Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli"

Зиятдинов Михаил Харисович

«Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli»

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степепи кандидата биологических наук

16 мдп т

- Москва 2013 -

005059338

Работа выполнена в лаборатории №1 Закрытого Акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» {ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент ЗАО «АГРИ»

М.М.Гусятинер

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор ФГУП ГосНИИгенетика

В.В.Носиков

Доктор биологических наук, ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи.

Г.И.Каратаев

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «£*у>> с ¿¿¿/.--^2013 года в 14— на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и . селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан «апреля 2013 г. ..:.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Т. Л. Воюшина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Аминокислота Ь-цистеин (далее цистеин) является одной из двух канонических аминокислот, содержащих в своем составе атом восстановленной серы (в "2), который включается в

предшественник цистеина, О-ацетилсерин, превращая его в цистеин, а эта аминокислота уже служит донором серы для синтеза второй серусодержащей амикислоты, Ь-метионина. Биосинтез цистеина, включая восстановление атома серы сульфат-иона до Б'2, осуществляют микроорганизмы и растения, тогда как животные и, в том числе человек, не способны к сульфат-редукции и нуждаются поэтому в том или ином источнике восстановленной серы. Такими источниками может быть и цистеин, и метионин, а также некоторые другие серусодержащие биологические молекулы.

Роль цистеина в составе белков уникальна в связи со свойствами тиоловой (-8Н) функциональной группы. Окисляясь, она образует ковалентную связь с тиоловой группой другого остатка цистеина, находящегося в той же полипептидной цепи или в составе другой, образуя дисульфидный мостик. Остатки цистеина в составе белков отличается наряду с разветвленными аминокислотами, метионином и тирозином гидрофобностью и поэтому участвуют в гидрофобных взаимодействиях между белковыми молекулами, сообщая белкам волокнистую структуру. С этим связано обилие цистеина в белках типа кератина в волосе, перьях и когтях. Кроме структурной функции цистеиновые остатки часто входят в состав каталитических центров ферментов, поскольку тиоловая группа может служить нуклеофилом в различных биохимических реакциях.

Потребность в цистеине постоянно растет. Он используется в пищевой промышленности, например, в хлебопечении, улучшая качество выпечки. Его добавка к мясным продуктам усиливает характерный мясной аромат, который обусловлен реакцией между цистеином и сахарами. Эффективна добавка цистеина в корм овец с точки зрения получения шерсти, которая очень богата этой аминокислотой. Интересно, что сейчас получены трансгенные овцы, в геном которых введены гены, обеспечивающие эндогенный синтез цистеина. Применение цистеина в медицине обусловлено высокой реакционной способностью его тиоловой группы. Он применяется для детоксикации при отравлении тяжелыми металлами, образуя прочные связи с последними. Цистеин ускоряет метаболизацию уксусного альдегида, токсичного продукта окисления этанола в организме, ответственного за похмельный синдром. Производное цистени Ы-ацетилиистеип широко используется в качестве лекарственного средства для борьбы с легочными явлениями, так как способствует разжижению мокроты, а также для детоксикации при некоторых отравлениях, что связывают с увеличением образования глутатиона, в состав которого входит цистеин.

В настоящее время цистеин получают в основном путем гидролиза перьев птиц и человеческих волос с последующим выделением его из смеси продуктов гидролиза. Полученный таким способом цистеин не является достаточно приемлемым продуктом на мировом рынке в силу несоответствия

религиозным и культурным традициям ряда народов. Некоторое количество цистеина получают путем микробиологической конверсией 2-амино-Д2-тиазолин-4-карбоновой кислоты, которую получают органическим синтезом. Цистеин можно также получать и биосинтезом без использования его предшественников с помощью продуцирующих эту аминокислоту микроорганизмов, созданных транснациональной компанией "Вакер Хеми АГ", которой принадлежат патенты на соответствующий способ получения цистеина; есть также научные публикации, основанные на этих патентах. Этот способ основан на применение штаммов Escherichia coli, с мутацией в гене cysE, освобождающей соответствующий фермент от ретроингибирования цистеином. Кроме того, в штаммах супер-экспрессирован ген ydeD, кодирующий белок-экспортер цистеина, что снижает токсическое действие цистеина на клетки кишечной палочки.

Данная работа посвящена изучению некоторых аспектов метаболизма цистеина у Escherichia coli, результаты которого могут быть использованы для дальнейшего развития микробиологического метода получения цистеина ферментацией без использования каких-либо его предшественников.

Цели и задачи работы.

1) Для создания эффективных бактериальных продуцентов цистеина необходимо десенсибилизировать ключевой фермент биосинтеза цистеина, серин-О-ацетилтрансферазы (САТ), к ингибированию этой аминокислотой. В известных штаммах-продуцента цистеина эта задача решена лишь частично. Ее решение осложняется тем, что ингибиторная молекула цистеина отличается от молекулы субстрата, серина, лишь заменой атома кислорода на атом серы. Обе эти молекулы конкурируют за один и тот же центр связывания, образуя практически одинаковые водородные связи с аминокислотными остатками САТ. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• На основании ранее опубликованных данных о структуре САТ, содержащей цистеин в каталитическом центре, построить трехмерную компьютерную модель центра связывания серина, в который поместить серин.

• Сравнить трехмерные структуры центра, связанного с цистеином и серином, с целью определения тех аминокислотных остатков САТ, которые более важны для связывания цистеина.

• С помощью рандомизированного мутагенеза участков гена cysE (кодирующего САТ) изменить пространственное положение аминокислотных остатков, взаимодейтсвующих с цистеином , но не с серином.

• Отобрать мутанты с рандомизированными участками гена cysE и изучить каталитические свойства мутантных САТ, сравнив их со свойствами известных.

2) После получения мутантов по гену cysE с высокой степенью устойчивости к ингибированию цистеином выяснилось, что такие мутантны экскретируют О-ацетилсерин (ОАС), продукт реакции, катализируемой мутантной CAT, что, вероятно, связано с недостаточностью последующей реакции биосинтеза цистеина. Представляет научный и практический интерес обнаружение транспортных систем, участвующих в поглощение ОАС из внешней среды и возвращение его в клетки.

В связи с этим решались следующие задачи:

• Индуцировать мутации, приводящие к неспособности усвоения ОАС.

• Используя плазмидные банки хромосомы E.coli, выявить плазмиды, комплементирующие эти мутации, и путем определения нуклеотидных последовательностей вставок в плазмиды идентифицировать гены, контролирующие процесс транспорта.

3) Целью нашей работы являлось изучение также превращения одного из продуктов реакции последнего этапа биосинтеза цистеина, S-сульфоцистеина, в цистеин. Это вещество образуется вместо цистеина при использовании тиосульфата в качестве источника серы и может накаливаться в среде роста. Были поставлены следующие задачи:

• Определить, является ли процесс превращения S-сульфоцистеина в цистеин чисто химическим или зависимым от белковых факторов и идентифицировать их.

• Найти транспортные системы, перемещающие S-сульфоцистеин из среды внутрь клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы.

На основании компьютерного моделирования центра связывания CAT с конкурирующими лигандами (серин и цистеин) сделаны предсказания, касающиеся модификации первичной структуры этого центра. В соответствии с этими предсказаниями методом рандомизированного мутагенеза удалось отобрать мутантные формы CAT со сниженным сродством к ингибитору при сохранении каталитической активности. Полученные мутации использовались для создания продуцентов цистеина, которые защищены российским и зарубежными патентами, и нашли применение в промышленном производстве цистеина.

Изучен ранее не известный генетический контроль поглощения предшественника цистеина, О-ацетилсерина, клетками кишечной палочки. Показано участие ряда помп, предположительно относящихся к группе факторов множественной лекарственной устойчивости (МагС, YchE, YhgN и SdsRQP) в транспорте О-ацетилсерина. Обнаружена также способность ранее известного транспортера олигопептидов YdgR транспортировать О-ацетилсерин.

Установлены белковые факторы, участвующие в восстановлении S-сульфоцистеина до цистеина. Обнаружен ген ydjN, кодирующий белок-импортер S-сульфоцистеина. Полученные данные могут быть использованы

при разработке способов микробиологического получения серусодержащих веществ.

На основе природного промотора гена nlpD сконструирован методом рандомизированного мутагенеза эффективный промотор для экспрессии генов, функция которых важна в ходе длительных процессов. Промотор нашел применение в данном и последующих исследованиях.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работы (2 статьи в научных журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 2 патента РФ и одна заявка на патент РФ). Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ молодых сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2008). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика и НТС ЗАО "АГРИ" 8 апреля 2013 года.

Структура и объем работы. Диссертация состоит. из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на страницах, включая рисунков и таблицы. Список цитируемой литературы содержит источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы и среды. Большинство штаммов Е. coli, использованных в работе, были получены на основе штамма MG1655 (F", X', rph-l). Для получения мутаций в гене cysE использовался штамм E.coli LE392 (Sambrook and Russell, 2001). Штаммы выращивали на средах известного состава (Sambrook and Russell, 2001): LB, минимальной среде М9 с глюкозой (0.4 и добавлением при необходимости L-аминокислот. Для плотных сред использовали агар (1.5%). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): хлорамфеникол (Cm) - 25, ампициллин (Ар) — 100, тетрациклин (Тс) -12.5.

Конструирование штаммов. Все модификации (делеции, инсерции, замены) хромосомы были выполнены прецизионно с помощью Red системы фага X (Datsenko and Wanner, 2000) и удаляемого in vivo маркера CmR (ген caí), находящегося в составе фрагмента XattL-cat-XattR (Doroshenko et al., 2007). Для объединения генетических мутаций (делеций) в хромосоме одного штамма соответствующие модификации, маркированные геном устойчивости

к антибиотикам, переносили с помощью метода общей трансдукции бактериофагом PI.

Определение активности глутатионредуктазы проводилось спектрофотометрическим методом (340 им) по изменению концентрации кофактора, NADPH (Carlberg, Mannervik, 1985).

Определение активности S-сульфоцистеин редуктазы (глутатнон-зависимой). Этот фермент восстанавливает S-сульфоцистеин до цистеина и сульфита, окисляя глутатион (образование цистеина подтверждали с помощью HPLC) Количество продукта реакции (окисленного глутатиона) определяли по расходу NADPH на его восстановление, которое катализировалось ферментным препаратом глутатионредуктазы фирмы Sigma. Количество израсходованного NADPH в реакционной смеси регистрировалось по уменьшению светопоглощения (340 нм).

Определение активности L-серин-О-ацетилтрансферазы (CAT) и ее каталитические свойства определяли по методу описанному ранее (Kredich, Tomkins, 1966) с некоторыми модификациями. Реакционная смесь (1 мл) содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ L-серин, 0,1 мМ ацетил-КоА и частично очищенный ферментный препарат.

Начальную скорость реакции определяли по уменьшению светопоглощения при 232 нм, вызванного разрывом тиоэфирной связи в ацетил-КоА. Расчет скорости реакции производили, основываясь на разнице в коэффициентах экстинкции (3,2 ммоль/литр/см) между ацетил-КоА и КоА. Единицей активности принимали такое количество ферментного препарата, которое катализирует образование 1 мкмоля КоА в мин. Белок определяли с помощью набора Bio Rad, при использовании бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Компьютерное моделирование каталитического сайта CAT. Сайт связывания цистеина находится в кармане, образованным двумя субъединицами CAT при образовании триммера. Цистеин, связывается в том же сайте, где происходит связывание одного из субстратов, серина, как это показали Pye et al (2004), изучив кристаллическую структуру CAT с разрешением 2,2 ангстрема. Нами в качестве основы была использована трехмерная структура центра связывания, содержащая цистеин. С помощью компьютерной программы InsightH (Moitcular simulations Inc., США), предназначенной для "причаливания" лигандов к рецепторным структурам, была получена 3D модель центра связывания серина, путем удаления связанного там цистеина. Далее была получена модель 3D структуры серина с помощью специального раздела той же программы. Структура серина была предварительно (ручное моделирование) помещена на место цистеина. Затем были взяты в расчет аминокислотные остатки CAT на расстоянии меньшем 6 ангстрем от молекулы серина; при этом считалось, что остальная часть CAT неподвижна. Сравнивали энергии десяти структур в зависимости от размещения лиганда (серина) и выбрали структуру, отвечающая наименьшей энергии. Для принятия решения о предполагаемой модификации данного

сайта связывания полученная 3D структура, содержащая серин, была наложена на соответствующую структуру, содержащую цистеин (подробнее см. патент России 2279477, http://www.freepatent.ru/patents/2279477).

Получение мутаций в гене cysE методом рандомизации фрагментов. Вначале на основе векторной плазмиды pMWl 18 (Nippon Gene, Япония) были созданы плазмиды pMW-PompC и pMW-PnlpD в рестрикционные сайты которых были включены фрагменты хромосомы штамма Е.соИ MG1655, содержащие промоторные последовательности генов отрС и nlpD, соответственно.

Далее ген cysE был получен путем ПЦР амплификации и включен в состав указанных плазмид, что привело к получению плазмид pMW-PompC-cysE и pMW-PnlpD-cysE. Для создания набора мутантных генов cysE с рандомизированной с 285 по 291 нуклеотид областью, в первом раунде был амплифицирован с помощью ПЦР фрагмент cysE гена, кодирующий последовательность с 1 по 102 аминокислотный остаток SAT. ПЦР осуществлялась с использованием плазмиды pMW-PompC-cysE в качестве матрицы и праймеров, содержащих по 6 рандомизированных нуклеотидов (см. рис.1).

РочфС г,")

Природный ген cysE

pMW-P™,pC-cysE

Первый рауид ПЦР, очистка в агароэном геле

pMW-Pnipo-cysE

Второй раунд ПЦР (удлинение)

Мутантный ген cysE

Третий раунд ПЦР

Рис. 1. Рандомизация фрагмента гена cysE (нуклеотидные позиции 285-291).

В результате был амплифицированы фрагменты гена cy.sE длиной 0,3 т.п..н. Во втором раунде амплификации (рис.1) эти фрагмент ДНК были очищены методом электрофореза в агарозном геле и использованы в качестве затравки для того, чтобы нарастить этот фрагмент до полной последовательности гена cysE (10 циклов ПЦР) В третьем раунде ПЦР к полученному фрагменту был добавлен праймер, гомологичный промоторной области гена отрС (рис.1), и проведены дополнительные 15 циклов реакции. Фрагменты ДНК длиной 0,83 т.п.н., кодирующие набор мутантных вариантов гена cysE, были очищены и расщеплены рестриктазами, после чего лигированы в вектор pMW-PompC; предварительно расщепленный теми же рестриктазами. Полученные плазмиды pMW-PompC-cysE

(рандомизированный) были использованы для трансформации клеток -реципиентов Е. coli.

В дальнейших экспериментах в качестве штамма-реципиента использовали штамм E.coli LE392 cysE::K.mR, полученный из штамма E.coli LE392 в результате инсерции гена устойчивости к канамицину с использванием штамма JC7623 ( Kushner et al. 1972).

Штамм E.coli LE392 cysE::KmR трансформировали смесью рекомбинантных плазмид pMW-PompC-cysE (рандомизированный). Мугантные гены cy.sE, кодирующие активную SAT, были отобраны по комплементации хромосомной мутации cysE в штамме E.coli LE392 cysE::KmR на чашках с агаризованной М9, не содержащей цистеин. Полученные клоны были проверены на способность к кормлению цистеиновых ауксотрофов, в результате было отобрано 15 вариантов. Из них были выделены плазмиды и в них были определены последовательности ДНК структурной части гена cysE. Для определения уровня активности SAT цистеиновый ауксотроф LE392 cysE::KmR повторно трансформировали этими плазмидами.

Мутантный ген cysE (cysE256) с точечной нуклеотидной заменой в позиции 767, выражающийся в замене метионина 256 на изолейцин (Denk and Bock, 1987) был получен с помощью стандартной методики сайт-направленного мутагенеза.

Результаты исследований

1. Получение и изучение мутантых вариантов серинацетилтрансферазы (CAT), устойчивых к ингибированию цистеином

Биосинтез цистеина бактериями состоит из реакций восстановления сульфат-иона до сульфида с последующим включением атома восстановленной серы в углеродный скелет серина. При этом сначала гидроксил серина ацетилируется (серинацетилтрансфераза, далее CAT, ген cysE), затем восстановленная сера вытесняет ацетат из молекулы О-

ацетилсерина с образованием цистеина (изоферментные О-ацетилсеринсульфгидрилаза, гены cysK и cysM): ■

Ser + ацетил-СоА = О-ацетилсерин + CoASH

О-ацетилсерин + S2- = Cys + ацетат.

Гены, контролирующие сульфатредукцию, находятся под регуляторным контролем на уровне их экспрессии (Суэ-регулон), тогда как превращение серина в О-ацетилсерин регулируются только путем ингибирования активности CAT цистеином. CAT чрезвычайно чувствительна к присутствию цистеина в клетке (Kredich и др.1966): концентрация 0.8 мкМ цистеина ингибирует активность CAT на 50%, что важно также для предотвращения расходования клеточной энергии для восстановления серы, так как при подавлении CAT цистеином не происходит синтеза О-ацетилсерина, который, спонтанно изомеризуясь, превращается в N-ацетилсерин — сигнальную молекулу, включающую экспрессию генов Cys-регулона.

Для создания бактериальных продуцентов цистеина необходимо:

1) максимально дерепрессировать синтез ферментов сульфатредукции (Cys-peryflOH);2) освободить от ретроингибирования серином синтез серина из метаболита гликолитического пути 3-фосфоглицерата (десенсибилизировать 3-фосфоглицератдегидрогеназу (ген ser А) в отношении ингибирования серином); 3) десенсибилизировать CAT к ингибированию цистеином.

Подходы к решению третьей задачи составляли предмет нашего исследования. Как отмечено выше уже в 60-х годах была обнаружена высокая чувствительность CAT к ингибированию конечным продуктом -цистеином, причем CAT обладает гораздо большим сродством к своему ингибитору, чем к обоим субстратам : Км для серина и ацетил-СоА равны 0, 77 мМ и 0,1 мМ, a Ki для цистеина - около 0.001 мМ. Предполагалось, что цистеин связывается специальным аллостерическим сайтом, и в результате того связывания снижается сродство CAT ко второму субстрату, ацетил-СоА (Cook, Wedding, 1978) . Позднее, уже после ренгеноструктурного анализа фермента, это предположение было отвергнуто. Как оказалось, цистеин связывается в центре, предназначенным для связывания серина - одного из субстратов, однако гораздо прочнее. Сообщалось об отборе мутантов с частично десенсибилизрованной к ингибированию цистеином CAT в бактериях (Nakamori et al., 1998) и растениях (Takagi et al., 1999; Noji et al., 1998) однако эти варианты CAT обладали либо низкой степенью устойчивости к ингибированию цистеином, либо их энзиматическая активность была крайне низкой, т.е. мутации, снижающие сродство к ингибитору, приводили одновременно к снижению сродства к субстрату (серину), а также снижали эффективность катализа. Описанные варианты

могут считаться малоэффективными в плане решения проблемы достижения высокого уровня производства L-цистеина из глюкозы.

К моменту начала нашей работы уже была опубликована трехмерная структура CAT Escherichia coli, основанная на рентгеноструктурных исследованиях CAT с разрешением 2,2 ангстрема (Pye et al, 2004), которую мы использовали в настоящей работе по получению мутантов методом рандомизированного мутагенеза. Как показано в указанной работе, мономер CAT (рис. 2а, верхний - вид сверху, нижний - вид сбоку) состоит из двух доменов: остатки 1-140 образуют альфа-спиральный домен из 8-ми альфа-спиралей, а остатки 141-262 - бета-спиральный.

Рис.2. Ленточная модель CAT E.coli (по Pye et al, 2004)

Три мономера соединены своими N-концами «голова к голове», образуя трехгранную пирамиду (рис. 2Ь, вид сверху и сбоку) за счет взаимодействий гидрофобной природы. Более того, оказалось, что два тримера взаимодействуют между собой опять же за счет N-концевой последовательности, образуя структуру из 6-ти мономеров, отвечающую формуле 3x2, то есть, димер тримеров.(с на рис. 2). В результате образуется структура из двух пирамид, соединенных N-концевыми частями, а С-концы каждого тримера направлены в противоположные стороны. Было установлено, что ингибирующая молекула цистеина связывается с серин-связывающим сайтом, который находится между мономерами CAT и образуется при образовании тримера.

Нашей задачей было снизить прочность связывания цистеина этим сайтом, не изменив связывания серина. Для этого с помощью компьютерного моделирования (см. Материалы и методы) были построены пространственные модели этого сайта (Рис. 3), связанного как с серином (Рис. 3 В) так и с цистеином (Рис. ЗА). Как видно (Рис.3 В), атом серы сближен и образует водородные связи с His 158 и Hisl93, атом кислорода - с Argl92, а атом азота - с Asp92 и Aspl57. Причем Asp92, Aspl57 и Hisl58, принадлежат одному мономеру CAT, a Argl92 и His 193 - другому. Если в этом кармане находится серии (Рис.3 В), то атом кислорода приближен к Argl92, а азота - к Asp92. Последний аминокислотный (Asp92) остаток был наиболее подвижен при смене лигандов (цистеина на серин), то есть проявлял специфичность по отношению к цистеину.

(А)

His 193 His ¡93

His 158

-4

** '92 v*X

Asp 157

Asp 32

(B)

His 193 His 193

His 158 yC£r His 158

A,9192y A>g 192^

Y Asp 157 V Asp 157

Asp 92 Asp 92

Рис. 3. Пространственные модели сайта связывания серина в присутствии в нем серина (А) и цистеина (В).

Поскольку незначительное изменение позиции Asp92 могло бы сказаться на эффективности связывания цистеина (но не серина), мы предприняли попытку слегка сместить его путем замены аминокислотных остатков в петле, в которой он находится, т.е. от Arg89 до Asp96. Соответствующий указанным аминокислотным остаткам фрагмент гена cysE был рандомизирован с использованием соответствующих ДНК-праймеров, которые использовались при ПЦР амплификации. В результате на плазмидах был получен набор случайных замен нуклеотидов в интересующей нас области, и этими плазмидами был трансформирован дефектный по гену cysE штамм кишечной палочки MG1655. На минимальной среде, лишенной цистеина, были получены колонии CysE+, которые должны были обладать функциональной (но мутантной) CAT. Далее, среди цистеин-независимых клонов были найдены такие, которые выделяли цистеин в минимальный агар

и обеспечивали рост штамма E.coliAcysE, посеянного газоном. Клоны, экскретирующие цистеин, были отобраны для дальнейшего изучения.

Одновременно была получена с помощью сайт-специфического мутагенеза известная мутации в гене cysE, которая сообщает устойчивость CAT к ингибированию цистеином (в качестве контроля). Это - мутации cysE256, имеющие замену Met256IIe (Denk, Bock, 1987).

Среди полученных мутантов, содержащих рандомизированные участки в гене cysE, после измерения активности CAT были обнаружены клоны с достаточно высоким уровнем ферментативной активности. Кроме того, среди них были обнаружены такие клоны, у которых CAT приобрела устойчивость к ингибирования цистеином (Таблица 1). Некоторые из полученных мутаций (cys5, cysE15), вызывали значительную десенсибилизацию CAT к ретроингибированию и при этом сохраняли достаточно высокий уровень

Таблица 1. Сравнение активности мутантных CAT и чувствительности к

ингибированию цистеином

Аллели гена cysE Происхождение Удельная активность, мкмоль/мин/ мг белка бесклеточного экстракта ICso,*mkM Ä/,**mkM

CysE Дикий тип 1680 0.8 0.6

CysE 256 (Denk, Bock,1987) 1067 18.1 14.5

CysE 1 Данная работа. Рандомизация позиции 89 - 96 1220 20.0 15.0

CysE 142 1600 460.0 420.0

CysE 5 715 1100.0 950.0

CysE 12 1440 125.0 114.0

CysE 15 1470 550.0 510.0

CysE 10 2692 4.7 3.4

CysE 11-2 1900 410.0 395.0

CysE 15-2 1100 6.0 4.5

1С,„* - Концентрация цнстеина в , вызывающая ннгнбировання активности на 50%;Л',,А*- константа ингибирования CAT цистеином.

каталитической активности. Наибольшая степень десенсибилизации к ингибированию цистеином вызывалась мутацией cysE5 (концентрация цистеина, снижающая ферментативную активность на 50% (1С50) составляла 1100 мкМ, что превышает соответствующую величину для штамма дикого типа на 3 порядка. Эта десенсибилизация сопровождалась все же некоторым снижением каталитической активности.

Определение нуклеотидной последовательности области гена, соответствующей аминокислотным позициям с 89 по 96 показало, что она содержит мутации, приводящие к заменам аминокислот (Таблица 2). Позиции этих замен отличаются от позиций ранее известных мутаций. Характерно, что у более эффективных мутантов (cysE5, cysE15 и cysE12) в рандомизированной последовательности появляются аминокислотные остатки пролина и глицина, что должно влиять на пространственное

il

расположение Asp92 в каталитическом центре относительно лигандов (серин, цистеин).

Таблица 2. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, соответствующие позициям 89 - 96 структуры CAT, полученные в результате рандомизированного мутагенеза, у наиболее эффективных мутантов по гену CysE'.

Мутация Происхождение Нуклеотидная и аминокислотная последовательность (позиции CAT 89-96), подвергшаяся рандомизации (по 6 соседних нуклеотидов близ позиции Asp92)

CysE Дикий тип cgt асс cgcgac ccg gcagtc gat Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp

CysEl ccc асс ege gac ccg gca gtc gat Pro Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp

CysE142 agt cta ege gac ccg gca gtc gat Ser Leu Arg Asp Pro Ala Val Asp

CysES Данная работа. Рандомизация позиций 89 - 96 cgt асс cgc gac ccg gca aga ccc Arg Thr Arg Asp Pro Ala Are Pro

CysE12 cgt acc ege gac ccg gcaggtggt Arg Thr Arg Asp Pro Ala Glv Glv

CysElS cgt acc ege gac ccg gca cta cca Arg Thr Arg Asp Pro Ala Leu Pro

CysElO cgt acc ege gat ccc аса gtc gat Arg Thr Arg Asp Pro Thr Val Asp

CysElI-2* cat gta ege gac get аса gta gat His Val Arg Asp Ala Thr Val Asp

CysElS-2 acc cgc cgc gac ccg gca gtc gat Thr Arg Arg Asp Pro Ala Val Asp

♦Объединение двух рандомизированных фрагментов (89-90 и 93-94).

Данные таблицы 3 дают представление о возможном практическом применении полученных мутантов для создания продуцентов цистеина. При концентрации цистеина 0,1 мМ, то есть при концентрации намного превышающей обычную внутриклеточную концентрацию цистеина, полученные в данной работе мутанты практически полностью сохраняют ферментативную активность, тогда как лучшая ранее известная мутация cysE256 в 5 - 6 раз менее эффективна. Что касается CAT из растений Arabidopsis, то хотя такой фермент по своей природе и не чувствителен к ингибированию цистеином, но в связи с низкой активностью и необходимостью специальной адаптации соответствующего гена для его экспрессии в бактериях, а также принимая во внимание ограничения в применении генно-модифицированных организмов практическое использование его для бактериальной продукции цистеина представляется проблематичным.

Таблица 3. Сравнение активности и устойчивости к ретроиигибированию цистеином полученных мутантов

Аллели гена cysE Происхождение Относительная активность CAT, % (за 100% принята астивность CAT в штамме дикого типа) Остаточная активность в присутствии 0.1 мМ цистеина

Arabidopsis thaliana SAT-m (Takagi et a!., 1999) 1.2 100

cysE156 (Denk, Bock, 1987) 50.1 18.6

CysEl Данная работа, рандомизация 95.2 87.5

CysE\42 72.6 31.6

CysE5 42.5 100

CysE [2 85.7 54.4

CysE 15 87.5 89.3

CysE 10 160.2 <10

CysE 11-2 113.1 92.1

CysFAS-2 65.5 <10

На основе полученных в данной работе мутантов по CAT разработан метод получения цистеина ферментацией, на который получены патенты в России (Патент на изобретение 2279477) и за рубежом (ЕР 1650296, US patent 7,312,058, ).

2. Изучение процессов транспорта предшественника цистеина, О-ацетилсерина

В процессе создания штамма, способного к продукции цистеина на глюкозе, мы обратили внимание на то, что системы экспорта цистеина из клетки, очевидно, мало специфичны и одновременно с цистеином транспортируют в окружающую среду его предшественник - О-ацетилсерин (ОАС). Было интересно найти транспортеры, которые бы возвращали выброшенный наружу О-ацетилсерин обратно внутрь бактериальной клетки для последующего превращения в цистеин под действием цистеинсинтаз (гены cysK, cysM).

С этой целью были отобраны мутанты, утратившие способность усваивать О-ацетилсерин вместо цистеина. Для этого культуру цистеин-недостаточно штамма MG1655AcysE подвергали процедуре мутагенеза (транспозон Тп5). Затем двукратно проводили пенициллиновое обогащение на жидкой среде, содежащей ОАС в качестве источника цистеина. Из 1200 полученных клонов было отобрано 26, которые не росли на среде с ОАС и сульфидом (присутсвие сульфида необходимо, чтобы исключить отбор мутантов с нарушенной сульфатредукцией). Место интеграции транспозона Тп5 в каждом из этих 26-и клонов было определено путем проведения ПЦР с хромосомы мутантов с использованием праймеров на последовательности транспозона Тп-5 с последующим анализом полученных фрагментов путем

определения нуклеотидных последовательностей. В результате было установлено, что из 26-и отобранных клонов 22 несли инсерции транспозона Тп5 в гене суБВ, кодирующем позитивные регулятор транскрипции цистеинового регулона, а оставшиеся 4 имели двойную вставку транспозона: первая копия транспозона был найдена в гене суяК (кодирующем О-ацетил-Ь-серин тиоллиазу А), а вторая в гене суяМ (кодирующем О-ацетил-Ь-серинтиоллиазу В). Инактивация гена сузВ, который необходим для экспрессии всех генов цистеинового регулона и в том числе генов, кодирующих цистеинсинтазы, вполне естественна при данном отборе, тогда как вероятность блокирования одновременно двух генов, кодирующих две изоферментные цистеинсинтазы, очень мала. Эти данные с очевидностью указывают на существование значительного количества транспортирующих ОАС белков. Как минимум, таких систем больше двух, иначе они были бы обнаружены при использованной нами методике.

Для дальнейшего поиска мы воспользовались нашим наблюдением, что штамм М01655ДсузЕ не растет на минимальной среде, содержащей все канонические аминокислоты (кроме цистеина) несмотря на присутствие ОАС. Очевидно, что аминокислоты, присутствующие в смеси, каким-то образом препятствуют усвоению ОАС. Для идентификации ингибирующих аминокислот они были распределены по группам, указанным в Таблице 4, и изучалось влияние этих групп на рост цистеин-недостаточного штамма М01655ДсузЕ в присутствии ОАС в качестве заменителя цистеина.

Таблица 4. Рост штамма МС1655Дсу5Е на агаре М9 в присутствии ОАС и аминокислотных смесей (20 мг/л каждой)

Группа аминокислот Рост Группа аминокислот Рост Группа аминокислот Рост

А+В+С+й - А+В+С ++ А+В+С+О-аБр -

А ++ А+В+Э ++ А+В+С+О-аэп •

в ++ А+С+О + А+В+С+0-1уБ -

С ++ В+С+О ++ А+В+С+О-агц -

о ++ А+В+С+О -Не - Л+В+С+0-5ег -

А+В ++ А+В+С+О-Ьи + А+В+С+О-рго -

А+С ++ А+В+С+й-уа! - А+В+С+О-Ыв -

А+Э ++ А+В+С+0-а1а - А+В+С+0^1у -

В+С ++ А+В+С+О-Лг - А+В+С+0-1уг -

В+Э ++ А+В+С+Ц-^и - А+В+С+О-рЬе -

С+О ++ А+В+С+О^Ы + А+В+С+0-ше1 ++

А: ¡1е+1еи+уа1+Шг+а1а; В: glu+asp+gln+asn; С : рЬе+1уг+Ор+рго+Ы5; Б : 1уз+а^+те1+£1у+5ег

Как оказалось (Таблица ; 4), рост штамма наблюдался лишь при исключение из смесей метионина, лейцина и глутамина. Присутствие любой из этих трех аминокислот в смесях и особенно лейцина препятствовало усвоению АОС. Надо отметить, что каждая из этих аминокислот в отдельности лишь незначительно подавляла рост на ОАС, т.е. для этого требуется некоторое сочетание аминокислот в среде. По-видимому, обнаруженное нами ингибирование усвоения ОАС может быть связано как с ингибированием транспорта ОАС или сульфида внутрь клеток, так и с ингибированием внутриклеточной цитеинсинтетазной реакции.

Для поиска генетических факторов, обусловливающих усвоение ОАС в присутствии смеси аминокислот, ингибирующих этот процесс, культуру штамма М01655ДсуэЕ трансформировали плазмидным банком генов, полученным от этого же штамма на основе плазмидного вектора р8ТУ24, и отбирали трансформанты, способные расти в присутствии ингибирующей аминокислотной смеси (А+В+С+О, Таблица 4), на среде М9, в которой цистеин заменен на ОАС. Из отобранных трансформантов выднляли плазмидную ДНК и определяли нуклеотидную последовательность хромосомных вставок в отобранных плазмидах. В результате оказалось, что вставки содержат гены тагС, усИЕ, yhgN и sdsRQP.

Известно, что МагС, УсЬЕ, - паралоги, являющиеся белками

внутренней мембраны с 6-ю трансмембранными участками. Их структура указывает на родство с помпами множественной лекарственной устойчивости, однако показано, что их функция не связана с устойчивостью к антибиотикам. Считается, что все три гена предположительно кодируют экспортеры из группы детерминантов множественной лекарственной устойчивости (МсОегтои, 2008).

Белок, кодируемый генами sdsRQP, также является предполагаемой помпой множественной лекарственной устойчивости. В подтверждение этому показано, что инактивация оперона sdsRQP повышает чувствительность к серусодержащим лекарственным средствам (8Ытас1а, 2009). Наши данные не позволяют исключить возможность того, что эти белки являются не помпами-экспортерами, а импортерами ОАС, однако, учитывая их сходство с помпами множественной лекарственной устойчивости, мы все же полагаем, что они таковыми и являются.

Для проведения дальнейшего исследования гены тагС, усЪЕ, yhgN и sdsRQP были удалены из хромосомы штамма М01655ДсузЕ. Полученный штамм с делециями этих генов (МС1655Д5), а также с делецией гена сувЕ, рост которого на ОАС также ингибировался смесями аминокислот, был использован для поиска возможных транспортеров ОАС. При этом культуру штамма М01655Д5 трансформировали плазмидным банком генов, полученных от исходного штамма М01655Д5 на основе плазмидного вектора р8ТУ24, и отбирались трансформанты, способные расти на АОС в присутсвии аминокислотной смеси (19 аминокислот), не содержащей цистеин. Из отобранных трансформантов с восстановленной способностью

расти в данных условиях выделяли плазмидную ДНК, и хромосомные вставки на этих плазмидах были определены с помощью секвенирования. Так нам удалось отобрать вставку гена ус1%Я, который кодирует известный транспортер, относящийся к группе протон-зависимых транспортеров олигопептидов (Ай'еКг е1 а1., 2007).

Ген ydgR был помещен под специально сконструированный сильный промотер гена п1рО в составе вектора рМ\У118. Промотер гена п1рЭ, кодирующий один из белков внешней мембраны, был выбран на том основании, что его экспрессия эффективно продолжалась у ряда продуцентов аминокислот на протяжении всего периода выращивания в ферментерах (данные получены методом 1ША-аггау). Под контроль этого промотора был поставлен репортерный ген су.чМ и -10 и -35 участки промотера были подвергнуты рандомизированному мутагенезу. В результате был получен промотер п1рВ8, с которого наиболее эффективно экспрессировался репортерный ген суэМ, о чем можно было судить по активности цистеинсинтазы. Полученный промотор использовался также для экспрессии других транспортных белков (КиШкоуа е1 а1., 2005)

Плазмида рМ1\У-Рп1рВ8-усу11 была введена в штамм МС1655Д5, и была подтверждена способность этого транспортера восстанавливать рост на ОАС в присутствии смеси 19 аминокислот. Дополнительно было показано, что клетки штамма МС1655Д5, содержащего экспрессионную плазмиду рМ1\У-Рп1р08-усу11, более эффективно потребляли ОАС из среды роста (Рис. 4), чем бесплазмидный штамм.

Рис. 4. Поглощение О-ацетилсерина клетками штамма Мв1655Д5 (верхняя кривая) и его плазмидного производного

МС1655Д5/ рМ1\У-Рп1р08-у(Ци (нижняя кривая).

Проведенные нами исследования указывают на то, что в поглощении АОС из среды участвуют многие неспецифические транспортеры. Роль помп, относящихся к факторам множественной лекарственной устойчивости, может трактоваться двояко: 1) они могут транспортировать АОС внутрь клеток; 2) они не транспортируют АОС внутрь клеток, но под действием накопленных внутриклеточно ингибирующих аминокислот (метионина, лейцина, глутамина) начинают неспецифически выбрасывать из клетки эти аминокислоты, а также другие низкомолекулярные вещества. Это в свою

очередь вызывает активацию (дерепрессию) генов, кодирующих целый ряд транспортеров, включая обнаруженный нами ген ydgR, которые способны поглощать из среды необходимые для роста вещества. Что касается гена ydgR, то к его функции относится не только поглощение из среды олигопептидов, но и поглощение ОАС, который структурно напоминает дипептиды.

3. Изучение восстановления 8-сульфоцистеина до цистеина клетками кишечной палочки.

Нами был разработан способ получения цистеина ферментацией, осуществляемый сконструированным штаммом кишечной палочки, способным накапливать в ферментационной среде цистеин (Зиятдинов М.Х. и др. 2003. Патент России 2275425). В качестве источника серы использовался тиосульфат-ион, содержащий атом восстановленной серы, который включается в состав цистеина благодаря реакции тиосульфата с О-ацетил-Ь-серином, катализируемой 0-ацетилсерин(тиол)-лиазой-В, кодируемой геном суяМ, с образованием 8-сульфоцистеина, который в дальнейшем восстанавливается до Ь-цистеина. Этот процесс протекал недостаточно эффективно, и в ферментационной среде обнаруживался не превращенный в цистеин 8-сульфоцистеин.

В связи с отсутствием в литературе сведений о механизме восстановления Б-сульфоцистеина до цистеина бактериями представлялось интересным и практически значимым изучить этот процесс. Для этого вначале от цистеин-недостаточного штамма ЬЕ392 суэЕ:: КмII с помощью мутагенеза (нитрозогуанидин) с последующим пенициллиновым обогащением были отобраны 800 мутантов, не способных усваивать сульфоцистеин в качестве источника цистеина, но только 18 из них росли на О-ацетилсерине (биосинтетический предшественник цистеина), и эти мутанты изучались далее. В каждый из отобранных мутантов вводился плазмидный (вектор рВЮ22) банк генов штамма Е.соН К12 дикого типа, и отбирались клоны, приобретшие способность усваивать 8-сульфоцистеин.

Анализ хромосомных вставок (определение нуклеотидной последовательности) в плазмидах показал следующее: 5 клонов содержали ген gshA (фермент глутамат-цистеин лигаза), 4 - gshB (глутатион синтаза), 9 ген усЩ (неизвестный консервативный трансмембранный белок). Указанные гены были клонированы из хромосомы Е.соН с помощью метода ПЦР и затем введены в соответствующие им мутанты, и полученные трансформанты действительно приобретали способности усваивать Б-сульфоцистеин в качестве заменителя цистеина.

Инактивация генов, необходимых для синтеза глутатиона ^бЬА, дэИВ), у отобранных мутантов, утративших способность к усвоению Б-сульфоцистеина, непосредственно указывало на участие глутатиона в восстановлении 8-сульфоцистеина. Как оказалось, внесение в среду роста глутатиона позволяло расти на Б-сульфоцистеине мутантам, недостаточным

по цистеину, у которых были выявлены инактивации генов gshA или gshB. Оставалось неясным, является ли процесс восстановления с помощью глутатиона в качестве донора электронов неферментативным или он опосредован каким-либо дополнительным, вероятно, белковым фактором. Нами было показано (Таблица 5), что даже в присутствии глутатиона (универсальный восстановитель у бактерий) и фермента, регенерирующего окисленный глутаредоксин в его восстановленную форму в присутствии его кофактора, ЫАЭРН, не происходит восстановления Б-сульфоцистеина. В тоже время, при добавлении бесклеточного экстракта штамма дикого типа Е.соИ МС1655 наблюдалось интенсивное восстановление 8-сульфоцистеина, что означает обязательность участия какого-то дополнительного фактора из клеточного экстракта. При этом необходим был как глутатион, так и его регенерирующая система.

Table 5. Демонстрация энзиматнческого характера восстановления __S-сульфоцистеина__

Бес клеточный экстракт Е.соП К12 МС1655 (0,1 мг белка на 1 мл Глутатион, (12мМ) Глутатион редуктаза (1 ед./мл) + NADPH (0.1мМ) Активность в-сульфоцистеин редуктазы (нмоль/мин/ мг белка)

- - - <0.5

- - + <0.5

- + - <0.5

- + + <0.5

+ - - 2,4

+ + - 3.9

+ - + 1.1

+ . + + 38

Тот факт, что при первичном отборе не усваивающих Б-сульфоцистеин мутантов не удалось отобрать мутантов по белкам, катализирующих процесс восстановления 8-сульфоцистеина, указывал на то, что таких белковых факторов может быть одновременно несколько. Они, по-видимому, относятся к какой-то одной группе. Мы предположили, что такими белками могут быть глутаредоксины, так как известно, что они способны восстанавливать дисульфидные мостики за счет энергии ЫАОРП, кроме того, кишечная палочка содержит как минимум 3 вида глутаредоксинов (Аз1ипс1 Р. е1а1, 1994).

Чтобы проверить это предположение, делеции известных генов, кодирующих глутаредоксины grxA, grxB и grxC, были перенесены в цистеин-

недостаточный штамм ЬЕ392 сузЕхКтЯ. Также были сконструированы штаммы с делециями по всем трем указанным генам. Как оказалось, все они не утратили способность расти на Б-сульфоцистеине как единственном источнике серы. Кроме того гены %гхЛ, %ухВ и grxC были клонированы на плазмидный вектор рМ\¥118, и полученные плазмиды были трансформированы в штамм, где были делетированы все три гена, кодирующих глутаредоксины. В полученных трансформантах, а также в исходном штамме с векторной плазмидой была измерена энзиматическая активность 8-сульфоцистеин редуктазы. Оказалось (Таблица 6), что делеция гена grxC приводит к двукратному уменьшению активности сульфоцистеинредуктазы, тогда как делении двух других генов, кодирующих глутаредоксины, grxA и grxB, существенного влияния на активность Я-сульфоцистеин редуктазы не оказали.

Таблица 6 . Активность S-сульфоцистеин редуктазы в штаммах с инактивированными и амплифицированными генами для глутаредоксииов

Штаммы Плазмиды Активность S-сульфо- цистеинредуктазы (нмоль/мин/мг белка)

MG1655 pMWl 18 (вектор) 26,1

MG16S5 AgrxA pMWl 18 28,3

MG1655 ДйгхВ pMW118 20,1

MG1655AgrxC pMW118 13,7

MG1655AgrxAAgrxBAgrxC pMW118 11,2

pMW-grxA 12,1

pMIV-grxB 39,2

pMIV-grxC 201,9

Если амплификации гена grxA не сказывалась на способности клеток восстанавливать S-сульфоцистеин, то амплификация гена grxC, повышала эту способность на порядок, а амплификация гена grxB увеличивала эту способность приблизительно на 40% (Таблица 6). Таким образом, GrxA в восстановлении S-сульфоцистеин участия не принимает, GrxB может восстанавливать S-сульфоцистеин, но его доля в общей клеточной S-сульфоцистеинредуктазной активности составляет не более 10%, в то время как доля GrxC в общей клеточной S-сульфоцистеинредуктазной активности можно оценить в 60%. Этим S-сульфоцистеинредуктазной активность не исчерпывается, остается еще примерно 35% активности, природа которой еще не ясна.

Способ получения цистеина с помощью штамма E.coli, в котором увеличена активность глутаредоксина, кодируемого геном grxC, защищен патентом России 2458981 ( Зиятдинов М.Х. и др., 2010).

19

4. Изучение функции продукта гена

Как сказано ранее, помимо мутаций в генах синтеза глутатиона, неспособность усваивать Б-сульфоцистеин вызывает мутация в гене ус1]Ы. Этот ген кодирует белок массой 42,7 кДа, в котором отчетливо фиксируются 10 трансмембранных доменов, что позволяет сделать предположение, что он может участвовать в транспорте Б-сульфоцистеина в клетку. Для доказательства этой гипотезы, от цистеин-недостаточного штамма были получены производные с делециями либо генов, кодирующих ферменты , ответственные за синтез глутатиона, gshA (фермент глутамат-цистеин лигаза) и gshB (глутатионсинтаза), либо с делеций гена Оказалось (Таблица 7), что все полученные производные утратили способность расти на Б-сульфоцистеине, однако в отличие от делеции генов gshA или ¿зИВ делеция генаydjN позволяла расти при добавлении смеси предшественника цистеина, О-ацетилсерина с тиосульфатом. То есть, функция гена не затрагивает внутриклеточного образования цистеина из 8-сульфоцистеина, а очевидно связана с транспортом 8-сульфоцистеина в клетку.

Таблица 7. Рост штаммов Е.соИ, не способных усваивать Б-сульфоцистеин для синтеза цистеина на различных предшественниках цистеина._

Штамм Цистеин, 0,4 мМ 8-сульфоцистеин, 0.3 шМ О-ацетилсернн (1 шМ) и сульфид(0.4 шМ) О-ацетилсернн (1 мМ) И тиосульфат (0.4 шМ)

ЬЕ392 ДсуБЕ + + + +

ЬЕ392 Дсу$Е ДgshA + - + -

1.Е392 ДсувЕ ДgshB + - + -

ЬЕ392 ДсувЕ ДуфЫ + - + +

Для подтверждения этого вывода измеряли потребление 8-сульфоцистеина из жидкой минимальной среды штаммами, различающимися присутствием гена ус1]Ы. Как показано на рис. 4, клетки штамма с делецией гена ус1]Ы, не потребляли в-сульфоцистеин из среды в отличие от штамма с интактным геном ус!]Ы. Амплификация этого гена на плазмиде существенно ускоряла этот процесс (рис.5 А). Таким образом, несомненно, что белок Ус^Ы является импортером 8-сульфоцистеина, локализованным в мембране кишечной палочки, на что указывают результаты проведенных нами экспериментов, а также выявленные в его структуре транс-мембранные элементы.

Как показали аналогичные эксперименты с этими же штаммами, белок Усуы может транспортировать в клетки цистин (рис. 5 В), но не цистеин (рис. 5 С).

Рис. 5. Влияние гена ydjN на потребление Б-сульфоцистеина цистина (В) и цистеина (С) клетками Е.соН.

Выводы

1. С помощью компьютерного моделирования построена трехмерная структура активного центра серин-О-ацетилтрансферазы кишечной палочки, содержащего связанный в нем Ь-серин (субстрат фермента). Сравнение полученной структуры с аналогичной структурой, содержащей цистеин, показало важность пространственного положения Аэр92 для связывания цистеина. Сделан вывод о необходимости смещения положения Аэр92 путем случайного подбора (рандомизации) ближайших аминокислотных остатков для ослабления связывания цистеина (ингибитор).

2. Методом рандомизированного мутагенеза участка гена сувЕ, кодирующего соседние с АБр92 аминокислоты, получены мутации, вызывающие практически полную десенсибилизацию серин-О-ацетилтрансферазы к ингибированию цистеином без снижения каталитической активности.

3. Показано, что для импорта предшественника цистеина О-ацетилсерина клетками необходима активность ряда генов, кодирующих помпы предположительно относящиеся к группе факторов множественной лекарственной устойчивости (МагС, УсЬЕ, и БёзШЗР). Продемонстрирована способность ранее известного транспортера олигопептидов Ус^Ы транспортировать О-ацетилсерин.

4. Показано, что для превращения Б-сульфоцистеина, который образуется вместо цистеина при усвоении клетками тиосульфата в качестве источника серы, необходимы белки группы глутаредоксинов. Наибольшее значение имеет вгхС, на долю которого приходится около 60% общей 8-сульфоцистеинредуцирующей активности.

5. Показано, что ген уфЫ, кодирующий трансмембранный белок, необходим для импорта 8-сульфоцистеина. УсЦЫ участвует также в транспорте цистина, но не цистеина в клетки Е.соП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Kutukova ЕА, Livshits VA, Altman IP, Ptitsyn LR, Zyiatdinov MH, Tokmakova IL, Zakataeva NP. (2005) The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression. FEBS Lett. 579 (21):4629-34.

2) Kai Y, Kashiwagi T, Ishikawa K, Ziyatdinov MK, Redkina EI, Kiriukhin MY, Gusyatiner MM, Kobayashi S, Takagi H, Suzuki E. (2006). Engineering of Escherichia coli L-serine O-acetyltransferase on the basis of crystal structure: desensitization to feedback inhibition by L-cysteine. Protein Eng Des Sei. 2006, 19(4):163-7.

3) Касиваги Т., Каи Ю., Исикава К., Сузуки Э., Такаги X., Зиятдинов М.Х., Редькина Е.И., Гусятинер М.М (2003). Мутантная серинацетилтрансфераза..., Патент России 2279477,

Патент США US7312058, Mutant serine acetyltransferase.

Европейский патент ЕР 1650296, Mutant serine acetyltransferase and process

for producing L-cysteine.

4) Зиятдинов M.X., Самсонов B.B., Гусятинер М.М. (2009). Способ получения L-цистеина, L-цистина, S-сульфоцистеина или тиазолидинового производного L-цистеина, или их смеси с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae. Патент России 2458982 (2012),

5) Зиятдинов М.Х., Самсонов В.В., Гусятинер М.М. (2010). Способ получения L-цистеина с использованием бактерий семейства Enterobacteriaceae. Патент России 2458981 (2012).

Заявка на патент в США 20120237986А1

Подписано в печать:

22.04.2013

Заказ № 8392 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зиятдинов, Михаил Харисович, Москва

Закрытое акционерное общество 'Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика':

На правах рукописи

Зиятдинов Михаил Харисович

Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность: 03.01.03 - «Молекулярная биология»

Научный руководитель: к. б. н. Гусятинер Михаил Маркович

Москва - 2013

Оглавление

Список используемых сокращений...............................................3

1. Введение................................................................................4

1.1. Актуальность проблемы.......................................................4

1.2. Цели и задачи работы..........................................................6

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы......................8

1.4. Список работ, опубликованных по теме диссертации..................10

2. Обзор литературы....................................................................11

2.1. Происхождение углеродного скелета цистеина........................11

2.2. Транспорт сульфата в клетку................................................12

2.3. Восстановление серы от степени окисления +6 до -2...................14

2.4. Энергетические затраты на синтез углеродного скелета цистеина... 19

2.5. Токсичность цистеина..........................................................26

2.6. Цистеин в качестве антиоксиданта..........................................30

2.7. Регуляция биосинтеза цистеина..............................................32

2.7.1. Регуляция экспрессия СуБ-регулона...................................32

2.7.2. Регуляция потока углерода от 3-фосфоглицерата до цистеина..35

2.8. Ферменты, катализирующие превращение серина в цистеин.........41

3. Материалы и методы исследования................................................46

3.1. Бактериальные штаммы и среды..............................................46

3.2. Конструирование штаммов.....................................................46

3.3. Определение активности глутатионредуктазы.............................46

3.4. Определение активности Э-сульфоцистеин редуктазы..................47

3.5. Определение активности Ь-серин-О-ацетилтрансферазы.................47

3.6. Компьютерное моделирование каталитического сайта Ь-серин-О-ацетилтрансферазы.................................................48

3.7. Получение мутаций в гене суэЕ методом рандомизации................49

4. Результаты исследований и обсуждение...........................................52

4.1. Получение и изучение мутантных вариантов серинацетилтрансферазы (САТ), устойчивых

к ингибированию цистеином................................................52

4.2. Изучение процессов транспорта предшественника цистеина, О-ацетилсерина..................................................................62

4.3. Изучение восстановления Б-сульфоцистеина до цистеина

клетками кишечной палочки.........................................70

4.4. Изучение функции продукта гена уфЫ.............................75

5. Выводы................................................................................79

6. Список литературы..................................................................81

Список используемых сокращений

ФГД - 3-фосфоглицератдегидрогеназа; CAT - серинацетилтрансфераза

ОАСС - О-ацетилсеринсульфгидрилаза, или цистеинсинтаза ОАС - О-ацетилсерин NAC, NAS - N-ацетилсерин PEP - фосфоенолпируват

АТФ, АДФ, АМФ - аденозинтри-..., аденозинди-..аденозинмонофосфат Acetyl-CoA, СоА (CoASH) - ацетилкофермента А, кофермент А NADH, NAD+ - восстановленная и окисленная форма никодинамиддинуклеотида

NADPH, NADP+ - восстановленная и окисленная форма фосфата

никотинамиддинуклеотида

2-КГ - 2-кетоглутарат

РРР - пентозофосфатный путь метаболизма Сахаров ПЦР - полимеразная цепная реакция

Использовались общепринятые сокращенные названия антибиотиков, а также аминокислот как в свободном виде, так и находящихся в виде аминокислотных остатков в составе белков.

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы.

Работа посвящена исследованию некоторых аспектов биосинтеза L-цистеина кишечной палочкой Escherichia coli К12. Аминокислота L-цистеин (далее цистеин) является одной из двух канонических аминокислот, содержащих в своем составе атом восстановленной серы (S " ), который включается в предшественник цистеина, О-ацетилсерин, превращая его в цистеин, а эта аминокислота уже служит донором серы для синтеза второй серусодержащей аминокислоты, L-метионина. Биосинтез цистеина, включая восстановление атома серы сульфат-иона до S" , осуществляют микроорганизмы и растения, тогда как животные и, в том числе человек, не способны к сульфат-редукции и нуждаются поэтому в том или ином источнике восстановленной серы. Такими источниками может быть и цистеин, и метионин, а также некоторые другие серусодержащие биологические молекулы.

Роль цистеина в составе белков уникальна в связи со свойствами тиоловой (-SH) функциональной группы. Окисляясь, она образует ковалентную связь с тиоловой группой другого остатка цистеина, находящегося в той же полипептидной цепи или в составе другой, образуя дисульфидный мостик. Наряду с разветвленными аминокислотами, метионином и тирозином, остатки цистеина в составе белков отличаются гидрофобностью и участвуют в гидрофобных взаимодействиях между белковыми молекулами, сообщая им волокнистую структуру. С этим связано обилие цистеина в белках типа кератина в волосе, перьях и когтях. Кроме структурной функции цистеиновые остатки часто входят в состав каталитических центров ферментов, поскольку тиоловая группа может служить нуклеофилом в различных биохимических реакциях.

Потребность в цистеине постоянно растет. По оценкам экспертов суммарная годовая продукция цистеина в мире составляет около 3,2 тыс тонн (45 млн долларов). Он используется в пищевой промышленности, например, в хлебопечении, улучшая качество выпечки. Его добавка к мясным продуктам усиливает характерный мясной аромат, который обусловлен реакцией между цистеином и сахарами. Эффективна добавка цистеина в корм овец для увеличения производства шерсти, которая очень богата этой аминокислотой. Интересно, что сейчас созданы трансгенные овцы, в геном которых введены гены, обеспечивающие эндогенный синтез цистеина. Применение цистеина в медицине обусловлено высокой реакционной способностью его тиоловой группы. Он применяется для детоксикации при отравлении тяжелыми металлами, образуя прочные связи с ними. Цистеин ускоряет метаболизацию уксусного альдегида, токсичного продукта окисления этанола в организме, ответственного за похмельный синдром. Производное цистеина 1чГ-ацетилцистеин широко используется в качестве лекарственного средства для борьбы с легочными явлениями, так как способствует разжижению мокроты, а также для детоксикации при некоторых отравлениях, что связывают с увеличением образования глутатиона, в состав которого входит цистеин.

К настоящему времени разработаны биотехнологические методы получения практически всех двадцати канонических аминокислот, входящих в состав белков, а также аминокислот, промежуточных продуктов биосинтеза этих аминокислот, таких как гомосерин, орнитин, цитруллин и др. Нерешенной остается . проблема биотехнологического получения серусодержащих аминокислот: цистеина и метионина. Это, видимо, связано с большой затратой биологической энергии для восстановления серы из ее основного источника, сульфата, а также с необычайно высокой токсичностью цистеина, который должны сверхпродуцировать клетки бактерий. Кроме того, ключевой фермент собственно биосинтеза цистеина, серин-О-ацетилтрансфераза, чрезвычайно чувствительна к ингибированию цистеином. При этом связывающий цистеин

сайт является одновременно сайтом связывания своего субстрата, серина. Поэтому существующие мутации, ведущие к повышению устойчивости к ингибированию цистеином, ухудшали каталитические свойства этого фермента. Решение указанных проблем позволит получить эффективные продуценты цистеина, а позднее и метионина, для синтеза которого цистеин является донором восстановленной серы.

В настоящее время цистеин получают в основном путем гидролиза перьев птиц и человеческих волос с последующим выделением из смеси продуктов гидролиза. Полученный таким способом цистеин не является достаточно приемлемым продуктом на мировом рынке в силу несоответствия религиозным и культурным традициям ряда народов. Некоторое количество цистеина получают путем микробиологической конверсией 2-амино-Д2-тиазолин-4-карбоновой кислоты, которую предварительно получают органическим синтезом. Возможно также, что цистеин получают и биосинтезом без использования его предшественников с помощью продуцирующих эту аминокислоту микроорганизмов, полученных транснациональной компанией "Вакер Хеми АГ", которой принадлежат патенты на соответствующий способ получения цистеина; есть также научные публикации, основанные на этих патентах [1, 2]. Этот способ основан на применение штаммов Escherichia coli, с мутацией в гене cysE, частично освобождающей соответствующий фермент от ретроингибирования цистеином. Кроме того, в штаммах супер-экспрессирован ген ydeD, кодирующий белок-экспортер цистеина, что снижает токсическое действие цистеина на клетки кишечной палочки.

Наша работа направлена на изучение некоторых аспектов биосинтеза цистеина кишечной палочки, результаты которой могут быть использованы для дальнейшего развития микробиологического метода получения цистеина ферментацией без использования каких-либо его предшественников.

1.2. Цели и задачи работы

1) Исследования, изложенные в настоящей диссертационной работе, направлены на изучение некоторых особенностей биосинтеза и метаболизма цистеина у кишечной палочки, имеющих практическое значения для создания эффективных бактериальных продуцентов этой аминокислоты и, в частности, на решение задачи десенсибилизации ключевого фермента биосинтеза цистеина серин-О-ацетилтрансферазы (CAT) к ингибированию цистеином. В известных штамма-продуцента цистеина эта задача решена лишь частично. Ее решение осложняется тем, что ингибиторная молекула цистеина отличается от молекулы субстрата, серина, лишь заменой атома кислорода на атом серы. Обе эти молекулы конкурируют за один и тот же центр связывания, образуя практически одинаковые водородные связи с аминокислотными остатками CAT. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

• На основании ранее опубликованной структуре CAT, содержащей цистеин в каталитическом центре, построить трехмерную компьютерную модель центра связывания серина, в который поместить серин.

• Сравнить трехмерные структуры центра, связанного с цистеином и серином, с целью определения тех аминокислотных остатков CAT, которые более важны для связывания цистеина.

• С помощью рандомизированного мутагенеза участков гена cysE (кодирующего CAT) изменить пространственное положение аминокислотных остатков, взаимодейтсвующих с цистеином , но не с серином.

• Отобрать мутанты с рандомизированными участками гена cysE и изучить каталитические свойства мутантных CAT, сравнив их со свойствами известных.

2) После получения мутантов по гену cysE с высокой степенью устойчивости к ингибированию цистеином выяснилось, что такие мутантны экскретируют не только цистеин, но и О-ацетилсерин (ОАС), продукт реакции, катализируемой мутантной CAT, что связано с недостаточностью

последующей реакции биосинтеза цистеина. Это вещество довольно быстро и необратимо изомеризуется с образованием N-ацетилсерина, который уже не используется клетками для синтеза цистеина. Таким образом, происходит потеря субстрата для образования цистеина. Представляло научный и практический интерес обнаружение транспортных систем, участвующих в поглощение ОАС клетками из внешней среды. В связи с этим решались следующие задачи:

• Индуцировать мутации, приводящие к неспособности усвоения ОАС.

• Используя плазмидные банки хромосомы E.coli, выявить плазмиды, комплементирующие эти мутации, и путем определения нуклеотидных последовательностей вставок в плазмиды идентифицировать гены, контролирующие процесс транспорта.

3) Целью нашей работы являлась изучение превращения одного из продуктов реакции последнего этапа биосинтеза цистеина, S-сульфоцистеина, в цистеин. Это вещество образуется вместо цистеина при использовании тиосульфата в качестве источника серы и может накаливаться в среде роста. Были поставлены следующие задачи:

• Определить, является ли процесс превращения S-сульфоцистеина в цистеин чисто химическим или зависимым от белковых факторов и идентифицировать их.

• Найти транспортные системы, проводящие S-сульфоцистеин из среды внутрь клеток.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

На основании компьютерного моделирования центра связывания CAT с конкурирующими лигандами (серин и цистеин) сделаны предсказания, касающиеся модификации первичной структуры этого центра. В соответствии с этими предсказаниями методом рандомизированного мутагенеза удалось отобрать мутантные формы CAT со сниженным сродством к ингибитору при

сохранении каталитической активности. Полученные мутации использовались для создания продуцентов цистеина, которые защищены российским и зарубежными патентами и нашли применение в промышленном производстве цистеина в Японии.

Изучен ранее не известный генетический контроль поглощения предшественника цистеина, О-ацетилсерина, клетками кишечной палочки. Показано участие ряда помп, предположительно относящихся к группе факторов множественной лекарственной устойчивости (МагС, УсЬЕ, УЬ^К и 8с18КС)Р) в транспорте О-ацетилсерина. Обнаружена также способность ранее известного транспортера олигопептидов Ус^Я транспортировать О-ацетилсерин.

Установлены белковые факторы, участвующие в восстановлении 8-сульфоцистеина до цистеина. Обнаружен ген уфЫ, кодирующий белок-импортер 8-сульфоцистеина. Полученные данные могут быть использованы при разработке способов микробиологического получения серусодержащих веществ.

На основе природного промотора гена п1рЭ сконструирован методом рандомизированного мутагенеза эффективный промотор для экспрессии генов, функция которых важна в ходе длительных процессов. Промотор нашел применение в данном и последующих исследованиях.

Апробация дисседтащ«!, состоялась 8 апреля 2013 года на заседании Ученого Совета ' «Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу : 117545, г. Москва, 1-й Дорожный пр., д.1

Диссертационная работа изложена на страницах и содержит 7 таблиц и 14 рисунков, а также 118 ссылок на научную литературу.

/

1.4. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Kutukova ЕА, Livshits VA, Altman IP, Ptitsyn LR, Zyiatdinov MH, Tokmakova IL, Zakataeva NP. (2005) The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression. FEBS Lett. 579 (21):4629-34.

2) Kai Y, Kashiwagi T, Ishikawa K, Ziyatdinov MK, Redkina EI, Kiriukhin MY, Gusyatiner MM, Kobayashi S, Takagi H, Suzuki E. (2006). Engineering of Escherichia coli L-serine O-acetyltransferase on the basis of crystal structure: desensitization to feedback inhibition by L-cysteine. Protein Eng Des Sel. 2006, 19(4): 163-7.

3) Касиваги Т., Каи Ю., Исикава К., Сузуки Э., Такаги X., Зиятдинов М.Х., Редькина Е.И., Гусятинер М.М (2003). Мутантная серинацетилтрансфераза..., Патент России 2279477,

Патент США US7312058, Mutant serine acetyltransferase.

Европейский патент ЕР 1650296, Mutant serine acetyltransferase and process for producing L-cysteine.

4) Зиятдинов M.X., Самсонов B.B., Гусятинер М.М. (2009). Способ получения L-цистеина, L-цистина, S-сульфоцистеина или тиазолидинового производного L-цистеина, или их смеси с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae. Патент России 2458982 (2012).

5) Зиятдинов М.Х., Самсонов В.В., Гусятинер М.М. (2010). Способ получения L-цистеина с использованием бактерий семейства Enterobacteriaceae. Патент России 2458981 (2012). Заявка на патент в США 20120237986А1

2. Обзор литературы 2.1. Происхождение углеродного скелета цистеина.

Для образования цистеина используется углеродный скелет серина, и суть превращения серина в цистеина сводится к замене гироксильной группы на сульфгидрильную, что протекает в две ферментативные стадии.

Серинацетилтрансфераза (CAT), 0-ацетилсерин(тиол)лиаза,

cysE cysK, cysM

Серии -+ О-ацетилсерин -► Цистеин

Acetyl-CoA СоА S"2 acetate

Вначале под действием продукта гена cysE, серинацетилтрасферазы (CAT), ацетильная группа ацетил-КоА переносится на углеродный скелет серина, образуя О-ацетилсерин (ОАС). Затем происходит замещение ацетильной группы ОАС на сульфгидрильную. Донором восстановленной серы S"2 служит продукт заключительной стадии восстановления сульфата (сульфат-редукция рассмотрена ниже) или присутствующий в клетке ионы HS" или S Эту стадию могут катализировать две изоферментные цистеинсинтазы А и В, кодируемые гена cysK и cysM (другие названия этих ферментов О-ацетилсерин-(тиол)-лиаза-А и -В или О-ацетилсеринсульфгидрилаза-А и -В, соответственноуу [3, 4, 5]. Причем, если продукт первого гена использует только серу S" в виде иона HS", то продукт гена cysM использует также и тиосульфат-ион, образуя в этом случае не цистеин, а другое серусодежащее производное цистеина, S-сульфоцистеин [6, 7]. Точный механизм превращения S-сульфоцистеина в цистеин не известен. По мнения Кредича он представляет

собой либо гидролиз с освобождением сульфата и образованием цистеина, либо восстановление глутатионом с образованием сульфита �