Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функции регуляторных цистеин-богатых белков вирусов растений
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Функции регуляторных цистеин-богатых белков вирусов растений"
ЛУХОВИЦКАЯ Нина Иосифовна
На права* рукописи
ФУНКЦИИ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЦИСТЕИН-БОГАТЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ
03.00.06 - ВИРУСОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2006
Работа выполнена в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук Соловьёв Андрей Геннадьевич
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор химических наук, профессор Вартапетян Андрей Борисович
кандидат биологических наук Иванов Петр Алексеевич
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Институт Биоорганической Химии РАН им. М.Н. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Зашита состоится 41. декабря 2006 года в©00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н, Белозерского
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Автореферат разослан Лл » ноября 2006 года
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
Н.О, Калинина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений с вирусными патогенами представляет собой одно из основных направлений современной фитовирусологии и имеет не только большое теоретическое значение, поскольку вирусы в силу простой организации, представляют собой удобную модельную систему для изучения механизмов взаимодействия растение-патоген, но и существенное практическое значение, позволяя разрабатывать эффективные способы защиты растений от вирусной инфекции. Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия вирусных патогенов к растений-хозяев на молекулярном уровне. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе вирусного патогенеза, напрямую связано с изучением фундаментальных биологических процессов в растениях, таких как передача сигнала, регуляция экспрессии генов, межклеточная коммуникация и программируемая клеточная смерть. В представленной работе описана и исследована новая группа кодируемых фитовирусами белков, определяющих характер взаимодействия с растениями хозяевами
Малые неструктурные цистеин-богатые белки (ЦББ) кодируются геномом ряда (+)РНК-содержащих вирусов растений. К ним относятся вирусы родов Hordeivirus, Tobra virus, Benyvirus, Pecluvims, Allexivirus, Furovims, Pomovirus н Carlavirus. По степени структурного сходства ЦББ можно разделить на две группы. К первой относятся белки, кодируемые вирусами родов Hordeivirus, Tobravirta, Benyvirus, Pecluvims и Furovirus. Известно, что белки этой группы участвуют в регуляции репликации и экспресии генома вируса, системного транспорта вируса н являются детерминантами патогекностн. Для. ряда ЦББ этой группы была продемонстрирована способность подавлять PTGS (Dunoyer et а!.. 2002, Yelina et al., 2002, Reavy et al., 2004, Те et al., 2005). Вторую группу составляют ЦББ, кодируемые вирусами, относящимися к двум родам семейства Flexiviridae, Allexivirus и Carlavirus. ЦББ PMTV (Pomovirus) нельзя отнести ни к одной из этих групп из-за отсутствия статистически значимого сходства последовательностей между ним и другими.
Объектами настоящей работы явились ЦББ 8К PMTV {Pomovirus), 12К CVB (Carlavirus) и 15К ShVX (Allexivirus). Функции этих белков ранее небыли изучены.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в изучении функций ЦББ 8К PMTV (Pomovirus), 12К CVB (Carlavirus) н 15K ShVX (Allexivirus). В ходе работы решались следующие основные задачи:
]. Изучение влияния экспрессии ЦББ в составе генома PVX на развитие вирусной инфекции и накопление вирусспецифических РНК в растениях N. benthamiana и N. tabacum;
2. Изучение молекулярных механизмов влияния ЦББ на индукцию защитной реакции растений;
3. Изучение внутриклеточной локализации ЦББ 8К. PMTV и 12К CVB;
4. Картирование районов ЦББ 12К CVB, необходимых для его функционирования в качестве детерминанты патогенности;
5. Изучение способности 12К. CVB связывать нуклеиновые кислоты in vitro.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В ходе работы были изучены функции ЦББ PMTV, CVB и ShVX. Было показано, что при экспрессии в контексте PVX эти белки являются детерминантами вирусной патогенности, не являясь при этом супрессорами PTGS или факторами авирулентности.
Было показано, что функционирование этих белков в качестве детерминант вирусной патогешюсти может осуществляться через систему ответа растения на атаку вирусных и иевнрусных патогенов, которая активируется с помощью генов устойчивости. Были выявлены последовательности ЦББ 12К CVB, необходимые для его функционирования в качестве детерминанты патогенности. Было показано, что I2K CVB связывает нуклеиновые кислоты ш vitro. Работа имеет теоретическое значение для последующих исследований вирусного патогенеза у растений. Полученные данные могут быть использованы при разработке подходов антивирусной защиты, например, при создании устойчивых к вирусной инфекции трансгенных растений.
Апробация работы.
Материалы работы были представлены на российских и международных конференциях: интернациональный симпозиум "Cell biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants" Ялта, Украина, 2002; 10-я путинская школа-конференция молодых ученых, Россия, Пущино, 2006; а также на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии нм. А. Н. Белозерского.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано б печатных работ. Структура работы.
Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Работа изложена на 1JA страницах, содержит ££» иллюстраций и 2 таблицы. Список литературы включаст£ публикаций,
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Геномы вирусов растений, размеры которых весьма невелики, кодируют ограниченное количество белков. В их число входят компоненты вирусной репликазы, белки оболочки, белки, обеспечивающие межклеточный и дальний транспорт вирусной инфекции в растении, белки, участвующие в распространении вируса переносчиками, и супрессоры PTGS. Для большинства известных вирусов растений функции всех кодируемых ими продуктов выявлены экспериментально или предсказаны на основании анализа их аминокислотных последовательностей. Вместе с тем, существует незначительное количество белков фитовирусов, функции которых к настоящему времени остаются неизвестными. К ним относятся малые цистеин-богатые белки (ЦББ), кодируемые рядом вирусных групп. Целью данного исследования было изучение функциональных свойств и сравнительная характеристика трех ЦББ, белка SK PMTV (Pomovirus), белка 12К CVB (Carlavinis) и белка 15К ShVX (Allexivirus).
Влияние ЦББ на развитие инфекции PVX
Белки, определяющие ответ растения на вирусную инфекцию, такие как супрессоры PTGS или факторы авирулентностн, способны существенно менять симптомы Х-вируса картофеля (PVX) при их экспрессии в контексте генома этого вируса (Hammond-Kosack el al., 1995, Scholthof et al., 1996, Pruss el al„ 1997, Brignetti et al., 1998, Li et al., 1999, Yelina et al., 2002). Для изучения возможного влияния на инфекцию PVX гены ЦББ вируса курчавости верхушек картофеля (белок 8К), Б-вируса хризантем (белок 12К) и Х-вируса лука шалота (белок 15К) были клонированы в составе генома PVX (Рис. I).
pvx
-| MET
pvx-ек
-I-
PVX.tIK
-cm
о
PVX-15K
□E
гИз
Рис. 1. Схемы геномов рекомбинантных вирусов, использованных для изучения влияния малых цистеин богатых белков на симптомы PVX. Схематически изображены геномы РУХ дикого
-_ типа (А) и химерных вирусов на основе PVX,
HZZL-qOHIIIJ— несущих ген 8К PMTV (В), ген 12К CVB (С) и " ген 15К ShVX CD). Прямоугольниками
обозначены гены. МЕТ - метнлтрансферазный домен репликазы, HEL - хеликазный домен репликазы, POL — полимеразный домен репликазы. ТОВ1, TGB2 и TGB3 составляют тронной блок транспортных генов. CP — белок оболочки. Стрелками показано положение дуплицированного промогера гена СР.
Плазмидами РУХ-8К, РУХ-12К и РУХ-15К ино кул провали растения N. Ьеп1Ьаппапа. В контрольной инокуляции РУХ дикого типа не вызывал видимых симптомов на инокулиро ванных листьях, тогда как на верхних неинокул про ванных листьях через 7 дни (дней после инокуляции) возникали симптомы мозаики. При заражении РУХ-8К на 5 дни появлялись локальные некрозы на инокулиро ванных листьях (от одного до четырех некрозов на лист), а на верхних неинокулнро ванных листьях возникала мозаика, которая через один день становилась некротической, на 9-10 дли происходила полная некротизация инокулированных листьев и развивался обширный некроз верхних, ней нокулирова иных листьев (Рис. 2), что через 2-3 дня приводило к гибели растений. Фенотип инфекции РУХ-12К и РУХ-15К был сходен с фенотипом инфекции РУХ-8К. (Рис. 2). Основное отличие заключалось в количестве некрозов на инокулированных листьях: при заражении РУХ-12К и РУХ-15К на 5 дли появлялось от 5 до 20 некрозов на лист. При помощи блот-гибридизации РНК было показано, что на 7 дпи уровень накопления вирус-спекцифических РНК в растениях, зараженных РУХ-8К и РУХ-12К. был выше, чем в в растениях зараженных РУХ, тогда как 15К не влиял на уровень накопления вирус-спекцифических РНК (Рис. 3). Таким образом, экспрессия ЦББ значительно увеличивает патогенность РУХ в растениях N. ЬепЛагшапа, а в случае 8К. и 12К повышает также уровень накопления вирус-специфических РНК в зараженных тканях.
Рис. I. Влипни« экспрессии генов 8К РМТУ, 12К СУВ и 15К БЬУХ на фенотип инфекции РУХ в растениях N. ЬешЬапиапа. Показаны растения, зараженные РУХ (А), РУХ-8К (В), РУХ-12К (С) и РУХ-15К (О). Фотографин сделаны на 7 дпи.
i Hovii _ tnlB*fc Itmi _
ie fVK-K ? К ton-««
£ * » с с » * * ......
"3 PVX 3 PVX, rV*-12K
V в * 3 t з » I 1 2 1 2 1
!(, i ( it n
** fl ПМ Й PVTt tvX-lW
I 1 t » 1 t 1 | I J t I 3»
Г тЩт - -
: ;
r*"-*~*~T~ff~T ТУГ-»-—--».-«- » - .
Рис. 3. Анализ накопления вирус-спенифических РНК к растениях N. benthamiana, инокулированных PVX-8K (A), PVX-I2K (В) и PVX-15K (С) в сравнении с растениями, иногулнрованными PVX. Детекцию провешили при помоши блот-шбриднмцнн РНК с зондом, специфичным к гену CP PVX. Mock <- контрольные растения, (шокул и ронянные водой. Номера соответствуют индивидуальным растениям, инокулированным PVX или рекомбинанткыми вирусами. Пробы отбирались на 7 дли. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждали окрашиванием рРНК бромистым этидием (показано под каждой панелью).
ПЕВ как возможные Факторы авирулентности
При экспрессии Avr-гена в контексте PVX в растении, несущем соответствующий R-ген, симптомы отличаются от симптомов, возникающих при инфекции PVX дикого типа. Происходит некротнзация инфицированных тканей, однако это не препятствует распространению вируса и развитию системной инфекции (Hatnmond-Kosack et а)., 1995, Scholthof et al., 1996).
Поскольку подобное изменение симптомов наблюдалось при заражении N. benthamiana химерными вирусами PVX-8K, PVX-12K и PVX-15K, была проведена экспериментальная проверка того, являются ли ЦББ факторами а вирулентности в N. benthamiana. Было обнаружено, что при независимой от вирусного вектора экспрессии ЦББ в растениях с помощью агроинфнльтрации не происходит развития некротической реакции (данные не приведены). Таким образом, ЦББ SK, 12К и 15К не являются факторами авирулентности в N. benthamiana, и наблюдаемый фенотип можно рассматривать, как результат индуцированного ЦББ значительного усиления ответа на инфекцию PVX в этом растении-хозяине. Следовательно, изучаемые ЦББ способны, по крайней мере в гетерологичной системе, модулировать защитный ответ растения на вирусную инфекцию.
ЦББ как возможные супрсссопы PTfiS
Одной из характерных особенностей супрессоров PTGS, кодируемых вирусами растений, является способность усиливать симптомы гетерологичных вирусов, таких как PVX и TMV, что приводит к некротизацин инфицированных тканей и гибели растения (Press et al., 1997, Brignetti et a!., 1998, Li et al„ 1999, Yelina et al., 2002).
Способность ЦББ подавлять PTGS исследовалась в системе временной экспрессии генов в растении. Была использована ранее описанная экспериментальная система, в которой при помощи агроинфнльтрации достигается ко-экспрессия репортерного гена зеленого флуоресцирующего белка GFPC3, гена dsGF, обеспечивающего образование транскрипта с двунитевой областью длиной 342 и.о., который является сильным индуктором PTGS GFP, и гена предполагаемого белка-супрессора PTGS (Johansen and Camngton, 2001) (Рис. 4). При инфильтрации листьев культурой A.tumifaciens, несущей экспрессной иу ю кассету GFPC3, об экспрессии этого гена свидетельствовала
флуоресценция инфильтрированных областей на 3 дпи. При инфильтрации листа смесью двух агробактериальных культур, одна из которых несла геи СИРСЗ, а другая - ген йзвР, флуоресценция в инфильтрированной области отсутствовала в результате РГСЗ гена СзРРСЗ. При анализе супрессорной активности для инфильтрации использовали смесь трех культур, две из которых несли гены ОРРСЗ и <1зСР, а третья - ген ЦББ, В контроле третья культура несла ген белка уЬ РЭЬУ, являющегося супрессором РТОЗ (УеИпа е1 а!., 2002). На 3 дпи флуоресценция ОРРСЗ наблюдалась в листьях, инфильтрированных смесью культур, несущих гены СБРСЗ + ёвОР + уЬ, но не смесью культур, несущих гены СРРСЗ + ¿ЮБ + 8К, СРРСЗ + (ШР + 12К или СИРСЗ + (ЫЗР + 15К (данные не показаны). Для подтверждения данных визуальных наблюдений в инфильтрированной области листа определяли уровень белка ОРРСЗ при помощи иммуноблота и мРНК ОРРСЗ путем блот-гибридизацин РНК. По сравнению с листьями, экс премирующими только йРР, уровень белка и мРНК вРР был значительно понижен в присутствии скОР и повышен при ко-экспрессии ОРРСЗ и ёзйР с уЬ РБЬУ. Ко-экспрессия с 8К, 12К и 15К не влияла на уровень белка и мРНК СРР. При помощи блот-гибридиаации было показано что,
так же, как уЬ РЭЬУ (УеНпа е1 а1., 2002), 8К, 12К и 15К не влияют на уровень ОРРСЗ-специфичиых вИША (Рис. 4). Таким образом, ЦББ не способны подавлять РТОЭ в данной системе.
Известно, что оцРНК также индуцирует РТйЗ, однако значительно слабее, чем дцРНК (Уотпе1 е1 а1 2003). Для изучения способности ЦББ супрессировать РТвЗ, вызванный оцРНК, использовалась сходная система временной экспрессии генов в растении, но индуктором РТОЭ в ней служила мРНК репоргерного гена. При ко-экспрессии ОРТСЗ и уЬ РБЬУ на 3 дпи наблюдалась более интенсивная флуоресценция инфильтрированных областей, чем при экспрессии только ОРРСЗ, тогда как ко-экспрессия с 8К, 12К и 15К ие оказывала влияния на интенсивность флуоресценции (данные не показаны). Для подтверждения визуальных наблюдений в инфильтрированной области листа определялся уровень белка ОРРСЗ и мРНК ОРРСЗ (Рис. 5). Таким образом было показано, что ЦББ не
являются супрессорами "слабого" пути индукции РЮЭ
* *
Рис. 4, Анализ способности ЦББ супрессировать «сильный » путь индукция РТбЗ в системе временной экспрессии генов в растении. (А) Схемы использовании к рекомбинантных конструкций. 358, промотер вируса мозаики цветной капусты; 1егт, участок терминации транскрипции; ОЙ", ген зеленого флуоресцирующего белка; вР и Рв, фрагменты гена СРР, клонированные в прямой и обратной ориентации и разделенные промежуточным участком (зрасег). Показаны результаты Экспериментов с белками 8К (В), РУХ-12К (О и РУХ-]5К(0). Гены, экепрессированные в агроинфильтрированной области листа, указаны над дорожками. р1-Н, контрольная инфильтрация культурой, несущей вектор без экспрессионной кассеты. Накопление белка ОРРСЗ детектировали с помощью иммуноблота с использованием специфических моноклональньдх антител. Блот-гибрндазацию РНК проводили с использованием ДНК-зонда, специфичного к 3'-концевой часта гена бРРСЗ. Блот-гибридизацию 5]1ША проводили с использованием РНК-зонда специфичного к 3' концевой последовательности гена £фсЗ. Пробы отбирали на 4 дпи. Содержание равных количеств
Р] {К в каждой дорожке подтверждено окрашиванием бромистым эткдисм рРПК (при анализе мРНК gfpc3) и низкомолскулярной PIIК (при анализе siRNA).
* я « i i Рис. 5. Анализ способности белков 8К (А), 1Ж и 15К (В)
j , j 1 i супрессировать «слабый» путь индукции PTGS в системе временной
t | Л ® экспрессии генов в растении. Гены, экспрессированные в
i a S a ofi> -»-м**. агроинфильтрированной области листа, указаны над дорожками.
' ^ pLH, контрольная инфильтрация культурой, несущей вектор без
Т. it £ г экспрессной ной кассеты. Накопление белка GFPC3 детектировали с
Ж** < помощью иммуноблота с использованием специфических
wj," моноклональных антител. Блот-гибридизацию РНК проводили с использованием ДНК-зонда, специфичного к З'-кондевой части гена
* ' GFPC3. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке
; подтверждали окрашиванием рРНК бромистым этидием (показано
■""ИЯШКЗ .»»»II_________под кавдой панелью).
8К как возможный компонент системы супрессии PTGS PMTV
Супрессия PTGS может осуществляться при комплексном воздействии двух вирусепецифичсских белков (Kreuze et al., 2005). Было сделано предположение, что ЦББ являются кофакторами, необходимыми для реализации супрессорной активности другого вирусспецифического белка. Это предположение проверялось для 8К PMTV, так как ранее нами было показано, что ни один из белков PMTV сам по себе не является супрессором «сильного» пути PTGS (данные не показаны). Наиболее вероятными партнерами 8К являются компонент репликазы PMTV, содержащий метилтрансферазкый и хеликазный домены (MET-HEL), белок CP-RT, экспрессирующийся при помощи трансляционной супрессии терминатора CP, и транспортный белок TGBI PMTV, так как ряд виру специфических белков, функционально сходных с этими белками PMTV, являются супресеорами PTGS (Ding et al„ 2004, Qu et a!., 2003, Voinnet et al., 2000). Для проверки этого предположения исследовалось влияние ко-экспрессии 8К с MET-HEL и 8К с CP-RT на PTOS GFP, в системе временной экспрессии генов в растениях N.benthamiana, индуктором PTGS в которой является дцРНК. В контроле осуществлялась ко-экспрессия GFPC3 и dsGF с белком НС-Pro PVA, являющегося супрессором PTGS (Pruss etal., 1997). На 3 дпи флуоресценция GFPC3 наблюдалась в листьях, инфильтрированных GFPC3 и листьях, инфильтрированных смесью культур, несущих гены CFPC3 + dsGF + НС-Pro, но не смесью культур, несущих гены GFPC3 + dsGF + 8K+MET-HEL и CFPC3 + dsGF + 8K+CP-RT (данные не показаны). Данные визуальных наблюдений были подтверждены при помощи блот-гибридизации РНК (Рис. 6). Так же, как НС-Pro (Chapman et al., 2004), 8К сам по себе и при ко-экспрессии с другими белками PMTV не влияет на уровень йРРСЗ-специфичных siRNA (Рис.6), Ранее в той же системе было показано, что ко-экспрессия 8К с TGB1 PMTV также не оказывает влияния на PTGS (Н, Елина, неопубликованные данные). Следовательно, 8К не является кофактором ни одного из белков PMTV, предположительно участвующих в супрессии PTGS и сам не приобретает супрессорной активности при ко-экспрессии с MET-HEL, CP-RT и TGB1 PMTV,
i 5
ï!
^ Рис. 6. Анализ возможной активности 8К как супрессора РТОЭ в * качестве кофактора одного нз белков РМТУ. Накопление нРНК бРРСЗ
_ и £фсЗ при временной экспрессии генов в растениях N.
ЬетЬапиапа детектировали с помощью блот-гкбр идизации с ч М Ь- & й использованием ОРР-спеиифичных зондов. Гены, экспрессированные в а 1р v, агроинфильтрированной области листа, указаны над дорожками. рЬН,
контрольная инфильтрация культурой, несущей вектор без экспрессиониой кассеты.
Детекция белка 8К в зараженных растениях
Последвательность гена 8К вариабельна в различных штаммах PMTV. В четырех датских изолятах, в отличии от шведского и шотландского, инициаторный кодон AUG заменен на GUG (Pecenkova et al 2004). Для того, чтобы установить, экспрессируется ли белок 8К в растениях при инфекции PMTV, была получена конструкция PHK3-FLAG. Она представляет собой кДНК копию РНКЗ PMTV (Savenkov et al., 2003), в которой последовательность гена ЦББ заменена на последовательность гена ЦББ, слитого с элитопом FLAG (Рис.7). Растения N. benthamiana инокулировали смесью транскрнптои, полученных на матрицах кДНК копий РНК1, РНК2 и РНКЗ-FLAG. В контроле растения инокулировали смесью транскриптов, полученных на матрицах кДНК копий РНК1, РНК2 и РНКЗ PMTV. Через неделю после инокуляции на растениях появилась желтая мозаика -симптомы, характерные для инфекции PMTV, На 14 дпи были отобраны пробы для иммуноблот-гибридизации с специфичными к эпитопу FLAG моноклональными антителами. В инокулированных листьях 8K-FLAG детектируется в виде двух полос, соответствующих белкам с молекулярной массой 8кДа и 17кДа (Рис.7). Наличие полосы 17кДа, видимо, отражает способность 8К к димеризации, характерную для ряда ЦББ (Dunoyer et at 2004, Bragg and Jackson 2004, Yelina et al 2005).
А В
3m*" T »EHI—
Рис. 7. Детекция белка 8К в зараженных растениях. (А) Схематическое изображение генома PMTV и модифицированной РНКЗ PMTV (В), в которой последовательность гена 8К заменена на на последовательность, кодирующую белок 8К, слитый с эпитопом FLAG. Прямоугольниками обозначены открытые рамки трансляции. МЕТ-метилтрансфераэный домен репликазы, HEL-хеликазный домен репликазы, POL - полимеразный домен репликазы, ТСВ —тройной блок транспортных генов. CP —белок оболочки, CP-RT - продукт трансляционной супрессии терминатора СР. (С). Иммуноблот-анализ накопления белка 8К, слитого с эпитопом FLAG в растениях, зараженных модифицированным PMTV, кодирующим белок 8K-FLAG (дорожки 2 и 3). В контроле анализировали растение, инокулированное немодифицироваиным PMTV (дорожка 1). Mock — растение, инокулированное водой. Иммунодетекцня проводилась с использованием специфичных моноклональных антител к эпитопу FLAG. Пробы отбирали на 14 дли. Значения маркера молекулярных масс отмечены слева. Положение мономерной (<) и димерной («) форм белка SK-FLAG отмечено справа.
Внутриклеточная локализация белков CFP-8K и 12K-GFP
ЦББ PMTV, CVB и ShVX, не являясь супрессорами PTGS или факторами авирулентности, служат детерминантами вирусной патогенности. Сходные свойства были установлены при изучении предполагаемого продукта трансляции ОРТб TMV (Tobamovirus), небольшого белка, не являющегося цистеин-богатым и не имеющего сходства первичной структуры с изучаемыми ЦББ (Canto et al., 2004). Было показано, что продукт трансляции ОРТб, слитый с GFP, имеет плазмодесмальную локализацию (Canto et al., 2004). Нами была изучена внутриклеточная локализация белков 8К. и I2K, спитых с GFP,
Анализ аминокислотной последовательности белка 8К выявил центральный гидрофобный район, что указывает на возможное взаимодействие 8К с мембранами клетки. Исследование ЦББ из шести штаммов PMTV при помощи четырех различных
алгоритмов показало, что центральный сегмент 8К с высокой долей вероятности является трансмембранн ым, и 8К представляет собой интегральный мембранный белок (данные не показаны). Для изучения внутриклеточной локализации 8К была получена конструкция pR.T-8K.-GFP. Было показано, что белок 8К-СРР накапливался в аморфных структурах в цитоплазме (Рис. 8). Ко-экспрессия с бел ком-маркером экдо плазматического ретикулума (ЭПР) ЕЛ-УРР (гатуамт е* а)., 2004) показала, что эти структуры являются производными мембран ЭПР. Важно отметить, что ко-экспрессия с 8К-ОРР радикально изменяла локализацию ЕКЛТР. При ко-экспрессии Е11-\ТР всегда содержался в тех же аморфных включениях, что н ВК-ЬРР, а сеть кортикального ЭПР в различных клетках подвергалась в разной степени выраженной деструкции, что во многих случаях выражалось в ее полной деградации (Рис. 8). Экспрессия белка 8К, не слитого с йРР, таким же образом влияла на локализацию ЕИ-УРР (данные не показаны). Основываясь на этих результатах, можно сделать вывод о том, что структуры, в которых локализуется 8К-йРР, являются производными мембран ЭПР, и что 8К вызывает разрушение полигональной сети ЭПР, в результате чего образуются абберантные внутриклеточные агрегаты. На основании полученных данных можно предположить, что вызываемое экспрессией 8К усиление симптомов РУХ связана с нарушением эндомембранной системы клетки.
Рнс. 8. Изображения клеток эпидермиса N. ЬепЛапиапа, экспресснрующих слитые флуоресцирующие белки 8К-йРР (А) и ЕЯ-УРР (В). (С и Б) Ко-экспрессия 8К-СРР и ЕЯ-УРР. Приведши изображения, независимо полученные для СРР (левая колонка) и УРР (средняя колонка), а также и* наложение (правая колонка). Масштабная линейка, 5мкм (А, С ■ О) н Юм км (В). Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
ЕяИЕэтВН
И^НЦЯН
Щ^^ШШВЕЩ
Для изучения внутриклеточной локализации 12К была получена конструкция рР.Т-ОРР-12К. Белок ОРР-12К преимущественно локализуется в ядре в составе крупных структур неправильной формы и, частично, в цитоплазме в виде небольших (0.5-1мкм) включений (Рис. 9). Природа этих структур и значение локализации белка 12К в этих структурах для реализации его функций остаются неизвестными.
Рос. 9. Изображения клеток эпидермис» N. ЬемЬагтапа, экспресснрующих слитый флуоресцирующий белок СРР-12К. (А и Б), изображения целой клетки. Изображение 8 было получено при меньшей экспозиции. (С), увеличенное изображение области ядра. Масштабная линейка 20 мкм (А и В) и К мкм (С). Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа
Тем не менее, можно заключить, что внутриклеточная локализация белков 8К, 12К и продукта ОРТб ТМУ различна, что, вероятно, указывает на то, что сходный эффект на
защитный ответ растения, наблюдаемый при гетерологнчной экспрессии этих белков в контексте генома PVX, может возникать в результате действия механизмов, различающихся для этих трех белков.
Влияние N-гена на инфекцию PVX-8K. PVX-12K и PVX-15K в N. tabacum
Несмотря на то, что ЦББ не являются факторами авирулентности, наши данные позволяют высказать предположение о том, что их функционирование в качестве детерминант вирусной патогенностн может осуществляться через систему ответа растения на атаку вирусных и невирусных патогенов, которая активируется с помощью генов устойчивости
Конструкциями PVX-8K, PVX-12K и PVX-15K инокулировали кроме N. benthamiana, и L другое растение-хозяин PVX, N. tabacum cv. Samsun. В этом эксперименте использовали растения N.tabacum двух генотипов, пп и NN. N-ген является R-геном, специфичным по отношению к TMV (Holmes et al,, 1938), Взаимодействие продукта N-гена с фактором авирулентности, которым является репликаза TMV, индуцирует развитие гиперчувсгвительного ответа (HR), при котором запускается запрограммированная клеточная гибель (PCD) в клетках, входящих в состав очага инфекции, что приводит к образованию на растении отдельных некрозов, окруженных фенотипически здоровой тканью (Padgett et al„ 1997, Hammond-Kosak et al., 1996). Молекулярные и физиологические механизмы, вовлеченные в развитие HR, индуцированного взаимодействием продукта N-гена с фактором авирулентности, до сих пор изучены недостаточно. Известно, что они включают несколько параллельных каскадов передачи сигнала, в которых принимают участие клеточные белки, принадлежащие к различным классам. В этот комплекс входят белки, связанные с аппаратом протеосомной деградации белков, такие как SGT1, SKPI, белки снгналосомы СОР9, Hsp90, Rarl, а также факторы транскрипции NPR/NIM1 и COI 1, вакуолярная протеаза VPE, а также EDS1 hNRGI (Liu et al., 2002, Liu et al., 2002b, Liu et al„ 2004a, Levy et al„ 2004).
Растения двух генотипов давали сходные симптомы при контрольном заражении PVX: на инокулированных листьях не развивалось видимых симптомов, на 8 дпи на верхних неинокулированных листьях появлялись характерные для PVX симптомы мозаики. На листьях растений генотипов пп и NN, инокулированных PVX-8K, на S дпи появлялись мелкие немногочисленные некрозы, тогда как на верхних неинокулированных листьях симптомов вирусной инфекции не наблюдалось. Исключение составило одно из пяти растений генотипа NN, где на 8 дпи отсутствовали симптомы иа инокулированных листьях, но наблюдалась мозаика верхних системно-инфицированных листьев, что соответствовало симптомам PVX дикого типа (данные не показаны). На 23 дпи на трех из пяти растений генотипа NN, инокулированных PVX-8K, развились системные симптомы некротической мозаики, а на растениях генотипа пп симптомов системного заражения не появилось (данные не показаны). Образцы инокулированных и верхних листьев, отобранные на 8 и 23 дпи, анализировались на наличие вирусной РНК. В качестве контроля были взяты образцы инокулированных и системных листьев растений, зараженных PVX, также отобранные на 8 и 23 дпи. Для детекции вирусной РНК использовали блот-гибридизацню РНК с зондом, специфичным для гена СР. На 8 дпи вирусная РНК детектировалась в инокулированных и системно-инфицированных листьях растений обоих генотипов, зараженных вирусом дикого типа (Рис. 10), тогда как из всех растений, инокулированных PVX-8K, вирус-специфические РНК были обнаружены только в одном растении генотипа NN, где симптомы инфекции были сходны с симптомами, вызываемыми вирусом дикого типа (Рис. 10). На 23 дпи, когда анализировали только верхние неинокулированные листья, вирусная РНК была обнаружена в растениях обоих генотипов, зараженных вирусом дикого типа, но не
детектировалась в растениях генотипа пп, инокулированных РУХ-8К (Рис. 11). Из пяти растений генотипа NN. инокулированных РУХ-8К, вирусная РНК была обнаружена в трех растениях, где наблюдалась некротическая мозаика системно инфицированных листьев, и в одном растении, где симптомы инфекции совпадали с симптомами вируса дикого типа (Рис. 11). В последнем растении подвижность вирус-специфических РНК совпадала с подвижностью геномных и субгеномных РНК вируса дикого типа (Рис. 11), что указывало на то, что в данном растении произошла делеция гена 8К и реверсия к вирусу дикого типа. Это предположение было подтверждено при помощи блот-гибриднзации РНК с зондом на ген 8К, когда было показано, что в трех растениях генотипа зараженных РУХ-8К, где наблюдалась системная некротическая мозаика, этот ген присутствовал в вирусном потомстве, тогда как в растении, инокулированном РУХ-8К, но проявляющем симптомы РУХ, ген 8К отсутствовал (Рис, 11). Данные по накоплению вирусных РНК в растених генотипов пп и NN. инокулированных РУХ-8К, показывают, что РУХ, несущий ген 8К, способен системно заражать растения N. (аЬасит су. Батгоип, имеющие генотип NN. но не генотип пп.
При инокуляции РУХ-12К на 5 дли появились немногочисленные точечные некрозы на инокулированных листьях растений генотипов пп и NN. На 7 дли на растениях генотипа NN размер некрозов увеличился до 2-5мм в диаметре, и появились симптомы некротической мозаики на верхних нейнокулированных листьях. На растениях генотипа пп некротизация инокулированных листьев развивалась сходным образом с растениями генотипа NN с тем отличием, что увеличения размеров некрозов на инокулированных листьях не происходило. Системные симптомы иа растениях генотипа пп появились только на 8 дпи и были значительно менее интенсивными (данные не показаны). Блот-гибридизация РНК с зондом, специфичным для СР РУХ, показала, что на 8 дпи РНК химерного вируса РУХ-12К присутствовала в инокулированных н системно инфицированных листьях растений обоих генотипов. В растениях генотипа NN уровень накопления РНК РУХ-12К был выше, чем в растениях генотипа пп, и выше, чем уровень накопления РНК вируса дикого типа типа (Рис. 10). Ген 12К присутствовал в вирусном потомстве, и сгРНК, необходимая для экспрессии 12К в составе рекомбинантиого генома вируса РУХ-12К, также обнаруживалась в зараженной ткани в существенных количествах (Рис. 12).
При заражении РУХ-15К. на 6 дпи появились немногочисленные некрозы на инокулированных листьях растений обоих генотипов, а на 7 дпи - мозаика на системно инфицированных листьях всех пяти инокулированных растений генотипа NN. которая затем, на 9-10 дпи, приобретала некротический характер. На 8 дпи появилась мозаика на системно инфицированных листьях двух из пяти растений генотипа пп, которая затем, на 10-11 дпи, принимала некротический характер (данные не показаны). На 8 дпи РНК химерного вируса РУХ-15К не детектировалась в инокулированных листьях растений обоих генотипов, в системно инфицированных листьях растений генотипа пп РНК РУХ-15К детектировалась в двух зараженных растениях, где наблюдались симптомы мозаики, и уровень ее накопления не отличался от уровня накопления РНК РУХ. В растениях генотипа NN уровень накопления РНК РУХ-15К был выше, чем в растениях генотипа пп, н выше, чем уровень накопления РНК вируса дикого типа (Рис. 10). Ген 15К присутствовал в вирусном потомстве, н сгРНК, необходимая для экспрессии 15К, также детектировалась в существенных количествах (Рис. 12).
-
Г А,*
г*****
ви
■и
■ т
Ш «I» 1
Рис. 10. Накопление вирус-специфических РНК в растениях N. иЬасит су. Батэил генотипов NN (А и В) II ЯП (С II Э), инокулированных РУХ. РУХ-8К, РУХ-12К и РУХ-15К. РНК детектировали с помощью блот- гибридизации с зондом на ген СР РУХ. Анализировали инокулнрованные (А и С) и верхние неинокулированиые листья (В и О). Моек - контрольные растения, инокулнрованные водой. Номера соответствуют индивидуальным растениям, инокулированным РУХ, РУХ-8К, РУХ-12К и РУХ- 15К. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рРНК бромистым этндием. Пробы отбирались на 8 дли.
тс рух як __гух-рх
к I 3 I 2 Э 4 Э писк 11 I 3 14 9
гу* рух8к
к I 1 С 1 1 * i
_NN_ Г**""
-Ш.__ОЗУ*- |
1113 3«) I
"И»
I»
■
Рис. 11. Анализ накопления вирус-специфических РНК в системно-инфицированных листьях растений N. гаЬасит су. Запвип генотипов пп и NN, инокулированных РУХ и РУХ-8К, РНК детектировали при помощи блот-гибриднзации с зондом на ген СР РУХ (А) и зондом на ген 8К (В). Моек - контрольные растения, инокулнрованные водой. Номера соответствуют индивидуальным растениям, инокулированным РУХ и РУХ-8К. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рРНК бромистым этнанем. Пробы отбирались на 23 дли.
jnecuiat«<M«*w«t _$v«i«ff*c imeuUMtf itavrt arttnntt MWM
¿vx pvjmwT pvx глыг* pvx _pvx-is* pyx _ pvx-tsK
t12 12312423 1 J » 1 Э 4 i i » J J
** P^
I «
t * > :
i 1; : ' ?
ii.'.-w
MWukB№d tcwci
PV* , PV*.1IK PVX
mnt* II 12313123
kveu4«Hd 1ччн_ __wntmtte
PVX PVX-1W _ Р1ЛС PVX-1)«
i i l a j V l i I l j t
Рнс. 12. Анализ накопления вирус-специфических РНК в растениях N. 1зЬаситпСУ. £зтзцп генотипов пп и NN. инокулированных РУХ, РУХ-12 К н РУХ-15К. РНК детектировали с помощью Слот гибридизации с зондами на ген 12К(А)и ген 15К (В) в инокулированных и верхних неинокулированных листьях. Моек - контрольные растения, инокулированные водой. Номера соответствуют индивидуальным инокулированным растениям. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рРНК бромистым этидием. Пробы отбирались на 8 дли.
Фенотип инфекции рекомбннантных вирусов PVX-8K, PVX-12K и PVX-15K позволил предположить, что эти вирусы вызывают развитие защитной реакции в зараженных тканях. Чтобы подтвердить это предположение, при помощи блот-гибридизации РНК анализировали количество РНК PR1, гена белка, ассоциированного с патогенезом, который индуцируется в растениях при развитии различных типов защитных ответов (van Loon et al., 1999), В незаряженных растениях РНК PRI не детектируется (Рис, 14). Известно около 40 белков PR принадлежащих к 13 семействам (van Loon et al.t 1999). Экспрессия PRI индуцируется в растениях, несущих N-ген, при инфекции TMV, а также при обработке растений салициловой кислотой (SA), Транскрипция PR1 активируется SA; этот путь опосредован белком NPR1 н транскрипционными факторами группы TGA (Clarke et al„ 2003,. Zhang et al., 1999).
Ha S дпи РНК PRI в инокулированных листьях растений обоих генотипов, зараженных PVX, PVX-12K и PVX-15K, накапливалась в сопоставимом количеств«. В системно-инфицированных листьях растений обоих генотипов, зараженных PVX-12K, уровень РНК PR1 был повышен по сравнению с таковым при заражении вирусом дикого типа, причем в системно инфицированных листьях растений генотипа NN при заражении PVX-I2K уровень экспрессии гена PR1 был выше, нежели в растениях генотипа пп (Рис. 13). В системно инфицированных листьях растений генотипа пп, зараженных PVX-I5K, РНК
РК.1 детектировалась на том же уровне, что и в случае заражения РУХ, и только в двух растениях. В системно инфицированных листьях растений генотипа NN. зараженных РУХ-15К., уровень РНК РП1 был значительно повышен. В и но кул про ванн ых и системно инфицированных листьях растений обоих генотипов, зараженных РУХ-8К, РНК РН1 не детектировалась на 8 дпи (Рис. 13). На 23 дли РНК РК1 обнаруживалась в системно инфицированных листьях растений генотипа NN. зараженных РУХ-81С, на более высоком уровне, чем при заражении вирусом дикого типа (Рис. 14). Этот результат позволяет предположить, что при экспрессии ЦББ в контексте РУХ активируется зависимый от БА путь развития защитной реакции растения.
Таким образом, развитие инфекции химерных вирусов, несущих гены ЦББ, происходит значительно более интенсивно в растениях N. (аЬасит генотипа NN по сравнению с растениями генотипа пп. Наиболее сильно этот эффект выражен при инфекции РУХ-8К, когда в растениях генотипа пп происходит супрессия системного транспорта вируса, а в растениях, несущих Ы-геп, развивается системная инфекция. При инфекции РУХ-12К и РУХ-15К системная инфекция развивается в случае растений обоих генотипов, но интенсивность симптомов и уровень накопления РНК и белка оболочки вируса в растениях генотипа NN значительно выше, чем в растениях генотипа пп.
I1I1I1141I1JI1J4 111111)4*111111
1 1 I 1 1 1 Э » J I 1 J I 1 > 4 1111111(111)11)4
Рис. 13. Анализ накопления мРПК белка РЯ1 в растениях N. (аЬасит су. Затят генотипов пп и NN. инокулированных РУХ, РУХ-8К, РУХ-12К и РУХ-15Кблот-гибридизацией РНК с зондом на ген РШ. Моек ~ контрольные растения, ннокулированные водой. Номера соответствуют индивидуальным растениям, инокулированным РУХ» РУХ-81С, РУХ-12К и РУХ-15 К. Содержанке равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рРНК бромистым этидием. Показаны результаты детекции мРНК белка РК1 в инокулированных и верхних неинокулнрованных листьях растений генотипа NN (А) и генотипа пп (В) на 8 дпи.
__Ий_
ГУХ | РУН BU РУЯ tvx-frt
i i i i a i * i I 1111145
Рис. 14. Анализ накопления мРПК белка РЯ1 в растениях N. (аЬасиш су. 5атшип генотипов пп и NN. инокулированных РУХ и РУХ-8К блот-гибридизацией РНК с зондом па ген РК1. Моек -контрольные растения, ннокулированные водой. Номера соответствуют индивидуальным растениям, инокулированным РУХ и РУХ-8К. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рРНК бромистым зтндием. Показаны результаты детекции мРНК белка РШ в верхних неинокулированных листьях растений генотипа NN и пп на 23 дпи.
Продукт ОРТ6 TMV, также как рассматриваемые в данной работе ЦББ, определяет ответ растения па вирусную инфекцию, но не является фактором авирулентности или супрессором PTGS (Canto et al 2004). Возможно, механизм действия ОРТб сходен с таковым ЦББ. Для того, чтобы проверить, отличается ли эффект, оказываемый ОРТ6
TMV на развитие инфекции PVX в растениях N.tabacum генотипа NN и пп, была получена конструкция на основе инфекционной кДНК копни генома PVX, PVX-OPT6. Полученной конструкцией циркулировали растения N.tabacum генотипов NN и пп. В контроле растения заражали PVX, На 7 дли на верхних листьях растений обоих генотипов, зараженных PVX и PVX-0PT6, возникали симптомы мозаики, более интенсивные в случае PVX-OPT6, а на инокулированных листьях не развивалось видимых симптомов. Образцы инокулированных и системно инфицированных листьев, отобранные на S дпи, анализировали на наличие вирусной РНК и РНК PRI. При помощи блот-гибридизации РНК с зондом, специфичным для гена СР PVX, РНК вируса детектировалась в инокулированных и системно-инфицированных листьях растений обоих генотипов, зараженных вирусом дикого типа и химерным вирусом PVX-OPT6. В растениях генотипа NN, зараженных PVX-OPT6, уровень накопления вирусной РНК не отличался от уровня накопления РНК PVX. В растениях генотипа пп, зараженных PVX-OPT6, уровень накопления вирусной РНК был несколько ниже уровня накопления РНК PVX и РНК PVX-ОРТб в растениях генотипа NN (Рис, 15). Блот-гибридизация РНК с зондом, специфичным для гена ОРТб, показала, что в зараженных растениях этот ген присутствовал в вирусном потомстве (Рис. 15). На 8 дли РНК PR1 в растениях генотипа пп, зараженных PVX-OPT6, накапливалась на более высоком уровне, чем в растениях, зараженных вирусом дикого типа. В растениях генотипа NN, зараженных PVX-OPT6, РНК PR1 не детектировалась (Рис. 15).
д NN в ия
taaMHlhMt t^mtnfeHaw пшММ1иМ lytttnlettHH
л PVX PVXORfB ж fVX PVX-OftFft » PVX * PVX йух-QftFg
El 212 3 4 9 I t J 1 2 3 4 5 ( t ! t J Э 4 5.11 1 t Й 4 < 5
„ - -„,4,-. ■■ M.>~ .•••••, -^-V | f т • . i . s . s .. s ' " ' •"< ' ' JJ". ( " M 4. V - V
| «*(W =" < «Г* <Mt ' • "
^тмшт
Рис. 15. Анализ инфекции РУХ-ОЯРб в растениях N. УЬасит су. Бапкип.Анализ накопления вирус-специфических РНК в растениях N. 1аЬасит сорта Затаил генотипа пп и МЫ, инокулированных РУХ и РУХ-ОЯРб, с помощью блат-гибридизации РНК с зондом на ген СР (А) и зондом на на ген 0(1Г6 (В). (С) Детекция мРНК белка РЯ1 в тех же растениях. Моек, растения, инокулнро ванные водой. Номера соответствуют индивидуальным растениям, инокулнрованным РУХ н Р\гХ-ОК.К6. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рРНК бромистым этидием. Пробы отбирались на 7 дли.
Таким образом, можно заключить, что активность продукта трансляции ОРТб в качестве детерминанты вирусной патогенносги, видимо, основана на тех же механизмах, что и в случае ЦББ. Развитие защитной реакции растения более эффективно происходит в растениях генотипа пп. Различное влияние ЦББ и продукта трансляции ОРТб на индукцию PR1, возможно, связано с тем, что развитие защитной реакции в растениях при экспрессии ОРТб происходит менеее эффективно, чем при экспрессии ЦББ.
Полученные в настоящей работе данные указывают на то, что продукт N-гена способен оказывать влияние на вирусную инфекцию в отсутствии специфического лиганда. Можно предположить, что в ответ растения, индуцируемый ЦББ, вовлечены зависимые от N-гена пути, и что передача сигнала, приводящая к развитию гиперчувствительного ответа, частично блокируется N-ген-зависимыми компонентами. С другой стороны, если продукт N-гена способен прямо или опосредованно взаимодействовать с ЦББ, то это может приводить к частичной инактивации последнего как фактора патогенности.
Сравнительный анализ профиля экспрессии генов N. benthamiana при инфокиин PVX дикого типа и юекомбинантного вируса PVX-12К
Идентификация дифференциально экспрессирующихся мРНК
Развитие некротической реакции и индукция PR] позволяет предположить, что ЦББ активируют сигнальные каскады, которые обусловлены наличием R-геноа. Ряд подтверждений этой гипотезы был получен при сравнительном анализе профиля экспрессии генов N. benthamiana при инфекции рекомбинантного вируса PVX-12K PVX и дикого типа методом дифференциального дисплея. Дифференциальный дисплей мРНК -это метод, основанный на сравнении наборов экспрессирующихся генов в образцах тканей или клеток, позволяющий идентифицировать дифференциально экспрессирусмые гены (Liang et at., 1992, Bauer etal., 1993).
При помощи дифференциального дисплея мРНК анализировали растения N. benthamiana, зараженные химерным вирусом PVX-12K, в сравнении с растениями N. benthamiana, зараженными PVX дикого типа. Было использовано по 20 растений в каждом случае, для анализа отбирались пробы верхних неиноку л ированных листьев сразу же после появления симптомов мозаики, на 7-10 д.п.и. Тотальная РНК, выделенная из растений, зараженных одной конструкцией, объединялась и использовалась для дальнейших манипуляций. На матрице тотальной РНК из сравниваемых образцов ткани при помощи обратной транскрипции синтезировалась тотальная кДНК. D качестве затравки при обратной транскрипции использовались модифицированные олигонуклеотиды, специфичные к 3' концу мРНК (заякоренные олигоТ праймеры), что позволило получить три субпопуляции кДНК. Для последующей амплификации использовались пары олигонуклеотидов: 3'концевой олигоТ праймер, с которым была получена данная субпопуляция кДНК, и один из набора псевдоспецифичных праймеров, определяющий 5'конец синтезирующихся фрагментов. Псевдоспецифичные праймеры были подобраны таким образом, чтобы в сочетании С заякоренными олигоТ праймерами при постановке полного набора реакций с определенной вероятностью амплифицировать все возможные последовательности мРНК растительной клетки (Liang et at., 1992). Радиоактивно меченные продукты реакции разделялись в денатурирующем акриламидном геле. При авторадиографии продукты реакции детектировались в виде ряда дискретных полос; те полосы, интенсивность которых была различна в реакциях с одинаковыми парами праймеров на матрице кДНК сравниваемых образцов, соответствовали дифференциально экслресснруемым генам. Из зон геля.
соответствующих дифференциальным полосам на радиоавтографе, экстрагировалась ДНК. Выделенная из геля ДНК использовалась для клонирования и секвенирования. Однородность выделенного фрагмента ДНК и точность вырезания зон геля подтверждалась при помощи метода определения конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (single strand conformational polymorphism). После клонирования фрагментов ДНК в вектор pGEM-T (Promega) в ряде случаев соответствие фрагментов дифференциально экспресс иру ем ым генам провяржлось при помощи дот-блот гибридизации продуктов ПЦР, полученных при скрининге бактериальных колоний. В качестве зонда использовалась радиоактивно меченная кДНК, полученная при помощи обратной транскрипции с заякоренными олигоТ праймерами, на матрице образцов тотальной РНК, использовавшейся для дифференциального дисплея. В других случаях осуществлялось секвенирование от 10 до 15 параллельных клонов, и однородность полученных последвательностей указывала на соответствие фрагментов дифференциально экспресс пру ем ым генам. Было проанализировано 173 образвд ДНК, выделенных из зон геля, совпадавших с дифференциальными полосами на радиоавтографе. Десять нз них содержали фрагменты ДНК соответствующие дифференциально экспресс пру ем ым мРНК, уровень экспрессии которых повышается при инфекции химерного вируса PVX-12K по сравнению с инфекцией PVX (Табл. 1).
Таблица 1. Анализ последовательностей, полученных в результате сравнения профиля экспрессии генов N. ЬеШЬапнапа при инфекции РУХ дикого типа и рекомбинактного вируса РУХ-12К _ _ _ ___
клон кДНК Ген, с которым клон имеет сходство Accession number Степень сходства
4АА7 N. tabacum SAR8.2U AAF23856 Expect = 0.0 Identities = 501/504 (99%)
7АА6 N. tabacum NIPDR2 AB109389 Expect = 7e-77 Identities = 315/370 (85%)
1АА12 Клон кДНК c3-2-4.tfa N. tabacum cv. Petit Havana SRI AJ344591 Expectж 5e-21 Identities = 73/81 (90%)
4СА22 Транскетолаза 1 N. tabacum cv. Samsun генотипа NN DQ198165 Expect = 5e-67 Identities = 168/176 (95%)
6СА24 клон кДНК N. tabacum KR3B.1Ö3K10 "bW002693 Expect» 1e-103 Identities = 234/241 (97%)
ЗАА2 PR-Q (pathogenesis-related protein Q) N. tabacum. M29868 Expect = 3e-99 Identities = 242/258 (93%)
öAAi Клон кДНК N .tabacum ARG41 СN498825 Expect «6e-35 Identities = 73/80 (91%)
ЗААЗ Know KflHK N, benthamiana 10-284 AY310790 Expect = 6e-19 Identities = 51/51 (100%)
1GA29 КпонкДНкМ7С.10бАМ N. tabacum EB450178 Expect = 9e-65 Identities = 131/132 (99%)
1СА25 Клон KflHKTL13.109C11 N. tabacum EB435045 Expect = 0.0 Identities = 381/384 (99%)
Свойства белков, кодируемых дифференциально Репрессируемыми генами
Клон 4АА7 соответствует гену SAR8.2 N. tabacum. SAR8.2 принадлежит к небольшому семейству генов, которое было идентифицировано при анализе изменения паттерна транскрипции N. tabacum генотипа NN в ответ на инфекцию TMV (Alexander et al,, 1992), однако, в растениях N. tabacum, неспособных накапливать SA, не происходит индукции SarfS.2 в ответ на инфекцию TMV (Herbers et al., 1996). Видимо, при инфекции
TMV позитивная регуляция экспрессии Sar8.2 осуществляется исключительно по пути, зависящем от SA. Изменение уровня экспрессии SAR8.2 не так значительно, как в случае ряда генов, ассоциированных с приобретенной системной устойчивостью (SAR), например PR1, однако происходит на более ранней стадии развития SAR (Ward et al.,
1991). Гомолог SAR8.2 - CASARS.2 был найден в растениях Capsicum anmium. Индукция CASARS. 2 происходит при инфекции различных вирулентных и авнрулентных бактериальных патогенов, холодовом шоке, механических повреждениях, засухе и осмотическом шоке, обработке растительными гормонами, такими как SA, BADA, ABA, IAA, BTH, метил-жасмонатом и этиленом. При обработке SA белок CASAR8.2 накапливается преимущественно в клетках флоэмы и в эпидермальных клетках, что возможно указывает на его участии в формировании защитного барьера, препятствующего проникновению патогенов или же образовании сигнальных молекул, активирующих развитие защитной реакции в других тканях растения (Lee et al, 2003).
Клон 7АА6 соответствует гену NtPDRl N. tabacum, NtPDRl принадлежит к суперсемейству мембранных транспортеров ABC (ATP binding cassette). Представители этого суперсемейства найдены у всех про- и эукариот; они осуществляют АТФ-зависимый транспорт различных химических веществ через мембрану (Higgins et al,,
1992). Ген NtPDRl был идентифицирован при изучении изменения паттерна экспрессии генов в культуре клеток N. tabacum при обработке IFN1 - бактериальным элиситором, индуцирующим гиперчувствительный ответ в N. tabacum (Sasabe et al., 2002), Наиболее близкими к NtPDRl являются белки NpABCl N. plumbaginifolia, ABC транспортер А. thaliana, TUR2 S. potyixhiza. Эти белки выделяют в отдельную группу семейства PDR ABC транспортеров; они состоят из двух одинаковых модулей, включающих в себя трансмембранный и нуклеотидсвязывающий домены, и, видимо, локализуются в плазматической мембране. Экспрессия NtPDRl индуцируется под действием JA и ряда бактериальных, дрожжевых и грибных элиситоров, но не SA и ABA, что указывает на участие данного белка в развитии защитной реакции растения (Sasabe et al., 2002). Уровень мРНК NtPDRl в листьях N.tabacum повышается при обработке перекисью водорода (Vandenabeele et al., 2003), Предполагают, что роль NtPDRl состоит в детоксикации клетки путем выведения фенольных соединений образующихся при гиперчувствительном ответе, или же в защите от внеклеточных патогенов путем секреции антипатогенных веществ, таких как фитоаллексины. NpABCl индуцируется под действием тепреноидов, синтезируемых растением при инфекции вирулентных грибов, и секретирует их во внеклеточное пространство (Jasinski et al., 2001). Высокий уровень сходства позволяет предположить, что NtPDRl выполняет аналогичную функцию (Sasabe et al., 2002).
Клон 1АА12 соответствует последовательности из кДНК-библиотеки, полученной методом дифференциального дисплея при сравнительном анализе паттерна экспрессии генов Nicotiana tabacum в условиях оксидативного стресса. Наибольшим сходством с этой последовательностью обладает ген ß-субъеднницы АТФ-цитрат лиазы Lupinus albus. АТФ-цитрат лиаза растений осуществляет биосинтез Ацетмл-КоА в цитоплазме. Этот фермент необходим для синтеза метаболитов, таких, как жирные кислоты, флавоноиды и кутикулярный воск (Fatland et al., 2000). Экспрессия генов аир субъединиц АТФ-цитрат лиазы индуцируется при инфекции ряда фнтопатогенов, что, возможно, указывает на ее роль в развитии защитной реакции (Suh etat., 2001).
Клон 4СА22 соответствует гену транскетолазы! Nicotiana tabacum , Транскетолаза! -фермент, участвующий в пентозо-фосфатном окислительном пути, биосинтезе предшественников нуклетидов, аминокислот, углеводов и липндов. Исследование микроорганизмов и дрожжей, дефектных по гену транскетолазы, показало, что этот фермент играет значительную роль в защитной реакции клетки при окислительном
стрессе (Juhnke et al,, 1996; Siekar et al,, 1996). У растений транскстолаза представлена одной изоформой, локализующейся в хлоропластах (Schnarrenberger et al., 1995). Подавление экспрессии транскетолазы шпината ведет к снижению активности фотосинтеза, уровня накопления сахаров и ароматических аминокислот; ингибируст рост растения (Henkes et al., 2001).
Клон 6СА24 соответствует последовательности из кДНК библиотеки N. tabacum, наибольшим сходством с которой обладает ген кислого Pia-подобного рибосомального белка Solanum tuberosum. Можно предположить,что индукция этого гена также связана с оксиксидативным стрессом, так как ранее было показано, что экспрессия генов ряда рибосомальных белков повышается в условиях оксидативного стресса. Например, уровень экспрессии рибосомального белка N. tabacum L23A повышается при обработке растений Н:0, (Vranova et al., 2002), SI - при совместной обработке Н;02 и NO, и L10 - при обработке NO (Zago et al., 2006).
Клон 3AA2 соответствует гену PR-Q N. tabacum. PR-Q относится к группе кислых хитиназ. Предположительно, биологической ролью хитиназ является защита от фитопатогенных грибов, основным компонентом клеточной стенки которых является хитин (Boller et al., 1989). Уровень экспрессии PR-Q повышается при инфекции ряда микрорганизмов, грибов и вирусов (Heitz et al„ 1994), а также при абиотических стрессах, таких, как повышение уровня свободных радикалов, Н2О2 (Wingler et al., 2005) и тяжелых металлов (Sarovar et al., 2005) в клетке, однако роль PR-Q в регуляции данных процессов неизвестна.
Клон 8АА2 соответствует клону кДНК ARG41 N. tabacum, полученному при сравнительном анализе паттерна экспрессии генов N. tabacum при экспрессии AvrPto. Индукция экспрессии той же мРНК была обнаружена в листьях N.tabacum при обработке перекисью водорода (Vandenabeele et а)., 2003) и индукции запрограммированной клеточной смерти (Zago et al,, 2006), мРНК, кодирующая сходный белок, индуцировалась при обработке озоном растений Pisum sativum (Savenstrand et al., 2000).
Клон ЗААЗ соответствует клону 10-284, одному из 79 клонов, выявленных при скрининге кДНК библиотеки N. tabacum с целью идентификации генов, участвующих в развитии гиперчувствительного ответа в ответ на инфекцию Pseudomonas syringae, обусловленного взаимодействием фактора авирулектности AvrPto с продуктом R-гена Pto (Lu et at., 2003). Наибольшим сходством с последовательностью клона 10-284 обладает ген хлоропластного предшественника белкаЮкДа фотосистемы II Solanum tuberosum.
Клон 1GA29 соответствует последовательности из экспрессионной библиотеки N. tabacum, наибольшим сходством с этой последовательностью обладает ген AtMUBl А. thaliana. AtMUBl принадлежит к семейству мембранных белков, содержащих убиквитин-подобный мотив в карбонетерминальной области. Белки этого семейства найдены у животных, растений и нитчатых грибов. Убиквитин-подобныЙ мотив направляет пренияированне белка, следствием чего является его заякоревание в плазматической мембране. Функциональное значение белков данного семейства неизвестно; предположительно, они облегчают ассоциацию ряда других белков с плазматической мембраной клетки, однако, известно, что белки, содержащие убиквитин-подобный мотив, участвуют в регуляции различных клеточных процессов, таких как селективная деградация белков, импорт белков из ядра, везикулярный транспорт, поляризация клетки, а также принимают участие в развитии защитной реакции при биотическом и абиотическом стрессе (Downes et al., 2006).
Клон 1СА25 соответствует последовательности из библиотеки кДНК N. tabacum. Наибольшим сходством с ней обладает последовательность из библиотеки кДНК Vitis vinifera, полученной при исследовании изменения транскрипционного статуса клетки в процессе созревания плода, н ей соответствует ген ингибитора пектин-метнлэстеразы
(PMEI) V. vin ¡fera. Предполагаемой ролью PMEI является защита плодов от патогенных микроорганизмов, так как известно, что многие микроорганизмы секретируют ферменты гидролиза полисахаридов, с другой стороны PME является одним из центральных ферментов участвующих в процессе созревания плода, что указывает на возможную роль PMEI в регуляции этого процесса (Camardelta et al., 2000),
Развитие некротической реакции н индукция PR1 позволяет предположить, что ЦББ активируют сигнальные каскады, контролируемые R-генами. Ряд подтверждений этой гипотезы был получен при сравнительном анализе профиля экспрессии генов N. benthamiana при инфекции рекомбинантного вируса PVX-12K и PVX дикого типа. Этот анализ, не претендуя на исчерпывающий характер, показывает, экспрессия какого рода генов индуцирутся в ответ на экспрессию белка 12К CVB в контексте генома PVX. С помощью мето дифференциального дисплея было выявлено десять дифференциаль но-экспрессируемых генов (Табл. 1), Из литературных данных известно, что индукция семи из них происходит при ответе растения на оксидативный стресс. Четыре гена из этой группы и три гена, не вошедшие в нее, связаны с развитием защитной реакции при инфекции авирулентных патогенов. Большая часть найденных генов индуцируется при обработке растений гормонами, такими как SA, этилен и жасминовая кислота, а также при абиотических стрессах, таких как температурный шок, засуха, механические повреждения, осмотический шок, повышение уровня свободных радикалов и тяжелых металлов. В настоящее время известно, что сигнальные каскады обеспечивающие устойчивость растения при различных абиотических стрессах и при инфекции авирулентных патогенов тесно взаимосвязаны (Banzet et al,, 1998). Полученные методом дифференциального дисплея данные подтверждают наше предположение о том, что экспрессия белка I2K CVB в составе генома PVX индуцирует такого рода каскад. По способу индукции этот каскад, вероятнее всего, наиболее схож с тем, который активируется с помощью генов устойчивости, поскольку наличие N-гена существенно влияет на его индукцию. Активация такого каскада при инфекции рекомбинаптным вирусом PVX-12K растений, не несущих N-гена, таких как N. tabacum cv. Samsun генотипа nn или N. benihamiana, говорит о том. что данный сигнальный каскад можен иметь, кроме одного известного в настоящее время пускового механизма, который реализуется с помощью продукта N-гена, и другие возможные способы активации. Косвенным подтвержением этому является возможность развития гиперчувствителыюго ответа на инфекцию TMV в растениях N. benthamiana в том случае, если они трансгснны по N-гену (lin et al., 2002, Liu et al., 2004), что указывает на наличие в не-трансгенных N. benthamiana полностью функционального N-ген-зависимого пути передачи сигнала в отсутствие N-гена. Можно полагать, что PVX-12K индуцирует N-ген-зависимый (или бизкий с ним) путь передачи сигнала и в растениях N. tabacum, и в растениях N. benthamiana, в который проводился анализ индукции экспрессии генов растения-хозяина методом дифференциального дисплея.
Изучение свойств белка 12KCVB
Мутагенз белка 12К CVB.
Анализ аминокислотной последовательности белка 12К CVB показал, что остатки цистеина организованы в виде С-концевого мотива цинкового пальца, тогда как в центральном районе белка расположен обогащенный аргинином положительно заряженый кластер аминокислотных остатков (Рис, 16), В соответствии с этими данными был проведен мутагенез белка 12К. С помощью сайт-направленного мутагенеза в последовательность гена 12К вносились иуклеогидные замены, приводящие к точечным аминокислотным заменам в белке 12К. Были получены два мутанта 12К, mutBM, в
котором четыре остатка аргинина в положительно за ряженом кластере были заменены на остатки алан и на, и ти1р[п§, в котором два остатка цистеина, входящих в состав мотива цинкового пальца, были заменены на остатки аланина (Рис. 16).
Wt Т A ft It В И ALÉ LCRtHR£YltVVPPLF^eiSR£DNflT¿V
JnvtBM , . A A А A . .............................
mutFIng ... . ...... ..А. .А.. .... ... ...........
Рис. 16. Предполагаемая доменная организация и мутагенез 12К CVB. Аминокислотная последовательность белка показана в виде линии, на которой выделены остатки цистеина (С), предположительно принимающие участие в образовании цинкового пальца, который показан в виде петли, и положительно заряженные остатки аргинина (обозначены «+»). Приведена аминокислотная последовательность района, подвергшегося мутагенезу, и замены, внесенные при конструировании мутантов mutBM и mutFing.
Влияние!2К и его мутантных вариантов на инфекцию PVXin Irans
При экспрессии в контексте генома вируса 12К увеличивает патогеность PVX в растениях N. tabacum, и этот эффект различен в растениях генотипов NN и пл. Для того, чтобы проверить, оказывает ли 12К подобное действие на инфекцию PVX in trans, был поставлен эксперимент, в котором исследовалось влияние экзогенной экспрессии 12К на развитие инфекции PVX. Были получены конструкции pLH-PVX, pLH-PVX-12K, pLH-mutFing и pLH-mutBM. Способность I2K и его мутантных вариантов индуцировать in trans развитие защитной реакции растений при заражении PVX исследовалась в системе временной экспрессии геноа в растениях N.tabacum генотипов NN и пп. Листья N. tabacum инфильтрировали смесью двух культур A, tumefaciens, одна из которых несла pLH-PVX, а другая - pLH'12K или один из описанных выше бинарных векторов, кодирующих ген белка I2K с определенной мутацией. В качестве положительного контроля листья инфильтрировали смесью двух культур A. tumefaciens, одна из которых несла pLH-PVX-12К, а другая - бинарный вектор pLH без экспресс ион ной кассеты, в качестве отрицательного контроля листья инфильтрировали смесью двух культур A. tumefaciens, одна из которых несла pLH-PVX, а другая бинарный вектор pLH без экспрессионной кассеты. На 4 дли на листьях растений генотипа пп инфильтрированных культурой несущей pLH-PVX-12К и смесью культур, несущих pLH-PVX и pLH-12 К, начиналось развитие некротической реакции, что на 7 дпи приводило к отмиранию инфильтрированных листьев (данные не показаны). Развития некротической реакции на листьях растений генотипа пп, инфильтрированных культурой, несущей pLH-PVX, или смесью культур, несущих pLH-PVX + pLH-mutPing или pLH-PVX + pLH-mutBM, не происходило. В растениях генотипа NN наблюдался сходный эффект, однако развитие некротической реакции происходило не на 4, а на 7 дпи (данные не показаны), что на 10 дпи приводило к отмиранию инфильтрированных листьев.
На основании этих данных можно сделать вывод, что экспрессия 12К в контексте генома вируса не является необходимой для функционирования 12К в качестве детерминанты патогенности при инфекции PVX, а также, что введение мутаций в кластер положительно заряженных аминокислотных остатков или мотив цинкового пальца подавляет данную активность белка 12К.
Способность белка 12К связывать РНК и ДНК in vitro
Ядерная локализация белка 12К позволяла предположить, что действие 12К основано на взаимодействии с нуклеиновыми кислотами в ядре. Это предположение согласовывалось с сообщением о том, что ЦББ PVM (карлавируса, родственного CVB) обладает ДНК- и РНК-связывающей активностью in vitro (Gramstat et al,, 1990). Кроме того, центральный район последовательности, консервативный у белка 12К CVB и ЦББ других карлавирусов, содержит богатый аргинином мотив и мотив цинкового пальца (Рис. 16), которые присутствуют у ряда белков, связывающих нуклеиновые кислоты (Levay andZavriev, 1991; Koonin et al, 1991). Для исследования РНК и ДНК связывающей активности белка 12К использовался белок, слитый с олигогистидиловой последовательностью в карбокситерминальной области. Был применен метод сдвига в агарозном геле в иеденатурирующих условиях, позволяющий судить об образовании РНП- и ДНП-комплексов в растворе (Kalinina et al., 2001). Для того, чтобы определить роль мотива цинкового пальца в связывании нуклеиновых кислот белком 12К. реакция проводилась в присутствии катионов магния и в присутствии катионов цинка.
Для изучения РНК-свдзывания белок 12К, взятый в последовательно увеличивающихся количествах, инкубировали с гетерологичной РНК, которая представляла собой транскрипт кДНК копии геномной РНК a BSMV и имела размер 3164 н.о. В присутствии ионов Mg2* белок 12К. проявил РНК-связывающую активность, образуя РНП-комплексы, неспособные входить в гель. С увеличением соотношения белок:РНК количество задержанной в геле РНК увеличивалось, и при молярном соотношении белок:РНК 700:1 вся РНК переходила в состав РНП-комплекса, РНК находилась либо в свободном состоянии, либо в составе комплекса с I2K в полностью ретардированном состоянии (Рис. 17). Подобный характер связывания белков с нуклеиновыми кислотами в опытах по сдвигу в геле считается прямым указанием на кооперативность их взаимодействия (Citovsky et al 1992). В присутствии ионов ZnJ* эффективность связывания РНК белком 12К была выше, чем в присутствии иоиов MgJ+: уже при молярном соотношении белок:РНК 250:1 вся РНК полностью переходила в состав РНП-комплекса, неспособного входить в гель (Рис. 17). Белок в равной степени связывал РНК, имеющие разные первичные структуры (данные не показаны), что говорит о том, что его связывание с нуклеиновыми кислотами неспецифично по отношению к их последовательности.
Для изучения ДНК-связывания белок 12К инкубировали с линейной двуцепочечной ДНК длиной 590 нп, В присутствии катионов Mg вся РНК переходила в состав ДНП комплекса при молярном соотношении белок:ДНК 600:1. В присутствии катионов Zn2' при малых молярных соотношениях белокгДНК (1:75) возникали комплексы, мигрирующие геле, и только при достижении соотношения 250:1 обнаруживались комплексы, неспособные входить в гель (Рис. 17). Образование двух типов комплексов согласуется с наличием у белка 12К двух районов, потенциально способных связывать нуклеиновые кислоты, а именно аргинин-богатого мотива и мотива цинкового пальца. Поскольку РНК- и ДНК-связывающая активность 12К была выше в присутствии ионов цинка (Рис. 17), можно говорить о том, что предполагаемый мотив цинкового пальца играет существенную роль в связывании нуклеиновых кислот.
Для того, чтобы выяснить с какой нуклеиновой кислотой 12К взаимодействует эффективнее, использовался метод конкурентного связывания. Реакция связывания белка дикого типа с радиоактивномеченной дцДНК длиной 590 нп проводилась в присутствии оцРНК длиной 3164 но. Реакция проводилась в присутствии катионов Mg2+ или Zn2\ Молярное соотношение РНК:ДНК:белок в пробах, содержащих Mg2+ , составляло 0:1:5800, 10:1:5800, 50:1:5800 н 100:1:5800, в пробах, содержащих Zni+ , - 0:1:2900,
10:1:2900, 50:1:2900 и 100:1:2900. В присутствии катионов Mgi+ комплексы ДНК-белок, не способные мигрировать в геле, образовывались в отсутствие РНК и при соотношении РНК:ДНК:белок 10:1:5800. При большем соотношении РНЮДНК комплексов белок-ДНК не образовывалось, В присутствии катионов Zn2+ полностью ретардированный комплекс ДНК-белок образовывался только при соотношении РНК:ДНК:белок 0:1:2900. При больших соотношениях образовывались промежуточные ДНП-комплексы, подвижность которых характеризовалась обратной зависимостью от количества РНК в реакционной смеси (Рис. 18). Таким образом, было показано, что 12К более эффективно связывает оцРНК, чем дцДНК (Рис. 18). С другой стороны, в присутствии ионов цинка даже при молярном соотношении РНК:ДНК равным 100:1 осутствовала ДНК, не связанная с белком 12К (Рис. 18), что говорит об эффективности связывания ДНК этим белком. Такие данные не позволяют с уверенностью говорить о том, какой тип нуклеиновый кислоты связывает белок 12К ¡n vivo. Учитывая его локализацию в ядре, можно предполагать влияние белка 12К на транскрипционный статус определенных генов за счет его способности связывать ДНК и/или на созревание и транспорт мРНК из ядра в том случае, если реализуется его РНК-связывающая активность.
•V
* i I i I i i i i I
Mg1
gsfiigfil
Рис, 17. Анализ РНК(А) и ДНК-связываюшей (В) активности 12К методом сдвига в геле. Очищенный рекомбинантный белок инкубировали с оцРНК длиной 3164 н.о (А) или с дцДНК длинной 590 н.п.(В) во льду в течении 30 мин. Реакция проводилась в буферном растворе, содержащем катионы или ¿п1*. Реакционные смеси подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем бромистый этндий. Для каждой дорожки указано молярное соотношение белок:РНК (А) или белок;ДНК (В), К, свободная РНК (А), или свободная ДНК (В), инкубированная в отсутствии белка.
мя'* гпг*
Рис. 18. Конкурентное связывание рекомбинаитног» белка 12К с дцДНК и оцРНК. Комплексы 12К с радиоактивно-меченой дцДНК длинной 590 н.п. образовывали в присутствии возрастающих количеств оцРНК длинной 3164 и.о. Реакция проводилась в буферном растворе, содержащем катионы (левая часть рисунка) и (правая часть рисунка). Молярное соотношение 6слок:ДНК в реакционной смеси, содержащей катионы М^, составляло 5800:1. Молярное соотношение белок:ДНК в реакционной смеси, содержащей катионы гп11", составляло 2900:1. Реакционные смеси подвергали электрофорезу в неденэтурирующем 6% акрил амид ном геле, затем гель высушивали и радиоавтограф иро вал и. Для каждой дорожки указано молярное соотношение ДНК: РНК, К, свободная ДНК, инкубированная в отсутствии белка.
ВЫВОДЫ
1. Показано, что при экспрессии в контексте PVX ЦББ 8К PMTV, 12К CVB н 15К ShVX увеличивают патогенность PVX в растениях N. benthamiana, не являясь при этом супрессорами PTCS или факторами авирулентности.
2. На основании анализа инфекции рекомбинантных вирусов PVX-8K, PVX-12K и PVX-15К в N. tabacum cv. Samsun показано, что защитный ответ растения на инфекцию рекомбинантными вирусами выражен существенно сильнее в растениях генотипа пп по сравнению с растениями генотипа NN.
3. При сравнительном анализе профиля экспрессии генов N. benthamiana в тканях, инфицированных PVX и рекомбинантным вирусом PVX-12K, идентифицированы десять генов, дифференциально экспрессирующнхея при инфекции PVX-12K, и выявлено их сходство с генами, ассоциированными с защитной реакцией растения на атаку а вирулентных патогенов.
4. Установлено,, что кластер положительно заряженных аминокислотных остатков и предполагаемый мотив цинкового пальца в составе 12К CVB необходимы для функционирования этого белка в качестве детерминанты патогенностн; показано, что 12К CVB обладает РНК- и ДНК-связывающеЙ активностью in vitro,
5. Изучена внутриклеточная локализация ЦББ 8К PMTV и I2K CVB. Показано, что слитый с GPP 8К PMTV локализован в цитоплазматических мембранных структурах, которые являются производными эндоплазматического ретикулума, тогда как слитый с GFP 12К СVB локализован в ядре.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Н. И. Луховицкая, А. Г. Соловьев, Т. Е. Кошкина, С. К. Завриев, С. Ю. Морозов. Взаимодействие цистеи и-богатого белка карлавируса с защитной системой растения-хозяина. Молекулярная Биология (Молекулярная биология, 2005, том 39, MS стр. 896* 904)
2.YeMna NE, Erokhina TN, Lukhovitskaya N1, Minina EA, Schepetilnikov MV, Lesemann DE, Schiemann J, Solovyev AG, Morozov SY. Localization of Poa semilatent vims cysteine-rich protein in peroxisomes is dispensable for its ability to suppress RNA silencing. J Gen Virol. 86,2005,479-89.
3.Lukhovitskaya N1, Yelina N.E. Zamyatnin A.A. Solovyev A.G. Schepetilnikov M.V. Sandgren M. Morozov S.Y. Valkonen J.P, Saveukov E.I. Expression, localization and effects on virulence of the cysteine-rich 8 kDa protein of Potato mop-top virus.(77ie Journal Of General Virology, 86,2005, P.2879-89 )
4 Zamyatnin AA, Yelina NE, Lukhovitskaya N1 , Solovyev AG, Germundsson A, Sandgren M, Morozov SYu, Valkonen JPT, Savenkov EI. High-scale analysis of pathogenicity determinants of Potato mop-top virus, International symposium "Cell biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants" (71 September 2004, Yalta, Ukraine)
5. Луховицкая Н.И., Соловьев А.Г. Взаимодействие цнстеин-богатого белка карлавируса с защитной системой растения-хозяина. 10-я пущииская школа-конференция молодых ученых посвященная SO-летию Пущинского научного центра РАН 17-21 апреля 2006 года
6. Solovyev AG, Yelina NE, Lukhovitskaya N1, Minina EA, Morozov SY. "Viral proteins control both triggering and suppression of plant defense response." Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development: Proceedings of the II Moscow International Congress (10-14 November 2003, Moscow, Russia)
Заказ Ng 179/11/06 Подписано в печать 17.11.2006 Тираж 80 экз. Усл. пл. 1,5
е" ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Луховицкая, Нина Иосифовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Gene-for-gene resistance
СI р) кг) pa R-белков
Механизм вшимодействия R-Avr
Индукция сигнальных путей, вызванная взаимодействием R-Avr
Приобретенная сиаемная устойчивость (SAR)
1Ч-!ависимая усюйчивость табака к TMV
Rx-зависиман усюйчивость картофеля к PVX
Тт2.2-твисимая устойчивость томата к ToMV
SwS-завнсимая устойчивость томата к TWSV
HRT-зависимая усюйчивоаь арабидопсиса kTCV
RCY1 зависимая усюйчивос1ь арабидопсиса к CMV-Y
Рецессивные гены ус i ойчивосз и
Р11 (PAMP triggered immunity)
Поспранскрипционноеумолкание генов
Механизм индукции PTGS вирусами растений
РНК-содержащие вирусы
Д11К-содержащие вирусы
Стадии PTGS
Распространение PTGS
С) прессоры PTGS
P19TBSV
He-Pro PVY
2b CMV и ГАУ
25К PVX
CP TCV
TrAP TYLCV
NSsTSWVhNS3RHBV
P15PCV yb BSMV и PSLV
ORF6 TMV
Малые цис геип-бога i ые белки (ЦББ) вирусов рас i ений
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние ЦББ па развшие инфекции PVX
ЦББ, как возможные факторы авирулентности
ЦББ, как возможные супрессоры «сильного» пути индукции PTGS
ЦББ, как вошожные супрессоры «слабого» пут индукции PTGS
8К, как возможный компонент системы супрессии PTGS PMTV
Дс1скция белка 8К в зараженных растениях
Вн) I риклеточная локализация белка GFP-8K
Вн> I риклеточная локализация белка 12К слито! о с GFP 102 Влияние N-гена на инфекцию PVX-8K, PVX-12K и PVX-15K в N. 104 tabacum
Сравнительный анализ профиля экспрессии ichob N. benthamiana при 115 инфекции PVX дикого тина и рекомбинанзного вируса PVX-12K
Идентификация дифференциально экспрессирукицихся мРНК 115 Свойсша белков, кодируемых дифференциально экспрессируемыми 118 ■енами
Изучение свойств белка 12К CVB
MyraieHi белка 12К CVB.
Влияние 12К и его мутантных вариантов на инфекцию PVX in trans
Способное ib белка 12К связывать РНК и ДНК in vitro
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Функции регуляторных цистеин-богатых белков вирусов растений"
Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия вирусных патогенов ирастений-хо?яев на молекулярном уровне. Исследование молекулярных механизмов,1ежан|их в основе вирусною патогенеза, напрямую связно с изучениемф>ндамен1а.1ьных биочогических процессов в растениях, гаких как передача сигнала,ре1уляция -жсирессии генов, межклеточная коммуникация и программируемаяклеточная смерть В мредставле1пюй работе описана и исследована новая группакодируемых фиювирусами белков, определяющих xapaKiep взаимодействия срастениями хозяевами.Малые неструктурные цистеин-богатые белки (ЦББ) кодируются геномом ряда(+)РНК-содержан1их вирусов растений, К ним относятся вирусы родов Hordeivirus,Tohiavints, Benyvirus, Peduvirm, Allexivirus, Furovirus, Pomovirus и Carlavirus Посгепени структурною сходства ЦББ можно разделить на две группы К первой01 носятся белки, кодируемые вирусами родов Hordeivirus, Tobrcmrus, Benyvirus,Peduviriis и Furovirus И$вестно, что белки этой фуппы участвуют в регуляциирепликации и экспрессии генома вируса, системного транспорта вируса и являютсядетерминантами пато1енности Для ряда ЦББ этой группы была продемопстрированаспособность подавпять PTGS (Dunoyer et al., 2002, Yelina et a l , 2002, Reavy et al., 2004,le et al, 2005) Вторую группу составляют ЦББ, кодируемые вирусами, относяншмисяк двум родам семейсгва Flexiviridae, Allexivirus и Carlavirus. ЦББ PMIV {Pomovirus)неп.зя отнести ни к одной из этих грунн из-за отсутствия сташстически значимогосходства носледовательностеи между ним и дру1 ими.Цель данной работы состояла в изучении функций ЦББ 8К PMTV {Pomovirus), 12КCVB (Сшlavirus) и 15К ShVX {Allexivirus). В ходе работы решались следующиеосновные задачи' Изучение влияния экспрессии ЦББ в составе генома PVX на развитиевирусной инфекции и накопление вирус-сцеццфических РНК в растениях N.benthamiana и N tabacuni; изучение молекулярньЕХ механизмов влияния ЦББ наицд)кцию защитной реакции растении; и-^учение внутриклеточной локализации ЦББ8К PMTV и 12К CVB, картирование районов ЦББ 12К CVB, необходимых для егоф>нкционирования в качестве детерминанты патогенности, изучение снособности 12КCVB связывать нуклеиновые кислоты т vitro
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Луховицкая, Нина Иосифовна
выводы
1 Показано, что при экспрессии в контексте PVX ЦББ 8К PMTV, 12К CVB и 15К ShVX увеличивают иаюгснность PVX в растениях N. benthamiana, не являясь при этом супрессорами PTGS или факторами авирулентности.
2 На основании анализа инфекции рекомбинантных вирусов PVX-8K, PVX-12K и PVX-15К в N tabacum cv Samsun показано, что защитный ответ растения на инфекцию рекомбинантными вирусами выражен существенно сильнее в растениях генотипа пп по сравнению с растениями генотипа NN.
3 При сравнительном анализе профиля экспрессии 1енов N. benthamiana в тканях, инфицированных PVX и рекомбинантным вирусом PVX-12K, идентифицированы десять генов, дифференциально экспрессирующихся при инфекции PVX-12K, и выявлено их сходство с генами, ассоциированными с защитной реакцией растения на атаку авирулентных патогенов.
4 Установлено, что кластер положительно заряженных аминокислотных остатков и предполагаемый мотив цинкового пальца в составе 12К CVB необходимы для функционирования этого белка в качестве детерминанты патогенности; показано, что 12К CVB об 1адает PIIK- и ДНК-связывающей активностью in vitro
5 Изучена внутриклеточная локализация ЦББ 8К PMTV и 12К CVB. Показано, что слитый с GFP 8К РМIV локализован в цитонлазматических мембранных структурах, которые являются производными эндоплазматического регикулума, тогда как слитый с GFP 12К CVB локализован в ядре.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Луховицкая, Нина Иосифовна, Москва
1. Anandalakshmi, R., Marathe, R, Ge, X., Herr, J. M., Jr, Май, С , Mallory, A., Pruss, G, Bowman, L. & Vance, V. B. (2000). A calmodulin-related protein that suppresses posttranscnptional gene silencing in plants Science 290,142-4.
2. Anandalakshmi, R, Pruss, G. J, Ge, X, Marathe, R., Mallory, A. C., Smith, Т. II. & Vance, V В (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13079-84
3. Apel, К & Ilirt, H (2004). Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Biol 55,373-99.
4. Aravind, L. & Koonin, E V. (2002). Classification of the caspase-hemoglobinase fold: detection of new families and implications for the origin of the eukaryotic separins Proteins 46, 355-67
5. Axtell, M. J. & Staskawicz, B. J. (2003). Initiation of RPS2-specified disease resistance in Arabidopsis is coupled to the AvrRpt2-directed elimination of RIN4. Cell 112, 369-77.
6. Azevedo, C., Sadanandom, A., Kitagawa, K., Freialdenhoven, A., Shirasu, K. & Schulze-Lefert, P. (2002). The RAR1 interactor SGT1, an essential component of R gene-triggered disease resistance. Science 295,2073-6.
7. Ban/et, N., Richaud, C., Deveaux, Y., Kazmaier, M., Gagnon, J. & Tnantaphylides, C. (1998) Accumulation of small heat shock proteins, including mitochondrial HSP22, induced by oxidative stress and adaptive response in tomato cells. Plant J 13,519-27.
8. Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116,281-97.
9. Bauer, D, Mullcr, H., Reich, J., Riedel, H, Ahrenkiel, V., Warthoe, P. & Strauss, M. (1993) Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR) Nucleic Acids Res 21,4272-80.
10. Baulcombe, D (2002) Viral suppression of systemic silencing Trends Microbiol 10, 306-8
11. Baync, I: H , Rakitina, D. V., Morozov, S. Y. & Baulcombe, D. C. (2005). Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing Plant J 44, 471-82
12. Bendahmane, A, Farnham, G., Moffett, P. & Baulcombe, D. C. (2002) Constitutive gain-of-function mutants in a nucleotide binding site-leucine rich repeat protein encoded at the Rx locus of potato. Plant J 32,195-204.
13. Bendahmane, A , Kanyuka, K. & Baulcombe, D. C. (1999) The Rx gene from potato controls separate virus resistance and cell death responses Plant Cell 11, 781-92.
14. Bernstein, E, Caudy, A A, Hammond, S. M. & Hannon, G. J. (2001) Role for a bidentate nbonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-6.
15. Bisgrove, S. R, Simonich, M. Т., Smith, N. M., Sattler, A. & lnnes, R. W. (1994) A disease resistance gene in Arabidopsis with specificity for two different pathogen avirulence genes Plant Cell 6, 927-33.
16. Bonas, U (1994) hrp genes of phytopathogenic bacteria. Curr Top Microbiol Immunol 192,79-98
17. Boyes, D. C., Nam, J & Dangl, J. L. (1998). The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A 95,15849-54.
18. Bragg, J N., Lawrence, D. M. & Jackson, A. O. (2004). The N-terminal 85 amino acids of the barley stripe mosaic virus gammab pathogenesis protein contain three zinc-binding motifs J Virol 78, 7379-91.
19. Brigneti, G , Voinnet, O., Li, W. X, Ji, L. H., Ding, S. W. & Baulcombe, D. C. (1998). Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana HmboJ 17,6739-46.
20. Brommonschenkel, S. H., Frary, A., Frary, A & Tanksley, S D (2000). 'I he broad-spectrum tospovirus resistance gene Sw-5 of tomato is a homolog of the root-knot nematode resistance gene Mi. Mol Plant Microbe Interact 13,1130-8.
21. Bucher, E, Sijen, T, De Haan, P., Goldbach, R. & Prins, M. (2003). Negative-strand tospoviruses and tenuiviruses carry a gene for a suppressor of gene silencing at analogous genomic positions J Virol 77, 1329-36
22. Canto, I., MacFarlane, S. A. & Palukaitis, P. (2004) ORF6 of Tobacco mosaic virus is a determinant of viral pathogenicity in Nicotiana benthamiana. J Gen Virol 85, 3123-33.
23. Carroll, Г. W. (1970). Relation of barley stripe mosaic virus to plastids. Virology 42, 1015-22.
24. Chandra-Shekara, А С , Navarre, D., Kachroo, A., Kang, H. G., Klessig, D. & Kachroo, P (2004) Signaling requirements and role of salicylic acid in HRI- and rrt-mediated resistance to turnip crinkle virus in Arabidopsis. Plant J 40, 647-59.
25. Chapman, E. J., Prokhnevsky, A. I., Gopinath, K., Dolja, V. V. & Carrington, J. C. (2004) Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate step. Genes Dev 18, 1179-86.
26. Chellappan, P , Vanitharani, R., Pita, J. & Fauquet, С. M. (2004) Short interfering RNA accumulation correlates with host recovery in DNA virus-infected hosts, and gene silencing targets specific viral sequences J Virol 78, 7465-77.
27. Chen, II. M., Zhou, J. & Dai, Y. R. (2000). Cleavage of lamin-like proteins in in vivo and in vitro apoptosis of tobacco protoplasts induced by heat shock. FEBS Lett 480,165-8.
28. Chen, Z, Silva, H & Klessig, D. F. (1993) Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science 262, 1883-6.
29. Chichkova, N. V, Kim, S. II., Titova, E S , Kalkum, M., Morozov, V. S., Rubtsov, Y. P., Kalinina, N. 0, 1 aliansky, M. E. & Vartapetian, A. B. (2004) A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. Plant Cell 16, 157-71.
30. Chinchilla, D., Bauer, Z., Regenass, M., Boiler, T. & Felix, G. (2006). The Arabidopsis receptor kinase H.S2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception. Plant Cell 18,465-76.
31. Chisholm, S T, Coaker, G, Day, 13. & Staskawicz, B. J. (2006). Host-microbe interactions shaping the evolution of the plant immune response Cell 124, 803-14.
32. Citovsky, V, Wong, M. L., Shaw, A. L, Prasad, В. V. & Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids Plant Cell 4, 397-411.
33. Clarke, J. D , Volko, S. M., Ledford, H., Ausubel, F. M. & Dong, X. (2000). Roles of salicylic acid,jasmonic acid, and ethylene in cpr-induced resistance in arabidopsis. Plant Cell 12,2175-90
34. Cogoni, С & Macino, G. (1999). Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase. Nature 399, 166-9.
35. Cooley, M В , Pathirana, S., Wu, H. J., Kachroo, P. & Klessig, D. F. (2000). Members of the Arabidopsis HRI/RPP8 family of resistance genes confer resistance to both viral and oomycete pathogens Plant Cell 12,663-76.
36. Coppinger, P , Repetti, P. P., Day, В., Dahlbeck, D, Mehlert, A. & Staskawicz, B. J. (2004) Overexpression of the plasma membrane-localized NDR1 protein results in enhanced bacterial disease resistance in Arabidopsis thaliana. Plant J 40, 225-37.
37. Coquoz, J. L., Buchala, A. & Metraux, J. P. (1998). The biosynthesis of salicylic acid in potato plants Plant Physiol 117, 1095-101.
38. Culver, J. N, Lindebeck, A. G. C. & Dawson, W. O. (1991).Virus-host interactions: induction of chlorotic and necrotic responses in plants by tobamoviruses. Annu. Rev. Phytopathol 29, 193-217.
39. Dalmay, Г, Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S. & Baulcombe, D. C. (2000). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus Cell 101,543-53.
40. Dalmay, Т., Horsefield, R, Braunstein, Т. H. & Baulcombe, D. C. (2001). SDE3 encodes an RNA helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis. Embo J 20, 2069-78.
41. Dangl, J. L. & Jones, J. D. (2001). Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411, 826-33.
42. Dangl, J. L., Dietrich, R. A & Richberg, M. H. (1996). Death Don't Have No Mercy: Cell Death Programs in Plant-Microbe Interactions. Plant Cell 8,1793-1807.
43. Daniell, II. (1993) Foreign gene expression in chloroplasts of higher plants mediated by tungsten particle bombardment Methods in Enzymology. 217, 537-557.
44. Dardick, C. & Ronald, P. (2006). Plant and animal pathogen recognition receptors signal through non-RD kinases. PLoS Pathog 2, e2.
45. De Wit, PJGM. (1995). Fungal avirulence genes and plant resistance genes: Unraveling the molecular basis of gene-for-gene interactions. Adv. Bot. Res. 21,148-178.
46. DebRoy, S , Thilmony, R , Kwack, Y. В., Nomura, K. & He, S. Y. (2004). A family of conserved bacterial effectors inhibits salicylic acid-mediated basal immunity and promotes disease necrosis in plants Proc Natl Acad Sci U S A 101, 9927-32.
47. Delaney ТР., Uknes S., Vernooij В., Friedrich L., Weymann K., Negrotto D., Gaffney T , Gutrella M , Kessmann H , Ward E. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance Science 266, 1247-1250.
48. Delledonne, M , Xia, Y, Dixon, R. A. & Lamb, C. (1998). Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance Nature 394, 585-8.
49. Denti, M. A, Boutla, A., Tsagris, M. & Tabler, M. (2004). Short interfering RNAs specific for potato spindle tuber viroid are found in the cytoplasm but not in the nucleus. Plant J 37,762-9.
50. Duo, Л, Chen, J, Gitton, F., Antoniw, J. F., Mullins, J., Hall, A. M. & Adams, M. J. (1999) Sequences of European wheat mosaic virus and oat golden stripe virus and genome analysis of the genus furovirus. Virology 261,331-9.
51. Dijikstra J, Bruin, GCA., Burgers, AC. (1977). Systemic infection of some N-gene earning Nicotiana species and cultivars after inoculation with tobacco mosaic virus Neth. J. Plant Pathol 83,41-59.
52. Dinesh-Kumar, S P & Baker, B. J. (2000). Alternatively spliced N resistance gene transcripts their possible role in tobacco mosaic virus resistance. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 1908-13.
53. Dinesh-Kumar, S P., Tham, W. H. & Baker, B. J. (2000). Structure-function analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 14789-94.
54. Ding, S W, Li, W. X. & Symons, R. H. (1995). A novel naturally occurring hybrid gene encoded by a plant RNA virus facilitates long distance virus movement. Embo J 14, 5762-72.
55. Ding, S W., Shi, В J, Li, W. X. & Symons, R. H. (1996). An interspecies hybrid RNA virus is significantly more virulent than either parental virus. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 7470-4
56. Donald, R G. & Jackson, A. O. (1994). The barley stripe mosaic virus gamma b gene encodes a multifunctional cysteine-rich protein that affects pathogenesis. Plant Cell 6, 1593606
57. Donald, R G. & Jackson, A. O. (1996). RNA-binding activities of barley stripe mosaic virus gamma b fusion proteins J Gen Virol 77 ( Pt 5), 879-88.
58. Dong, X (2001) Genetic dissection of systemic acquired resistance. Curr Opin Plant Biol 4, 309-14
59. Dunigan, D. D & Zaitlin, M. (1990). Capping of tobacco mosaic virus RNA. Analysis of viral-coded guanylyltransferase-like activity. J Biol Chem 265, 7779-86
60. Dunoyer, P., Herzog, E., Hemmer, O., Ritzenthaler, C. & Fritsch, C. (2001). Peanut clump virus RNA-1-encoded PI5 regulates viral RNA accumulation but is not abundant at viral RNA replication sites. J Virol 75,1941-8.
61. Duno>er, P., Lecellicr, С H, Parizotto, E. A., Himber, С & Voinnet, O. (2004). Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing Plant Cell 16, 1235-50.
62. Dunoyer, P., Pfeffer, S., Fritsch, C., Hemmer, O., Voinnet, О & Richards, К E. (2002). Identification, subcellular localization and some properties of a cysteine-rich suppressor of gene silencing cncoded by peanut clump virus. Plant J 29, 555-67.
63. Durncr, J. & Klessig, D. F. (1995). Inhibition of ascorbate peroxidase by salicylic acid and 2,6-dichloroisonicotinic acid, two inducers of plant defense responses. Proc Natl Acad Sci US A 92, 11312-6
64. Edwards, M. C. (1995). Mapping of the seed transmission determinants of barley stripe mosaic \irus Mol Plant Microbe Interact 8, 906-15.
65. Elbaz, M, Avni, A. & Weil, M. (2002). Constitutive caspase-like machinery executes programmed cell death in plant cells. Cell Death Differ 9,726-33.
66. Enckson, F. L , Dinesh-Kumar, S. P , Holzberg, S., Ustach, С. V., Dutton, M., Handley, V, Corr, C. & Baker, B. J (1999a). Interactions between tobacco mosaic virus and the tobacco N gene. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci 354,653-8
67. Erickson, F. L , Holzberg, S , Calderon-Urrea, A., Handley, V., Axtell, M., Corr, C. & Baker, В (1999b). The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco. Plant J 18, 67-75.
68. Falk, A, Teys, В J., Frost, L. N, Jones, J. D , Daniels, M. J. & Parker, J. E. (1999). EDS1, an essential component of R gene-mediated disease resistance in Arabidopsis has homology to eukaryotic lipases. Proc Natl Acad Sci U S A 96,3292-7.
69. Fatland, В., Anderson, M., Nikolau, B. J. & Wurtele, E. S. (2000) Molecular biology of cjtosolic acetyl-CoA generation Biochem Soc Trans 28, 593-5.
70. Tire, A , Xu, S , Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S E & Mello, С С. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-11.
71. Flor, HIL (1956). The complementary genie systems in flax and flax rust. Adv Genet. 8, 29-54.
72. Flor, HH (1971) Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev Phytopathol. 9, 275-296
73. Fraser, RSS (1990) The genetics of resistence to plant viruses Annu. Rev. Phytopathol. 28, 179-200
74. Gaffney, 1 , Triedrich, L, Vernooij, В., Negmtto, D., Nye, G, Uknes, S , Ward, E., Kessmann, H, and Ryals, J. (1993) Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science 261, 754-756.
75. Gazzani, S , Lawrenson, Т., Woodward, С, Headon, D. & Sablowski, R. (2004). A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis Science 306, 1046-8.
76. Glazebrook, J. & Ausubel, F M. (1994) Isolation of phytoalexin-deficient mutants of Arabidopsis thaliana and characterization of their interactions with bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A 91,8955-9.
77. Glazebrook, J , Chen, W, Estes, В., Chang, H. S., Nawrath, C., Metraux, J. P., Zhu, T. & Katagin, F. (2003) Topology of the network integrating salicylate and jasmonate signal transduction derived from global expression phenotyping Plant J 34,217-28.
78. Gomez-Gomez, L & Boiler, T. (2002). Flagellin perception: a paradigm for innate immunity. 7 rends Plant Sci 7,251 -6.
79. Gramstat, A., Courtpozanis, A. & Rohde, W. (1990) 'I he 12 kDa protein of potato virus M displays properties of a nucleic acid-binding regulatory protein. FEBS Lett 276,34-8.
80. Greenberg, J T. (1997) Programmed Cell Death in Plant-Pathogen Interactions. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48,525-545.
81. Greenberg, J. T, Silverman, F. P. & Liang, H. (2000). Uncoupling salicylic acid-dependent cell death and defense-related responses from disease resistance in the Arabidopsis mutant acd5. Genetics 156, 341-50.
82. Guo, II S. & Ding, S. W. (2002). A viral protein inhibits the long range signaling activity of the gene silencing signal. Embo J 21,398-407.
83. Gupta, V, Willits, M. G. & Glazebrook, J. (2000) Arabidopsis thaliana EDS4 contributes to salicylic acid (SA)-dependent expression of defense responses: evidence for inhibition ofjasmonic acid signaling by SA. Mol Plant Microbe Interact 13,503-11.
84. Hagiwara, Y , Komoda, K., Yamanaka, Т., Tamai, A., Meshi, Т., Funada, R., Tsuchiya, Г, Naito, S. & Ishikawa, M. (2003). Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication. Embo J 22,344-53.
85. Hamada, W. & Spanu, P. D. (1998). Co-suppression of the hydrophobin gene HCf-1 is correlated with antisense RNA biosynthesis in Cladosporium fulvum. Mol Gen Genet 259, 630-8
86. Hamilton, A , Voinnet, О , Chappell, L & Baulcombe, D. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. Embo J 21,4671-9.
87. Hammond-Kosack, К В & Jones, J D. (1996). Resistance gene-dependent plant defense responses Plant Cell 8, 1773-91.
88. Hatsugai, N., Kuroyanagi, M., Yamada, K., Meshi, Т., Tsuda, S., Kondo, M., Nishimura, M. & Hara-Nishimura, 1. (2004). A plant vacuolar protease, VPE, mediates virus-induced hypersensitive cell death Science 305, 855-8.
89. He, Y & Gan, S (2002) A gene encoding an acyl hydrolase is involved in leaf senescence in Arabidopsis Plant Cell 14,805-15.
90. Hedrick, S. A , Bell, J N, Boiler, T. & Lamb, C. J. (1988). Chitinase eDNA Cloning and mRNA Induction by Fungal Elicitor, Wounding, and Infection. Plant Physiol 86,182-186.
91. Heil, M. & Bostock, R M (2002). Induced systemic resistance (ISR) against pathogens in the context of induced plant defences Ann Bot (Lond) 89, 503-12.
92. Heitz, T, Segond, S., Kauffmann, S., Geoffroy, P., Prasad, V., Brunner, F., Fritig, B. & Legrand, M (1994). Molecular characterization of a novel tobacco pathogenesis-related (PR) protein a new plant chitinase/lysozyme. Mol Gen Genet 245,246-54.
93. Henkes, S, Sonnewald, U., Badur, R., Flachmann, R. & Stitt, M. (2001) A small decrease of plastid transketolase activity in antisense tobacco transformants has dramatic effects on photosynthesis and phenylpropanoid metabolism Plant Cell 13, 535-51.
94. Higgins, C. F. (1992). ABC transporters: from microorganisms to man. Annu Rev Cell Biol 8,67-113
95. Holmes, FO.(1938). Inheritance of resistance to tobacco-mosaic disease in tobacco. Phytopathology 28,553-561.
96. Holt, B. F, 3rd, Belkhadir, Y. & Dangl, J. L. (2005). Antagonistic control of disease resistance protein stability in the plant immune system. Science 309, 929-32.
97. Holt, В F, 3rd, Hubert, D A. & Dangl, J. L. (2003). Resistance gene signaling in plants-complex similarities to animal innate immunity. Curr Opin Immunol 15,20-5.
98. I long, Y, Saunders, K. & Stanley, J. (1997). Transactivation of dianthin transgene expression by African cassava mosaic virus AC2. Virology 228,383-7.
99. Hueck, C. J. (1998). Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants Microbiol Mol Biol Rev 62,379-433.
100. Hunt, M. D , Neuenschwander, U. II., Delaney, T P., Weymann, К В , Friedrich, L. В., I aw ton, К. A, Sterner, H Y. & Ryals, J. A. (1996) Recent advances in systemic acquired resistance research-a review. Gene 179, 89-95.
101. Jackson, А. О & Taylor, С. В (1996). Plant-Microbe Interactions- Life and Death at the Interface Plant Cell 8, 1651-1668.
102. Jackson, AO., Goodin, M, Moreno, I, Johnson, J., Lawrence, DM. (1998). Plant rhabdoviruses In Encyclopedia of Virology, in press.
103. Jasinski, M., Stukkens, Y., Degand, H., Purnelle, В, Marchand-Brynaert, J. & Boutry, M (2001) A plant plasma membrane ATP binding cassette-type transporter is involved in antifungal terpenoid secretion. Plant Cell 13, 1095-107
104. Ji, L II. & Ding, S. W. (2001). The suppressor of transgene RNA silencing encoded by Cucumber mosaic virus interferes with salicylic acid-mediated virus resistance. Mol Plant Microbe Interact 14, 715-24.
105. Jia, Y., McAdams, S. A., Bryan, G. Т., Hershey, H. P. & Valent, B. (2000). Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance. Embo J 19,4004-14.
106. Jin, H , Axtell, M. J., Dahlbeck, D., Ekwenna, O., Zhang, S , Staskawicz, B. & Baker, B. (2002) NPK1, an MLKKl-Iike mitogen-activated protein kinase kinase kinase, regulates innate immunity and development in plants. Dev Cell 3,291-7.
107. Jin, H., Liu, Y., Yang, K. Y., Kim, C. Y., Baker, B. & Zhang, S. (2003). Function of a mitogen-activated protein kinase pathway in N gene-mediated resistance in tobacco. Plant J 33,719-31.
108. Johansen, L. К & Carrington, J. C. (2001). Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiol 126, 930-8.
109. Jones, D A., Thomas, С M., Hammond-Kosack, К. E , Balint-Kurti, P. J. & Jones, J. D (1994). Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science 266,789-93.
110. Jones, L, Hamilton, A. J., Voinnet, O., Thomas, C. L., Maule, A. J. & Baulcombe, D. C. (1999). RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptional gene silencing Plant Cell 11,2291-301.
111. Kajava, A V. (1998). Structural diversity of leucine-rich repeat proteins. J Mol Biol 277,519-27.
112. Kashiwazaki, S , Scott, K. P., Reavy, B. & Harrison, B. D. (1995) Sequence analysis and gene content of potato mop-top virus RNA 3: further evidence of heterogeneity in the genome organization of furoviruses Virology 206, 701-6
113. Kasschau, K. D & Carrington, J. C. (1998). A counterdefensive strategy of plant viruses, suppression of posttranscriptional gene silencing. Cell 95,461-70.
114. Kasschau, K. D., Cronin, S. & Carrington, J. C. (1997). Genome amplification and longdistance movement functions associated with the central domain of tobacco etch potyvirus helper component-proteinase Virology 228, 251 -62.
115. Kawano, Г., Tanaka, S., Kadono, T. & Muto, S. (2004). Salicylic acid glucoside acts as a slow inducer of oxidative burst in tobacco suspension culture. Z Naturforsch C. 59,684-92.
116. Keen, N. T. (1990) Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions. Annu Rev Genet 24,447-63.
117. Kennedy, S , Wang, D. & Ruvkun, G. (2004). A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature 427, 645-9.
118. Kennerdell, J. R & Carthew, R. W. (1998). Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 95, 1017-26
119. Kim, С Y & Zhang, S. (2004). Activation of a mitogen-activated protein kinase cascade induces WRKY family of transcription factors and defense genes in tobacco. Plant J 38,142-51
120. Kim, M. G., da Cunha, L., McFall, A. J., Belkhadir, Y., DebRoy, S., Dangl, J. L. & Mackey, D (2005) Two Pseudomonas syringae type 111 effectors inhibit RIN4-regulated basal defense in Arabidopsis. Cell 121, 749-59.
121. Kjemtrup, S , Nimchuk, Z. & Dangl, J. L. (2000). Effector proteins of phytopathogenic bacteria bifunctional signals in virulence and host recognition Curr Opin Microbiol 3, 73-8.
122. Koenig, R, Pleij, С W., Beicr, C. & Commandeur, U. (1998) Genome properties of beet virus Q, a new furo-like virus from sugarbeet, determined from unpurified virus J Gen Virol 79 ( Pt 8), 2027-36.
123. Kohm, В. A , Goulden, M. G., Gilbert, J. E, Kavanagh, T A. & Baulcombe, D. C. (1993) A Potato Virus X Resistance Gene Mediates an Induced, Nonspecific Resistance in Protoplasts Plant Cell 5,913-920.
124. Koonin, E V. & Dolja, V. V. (1993). Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses' implications of comparative analysis of amino acid sequences Crit Rev Biochem Mol Biol 28,375-430.
125. Koonin, E V, Воуко, V. P. & Dolja, V. V. (1991). Small cysteine-nch proteins of different groups of plant RNA viruses are related to different families of nucleic acid-binding proteins Virology 181,395-8.
126. Kumar, I). & Klessig, D. F. (2003). High-affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity. Proc Natl Acad Sci USA 100, 16101-6
127. Kunhara, Y & Watanabe, Y. (2004). Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12753-8.
128. Lacomme, C. & Santa Cruz, S. (1999). Bax-induced cell death in tobacco is similar to the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 7956-61.
129. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-5.
130. Lamb, C. & Dixon, R. A. (1997). The Oxidative Burst in Plant Disease Resistance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48,251-275.
131. Lamb, C. J. (1994) Plant disease resistance genes in signal perception and transduction. Cell 76,419-22.
132. Lanfermeijer, F. C., Dijkhuis, J., Sturre, M. J., de Haan, P. & Hille, J. (2003). Cloning and characterization of the durable tomato mosaic virus resistance gene Tm-2(2) from L>copersicon csculentum. Plant Mol Biol 52,1037-49.
133. Levay, К & Zavnev, S. (1991). Nucleotide sequence and gene organization of the 3'-terminal region of chrysanthemum virus В genomic RNA. J. Gen. Virol. 72, 2333-7.
134. Levy, M, Edelbaum, О & Sela, I. (2004). Tobacco mosaic virus regulates the expression of its own resistance gene N. Plant Physiol 135,2392-7.
135. Li, H. W., Lucy, A. P., Guo, H. S., Li, W. X., Ji, L. H., Wong, S. M. & Ding, S. W. (1999). Strong host resistance targeted against a viral suppressor of the plant gene silencing defence mechanism. Fmbo J 18,2683-91.
136. Li, J., Brader, G. & Palva, E. T. (2004). The WRKY70 transcription factor: a node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. Plant Cell 16,319-31.
137. Liang, P & Pardee, A. B. (1992). Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257,967-71.
138. Lindgren, P. В , Peet, R C. & Panopoulos, N. J. (1986). Gene cluster of Pseudomonas s>ringae pv "phaseolicola" controls pathogenicity of bean plants and hypersensitivity of nonhost plants J Bacteriol 168, 512-22.
139. Liu, Y , Jin, II, Yang, K. Y , Kim, C. Y., Baker, B. & Zhang, S. (2003). Interaction between two mitogen-activated protein kinases during tobacco defense signaling Plant J 34, 149-60
140. Liu, Y, Schiff, M , Marathe, R. & Dinesh-Kumar, S. P. (2002a). Tobacco Rarl, EDS1 and NPR1/N1M1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus. Plant J 30,415-29.
141. Liu, Y, Schiff, M, Serino, G., Deng, X. W. & Dinesh-Kumar, S. P. (2002). Role of SCb ubiquitin-ligase and the COP9 signalosome in the N gene-mediated resistance response to Tobacco mosaic virus Plant Cell 14, 1483-96.
142. I lu, Y , Schiff, M , Serino, G, Deng, X. W. & Dinesh-Kumar, S P. (2002b). Role of SCb ubiquitin-ligase and the COP9 signalosome in the N gene-mediated resistance response to lobacco mosaic virus Plant Cell 14,1483-96.
143. Loegering, WQ, Ellingboe, AH. (1987). H H. Flor. Pioneer in phytophatology. Annu Rev Phytopathol. 25, 59-66
144. Lovvry, О II, Rosebrough, N. J., Farr, A. L & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193,265-75.
145. Lu, R, Folimonov, A., Shintaku, M., Li, W. X., Falk, B. W., Dawson, W. O. & Ding, S. W (2004) Three distinct suppressors of RNA silencing encoded by a 20-kb viral RNA genome Proc Natl Acad Sci U S A 101, 15742-7.
146. Lucy, A. P, Guo, II. S., Li, W. X. & Ding, S. W (2000). Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. Embo J 19, 1672-80.
147. Mackey, D., Belkhadir, Y., Alonso, J. M, Ecker, J. R & Dangl, J. L. (2003). Arabidopsis RIN4 is a target of the type III virulence effector AvrRpt2 and modulates RPS2-mediated resistance Cell 112, 379-89.
148. Makeyev, E. V & Bamford, D. H. (2002) Cellular RNA-dependent RNA polymerase involved in posttranscriptional gene silencing has two distinct activity modes Mol Cell 10, 1417-27.
149. Maldonado, A. M, Doerner, P., Dixon, R. A., Lamb, C. J. & Cameron, R. K. (2002). A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in Arabidopsis. Nature 419, 399-403
150. Martin, J. A., Murphy, R. A. & Power, R. F. (2003). Cloning and expression of fungal phytases in genetically modified strains of Aspergillus awamori. J Ind Microbiol Biotechnol 30, 568-76.
151. Mestre, Р & Baulcombe, D. С (2006). Elicitor-mediated oligomeri/ation of the tobacco N disease resistance protein. Plant Cell 18,491-501.
152. Metraux, J.-P., Streit, L and Staub, Th. (1988). A pathogenesis-related protein in cucumber is a chitinasc. Physiol. Mol. Plant Pathol. 33,1-9.
153. Mette, M F , van der Winden, J, Matzke, M. A. & Matzke, A J. (1999). Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans Embo J 18,241-8
154. Meyers, В. С , Chin, D. В., Shen, K. A., Sivaramakrishnan, S., Lavelle, D. О , Zhang, Z. & Michelmore, R W. (1998) I he major resistance gene cluster in lettuce is highly duplicated and spans several megabases. Plant Cell 10,1817-32.
155. Мои, Z, Fan, W. & Dong, X. (2003). Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPRI function through redox changes. Cell 113,935-44.
156. Muangsan, N , Beclin, С , Vaucheret, H. & Robertson, D. (2004). Geminivirus VIGS of endogenous genes requires SGS2/SDE1 and SGS3 and defines a new branch in the genetic pathway for silencing m plants. Plant J 38,1004-14.
157. Multani, D S , Mceley, R В., Paterson, A. H., Gray, J., Briggs, S. P. & Johal, G. S. (1998) Plant-pathogen microevolution: molecular basis for the origin of a fungal disease in maize Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1686-91.
158. Nagel, R , Elliott, A , Masel, A , Birch, R.G., Manners, J.M. (1990). Electyroporation of binary li plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. FFMS Microb Lett, 67,325-328.
159. Napoli, С , Lemieux, C. & Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans Plant Cell 2, 279-289.
160. Nawrath, С , Heck, S, Parinthawong, N. & Metraux, J. P. (2002). EDS5, an essential component of salicylic acid-dependent signaling for disease resistance in Arabidopsis, is a member of the MATE transporter family. Plant Cell 14,275-86.
161. Nomura, K., Melotto, M. & He, S Y. (2005). Suppression of host defense in compatibleplant-Pseudomonas syringae interactions. Curr Opin Plant Biol 8,361-8.
162. Noutoshi, Y., lto, Т., Seki, M., Nakashita, H., Yoshida, S., Marco, Y., Shirasu, K. &
163. Nykanen, A., Haley, B. & Zamore, P. D. (2001). ATP requirements and smallinterfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107,309-21.
164. Oldroyd, G. E D & Staskawicz, B. J. (1998) Genetically engineered broad-spectrumdisease resistance in tomato. Proc Natl Acad Sci U S A 95,10300-5.
165. Onta, M., Iwahana, II., Kanazawa, H., Hayashi, K. & Sekiya, T. (1989) Detection ofpolymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformationpolymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A 86,2766-70.
166. Palukaitis, P., Roossinck, M J., Dietzgen, R. G. & Francki, R I. (1992). Cucumber mosaic virus Adv Virus Res 41, 281-348.
167. Peart, J. R , Mcstre, P , Lu, R, Malcuit, I. & Baulcombe, D С (2005) NRG1, a CC-NB-LRR protein, together with N, a TIR-NB-LRR protein, mediates resistance against tobacco mosaic virus. Curr Biol 15, 968-73.
168. Pecenkova, Т., Moravec, Т., Filigarova, M., Rosecka, P. & Cerovska, N. (2004). Extended sequence analysis of three Danish potato mop-top virus (PMTV) isolates. Virus Genes 29, 249-55.
169. Petty, I Г., Donald, R. G. & Jackson, A. O. (1994). Multiple genetic determinants of barley stripe mosaic virus influence lesion phenotype on Chenopodium amaranticolor. Virology 198,218-26
170. Petty, I. Т., French, R., Jones, R. W. & Jackson, A. O. (1990). Identification of barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. Embo J 9,3453-7.
171. Pfeffer, S, Dunoyer, P., Heim, F., Richards, К. E., Jonard, G. & Ziegler-Graff, V. (2002) P0 of beet Western yellows virus is a suppressor of posttranscriptional gene silencing. J Virol 76,6815-24.
172. Pieterse, С M., van Wees, S. C., van Pelt, J. A., Knoester, M, Laan, R, Gerrits, H., Weisbeek, P J & van Loon, L, C. (1998). A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis Plant Cell 10, 1571-80
173. Preston, C. A, Lewandowski, C., Enyedi, A. J. & Baldwin, I. Г (1999). Tobacco mosaic virus inoculation inhibits wound-induced jasmonic acid-mediated responses within but not between plants Planta 209, 87-95.
174. Qu, 1;., Ren, T & Morris, Т. J. (2003). The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step. J Virol 77, 511-22.
175. Rakitina, D. V., Yelina, N. E. & Kalinina, N. 0. (2006) Zinc ions stimulate the cooperative RNA binding of hordeiviral gammab protein. FEBS Lett 580, 5077-83.
176. Reavy, В , Anf, M , Cowan, G. H. & Torrance, L. (1998). Association of sequences in the coat protein/readthrough domain of potato mop-top virus with transmission by Spongospora subterranea. J Gen Virol 79 ( Pt 10), 2343-7.
177. Ren, T, Qu, F & Morris, T. J. (2000). HRT gene function requires interaction between a NAC protein and viral capsid protein to confer resistance to turnip crinkle virus. Plant Cell 12, 1917-26.
178. Ritter, E , Debener, Т., Barone, A., Salamini, F. & Gebhardt, С (1991) RFLP mapping on potato chromosomes of two genes controlling extreme resistance to potato virus X (PVX). Mol Gen Genet 227,81-5.
179. Robaglia, С & Caranta, C. (2006). Translation initiation factors a weak link in plant RNA virus infection. 1 rends Plant Sci 11,40-5.
180. Rooney, H. C., Van't Klooster, J. W., van der Hoorn, R. A., Joosten, M. H., Jones, J. D. & dc Wit, P. J. (2005). Cladosporium Avr2 inhibits tomato Rcr3 protease required for Cf-2-dependent disease resistance. Science 308, 1783-6.
181. Rothstein, S. J , Dimaio, J, Strand, M. & Rice, D. (1987) Stable and heritable inhibition of the expression of nopaline synthase in tobacco expressing antisense RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 8439-8443
182. Ruiz, M. Т., Voinnet, O. & Baulcombe, D. C. (1998). Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing Plant Cell 10,937-46
183. Russo, M., Burgyan, J. & Martelli, G. P. (1994). Molecular biology of tombusviridae. Adv Virus Res 44,381-428.
184. Ryals, J. A., Neuenschwander, U. H., Willits, M. G., Molina, A., Steiner, II.-Y. & Hunt, M. D (1996) Sjstemic acquired resistance. Plant Cell 8, 1809-1819.
185. Sambrook, J., Tntsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd edn Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.
186. Saraste, M , Sibbald, P. R. & Wittinghofer, A. (1990). The P-loop--a common motif in A1P- and G ГР-bmding proteins. Trends Biochem Sci 15,430-4.
187. Savenkov, E. I, Solovyev, A. G. & Morozov, S. (1998). Genome sequences of poa semilatent and lychnis ringspot hordeiviruses. Arch Virol 143, 1379-93.
188. Scott, К. P., Kashiwazaki, S., Reavy, B. & Harrison, B. D. (1994). The nucleotide sequence of potato niop-top virus RNA 2: a novel type of genome organization for a furovirus J Gen Virol 75 ( Pt 12), 3561-8.
189. Silverman, P., Seskar, M., Kanter, D., Schweizer, P., Metraux, J. P. & Raskin, I. (1995). Salicylic Acid in Rice (Biosynthesis, Conjugation, and Possible Role). Plant Physiol 108, 633-639.
190. Slekar, К H , Kosman, D. J. & Culotta, V. C. (1996). 'I he yeast copper/zinc superoxide dismutase and the pentose phosphate pathway play overlapping roles in oxidative stress protection J Biol Chem 271,28831-6.
191. Solovyev, A. G , Stroganova, T. A., Zamyatnin, A. A., Jr., Fedorkin, O. N., Schiemann, J & Morozov, S. Y (2000) Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins IGBp3-assisted targeting of TGBp2. Virology 269,113-27.
192. Song, S I, Song, J. Г., Kim, С. H., Lee, J. S. & Choi, Y. D. (1998). Molecular characterization of the garlic virus X genome. J Gen Virol 79 ( Pt 1), 155-9.
193. Staskawicz, B. J, Dahlbeck, D. & Keen, N. T. (1984). Cloned avirulence gene of Pseudomonas syringae pv. glycinea determines race-specific incompatibility on Glycine max (L ) Merr Proc Natl Acad Sci U S A 81,6024-6028.
194. Staskawicz, В J, Mudgett, M. В., Dangl, J. L. & Galan, J. E. (2001). Common and contrasting themes of plant and animal diseases. Science 292,2285-9.
195. Stevens, MR., Rhoads, DD., Lamb, EM., Gergerieh, RC., Morelock, ТЕ (1993) Use of PGR and RFLP techniques to map the Sw-5 locus conferring resistance to tomato spotted wilt \ lrus (1SWV) in tomatoes HortScience 28, 583
196. Suare/, M. F., Filonova, L. H., Smertenko, A., Savenkov, E. I., Clapham, D. H., von Arnold, S , Zhivotovsky, B. & Bozhkov, P. V. (2004). Metacaspase-dependent programmed cell death is essential for plant embryogenesis. Curr Biol 14, R339-40.
197. Suh, M С, Yi, S Y, Lee, S, Sim, W. S., Pai, H. S. & Choi, D. (2001) Pathogen-induced expression of plant ATP: citrate lyase. FEBS Lett 488,211-2.
198. Szittya, G., Molnar, A , Silhavy, D., Hornyik, C. & Burgyan, J. (2002). Short defective interfering RNAs of tombusviruses are not targeted but trigger post-transcriptional gene silencing against their helper virus. Plant Cell 14, 359-72.
199. Szittya, G , Silhavy, D., Molnar, A , Havelda, Z., Lovas, A , Lakatos, L., Banfalvi, Z. & Burgyan, J. (2003). Low temperature inhibits RNA silencing-mediated defence by the control of siRNA generation Embo J 22,633-40.
200. Tao, Y, Yuan, F., Leister, R. Т., Ausubel, F. M. & Katagiri, F. (2000). Mutational analysis of the Arabidopsis nucleotide binding site-leucine-rich repeat resistance gene RPS2. Plant Cell 12,2541-2554
201. Thomma, В P, Nelissen, I, Eggermont, K. & Broekaert, W. F. (1999). Deficiency in phytoalexin production causes enhanced susceptibility of Arabidopsis thaliana to the fungus Altemana brassicicola Plant J 19, 163-71.
202. Topfer, R, Matzeit, V., Gronenborn, В., Schell, J., Steinbiss, H.-H. (1987). A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions. Nucleic Acids Res. 15, 5890
203. Vance, V. & Vaucheret, H. (2001). RNA silencing in plants-defense and counterdefense Science 292,2277-80.
204. Vargason, J. M., Szittya, G., Burgyan, J. & Tanaka Hall, Т. M. (2003). Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor. Cell 115, 799-811.
205. Verhagen, B. W , Glazebrook, J., Zhu, Т., Chang, H. S., van Loon, L. C. & Pieterse, C. M (2004) Ihe transcriptome of rhizobacteria-induced systemic resistance in arabidopsis. Mol Plant Microbe Interact 17, 895-908.
206. Voinnet, О (2001) RNA silencing as a plant immune system against viruses Trends Genet 17,449-59.
207. Voinnet, 0., Lederer, C. & Baulcombe, D. C. (2000) A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana Cell 103, 157-67.
208. Voinnet, О , Pinto, Y M. & Baulcombe, D. C. (1999). Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14147-52
209. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. & Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pi9 protein of tomato bushy stunt virus Plant J 33, 949-56.
210. Vranova, H, Atichartpongkul, S., Villarroel, R., Van Montagu, M., Inze, D. & Van Camp, W (2002) Comprehensive analysis of gene expression in Nicotiana tabacum leaves acclimated to oxidative stress Proc Natl Acad Sci U S A 99,10870-5
211. Wei, N & Deng, X. W. (2003). The COP9 signalosomc Annu Rev Cell Dev Biol 19, 261-86
212. Weng, Z & Xiong, Z (1997). Genome organization and gene expression of saguaro cactus carmovirus. J Gen Virol 78 ( Pt 3), 525-34.
213. Whitham, S., Dinesh-Kumar, S. P., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. & Baker, B. (1994) The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell 78, 1101-15.
214. Wianny, F & Zernicka-Goetz, M. (2000). Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol 2, 70-5.
215. Wiermer, M., Feys, B. J. & Parker, J. E. (2005). Plant immunity: the EDS1 regulatory node CurrOpin Plant Biol 8,383-9.
216. Wingler, A, Brownhill, E & Pourtau, N. (2005) Mechanisms of the light-dependent induction of cell death in tobacco plants with delayed senescence. J Exp Bot 56,2897-905.
217. Woltenng, E. J., van der Bent, A. & Hoeberichts, F. A. (2002). Do plant caspases exist? Plant Physiol 130, 1764-9.
218. Xiao, S , Ellwood, S., Calis, O., Patrick, E., Li, Т., Coleman, M. & Turner, J. G. (2001). Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science 291, 118-20
219. Xie, Z, Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D , Zilberman, D , Jacobsen, S. E. & Carrington, J. C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2, El04.
220. Yalpam, N, Leon, J., Lawton, M A. & Raskin, I. (1993) Pathway of Salicylic Acid Biosynthesis in Healthy and Virus-Inoculated Tobacco. Plant Physiol 103, 315-321.
221. Yang, В , Zhu, W, Johnson, L. B. & White, F. F. (2000). The virulence factor AvrXa7 of Xanthomonas oryzac pv oryzae is a type III secretion pathway-dependent nuclear-localized double-stranded DNA-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA 97, 9807-12.
222. Yang, S & Ravelonandro, M. (2002). Molecular studies of the synergistic interactions between plum pox virus НС-Pro protein and potato virus X. Arch Virol 147,2301-12.
223. Yamsch-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains' nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-19
224. Yao, N. & Greenberg, J. Г. (2006). Arabidopsis ACCELERATED CELL DEATH2 modulates programmed cell death Plant Cell 18, 397-411.
225. Yao, N , Eisfelder, B. J., Marvin, J. & Greenberg, J. T. (2004) The mitochondrion--an organelle commonly involved in programmed cell death in Arabidopsis thaliana. Plant J 40, 596-610
226. Ye, К, Malinina, L. & Patel, D. J. (2003). Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA silencing. Nature 426, 874-8.
227. Yoo, В. С , Kragler, F, Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M , Lough, T. J. & Lucas, W. J. (2004). A systemic small RNA signaling system in plants Plant Cell 16, 1979-2000
228. Yu, D., Fan, В , MacFarlane, S. A. & Chen, Z. (2003). Analysis of the involvement of an inducible Arabidopsis RNA-dependent RNA polymerase in antiviral defense. Mol Plant Microbe Interact 16, 206-16.
229. Zago, E , Morsa, S , Dat, J. F., Alard, P., Ferrarini, A., Inze, D., Delledonne, M. & Van Breusegem, F. (2006) Nitric oxide- and hydrogen peroxide-responsive gene regulation during cell death induction in tobacco. Plant Physiol 141,404-11.
230. Zamore, P D , I uschl, Т., Sharp, P. A. & Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101,25-33
231. Zhang, Y., Fan, W , Kinkema, M., Li, X. & Dong, X. (1999). Interaction of NPR1 with basic leucine zipper protein transcription factors that bind sequences required for salicylic acid induction of the PR-1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A 96,6523-8.
232. Zhou, N, Tootle, T L, Tsui, F, Klessig, D. F. & Glazebrook, J. (1998). PAD4 functions upstream from salicylic acid to control defense responses in Arabidopsis Plant Cell 10, 1021-30
233. Zhou, Y, Jackson, А.О (1996). Expression of the barley striple mosaic virus "triple gene block".Virology, 216,367-379.
234. Zipfel, C. & Felix, G. (2005) Plants and animals: a different taste for microbes? Сип-Орт Plant Biol 8, 353-60.
235. Zipfel, C., Robatzek, S , Navarro, L., Oakeley, E. J., Jones, J. D , Felix, G. & Boiler, T. (2004) Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception Nature 428, 764-7.
-
Луховицкая, Нина Иосифовна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.06
- Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli
- Структурная организация геномной РНК Х вируса шалота
- Структурный и функциональный анализ транспортных генов гордеивирусов
- Изучение генетического разнообразия вируса мозаики турнепса и создание удвоенных гаплоидных линий Brassica - источников устойчивости к нему
- Изучение взаимодействия белка VPR вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) с клеточными структурами и белками ВИЧ-1 в процессе формирования вирусоподобных частиц
