Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фрагменты рибосомных генов человека в составе внеклеточной ДНК: факторы стресс-сигнализации

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Фрагменты рибосомных генов человека в составе внеклеточной ДНК: факторы стресс-сигнализации"

На правах рукописи УДК 575.224

Костюк Светлана Викторовна

ФРАГМЕНТЫ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА В СОСТАВЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК - ФАКТОРЫ СТРЕСС-СИГНАЛИЗАЦИИ

03.00.15-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003064631

Москва - 2007

003064631

Работа выполнена в ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель. доктор биологических на]

Наталья Николаевна Вейк

Официальные оппоненты

- доктор медицинских на; профессор Валерий Андреевич Мякотки

- кандидат биологических на Сергей Владимирович Беневоленск

Ведущая организация: ГОУВПО Российский государственнт -

медицинский университе им. Н И Пирогов

Защита диссертации состоится слмти> 2007 года в Н_ час о« мин н заседании Диссертационного Совета Д 001016.01 при Медико-генетическо научном центре РАМН по адресу 115478, г Москва, Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан «¿/» а&ус^я 2007 год

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Д 001 016.01 доктор биологических наук,

профессор ЛФ Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейших характеристик гомеостаза является поддержание определенного соотношения между пролиферацией и гибелью клеток - фундаментальными характеристиками высших организмов, необходимыми для нормального развития и функционирования При патологии и опасных для генома воздействиях, как правило, увеличивается количество гибнущих клеток организма Фрагменты ДНК погибших клеток поступают в кровь и циркулируют во внеклеточной жидкости Эта ДНК получила название внеклеточной ДНК (внДНК) В последнее десятилетие в биомедицине сформировалось новое направление исследований - анализ и практическое использование внДНК Анализ внДНК оказался информативным в онкологической практике, в пренатальной диагностике, в травматологии и тд Исследования носят, в основном, прикладной характер и направлены на развитие нетравматичных методов как определения мутаций в конкретных последовательностях генома опухоли или плода, так и уровня гибели клеток Свойства и биологические функции фрагментов внДНК в норме и при патологии остаются малоизученными Большинство авторов полагают, что состав внДНК идентичен составу ядерной ДНК (яДНК), которая не способна воздействовать на клетки организма Немногочисленные исследования свойств внДНК, в частности, обнаружение накопления CpG-динуклеотидов, позволяют, однако, предположить, что фрагменты внДНК, циркудирующие в крови, небезразличны для организма В литературе практически нет работ, в которых рассматривались бы свойства фрагментов внДНК генома человека с точки зрения их воздействия на клетки организма Вместе с тем, имеются данные о том, что CpG-последовательности бактериальной ДНК и синтетические CpG-олигонуклеотиды существенно влияют на функционирование систем клеточного иммунитета Настоящая работа посвящена исследованию свойств внДНК генома человека и обусловленного этими свойствами биологического действия внДНК на клетки человека

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в следующем 1) определить некоторые свойства внДНК генома человека при длительном действии на организм повреждающего агента (ионизирующего излучения) и 2) исследовать биологическое действие внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека Исходя из целей работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) В выборке здоровых доноров и работников атомного предприятия, подвергавшихся воздействию облучения в фиксированных дозах, определить концентрацию внДНК, концентрацию в плазме и содержание во внДНК плазмы периферической крови двух повторяющихся последовательностей генома GC-богатой транскрибируемой области рибосомного повтора (ТОрДНК) и АТ-богатой субфракции сателлита 3, локализованной в прицентромерном участке длинного плеча 1-й хромосомы человека (lql2).

2) В опытах in vitro изучить влияние тотальной внДНК (тот-внДНК) и фрагментов ТОрДНК на лимфоциты человека, выяснить, через какие известные клеточные рецепторы реализуется действие фрагментов внДНК

3) Определить, вырабатываются ли антитела на конкретные

последовательности генома человека, накапливающиеся в составе внДНК.

Научная новизна. Впервые установлено, что по составу повторяющихся последовательностей внДНК облученных людей существенно отличается от яДНК ВнДНК обогащена фрагментами транскрибируемой области рибосомного повтора У облученных лиц содержание ТОрДНК и ее концентрация в плазме существенно выше, чем у контрольных доноров (КД) Впервые показано стимулирующее действие внДНК и фрагмента ТОрДНК на лимфоциты человека, которое сопровождается изменением структуры хроматина, активацией синтеза РНК и увеличением продукции цитокинов В реализации стимулирующего действия внДНК и ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы из семейства «toll-like» (TLR9), узнающие CpG-богатые мотивы ДНК, и пока не известные рецепторы, опознающие фрагменты ДНК Впервые в сыворотке крови человека обнаружены специфичные антитела, высокоаффинные к фрагменту ТОрДНК, которые присутствуют в свободном виде и в комплексе с внеклеточной ДНК

Научно-практическая значимость работы. Определение в плазме крови человека трех показателей (1) содержания ТОрДНК во внДНК плазмы периферической крови, (2) концентрации ТОрДНК в плазме крови, (3) титра антител к ТОрДНК может оказаться полезным для выявления лиц, у которых происходит интенсивный апоптоз клеток организма, увеличено количество иммуностимулирующих последовательностей ДНК и повышена вероятность развития аутоиммунных заболеваний Результаты, полученные в данной работе, могут быть использованы для оптимизации диагностических методов при оценке слабовыраженного процесса апоптоза клеток в условиях длительного неблагоприятного воздействия окружающей среды Обнаруженные в организме здорового человека высокоспецифичные антитела к последовательности ТОрДНК открывают перспективы их применения в будущем в терапии ряда аутоиммунных заболеваний

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1 В составе внДНК плазмы крови при длительном действии ионизирующего излучения накапливается CpG-богатая последовательность ТОрДНК, содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3, напротив, снижается Содержание ТОрДНК во внДНК плазмы крови - новый маркер скрыто протекающих процессов апоптоза клеток в организме Концентрация тот-внДНК в плазме не является маркером апоптоза клеток организма при длительном действии небольших доз радиации

2 Образцы внДНК и фрагменты ТОрДНК обладают выраженной способностью активировать m vitro лимфоциты человека, активирующее действие образцов ДНК изменяется в ряду ТОрДНК > внДНК больных ревматоидным артритом > внДНК здоровых доноров Тотальная яДНК активирующего действия не проявляет Эффект стимуляции зависит от концентрации накапливающихся фрагментов ДНК и времени воздействия (т е. от дозы)

3 В реализации стимулирующего действия ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы, узнающие неметилированные CpG-богатые мотивы ДНК (TLR9), и другие, пока неизвестные, рецепторы для ДНК

4 В сыворотке крови человека присутствуют специфичные, высокоаффинные антитела к фрагменту ТОрДНК, которые могут быть как в свободном виде, так и в

комплексе с внеклеточной ДНК.

Личный вклад соискателя. Основные результаты исследования получены и оформлены лично автором в лаборатории молекулярной биологи ГУ МГНЦ РАМН

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006), V Congress on radiation research (Москва, 2006), Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006), Ш Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); Международной конференции "Новые направления в радиобиологии" (Москва, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 218 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализ состава внДНК.

Сбор образцов плазмы периферической крови работающих на атомном предприятии - ГНЦ РФ Физико-энергетический институт (ФЭИ, г Обнинск) проводился сотрудниками Медицинского радиологического научного центра РАМН (г Обнинск) Выделение внДНК проводили методом экстракции органическими растворителями Концентрацию внДНК определяли флуориметрически на люминесцентном спектрометре «LS 55» («PerkmElmer», Англия) с использованием ДНК-связывающегося красителя Hoechst 33258 Размер фрагментов ДНК определяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле

Содержание повторяющихся последовательностей генома определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации с биотинированными зондами на фильтрах (Hybond ExtraC, «Amerscham») Для анализа ТОрДНК использовали зонд pHRGBB-28S (порядковый номер нуклеотидов 9346-10783, HSU 13369, GeneBank), для субфракции сателлита III - зонд pRt301 (Томилин и сотр, 1984) Биотин выявляли с помощью коньюгата стрептавидин - щелочная фосфатаза («Sigma», США) Использовали субстрат для фосфатазы BCIP в присутствии NBT, который образует нерастворимый осадок («Sigma», США) Интенсивность окрашенных пятен (гибридизационный сигнал) определяли компьютерным анализом изображения фильтра с помощью программы «Images» (ИнтерЭВМ, Москва). Средняя ошибка метода во всех опытах составляла (5±2)% от измеряемой величины

Анализ стимулирующего действия фрагментов внДНК на лимфоциты.

Использовали образцы внДНК здоровых доноров (ЗД) и больных ревматоидным артритом (РА), в плазме крови которых ранее обнаружено высокое содержание ТОрДНК В качестве источника фрагментов ТОрДНК использовали смесь двух линеаризованных плазмид, содержащих фрагменты ТОрДНК (участки от -515 до 5321 и от 9346 до 10783 нуклеотида, в соответствии с HSU 13369, GeneBank), встроенные в вектор pBR322, или смесь вырезанных из этих плазмид

вставок ДНК Е coli выделяли из штамма MG 1655 Геномную ДНК человека выделяли из лейкоцитов КД Все образцы ДНК подвергали одинаковой дополнительной очистке последовательно проводили обработку тритоном Х-114 [Aida et al., 1990] и гель-фильтрацию на носителе HW-85.

Нестимулированные GO-лимфоциты человека выделяли в системе фиколл-урографин из гепаринизированной периферической крови здоровых доноров Лимфоциты культивировали 2-4 часа при 37°С в среде RPMI 1640 (ICN, США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС, HyClone, США) в количестве 600 -700 тыс/мл в присутствии ДНК разных типов. Определение действия фрагментов ДНК на лимфоциты человека проводили с использованием трех групп методов

Цитохимические методы флуоресцентная гибридизация m situ (FISH) с зондом на участок lql2 (показатель перегруппировки хроматина ядер лимфоцитов), селективная окраска ядрышка фиксированных ядер лимфоцитов нитратом серебра (показатель активности транскрипции рДНК) Окраска азотнокислым серебром проводилась сотрудником лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН H А Еголиной

Биохимические методы определение количества тотальной РНК, активности каспазы 3 и нуклеазной активности в клеточных лизатах РНК выделяли с использованием реагента Trizol Концентрацию РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iT™ RiboGreen RNA reagent (MoBiTec) Активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах лимфоцитов с помощью флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (7-amino-4-trifluoromethylcoumarin, N-CBZ-L-aspartil-L-giutamyl-L-valyl-L-aspartic acid amide, "Sigma"), Х.возб=400 нм, >-флу=490 нм Эндонуклеазную активность определяли по увеличению интенсивности флуоресценции с использованием модельного субстрата - комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом R6G АСС ССС AGC GAT TAT CCA AGC GCG BHQ1, включающим флуоресцирующую группу (R6G, 5(6)-карбоксиродамин) и молекулу тушителя (BHQ1, «Синтол», Москва)

Иммунологические методы Уровень ИЛ-6 в среде культивирования лимфоцитов определяли твердофазным ИФА с использованием набора реактивов фирмы "Innogenetics" (Бельгия) Анализ проводили в лаборатории Клинической иммунологии Института ревматологии РАМН Активность ФНО-а определялась сотрудником лаборатории иммуногенетики ГУ МГНЦ РАМН Е А Калашниковой по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток фибросаркомы мыши L-929

Для ингибирования клеточного сигнала, связанного с рецепторами TLR9, использовали олигонуклеотид ТСС TGG CGG GGA AGT (2088) («Синтол», Москва) в конечной концентрации 3 мкг/мл [Lenert et al, 2006] или хлорокин («Boots Company PLC», Англия) в концентрации 2 мкг/мл [Huang et al, 2005]

Количество мРНК TLR9 оценивалось методом real-time ПЦР Обратную транскрипцию проводили с помощью реактивов фирмы "Силекс" по стандартной методике Для оценки уровня экспрессии TLR9 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по принципу TaqMan с синтезированными праймерами ("Синтол") В реакции амплификации использовали модифицированный олигонуклеотид, который на 5'-конце содержал флуоресцирующую группу (FAM), а на 3'-конце - тушитель флуоресценции BQH1 В качестве внутреннего стандарта

использовали ген GAPDH, мРНК которого определяли с помощью меченного карбоксиметилфлуоресцеином (R6G) олигонуклеотида ПЦР проводили в приборе Rotor Gene 300 (Corbett, Австр.) Полученные данные обрабатывали методом калибровочного графика и прямым сравнением данных с использованием программы прибора В серии опытов получена хорошая воспроизводимость результатов, ошибка измерения составила ~ 2%.

Анализ сыворотки (плазмы) человека на наличие специфичных антител к фрагментам ТОрДНК.

Нанесенные на мембрану (Hybound ExtraC, «Amersham») образцы ДНК инкубировали (37°С, 30 мин) с сывороткой Затем фильтр инкубировали (37°С, 30 мин) с вторичными антителами к иммуноглобулину G, коньюгированными с пероксидазой и помещали в раствор проявляющего субстрата Интенсивность окрашенных пятен (сигнал) определяли компьютерным анализом изображения фильтра с помощью программы «Images» («ИнтерЭВМ», Москва)

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics и Statistica б 0 Анализировали распределение выборок по методу Колмогорова-Смирнова (К-С), так как не для всех выборок было характерно нормальное распределение Средние значения величин сравнивали с использованием t-критерия. Для выяснения возможной связи между четырьмя определяемыми параметрами, концентрация внДНК, концентрация ТОрДНК в плазме, содержание ТОрДНК во внДНК, частота TCR-мутантных клеток и характеристиками индивида - возраст и накопленная доза, был применен «метод главных компонент», компьютерная программа написана Р.К. Агаповой (ГУ МГНЦ РАМН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Свойства внДНК плазмы крови облученных лиц.

ВнДНК была выделена из образцов плазмы периферической крови 175 индивидов, среди которых были 22 контрольных донора (КД) и 153 облученных донора (ОД), которые по роду работ соприкасались с внешними источниками радиации (среднее значение годовой дозы - 2,9 мЗв, а кумулятивной дозы -104 мЗв) Для оценки влияния накопленной дозы радиации на свойства внДНК, всю выборку ранжировали по значениям дозы радиации и разбили на 8 групп (см. табл 1)

Определены следующие параметры внДНК: (1) общая концентрация фрагментов в плазме, (2) длины фрагментов, (3) концентрация в плазме и (4) относительное содержание во внДНК двух повторяющихся последовательностей генома человека ТОрДНК и СатШ. В таблице 1 приводятся средние значения концентрации фрагментов внДНК в группах КД и ОД

Низкие средние значения концентраций внДНК у облученных лиц (по сравнению с необлученными, группа 0), наблюдали как для малых доз (0,39 - 27,4 мЗв, группа 1,2), так и для и для больших доз (260,2 - 578,6 мЗв, группа 7). Максимальные значения концентрации внДНК обнаружены у ОД, получивших облучение в диапазоне доз 50-90 мЗв Сравнение распределений концентрации

внДНК в каждой группе ОД и в контрольной группе по методу Колмогорова-Смирнова позволяет сделать вывод об отсутствии различий в концентрации внДНК у КД и ОД в большинстве групп. Полученные средние значения близки к данным, полученным авторами других работ [ТаткоуюИ е! а!, 2005, Яарив е1 а1., 1980] для здоровых людей

Таблица 1.

Концентрация внДНК (С) и сравнение выборок по критерию Колмогорова-

№ Групп ы Интервал доз, мЗв N СвнДНК, нг/мл плазмы (± SE) Сравнение с группой «0» по критерию К-С

0 0 22 198 ± 18

1 0,39-16,4 23 138 ± 19 D=0,41; Р>0,05 *

2 16,9-27,4 23 129 ± 16 D=0,46; Р>0,05*

3 27,5-48,8 23 170 ± 27 D=0,30; Р<0,05

4 49,0-84,7 23 212 ±36 D=0,30, Р<0,05

5 86,0-160,4 23 182 ±33 D=0,21; Р<0,05

6 165,6-245,6 23 147 ±21 D=0,39, Р<0,05

7 260,2 - 578,6 15 131 ± 26 D=0,42; Р>0,05*

* ) распределения различаются

Анализ длины фрагментов внДНК методом электрофореза в 1% агарозном геле показал, что внДНК в крови ОД, также как и в крови ЗД, циркулирует преимущественно в виде длинных фрагментов (20 и более т п н) Таким образом, концентрация или длина фрагментов внДНК для данной выборки ОД не являются маркерами усиленной гибели клеток организма

Методом нерадиоактивной количественной гибридизации определена концентрация двух повторяющихся последовательностей генома в плазме ТОрДНК и СатШ Выбор анализируемых последовательностей определялся их нуклеотидным составом ТОрДНК содержит высокий процент GC- пар и обогащена неметилированными CpG - динуклеотидами [Brock et al, 1997] Ранее было показано, что фрагменты ТОрДНК устойчивы к двунитевым разрывам при нуклеазном гидролизе [Вейко и Спитковский, 2000] и накапливаются в сыворотке больных ревматоидным артритом [Вейко и соавт, 2006] Последовательность СатШ обогащена AT - парами Рибосомный повтор человека (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22) представлен в геноме в количестве 300-700 копий [Вейко Н Н и соавт, 2003], анализируемый фрагмент сателлита 3 представлен в районе lql2 тысячами копий

Концентрация ТОрДНК у КД варьирует от 181 до 1962 пг/мл (среднее 522±92 пг/мл), а у ОД интервал варьирования более широкий - от 60 до 5880 пг/мл плазмы (среднее 1411±94 пг/мл) Концентрация СатШ изменяется от 232 до 4891 пг/мл (среднее 1835±243 пг/мл, N=22) для КД и от 12 до 5975 пг/мл (среднее 1042 пг/мл, распределение отличается от нормального, N=153) для ОД Результаты анализа концентрации ТОрДНК и СатШ в плазме крови контрольных и облученных доноров (группы 0-7) представлены в таблице 2.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что среднее значение концентрации ТОрДНК у облученных людей статистически значимо выше, чем у необлученных доноров, причем не наблюдается зависимости концентрации

8

ТОрДНК от величины накопленной дозы Иная картина обнаружена для повтора СатШ Для групп 3-6 (диапазон доз 27,4 - 245,6 мЗв) наблюдается снижение средних значений концентраций СатШ в плазме крови

Таблица 2.

Средние значения концентраций повторов ТОрДНК и СатШ в плазме крови

контрольных и облученных доноров и сравнение выборок по критерию __ Колмогорова-Смирнова._г__

№ групп ы СтОрДНК) пг/мл плазмы (±SE) Сравнение с группой «0» по критерию КС СсатНЬ пг/мл плазмы (± SE) Сравиение с группой «0» во критерию К-С

0 523 ±86 1835 ±253

1 1205 ±190 D=0,64; Р>0,05 1710 ±330 D=0,26; Р<0,05 *

2 1440± 321 D=0,52; Р>0,05 1345 ±248 D=0,38; Р<0,05 *

3 1413 ±220 D=0,69; Р>0,05 729 ±146 D=0,52; Р>0,05

4 1380 ±225 D=0,56; Р>0,05 781 ±146 D=0,52; Р>0,05

5 1609 ±320 D=0,52; Р>0,05 876 ±153 D=0,52, Р>0,05

6 1321±162 D=0,73; Р>0,05 803 ±161 D=0,60; Р>0,05

7 1566 ±257 D=0,71; Р>0,05 1051 ± 203 D=0,35; Р<0,05 *

*) распределения не различаются

Таким образом, в плазме крови людей, получивших дозу облучения, увеличена концентрация вС-богатой последовательности ТОрДНК и снижена концентрация АТ-богатой последовательности СатШ

Содержание анализируемых повторов в 1 нг внДНК было рассчитано на основании данных об общей концентрации внДНК и концентраций соответствующих повторов в плазме

Таблица 3.

Содержание (ш) повторов ТОрДНК и Сат III во внДНК и сравнение выборок по критерию Колмогорова-Смирнова.

№ ш ТОрДНК) пг/нг внДНК (± SE) Сравнение с группой «0» по критерию К-С m СатШ, пг/нг внДНК (± SE) Сравнение с группой «0» по критерию К-С

0 2,9 ±0,4 11 ± 1,9

1 12 (1 -74) * D=0,50; Р>0,05 11 ± 1,5 D=0,25; Р<0,05 **

2 16(1-63)* D=0,56; Р>0,05 8 ±1,3 D=0,38; Р<0,05 **

3 12,3 ± 1,6 D=0,78; Р>0,05 6(0,2-31)* D=0,49; Р>0,05

4 9,6 ± 1,5 D=0,63; Р>0,05 5 ±0,8 D=0,56; Р>0,05

5 13,6 (1 - 92)* D=0,55; Р>0,05 9(0,2-30)* D=0,36; Р<0,05**

6 19,8(2-151)* D=0,69; Р>0,05 8(0,2-40)* D=0,51; Р>0,05

7 12,8 ±2,9 D=0,62, Р>0,05 7 ±1,3 D=0,47; Р>0,05

*) распределение отличается от нормального, в скобках приводятся интервалы варьирования значений, ** ) распределения не различаются

В изученной выборке в составе внДНК плазмы ОД содержание ТОрДНК варьировало от 1,0 до 151 пг/нг внДНК (среднее 13,8 пг/нг внДНК, N=153), содержание СатШ изменяется от 0,2 до 39,6 пг/нг внДНК (среднее 7,8 пг/нг ДНК,

9

N=153) При этом во внДНК КД содержание ТОрДНК изменяется от 0,9 до 7,9 пг/нг ДНК (среднее 7,8 пг/нг ДНК, N=22), а содержание СатШ от 2,0 до 42,5 пг/мл ДНК (среднее 2,9 пг/нг ДНК, N=22). Далее мы проанализировали, как влияет облучение на содержание ТОрДНК и СатШ во внДНК. Данные представлены в табл 3. Во всех группах ОД от 40 до 65% образцов внДНК обогащены фрагментами ТОрДНК по сравнению с внДНК ЗД Содержание СатШ во внДНК у облученных и необлученных людей различаются несущественно. Наиболее выражена зависимость содержания ТОрДНК во внДНК от накопленной дозы в возрастной группе сотрудников 52-59 лет (25 человек), получивших за время работы дозы радиации больше 90 мЗв (коэффициент линейной регрессии к = 0,7, р <0,001)

Мы сравнили содержание повторов в составе внДНК и яДНК, распределения приводятся на рис. 1.

ТОрДНК СатШ

60 40

^ 20

I о h 20

15

10

А

я(ТОрДНК)

Й

Б

внСШрДНК)

40 30 20 10

2% 15 10 5

А

я(Сот1В)

Б

вн{СатИ)

31Q (81 }4

3lg imf

в

Рис. 1. Нормированное распределение образцов геномной ДНК (А, п=256) и образцов внДНК (Б, п=153) по относительному содержанию (т) ТОрДНК и

СатШ.

К сожалению, мы не располагали образцами яДНК ОД Поэтому мы воспользовались данными о содержании анализируемых повторов в яДНК, полученными нами для другой выборки практически здоровых индивидов, включающей 256 человек Ранее было показано [Вейко и соавт, 2003], что при увеличении выборки свыше 30 человек вид частотного распределения и средние значения относительного содержания ТОрДНК и СатШ в яДНК человека практически не изменяются Из сравнения распределений образцов геномной и внДНК по содержанию ТОрДНК, представленных на рис 1 по методу Колмогорова-Смирнова (Б=0,46, Р>0,05), ясно видно, что внДНК ОД существенно обогащена фрагментами ТОрДНК по сравнению с яДНК Иная картина наблюдается для повтора СатШ Как следует из данных рис 1, содержание повтора СатШ во внДНК плазмы человека снижено по сравнению с содержанием этого повтора в яДНК

(0=0,46, Р>0,05, по критерию Колмогорова-Смирнова) Аналогичные данные -повышение содержания ТОрДНК и снижение содержания СатШ были получены при изучении внДНК сыворотки больных ревматоидным артритом [Вейко и соавтр, 2006]. Из анализа литературы известно, что ДНК, выделенная из плазмы крови больных СКВ, содержит заметно больше Срв-динуклеотидов, чем геномная ДНК человека [Са1еагг1 й а1, 2003] Последовательность повтора СатШ содержит малое количество СрО-динуклеотидов, такое же, как и тотальная геномная ДНК, и его концентрация во внДНК снижена по сравнению с ДНК, заключенной в ядре клетки, как в норме, так и при облучении

Одна из возможных причин качественного изменения состава внДНК -неодинаковая скорость гидролиза разных фрагментов внДНК в составе растворимого хроматина погибших клеток нуклеазами крови до коротких фрагментов, которые далее могут быть элиминированы Поскольку, как ранее было показано, ТОрДНК существенно более устойчива к возникновению двойных разрывов, возникающих при накоплении однонитевых разрывов в ДНК вследствие нуклеазного гидролиза или химической модификации, чем последовательность СатШ [Вейко и Спитковский , 2000], во внеклеточной жидкости накапливаются фрагменты ТОрДНК Увеличение содержания фрагментов ТОрДНК во внДНК облученных лиц по сравнению с необлученными донорами может указывать на интенсификацию процессов апоптоза клеток у облученных лиц одновременно с активацией элиминации большей части фрагментов внДНК Причиной апоптоза части клеток при действии ионизирующей радиации является недостаточно эффективная репарация повреждений ДНК При эффективной репарации некоторые поврежденные клетки организма могут выжить, но при этом возникает вероятность соматических мутаций в различных локусах генома Мы сравнили содержание ТОрДНК во внДНК облученных лиц с частотой ТСЯ - мутаций, поскольку эти два параметра должны отражать одно и то же явление - повреждение ДНК клеток ионизирующей радиацией По данным сотрудников ГУ МРНЦ РАМН (г Обнинск) частота ТСЯ-мутантных лимфоцитов в группе 100 необлученных доноров изменяется от 1,4 10"4 до 10 10"4 (среднее значение (4,0±0,2) 10"4). В анализируемой группе ОД частота варьирует от 1,2 10"4 до 63'10"4 (среднее значение 6,2'10'4) По критерию Мэнн-Уитни частота мутантных клеток в группе сотрудников ФЭИ статистически значимо выше, чем в контроле (р=0,003, данные получены в МРНЦ РАМН).

Для выяснения возможной связи между четырьмя определяемыми параметрами- концентрация внДНК, концентрация ТОрДНК в плазме, содержание ТОрДНК во внДНК, частота ТСЯ-мутантных клеток и характеристиками индивида -возраст и накопленная доза, был применен «метод главных компонент» Результат анализа в графическом виде представлен на рис 2 Наиболее тесно связаны три признака накопленная доза радиации, содержание ТОрДНК во внДНК и частота ТСЯ-мутантных клеток Для всей выборки обнаружена достоверная линейная корреляция между содержанием ТОрДНК и частотой ТСЯ-мутантных клеток (к=0,32, р < 0,001, N=153) Для лиц, получивших дозы радиации больше 90 мЗв, линейная зависимость этих показателей более выражена (к=0,47, р<0,001, N=56).

Наличие корреляции между содержанием ТОрДНК во внДНК и частотой ТСЯ-мутантных клеток подтверждает предположение о том, что эти два показателя

отображают единый процесс в организме - повреждение клеточной ДНК при действии радиации. Определение содержания ТОрДНК в составе внДНК плазмы крови может служить биомаркером при оценке слабовыраженного процесса апоптоза клеток в условиях длительного неблагоприятного воздействия окружающей среды

Концентрация внДНК

до\.стдо£дак

частота TCR-мутации

1 2 3 4 5 6

* возраст

Содержание J-ТОрДНК

• концентрация ТОрДНК

концентра1щя внДНБ

Рис.2. Графическое представление результатов анализа методом главных компонент совокупности 6 признаков для выборки ОД.

Действие внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека.

Мы установили, что внДНК существенно отличается от яДНК по содержанию CpG-богатых последовательностей (ТОрДНК), которые являются потенциальными иммуномодуляторами, аналогичными бактериальной и вирусной ДНК. В литературе нет работ, в которых исследовали бы действие именно внДНК на эукариотические клетки Поэтому мы поставили задачу, изучить возможные последствия изменения состава внДНК по сравнению с яДНК и накопления в крови человека CpG-богатых последовательностей на модельной системе - выделенные из периферической крови здоровых доноров и культивируемые in vitro лимфоциты человека

Для определения возможного действия внДНК (ТОрДНК) на лимфоциты использовали два цитохимических показателя, которые отражают активацию клеток при действии внешних агентов Ранее было показано, что стимуляция лимфоцитов малыми дозами радиации сопровождается изменением пространственной локализации хромосомных участков, в частности, перемещением прицентромерных локусов lql2 от мембраны к центру ядра [Спитковский и соавт, 2002] | Положение прицентромерных локусов хромосомы 1 в ядре определяли методом FISH Для краткости вместо гистограмм частотного распределения гибридизационного сигнала (для 500 клеток) по нормированному радиус-вектору (г) клеточного ядра в табл 5 мы приводим частоты клеток с примембранной локализацией прицентромерных

локусов (re[0,8, 1]) О стимуляции клеток свидетельствует уменьшение числа клеток с примембранной локализацией прицентромерных локусов! (re[0,8, 1]) и увеличение числа лимфоцитов с их внутриядерной локализацией (г < 0,8).

Для анализа биологического действия внДНК использовали Go-лимфоциты 4-х здоровых доноров (обозначенных условно А,Б,В и Г) Проанализировали действие на лимфоциты доноров образцов внДНК больных РА и здоровых людей Ранее было показано, что внДНК больных РА значительно обогащена рибосомными повторами [Вейко и соавт., 2006] и другими последовательностями с высоким содержанием CpG-динуклеотидов [Galeazzi et al, 2003] Кроме того, в экспериментах были использованы клонированные фрагменты ТОрДНК (р(ТОрДНК)) и ДНК, выделенная из Е coli, которая по количеству CpG-динуклеотидов и по GC-составу похожа на ТОрДНК и известна как сильный стимулятор клеток иммунной системы.

В табл 4 приводятся данные, полученные при культивировании лимфоцитов с перечисленными образцами ДНК, которые использовались в указанных в столбце 4 концентрациях

Таблица 4.

Результат воздействия различных образцов ДНК на культивируемые

лимфоциты.

№ Донор Тип ДНК СвнДНК нг/мл среды Частота значений Гб[0,8,1,0] Fr, % Сравнение с контрольными распределениями по методу Колмогорова-Смирнова

1 2 3 4 5 6

1 А ВнДНК РА 1 326 12 D=0,30, Р<0,05

2 А ВнДНК РА 1+ДНКаза1 326 39 D=0,27, PO,05**

3 А ВнДНК РА 2 572 15 D=0,29, Р<0,05

4 А ВнДНК РА 2+ДНКаза1 572 38 D=0,23, PO,05**

5 Б ВнДНКРАЗ 226 24 D=0,39, Р<0 05

6 Б ВнДНК РА 4 23 25 D=0,38, Р<0,05

7 А ВнДНК ЗД1 152 33 D=0,17, Р<0,05

8 А ВнДНК ЗД2 25 29 D=0,19, Р<0,05

9 А Контроль (без ДНК) 0 44

10 Б,В Контроль (без ДНК) 0 60±3 *

11 Б р(ТОрДНК) 20 000 12 D=0,47, Р<0,05

12 Б,В р(ТОрДНК) 2 000 25 ±4 D=0,32, PO,05

13 Б,В р(ТОрДНК) 200 30 ±5 D=0,33, PO,05

14 А,Б,В,Г р(ТОрДНК) 50 17 ±3 D=0,48, PO,05

15 Б,В р(ТОрДНК) 20 28 ±3 D=0,36, PO,05

16 Б р(ТОрДНК) 2 23 D=0,48, PO,05

17 Б PBR322 20000 60 D-0,13, P>0,05***

18 Б,В PBR322 2000 55±7 D=0,17; P>0,0S***

19 Б,В PBR322 200 53 ±6 D=0,17, P>0,05***

20 Б ДНК Е coll 20 000 14 D=0,49, PO,05

21 Б,В ДНК Е coli 2000 51 ±3 D=0,17, P>0,05"*

22 Б,В ДНК Е cob 200 64 ±4 D=0,15, P>0,05***

24 Б яДНК 2 000 58 D=0,15, P>0,05***

25 Б,В яДНК 2 000 57 ±4 D=0,13, P>0,05***

26 Б,В яДНК 200 61 ± 5 D=0,12, P>0,05***

*) - приводятся средние значения и отклонения от среднего для независимых опытов, в которых исследовали лимфоциты донора, который в столбце 2 обозначен первым, **) - проводили сравнение образцов, обработанных ДНКазой! и тех же интактных образцов, ***) - выборки достоверно не различаются

Концентрации образцов внДНК здоровых доноров и больных РА в среде культивирования соответствовали их концентрациям в сыворотке крови. Для остальных образцов ДНК мы провели исследование при различных концентрациях. Анализ данных таблицы позволяет сделать следующие выводы. С точки зрения количества клеток, в которых наблюдается перемещение прицентромерных локусов хроматина при действии фрагментов ДНК, взятых примерно в одном диапазоне концентраций, фрагменты ДНК условно можно расположить в ряд: рСГОрДНК) ~ внДНК (РА) > внДНК(ЗД)> pBR322> ДНК E.coli> яДНК « 0; яДНК активирующего действия не проявляет

Приведенные в таблице 4 данные позволяют заключить, что наибольшим стимулирующим действием обладают фрагменты внДНК, выделенные из сыворотки больных РА и фрагменты р(ТОрДНК). Эффект от воздействия внДНК(РА) значительно снижается после гидролиза ДНКазой 1 до олигонуклеотидных фрагментов. Действие р(ТОрДНК) проявляется при всех исследованных концентрациях в диапазоне от 2 до 20 ООО нг/мл Стимулирующее действие ДНК E.coli проявлялось только при концентрациях более 2 мкг/мл, что совпадает с данными литературы [Vollmer et al, 2004, Klinman et al, 1996] Плазмида - вектор также обладает небольшим стимулирующим действием, что подтверждает полученные ранее данные [Beyer et al, 2001] ДНК, выделенная из ядер лимфоцитов, не индуцирует наблюдаемый эффект даже при очень высоких концентрациях

Известно, что стимуляция лимфоцитов сопровождается также изменениями структуры ядрышка, которые отражают увеличение синтеза рРНК- возрастает число центров, выявляемых окраской нитратом серебра, и увеличивается их суммарная площадь [Ochs et al, 1989]

В табл 5 приводятся данные о влиянии фрагментов внДНК больных РА и ЗД и перечисленных выше модельных последовательностей на структуру ядрышка лимфоцитов доноров Данные представлены средними значениями числа серебрящихся центров на клетку (NAg) и средними значениями суммарных площадей серебрящихся участков ядрышка на клетку (SAg) Из табл. 5 следует, что при действии фрагментов внДНК, (р(ТОрДНК), pBR322 и ДНК E.coli на лимфоциты наблюдаются признаки активации ядрышка, увеличение общей площади серебрящихся участков (в 1,04 - 3,24 раза) и их числа (в 1,1 - 2,56 раза). ДНК, выделенная из ядер, не вызывает активации ядрышка С точки зрения количественных параметров активации ядрышка фрагменты ДНК условно можно расположить в ряд

р(ТОрДНК)» pBR322 > внДНК (РА) я внДНК(ЗД) = ДНК E.coli > яДНК = 0; яДНК активирующего действия не проявляет.

Сопоставление данных табл 4 и табл 5, полученных для лимфоцитов одних и тех же доноров, показало, что параметр Fr (столбец 5, табл. 4) коррелирует с параметрами SAg и NAg (столбцы 5 и 6, табл 5) Таким образом, два метода (анализ перемещения хромосом и анализ структуры ядрышка) отражают один и тот же процесс активацию лимфоцитов при инкубации с определенными фрагментами ДНК

Таблица 5.

Результат воздействия различных образцов ДНК на структуру ядрышка культивируемых лимфоцитов

№ Донор Тип ДНК Конц. внДНК, нг/мл среды SAg, рх <±SE) Na8 (± SE) Сравнение средних значений опытных образцов с контрольными по t-критерию

Su,, Na,

/ 2 3 4 5 е 7 8

1 А ВнДНК РА1 326 431 ± 14 1,95 ±0,09 Р=0,99, t=4,56>2,59 Р=0,99, t=4,0>2,34

г А ВнДНК РА1+ДНКаза1 326 283 ± 12 1,44 ±0,06 Р=0,99, t=8,l>2,6* Р=0,99, t=4,76>2,34*

3 А ВнДНК РА2 572 518 ± 25 2,56 ± 0,12 Р=0,99, t=6,43>2,6 IM),99,t=7,52>2,34

4 А ВнДНК РА2+ДНКаза1 572 276 ±9 1,47 ±0,06 Р=0,99, t=9,52>2,6* Р=0,99, t=8,09>2,34*

5 А ВнДНК ЗД1 152 466 ±17 2,85 ±0,19 Р=0,99, t=5,01>2,6 Р=0,99, t=6,88>2,34

6 А ВнДНК ЗД2 25 546 ± 21 2,51 ±0,17 Р~0,99, t=8,38>2,6 Р=0,99, t=5,7>2,34

7 А Контроль (без ДНК) 0 349 ±18 1,5 ±0,07

8 Б Контроль (без ДНК) 0 342 ±17 1,41 ± 0,06

9 Б р(ТОрДНК) 2000 621 ± 19 1,93 ±0,09 Р=0,99, t=ll,71>2,6 Р=0,99, t=4,36>2,34

10 Б р(ТОрДНК) 200 1109 ± 40 3,61 ± 0,24 Р=0,99, t=18,5>2,6 Р=0,99, t=8,97>2,34

И А р(ТОрДНК) 50 597 ± 23 2,66 ±0,14 Р=0,99, t=9,43>2,6 Р=0,99, t=7,65>2,34

12 Б р(ТОрДНК) 20 615 ± 24 3,37 ±0,11 Р=0,99, t=10,l>2,6 Р=0,99, t=15,6>2,34

13 Б р(ТОрДНК) 2 412 ± 22 1,85 ±0,12 Р=0,99, t=2,74>2,6 Р=0,99, t=3,l>234

14 А pbr322 50 357 ±20 1,41 ± 0,06 Р=0,99, t=0,54<2,6** Р=0,99, t=l,0<2,34**

15 Б PBR322 200 578 ± 22 1,8 ±0,09 Р=0,99, t=9,l>2,6 Р=0,99, t=3,19>2,34

16 б ДНК Е coli 50 497± 18 2,12 ± 0,11 Р=0,99, t=6,7>2,6 Р=0,99, t=5,68>2,34

17 б ДНК Е coli 200 453 ±16 1,55 ±0,05 Р=0,99, «=5,22>2,6 Р=0,99, t=2,42>2,34

18 б яДНК 2000 302 ± 23 1,30 ±0,07 Р=0,99, t=2,35<2,6»* Р=0,99, t=l,15<2,34**

19 б яДНК 200 321 ±11 1,36 ±0,06 Р-0,99, t=l,19<2,6** Р=0,99, t=0,51<2,34**

*) - проводили сравнение образцов с ДНКазой! и тех же интактных образцов, **) - выборки достоверно не различаются

Более детальный анализ данных табл.4 и 5 выявил некоторые различия в относительных количественных характеристиках эффектов, определяемых двумя методами Так, фрагменты внДНК больных РА наряду с фрагментами р(ТОрДНК), введенные в среду, примерно в одинаковой концентрации, вызывают перемещение локусов хромосом в подавляющем большинстве клеток (табл. 4). Однако на активацию ядрышка фрагменты р(ТОрДНК) влияют гораздо сильнее, чем внДНК больных РА или здоровых доноров (табл 5). Это можно объяснить тем, что в составе внДНК не только ТОрДНК, но и другие последовательности ДНК способны индуцировать перемещение анализируемых прицентромерных локусов, но именно фрагменты ТОрДНК активнее других фрагментов внДНК влияют на стимуляцию синтеза рРНК.

Таким образом, мы установили, что фрагменты ТОрДНК обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты Стимулирующее действие р(ТОрДНК) сопровождается изменением ряда биохимических показателей, отражающих функционирование клеточной популяции Мы обнаружили, что в присутствии р(ТОрДНК) (50 нг/мл) наблюдается увеличение количества РНК в клетке в среднем на (37 ± 16)% (N=4, данные для лимфоцитов четырех доноров) Этот результат хорошо совпадает с данными, полученными при анализе активации ядрышка, т к рРНК составляет до 80% от всей клеточной РНК Вместе с тем, можно отметить тенденцию к снижению общего количества РНК в лимфоцитах ЗД при инкубации с ДНК Е coli на 3 - 10%, по сравнению с контролем (N=4, различия недостоверны) Однако, при анализе активации ядрышка при действии ДНК E.coli в части клеток наблюдали увеличение синтеза рРНК

Действие рибосомного повтора на лимфоциты трех доноров сопровождается снижением активности каспазы 3 в клеточных лизатах на (23 ±9)% (N=3) В лимфоцитах одного из 4-х доноров в присутствии р(ТОрДНК) активность каспазы 3 возрастала на 10% (различия с контролем недостоверны) В присутствии ДНК Е coli активность каспазы 3 возрастает в среднем на (20 ± 8)% (N=4). Таким образом, ДНК E.coli в концентрации 50 нг/мл индуцирует апоптоз в части клеток, в отличие от р(ТОрДНК), которая снижает уровень спонтанного апоптоза в лимфоцитах

ТОрДНК повышает активность клеточных нуклеаз в среднем на (40 ± 8)% (N=4), а ДНК E.coli в среднем - на (32 ± 16) % (N=4) Таким образом, и р(ТОрДНК) и ДНК Ecoli вызывают увеличение нуклеазной активности в клетках Вероятно, возрастание нуклеазной активности является одним из возможных защитных механизмов клетки при накоплении как фрагментов чужеродной бактериальной ДНК, так и эндогенных продуктов разрушения клеток Обладая пониженной чувствительностью к действию нуклеаз, ТОрДНК может способствовать активации нуклеазного гидролиза других фрагментов ДНК, попадающих во внеклеточное пространство при апоптозе

Одним из показателей активации клеток иммунной системы является синтез цитокинов. Мы проанализировали изменение концентрации в среде культивирования лимфоцитов двух хорошо изученных белков - ИЛ-6 и ФНО-а. На рис 3 показано, что р(ТОрДНК) стимулирует синтез значительно большего количества ИЛ-6 по сравнению с ДНК E.coli, яДНК не индуцирует синтез ни ИЛ-6, ни ФНО-а В отличие от ИЛ-6, для синтеза ФНО-а ДНК Е coli оказалась гораздо более сильным стимулятором, чем ТОрДНК (рис 3)

А Концентрация ИЛ-6, пг/мл Б Активность ФНО-«,МЕ/мл

о 200 400 600 800 10Q0 0 10 20 30

10

20

30

К к

ТОрДНК ТОрДНК Ш

ДНК Е coli

ДНК В coil

яДНК >

яДНК

Рис. 3. Концентрация ИЛ-6 (А) и активность ФНО-а (Б) в среде культивирования лимфоцитов после инкубации в течение 24 часов в присутствии 2 мкг/мл (А) или 200 нг/мл (Б) образцов ДНК, указанных на рисунке.

Определение клеточных сигнальных путей, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты человека.

Далее мы постарались ответить на вопрос, какие клеточные сигнальные пути активируются в клетке в присутствии фрагментов ТОрДНК Известно, что фрагменты ДНК, содержащие неметилированные CpG-мотивы, обладают способностью связываться с белками семейства «Toll-like» рецепторов, обозначаемыми как TLR9 Эти рецепторы расположены в эндосомах Для блокирования связывания ДНК с рецепторами использовался ингибитор хлорокин в концентрации 2 ммоля/л, который изменяет рН в эндосомах При добавлении в среду культивирования лимфоцитов (предварительно инкубированных с хлорокином) фрагментов р(ТОрДНК) не наблюдали перемещения локусов хромосом, активации ядрышка или увеличения активности ФНО-а Таким образом, можно предполагать, что ТОрДНК реализует стимулирующее действие через рецепторы, расположенные в эндосомах

Чтобы проверить предположение об участии в проведении сигнала именно рецепторов TLR9, мы провели эксперимент, в котором проведение сигнала через TLR9 конкурентно ингибировали супрессорным олигонуклеотидом (2088) без изменения рН в эндосомах При добавлении р(ТОрДНК) (50 нг/мл) к среде культивирования лимфоцитов, содержащей супрессорный олигонуклеотид (3 мкг/мл), мы не наблюдали эффекта перемещения прицентромерных локусов хромосом При этом тестировали активацию ядрышка средняя площадь окрашенных серебром ЯОР возрастала в 1,5 раза, среднее число ядрышек на ядро -в 5 раз Активность ФНО-а в среде возрастала в 1,2 раза При отсутствии олигонуклеотида-супрессора активность ФНО-а увеличивалась в 3,5 раза Подобная ситуация позволяет высказать предположение, что в эндосомах существует еще один тип рецепторов, связывающих определенные мотивы в ТОрДНК Взаимодействие ТОрДНК с этими рецепторами не сопровождается перемещением анализируемых локусов хромосом и стимуляцией синтеза ФНО-а, но существенно влияет на активность ядрышка

Предположение о существовании дополнительных рецепторов для связывания

рибосомного повтора подтверждается при исследовании изменения экспрессии TLR9 в лимфоцитах в присутствии р(ТОрДНК) методом real-time ПЦР. Данные приведены на рис 4.

Л ТипДНК КОКфОЛ» Котроль+мторокии ТОрДНК ТОрДНК+хлорохии ДНКЬсо« ДНК S сой*хлорокин

Количество «PKK U.R9, отн. ед Б типднк Количество иРНК TU», отн. ея

Р

Кокгроль

ТОрЯНК

PBR322

2 3

1 г 3 4 8 «

Рис. 4. Количество мРНК ТЬЯ9 в лимфоцитах (А) и эмбриональных фибробластах кожи (Б) после стимуляции различными фрагментами ДНК (50 нг/мл, 24 часа). Количество мРНК в вариантах опыта измеряли относительно количества мРНК в контроле

ДНК Е coli является известным лигандом, взаимодействующим с рецепторами TLR9 При действии фрагментов ТОрДНК и ДНК Е coli на лимфоциты наблюдается увеличение количества мРНК белка TLR9 соответственно в 2,8 и в 5,4 раза (рис 4) Таким образом, ДНК E.coli. является более сильным стимулятором экспрессии TLR9, чем р(ТОрДНК). Кроме того, мы обнаружили, что ТОрДНК стимулирует экспрессию TLR9 и в клетках неиммунной природы, какими являются, например, эмбриональные фибробласты (рис.4) Как и в случае лимфоцитов, экспрессия TLR9 в присутствии ДНК Е coli выше, чем в присутствии р(ТОрДНК) Мы обнаружили, что хлорокин полностью блокирует синтез мРНК TLR9 при действии на лимфоциты ДНК Е coli (рис.4). При стимуляции лимфоцитов фрагментами рибосомного повтора количество мРНК в присутствии хлорокина снижалось на 20%, но, тем не менее, в 2 раза превышало контрольные значения (рис 4)

На наш взгляд, возможны два объяснения столь различного действия р(ТОрДНК) й ДНК Е coli на транскрипцию гена TLR9 в лимфоцитах. Во-первых, можно предположить наличие дополнительных рецепторов для ТОрДНК, которые расположены не в эндосомах, а на поверхности клетки. Во-вторых, возможно, не столь высокая экспрессия TLR9 при действии р(ТОрДНК) по сравнению с ДНК Е coli - один из вариантов приспособительной реакции организма, противодействующей активации клеток продуктами их распада. Механизмы реализации приспособительной реакции еще не исследованы, и их изучение требует дальнейшего осмысления. Например, нельзя исключить, что экспрессия TLR9 подавляется какими-то ингибиторными молекулами, нарабатывающимися в результате воздействия на клетки ТОрДНК

Антитела к фрагментам ТОрДНК,

В предыдущем разделе мы показали, что фрагменты рибосомного повтора обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты. Логично предположить, что в организме должны существовать механизмы блокирования стимулирующего действия фрагментов рибосомного повтора. В сыворотке крови здоровых людей обнаружены анти-ДНК антитела (аД-антитела) к бактериальным ДНК, которые отличаются от аД-антител, наблюдаемых при аутоиммунной патологии, специфичностью к эпитопам ДНК и другими свойствами [Pisetsky et al., 1999],

Для поиска сывороточных антител к фрагментам ТОрДНК мы использовали вариант ИФА на ДНК-связывающих мембранах. На фильтры наносили одинаковые количества денатурированных и нативных образцов р(ТОрДНК) и тот-ДНК человека и обрабатывали разведенной сывороткой с последующим выявлением ДНК-белкового комплекса вторичными антителами к иммуноглобулину G, конъюгированными с пероксидазой (рис.5). В случае сыворотки больного СКВ (вверху слева) примерно одинаковые сигналы тестируются для всех образцов ДНК, так как при СКВ в сыворотке присутствуют аД-аутоантитсла, которые узнают определенную конформацию ДНК, независимо от последовательности оснований [Pisetsky el al., 1999].

«то |>л ? i к 0 si

lisio |>ДНК Щ ф

«тенцмнли

днк

fis Г I* H О M H ВЯ ^^ '

днк т"

чтЛ t»p/ll;< ils f ОрЛИК «згемсынцк dsi яни 1111A y

ДНК ДНК

Ойрлэцы ДНК

Рис. 5. Доказательство присутствия в сыворотке здоровых людей антител к ТОрДНК, отличных от аД-антител больных СКВ. А На фильтры 1-4 нанесено по 60 HZ на пятно образцов ДНК (по три пятна для образца). Обозначения ДНК слева: буквы ss и ds - соответственно денатурированные и кат иены е образцы ДНК. Фгаьтры i и 3 - обрабатывали сывороткой больного СКВ. фильтры 2 и 4-сывороткой донора. Разведение сывороток - 1:200. Фильтры 1 и 2- отмывку солевым раствором не применяли; фильтры 3 и 4 - приметши отмывку 1,5 M раствором NaCl. Б. Средние интенсивности пятен, определенные для фильтров 1 и 2. Черные столбики - фильтр 1 (СКВ), серые - фильтр 2 (донор)

В случае использования сывороток здоровых людей мы обнаружили устойчивые к действию 1,5 М NaCl сигналы на образцах ТОрДНК и практически полное отсутствие сигнала на денатурированной геномной ДНК (рис.5).

Чтобы подтвердить специфичность аД-антител в сыворотке здоровых доноров к определенным эпитопам ДНК, мы протестировали 8 образцов двуспиральной ДНК, нанесенных на один фильтр (рис.6). Только два образца - ETS-18SpflHK и ДНК Е coli дали воспроизводимый для сывороток здоровых доноров сигнал. Вместе с тем, все 8 образцов взаимодействовали с аД-антителами сыворотки больного СКВ Эти опыты говорят о том, что основная часть аД-антител в сыворотке больных СКВ связывается с эпитопами ДНК, имеющими определенную конформацию, независимо от последовательности оснований. Полученные данные позволяют утверждать, что обнаруженные антитела специфично вырабатываются в ответ на присутствие GC-богатых последовательностей ТОрДНК

EST-18S рДНК

28SpflHK

Сигнал, отн ед 200 400 600

Рис. б. Сигналы, полученные при обработке 8 образцов ДНК, нанесенных на один фильтр в количестве 100 нг (по 3 пятна для образца) сывороткой СКВ (черные столбики) и донора (серые столбики) взятых в разведении 1:200.

Более подробно мы исследовали взаимодействие аД-антител сыворотки здорового донора с фрагментом ЕТ8-188рДНК, который включает промоторный участок, внешний транскрибируемый спейсер и ген 188рДНК. На рис. 7 приводятся зависимости сигнала от количества ДНК в пятне, полученные для разных разведений сыворотки. Для приблизительной количественной оценки взаимодействия аД-антител с ЕТ8-188рДНК использовали упрощенную модель, в которой это взаимодействие рассматривается как гомогенный, равновесный, одноступенчатый процесс с однородной степенью связывания, что позволяет применить уравнение Скэтчарда Эти допущения помогают оценить нижние значения Касс комплекса аД-антител с ЕТ8-188рДНК 5*109 М"1.

Прогрев сыворотки (55°С, ЗОмин.) не влияет на образование комплекса Предварительная обработка сыворотки ДНКазой 1 с последующей инактивацией фермента прогреванием, приводит к увеличению сигнала в среднем в 1,4 раза.

Количество ЕЭТ-183рДНК в пятне, нг

Рис. 7. Взаимодействие аД-антител сыворотки здорового донора с ЕТБ-18БрДНК. Зависимость сигнала от количества ДНК в пятне, полученная для разных разведений сыворотки (указаны на рис.). Каждая точка на графиках -среднее значение для пяти пятен ДНК Средняя стандартная ошибка составляет (10 ±5) % от измеряемой величины

Таким образом, ДНК-антитела к ЕТ8-188рДНК в сыворотке здоровых доноров присутствуют как в свободном, так и в связанном с внеклеточной ДНК виде

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В ходе проведенного исследования обнаружены ранее не известные свойства внДНК человека, что позволяет высказать некоторые предположения о возможных функциях внДНК в организме Мы установили, что в составе внДНК как облученных, так и необлученных людей накапливается СрО-богатая неметилированная последовательность ТОрДНК У 54% облученных людей содержание ТОрДНК во внДНК увеличено по сравнению с содержанием во внДНК необлученных доноров Напротив, содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3 во внДНК снижено

В плазме крови 22% облученных людей увеличена концентрация фрагментов ТОрДНК и, вероятно, других ОС-богатых последовательностей генома Мы предположили, что увеличение концентрации этих последовательностей в крови не безразлично для иммунной системы организма, так как ТОрДНК содержит большое число неметилированных Срв-мотивов связывания с «1о11»-рецепторами Т1Л19, которые представлены в иммунных клетках Для подтверждения этого предположения мы провели серию опытов на модельной клеточной системе -выделенные лимфоциты здоровых доноров, культивируемые в присутствии фрагментов внДНК человека и модельных фрагментов ДНК с различной последовательностью

Было показано, что фрагменты внДНК и фрагменты ТОрДНК в небольших концентрациях обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты

человека in vitro. Результатом действия внДНК и ТОрДНК на популяцию лимфоцитов является изменение структуры хроматина в первые часы культивирования в большом числе клеток, которое выражается в перемещении прицентромерных локусов 1-й хромосомы от мембраны внутрь ядра и в увеличении числа окрашиваемых серебром плотных фибриллярных центров ядрышка и их площади Активация лимфоцитов фрагментами ТОрДНК сопровождается значительным увеличением продукции ИЛ-6 и, в меньшей степени, ФНО-а Кроме того, обнаружено увеличение количества общей РНК клетки и количества мРНК TLR9, снижение активности каспазы 3 и возрастание нуклеазной активности в клеточных лизатах.

При анализе действия фрагментов ДНК на клетки очень важно определить возможные рецепторы ДНК, через которые активируются клеточные сигнальные пути. Несомненно, рецепторы TLR9 принимают участие в реализации действия ТОрДНК на клетки Блокирование этих рецепторов ингибиторами (хлорокин и олигонуклеотид-супрессор) сопровождается исчезновением эффектов перемещения хромосом в ядре и стимуляции синтеза ФНО-а при действии ТОрДНК Однако активация ядрышка в присутствии ТОрДНК при блокировании TLR9 олигонуклеотидом-супрессором сохраняется

Сравнительный анализ стимулирующего действия одинаковых количеств известного лиганда для TLR9 - ДНК E.coli и ТОрДНК на лимфоциты, выявил существенные различия При действии ТОрДНК структурная перестройка ядра и активация ядрышка наблюдаются в заметно большем числе клеток и при меньших концентрациях стимулирующих фрагментов ДНК Продукция ИЛ-6 в присутствии ТОрДНК на порядок выше, а активность ФНО-а на порядок ниже, чем при культивировании лимфоцитов с ДНК Е coli. ДНК Е coli, в отличие от ТОрДНК, стимулирует увеличение активности каспазы 3, те индуцирует апоптоз в части клеток Бактериальная ДНК является гораздо более сильным стимулятором экспрессии TLR9, чем ТОрДНК Стимуляция экспрессии TLR9 фрагментами ДНК Е coli, в отличие от стимуляции фрагментами ТОрДНК, полностью блокируется в присутствии ингибитора TLR9 - хлорокина

Совокупность вышеизложенных фактов позволяет предположить, что фрагменты ТОрДНК воздействуют на клетки не только через TLR9. Несомненно, существуют еще какие-то рецепторы для ДНК, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты В последние годы в литературе появилось несколько работ, в которых высказывается такое же предположение [Yasuda et al, 2005, McCoy et al, 2004, Cortez-Gonzalez et al, 2006]

Схема на рис 9 объединяет наши данные и данные литературы относительно возможных путей сигнализации при взаимодействии клеток с внДНК О природе не-TLR9-peuenTopoB для внДНК пока известно очень мало Предполагается, что это могут быть белки, аналогичные RIG-1 (retmoic acid inducible gene 1), который принимает участие в связывании вирусной РНК Наши данные указывают на то, что эти неизвестные рецепторы, как и TLR9, расположены в эндосомах Их активация сопровождается увеличением синтеза рРНК и мРНК TLR9 в клетке. Наличие нескольких типов рецепторов для связывания внДНК может иметь значение для эффективной деградации избыточных количеств внДНК крови

В О0П1 С * 1' т -(■ ■ хромлтннг

Рис.8. Регуляция клеточного ответа на интенсификацию процессов гибели клеток в организме при длительном воздействии небольших доз повреждающих агентов. Радиация индуцирует гибель клеток организма. Фрагменты хроматина погибших клеток появляются в крови, где гидролизуются ¿о более коротких фрагментов эндонуклеазами. Рибосомный повтор относительно устойчив к фрагментации, циркулирует в виде более длинных фрагментов и медленнее элиминируется. Происходит постепенное увеличение концентрации ТОрДНКв крови, при этом общая концентрация ей ДНК может существенно не изменяться или снижаться. При достижении определенной концентрации ТОрДИК взаимодействует, как минимум, с двумя типами рецепторов в эндосомах: известные рецепторы ИКУ и, пока неописанные, рецепторы X. Результатом взаимодействия является ответ клеток организма, который включает временное снижение уровня апоптоза, увеличение активности клеточных эндонуклеаз, дополнительную экспрессию рецепторов, опознающих СрС-ДНК, и проводников сигнала (Мус188). Кроме того, активируется синтез антител к СрС-ДНК. Негативным результатом накопления ТОрДНК и других СрС-ДНК в крови является синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФИО).

Недавно было показано, что предварительная стимуляция TLR9 лигандами приводит к значительному увеличению транспорта фрагментов ДНК в клетку и связыванию их не только с TLR9, но и с другими рецепторами [McCoy et al., 2003; Yasuda et al, 2005] CpG-ДНК, которые присутствуют в крови в небольших концентрациях, могут играть положительную роль своеобразного «ключа», открывающего доступ в клетку остальным фрагментам внДНК для их последующей деградации и реутилизации. Это предположение подкрепляется данными работы 2006 г, где впервые показано, что усиленная экспрессия TLR9 при СКВ необходима для эффективной компенсации аутоиммунных нарушений [Wu et al, 2006] Отметим, что эти нарушения обусловлены, в том числе, и накоплением больших количеств внДНК [Barrat et al, 2005] в крови.

В большинстве современных работ, однако, предполагается, что активация TLR9, способствует развитию аутоиммунной патологии [Papadimitraki et al, 2006; Barrat et al., 2005] Высокие концентрации CpG-ДНК (в том числе и ТОрДНК) в крови могут приводить к нарушению эффективной работы иммунной системы, поскольку усиливают синтез провоспалительных цитокинов и провоцируют аномально высокий уровень активации клеток Мы впервые показали, что в организме здорового человека вырабатываются высокоспецифичные антитела к последовательности ТОрДНК, причем часть молекул антител циркулирует в крови в виде комплексов с фрагментами внДНК, а часть - в свободном состоянии Таким образом, в организме человека предусмотрена защита от избыточных количеств «собственных» стимулирующих клетки фрагментов ТОрДНК Мы не обнаружили специфичных антител к другим повторам генома человека (сателлиту 3 или генам гистонов) Наличие антител к фрагментам ТОрДНК дает основание для разработки новых способов блокирования гиперстимуляции клеток иммунной системы Возможно, подавление излишней активности ТОрДНК антителами может привести к состоянию длительной ремиссии у больных аутоиммунными заболеваниями Однако, разработка методов лечения и профилактики расстройств, вызванных активностью фрагментов внДНК - дело будущего, и для осуществления этих проектов необходимо дальнейшее исследование биологических свойств и функций фрагментов внДНК.

ВЫВОДЫ

1) В составе внДНК плазмы крови человека при длительном действии ионизирующей радиации накапливается CpG-богатая последовательность транскрибируемой области рибосомного повтора, напротив, содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3 снижается Содержание ТОрДНК во внДНК плазмы крови можно рекомендовать в качестве потенциального маркера, скрыто протекающих, компенсированных процессов гибели клеток в организме при повреждающих воздействиях Концентрация внДНК в плазме не является маркером апоптоза

2) Суммарная внДНК и ее отдельные фрагменты обладают выраженной способностью активировать in vitro лимфоциты человека Стимулирующее действие внДНК и ТОрДНК на лимфоциты сопровождается изменением пространственной организации хроматина и изменениями структуры ядрышка, которые отражают

24

активацию транскрипции рибосомных генов Активирующее действие образцов ДНК изменяется в ряду

ТОрДНК > внДНК(больные РА) > внДНК(КД), тотальная яДНК не обладает активирующими свойствами Эффект стимуляции зависит от концентрации фрагментов ДНК и времени воздействия (т е от дозы)

3) Фрагменты ТОрДНК вызывают в лимфоцитах увеличение уровня транскрипции генома, снижение активности каспазы 3, увеличение нуклеазной активности клеток и повышение уровня экспрессии белка TLR9 При действии ТОрДНК значительно возрастает синтез интерлейкина 6 и, в меньшей степени, ФНО альфа

4) В реализации стимулирующего действия ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы TLR9 и другие, пока неизвестные, рецепторы для ДНК, которые могут быть локализованы в эндосомах

5) В сыворотке крови человека впервые обнаружены специфичные, высокоаффинные антитела к фрагменту ТОрДНК, которые присутствуют в свободном виде и в комплексе с внеклеточной ДНК

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Вейко Н Н, Калашникова Е А, Кокаровцева С Н., Костюк С В , Ермаков А В , Иванова С М, Рязанцева Т А , Еголина Н А , Ляпунова Н А , Спитковский Д М Стимулирующее действие фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора на лимфоциты периферической крови человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2006 -№10-С 410-414

2 Ермаков А В , Костюк С В , Еголина Н А, Малиновская Е М, Вейко Н Н, Спитковский ДМ Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в адаптирующих дозах, являются фактором стресс-сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями // Радиационная биология Радиоэкология -2007 -Т47,№2 -С 133-140

3 Вейко Н Н, Костюк С В , Шубаева Н О , Иванова С М, Сперанский А И Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови при ревматоидном артрите //Иммунология -2007 -№3 -С389-394

4 Калашникова Е А, Вейко Н Н, Кокаровцева С Н , Костюк С В , Ермаков А В , Еголина Н А , Ляпунова Н А, Спитковский Д М Активация мононуклеаров периферической крови фрагментами транскрибируемой области рибосомного гена, человека m vitro // Тез докл X международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» СПб Медицинская иммунология, - 2006 - Т 8, № 2-3 - С 143144

5 Костюк С В , Вейко Н Н, Калашникова Е А., Кокаровцева С Н , Иванова С М, Рязанцева Т А, Сперанский А И Периферическая кровь здоровых доноров содержит антитела к фрагментам ДНК рибосомного повтора человека (ТОрДНК) // Аллергология и иммунология материалы 6 съезда аллергологов и иммунологов СНГ -2006 -Т7,№3 -С254

6 Вейко Н Н, Иванова С М, Костюк С В , Ермаков А В , Еголина Н А,

Сперанский А И. Внеклеточная ДНК периферической крови больных ревматоидным артритом является сильным стимулятором клеток иммунной системы // Аллергология и иммунология- материалы 6 съезда аллергологов и иммунологов СНГ. - 2006. - Т.7,№3 -С.348

7 Вейко Н Н, Ермаков А В, Костюк С В, Малиновская Е М, Еголина Н А., Замулаева И А, Саенко А.С Фрагменты внеклеточной ДНК - факторы клеточной стресс-сигнализации при действии ионизирующей радиации. // Новые направления в радиобиологии Международная конференция. Тезисы докладов. М. РУДН. - 2007

-С.10-13

Подписано в печать 14 08 2007 г Исполнено 14 08 2007 Печать трафаретная

Заказ № 619 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костюк, Светлана Викторовна

СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Свойства внеклеточной ДНК.

1.1. Концентрация внДНК.

1.2. Размеры фрагментов внДНК.

1.3. Изменение содержания различных последовательностей в внДНК

1.4. Модификация оснований внДНК.

2. Происхождение фрагментов внДНК в организме.

3. Взаимодействие фрагментов внДНК с клетками.

4. Рецепторы, опознающие фрагменты внДНК.

4.1. Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR).

4.1.1. Общая характеристика белков TLR.

4.1.2. Рецепторы TLR9.

4.1.2.1. Природные и синтетические лиганды для белков TLR9.

4.1.2.2. Ингибиторы взаимодействия CpG-ДНК с TLR9.

4.1.2.3. Пути передачи сигнала через TLR9.

4.1.2.4. Полиморфные варианты гена TLR9.

4.2. TLR—независимый путь узнавания нуклеиновых кислот.

5. Выводы из обзора литературы и постановка задачи исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Анализируемая выборка.

2. Определение свойств внДНК.

2.1. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы периферической крови.

2.2. Определение концентрации внДНК.

2.3. Определение размеров фрагментов ДНК.

2.4. Определение концентрации повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови.

2.5. Определение частоты TCR - мутантных лимфоцитов.

3. Определение действия внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека.

3.1. Выделение лимфоцитов.

3.2. Приготовление образцов ДНК.

3.3. Приготовление клеточных препаратов.

3.4. Цитохимические методы.

3.4.1. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

3.4.2. Анализ конформации ядрышка.

3.5. Биохимические методы.

3.5.1. Выделение РНК из культивируемых лимфоцитов.

3.5.2. Определение концентрации РНК.

3.5.3. Определение ферментативной активности каспазы 3.

3.5.4. Определение нуклеазной активности.

3.6. Иммунологические методы.

3.6.1. Определение концентрации ИЛ-6.

3.6.2. Определение концентрации ФНО-а.

3.7. Ингибирование TLR9 клеточного пути.

3.8. Оценка экспрессии TLR9 методом real-time ПЦР.

4. Анализ сыворотки (плазмы) человека на наличие специфичных антител к фрагментам ТОрДНК.

4.1. Приготовление образцов двуспиральной ДНК для нанесения на фильтр.

4.2. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах.

4.3. Обработка сыворотки ДНКазой 1.

5. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Свойства внДНК плазмы крови облученных лиц.

1.1. Концентрация внДНК.

1.2. Длины фрагментов внДНК.

1.3. Концентрации повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови.

1.4. Содержание повторяющихся последовательностей генома во внДНКплазмы крови.

1.5. Частота встречаемости TCR-мутантных лимфоцитов.

1.6. Анализ связи между определяемыми параметрами методом главных компонент.

2. Действие внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека.

2.1. Экспериментальные подходы к исследованию активации лимфоцитов человека при действии фрагментов внДНК.

2.2. Определение изменения пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района lql2 при действии фрагментов внДНК.

2.3. Изменения конформации ядрышка при действии фрагментов внДНК на лимфоциты человека.

2.4. Изменение некоторых биохимических показателей культивируемых лимфоцитов при действии фрагментов ТОрДНК.

2.4.1. Общее количество РНК в лимфоцитах.

2.4.2. Активность каспазы 3.

2.4.3. Анализ изменения нуклеазной активности.

2.5. Влияние ТОрДНК на синтез лимфоцитами цитокинов.

2.5.1. Изменение концентрации ИЛ-6.

2.5.2. Изменение концентрации ФНО-а.

2.6. Определение возможных известных клеточных сигнальных путей, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты человека.

2.6.1. Ингибирование TLR9 клеточного пути хлорокином.

2.6.2. Ингибирование супрессорным нуклеотидом проведения сигнала через TLR9 при стимуляции лимфоцитов фрагментами р(ТОрДНК).

2.6.3. Изменение экспрессии белка - рецептора TLR9 при действии фрагментов р(ТОрДНК) на клетки.

3. Антитела к фрагментам ТОрДНК.

3.1. Анализ сыворотки (плазмы) человека на наличие специфичных антител к фрагментам ТОрДНК.

3.2. Доказательство специфичности обнаруженных антител.

3.3. Определение константы Касс комплекса аД-антител сЕТЗ-ШрДНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фрагменты рибосомных генов человека в составе внеклеточной ДНК: факторы стресс-сигнализации"

Актуальность проблемы. Одной из важнейших характеристик гомеостаза является поддержание определенного соотношения между пролиферацией и гибелью клеток - фундаментальными характеристиками высших организмов, необходимыми для нормального развития и функционирования. При патологии и опасных для генома воздействиях часто возрастает уровень гибели клеток организма. Фрагменты ДНК погибших клеток поступают в кровь и циркулируют в организме. Эта ДНК получила название внеклеточной ДНК (внДНК). В последнее десятилетие в биомедицине сформировалось новое направление исследований - анализ и практическое использование внДНК. Анализ внДНК оказался информативным в онкологической практике, в пренатальной диагностике, в травматологии и т.д. Исследования носят, в основном, прикладной характер и направлены на развитие нетравматических методов как определения мутаций в конкретных последовательностях генома опухоли или плода, так и уровня гибели клеток. Свойства и биологические функции фрагментов внДНК в норме и при патологии остаются малоизученными. Большинство i авторов полагают, что состав внДНК идентичен составу яДНК, которая не способна воздействовать на клетки организма. Немногочисленные исследования свойств внДНК, в частности, определение изменения ее нуклеотидного состава по сравнению с ядерной ДНК, позволяют, однако, предположить, что фрагменты внДНК, циркулирующие в крови, небезразличны для организма. В литературе практически нет работ, в которых рассматривались бы свойства отдельных фрагментов внДНК генома человека с точки зрения воздействия на клетки организма. Вместе с тем, имеются данные о том, что определенные последовательности бактериальной ДНК и синтетические CpG-олигонуклеотиды существенно влияют на функционирование систем клеточного иммунитета. Настоящая работа посвящена исследованию свойств внДНК генома человека и обусловленного этими свойствами биологического действия внДНК на клетки человека.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в следующем: 1) определить некоторые свойства внДНК генома человека при длительном действии на организм повреждающего агента (ионизирующей радиации) и 2) исследовать биологическое действие внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека. Исходя из целей работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) В выборке здоровых доноров и работников атомного предприятия, подвергавшихся воздействию облучения в фиксированных дозах (175 человек), определить концентрацию внДНК, концентрацию в плазме и содержание во внДНК плазмы периферической крови двух повторяющихся последовательностей генома: GC-богатой транскрибируемой области рибосомного повтора (ТОрДНК) и АТ-богатой субфракции сателлита 3, локализованной в прицентромерном районе 1-й хромосомы (lql2).

2) В опытах in vitro изучить влияние тотальной внДНК (тот-внДНК) и фрагментов ТОрДНК на функционирование клеток иммунной системы; выяснить, через какие известные клеточные рецепторы реализуется действие фрагментов внДНК.

3) Определить, вырабатываются ли антитела на конкретные последовательности генома человека, накапливающиеся в составе внДНК.

Научная новизна. Впервые установлено, что по составу повторяющихся последовательностей внДНК облученных людей существенно отличается от яДНК. ВнДНК обогащена фрагментами транскрибируемой области рибосомного повтора. У облученных людей содержание ТОрДНК и ее концентрация в плазме существенно выше, чем у необлученных контрольных доноров (КД). Впервые показано стимулирующее действие внДНК и фрагмента ТОрДНК на лимфоциты человека, которое сопровождается изменением структуры хроматина, активацией синтеза РНК и увеличением продукции цитокинов. В реализации стимулирующего действия внДНК и ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы из семейства «toll-like» (TLR9), узнающие CpG-богатые мотивы ДНК, и пока не известные рецепторы, опознающие фрагменты внДНК. Впервые в сыворотке крови человека обнаружены специфичные, высокоаффинные антитела к фрагменту ТОрДНК, которые присутствуют в свободном виде и в комплексе с внеклеточной ДНК.

Научно-практическая значимость работы. Определение в плазме крови человека трех показателей: (1) содержания ТОрДНК во внДНК плазмы периферической крови, (2) концентрации ТОрДНК в плазме крови и (3) титра антител к ТОрДНК может оказаться полезным для выявления лиц, у которых происходит интенсивный апоптоз клеток организма, увеличено количество иммуностимулирующих последовательностей ДНК и повышена вероятность развития аутоиммунных заболеваний. Результаты, полученные в данной работе, могут быть использованы для оптимизации диагностических методов при оценке слабовыраженного процесса апоптоза клеток в условиях длительного неблагоприятного воздействия окружающей среды. Обнаруженные в организме здорового человека высокоспецифичные антитела к последовательности ТОрДНК открывают перспективы их применения в будущем в терапии ряда аутоиммунных заболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. В составе внДНК плазмы крови при длительном действии ионизирующего излучения накапливается CpG-богатая последовательность ТОрДНК; содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3, напротив, снижается. Содержание ТОрДНК во внДНК плазмы крови - новый маркер скрыто протекающих процессов апоптоза клеток в организме. Концентрация тот-внДНК в плазме не является маркером апоптоза клеток организма при длительном действии небольших доз радиации.

2. Образцы внДНК и фрагменты ТОрДНК обладают выраженной способностью активировать in vitro лимфоциты человека; активирующее действие образцов ДНК изменяется в ряду: ТОрДНК > внДНК больных ревматоидным артритом > внДНК здоровых доноров. Тотальная яДНК активирующего действия не проявляет. Эффект стимуляции зависит от концентрации накапливающихся фрагментов ДНК и времени воздействия (т.е. от дозы).

3. В реализации стимулирующего действия ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы, узнающие неметилированные CpG-богатые мотивы ДНК (TLR9), и другие, пока неизвестные, рецепторы для ДНК.

4. В сыворотке крови человека присутствуют специфичные, высокоаффинные антитела к фрагменту ТОрДНК, которые могут быть как в свободном виде, так и в комплексе с внеклеточной ДНК.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Около 60 лет назад было обнаружено, что геномная ДНК млекопитающих заключена не только в клеточном ядре, но и циркулирует в периферической крови [обзор Galeazzi et al., 2003]. Фрагменты ДНК, извлекаемые из биожидкостей организма, принято называть экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, внеклеточной ДНК (внДНК), ДНК плазмы, ДНК сыворотки, cell-free DNA, circulating DNA, CNAPS. Особое внимание внДНК уделяется в последнее десятилетие, когда стало очевидным, что современные методы позволяют проводить анализ первичной последовательности и метилирования очень низких количеств определенных фрагментов ДНК. Активно совершенствуются методы анализа измененной ДНК опухоли, циркулирующей в крови больного, или ДНК плода, фрагменты которой присутствуют в крови матери. ВнДНК используется как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях, диабете, травмах, инсультах, инфарктах миокарда и т.д. Вопросу использования феномена внДНК в медицинской диагностике при различных заболеваниях посвящено большинство работ и обзоров (см., например, обзоры [Galeazzi et al., 2003; Swaminathan et al., 2006; Tong et al., 2006]). В данном обзоре мы уделили внимание исследованиям возможных биологических функций внДНК генома человека. Для того чтобы определить влияние внДНК на процессы, протекающие в организме, необходимо иметь представление о свойствах внДНК и о характере взаимодействия фрагментов внДНК с клетками организма.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Костюк, Светлана Викторовна

выводы

1) В составе внДНК плазмы крови человека при длительном действии ионизирующей радиации накапливается CpG-богатая последовательность транскрибируемой области рибосомного повтора; напротив, содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3 снижается. Содержание ТОрДНК во внДНК плазмы крови можно рекомендовать в качестве потенциального маркера скрыто протекающих, компенсированных процессов гибели клеток в организме при повреждающих воздействиях. Концентрация внДНК в плазме не является маркером апоптоза.

2) Суммарная внДНК и ее отдельные фрагменты обладают выраженной способностью активировать in vitro лимфоциты человека. Стимулирующее действие внДНК и ТОрДНК на лимфоциты сопровождается изменением пространственной организации хроматина и изменениями структуры ядрышка, которые отражают активацию транскрипции рибосомных генов. Активирующее действие образцов ДНК изменяется в ряду:

ТОрДНК > внДНК(больные РА) > внДНК(КД); тотальная яДНК не обладает активирующими свойствами.

Эффект стимуляции зависит от концентрации фрагментов ДНК и времени воздействия (т.е. от дозы).

3) Фрагменты ТОрДНК вызывают в лимфоцитах увеличение уровня транскрипции генома, снижение активности каспазы 3, увеличение нуклеазной активности клеток и повышение уровня экспрессии белка TLR9. При действии ТОрДНК значительно возрастает синтез интерлейкина 6 и, в меньшей степени, ФНО альфа.

4) В реализации стимулирующего действия ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы TLR9 и другие, пока неизвестные, рецепторы для ДНК, которые могут быть локализованы в эндосомах.

5) В сыворотке крови человека обнаружены специфичные, высокоаффинные антитела к фрагменту ТОрДНК, которые присутствуют в свободном виде и в комплексе с внеклеточной ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенного исследования обнаружены ранее не известные свойства внДНК человека, что позволяет высказать некоторые предположения о путях клеточной сигнализации и возможных функциях внДНК в организме. В качестве объекта исследования была выбрана плазма периферической крови здоровых доноров и людей, получающих в ходе профессиональной деятельности различные дозы ионизирующей радиации. Известно, что действие радиации сопровождается повреждениями клеточной ДНК, которые приводят к возникновению соматических мутаций в геноме и/или апоптозу клеток организма. Мы показали, что общая концентрация внДНК не является характеристикой уровня гибели клеток при действии радиации в течение длительного времени. Однако обнаруженные нами изменения состава внДНК облученных людей могут быть рекомендованы в качестве маркера усиленной гибели клеток организма при длительном воздействии небольших доз радиации или других повреждающих факторов. Во внДНК человека накапливается CpG-богатая неметилированная последовательность ТОрДНК (см. схему на рис.4-1). У 54% облученных людей содержание ТОрДНК во внДНК увеличено по сравнению с содержанием во внДНК необлученных доноров. Напротив, содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3 во внДНК снижено. Обнаружено, что содержание ТОрДНК во внДНК плазмы облученных людей коррелирует с частотой TCR-мутантных лимфоцитов. Эти два показателя отображают единый процесс в организме - повреждение клеточной ДНК. Часть поврежденных клеток гибнет по механизму апоптоза, что приводит к появлению избыточных количеств внДНК, усилению со временем процессов элиминации внДНК и увеличению содержания устойчивых к двунитевым разрывам внеклеточных фрагментов ТОрДНК. Какая-то часть поврежденных клеток выживает, благодаря процессам репарации, но при этом могут возникнуть мутации в различных локусах генома. Согласно нашим данным, одна из наиболее вероятных функций внДНК - это сигнализация неповрежденным клеткам, прежде всего, клеткам иммунной системы, о превышении в организме нормального уровня гибели клеток и накоплении избыточных количеств внеклеточной ДНК. Гипотетический механизм сигнализации приводится на рис. 4-1.

Клетки организма

РАДИА о

Повреждение ДНК, репарации ошибки репарации

Клетки с мутациями

1 1 I Ж

Появление в крови фрагментов хроматина погибши* клеток некро апогп"! Ф

Погибшие клетки ГИДР0ЛИ1 до \ НИ1 комопекулярны* \ фрагментов

С вя)ывание ТОрДНК актителями

Элинхиаоия коротких обогащенаСрэ

ТОрДНК .

ДНК e.col

Снижение уровня а по ито га

Увеличение активности эндонуклеаз

Синтез антител к фрагментам внДНК

Активация TLR ■ Рецеггтор X' ' Я Аналог RIG1?\ / Л / г

Активация транскрипции генов ИНФ

Рис.4-1. Регуляция клеточного ответа на интенсификацию процессов гибели клеток в организме при длительном воздействии небольших доз повреждающих агентов. Для сравнения приводится ДНК E.coli, которая действует через TLR9.

В плазме 22% облученных людей увеличена концентрация фрагментов ТОрДНК и, вероятно, других GC-богатых последовательностей генома. Мы предположили, что увеличение концентрации этих последовательностей в крови не безразлично для иммунной системы организма, так как ТОрДНК содержит большое число неметилированных CpG-мотивов связывания с «1о11»-рецепторами TLR9, которые экспрессируются в иммунных клетках. Для подтверждения этого предположения мы провели серию опытов на модельной клеточной системе - выделенные лимфоциты здоровых доноров, культивируемые в присутствии фрагментов внДНК человека и модельных фрагментов ДНК с различной последовательностью.

Было показано, что фрагменты внДНК и модельные фрагменты ТОрДНК в небольших концентрациях обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты человека in vitro. Результатом действия внДНК и ТОрДНК на популяцию лимфоцитов является изменение структуры хроматина в первые часы культивирования в большом числе клеток, которое выражается в перемещении прицентромерных локусов 1-й хромосомы от мембраны внутрь ядра и в увеличении числа окрашиваемых серебром фибриллярных центров ядрышка и их площади. Активация лимфоцитов фрагментами ТОрДНК сопровождается значительным увеличением продукции ИЛ-6 и, в меньшей степени, ФНО-а. Кроме того, обнаружено увеличение количества общей РНК клетки и количества мРНК TLR9, снижение активности каспазы 3 и возрастание нуклеазной активности в клеточных лизатах.

При анализе действия фрагментов ДНК на клетки очень важно определить возможные рецепторы ДНК, через которые активируются клеточные сигнальные пути. Несомненно, рецепторы TLR9 принимают участие в реализации действия ТОрДНК на клетки. Блокирование этих рецепторов ингибиторами (хлорокин и олигонуклеотид-супрессор) сопровождается исчезновением эффектов перемещения хромосом в ядре и стимуляции синтеза ФНО-а при действии ТОрДНК. Однако активация ядрышка в присутствии ТОрДНК при блокировании TLR9 олигонуклеотидом-супрессором сохраняется.

Сравнительный анализ стимулирующего действия одинаковых количеств известного лиганда для TLR9 - ДНК E.coli и ТОрДНК на лимфоциты, выявил существенные различия. При действии ТОрДНК структурная перестройка ядра и активация ядрышка наблюдаются в заметно большем числе клеток и при меньших концентрациях стимулирующих фрагментов ДНК. Продукция ИЛ-6 в присутствии ТОрДНК на порядок выше, а активность ФНО-а на порядок ниже, чем при культивировании лимфоцитов с ДНК E.coli. ДНК E.coli в отличие от ТОрДНК стимулирует увеличение активности каспазы 3, т.е. индуцирует апоптоз в части клеток. Бактериальная ДНК является гораздо более сильным стимулятором экспрессии TLR9, чем ТОрДНК. Стимуляция экспрессии TLR9 фрагментами ДНК E.coli в отличие от стимуляции фрагментами ТОрДНК, полностью блокируется в присутствии ингибитора TLR9 — хлорокина. Совокупность вышеизложенных фактов позволяет предположить, что фрагменты ТОрДНК воздействуют на клетки не только через TLR9 при активации MyD88. Несомненно, существуют еще какие-то рецепторы для ДНК, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты. В последние годы в литературе появилось несколько работ, в которых высказывается такое же предположение [Yasuda et al., 2005; McCoy et al., 2004; Cortez-Gonzalez et al., 2006].

Схема на рис. 4-1 включает наши данные и данные литературы относительно возможных путей сигнализации при взаимодействии клеток с внДНК. Мы предполагаем существование для фрагментов ТОрДНК как минимум двух типов не - TLR9 рецепторов. Одни рецепторы расположены на поверхности клетки и не чувствительны к хлорокину. Этот вывод подтверждается данными других авторов о наличии в В-лимфоцитах ДНК-связывающих рецепторов, не чувствительных к действию хлорокина [Cortez-Gonzalez et al., 2006]. Стимуляция с помощью ТОрДНК неизвестных пока рецепторов в условиях блокирования рецепторов внутри эндосом хлорокином приводит к активации транскрипции TLR9. Связывание

ТОрДНК с этими рецепторами не сопровождается перестройкой хроматина, активацией ядрышка или изменением синтеза ФНО. Эти рецепторы на поверхности определенных клеток возможно первыми распознают эндогенные и экзогенные лиганды для эндосомальных ДНК-рецепторов во внеклеточной среде и дают сигнал для реализации доставки лигандов в эндосомы.

Другие He-TLR9 рецепторы локализованы в эндосомах. Эти рецепторы блокируются хлорокином, но при действии ингибитора - олигонуклеотида, действующего на TLR9, рецепторы, тем не менее, распознают фрагменты ТОрДНК. Результатом взаимодействия является активация ядрышка, при этом отсутствует перемещение хромосом и не наблюдается увеличения синтеза ФНО. По-видимому, фрагменты ТОрДНК взаимодействуют, в основном, с этими рецепторами. Взаимодействие инициирует синтез больших количеств ИЛ-6 и активацию практически всех клеток (В- и Т-лимфоцитов). Возможно, что неизвестные рецепторы и TLR9 экспрессируются в различных субпопуляциях лимфоцитов.

О природе не Т1^9-рецепторов для внДНК пока известно очень мало. Предполагается, что это могут быть белки, аналогичные RIG-1 (retinoic acid inducible gene 1), который участвует в связывании вирусной РНК (см. схему). Наличие нескольких типов рецепторов для связывания внДНК может иметь значение для эффективной деградации избыточных количеств внДНК крови. Недавно было показано, что предварительная стимуляция TLR9 лигандами приводит к значительному увеличению транспорта фрагментов ДНК в клетку и связыванию не только с TLR9, но и с другими рецепторами [McCoy et al., 2003; Yasuda et al., 2005]. CpG-ДНК, которые присутствуют в крови в небольших концентрациях, могут играть положительную роль своеобразного «ключа», открывающего доступ в клетку остальным фрагментам внДНК для их последующей деградации и реутилизации. Это предположение подкрепляется данными работы 2007 г, где впервые показано, что усиленная экспрессия TLR9 при СКВ необходима для эффективной компенсации аутоиммунных нарушений [Wu et al., 2006]. Отметим, что эти нарушения обусловлены, в том числе, и накоплением больших количеств внДНК [Barrat et al., 2005] в крови. В большинстве современных работ, однако, предполагается, что чрезмерная активация TLR9 способствует развитию аутоиммунной патологии [Papadimitraki et al., 2006; Barrat et al., 2005]. Ha наш взгляд, развитию патологии способствуют, прежде всего, нарушения в регуляции количества и состава внДНК в крови (см. рис.4-1). Повышение концентрации CpG-ДНК (в том числе и ТОрДНК) приводит к усилению синтеза провоспалительных цитокинов и провоцирует аномально высокий уровень активации клеток. В организме человека предусмотрена защита от избыточных количеств «собственных» стимулирующих клетки фрагментов ТОрДНК, которые появляются в крови в результате усиления гибели клеток. Согласно нашим данным (см. схема 4-1), эта защита включает несколько клеточных ответов, которые индуцируются определенными «дозами ТОрДНК»: (1) снижение уровня апоптоза клеток, (2) значительное усиление эндонуклеазной активности клеток, (3) экспрессия TLR9 и (4) выработка антител. Мы впервые показали, что в организме здорового человека вырабатываются высокоспецифичные антитела к последовательности ТОрДНК, причем часть молекул антител циркулирует в крови в виде комплексов с фрагментами внДНК, а часть - в свободном состоянии. Мы не обнаружили специфичных антител к другим повторам генома человека (сателлиту 3 или генам гистонов).

Обнаружение антител к фрагментам ТОрДНК, дает материал для разработки новых способов блокирования гиперстимуляции клеток иммунной системы. Возможно, подавление излишней активности ТОрДНК антителами может привести к состоянию длительной ремиссии у больных аутоиммунными заболеваниями. Однако, разработка методов лечения и профилактики расстройств, вызванных активностью фрагментов внДНК -дело будущего, и для осуществления этих проектов необходимо дальнейшее исследование биологических свойств и функций фрагментов внДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костюк, Светлана Викторовна, Москва

1. Владимиров В.Г, Шерлина С.С. Влияние различных по природе факторов риска на содержание повторяющихся последовательностей во внеклеточной ДНК. // Рад. Биол. Радиоэкол. 2002. - V. 42, № 6. -Р. 754-758.

2. Ганнушкина И.В, Фараго М.Л, Антелава А.Л, Баранчикова М.В, Вейко Н.Н. Гемодинамический эффект ДНК плазмы крови // Вестник РАМН. -1998. -№.5. С. 16-22.

3. Ганнушкина И.В., Фараго М.Л, Карпухин А.В. и др. Уровень ДНК в плазме крови больных с атеросклеротическим поражением магистральных артерий головы и больных боковым амиотрофическим склерозом // Бюл. Эксп. Биол. и Мед. 1997. -№. 12. - С. 610-612.

4. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. Москва: Изд-во1. Мир». 1994.

5. Дерябин В.Е. Многомерная биометрия для антропологов. Москва: Изд-во МГУ.- 1983.

6. Карпухин А.В., Салимов А.Г., Вейко Н.Н., Карпухин С.А., Богуш А.И. Анализ взаиморасположения гомологичных хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов человека. // Генетика. 1994. - Т.30. - С. 66.

7. Керова Н.И., Пухова Г.Г., Чеботарев Е.Е. Естественные ингибиторы нуклеаз. — Киев: Наукова думка. 1974.

8. Орехов А.Н., Писаржевский С. А. Инфекционно-аутоиммунно-воспалительная гипотеза патогенеза атеросклероза // Клинические лекции.- М.: Ин-т атеросклероза РАЕН. 2005.

9. Пол У. // Иммунология. 1989. - Т. 3. - С. 14.

10. Томилин Н.В., Подгорная О.И., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. // Цитология. — 1984. Т. XXVII — №5- с.554-564.

11. Abstracts for CNAPS IV. // Clinical Chemistry.- 2005.-V. 51, No. 10.

12. Ahmad-Nejad P., Hacker H., Rutz M., et al. Bacterial CpG-DNA and lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. // Eur. J. Immunol. 2002. - V. 32. - P. 1958-1968.

13. Ahmad-Nej ad P., Hacker H.5 Rutz M., et al. Bacterial CpG-DNA and lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. // Eur. J. Immunol. 2002. - V. 32. - P. 1958-1968.

14. Akira, S., and K. Takeda. 2004. Toll-like receptor signaling. // Nat. Rev. Immunol. V.4., №7. - P.499-511.

15. Andersen J.M., Al-Khairy D., Ingalls R.R. Innate immunity at the mucosal surface: role of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial pathogens. // Biol. Reprod. 2006. V.74., №5. -P.824-31.

16. Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system. // Cancer Res. 1975. -V.35. - P.2375-2382.

17. Antonatos D., Patsilinakos S.,Spanodimos S., Korkonikitas P.,Tsigas D. Cell-free DNA levels as a prognostic marker in acute myocardial infarction. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. - V. 1075, № 9. - P.278-81.

18. Ara J, Ali R. Reactive oxygen species modified DNA fragments of varying sizeare the preferred antigen for human anti-DNA autoantibodies. // Immunol. Lett. 1992. - V.34, №3 - P. 195-200.

19. Armant M.A., Fenton M.J. Toll-like receptors: a family of pattern-recognition receptors in mammals. // Genome Biol. Y. 3. - P. 3011-3016.

20. Ashman R.F., Goeken J.A., Drahos J., Lenert P. Sequence requirements for oligodeoxyribonucleotides inhibitory activity. // Int. Immunol. 2005. - Y.17. -P.411-420.

21. Atamaniuk J., Ruzicka K., Stuhlmeier K.M., et al. Cell-free plasma DNA: a marker for apoptosis during hemodialysis. // Clin. Chem. — 2006. V.52, №3. — P. 523-526.

22. Atamaniuk J., Vidotto C., Tschan H., et al. Increased Concentrations of Cell-Free Plasma DNA after Exhaustive Exercise. // Clinical Chemistry. 2004. — V.50. -P.1668-1670.

23. Barchet W., Cella M., Colonna M. Plasmacytoid dendritic cells—virus experts of innate immunity. // Semin Immunol. 2005. - V. 17. - P.253-61.

24. Barrat F.J., Meeker Т., Gregorio J., Chan J.H., et al. Nucleic acids of mammalian origin can act as endogenous ligands for Toll-like receptors and may promote systemic lupus erythematosus. // J. Exp. Med. 2005. - V.202. -P.1131-1139.

25. Basu S., Fenton M.J. Toll-like receptors: function and roles in lung disease. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2004. - V. 286. - P. 887-L892.

26. Bauer S., Kirschning C.J., Hacker H., et al. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. - V.98 - P.923 7-9242.

27. Bell J.K., Botos I., Hall P.R., et al. The molecular structure of the Toll-like receptor 3 ligand-binding domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005. — V.102. -P.10976-10980.

28. Bennett R.M., Gabor G.T., Merritt M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA. // J. Clin. Invest. 1985. - Y.76, № 6. -P.2182-90.

29. Berghofer В, Frommer T, Konig I.R, et al. Common human Toll-like receptor 9 polymorphisms and haplotypes: association with atopy and functional relevance. // Clin. Exp. Allergy. 2005. -V. 35. - P. 1147-1154.

30. Bin, L. H, Xu, L. G, Shu, H. B. TIRP, a novel Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein involved in TIR signaling. // J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P.24526-24532.

31. Bird A. CpG-rich islands and the function of DNA methylation. // Nature. -1986.-V. 321.-P. 209-213.

32. Boyd J.H, Mathur S, Wang Y, Bateman R.M, Walley K.R. Toll-like receptor stimulation in cardiomyoctes decreases contractility and initiates an NF-kappaB dependent inflammatory response. // Cardiovasc Res. 2006. - V. 72, № 3. -P.384-93.

33. Branda R, Moore A, Hong R, McCormack J., Zon G, Cunningham-Rundles C. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1996. -V. 79. - P. 115-121.

34. Brock G, Bird A. // Mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes. // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. - P. 451-456.

35. Brummel R, Lenert P. Activation of marginal zone В cells from lupus mice with type A(D) CpG-oligodeoxynucleotides. // J. Immunol. 2005. - V.174. -P.2429-2434.

36. Chan K.C, Hui A.B, Wong N, et al. Investigation of the genomic representation of plasma DNA in pregnant women by comparative genomic hybridization analysis: a feasibility study. // Clin. Chem. 2005. - V.51, №12. -P.2398-401.

37. Chan КС, Yeung SW, Lui WB, Rainer TH, Lo YM. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. // Clin. Chem. 2005. -V.51, № 4. -P.781-4.

38. Chaudhary, P.M.; Ferguson, C.; Nguyen, V., et al. Cloning and characterization of two Toll/interleukin-1 receptor-like genes TIL3 and TIL4: evidence for a multi-gene receptor family in humans. // Blood 1998. - V.91. - P.4020-4027.

39. Chen Y., Lenert P., Weeratna R., et al. Identification of methylated CpG motifs as inhibitors of the immune stimulatory CpG motifs. // Gene Ther. 2001. -V.8. - P.1024-1032

40. СЫ H., Barry S., Roth R.J., et al. Dynamic regulation of pro- and antiinflammatory cytokines by МАРК phosphatase 1 (MKP-1) in innate immune responses. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006. V. 103, № 7, - P.2274-2279.

41. Choe J., Kelker M.S., Wilson I.A. Crystal structure of human Toll-like receptor 3 (TLR3) ectodomain. // Science. 2005. - V.309. - P.581-585.

42. Choi J.J., Reich C.F., Pisetsky D.S. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. // Immunology. 2005. - V.l 15, №1. - P.55-62.

43. Choi JJ, Reich CF 3rd, Pisetsky DS. Release of DNA from dead and dying lymphocyte and monocyte cell lines in vitro. // Scand. J. Immunol. 2004. -V.60, №1-2. P.159-66.

44. Chuang Т.Н.; Ulevitch R.J. Cloning and characterization of a sub-family of human Toll-like receptors: hTLR7, hTLR8 and hTLR9. // Europ. Cytokine Netw. 2000. - V. 11. - P. 372-378.

45. Collins L.V., Hajizadeh S., Holme E., Jonsson I.M., Tarkowski A. Endogenously oxidized mitochondrial DNA induces in vivo and in vitro inflammatory responses. // J. Leukoc. Biol. 2004. - V.75, № 6. - P.995-1000.

46. Cooper C.L., Davis H.L., Morris M.L., et al. CPG 7909, an immunostimulatory TLR9 agonist oligodeoxynucleotide, as adjuvant to Engerix-B((R)) HBVvaccine in healthy adults: a double-blind phase 1=11 study. // J. Clin. Immunol. -2004. V.24. P. 693-701.

47. Cornelie S., Hoebeke J., Schacht A.M., et al. Direct evidence that toll-like receptor 9 (TLR9) functionally binds plasmid DNA by specific CpG motifs recognition. // J. Biol. Chem. 2004. - V.279 - P. 15124-15129.

48. Cortez-Gonzalez X., Pellicciotta I., Gerloni M., et al. TLR9-independent activation of В lymphocytes by bacterial DNA. // DNA Cell Biol. 2006. -V. 25, №5.-P. 253-261.

49. Degli-Esposti M.A. and Smyth M.J. Close encounters of different kinds; dendritic cells and NK cells take centre stage. // Nat. Rev. Immunol. 2005. -V. 5-P. 112-24.

50. Distelhorst C.W., Cramer K., Roger J. C. Selective release of excreted DNA sequences from phytohemagglutinin-stimulated human peripheral blood lymphocytes. // J. Clin. Invest. 1978. - V.61 - P. 1204-1217.

51. Dong L., Ito S., Ishii K.J., Klinman D.M. Suppressive oligodeoxynucleotides delay the onset of glomerulonephritis and prolong survival in lupus-prone NZB x NZW mice. // Arthritis Rheum. 2005. - V.52. - P.651-658.

52. Du, X.; Poltorak, A.; Wei, Y.; Beutler, B. Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution. // Europ. Cytokine Netw. -2000.-V. 11.-P. 362-371,.

53. Duramad O., Fearon K.L., Chang В., et al. Inhibitors of TLR-9 act on multiple cell subsets in mouse and man in vitro and prevent death in vivo from systemic inflammation. // J. Immunol. -2005. V. 174. -P.5193-5200.

54. Encabo A., Solves P., Mateu E., et al. Selective generation of different dendritic cell precursors from CD34+ cells by interleukin-6 and interleukin-3. // Nature. // 1995. V. 374(6522). P. 546-549.

55. Fatouros I.G., Destouni A., Margonis K., et al. Cell-Free Plasma DNA as a Novel Marker of Aseptic Inflammation Severity Related to Exercise Overtraining. // Clinical Chemistry. 2006. - V.52. - P. 1820-1824

56. Fitzgerald K.A, Palsson-McDermott E.M., Bowie A.G., et al. Mai (MyD88adapter-like) is required for Toll-like receptor-4 signal transduction. // Nature -2001. V.413. -P.78-83.

57. Fitzgerald K.A., McWhirter S.M., Faia K.L., et al. IKKQand TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway. // Nat. Immunol. 2003. — V.4. - P.491-496.

58. Gal S., Fidler C., Lo Y.M., et al. Quantitation of circulating DNA in the serum of breast cancer patients by real-time PCR. // Br. J. Cancer. 2004. - V.90, №6, -P.1211-5.

59. Galeazzi M., Morozzi G., Piccini M., et al. Marcolongo R. Dosage and characterization of circulating DNA: present usage and possible applications in systemic autoimmune disorders. // Autoimmun. Rev. 2003. - V.2, №1. -P.50-5.

60. Gursel I., Gursel M., Yamada H., et al. Repetitive elements in mammalian telomeres suppress bacterial DNA-induced immune activation. // J. Immunol. -2003. V. 171. - P. 1393-1400.

61. Hagmar L., Brogger A., Hansteenl.L., et al. Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic study group on the health risk of chromosome damage // Cancer Research. 1994. -V.54. -P.2919-2922.

62. Hajizadeh S., DeGroot J., TeKoppele J.M., Tarkowski A., Collins L.V. Extracellular mitochondrial DNA and oxidatively damaged DNA in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. // Arthritis Res. Ther. 2003. -V5, №5. P.R234-40.

63. Hajjar A.M., O'Mahony D.S., Ozinsky A., et al. Cutting edge: functional interactions between Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR1 or TLR6 in response to phenol-soluble modulin. // J. Immunol. 2001. - V. 166 -P.l5-19.

64. Hamann L., Glaeser C.3 Hamprecht A., et al. Toll-like receptor (TLR)-9 promotor polymorphisms and atherosclerosis. // Clin. Chim. Acta. 2006. - V. 364.-P. 303-307.

65. Hartmann G., Krigg A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG

66. DNA motif in human primary В cells. // J. Immunol. 2000. - V. 164. -P. 944-953.

67. Hasan U.; Chaffois C.; Gaillard C., et al. Human TLR10 is a functional receptor, expressed by В cells and plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transcription through MyD88. // J. Immun. 2005. - V.174 - P.2942-2950.

68. Hayashi, F.; Smith, K. D.; Ozinsky, A., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. // Nature 2001. - V.410 -P.1099-1103,

69. Heikenwalder M, Polymenidou M, Junt T, et al. Lymphoid follicle destruction and immunosuppression after repeated CpG oligodeoxynucleotide administration. //Nat. Med. 2004. - V. 10, № 2. - P. 187-92.

70. Hemmi H.; Takeuchi O.; Kawai Т., et al. A toll-like receptor recognizes bacterial DNA. // Nature 2000 - V.408 - P.740-745.

71. Hoebe K., Du X., Georgel P., Janssen E., et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling. // Nature 2003 - V.424 -P.743-748.

72. Honda K., Yanai H., Mizutani Т., et al. Role of a transductional-transcriptional processor complex involving MyD88 and IRF-7 in Toll-like receptor signaling. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2004.-V. 101.-P. 15416-15421.

73. Honda K.; Ohba Y.; Yanai H., et al. Spatiotemporal regulation of MyD88-IRF-7 signalling for robust type-I interferon induction. // Nature. 2005. - V. 434. -P. 1035-1040.

74. Horng Т., Barton G.M., Medzhitov R. TIRAP: An adapter molecule in the Toll signaling pathway. // Nat. Immunol. 2001. - V.2. - P.825-841.

75. Huang L.Y., Ishii K.J., Akira S. et al. Thl-like cytokine induction by heat-killed Brucella abortus is dependent on triggering of TLR9. // J.Immunol. 2005. - V. 175.-P. 3964-3970.

76. Huck S., Deveaud E., Namane A., Zouali M. Abnormal DNA methylation and deoxycytosine-deoxyguanine content in nucleosomes from lymphocytesundergoing apoptosis. // The FASEB Journal. 1999. - V. 13. - P. 1415-1422.

77. Jahrsdorfer В., Weiner G.J. Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides and antibody therapy of cancer. // Semin. Oncol. 2003. - V.30. - P.476-82.

78. Janssens S., Beyaert R. A universal role for MyD88 in TLR/IL-1 receptor-mediated signaling. // Trends Biochem. Sci. 2002. - V.27. - P.474-482.

79. Jiang N., Pisetsky D.S. The effect of inflammation on the generation of plasma DNA from dead and dying cells in the peritoneum. // J. Leukoc. Biol. 2005. -V.77, № 3. - P.296-302.

80. Jiang W.W., Zahurak M., Goldenberg D., et al. Increased plasma DNA integrity index in head and neck cancer patients. // Int. J. Cancer. 2006. - V.l 19, №11. -P.2673-6.

81. Kaisho T, Takeuchi O, Kawai T, Hoshino K, Akira S. Endotoxin-induced maturation of MyD88-deficient dendritic cells. // J. Immunol. 2001. - V. 166 -P.5688-5694.

82. Kato H, Sato S, Yoneyama M, et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. // Immunity. 2005. - V. 23. - P. 19-28.

83. Kawai T, Akira S. TLR signaling. // Cell Death Differ. 2006. - V.13. -P.816-825.

84. Kawai Y, Yoshida M, Arakawa K, et al. Diagnostic Use of Serum Deoxyribonuclease I Activity as a Novel Early-Phase Marker in Acute Myocardial Infarction. // Circulation. 2004. - V. 109. - P. 2398-2400.

85. Khazen W, M'bika J.P, Collinet M, et al. Differentiation-dependent expression of interferon gamma and toll-like receptor 9 in 3T3-F442A adipocytes. // Biochimie. 2007. - V. 89, № 5. - P. 669-675.

86. Kikuchi K, Lian Z.X, Kimura Y, et al. Genetic polymorphisms of toll-like receptor 9 influence the immune response to CpG and contribute to hyper-IgM in primary biliary cirrhosis. // J. Autoimmun. 2005. - V. 24. - P. 347-352.

87. Kishimoto T, Akira S., Narazaki M, Taga T. // Interleukin-6 family of cytokines and gp 130. Blood. 1995. - V. 86. - P. 1243—1254.

88. Klinman D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. // Nature Rev. Immunol. 2004. - V.4. - P. 1-10.

89. Klinman D.M, Zeuner R, Yamada H, et al. Regulation of CpG-induced immune activation by suppressive oligodeoxynucleotides. // Ann. N.Y. Acad. Sci. -2003. V. 1002.-P. 112-123.

90. Klinman D.M, Yi A.K, Beaucage S.L, Conover J, Krieg A.M. CpG motifspresent in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. -V. 93.-P. 2879-83.

91. Kotake S., Sato K., Kim K.J., et al. Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast-like cell formation. // J. Bone Miner. Res. 1996. -V. 11.-P. 88—95.

92. Koutouzov S., Jeronimo A.L., Campos H., Amoura Z. Nucleosomes in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus. // Rheum. Dis. Clin. North. Am. -2004.-V. 30.-P. 529-558.

93. Krieg A., Yi A., Matson S., Waldschmidt Т., et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // Nature. 1995. - V. 374. - P. 546-549.

94. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. // Ann. Rev. Immunol. 2002. - V. 20. - P. 709-60.

95. Krieg A.M. Now I know my CpGs. // Trends Microbiol. 2001. - V. 9, № 6.-P. 249-52.

96. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // J. Biol. Chem. 2004. - V. 79, №4.-P. 17217-17223.

97. Kyoizumi S., Akiyama M., Hirai Y., et al. Spontaneous loss and alteration of antigen receptor expression in mature CD4+ T cells. // J. Exp. Med. 1990. -V. 171.-P. 1981-1999.

98. Lafarga M., Lerga A., Andres M.A., et al. Apoptosis induced by methylazoxymethanol in developing rat cerebellum: organization of the cell nucleus and its relationship to DNA and rRNA degradation. // Cell. Tissue Res. 1997-V. 289.-P. 25-38.

99. Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Rykova E.Y., et al. Extracellular circulating nucleic acids in human plasma in health and disease. // Nucl. Nucl. Nucleic Acids. 2004 - V. 23, № 6-7. -P. 879-83.

100. Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Rykova E.Y., Bryzgunova O.E., Starikov

101. A.V. Cell-surface-bound nucleic acids: Free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. - V. 7.-P. 1022:1221.

102. Lammers KM, Ouburg S, Morre SA, et al. Combined carriership of TLR9-1237C and CD14-260T alleles enhances the risk of developing chronic relapsing pouchitis. // World J. Gastroenterol. 2005. - V.46. - P. 7323-7329.

103. Lau C.M., Broughton C., Tabor A.S., et al. RNA-associated autoantigens activate В cells by combined В cell antigen receptor/Toll-like receptor 7 engagement. //J. Exp. Med. -2005. -V. 202. P. 1171-1177.

104. Lebre M.C., van der Aar A.M., van Baarsen L., et al. Human keratinocytes express functional Toll-like receptor 3, 4, 5, and 9. // J. Inves. Dermatol. -2007.-V. 127, №2.-P. 331-41.

105. Lee Т.Н., Montalvo L., Chrebtow V., Busch M.P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. // Transfusion. 2001. - V. 41, № 2. - P. 27682.

106. Lenert P., Goeken J.A., Ashman R.F. Extended sequence preferences for oligodeoxyribonucleotide activity. // Immunology. 2006. - V. 117, №4, -P. 474-481.

107. Lenert P.S. Targeting Toll-like receptor signaling in plasmacytoid dendritic cells and autoreactive В cells as a .therapy for lupus. // Arthritis Res. Ther. — 2006.-V. 8, № 1. P. 203.

108. Lenert P., Yi A.K., Krieg A.M., Stunz L., Ashman R.F. Inhibitory oligonucleotides block the induction of АР-1 transcription factor by stimulatory CpG oligonucleotides in В cells. // Antisense Nucl. Acid. Drug. Dev. 2003.1. V. 13.-P. 143-150.

109. Li J.Z., Steinman C.R. Plasma DNA in systemic lupus erythematosus. Characterization of cloned base sequences. // Arthritis Rheum. 1989. - V. 32, №6.-P. 726-33.

110. Li K., Foy E., Ferreon J.C., et al. Immune evasion by hepatitis С virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P. 2992-2997.

111. Li K.; Chen Z.; Kato N., et al. Distinct poly(I-C) and virus-activated signaling pathways leading to interferon-beta production in hepatocytes. // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 16739-16747.

112. Li L. Regulation of innate immunity signaling and its connection with human diseases. // Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 2004. - V. 3, № 1 -P. 81-86.

113. Li Y., Zimmermann В., Rusterholz C., et al. Size Separation of Circulatory DNA in Maternal Plasma Permits Ready Detection of Fetal DNA Polymorphisms. //Clinical. Chemistry. -2004. V. 50.-P. 1002-1011.

114. Lui Y.Y., Dennis Y.M. Circulating DNA in plasma and serum: biology, preanalytical issues and diagnostic applications. // Clin. Chem. Lab. Med. -2002. -V. 40, № 10. -P. 962-968.

115. Majewslca M., Szczepanik M. The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune responses and their function in immune response regulation. // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). 2006. - V. 60. - P. 52-63.

116. Mayer A.K., Muehmer M., Mages J., et al. Differential recognition of TLR-dependent microbial ligands in human bronchial epithelial cells. // J. Immunol. -2007. V. 178, №5.-P. 3134-3142.

117. McCoy S.L., Kurtz S.E., Hausman F.A., et al. Activation of RAW264.7

118. Macrophages by Bacterial DNA and Lipopolysaccharide Increases Cell Surface DNA Binding and Internalization. // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. -P. 17217-17223.

119. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. -1997. V. 388, № 6640. - P. 394—397.

120. Meylan E., Curran J., Hofmann K., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis С virus. // Nature. 2005. -V. 437.-P. 1167-1172.

121. Miggin S.M. O'Neill L.A.J. New insights into the regulation of TLR signaling. // J. Leukoc. Biol. 2006. - V. 80. - P. 220-226.

122. Miyata M., Kanno Т., Ishida H., et al. CpG motif in DNA from immune complexes of SLE patients augments expression of intercellular adhesion molecule-1 on endothelial cells.Rinsho Byori. 1996. - V. 44, № 12. -P. 1125-3.

123. Mockenhaupt F.P., Cramer J.P., Hamann L., et al. Toll-like receptor (TLR) polymorphisms in African children: Common TLR-4 variants predispose to severe malaria. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103, № 1. - P. 177182.

124. Noguchi E., Nishimura F., Fukai H., at al. An association study of asthma and total serum immunoglobin E levels for Toll-like receptor polymorphisms in a Japanese population. // Clin. Exp. Allergy. 2004. - V. 34. - P. 177-183.

125. O'Neill L.A., Fitzgerald IC.A., Bowie A.G. The Toll-IL-1 receptor adaptor family grows to five members. // Trends Immunol. 2003. - V. 24 - P. 286290.

126. Ochs R.L., Smetana K. Fibrillar center distribution in nucleoli of PHA-stimulated human lymphocytes. // Exp.Cell Res. 1989. - V.184. - P.552-557

127. Ohlbaum A., Csuzi S., Antoni F. Binding of exogenous DNA by human lymphocytes and by their isolated plasma membranes. // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275, №43. P. 33655-62.

128. Ohlbaum A., Csuzi S., Antoni F. Binding of exogenous DNA by human lymphocytes and by their isolated plasma membranes. // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1979. - V. 14, № 3 - P. 165-176.

129. Oshiumi, H., Sasai, M., Shida, K., Fujita, Т., Matsumoto, M., and Seya, Т., TICAM-2: A bridging adapter recruiting to Toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-B. J. Biol. Chem. Sept. 30 Epub ahead of print. PMID: 14519765 (2003).

130. Oshiumi, H., Sasai, M., Shida, K., Fujita, Т., Matsumoto, M., and Seya, Т., TICAM-2: A bridging adapter recruiting to Toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-B. J. Biol. Chem. Sept. 30 Epub ahead of print. PMID: 14519765 (2003).

131. Palsson-McDermott E.M., O'Neill L.A. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. // Immunology. 2004. -V. 113.-P. 153-162.

132. Palucka A.K., Blanck J.P., Bennett L., Pascual V., Banchereau J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005. V. 102, № 9. - P. 3372-3377.

133. Pisetsky D.S. DNA as a marker of cell death in systemic lupus erythematosus. // Rheum. Dis. Clin. North. Am. 2004. V. 30, № 3. - P. 57587.

134. Pisetsky D.S., Drayton D., Wu Z.Q. Specificity and immunochemical properties of antibodies to bacterial DNA in sera of normal human subjects and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). // Clin Exp Immunol. -1997.-V. 109.-P. 27-31.

135. Pisetsky D.S., Gonzalez T.C. The influence of DNA size on the binding of antibodies to DNA in the sera of normal human subjects and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). // Clin. Exp. Immunol. 1999. - V. 116.-P. 354-359.

136. Prohaszka Z., Fust G. Immunological aspects of heat-shock proteins-the optimum stress of life. // Mol. Immunol. -2004. -V. 41. P. 29-44.

137. Prud'homme G.J. DNA vaccination against tumors. // J. Gene Med. 2005. -V. 7,№ l.-P. 3-17.

138. Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F., Edberg S., Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. // Cell. 2004, - V. 118. - P. 229-241.

139. Raptis L., Menard H.A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. — 1980.-V. 66, №6.-P. 1391-9.

140. Raptis L., Menard H.A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. -1980.-V. 66.-P. 1391-9.

141. Rhodes A., Wort S.J., Thomas H., Collinson P., Bennett E.D. Plasma DNA concentration as a predictor of mortality and sepsis in critically ill patients. // Crit. Care. 2006. - V. 10, № 2. - P. 60-66

142. Rock F.L.; Hardiman G.; Timans J.C.; Kastelein R.A.; Bazan J.F. A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll. Proc. // Nat. Acad. Sci. 1998 - V. 95. - P. 588-593.

143. Rogers J.C., Boldt D., Kornfeld S., Skinner A., Valeri R. Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. -V. 69. - P. 1685-1689.

144. Ruff M.R., Gifford G.E. // Lymphokines: N. Y.: Acad, press 1981. -P. 235-241.

145. Rutz M., Metzger J., Gellert Т., et al. Toll-like receptor 9 binds single-stranded CpG-DNA in a sequence- and pH-dependent manner. // Eur. J. Immunol. 2004. -V. 34. - P. 2541-2550.

146. Sano H., Morimoto C. Dna isolated from DNA/anti-DNA antibody immune complexes in systemic lupus erythematosus is rich in guanine-cytosine content.

147. J. Immunol. 1982.-V.128,№3.- P. 1341-5.

148. Sano H, Talcai O, Harata N, et al. Binding properties of human anti-DNA antibodies to cloned human DNA fragments. // Scand. J. Immunol. 1989. — V. 30.-P. 51-63.

149. Sasai M, Matsumoto M, Seya T. The kinase complex responsible for IRF-3-mediated IFN-B production in myeloid dendritic cells (mDC). // J. Biochem. -2006.-V. 139.-P. 171-175.

150. Schindler R, Mancilla J, Endres S, et al. Correlations and interactions in the production of interleukin-6 (IL-6), IL-1, and tumor necrosis factor (TNF) in human blood mononuclear cells: IL-6 suppresses IL-1 and TNF. // Blood. -1990.-V. 75.-P. 40-47.

151. Schroder N.W, Schumann R.R. Single nucleotide polymorphisms of Tolllike receptors and susceptibility to infectious disease. // Lancet. Infect. Dis. 2005.-V. 5, № 3. P. 156-64.

152. Seth R.B, Sun L, Chen Z.J. Antiviral innate immunity pathways. // Cell Res.-2006.-V. 16.-P. 141-147.

153. Seya T, Akazawa T, Tsujita T, Matsumoto M. Role of Toll-like Receptors in Adjuvant-Augmented Immune Therapies. // eCAM. 2006. - V. 3. - P. 3138.

154. Seya T, Oshiumi H, Sasai M, Akazawa T, Matsumoto M. TICAM-1 and TICAM-2: toll-like receptor adapters that participate in induction of type 1 interferons. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005.- V. 37. P. 524-529.

155. Sharma S, tenOever B.R, Grandvaux N, et al. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway. // Science. 2003. -V. 300.-P. 1148-1151.

156. Shirota H, Gursel M, Klinman D.M. Suppressive oligodeoxynucleotides inhibit Thl differentiation by blocking IFN-gamma-and IL-12-mediated signaling. // J. Immunol. 2004. - V. 173. - P. 5002-5007

157. Shlyakhovenko V.A, Olishevsky S.V., Kozak V.V., et al. Anticancer and immunostimulatory effects of nucleoprotein fraction of Bacillus subtilis 7025culture medium filtrate. // Exp. Oncol. 2003. - V.25. - P. 119-23.

158. Siess D.C., Vedder C.T,. Merlcens L.S., et al. A human gene coding for a membrane-associated nucleic acid-binding protein. // Stem Cells. 2004. -V.22, №5.-P. 725-40.

159. Silverman E.S., Drazen J.M. Immunostimulatory DNA for asthma. Better than eating dirt. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2003. -V. 28. - P. 645-7.

160. Stacey K., Young G., Clark F., et al. The molecular basis for the lack of immunostimulatory activity of vertebrate DNA. // J. Immunol. 2003. -V. 170.-P. 3614-3620.

161. Stroun M., Anker P. Prehistory of the notion of circulating nucleic acids in plasma/serum (CNAPS): birth of a hypothesis. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006 -V. 1075-P. 10-20.

162. Stroun M., Lyautey J., Lederrey C., Olson-Sand A., Anker P. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. // Clin. Chim. Acta. 2001. - V. 313. - P. 139-42.

163. Stunz L.L., Lenert P., Peckham D., et al. Inhibitory oligonucleotides specifically block effects of stimulatory CpG oligonucleotides in В cells. // Eur. J. Immunol. 2002. - V. 32. - P. 1212-1222.

164. Swaminathan R., Butt A.N. Circulating nucleic acids in plasma and serum: recent developments.// Ann N Y Acad Sci. 2006 - V. 1075, № 9. - P. 1-9.

165. Swaminathan R., Butt A.N., Circulating nucleic acids in plasma and serum: recent developments.// Ann N Y Acad Sci. 2006. - V. 1075, № 9. - P. 1-9.

166. Taguchi Т., Mitcham J.L., Dower S.K., Sims J.E., Testa J.R. Chromosomal localization of TIL, a gene encoding a protein related to the Drosophila transmembrane receptor Toll, to human chromosome 4pl4. // Genomics. -1996.-V. 32.-P. 486-488.

167. Takeuchi О., Kawai Т., Sanjo H., et al. TLR6: a novel member of an expanding Toll-like receptor family. // Gene. 1999. - V. 231. - P. 59-65.

168. Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Rykova E.Y. et al. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. // Clinical Chemistry. 2005. -V. 51.-P. 1317-1319.

169. Thijssen M.A., Swinlcels D.W., Ruers T.J., de Kok J.B. Difference between free circulating plasma and serum DNA in patients with colorectal liver metastases. // Anticancer Res. 2002. - V.22. - P. 421-5.

170. Tobias P., Curtiss L.K. Thematic review series: The Immune System and Atherogenesis. Paying the price for pathogen protection: toll receptors in atherogenesis. // Journal of Lipid Research. 2005. - V. 46. - P. 404-411.

171. Tong Y.K., Lo YM. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids.// Clin Chim Acta. 2006. -V.363, №1-2. - P. 187196.

172. Tougne C., Efler S.M., Morris M.L., et al. Co-administration of CpG oligonucleotides enhances the late affinity maturation process of human anti-hepatitis В vaccine response. // Vaccine. 2004. - V. 23. - P. 615-622.

173. Umetani N., Giuliano A.E., Hiramatsu S.H., et al. Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum. // J. Clin. Oncol. -2006. V. 24. - P. 4270-4276.

174. Umetani N., Hiramatsu S., Hoon D.S. Higher amount of free circulating DNA in serum than in plasma is not mainly caused by contaminated extraneous DNA during separation. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. - V. 1075. - P. 299307.

175. Umetani N., Kim J., Hiramatsu S., et al. Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer:direct quantitative PCR for ALU repeats. // Clin. Chem. 2006.- V. 52 -P. 1062-1069.

176. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averiging of multiple internal control genes. // Genome Biol. 2002. - V. 18. - P. 7-14.

177. Vernon S.D., Shukla S.K., Conradt J., Unger E.R., Reeves W.C. Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA from plasma of chronic fatigue syndrome and non-fatigued subjects. // MC. Microbiol. — 2002. V. 23-P. 2-39.

178. Verthelyi D., Klinman D.M. Immunoregulatory activity of CpG oligonucleotides in humans and nonhuman primates. // Clin. Immunol. 2003. -V. 109.-P. 64-71.

179. Viglianti G.A., Lau C.M., Hanley T.M., et al. Activation of autoreactive В cells by CpG dsDNA. // Immunity. 2003. - V. 19. P. 837-847.

180. Vogel S.N., Fitzgerald K.A., Fenton M.J. TLRs: differential adapter utilization by toll-like receptors mediates TLR-specific patterns of gene expression. // Mol. Interv. 2003. - V. 3. - P. 466-477

181. Vollmer J. Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9. // Expert. Opin. Biol. Ther. 2005. -V. 5.-P. 673-682.

182. Vollmer J. TLR9 in Health and Disease. // Int. Rev. of Immunology. 2006. -V. 25.-P. 155-181.

183. Vollmer J., Weeratna R.D., Jurk M., et al. Oligodeoxynucleotides lacking CpG dinucleotides mediate Toll-like receptor 9 dependent T helper type 2 biased immune stimulation. // Immunology. 2004. -V. 113 - P. 212-223.

184. Wagner H., Bauer S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. // JEM V.203, № 2, - P. 265-268

185. Wagner S., Weber J., Redman Т., et al. CPG 7909, a TLR9 agonist immunomodulator in metastatic melanoma: A random- ized phase II trial comparing two doses and in combination with DTIC. // J. Clin. Oncol. 2005.-V. 23 (16 suppl) P. 7526.

186. Wang B.G., Huang H.Y.,Chen Y.C., et al. Increased plasma DNA integrity in cancer patients. // Cancer Res. 2003. - V. 63. - P. 3966-3968.

187. Wang C., Deng L., Hong M., et al. TAK1 is a ubiquitin-dependent kinase of MKEC and IKK. // Nature. 2001. - V. 412. -P. 346-351.

188. Wang H., Rayburn E., Zhang R. Synthetic oligodeoxynucleotides containing deoxycytidyl-deoxyguanosine dinucleotides (CpG ODNs) and modified analogs as novel anticancer therapeutics. // Curr. Pharm. Des. 2005. - V. 11. — P. 2889-2907.

189. Wild J.S., Choudhury B.K., Sur S. CpG DNA modulation of allergic asthma. // Isr. Med. Assoc. J. 2002. - V. 2. - P. 13-15

190. Wu X., Peng S.L. Toll-like receptor 9 signaling protects against murine lupus. // Arthritis Rheum. 2006. - Jan;54(l):336-42.

191. Yamamoto M., Sato S., Hemmi H., et al. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4. // Nature. -2002.-V. 420.-P. 324-329.

192. Yamamoto S., Yamamoto Т., Shimada S., et. DNA from bacteria, but not from vertebrates, induces interferons, activates natural killer cells and inhibits tumor growth. // Microbiol. Immunol. 1992. - V.36. - P. 983-997.

193. Yasuda K., Rutz M., Schlatter В., et al. CpG-motif independent activation of TLR9 upon endosomal translocation of "natural" phosphodiester DNA. //Eur. J. Immunol. 2006. - V. 36 - P. 431-6.

194. Yasuda K., Yu P., Kirschning C.J., et al. Endosomal translocation of vertebrate DNA activates dendritic cells via TLR9-dependent and -independent pathways. // J. Immunol. 2005. - V. 174. - P. 6129-6136.

195. Yasuda, K., Ogawa Y., Yamane I., Nishikawa M., Takakura Y. Macrophage activation by a DNA/cationic liposome complex requires endosomal acidification and TLR9-dependent and -independent pathways. // J. Leukoc. Biol. -2005. -V. 77. P. 71-79.

196. Yoneyama M.5 Kikuchi M., Natsukawa Т., et al. The RNA helicase RIG-Ihas an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. 11 Nat. Immunol. 2004. - V. 5. - P. 730-737.

197. Zarember K.A., Godowski P.J. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. // J. Immunol. 2002. -V. 168.-P. 554-61.

198. Zhong В., Tien P., Shu H-B. Innate immune responses: Crosstalk of signaling and regulation of gene transcription. // Virology. 2006. - V. 352. -P. 14-21.

199. Zhong X.Y , Hahn S., Kiefer V., Holzgreve W. Is the quantity of circulatory cell-free DNA in human plasma and serum samples associated with gender, age and frequency of blood donations. // Ann. Hematol. 2006. - V. 86. - P 139143.