Експерименти з аплікацією СРТ в модифікованому розчині (1,5 мМ Са2+ і 1,5 мМ Mg2+) виявили ключову роль іонів кальцію і/або магнію в регуляції співвідношення компонентів ЗПСС. Відомо, що аденозин блокує кальцієві канали як N-, так і Р-типу, а и-СТХ - тільки N-типу. З іншого боку, обидва ці класи кальцієвих каналів беруть участь у процесі звільнення неїіромедіатору в гіпоклмпі (Takahashi & Momiyama, Nature 366:156, 1993). Враховуючи відмінності дій ш-СТХ і СРТ на співвідношення компонентів ЗПСС (мал. 7) можна припустити, що на кінетику ЗПСС впливає не тільки кальцій, який входить до клітини, але і шлях, яким він проникає до клітини. Подальше дослідження з використанням специфічних блокагорів кальцієвих каналів P-типу може пролити світло на цю загадку.

. Особливості дії динукпеотидів па синоптичну передачу.

На сьогоднішній день найбільша проблема при роботі з динуклеотидами - їх відносна нестабільність. Вони досліджуються зовсім недавно, тому м досі не з'явилося повідомлень про існування стабільних аналогів. А оскільки в організмі динуклеотиди швидко розщеплюються динуклеозид-поліфосфатазами до аденозину, AMP, ADP, АТР і т.д., то практично неможливо точно визначити причину ефекту прикладення динукпеотидів до тканин, в котрих і аденозин, і АТР викликають свої незалежні ефекти.

Кожний з компонентів суміші аденозинових похідних (аденозин, аденозии-поліфосфати, диаденозин-поліфосфат), яка створюється під пас проникнення диаденозин-поліфосфата в зріз гіпокампу, спроможний активувати адснозинові рецептори, котрих дуже багато в цьому відділі мозку. Результати даної роботи демонструють, шо подібна суміш ефективно блокує синаптичну передачу в зрізах гіпокампу. Показано, Що блокування має місце при активації А| аденозинових рецепторів.

Природно, що диаденозин-поліфосфати будугь імітувати дію аденозину, • додаючи до загальної картини свої індивідуальні ефекти (мал. 8, 9). Поки-шо залишаються без відповіді наступні питання: з чим пов'язані часткове відновлення популяційного ііосгсиїїаптичііого потенціалу на фоні ЛР5Л та його посгінгібіторна потениіапія після вилучення . ЛР5Л is зонніппіьокліГиниого розчину. Можна тільки припустити, шо не - процес попільної погсннілпії (механізм невідомий), накладений на процес швидкого прнтічеипя (акмтацін

Aj рецепторів). Відомо також, що повільна потенціаціи обумовлена активацією протеїн-кіназн С (мал. 9) і являється цілком лостспнаптичним ефектом, пов'язаним, мабуть, зі зміною збудливості лостсииаптичної клітини. Це випливає з того, що ефект виявляється при реєстрації популяційного зовнішньоклітинного потенціалу (мал. 8) і повністю відсутній при внутрішньоклітинній реєстрації (тобто при фіксації мембранного потенціалу і перфузії лостсииаптичної клітини). .

Поки-що важко відповісти на запитання: активація (чи блокада) яких рецепторів призводить до виявленої повільної потенціації в гіпокампі? Це можуть бути Р2у пуринові рецептори, які виявлені в головному мозку щурів (Gordon, Biochem.J. 233:309, 1986) і для котрих AP4A та AP5A являються специфічними агоністами (Pintor et al., Br.J.Pharmacol. 103:1980, 1991).

Навіть сам факт існування активного транспорту диаденозин-иоліфосфатів в секреторні гранули лресинаптичних терміналей спроможний привести до висновку, іцо ці природні сполуки грають чималу роль у синалтичні/і передачі. Тому так важливо всебічно вивчити механізм їх дії. Але для застосованого нами електрофізіологічного методу вивчення цього механізму, перш за все, необхідно мати аналоги диаденозин-поліфосфатів, що не розкладаються. Останнє питання можуть вирішити біохіміки. '

ВИСНОВКИ

1. Використовуючи метод фіксації потенціалу па мембрані нейронів у зрізах гіііокампу щурів досліджені загальні властивості збуджуючої синаптичної передачі між пірамідними нейронами ділянок САЗ и СА1. Удосконалення методики реєстрації надало можливість проводити тривалу реєстрацію постсинаптичних струмів (більше двох годин), достовірно розподіляти сумарний ЗІІСС на окремі компоненти і з достатньою точністю реєструвати їх співвідношення. Були виділені два компоненти ЗПСС, які обумовлені активацією рецепторів NMDA и не-NMDA типу. Зареєстрований ЗПСС виявляв такі самі фармакологічні властивості, як і ЗПСС, зареєстрований у зрізах гіпокампу за допомогою інших методик.

2. Досліджено вплив аденозину, його агоиістів та антагоністів на ЗПСС. Аденозин швидко і ефективно пригнічував ЗПСС. Виявлено, що при нормальних умовах у зовнішиьоклітинному середовищі зрізів гіпокампу завжди присутній аденозин у концентрації декілька мікромолів. Отже, аденозиіюві рецептори завжди тонічно активовані, що призводить до часткової блокади синаптичної передачі. Фізіологічна роль цього феномену полягає в здатності нервової системи швидко та зворотньо змінювати ефективність синаптичної передачі (як в бік зниження, так і в бік підвищення).

3. Виявлено, що аденозин, специфічні агоністи та .антагоністи Aj аденозинових рецепторів переважно регулюють внесок NMDA-коміюнепту в сумарний ЗПСС. Ат аленозинові рецептори не беруть участь в подібнііі модуляції.

Знайдено, що прикладання антагоністів А} аденозинових рецепторів призводить до непропорційно більшого збільшений НМОА-комгюненту та подальшої загибелі постсинаптичної клітини. Таким чином, виявлена ще одна нейропротекторна роль аденозину, тобто: аденозин переважно блокує ту частину ЗПСС, яка відповідає за вхід кальцію у постсинаптичну клітину і за подальший кальцієвий токсикоз. .

4. Виявлено, що викликані аденозином зміни співвідношення компонентів ЗПСС, які спостерігаються, не пов’язані з різницею форм вольт-амперних характеристик струмів через NMDA- та не-Т^КША-канали, як вважалось раніше. Зміна ефективності блокування ИМОА-каналів іонами магнію також не може бути причиною знайдених змін у кінетиці ЗПСС.

5. Встановлено, що концентрації зовнішньоклітинних іонів кальцію і магнію значно впливають на ступінь та швидкість розвитку зміни співвідношення компонентів ЗПСС, що викликаються СРТ.

6. Досліджено вплив специфічного блокатору кальцієвих каналів М-тину - м-конотоксину 0\ТА - на синаптичну передачу в зрізах гіпокампу. Виявлено, що іони кальцію, які входять через пресинаїїтичні кальцієві канали Г\г-типу, не беруть участь в регулюванні співвідношення компонентів ЗПСС.

7. Запропоновано ймовірний механізм впливу аденозину на співвідношення компонентів ЗПСС у гіпокампі, що базується на можливій різниці чутливості до блокуючої дії аденозину на обидва механізми звільнення Медіатору -везикулярний та невезикулярний,

8. Досліджено вплив диаденозин-поліфосфатів на синаптичну передачу у гіпокампі. Знайдено, іцо ці динуклеотидн повністю імітують дію аденозину, безпосередньо активуючи А) аденозинові рецептори. Крім того, диаденозин-поліфосфати здатні призводити до розвитку повільної потенціації постсинаптичної відповіді, яка пов’язана з активацією протеїн-кінази С у постсинаптичній клітині.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Klishin A., Lozovaya N., Krishta! О. and Watkins J.C. (1993) Novel antagonists

reveal various roles of metabotropic receptors in regulating hippocampal synaptic transmission, J.Neurochem. 61(Suppl.), S265B.

2. Klishin A., Lozovaya N., Pintor I., Miras-Portugal M.T. and Krishtal O. (1994)

Possible functional role of diadenosine polyphosphates: negative feedback for . excitation in hippocampus, Neuroscience, in press. 5fc>’2.2>5

19

Заказ ІН2 Тир. ICO зкз. г.Укрспоцконта?іпр»скт