Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование белков в тучных клетках в условиях радиопрофилактики

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование белков в тучных клетках в условиях радиопрофилактики"

n i Л ft

-"V 1-¿ ' i 1 >'

^ h.

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА.ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова

Биологический факультет

А

На правах рукописи

ДУЛИН НИКОЛАЙ ОЛЕГОВИЧ

УДК 577.391.612.014.46

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В ТУЧНЫХ КЛЕТКАХ В УСЛОВИЯХ РАДИОПРОФИЛАКТИКИ

а

03,00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени ? кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

О.Б.Кудряшов

Научный консультант - кандидат биологических наук

Г.М.Кравцов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

И.В.Филиппович,

доктор биологических наук, профессор Б.А.Цудзевич

Ведущее учреждение - институт радиобиологии АН БССР /Минск/.

Защита состоится 17 декабря 1990г. в/3 часов на заседании специализированного совета Д.053.05.74 при Московской государственном университете им. М.В.Ломоносова /Москва, Ленинские горы, МРУ, биологический факультет/.

Г» ' .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан МЛь/л^ ._1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук О.Р.Колье

■i sit ¡¡aw

;ел стаций

ОЫЦЛН ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Согласии гипотезе эндогенного фона радиорезистентности, устойчивость биологических объектов к ионизирующей радиации связана как с подавлением веществ, участвующих в развитии первичных лучевых процессов, так и с накоплением и мобилизацией эндогенных защитных ресурсов. К последним относится биогенный амины (серотонин, гистамин), обладающие противолучевой активностью (Гончаренко, Кудряшов, 1980). Одним из основных источников серотонина и гиспшина в организме является тучная клетка (мастоцит). К настоящему времени получены данные о том, что после введения яивотним различных классов противолучевых соединений происходит высвобождение биогенных аминов из мастоцитов (Гончаренко и др., 1986). Причем, если амины способ-, ны вызывать секрецию тучны:? клеток как после введения их животным, так и непосредственно в опытах in vitro,то серосодержащие препараты (МЭА,цистамин) стимулируют высвобождение гистамина только после введения их животным In vivo (Граевская, Гончаренко, 1980). В связи с этим было выдвинуто-предположение о наличии посредников, вызывающих дегранулнцию мастоцитов при введении животным тиоловых протекторов (Гончаренко и др., 1986).

Известно, что 2%-сыворотка крови крыс усиливает действие классических либераторов гистамина (Sydbcm, Uvnas, 1976т:), что указывает на существование активного фактора в крови, способного воздействовать на тучные клетки. По данным лаборатории радиационной биофизики МГУ усиление высвобождения гистамина из мастоцитов под влиянием МЭА происходит в присутствии депрот^иниэирован-

ной нагреванием сыворотки, теряющей активность после диализа. Ото позволило предположить, что потенциирующее действие сыворотки обусловлено фракцией термостабильных низко1»юлекулярных пептидов (Гончаренко и др.,1986). Показано, что ряд серосодержащих соединений, обладающих противолучевой активностью (Парибок,1964), вызывает повышение уровня пептидов кининовой системы (Erdos, Vang, 1966; ï «j i с et al. ,1972) .Одни но кинииов (брадикиш-ш) способен непосредственно стимулировать тучные клетки в опытах in vitro (Devil-lier et al.,1985). Поэтому брадлкинин рассматривается как наиболее вероятный посредник в действии тиоловых радиопротекторов на мастоцити (Гончаренко и др.,1986).

• Из изложенного выше следует необходимость исследования механизма стимуляции тучных клеток биогенными аминами и возможным посредником действия тиолов - брадикинином. К настоящему времени известно, что эти соединения вызывают увеличение внутриклеточной концентрации свободного кальция, играющего ключевую роль в секреции тучных плеток. Увеличение уровня Са, в свою очередь, модифицируется активатором протеинкиказы С -форболовым эфиром (Ломак »ш, 1987). На основании этих результатов автором цитируемой работы било сделано предположение об участии С-кииазы в секреции тучных клеток в условиях радиопрофилактики.

Действительно имеется ряд фактов, указывающих на важную роль протеинкинаэи С в ензоцитозе мастоцитов, стимулированных классическими либераторами (вещество 46/80, конканавалин А, анти-IgE): показано усиление обмена фосфоинозитидов, в процессе которого образуется эндогенный активатор С-киназы днацилглицерин

(ДЛГ) (Imai et al.,1934); увеличение активности протеинкиназы С ¡Kuros.iv/a,Parker,1986) и фосфорилирование белков (Kataka.i.i »1., 1934, Heiman, Crews,1935) в стимулированных кастоцитах. Необходимо отмстить, что основными субстратами С-кинаэы в секретирующих клетках являются цитоскелетные белки и их фосфорилирование -важный этап в процессе 3K3ouMro3a(Hishizuka,1936).

В связи с этим особу» актуальность приобретает исследование влияния биогенных аминов и брадикинина на функционирование С-киназы и связанное с ней фосфорилирование цитоскелетных белков в тучных клетках.

Цель работы: исследовать механизм фосфорилирования белков й роль этого процесса в секреции при воздействии на тучные клетки биогенным амином и возможным посредником действия серосодержащих радипротекторов - брадикинином. Конкретно били поставлены Следующие задачи:

1. Проверить способность брадикинина оказывать радиозащитное действие.

2. Исследовать участие цитоскелета в секреции тучных клеток, стимулированных серотонином'и брадикининоы.

3. Изучить влияние активатора протеинкиназы С - форболового эфира на секрецию и белковый состав тучных клеток.

4. Провести сравнительный анализ фосфорилирования белков различных фракций тучных клеток, обработанных серотонином, бради-кинином и форболовым эфиром.

5. Определить активность протеинкиназы С в тучных клетках.

Научная повинна работы. В ходе настоящего исследования получены новые данные об особенностях механизма секреции тучных клеток в условиях радипрофилактики. Показано, что стимуляция туч ных клеток серотонином и посредником действия тиоловых радиопротекторов - брадикинином сопровождается полимеризацией акт,Чг новых микрофилламентов, и этот процесс находится под 'поЛожил'.ед^.-ньм контролем протеинкиназы С. Обнаружено, что при йКТЙоацед! мастоцитов в условиях радипрофилактики происходит ние цитоскелетных белков протеиикипаэой С. Впербые бИредрдад активность цитоскелетной формы С-киназы в тучных !клеОДед- цоййг зано увеличение активности фермента при стимуляций'мастоцижо'й. брадикинином.

Теоретическое и практическое значение работы. Реаул-ьт-ата и выводы настоящего исследования способствуют понимаяйо.^еханизмов высвобождения биогенных аминов, являющихся одним'-из'КОМИбНёКтов эндогенного фона радиорезистентности, а также механизмов Экэо-цитоза в целом. Работа может найти применение!при'ПоИйсе., 'Оценке эффективности новых радиопрофилактических средств 'И 'б 'ибънснеши их защитного действия.

Внедрение. Полученные результаты внедрены в учебный 'процесс на кафедре биофизики биологического факультета МГУ в курсе лекций и практических занятий по тепе "Радиобиология".

Апробация работы. Результаты работы изложены на научной конференции стран СЭВ "Действие физических факторов на биологические системы" (Москва, 1987); Всесоюзной конференции "Изучение и применение лектинов" (Тарту, 1989); 1-го Всесоюзного

- 5 -

радиобиологического съезда (Москва, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на _

страницах, состоит из введения, обзора литература, методической части, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов. Материалы диссертации иллюстрированы _ рисунками. Список литературы нключает _ отечественные и _ иностранные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследовании. Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар возраста 12-20 недело массой 180-300г. и мышах линии BALB/C весом 20-25 г. Облучение животных проводили на рентгеновской установке РУМ-П, мощность 0.5 Гр/мин.

Выделение фракции леритонеальных тучных клеток и их гранул проводили по методу Увнас (Uvnas.1974), цитоекелета - методом, описанным Уайтом с соавт. (White et al.,1984). Содержание гистамина в тучных клетках определили с помощью реакции конденсации амина с о-фталевым альдегидом (Гущин, 1976). Концентрацию SH-rpynn в селезенке определяли методом, описанным Седлак и Линдсэй (SedlaH, Lindsay,1968).

При изучении фосфорилирования белков мастоциты преинкубиро-

32 л

вали с Р (I мКи/мл) в течение 60 мин при 37 С, после чего клетки отмывали от фосфата и обрабатывали исследуемыми веществами. Реакцию останавливали добавлением стартового буфера для электрофореза или холодной среды для выделения соответствующей фракции.

Разделение белков проводили электрофорезом в ПААГ-SDS с градиен-

V1

том акриламида 5-20%. После окончания электрофореза белки в геле окрашивали кумасси и серебром или переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроблоттингом и авторадиографировали.

Активность протеинкиназы С определяли в цитоскелетной и ци-топлазматической фракциях тучных клеток по включению в специфический субстрат С-киназы гистон Hj. За основу использовали метод, описанный На rao с соавт. (Hagao et al.,1987).

РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЖДЕНИЕ -I. Влияние брадикинина на клеточное опустошение костного мозга облученных мышей и на уровень SH-ppynn в селезенке.

Механизм действия брадикинина «ад предполагаемого посредник) серосодержащих радиопротекторов, по-видимому, должен быть связан с изменение'м радиорезистентности вдвотных. Однако до настоящего времени не было проведено экспериментов, направленных на изучение защитных свойств пептида.

Известно, что одной из кридаедких систем в лучевом поражении являются клетки костного модга. -Е\рц облучении мышей линии balb/c рентгеновским излучешцед |(;8 ¡ф) в бедренной кости на 3 сут ки остается 48£ ядросодержавда йцечюк по сравнению с необлучен-ными животными. Предварительное «ведение брадикинина (10 мг/кг) за 10-15 мин. до облучения ¡не приводит к достоверному увеличению кариоцигов э костном мозге. Однако на основании этого нельзя отрицать роль пептида в радиопрофилактическом эффекте протекторов. Известно, что кинины быстро разрушаются в оргяниэме различ-

лыми лептидаэами (кининазами), представленными во всех тканях (Дэизинский, Гомазков, 1976). Возможно в наших опытах брадики-нин не оказывал защитного действия вследствие разрушения.

В связи с этим последующие эксперименты были проведены с использованием ингибиторов кининаэ. Необходимо отметить, что боль-шинс?во ингибиторов кининаз является серосодержащими соединениями, которые в то же время обладают противолучевой активностью (Ег(1и$,Уа«9,1%6; Парибок, 1968). Введение, одного из них - МЭА в дозе 40 мг/кг, в 4-5 раз меньшей, чем эффективная и не оказывающей влияния на' выживаемость (Бак, 1968), приводит к достоверному увеличению клеток в костном мозге облученных животных до 57% по отношению к меоблученньш. При совместном введении МЭА (40 мг/кг) И брадикинина (10 мг/кг) отот эффект усиливается и достигает 65% (рис.1).

количество клеток, X

100

• 80

60 40 20 0

Рис.I. Общее количество клеток костного мозга мышей на з сутки после облучения в дозе 2 Гр.

(1)-.животные, облученные без введения препаратов;

(2)-предварительное введение брадикинина, 10 мг/кг;

(3)-МЭА, 40 мг/кг;

(4)-брадикинина,10 мг/кг+ МЭА, 40 мг/кг

(5)-необлученные животные.

1 2 3 4 6

Таким образом можно заключить, что брадикшшн на фоне малых доз МЭА увеличивает устойчивость к облучению одной из критических систем радиационного поражения - кроветворных клеток. Данный вывод подтверждается исследованиями по определению ко*ндедагщии небелковых SH-групп в селезенке животных. Известно, .чад ¡вдвдецие животным радиопротекторов вызывает увеличение эндо-геилога уровня сульфгидрильных групп в различных органах (Г^аевскш), 196Э>, В на ших экспериментах совместное введение МЭА (40 «г/кг) и брадотини на (10 мг/кг) приводит к увеличению количества 5М-,грулп в селезенке на 35% по отношению к контролю. D то же рреыя эти сооди-' кеиия, введенные по отдельности, не изменит уровня тиодов,

Как отмечалось во введении, влияние брадикаадкад ^at; посредника действия серосодержащих радиопротекторов связано в кошае-нием уровня биогенных аминов посредством стимуляции ида «леток. Однако механизм окзоцитоэа мастоцитов а условиях радиопрофилактики остается неисследованным. 2. Роль цитоскелета в оекреции тучных клеток

Экзоцитоэ тучных клеток включает в се<5я дередвижение гранул ic мембране, выброс их в окружающую сроду, а также ездяше -пери-гранулярной мембраны с плазматической, в результате чего содержимое гранул сообщается с внесшей средой. В настоящее время ключевую роль с этих процессах отводят белкам цитоскелета, а именно комплексам, составляющим микрофилламенты и микротрубочки (Burgoyrx 1984). в 1072г. Орр с соаот. (Orr et el., 1972), используя ингибиторы полимеризации актина (цитохалаэины Л и В) и ингибитор сборки ми-крогрубочек (колхицин), установили, что эти соединения блокируют

секрецию гистамина из тучных клеток, стимулированных веществом 48/80. С помощью различных методов было показано, что определяющую роль в движении гранул мастоцитов выполняют актиновые филла-менты, широко представленные в тучных клетках (яаинсь.ШЬ, Та5ака е1 а1.,1988). в связи с этим важно исследовать роль цитоскелета в механизме действия на мастоциты предполагаемого посредника радиопротекторов - брадикинина и биогенного амина - серотонина. .

о

Цитохалазин В в концентрации 10 М в зависимости от времени ингибируот дегрануляцию мастоцитов, стимулированных брадикинином. Максимальный эффект (60% ингибирования) наблюдается к 3-му часу инкубации тучных клеток с блокатором. Аналогичная картина наблюдается при воздействии на мастоциты колхицином (10 Н). Однако ингибирование секреции последним слабее, чем в случае цитохала-зина В (рис.2). Оба соединения наиболее эффективны в высоких •концентрациях. Низкое содержание этих веществ в среде инкубации (10"^М) практически не влияет на секрецию тучных клеток. Возникает вопрос, связано ли ингибирукнцее действие цитохалазина и колхицина с модификацией микрофилламентов и микротрубочек соответственно, как это предполагалось в исследованиях с применением различных либераторов гистамина (Огг а1., 197г; iegu^\off, СМ,1976).

С этой целью мы исследовали белковый состав цитоскелста после воздействия на тучнуо клетку цитохалазином В и колхици-

о

ном. Оба ингибитора в концентрации 10 И приводят к практически полному исчезновению полосы 43 кДа, соответствующей по электро-форетической подвижности актину (рис 3).

секреция гистамина, %

01_I_

I г

Рис .2. Влияние цитохалаэина В и колхицина на секрецию тучных клеток, стимулированных брадики-нином.

(а)-контроль о

(б)-цитохалазин В, ЮМ

(в)-колхицин, ЮМ

и

-------67

-43

зо

а б в

Рис 3. Влияние цитохалаэина В и колхицина на белковый состав цитоскелета тучных клеток

(а)-контроль о

(б)-цитохалазин,10" М; 3 ч.

(в)-колхицин, Ю"3М; 3 ч.

3 часа

Известно, что цитохалаэии В действует на секрецию других клеток, непосредственно влияя на концентрацию полимеризованного актина (Р-актина). Поэтому ингибирование цитохалазином В секреции тучных клеток,вероятно, связано с нарушением полимеризации микрофилламентов. Изменений в содержании белка 55 кДа (субъединицы молекулы тубулина) не было обнаружено при воздействии на мастоциты колхицином. В связи с этим механизм действия колхицина на секрецию тучных клеток нельзя объяснить его влиянием на сборку микротрубочек. По данным ряда авторов ингибитор пол-

ностью блокирует сборку микротрубочек в тучных клетках и концентрации 10 М (ьодипоГГ»СЬ1,1976). в наших экспериментах его воздействие на секрсцию не сказывается в таких концентрациях. Кроме того, и работах Акаги с соавт. (Лкау* «1а1.,198б) с использованием антител к белкам тубулина не было обнаружено тубулярной системы в тучних клетках крис. На основании отого можно заключить, что при воздействии колхицина, также как в случав цитохалаэина В, в мастоцитах имеются изменения полимеризации микрофилламентов.

С наших опытах инкубация мастоцитов с брадикинином и серо-тонином приводит к 3-4 кратному увеличению связанного с цитоске-летом актина. Причем цитохалазин В практически полностью блокирует отот эффект.Данные результаты свидетельствуют в пользу того, что один из механизмов воздействия брадикинина и серотонина на секрецию тучных клеток может быть связан с изменением полимеризаций актина.

В следующей серии экспериментов были изучены возможные механизмы увеличения концентрации Р-актйна в тучных клетках, стимулированных серотонином и брадикинином.

На нейтрофилах, тромбоцитах и других секретирующих клетках показано, что различные биологически активные соединения вызывают резкое повышение связанного с цитоскелетои актина и некоторых антин-свяэывающих белков. Форболовый эфир аналогичным образом влияет на концентрацию Р-актина, что позволило предположить участие С-киназы в перестройке цитоскелета стимулированных клеток (РснагеиюК «I а1., 1987; БЬааН, Мо1$к1,1987). Возможно, действие брадикинина и серотонина на тучные клетки также опосредуется

через активацию протеинкиназы С. Для доказательства этого необходимо было:

- установить, влияет ли активация протеинкиназы С на секрецию тучных клеток, и имеются ли при этом изменения в структуре цито-скелетних белков при воздействии форболового зфира;

- провести сравнительный анализ фосфорилирования белков мастоци-тов, стимулированных брадининином, серотонином и форболом;

- исследовагь активность протеинкиназы С в тучных клетках.

3. Роль протеинкиназы С в механизме действия серотонина и брадикинина на тучную клетку.

Эндогенным активатором протеинкиназы С является один из продуктов Обмена фосфоинозитидов - диацилглицерин (ДАГ) (Nlshtzuka, 1986). в экспериментальных условиях к основным методам исследования С-киназы относят воздействие на клетку аналогами ДАГ - фор-боловыми эфираыи. Такие офиры, как 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат (ТРА) имеют структуру, сходную с ДАГ, и аналогичным образом вызывают полную активацию С-киназы (Vaaanishi et а).,1982).

В наших экспериментах ТРА вызывает высвобождениетистамина из мастоцитов. Максимальный эффект (153!) наблюдается в области

о

концентраций 10" -10" М, что согласуется с данными Уайта с соавт. (White et а).,1984). Исследование влияния ТРА на белковый состав цитоскелета показало, что форболовый эфир в 3 раза увеличивает количество связанного с цитоскелетом актина. Причем этот эффект,

как в случае с брадикинином и серотонином , полностью устраняется преинкубацией масгоцитов с цитохалаэином В. Эти результаты свидетельствуют в пользу участия протеинкиназы С в механизме стимуляции мастоцитов серотонином и брадикинином.

Как известно, активация киназ, в том числе и С-киназы, приводив и усилению фосфорилирования различных белков. Изучение этого процесса явилось предметом нашего исследования в последующих опытах.

32

После инкубации нагруженных • р тучных клеток с брадикинином (10~5М), серотонином (IO'^IA) и ТРА ИО'^М) наблюдается усиление "фосфорилирования белков с молекулярной массой 15, 20, 23-25, 28, 34-36 кДа. Кроме того в опытах с ТРА и в меньшей степени с

•30

серотонином происходит включение Р в высокомолекулярные белки (60-95 кДа) (рис.4.).

Анализ литературы позволяет констатировать противоречивость результатов в этой области исследования. Так, по данным Катаками с соавт (Katakaml et al.,1984) форболовый эфир увеличивает фосфорилирование^епгидов 22, 31, 34, 60 кДа. Хейман и Крюс связывают' действие ТРА с фосфорилированием белков 48, 60, 78 кДа (Heinan,Crews, 1985). Наконец, Нагао с соавт (Nagao et а).,1985) отводят главную роль фосфорилированию белка 50 кДа. Наиболее значительному фосфорилированию в нашей работе при воздействии на тучные клетки как ТРА, так и серотонином и брадикинином подвержены белки с низким молекулярным весом (15-28 кДа). В этом отношении нйши данные больше всего соответствуют результатам Катаками с соавт. В осталььых цитируемых работах авторы не наблюдали

фосфорилироаание низки,юлепулярных пептидов, что, видимо, объясняется использованием ими нидких гелей при разделении белков электрофорезом.

т отсо <о и? '

i—. cvcviAi РЗ to цДа

Рис.4. Фосфорилирование белков тучных клеток. Денситограмыа. I- контроль; 2- серотонин, Ю'^М; 3- брадикинин, 4- ТРА, ЮМ; инкубация 10 мин.

Итак, при воздействии серотонина, брадикинина и ТРЛ на тучные клетки происходит усиление фосфорилирования белков с одной и той же молекулярной массой (15, 20, 23-25, 28, 34-36 кДа). Физиологическая роль фосфорилиронания высокомолекулярных белкоэ (60-95 кДа! в случае ТРЛ неизвестна. По-видимому, при стимуляции мастоцитов серотонином и брадикинином включаются не только процессы, приводящие к выбросу медиатора, но и отвечающие за окончание секреции. В случае ТРЛ, который, п отличие от нативного стимулятора С-кииазы (ДЛГ), долго сохраняется в клетке, картина ответа может искажаться (м$1тика,198б).

Поскольку процесс экзоцитоза секретирующих клеток включает передвижение гранул при участии белков цитоскелета, мы исследовали возможную принадлежность фссфопротеинов тучных клеток к гранулам и цитоскелету. На рисунке 5 представлена'олектроФоре-грамма белков гранулярной и цитоскелетной фракций. К основным гранулярным белкам мастоцитов относятся протеолитические ферменты: химаза (28-30кДа), триптаза (33-34 кДа), карбоксипептидаза (35 кДа) (&^<Ые1л Л.,1987; БсЫагЧг е1 а1.,1987). Данные литературы по характеристике цитоскелетных белков тучных клеток отсутствуют. Из результатов наших экспериментов нетрудно заметить, что в состав белков цитоскелетной фракции входят основные ферменты секреторных гранул. Это свидетельствует о прочной связи гранул с цитоскелетом, которая не разрушается обработкой тучных клеток детергентом.

В белках гранул мастоцитов, предварительно нагруженных не наблюдается'как баэального фосфорилироиания, так и поело

воздействия стимуляторов. В этом отношении тучные клетки отличаются от других секретирующих клеток, в которых активация киназ приводит к резкому увеличению фосфорилирования белков гранул (МшкочШ е1 а1.,1983).

Рис.5. Электрофореграмма белков различных фракций тучных клеток.

(а)-цитоскелет

» <

Г и

ГТ?"""

кДа

— 94

(б)-целые клетки . . ¿ ~__67

(в)-гранулы __43

ОЕЗа

тг^хга—30

-амкэ - -

• -20

• •• —

а б в

ор

В цитоскелетной фракции нагруженных Р тучных клеток наблюдается базальное фосфорилирование белков с молекулярной массой 15, 27-28 кДа (.рис.6.). Включение фосфата в эти белки усиливается при инкубации клеток с серотонином, брадикинином и ТРА. Это указывает на то, что фосфорилирование белков цитоскелета масто-цитов, стимулированных биогенным амином и брадикинином, осуществляется через активацию протеинкиназы С. Учитывая связь цитоскелета с гранулами, можно полагать, что фосфорилирование цито-скелетных белков тучных клеток С-киназой относится к основным процессам, вызывающим дегрануляцию. .

кДа

Рис.6. Влияние брадикинина,

серотонина и 'ГРЛ на .

фосфорилирование белков

цитоскелста мастоцитов. ¡. •

(Г)-ТРА,Ю"7М. 10 mihi.

(а)-контроль щт ^

(б)-брадикинин,Ю !.!, 10 мин,

(в)-серотонин, 10"°М, 10 мин, JJJ ф?»

\

Среди фосфопротеинов цитоскелета тучных клеток ми не обнаружили белка, соответствующего »о молекулярной массе актину, хотя полоса 43 кДа четко прослеживается на эдектрофореграмме. В связи с этим.можно полагать, чго влияние С-ктази осуществляется через фосфорилирование актин-сэязизаадих йелков. В настоящее время не представляется возмог..ihm дать характеристику цитоскелетных белков, включающих фосфат в мастоцитах. Основываясь на данных, имеющихся для других секреторных клеток, можно сделать следующие предположения.

Активация протеинкиназы С усиливает фосфорилирование группы свлэаных с актином белков: легкой цепи миозина, тропонинов, вин-кулина, филамина и белка 36 кДа (Nishizuka,1986; Saris et al.,1986). Винкулин (130 кДа) и филамин (250 кДа) из тромбоцитов представляют собой высокомолекулярные белки, что неприемлимо в плане

обсуждения наших результатов. Пептид 36 кДа - суб'ьединиц'а1 УМфбН'й' распространенного дитоскелегного белка - калпактина Г,, являющегося субстратом тироэиновой и С-кинаэы еппеу,Тась. 1985-);. Йе иешшче-но, что он представлен и в тучных клетках, и его фо.еф0(5иаирование при действии ТРА, серотонина и брадикинина влияет на1 полимеризацию актина. В состав немышечных' тропонинов, выделеннш ш тромбоцитов, -входят три пептида с молекулярной массой 36, 17.5, 14.5 кДа. Посредством фосфорилирования тропонина происходит регуляция взаимодействия Г-актина с миозином (Уайт и др.,1981). Возможно, как и в случае тромбоцитов, усиление фосфорилирования тропонино-вого комплекса влияет на функциональное состояние актиновых фил-ламентов и в тучных клетках.

Легкая цепь миозина, состоящая из двух субъединиц"(16 и 20 кДа), обладает АТФ-аоной активностью и контролирует состояние акто-миозинового комплекса. Регуляции АТФ-азной активности в секреторных клетках осуществляется через фосфорилирование легкой цепи миозина. Учитывая тот факт, что в тучных клетках обнаружены толстые филламенты, не принадлежащий к тубулярной системе (ШеХ е* а1., 1986),можно полагать, что в их состав входит миозин. В связи с этим, с нашей точки зрения решающее значение в регуляции цито-скелотом секреции мастоцитов приобретает фосфорилирование именно легкой цепи миозина. Основанием для этого положения служит также то, что в наших опытах полоса 15-16 кДа наиболее сильно включает фосфат.

Итак, полимеризация актина и*фосфорилирование связанных с актином цитоскелетных белков аналогичным образом меняется при

- 19 - .

воздействии брадининина, серотонина и ТРЛ, что позволяет сделать заключение о ведущей роли протеинкиназы С в механизме действия на мастоциты биогенного амина и предполагаемого посредника , серосодерхсапих радиопротекторов - брадиг.инина. Решающим доказательством этого явились бы эксперименты по прямому измерению активности С-киназы в мастоцитах.

А. Определение активности протеинкиназы С в тучных клетках.

В подавляющем большинствз клеток, в том числе и в мастоцитах,- протеинкиназа С существует в виде цитоплазматической формы, а при активации происходит Са-зависимал транслокация фермента к внутренней стороне мембраны и фосфорилирование мембранных белков (Nagao et al. ,1987, Erne et al.,1987 ). Кроме ТОГО на почечных клетках Y-I показано, что С-киназа связывается с цитоскелетом, где фосфорилируэг специфические субстраты (?apadopoulos,Ha1l,l989). Однако в литературе в настоящее время отсутствуют какие-либо сведения о существовании цитоскелетной формы фермента в тучных клетках. Поскольку в наших экспериментах секреция тучных клеток сопровождается фосфорилированием именно цитоскелетных белков, мы провели сравнительное' исследование активности протеинкиназы С в цитозольной и цитоскелетной фракциях мастоцитоз.

Измерение активности протеинкиназы С в интактных клетках показало, что как и в большинстве клеток , фермент находится практически полностью в виде цитозольной формы, активность которой в наших экспериментах была в 4 раза выше, чем в цитоскелете.

- 20 -При стимуляции мастоцитов брадйкйяймой (КГ^О основная киназ-ная активность обнаруживается в цич'эекеЛетной фракции, а в цито-зольной - резко падает (рис.7). Данные результаты свидетельствуют в пользу того, что брадикинин активирует протеинкийазу С в тучных клетках, вызывая транслокацию ферментй К ^»сюк'егЛету,

активность» срл/мг мин

1260 | 1000

Рис. 7. Активность протеинкиназы С в цитозольной и цитоскелетной франциях тучнУх клеток.

(а)-контроль

(б)-брадикинин, 10-бМ, 10 мин.

О-цитоплазматическая фракция -цитоскелетная фракция

- 21 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших экспериментов указывают на важнейшую роль белков цитоскелета в с<?кредеи тучных клеток, стимулированных биогенным амином (серогомшюмЗ и возможным посредником действия серосодержащих радиопротектор®« <брадикинином). Исследование влияния серотонина и •бр-адтиедимна на белковый состав цитоскелета, а также его модификации цитохалазином и колхицином свидетельствует в пользу того, -что главным цитоскелетным компонентом, участвующим в секреции мастоцитоо, являются актиновые микрофил-ламенты, полимеризация которых усиливается во время дегрануля-ции тучных клеток.

На основании экспериментов по влиянию ТРЛ на белковый состав цитоскелета можно полагать, что структурная модификация актина находится под положительным контролем протеинкиназы С. Это предположение подтверждается полученными данными по транслокации С-киназы к цитоскелету и фосфорилированию ряда цитоске-летпых белков во время активации тучных клеток брадикинином, серотонином и ТРА.

По-видимому, влияние протеинкиназы С на полимеризацию актина осуществляется косвенно через фосфорилирование актин-связывающих белков, поскольку в наших опытах не было обнаружено включение фосфата непосредственно в актин. В настоящее время трудно однозначно идентифицировать эти белки, так как состав цитоскелета мастоцитоа не исследован. По аналогии с другими клетками (тромбоциты, нейтрофилы) можно предположить, что во время секреции тучных клеток в.условиях радиопрофилактики происходит

фосфорилирование таких актин-связывающих белков, как калпактин I, тропонин или легкая цепь миозина. и

ВЫВОДЫ

1. Брадикинин на фоне малых доз МЭА вызывает противолучевой эффект по критерию клеточности костного мозга. Это свидетельствует в пользу предположения, что брадикинин является, посредником в защитном действии тиольных радиопротекторов.

2. Секреция тучных клеток, вызванная серотонином и брадикинином, связана с увеличением полимеризации актина, составляющего микрофилламенты. ,

3. Активатор протеинкинаэы С - форболовый эфир (ТРА) вызывает высвобождение гистамина из мастоцитов и, также как в случае с серотонином и брадикинином, увеличивает концентрацию полимери-зованного актина.

4. Серотонин, брадикинин и-ТРА усиливают фосфорилирование ряда одинаковых по молекулярной массе белков тучных клеток. Белки 15-16, 27-28, 34-36 кДа принадлежат к цитоскелету.

5. При стимуляции мастоцитов брадикинином происходит уменьшение активности протеинкинаэы С в цитозольной и увеличение в цигоске-летной Фракции тучных клеток, что указывает на транслокацию фермента к цитоскелету.

6. Механизм секреции тучных клеток в условиях радиопрофилактики связан с модификацией микрофилламентов посредством фосфорилиро-вания цитоскелетных белков протеинкиназой С. .

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гончаренко E.H., Граевская Е.Э., Кравцов .Г.И.', Ломакин H.H., Дулин 11.0. Механизму мобилизации биогенных аминов при противолучевой защите. Науч. конф.стран СЭВ "Действие физических факторов на биологические системы", М., 1987.

2. Дулин Н.О., Гончаренко E.H., Кудряшов Ю.Б., Граевская Е.Э., Кравцов P.M. Роль фосфорилировакия белкоз в секреции тучных клеток, стимулированных конканавалином А. Связь с цитоскелетом. Биохимия, 1989, т.59, !Р 9, с.1428-1433.

3. Кудряшов Ю.Б., Дулин 11.0. .Гончаренко E.H., Рраевская Е.Э., Ломакин H.H., Кравцов Г.!,i. Транспорт кальция и фосфорилирование белков и процессе секреции тучных клеток в условиях радиопрофи-лаитики. Материалы 1-го Всесоюзного радиобиологического съезда, _ Ы., 1989, с.732-733.

4. Кравцов P.M., Граевская Е.Э., Дулии И.О., Гончаренко E.H., Кудряшов Ю.Б. Механизм действия конканавалина А на тучные клетки. Учение записки Тартусского университета. "Изучение и применение лентинов", 1.2, Тарту, 1989, с.43-48.

5. Дулин'И.О., Кравцов Г.М.,Граевская Е.Э., Кудряшов Ю.Б.

Роль фосфорилировакия белков в секреции тучных плеток в условиях радиопрофилактики. Радиобиология, 1990, т.30, № I, с.32-35.