Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фоточувствительность изоформ лактатдегидрогеназы в присутствии некоторых химических агентов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фоточувствительность изоформ лактатдегидрогеназы в присутствии некоторых химических агентов"

я» N

пГ11 ^ На правах рукописи

Лысенко Юлия Александровна

ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ИЗОФОРМ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ НЕКОТОРЫХ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

03.00.02 — Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж — 1999

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ. профессор Артюхов В.Г.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук.

Ведущая организация: Московский государственный университет

Зашита диссертации состоится 14 декабря 1999 года в 13— на заседании диссерташ ного совета Д 063.48.11 при Воронежском государственном университете по адр 394693. г. Воронеж. Университетская площадь. 1

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронеже госуниверситета

профессор Холмогоров В.Е.,

доктор биологических наук, академик МАИ.

профессор Пашков А.Н.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема выявления механизмов фотохимических и фо-зических процессов, происходящих в полимерных макромолекулах под действием ческого излучения, имеет междисциплинарный, характер. Воздействие квантов све-i>- и видимого диапазона шкалы электромагнитных колебаний на биосистемы по* > положительного эффекта (образование витамина Д, увеличение неспецифической :тентности, лечебное действие при некоторых кожных заболеваниях и т. д.) может одить и к негативным последствиям (ожоги кожи и глаз, старение кожи, каниероге-иммуносупрессия и др.). Вид н степень фотоповреждения определяются спектром гвня и дозой облучения. Появление фотобиологических эффектов в области длин более 280 нм. пропускаемой озоновым слоем атмосферы, вызвано, в основном, рении с участием фотосенсибилизаторов. В реальных биологических системах в каче-последних могут выступать кофериенты, витамины и другие внутриклеточные ме-гиты. Известно, что фотосенсибилизирующие свойства могут проявлять некоторые зственные препараты, пищевые красители. Для ряда прикладных направлений фомин и медицины (фотодинамическая терапия онкологических заболеваний (J. Моаи. iristeansen. 1980; S.G. Brown, 1983)) необходимо иметь возможно более фоточувст-пьные системы: с целью стабилизации и защиты полимеров приходится решать ивоположную задачу — торможения фотохимических реакций. Поэтому актуаль-является вопрос о регулировании скоростей этих процессов. Особенности фотохн-полимеров связаны со сложностью макромолекул, зависимостью их свойств и ре-онной способности от конформаиии. а также с многостадинностью протекания фо-дификационных процессов и участием в них промежуточных соединений. Важную роль в фотоокислении биологических молекул играют активные формы орода: синглетный молекулярный кислород — !02; супероксидный анион радикал it; гидропероксидный радикал — НО,; радикал гидроксила — ОН, а также перок-зодорода — !bOv Фотосенсибилизированные реакции с участием '02 широко рас-транены и названы фотореашиями типа П. Окислительная активность 'От прибли-]ьно в 100 раз выше таковой 302. Потенциальными источниками генерации 'О; в огических и модельных системах могут являться различные световые и темновые ессы: генерация '02 синглетными и триплетными состояниями фотосенсибилизато-дисмутация Q], продуцирование 'Ог системой миелопероксидаза-НгОг-гипохло-нри активации фагоцитов и т. д. В процессе клеточного метаболизма образуются е другие активные формы кислорода, в частности, высокореакционноспособнын кал гидроксила, обладающий сильнейшим цитотоксическим действием. В норме организм имеет мощную антиоксидантнуто и фотопротекторную системы [ты. Но при различных патологиях и действии экстремальных факторов необходимо

предусматривать дополнительные меры, повышающие устойчивость к фотоокисле или избирательно уменьшающие таковую (при фотодинамической терапии).

Основная задача состоит в том, чтобы оценить реальный вклад реакции каи активной частицы в сложный процесс фотодеструкции, определить константы скор образования (выхода) различных интермедиатов для целенаправленного управ.т происходящими в изучаемой системе изменениями. Следовательно, в этом плане буются количественные исследования фотоокисления биологических соединений, ходя из вышеизложенного, представляется актуальным проведение эксперимента модельных объектах с использованием биомакромолекул и экзогенных фотопротеь ных агентов с известным характером действия, в частности, способных селективно минировать определенные формы "активированного" кислорода, для оценки возмо: го участия последних в фотоиндуцированных процессах, развивающихся в биосисте

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось выявление особенно прямых и сенсибилизированных фотохимических модификаций изоферментов лакгг гндрогеназы (ЛДГ) при воздействии оптического излучения различного спектраль состава в условиях модуляции их фоточувствительности акцепторами активных (] кислорода и внутриклеточным» метаболитами.

Задачи работы предусматривали: 1) исследование каталитической активное спектрально-люминесцентных характеристик лактатдегидрогеназы при УФ-облучении в присутствии дезактиваторов еннглетного кислорода (Д-каротина. тидина и азида натрия); акцепторов ОН-радикалов (О-маннита и третичного бутан конфор.чаинонного кофактора— МАОН: 2) изучение характера изменения кине1 ских параметров связывания лактатдегидрогеназой субстрата при УФ-облучении в сутствии азида натрия и О-маннита; 3) сравнительный анализ кинетических коне УФ-инактивацнн сердечной и мышечной изоформ лактатдегидрогеназы в присутс некоторых потенциальных фотопротекторов; 4) измерение инфракрасных спектро! глошения азида натрия в присутствии ЛДГ с целью уточнения механизма протектор действия модификатора; 5) изучение сенсибилизированного метиленовым голубы л тоокисления изоформ ЛДГ при широком варьировании концентраций белка и экз< ного соединения; 6) определение степени УФ-инактивации смеси изоформ тканс экстракта сердца свиньи.

Научная новизна. Впервые проведены систематические исследования, посвя ные сравнительнму анализу структурно-функциональных изменений отдельных форм ЛДГ, УФ-облученных в присутствии широкого спектра соединений, являюи как внутриклеточными метаболитами, так и экзогенными веществами. Выявлена синглетного молекулярного кислорода в процессе фотоинаггивации мышечной изс мы ЛДГ при ее УФ-облучении в дозе 2,27 кДж/м2. Показана возможность окис;

Г (М4) синглетным кислородом при его внешней генерации. Вычислены константы роста фотоинактивации и время полупревращения ЛДГ (Н4) и (М4). Изучено сенсн-шзированное метиленовым голубым фогоокисление язоформ ЛДГ, определен вклад го динамического действия красителя в процессах фотохимического превращения мо-ул лактатдегидрогеназы. Исследована УФ-чувствительность смеси изоферментов левого экстракта сердца свиньи, что может оказаться полезным для дальнейшей разотки критериев фотохрЧнческого поведения фермента в клетке.

Практическая значимость. Полученные результаты расширяют теоретические дставления, касающиеся механизмов фотохимических превращений сложных белков рксутствии экзогенных соединений; участия активных интермедиатов (например, 'СЬ !Н-радикалов) в фотомодифнкационных процессах белковых систем. Результаты экс-1Иментов будут способствовать разработке теоретических основ протекторного и сен-¡илизирующего действия различных модифицирующих агентов, фотодинамической алии онкологических заболеваний; выяснению условий избирательного повреждения I защиты биомакромолекул в различных режимах их облучения. Полученные данные ут быть использованы при чтении студентам биологических факультетов универсн-ов обших и специальных курсов: "Биофизика", "Физико-химическая биология", эгобиология". "Химическая энзимология". "Экологическая биофизика".

Апробация работы. Материалы работы рассмотрены и доложены на Всероссий-й конференции "Физико-химические основы и практическое применение ионооб-<ных процессов" (Воронеж. 1996); I и II Всероссийских конференциях фотобиологов /щино, 1996, 1998): Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" юдно. 1996); II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и ¡спективы их практического использования" (Пушино, 1997); Международной школе роблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998); Международной конференции олекулярные механизмы функционирования сложных белков и их комплексов" (Во-геж, 1998); V Международной конференции "Биоантиоксидант' (Москва. 1998>; альской конференции .молодых ученых "Физика в биологии и медицине" (Екатерин-1г. 1999); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверсистета (1996; 1998;

'9).

На защиту выносятся следующие положения.

1. 3 -Каротин, Б-маннит, азид натрия, гистндин, третичный бутанол, серотонин и .ОН являются модуляторами фоточувствительности лактатдегидрогеназы при ее >-облучении (240-К590 нм) в дозе 2,27 кДж/м2. Результирующий эффект (сенсибилиза-I или протекторное влияние) определяется концентрацией модификатора.

2. Синглетный кислород относится к числу промежуточных продуктов процесса Мшакгивации ЛДГ.

3. Процессы фотоинактивацяи мышечной и сердечной изофор.м лактатдегидрс назы в свободном состоянии и в присутствии D-макнига и серотонина относятся к ка гории мономолекулярных реакций первого порядка; it смеси с азидом натрия поря, реакции сменяется на нулевой.

4. Метиленовый голубой (МГ) является сенсибилизатором инактивации ЛДГ и форм Mi и Н4 как при его возбуждении в видимом, так и в УФ-спектральном диапа нах; повреждающий эффект определяется количестве:тым соотношением молекул Л и МГ. Роль динамического действия МГ (участие '02) и его сенсибилизирующий эфф существенно возрастают при иммобилизации красите, н на силикагеле.

5. Схемы возможных реакций, развивающихся t системах ЛДГ-NADH и ЛДГ-.N при действии УФ- и видимого света.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает/^* страниц маши писного текста, 7 табл.. 29 рис. Состоит из Введении. 8 глав. Заключения и Вывод Список литературы содержит ^^йсточников, из них отечественных и £

рубежных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ. И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОФОРМ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ. ИХ ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦ1 IJ1. РОЛЬ В У1ЕТАБОЛИЧ E'.CKI LX ПРОЦЕССАХ В главе представлены данные о структуре и функциональных особенностях и форм лактатдегидрогеназм.

ГЛАВА 2. ФОТОХИМИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ И

МОДУЛЯЦИЯ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ Описываются основные типы фотохимических реакций, развивающихся при не средственном поглощении света биополимерами и и:с фотосенсибилизироваьном ок лении.

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования использовались следующие изоферменты л татдегидрогеназы (L-лакгат: НАДт-оксидоредуктаза, К.Ф.: 1.1.1.27): а) ЛДГ (М4) из с летных мышц свиньи, полученная перекристаллизации сульфатом аммония коммер ского препарата O'Reanal", Венгрия); б) ЛДГ (Н4), выделенная из сердца свиньи пу двукратного осаждения сульфатом аммония и ацетоном с последующей троекратной рекристаллизацией (Г.А. Кочетов, 1980); в) тканевый экстракт сердца свиньи, содер щий 5 изоформ ЛДГ с преобладанием ЛДГ (Н4) (C.i:. Северин, Г.А. Соловьева, 19! Обессояивание растворов ЛДГ осуществляли методом гель-проникающей хроматм фии на колонке 1,5X15 см, упакованной Sephadex Cr-50 (fine; "Pharmacia'', Швец

центрацию растворов ферме t та измеряли на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО", :ия) при длине волны 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции ■ Ю3 л(моль-см)"' для мышечной и 1,96-104 л(моль-см)"1 для сердечной изоформы. гржакие общего белка в тканевом экстракте сердца свиньи определяли методом Ло-

Ферментативную активное". лактатдегидрогеназы регистрировали спектрофото-¡ически при 340 нм по реакции восстановлении пирувата натрия до лактата натрия, ювождаюшейся окислением НАДН.

УФ-облучение растворов производилось в кювете с двойными стенками для тер-гатирования (20±1 °С) при постоянном перемешивании магнитной мешаткой с нс->зованием ртутио-кварцевой л 1мпы типа ДРТ-400 и светофильтра УФС-1 с диапазо-светопропускания 240-К390 нм. Интенсивность облучения — 151 Дж(м:-мин)"'. Пешком света для фотосенсибилизнрованного окисления образцов служило устройст-ии локального облучения красным светом ''УЛОКС". изготовленное по лазерной ологии на основе трехкомпоьентного твердого раствора гелия, мышьяка и алгоми-

(Воронежский филиал государственной научно-производственной фирмы кротек"). Длина волны максимума излучения — 665±15 нм; диапазон излучения — -700 нм; выходная интенсивность излучения — 20 мВт/см". Источник располагался асстоянии 3 см от образца.

Методом хроматографии на гелях декстрана (Sephadex G-I50 (fine), "Pharmacia", ция) определялись величины жкуихихся молекулярных масс лактатдегидрогеназы в :п с модификаторами. Размеры хроматографической колонки— 1.5X50 с.м. Элюцшо 13водили раствором 0.1 моль/л Ка-фосфатного буфера (pH 7.4).

Регистрацию электронных слектров поглощения растворов ЛДГ и ее смеси с раз-1ыми модификаторами осуществляли на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО'". Рос-в диапазоне длин волн 210-к>40 нм. Для снятия спектров фотофлуоресценции ЛДГ шьзовалн установку, изготовленную на кафедре биофизики ВГУ (Г.А. Вашанов. '). на основе монохроматора спектрофотометра СФ-4А и фотоумножителя ''- 18А.

Для анализа спектральных свойств азида натрия в ИК-диапазоне применяли таб-и. изготовленные методом прессования с избытком КВг. Регистрацию ИК-спектров дествляли на спектрофотометр Specord-M80 ("Carl Ceiss", Германия) в диапазоне

1-1600 см"1.

Электрофоретические характеристики ЛДГ исследовали методом :-электрофореза в полиакрила\(идном геле (Г. Маурер, 1971; Э. Гааль и соавт., 1982). сперименте использовали буферную систему со значением рН8,3; концентрирую-и разделяющий мелкопористЕ 1Й (7 %) гели.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на ПЭВМ -IBM PC/AT. Достоверность отличий контрольных, и экспериментальных результ оценивали при помощи t-критерия Стыодента. Расчет параметров линейных функ аппроксимирующих экспериментальные данные, осуществляли методом наимень квадратов.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛДГ ИЗ МЫТ . СВИНЬИ ПРИ ФИКСИРОВАННОЙ ДОЗЕ УФ-ОБЛУЧЕНИЯ В ПРИСУТСТВИИ НЕКОТОРЫХ МОДИФИЦИРУЮЩИХ АГЕНТОВ

А.% ' _ А, % ■ _

100

90 80 70

60 50

(а)

* *

А,

А.

100 90 80 70 60 50

(б)

А,'."

100

90

SO

70

60

50

(с)

А,

•Рис. I. Изменение ферментативной тивностн ЛДГ УФ-облученной в сутствии азида натрия (а,). Р-каротин Э-маннита (б), гистидина (в); по оси цисс — концетрации экзогенного соед ния (моль/л); по оси ординат—- ферме тивная активность. %: А) — активность тивного фер.мента; А; — УФ-облучен фермента; активность УФ-облученной с; при различных добавках модификаторе. 1— б,6-Ю'3; 2 — 6.6-10"4 ; 3— 3.2-10" 1— 3,3-10° ф-каротин); 2 — 5,5 (О-.маннит): 3 — р-каротин + О-маннит 1 — 1,3-Ю-': 2 — 1,3-10"2; 3 — 3,3-10"2: * линия от уровня А: статистически не дс верны; * — отличия от уровня А| стати чески не достоверны

бутанол и D-маннит -

J Алифатические • спирты— трети1

являются эффективными акцепторами ОН-радикалов.

УФ-облучении (2,27 кДж/м ) ЛДГ из мышц свиньи (изоформа М4; МО" моль/л) в

*

:тш1и третичного бутанола (12,2-10' моль/л) регистрируется ярко выраженный сен-шшзлругощий эффект: фотоинактивацня ЛДГ т 28,2 % выше таковой белка, облу-ного в свободном состоянии. Б-маннит (5-10"6 моль/л) обнаруживает протекторное ствие (6,8 %) (рис. 1, б).

Далее были проведены эксперименты по исследованию уровня инактивации ЛДГ в 1сутствии: а) неорганического тушителя 'Ог — азида натрия; б) р-каротина. взаимо-ствующего с 'СЬ преимущественно по физическому механизму; в) гистндина (акцеп-'0:); г) кофактора лактатдегидрогеназы — МАОН. Использование №N3 (рис. 1, а) в ценграшш 3.2-10° моль/л индуцировало резкое увеличение активности -облученной ЛДГ по сравнению с контролем. При фотомодификации смеси ЛДГ с аротнном (2,4-10"7 моль/л. масляный раствор р-каротииа в концентрации 2.1 мг/.мл. творенный в этаноле) не наблюдалось статистически достоверных отличий уровня .ктнвации ЛДГ в присутствии потенциального протектора от контрольного Р-облучение без Р-каротина). Р-Каротин в концентрации 3,3-10° моль/л (инклюзион-\ комплекс модификатора с Р-цнклодекстрином) (рис. 1, б) оказывает защитное дей-ие по отношению к УФ-облученным молекулам ЛДГ (фотопротекторный эффект со-вляет 18.1%). Гистидин (3.3-10"' моль/л) снижает степень инактивации ЛДГ на 3% (рис. 1. в), что согласуется с данными, полученными при использовании аротина. •

>0 Ю

;о ¡о ю >о

о

1-

-"Г

..А .

Л:- -л - У

-Ч ;

- Ч':'

■ у">

А, % 110г

100 90 80 70 60 50 40

(б)

Рис. 2. Изменение ферментативной активности ЛДГ (М4), УФ-облученной в при-гствии ЫАЭН и р-каротина различных концентраций (моль/л): а) светофильтр УФС-1:

- контроль; 2 —УФ-облучение в дозе 3,02 кДж/м2; то же +■ ЫАБН: 3 — 2,5-10°; 4 — О"6; 5 — 4-10"7; б) светофильтр УФС-б: I — контроль (ЛДГ без облучения); 2 — ЛДГ. '-облученная в течение 30 мин; 3 — ЛДГ, УФ-облученная в течение 30 мин + ЫАОН Г1); 4 — ЛДГ, УФ-облученная в течение 30 мин + ЫАОН (10"4) + р-каротин (3,3-10°);

- ЛДГ, УФ-облученная в течение 30 мин + ЫАБН (Ю"4) + Р-каротин (1-Ю"1)

Четко выраженный эффект аддитивности действ-я каротина и маннита (рис. 1 является косвенным подтверждением того, что их протекторное действие связано с ( лизацией различных каналов защиты белка от УФ-повреждения — элиминирован: 'Ог и ОН-радикалов соответственно.

При введении в облучаемую систему (растиор ЛДГ 1 • 10"н моль/л) NA (4-10"7 моль/л) эффект ингиоирования каталитической активности биокатализатор присутствии кофактора оказался на 13,0 % выше такоиого для ЛДГ. облученной в с бодной форме: в присутствии кофермента 4-Ю"6 и 2,5 Ю'^ моль/л степень инактива1 на 9,3 и 16.0 % ниже таковой ЛДГ, облученной оез кофактора (рис. 2, а). Г УФ-облучении ЛДГ (2-10"4 моль/л1 в присутствии КАОН (10° моль/л) светом лампы па ДРТ-400. выделяемым светофильтром УФС-6 (300-Н00 им), в течение 30 мин про ходит снижение каталитической активности белка на 22.4 % (в то время как свободн фермент в этих условиях не подвергается инактивации) (рис. 2. о). Добавление в слс му до облучения р-каротина (3.3-10~в и 3.3- ¡0° моль/л: комплекс с, (З-цикподекстриш не вызывало статистически достоверных изл( нений степени инактива!. УФ-облученного фермента. Этот факт, по-видимому, сзидетельствует о том. что пов ждающий эффект экзогенного агента не связан с генерацией МАОН синглетного мо куляриого кислорода. Анализ экспериментальных и литературных данных позвол; предложить схему возможных реакций, развивающихся в системе ЛДГ-МАОН при УФ-облучении (рис. 3).

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ФОТОИНАКТИВАШ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФОРМ ЛДГ В ПРИСУТС ТВИИ НЕКОТОРЫХ ФОТОПРОТЕКТОРОЕ

Зависимость остаточной активности ЛДГ (НО"* моль/л) от времени УФ-облучен в полулогарифмическом масштабе (рис.4, а) аппроксимируется линейной функцш Для нативной ЛДГ к, (константа скорости фото! нактиваиин) оказалась раен 5.39-107* 1/с. Время полупревращения ЛДГ (период, в течение которого каталитнческ активность белка уменьшается на 50%) в этом случае составит (Ю.Г. Фролс В.В. Велик. 1993): Г|; = 1п2/к = 21 мин. Для ЛДГ (2-Ю"9 моль/л) к, существенно выше 3.05-Ю""' с'1. ^ ;= 3:8 мин. следовательно, фоточувстви-;льность фермента при разве; нии увеличивается.

При введении в облучаемую систему азида натр! л (3,2-Ю'3 моль/л) дозовая зав симость описывалась прямой, а в полулогарифмически« координатах— квадратичи функцией. То есть реакция фотоинактивации имеет и/левой порядок и описывает функцией (Ю.Г. Фролов, В.В. Велик, 1993): А = А0-к,1. Облучение ЛДГ в присутств! О-маннита и серотонина сопровождалось снижением ее фоточувствительности: ко

нты фотоинактивации— 4,0- 1СГ4 1/с и 3,5-10"4 1/с соответственно. Время полупре-ицения — 29 мин (Э-маннит) и 33 мин (серотонин).

Рис. 3. Гипотетическая схе1.:а процессов, развивающихся в системе ЛДГ^АЭН и ее УФ-облучении

Для ЛДГ (Н^) кг= 1,41-КГ1 1/с; ^ = 28 мин, что позволяет сделать вывод о мень-:й фоточувствительности гомсгетрамера Н4 по сравнению с Мд. При добавлении в створ ЛДГ до облучения азидг. натрия остаточная ферментативная активность оказа-сь выше таковой для облучен той в соответствующих дозах свободной изоформы. «ализ полученных данных позволяет сделать заключение о неоднонаправленном ха-

рактере действия модификатора: максимальный эффект ингибирования процесса фотоинактивации белка азидом натрия наблюдается для ЛДГ (МО при дозах облучения 3,02-6,04 кДж/м2, а по отношению к ЛДГ (НЦ) — 6,04-9,06 кДж/м5. ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ ВЕЩЕСТВ ПО ОТНОШЕНИЮ К ИЗМЕНЕНИЮ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ УФ-ОБЛУЧЕННОЙ ЛДГ Спектр поглощения лактатдегидрогеназы (М4) в диапазоне длин волн 240-340 им . характеризуется минимумом при 250 им и максимумом при длине волны 280 им. Фото-индуцированные дозой 2.27 кДж/м" (рис. 5) изменения фермента не затрагивают величину оптической плотности в максимуме поглощения белка, а выражаются в увеличении светопоглощения в минимуме (250 нм) и при длинах волн > 290 нм. Доза 4.53 кДж/'м" вызывает увеличение интенсивности абсорбции (А = 280 нм) на 8 %. Кроме того, после этой энергетической экспозиции наблюдается более значительное повышение оптической плотности в коротковолновой (по отношению к максимуму) и длинноволновой областях спектра (> 300 нм). При облучении фермента в дозе 2.27 кДж/м' в присутствии спектр поглощения белка не отличается от нативного (рис. 5).

1пА/А(, 1пА/А(1

Рис. 4. Кинетические кривые фотоинактивации лактатдегидрогеназы (М4) (а) и (Н4) (б)'П'Ю"в моль/л) в присутствии некоторых фотопротекторов: а) 1— нативная ЛДГ; ЛДГ, УФ-облученная в присутствии модификаторов: 2 — азида натрия (3.2-10"3 моль/л); 3 — Б-маннита (5,5-10° моль/л); 4— серотонина (МО'3 моль/л); 5 — ЛДГ 2-10"''> моль/л; б) 1 — нативная ЛДГ; 2 — ЛДГ в смеси с азидом натрия

УФ-модификация ЛДГ в дозе 2,27 кД>к/м2 в присутствии этанольного раствора Р-каротина в масле (2,4-10'7 моль/л) не сопровождается изменением повышенной по отношению к контролю оптической плотности в минимуме экстинкцик, а фотомодификация в дозе 4,53 кДж/м2 с аналогичной концентрацией каротина влечет за собой значи-

ьный рост оптической плотности на всем протяжении спектра поглощения биополи->а.

О I, отн. ед Рис. 5. Электронные

спектры поглощения и фотофлуоресценции ЛДГ, УФ-облученной в присутствии азида натрия: В — оптическая плотность; I — интенсивность фотофлуоресценции, отн. ед.; спектры поглощения и фотофлуоресценции соответственно: 1, 1*— нативной ЛДГ; 2. 2* — УФ-облученной ЛДГ; 3, 3* — ЛДГ, УФ-оолученпой в присутствии №N3

При

оолучении

ЛДГ

(1-Ю'моль/л) (рис.5) в дозе 2,27 кДж/'м2 изменений положения экстремума эмиссии не происходит, лишь снижается интенсивность излучения. При .■чении смеси белок-О-манниг спектры флуоресценции ЛДГ. облученной в свобод-состояний и в присутствии спирта, статистически достоверно не отличались друг от ~а. Однако при оолучении ЯД ' с азидом натрия спектры эмиссии фермента не предают изменений при УФ-облучении в применяемой дозе (рис. 5).

, %

1900

2000

2100

2200

Рис. 6. ИК-спектры светопропускания азида натрия в присутствии различных концентраций ЛДГ (моль/л): 1 — ЛДГ 10""; 2 — МаМ,: 3 — Х-'аМ;

ЛДГ 10"': 4 — МаЫ, + ЛДГ 10""

В качестве одного из механизмов протекторного действия азида натрия по отношению к ингибированию процессов УФ-инактивации ЛДГ можно предположить

—г I I

?300 см-1 комплексирование этого лиганда с белковой мак-

ромолекулой. К числу информативных методов исследования межмолекулярных вза модействий относится инфракрасная (ИК) спектроскопия (Н.Г. Бахшиев, 1972). Nat абсорбирует кванты ИК-излучения именно в том диапазоне, где у белков наблюдает! "полоса прозрачности": для ЛДГ— 2400-=-1800 см"1 (рис. 6). Таким образом, трансфо мации спектра поглощения азида натрия, регистрируемые в этой области, будут свид тельствозать о наличии изменений колебательных частот NaNt, вызванных взаимоде ствием с ЛДГ.

На рис. б представлен ИК-спектр светопропускания образца азида натрия, выс шенного из Na-фосфатного буфера (1 ммоль/л; pH 7,4) и аналогичный спектр в смеси ЛДГ (1-Ю'7 и 10"° моль/л). Спектр поглощения NaN? имеет максимум поглощения п[ 2140 см'1 и минорный пик (2040 см*1), не характерный для азида натрия, полученного водного раствора. При введении в систему ЛДГ (10"7 моль/л) наблюдается смещеш главного пика экстинкции NaN3 на 10, а в присутствии ЛДГ (10'" моль/л) — на 30 см"'.

Изменение ИК-спектралъных характеристик происходит уже при концентрат ЛДГ 10"7 моль/л (соотношение молекул модификатор-белок— 1:0.000031). Это мои; свидетельствовать о том. что число молекул протектора, связанного с одной молекул фермента, чрезвычайно велико.

Комплексирование с лигандо.м может отразиться на изменении объемных пар метров макромолекулы или ее четвертичной структуре (диссоциация на субъединт или агрегация). Показателем этих изменений может являться величина кажущейся м пекулярной массы биополимера. Для ее анализа мы использовали метод хроматограф| на гелях декстрана (Sephadex G-150). Величины объемов выхода белка из колонки в i тивном состоянии и в присутствии азида натрия и D-.маннита статистически достовер не отличаются от контрольных. Следовательно, возможные конформационные изме; ния молекулы ЛДГ носят локальный характер и существенно не затрагивают величи объемной плотности белковой глобулы.

Для выявления возможных особенностей кинетического поведения биополиме М4 при его УФ-облучении в свободном состоянии и в присутствии NaNj и D-манни мы исследовали кривые "насыщения" фермента субстратом (пируват натрия) п •УФ-облучении в дозах 4.53 и 9,06 кДж/м2. Обработку полученных данных производи методом Иди-Хофсти в координатах [V; V/S] (Т. Келети, 1990). Результаты эксперта та представлены в табл. 1, из которой следует, что УФ-облучение в различных доз оказывает неоднонаправленное воздействие на изменение величины константы Ми; элиса — облучение нативного фермента в дозе 4,53 кДж/м2 сопровождается уменьши ем К,„ ЛДГ и снижением величины максимальной скорости ферментативной реакщ УФ-модификация в дозе 9,06 кДж/м2 практически не затрагивает величину констаи

[ихаэлиса, но вызывает снижение максимальной скорости согласно экспоненциальной висимости.

Таблица 1

[зменение каталитических параметров ЛДГ, УФ-облученной в присутствии некоторых

модификаторов

№ Исследуемые образцы К„„ ммоль/л V™, отн. ед.

1 ЛДГ (нативный фермент) 0,18 1

2 ЛДГ, УФ-облученная в дозе 4.53 кДж/м2 0,15* 0,42

3. то лее (2) -ь N314,- 0,15* 0,71

4 ЛДГ, УФ-облученная в дозе 9.06 кДж/м2 0,19 0,39

5 то же (4) +■ N3141 0,17 0.62

6 то же (4) 4- О-маннит 0.18 0.41

Примечание: * — отличия от контроля (№ 1) статистически достоверны, уровень ачимости — 95%

При облучении фермента в присутствии азида натрия эффект ингибирования мак-мальной скорости ЛДГ оказался ниже, чем для свободного белка, а значение констан-I Михаэлиса статистически достоверно не отличалось от контрольной величины (для-гиеной ЛДГ и фермента, облученного в соответствующей дозе). ЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ СЕНСИБИЛИЗИРОВАННОГО МЕТИЛЕНОВЫМ ГОЛУБЫМ ФОТООКИСЛЕНИЯ ИЗОФОРМ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Спектр поглощения метиленового голубого характеризуется экстремумами в УФ-зидимой области спектра. С целью модуляции фотосенсибнлизнруюшеи активности нами были использованы различные режимы его фотовозбуждения ("активации"): пучение в УФ-диапазоне; облучение в видимой области спектра; облучение в видимой тасти спектра при иммобилизации красителя на силикагеле.

Облучение ЛДГ (М4) (10"8 моль/л) красным светом (АП1;1Х= 665=15 им) в течение ¡5 н с МГ в концентрациях 10"°: 10° и КГ1 моль/л сопровождалось эффектом сенсибили-ши (рис. 7, а): каталитическая активность ЛДГ снижалась на 26,7±6.0: П.СЫ.З и 4±2.6 % соответственно. Для концентрации МГ (Ю"6 моль/л) в присутствии азида на-1я активность фермента после его облучения составляет 87,8±3.6 %. Следовательно, в [х условиях фотоинактивация ЛДГ протекает с участием сипглетного кислорода. Для ,Г (10"? моль/л) функциональная активность убывает с ростом концентрации красите-и инактивация достигает максимальной величины (23,2±4,5 %) при концентрации [сибилизатора 10"4 моль/л (рис. 7, б). По отношению к ЛДГ (10'6 моль/л) максималь-: фотосенсибилизирующее действие обнаруживается для МГ (10"6 моль/л) и составля-

ет 30,0±4,0 %, а остаточная активность трия, — 90,3±2,4 %(рис. 7, в).

С (МГ), моль/л

I, обличенного в присутствии азида !

С (МГ), моль

С (МГ), моль/л

I не. 7. Зависимость ферментат ной активности ЛДГ (М4) (10"' мол! (а); (10'' моль/л) (б); и (10"*' моль/л) облученной красным светом в прису1 вин азида натрия, от концентрации тележного голубого: Ао - активно ферме та. облученного в течение 15 \ красшш светом без модификатор 1 — ЛДГ: 2 — ЛДГ - МаЫ, (3.2-моль/х:)

Но отношению к сердечной I-форме ЛДГ при равенстве моляр! концентраций фермента и красит (10'" моль/л) обнаруживается фотош

тивация белка, причем ее величина совпадает с таковс-й мышечной изоформы и сос ляет 31.7=6.1 %. Добавление в эту смесь до облучения азида натрия приводит к полн ингпбированшо процесса фотоинактивации биокатали:атора.

Данные, полученные при действии интегрального потока УФ-света (240-К390 на систему ЛДГ-МГ (табл. 2), свидетельствуют о том. что сенсибилизирующее дейст МГ (10'6 моль/л) выявляется по отношению к ЛДГ по всем диапазоне используе; концентраций и нивелируется при увеличении дозы «излучения до 2,27 кДж/м". При облучение (2,27 кДж/м2) ЛДГ (10"7 моль/л) с МГ (К)"6 моль/л) в присутствии МА (10"й моль/л) не сопровождается ингибированием актизкости ЛДГ. Краситель в кон! трации 10"4 моль/л оказывает сенсибилизирующее дей:твие при обеих дозах облучен

Таблица 2

Остаточная активность (%) ЛДГ(М4), УФ-облученной в присутствии МГ

: (ЛДГ), моль/л 10"8 ю-7 Ш6

- (МГ), моль/л — 10"6 — 10"6 — Ю"4

Доза облуче- 0,76 91,4+1,7 81,8±3,8 93,1+3,2 71,5±9,5 88,3+3,4 79,7±2,3

ния, кДж/м2 2,27 69,5+6,5 65,3±3,7 — — 77,2±0,9 72,8±1.0

Иммобилизация красителя ¡-а нерастворимой подложке существенно изменяет его этохимическне и спектральные свойства (А.Н. Теренин. 1967). Мы использовали в ка-стве носителя силикагель (БШсице! I 5/40 ц. для хроматографии; "ЬасЬета". Чехосло-кия). При облучении ЛДГ :Т0'7 моль/л) красным светом в смеси с I мг/мл ктивированного" снликагеля (онцентрация МГ в системе составляла величину полка 10ч моль/'л. то есть масса МГ. содержащаяся в 1 мл, соответствует концентрации растворе 10"4 моль/л) в течение 10 мин инактивация ЛДГ составила 31,3=1.8 "о. До-вление азида натрия индуцирошло полное ингибнрование процесса снижения катали-ческой активности фермента, следовательно, повреждающим глобулу агентом являет-'О;. Увеличение времени энергетической экспозиции до 20 мин вызвало 70 %-ную шктивацшо ЛДГ. Таким образ:м. иммобилизованный МГ оказался более эффектнв-,1м. чем растворенный.

На рис. 8 приведена схема возможных процессов, протекающих в системе ЦГ-МГ при ее облучении красном светом. ГЛАВА 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА УФ-ИНАКТИВАЦИИ ИЗОФОРМ ЛДГ ТКАНЕВОГО ЭКСТРАКТА СЕРДЦА СВИНЬИ Спектр поглощения приме^емого образца (тканевого экстракта сердца свиньи) 1наруживает максимумы экстиншии при длинах волн 250. 358. 410, 540 и 576 нм.

УФ-оолучение тканевого экстракта с концентрацией общего белка 7.3 мг/мл и .ельной активностью ЛДГ 2,7 ФЕ/мг белка в дозах 0,15; 2,27; 4,53; 9.06 кДж/м2 не оказало влияния на каталитическу о активность ЛДГ. Облучение разведенного экстракта энцентрация белка 0,033 г/мл) I1 дозах 2,27; 4,53 и 9,06 кДж/м" индуцировало умень-;ние активности ЛДГ на 12,1=3, !; 19.4±2,7 и 19,3±3,7 % соответственно.

Методом диск-электрофоре:а в полиакриламидном геле мы исследовали относи-льное содержание в экстракте мзоформ ЛДГ и количество общих белковых электро-)ретических фракций. Окрашшмние на общий белок позволило выявить 12 фракций ополимера. Окрашивание гелсд по специфической лакгатдегидрогеназной реакции азывает на наличие всех пяти и;оформ, причем доминирующими являются тетрамеры 1 и Н)М.

РЕАКЦИИ ТИПА II

Иу (Я = 665 нм)

МГ

МГ*

(р =0.52

' 1С*

■0>МГ+ <-

+ О,

+ЛДГ (обратимая ЛДГ + МГН"2 пли \ или реакция)

ЛДГ+\МГ (отрыв протона или4 электрона от субстрата)'

к = 10- 1 /с

:>м"г-» МГ

(тепловая диссппашш)

*> МГ + МГ

(концентрационое тушение)

\I

ИНАКТИВАЦИЯ

РЕАКЦИИ ТИПА 1

Рис. 8. Схема процессов, развивающихся в системе У1Г-ЛДГ при ее облучен к красным светом

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе продемонстрирована возможность модуляции воспр] имчивости лактатдегидрогеназы к действию некоторых диапазонов оптического излуч' ния, а также сравнительная оценка фоточувствительности сердечной и мышечной ю форм данного биокатализатора в условиях непосредственного поглощения его молек; лами квантов световой энергии и при фотосенсибшшзированном окислении в присутс вии некоторых химических агентов. Примененные экзогенные соединения имеют сп

фические особенности и могут быть сгруппированы в соответствии со своими функ-энальными свойствами следующим образом.

а1\'3, серотонин, гистидин, АБН, Р-каротин дезактиваторы 'СЬ; формирование динамического ком-

-маннит, трет-бутанол акцепторы ОН-радикалов плекса с молекулой

:ротонин, гистидин, р-ка-)тин, ЫАОН, О-маннит внутриклеточные метаболиты белка

АОН конформационный кофактор (преобразование вторичной и третичной структуры белка)

■ Нами выявлено, что при УФ-облучении (240н-390 нм) ЛДГ (М4) в дозе 2.27 кДж/.м" ;вободном состоянии происходит снижение уровня каталитической активности фер-нта. Этот факт сопровождается изменением оптических параметров биополимера: обсуживается снижение интенсивности люминесценции ЛДГ (л = 340 нм) и рост аб-эбции белка в спектральных областях, находящихся по обе стороны от максимума :тинкции органического катализатора (Я. = 280 нм). Наиболее эффективным из примерных модуляторов фотохимических свойств ЛДГ явился азид натрия. В его присучсг-и после облучения фермента а указанной дозе вышеперечисленные свойства ЛДГ ос-¡ались инвариантными по отношению к контролю. Обнаружено, что при использова-и энергетической экспозиции 4.53 кДж/м" ЛДГ изменяет параметры связывания суо-эата (КП1). а при дозе облучения 9.06 кДж/м: -— лишь максимальную скорость фермен-гивной реакции. Азид натрия при этом оказывал частичное протекторное действие (не иял на значение константы Михаэлиса фермента, но ингибировал уменьшение макси-льной скорости ферментативной реакции). Добавление азида натрия к натнвному рменту не вызывает регистрируемых методом проникающей гель-хроматографии нформационных изменений глобулы последнего (эффекты разворачива-я-сворачивания, диссоциации или агрегации субъединиц). Однако изменение С-спектра К'аЬЬ в смеси с ЛДГ в высушенном состоянии указывает на наличие множе-зенных взаимодействий белок-лиганд, что, возможно, имеет место и в растворе. Мее выраженными фотопротекторными свойствами (по отношению к ЛДГ, облученной в зе 2,27 кДж/м:) обладали также р-каротин и ЫАОН. Причем последний, являясь ко-ктором фермента, проявлял максимальное защитное действие при 50 %-ой степени 1ятости активных центров ЛДГ, а при снижении концентрации до 4-10"7 моль/л инду-ровал эффект сенсибилизации. Б-маннит и третичный бутанол при варьировании их нцентраций обнаруживали разнонаправленное действие на степень инактивации ЛДГ: юстом концентрации спирта преобладающим являлся эффект сёнсиблизации.

Исследование кинетики фотоинактивации ЛДГ показало, что зависимость ос точной ферментативной активности мышечной и сердечной изоформ олигомерного 6 ка от времени облучения аппроксимируется экспоненциальной функцией, характер! для классического описания фотохимического поведения простых белков. Сердеч изоформа более фотостабильна, чем мышечная. Это, вероятно, объясняется меньд значением коэффициента молярной экстинкции ЛДГ (НД Кроме того, примечате. выявленный нами факт изменения порядка реакции фотоинактивации ЛДГ (М4) с пер го на нулевой в присутствии ЫаМз.

Известно, что для оценки вклада синглетного кислорода в процесс фотомодифи ции биомолекул полезной является процедура сравнения эффективных скоростей вз .модействия модуляторов с '02. Доводом в пользу участия 'О; в рассматриваемом п цессе может служить корреляция этих параметров с величиной протекторного эффе (ингибирование фотоинактивации): при равенстве эффективных скоростей взаимод ствия хтя ряда модификаторов их защитное влияние также должно быть сходным нашем случае протекторные эффекты и эффективные скорости Р-каротина и гистид: удовлетворительно совпадают. Следовательно, 1СЬ принимает участие в процессе фо инактивации ЛДГ (МД Дополнительным подходом к 1 ыяснению участия 'О; в прои сах фотоинактивации фермента является экзогенная генерация этого активного инт медиата с целью демонстрации возможности окисления им аминокислотных остат белка. Нами показано, что в присутствии тиазинового красителя — метиленового го бого (10'" .моль/л), потеря ферментом функциональных свойств происходит под влия ем 'СК генерируемого сенсибилизатором.

При облучении в различных режимах (красный спет. УФ-излучение. иммобил! ция красителя на силикагеле) системы, содержащей мегиленовый голубой и ЛДГ, вы лено. что эффект фотоинактивации белка зависит от соотношения концентраций бис гализатора и фотопротектора и достигает .максимальной величины в присутствии .ме ленового голубого 10"° (раствор красителя) и 10ч моль/п (МГ. иммобилизованный на ликагеле). Показано, что при варьировании концентраций компонентов системы прс ходит смена механизма повреждающего действия красителя (участие в процессах с* летного кислорода и триплетного состояния сенсибилизатора).

Тканевый экстракт сердца свиньи содержит болидое число различных высоко низкомолекулярных компонентов, которые могут выступать как в качестве фотопрот торов, так и сенсибилизаторов по отношению к молекугам ЛДГ при УФ-облучении г парата. То есть рассматриваемая система может служи :ь моделью, в которой реализ} ся как прямое, так и опосредованное действие УФ-света. Нами установлено, УФ-облучение тканевого экстракта сердца свиньи : концентрацией общего бе

> мг/мл не оказывает влияния на каталитическую активность ЛДГ, но защитное дейст-е компонентов этого сложного объекта ослабевает при разведении препарата.

Полученные результаты расширяют и углубляют теоретические представления о ханизмах фотохимических превращений сложных белков в условиях различного мик-окружения и будут полезны при разработке методов направленной регуляции фото-дуцированных процессов в биологических системах и поиска веществ защитного ха-ктера действия. Исследование фотосенсибилизированного окисления в присутствии тиленового голубого обеспечит возможность глубже понять процессы, происходящие и фототерапии различных заболеваний с применением экзогенных фотосенсибилиза-ров.

ВЫВОДЫ

1. Алифатические спирты — третичный бутанол и О-маннит, при варьировании их нцентрацнй оказывают как фотопротекторное, так и сенсибилизирующее действие по ношению к изменению, каталитической активности лактатдегидрогеназы (МД Р-облученной в дозе 2.27 кДж/м2: при увеличении концентрации экзогенного агента вреждающий эффект доминирует над защитным. Ингнбирование фотоннактивации 1Г (\'Ь) в присутствии О-маннита (5-10° моль/л) указывает на участие в этом процессе Ч-радикалов.

2. По отношению к ЛДГ (МД УФ-облученной в присутствии р-каротина. гнети-Iна н азида натрия, наблюдается протекторное действие этих соединений. Степень ин-бировання инактивации ЛДГ р-каротино.ч н гистидином коррелирует с их эффектив-1ми скоростями взаимодействия с еннглетным кислородом, что свидетельствует об астии этого активного интермедиата в рассматриваемом процессе. Защитное действие ида натрия может быть связано как с акцепцией этим веществом 'О;, так и с образова-[ем динамического комплекса ^Ыч-белок.

3. При варьировании концентраций МАОН, соответствующих различной степени нятости активных центров ЛДГ кофактором, выявляется как фотопротекторный, так и ненбилизирующий эффекты лиганда при облучении смеси в диапазоне длин волн 0 -390 им. Максимальный защитный эффект выявляется при 50%-о.м заполнении ак-вных центров тетрамера коферментом. Фотовозбуждение ^'АОН УФ-светом 00^400 им) в области поглощения его никотинамидного кольца индуцирует инактива-1Ю фермента.

4. Процессы УФ-модификации мышечной и сердечной изоформ лактатдегидроге-13ы относятся к категории мономолекулярных реакций первого порядка, однако фото-'вствительность ЛДГ (Н4) существенно ниже таковой ЛДГ (МД время полупревраще-1я — 28 и 21 мин соответственно. При снижении концентрации ЛДГ до 2- Ю"9 моль/л )точувствительность увеличивается: время полупревращения составляет 3,8 мин.

5. Кинетическая кривая фотоинактивацин ЛДГ (МО в присутствии О-маннита серотонина сохраняет экспоненциальный характер, а в присутствии азида натрия ог сывается уравнением нулевого порядка. Протекторное действие ЫаМ5 максимально д ЛДГ (М4) на начальных (дозы 1,51-6,04 кДж/м2), а для ЛДГ (Н,) — на конечных стади фотоинактивации (6,04-9,06 кДж/м2).

6. Изменения спектрально-люминесцентных характеристик ЛДГ (М4) при ее об; ченни в дозе 2,27 кДж/м" в присутствии \!а№ коррелируют со степенью фотопроп торного (по отношению к уровню инактивации белка) действия экзогенного соединен! что указывает на доминирующую роль триптофана в процессе фотоинактивации фс мента.

7. ИК-спектр азида натрия в присутствии ЛДГ обнаруживает сдвиг в сторону с лее высоких частот, что свидетельствует об образовании комплекса фс мент-модификагор в высушенном состоянии белкового образца.

8. УФ-облучение ЛДГ (М4) оказывает неоднонаправленное действие на изменен кинетических параметров белка — К„, и V,,,. При дозе 4,53 кДж/м" величина I уменьшается, а при 9.06 кД>к/м~ не отличается от таковой для нативного фермента присутствии №N.1 и О-маннита К,„ остается инвариантной, а максимальная скорое ферментативной реакции снижается.

9. Величины кажущейся молекулярной массы нативной ЛДГ и ее смеси с азиде натрия и О-маннитом статистически достоверно не отличаются друг от друга, что ев детельствует о неизменности четвертичной структуры белка и отсутствии тотальш конформаиконных изменений глобулы в присутствии лиганда.

10. У1етиленовын голубой является фотосенсибилизатором по отношению к изм нению активности ЛДГ как при его возбуждении в видимой, так и УФ-области спектр Его максимальный повреждающий эффект обнаруживается в концентрации Ю"6 молы Иммобилизация красителя на силикагеле индуцирует увеличение сенсибилизируют активности экзогенного агента.

11. При варьировании концентраций ЛДГ и метиленового голубого происход смена механизма инактивации фермента (реакции типа I — с участием возбужденно состояния красителя — и II — с участием 'СЬ), то есть показана возможность окислен! ЛДГ этим активным интермедиатом ('СЬ) при его экзогенной генерации.

12. Изменение каталитической активности изоформ ЛДГ тканевого экстрак сердца свиньи при УФ-облучении, вероятно, происходит в результате частичного вс становления функций биокатализатора в результате влияния микроокружения раств римой клеточной фракции тканевого экстракта. Защитное действие последнего, по вс видимости, ослабевает при разведешш препарата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Наквасина М.А., Лысенко Ю.А., Артюхов В.Г. Комплексное изучение структур-эункциональных свойств лактатдегидрогеназы в присутствии некоторых лиган-// Всероссийская конференция "Физико-химические основы и практическое примете ионообменных процессов": Тез. докл. — Воронеж, 1996. — С. 246-247.

2. Наквасина М.А., Артюхов В.Г., Лысенко Ю.А. УФ-индуцированные изменения чпурно-функшкшальных свойств лактатдегидрогеназы в условиях различного мик-чружения//1 Всероссийская конференция фотобиологов: Тез. докл.— Пушино.

3. Лысенко Ю.А., Наквасина М.А., Артюхов В.Г. Оценка вклада 'О? и •радикалов в процесс фотоинактивации лактатдегидрогеназы // Кислород и свобод-радикалы: Материалы междунар. симп. — Гродно, 1996. — С. 112-114.

4. Артюхов В.Г., Наквасина М.А., Лысенко Ю.А. Активные формы кислорода и тень УФ-модификации структурно-функциональных свойств лактатдегидрогена-/ Радиационная биология. Радиоэкология. — 1996. — Т. 37, вып. 3. — С. 453-460.

5. О широком спектре действия циклокара — циклодекстриновой формы [3-ггина/С.Г. Резван. М.А. Наквасина. В.Г. Артюхов, Ю.А. Лысенко // И Международ-з симпозиума "'Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического ользования": Тез. докл. — Пушино. 1997. — Г. 2. — С. 82-83.

6. Арпохов В.Г., Наквасина М.А., Лысенко Ю.А. Кинетические закономерности - и термопревращений .молекул лактатдегидрогеназы в условиях различного микроужения // Международная школа "Проблемы теоретической биофизики": Тез. а. — М.. 1998. — С. 108.

7. Лысенко Ю.А., Наквасина М.А., Артюхов В.Г. УФ-чувствительность лактатде-эогеназы в присутствии некоторых химических агентов // II Всероссийский съезд обиологов: Материалы съезда. — Пушино, 1998. — С. 234-236.

3. Кинетические особенности фотоинактивации лактатдегидрогеназы в ирисутст-

некоторьгх фотопротекторов I Ю.А. Лысенко, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов. . Войткевич//II Международный симпозиум "Физико-химические основы функцио-ования белков и их комплексов": Материалы симп. — Воронеж: ВГУ, 1998. —

9. Артюхов В.Г., Наквасина М.А., Лысенко Ю.А. О роли активных форм кислоро-в процессах фотопревращения молекул ЛДГ // V Международная конференция оантиоксидант": Тез. докл. — М., 1998. — С. 106-107.

10. Лысенко Ю.А. Модуляция фоточувствительности изоформ лактатдегидрогена-некогорымн фото протекторными агентами // Уральская конференция молодых уче-: "Физика в биологии и медицине": Сб. науч. работ. — Екатеринбург, 1999. — С. 5-

5. — С. 83.

24-128.