Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование ретровирусов сарком птиц при трансдукции протоонкогена src и адаптации к неспецифическоку хозяину

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Формирование ретровирусов сарком птиц при трансдукции протоонкогена src и адаптации к неспецифическоку хозяину"

НАЩОНАЛЬНЛ АКАДЕМ1Я НАУК УКРЛШ1

Р f В1Нс9и?УТ ЮЛЕКУЛЯРНО? БЮЛОГН ТА ГЕНЕТИКИ

«? с . »t -Г

£ , Ui(i

На правах рлтопису Михайлик Анатолий Анатол1йсшич

УДК 577. 21:578. 828. 111

ФОРМУВАННЯ НОВИХ В1РУС1В САРКОМИ ГГГАХ1В ПРИ ТРАНСДУКЦП ПРОТООНКОГЕНУ SRC I АДАПТАЦП ДО НЕСПЕЦИФ1Ч1ЮГО ХАЗЯХНА

(спец1альн1сть 03.00.03 - молекулярна СИпдоНя)

АВТОРЕФЕРАТ дисертацН на здобуття вченого ступелл кандидата бЮлопчних наук

КиКв 19Р4

Роботу виконано у в1ддШ молекулярной онкогенетики 1нституту молекулярно* б!олог!1 та генетики HAH Укра*ни. Де-як! д!лянки роботи виконан! в еп1вроб!тництв! а в1дд!лом BípycHOi' í luiíTHHHoi генетики та 1Ммунолог1£ 1нституту молекулярное генетики АН 4exii (Прага) i 1нститутом б!ологН 1м. Кюр1, Opee (Франц!я).

Науковий кер! вник: доктор б1олог1чних наук А. В. Риндич

OÍ>i Ц1 Йн1 олоненти:

Пров!дна орган1зац1я: Нац!ональний Университет 1м. Тараса Шевченка МШстерства осв!ти Укра1ни

Захист дисертацН в!дбудеться "_" жовтня 1994 р. о _

годин! на saciflaHHi спец1ал!зовано1 ради Л 016.11.01 при 1нститут1 молекулярное б!олог!S та генетики HAH Украали за адресок* 262627, Ки*в-143, вул. Заболотного, 150.

3 дисертац!ею можна ознайомитися в б!бл!отец! Гнституту молекулярно! б!ологН та генетики HAH Укра1ни.

Автореферат роз!слано "_" _ 1994 р.

академ1к HAH Укргп ни 3. А. Бутенко

канд. (Иол. наук

О. П. Соломко

Вчений секретар спец!ал!зовано* рад канд. б! о л. наук

АШАЛЬНГСТЬ ПРОБЛЕМИ. Висока швидкхсть мутац!й геноШв ретров1рус!в -обумовлена вккористанням механизму зворотноХ транскрипцП в репл!кац!йному цикл!. Вони легко регамНнуххгь' в гомолог!чних регионах родинних вАрусхв 1 нав!ть здатн! за-хоплювати кл1тинн! генетичн1 елементи. Утворений пул в1русних часток, як! несуть в соб! модиф!кован! геноми, молю бути вих!дним материалом для в1русно1 еволюцН. Селекц!я з боку нового хазя!на (при умов! анфекугання) або в!дб!р в умовах експерименту моде лриводити до накопичення певного варианту вируса, який е найбзльш пристосованим до розмножен-ня в эм!нених умоЕах. Про швидк! теши еводхяШ ретров!руе!в св^дчить в!дкриття ! вивчення екзогенних ретров!рус!в у людей, що спричиняють виникнення лейкоз!в 1 синдрому набутого !мунодеф!циту. При чому, в1рус !мунодеф!циту людини 1 (Н1У-1), очевидно, виник за останн1 п1встолзття 1 походить в!д ретроварусу мавпи БIV. Зм^ни в яких дхлянках геном!в ретров1рус1в е суттевими для подальшох еволюц!х 1 розповсюд-жння у природ!?

Зручним ! безпечним е використання в!русу саркоми Рауса (ВСР) 1 його пох!дних як модел! для досл!дження харагаеру перетворень вирусного генетичного аппарату, як! приводить до зм!ни хазяЛна, утворення репл!кац!йно-дефектних в!русних часток, формування нетрансформуючих або нових трансформуючих в1рус!в.

Ранхше в надаму в1ддШ була визначена куклеотидна посл1довн!сть геному адаптованого до качиних кл!тин вар!анту в!русу саркоми Рауса (с!а Рг-ЯЗУ-С) [Кашуба та !н., 1993]. Вказаний в!рус с!а Рг-йЭУ-С здатний з такою х ефективн!ст» !нф!кувати та трансформувати качин! ембр!ональн1 ф!бробласти (БЕГ), як вих!дний в!рус саркоми Рауса !нф!куе 1 трансформуе

куряч! ембр!ональн! ф!бробласти (СЕР). Анализ нуклеотидних посл!довностей da Рг-ЯЗУ-С 1 його предка Рг-ЯЗУ-С виявив нуклеотиднх зам!ни, котр! розпод!ленх нер!вном1рно по всьому геномов! адаптованого до качиних кл!тин вар!анту ЯЗУ. У зв'язку э цим виникло запитання: зм!ни в яких д!лянках геному ВОР зумовлюють високий р1вень реплхкацН в!руеу в кл!ти-нах нового хачя!на та ефективну трансформацхю цих гл 1 тин?

■ 1з пулу адаптованого в!русу da Рг-НЗУ-С був вид!лений трансформацхйно-дефектний (Ьс1) мутант, який втратив увесь ген у-згс. Шсля !нф!кування повним Ьс1-мутантом курячих ембрхон!в був одержаний новий саркомний вхрус РЯ2257, пронес формування якого повинен був в!добразити законом!рност! ут-ворення високоонкогенних ретров!русхв у природ!. Визначення первинно^ етруктури в!русу РЯ2257 показало, щр його 5'~к!нець сформувався в результат! сплайсингу, який з'еднав дхдерну нуклеотидну посл!довнхсть вхрусу з екзоном 1 прото-онкогену с-згс курки (бегук еЬ а1., 1989). Подалыя! поди: формування в!русу РК2257 залишалися невиясненими, оск1льки, структура 3'-к!нцево£ частини трансдукованого протоонкогену зге, де в!дбулась 3'-рекомб!нац!я, була невхдома.

МЕТА I ЗАЕДАНИЯ ДОСШДЖЕНЬ. Метою запропоновано£ роботи е встановлення ймовхрного механ!зму формування саркомного вирусу РР2257 та виявления дхлянок геному da Рг-ЙЗУ-С, зм!ни в яких вкзначають здатн1сть в!русу швидко розмножуватись в кл!тинах нового хазяхла та ефективно ix трансформувати. Для досяглення поставлено! мети необх1дно було вирхшити так1 аавдання:

- визначити первинку структуру протоонкогену зге (його 3'-к1нцево2 облает!) та провести И пор!вняльний анал!з 1з структурами геномхв вих!дного трансформацхйно-дефоктного. та

- 3 -

утвореного онкогенного PR2257 BipyciB;

- створити peKOMCinaüTHi пров!руси на баз! reuot/.íB адаптованого та вих!дного вар!ант1в RSV í визначити 6íojiorí4Hí характеристики химерних молекул ДНК шляхом трансфекцН i вимхру титр!в одержуваних BipyciB.

НАУКОВА НОВИЗНА I ПРАКТИЧНА ЩНШСТЬ РОБОТИ. Встановле-на структура невизначено1 раШше 3'-кхнцево! облает! прото-онкогену c-src, трансдугаЦя якого привела до утворення сар-комного Bípyey PR2257. Знания структура вказано! области гену c-src i структур вих:дного трансформац1йно-дефектного та одержаного саркомного BipyciB дозволило запропонувати ме-хан!зм формування останнього, який в!добралае шлях утворення високоонкогенних BipyciB в природа. Вперше показано, ¡до 3'-к1нцева область c-src, яка не транслюеться, може брати участь у npaBOCTopoHHix рекомб!нац1ях в ход1 зворотноа транскрипцН при формуванн! саркомних BipyciB. Встановлено, що 3' -некодуюч! регiони останнього екзону 12 ген!в c-src курки i перепхлки не мають додатковог рамки эчитування, про 1снування яко£ пов!домлялось рanime (Doral et al., 1991). Продемонстровано, щр видовий троШзм адаптованого до качиних КЛ1ТИН BapiaHTy Bípyey саркоми Рауса (da Pr-RSV-C) головним чином зумовлений природою гену env i менше - природою довгих к!нцевих noBTopiB.

Таким чином, отриман! дан! дозволили створити модель формування високоонкогенних ретров!рус1в та визначити BípycHi детерм1нанти, як! зумовлююгь видовий тропизм Bipycy.

АПР0БАЦ1Я РОБОТИ Ochobhí результата, викладен! в дисертац!йн!й робот!, допов!дались на симпоз!ум! Европейсь-ко! Асоц!ацН досд!джень раку (the Meeting ЕАСН-ХП. Brussels, 1993), на розширеному ceMiHapi в!дд!л!в моле куля р-

Hoi снкогенетики, б1осинтезу нуклехнових кислот та в!дд!лу 6ioxiMi4iioi генетики 1нстктуту молекулярноИ б!ологП та генетики HAH УкраКни.

ПУБЛ1КАЦГЗ£. За матер1алами днсертаЩ i опубл!ковало 4 роботи.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ РОБОТИ. Дисертац!я складасться 1з вступу, огляду л1тератури, опису матер!ал!в та методов досл!дження, • одержаних результатов та ix обговорення, BHcnoBKiB та списку л1тератури, використаио! при налисанн! дисерт^дИ. Робота викладена на 88 стор!нках 1 включае 13 малшк!в i 3 таблиц!.

3MICT РОБОТИ

ЫАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ.

Скрин1нг reHOMitoS б!бл!отеки переп!лки для вид1лелня клон1в, як! м1стять нуклеотидн! посл1довност1 гену src, проводили за Benton i Davis (1977) э використанням src-cne-циф!чних зонд!в, представлених на мал. 1. Фрагмент геномно! ДНК, який в!дпов!дае 3'-к!нцю c-src курки, був клонований п!сля проведения пол1шразно1 ланцюгово! 'реакцП (Saiki et al. , 1988) з використанням npafiwepiB:

5' - ATGAATTCTACTTCACCTCGACAGAGC-3' та

5' -TAGAATTCGGTGAGGTCT6TTTGTC-3', як! магагь на К1НЦЯХ П0СЛ1Д0вн0ет! сайт!в рестриктази EcoRI (п^дкреслен!). ДНК вид!лених 1з геномной б!бл!отеки переп!лки клон1в або одержаних субклон!Б, як1 Шддавались рестрикц!йному анал1зу, i ДНК-продукти ашШф1кацН п!сля блотинга (Southern, 1976) Пбридизували на ф!льтрах (Jeffreys et al., 1980) э .. Р-м!ченими зондами (мах 1). Нуклеотидну посл!довн1сть визначали аа методом Максама i Г!лберта в ыодиф!кац!ях Ко-

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 т. п. н.

Pr-RSV-C (пров1рус) LTR!-----gag------i----pol-----!----env----1 —src----1 cl LTR

pSrcU3 __

pSrcll _

PR2257 (npOBipyo) stop

LTR!--------src—!-----1 -Aenv-i LTR

F3'D _

Мал. 1. Пбридизац^йн! вонди, використан! в робот!. pSrcl)3 -фрагмент от ATG src до EcoRI-сайта Pr-RSV-A в pBR325 (Qilmer et al. . 1982); pSrcll - PvulI/PvuII-фрагмент Pr-RSV-C в pBR322 (Geryk et al., 1986); F3'D - Cfr91/Kpni-фрагмент кл1тинного походження геному Bipycy PR2257; який знаходиться за терм!нац1йним кодоном гену src. Структура npoBipyciB Pr-RSV-C (Schwartz et ah. 1983) 1 PR2257 (Geryk et al. , 1989) наведена для пояснения природи використаних зонд!в.

робка та ±н. (1978), Чувпила 1 Кравченка (1983) та за методом Сенгера (1981).

Для конструювання рекомб!нантних npoBipyciB були вико-ристан! плазм!ди pATV8 (Katz et al., 1982) i pDF3 (Кашуба та

1н. , 1993), котр! м!стять в!дпов1дно npoBipycii Bipycy сарко-ми Рауса i його адаптоватаго до клхтин тачки вар!анту. Вико-ристан! прийоми 1 методи техн!ки одержання рекомб!нантних ДНК (вид!лення 1 рестрикц!йнкй анализ плазм!дних ДНК, елект-рофоретичне роздзлення, вид1мення is агарозного гелю та лагування фрагменПв ДНК, приготування компетентних кл!тин бактерзальнш штам!в Е. col 1 та ix трансформацию л1гованою Д!1К) будж взят! 1з 36ipHHKiB метод!в молекулярно* б!ологН (Maniatis et al., 1982; MasiH та iH. , 1990).

Ембр!ональн1 ф!бробдасти курки (CEF) та качки (DEF) для транс^йкцП створеними рекомб1нантними пров!русними ДНК буля приготовлен! ва методом, описании Hlozanek et al. (1979). Трансфекц!я була виконана э використанням кошрЩйного л!по-фектинового реагенту ДОТАП (BoehrInger Mannheim) за рекомендована« виробником протоколом.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ. '

1. Визначешга са-руктдаз 3'-к1нцевкх регШйв ген1в c-src курки та nepaniJjKJL

Для встановлення механ!зму формування гостротрансформу-ючкх BipyciB важливо знати не т!льки структури вих1дного та новоутвореного BipyciB, але також i трансдукованих протоон-коген!в. Геном Bipycy PR2257 в 5'-частин1 утворений шляхом з'сднання посл^довностей в!русного лйдерного рег!ону з екзо-ном 1 гену c-src (Geryk et al., 1989). Це вказуе на те, up першим кроком в аахопленн! гену c-src е формування г!бридно-го транскрипту, сплайсинг котрого Mir привести до такого. 5'-з'еднання. 3 другого боку був невияснений механ!зм З'-ре-комб1нацН при утворемн! Bipycy PR2257, який разом э кодук>-чою ну1«еотидною посл!довн!стю c-src м!стить додатково значку д!лянку (близько 950 н. п.) геноыцо! ДНК курки, природа

яко! була неведома. Визначення структури З'-реПону c-src дозволило б встаиовити мЮце 3'~рекомб!нацН та природу трансдукованого в PR2257 фрагменту кл1тинно1 ДНК. Якщо за-хоплений фрагмент ДНК Bipycy PR2257 не с кол!неарним кДНК c-src, а м!стить додатково !нтронн! посл!довност! ! навить нуклеотидн! посл!довност!, як! не налетать гену src, то це однозначно б св!дчило про участь ДНК в 3'-рекомб!нацН.

Рестрикц!йно-г!бридизац!йний анал!з клону ¿Q5 (мая. 2), вид!леного i3 reHOMHOï б!бл!отеки японськоХ перепглки шляхом скринингу э використанням зонд!в pSrcU3 (мастить весь v-src) та pSrcll (мал. 1), показав, що ттльки один BamHI-фрагмент розм!ром близько 2.9 т. л. п. г!бридизувався з обома зондами (мал. 2Б), вказуючи на те, що клон AQ5 м!стить т!льки З'-частину гену c-src, оск!льки кодуюч! екзони цього гену розтаяюван! на д!лянц1 близько 8 т. н. п. (Takeya i Hanafusa, 1983), а проба pSrcll здатна г!бридизуватися .нише з нукяео-тидною посл1Довностю, кодуючо1 С-к!нцев! ам!нокислоти ррбОс-sro.

Згаданий фрагмент 2. 9 т. н. п. клону AQ5 субклонували в склад1 плазм!ди pUC19 по сайту Ba:i4il (мая, 2В). Виб!ркове сиквенування вставки клону pF2.9 та результата г!бриди-зац!йного анал!зу (дан1 не показан!) з використанням зонду F3'D (фрагмент трансдукованоХ нуклеотидко! посл!доеност!, який знаходиться за терм!нуючим кодоном гену v-src PR2257 [мал. 13), дозволили картувати та сиквенувати д!лянку, шр йде сл!дом за терм!нуюч1{м кодоном c-src перепелки (5ас1-ВатН1-фрагмент розы!ром близько 1.1 т.я.п. [мал. 2Ю. Подальше вивчення структури 3*-KiHyeBoï облает! гену c-src переШлки опростилось у зв'язку з появого публ!кацН з вста-новленою посл!дог.я!стю кДНК курки (Dorai ot al., 1991).

a.i-Щ

e-e-K)

4 .4- ?.»

2 . 0- Si !

2 3 4 5 6 7

.» ... {Jc; "' Jo^f-*

1 2

Q56

В

Д05

B.1BL3

-2.9

&> & -2.9

3•-некодуючий perlon c-src

В s B"S

Мал. 2. Рестриктко-г1бридизац1йний анализ фагового клону JQ5. А. Электрофореграма фрагмент!в ДНК AQ5 п!сля роашеплен-ня рестриктазами: 2 - Cfr9I+BamHI, 3 - SalI+Cfr9I+BamHI, 4 -Cfr9I, 5 - SalI+Cfr9I. 6 - BainHI+Sall. 7 - BamHI; доражка 1 - маркер довжини рестрикцШшх фрагмент!в Л/HindIII (ДНК фага Я, г!дрол1эована рестркктазою HindiII). Цифри л!воруч вказують розмтр маркерних фрагментов, а цифри лраворуч -розм!ри ВапШ-фрагмент1в ДНК клону Д05 в т.н.п. Б. Радиоавтограф: 4i>i сигнал», одержан! п!сля використання pSrcLB аба pSrcll (результата !дентичн!) як г!бридизац!йних зонд!в. 1 -

да Д)5, оброблена BamHI; 2 - ДНК Д05, розщеплена двома рестриктазами: Sali та BamHI. Праворуч указаний приблизний poaMip згс-специф!чного фрагменту. Е Клон Л05 з уназашшм розм!р!в ВатН1-фрагмент!в вставки та некодуючого periony c-src (позначений прямокутником, який покривае к!кець та початок двох ВашН1-фрагмент1в: 2.9 та 4.0 т. н. п., в! дпов!дно) , сиквенованого в ход! подальшо! роботи. Також эобраакний плазм!дний • клон pF2. 9 з субклонованим ВапШ-фрагментом (2.9 т.н. п.). В - BamHI, S - Sac I, тонк! горизонталь«! л!нН -иугслеотидн! лосл!довност! вектор!в EMBL3 або pUC19, товст! л!нН - послхдовност! вставок.

Субкяонування isrnx BatrH I - фрагме ht i в (0.5 т. и. п., 4.0 т. н. п., 5. 8 т. н. л. [ мал. 2BJ ) вставки клону . Q5 та сиквену-вання з kîhuîb вставок отриманих субклон!в дозволило встано-вити, що клон рВ4 (вставка 4.0 т.н.п.) м!стить останн! 0.8 т.н. п. 3'-к!нця гену c-src переп!лки. Таким чином, нуклео-тидна посл!довн!сть гену c-src за його терм!нуючим кодоном становить близько 1.8 т.н.п. (мал. 3).

Знайдена Dorai et" al. (1991) додаткова довга paMica зчи-,тування в 3'-к!нц! кДНК c-src курки порушувалась через делец! ï та iHcepuiï нуклеотид1в як у перепелиному Tait ! в трансдукованому в PR2257 src-генах. Щоб остаточно вияснити питания про наявн1сть додатковоХ рамки зчитування в ген! c-src птах!в, в1дпов!дну д!лянку геномно1 ДНК курки було клоновано за допомогою пол!меразно£ данцюгопо! peaituiï. Од-нак, сиквенування 3'-к!нцево!1 частини c-src !з ДНК курки породи Brown Leghorn не л!дтвердило !снувания додатково* рамки зчитування в розглянутому район! Гену.

Slr22i tai of eios8]Ustr«a6

1 «¡штаспптишсвовсыш^ 769

Sct221

i ccctl£g||tcteíi!tiitjccííjgZ¡:¡etttjJiUígjt4UtiíM8ííUtíUUttí\tE!5tí2U«

esd of latroolSJitisail -z>

i ОТ17Ш!ЖАтштш1ЯС4ше5Скс1сэтсиснсст5шш(етгА1Х1а;шзгссе&з« use

I -------{-------------5-----------------------------------------------

J -с--------с--------------С-----------------------------------------------------------------------------------------------------1456

Ы oí Utroalll(«o»12">

j ес:цстсогспсштш/.тастжмсас(гтат 1553

Î ---------с-----------------------j---------------с-—G-----------C--C--G--------

3 ---------с------------------------j----------------С----g.---------C--S---------1S53

lfs50! _box?

1 стгстсссАСТ5асшААсс4аш*;Асей^^ ш

2--------------------------------------------!-------------------------------------------------C-

j---------------------------------------------1---------------------------------------------------- 1852

ifjMl

tSM'.op c-sre

1 тестшш1отшаесшшшстшзсс4шшес^^ 1752

3-------------------------------------С— и--------С-----------i— 6-С-------С------------------ 1752

i бАС(т5ссш5ссшгсшэтсАссс™^ isso

3 ~-----•----------,---------f-------------к---------------С-—С—----etc-—Т--------С----1948

4------------------------------е-----------.---------------;—р.——.-CSC----T-------С----

1 1049

3..........------Т------С------С--->------------------>-------Т--------------------¡M

2 —.....с-------е—î----с—с----с—c-i—c———-—i—e—---------

3..........•-......-S--T-------С-.....С-----------g-----С-А--С...............---------------2143

4.......—С--------С—I-------С-----С-----í----С-4--С------------á-в------;-----

i iSACCTTGGSiiGccccGTGGÄGccTS'TGGictcccT—откт/ттотатасшстмстстстлшёшяст 2244 г-----------------1—е—J---------itci-e-—te—в---------с-............-и---------------

3----------------->-----|j~д----------ГСТ--8-----CC"~~G---------•---------------ТА-----------------2243

4----------------и--------------ТОТ-«-----TS—G---------В--------------и-----------------

1 ашпоттаса<ш1™ттт«<так<ш^ гиз

2 —G...............-GA-----------------------С-"С----------С-Т------------С—— А-С-С-----G—S--

3---G----------------И-----------------------ССАС----------*-Т-------------С-----А-С-С-----G—С— 2312

4----s---------------Ci.---------------------С-"С----------С-Г-----------С------А-С-С—AG—в—

_ЪохР"

2 -с.................Т-------------------------S—TS--------А--Т--С— 6—в------------Т............

3 -К-----------------Т------------------------8—TS--------А—-С—G~'G...........г------------im

4 -е-...............Т--------------------------S—TG--------А—Г—С—-в—в............Т------------

i тгтстссттссатсяшсшспсстетестетс........астштассаг**шсгвтсстгАгавтвошсг ¡яг

г-------1---------------GC--------------S-A---------GTGTTCCTC..........CCCGC----------ÍS-T—С— -Т-

3 ...............GC--------------6-А---------6ТБТТССТС-.....—ЁСССС-.........TG-T—С-...... 2529

4-------у.--------------СС--------------в-А--------STGTTCCTC----------SCCGC-.........Тв-Т—С-------

i одажтсАтасАгатсАССАетвттхгшототА^ 2532 г--------g------------С--------------S-----Т--------А---------G.................G........G-'«

3--------s------------с--------------с-----х--------А---------С-—.......-S-.......G----------- 2628

4-------s------------с--------------G-----1--------А---------G----------------G-.......5-----------

_hoi9"

1 сстсетшттсаАгбС8тетАтАПАсствАспасА5пшшп5птаАТА5тглотсА5Т5ш»об5опитА2нз тг

3----------e„c-c—-с—-с---------------------С--С—-----с-с-с-...............ли........«с-— гтгт

4----------G-C-C-—С—С----------------------С—С—С-—С-С-С----------------ÍGS--------СТС-—

i Tí7ccíG5GíTCcciCTmGGOTCc¿fficcrmcrar«imnmncAcm«AmcsixccnCTcccCTncí/csm.......2025

3---------------С—-С-С-----А-----Т--6--С-С—CA-------G-.....С-СА...............С-G-......CCTSÎCC 2627

4---------------с—с-с-—a-—r--s--c-c—с--------в—e-e*-.........к.....es-......costs;

i "ссстшотспбСТ9САадаб<шшбсстшспаАСАгс^^ гэгз

3 ее-------------6----""6-А-Т--------в-----Т—G—GT"-T—СТ-СС--............G—GC—С-С--------- 2922

4 СС-------------G-----------G-I--------G------Ï-G-—GT'-T-GT-CC-------------GC--------C-C---------

i таатшАссосшсалсАСАгсАгсАСгтссссАТбштсш&АТбТ№1ШСАеста!ХА(ибсеААСШ№сшаш1; мгз

3--------AAG—.........................*-------------------G------S G-------""—.......G- SS91

4.............................................................fr------8-G--------—-----------G-

1 Агсш«мс<шгстестса1тттшдасссстсгвд^ Ли

3 g.-—.—и—"—тг—тис—c--------------------s---------------------------------ctcc-c soee

4 в--------Ci—"~TT—TGT—С-----------------С-—в----------------------------------ЯСС-С

i шотстгпвстшбгеАбШбст'ч-тссшшат 321s

j „-о----------------CA-CT-CAGS-Г—С-------Î--T-----------------С---------------------M.....Т- 3185

4 —ç.-----------------GA-CT-CAGG-T—С-------Î--Ï-----------------С--------------------C-T-—Т-

I ктешш7ШАТШбтйшбГААСАТ(тАствАШ1еааввшп8бАташтстасса^ ш

j-------------1------------------------С--------е~4"---------------С—Т--С 6—C-C--C--Î-ÎT 3283

4--------------j.---------------------с---------а—i"---------------с—г--св—ее-—г- тт

i -еттгг пгтгтствАТ А жт ь* - - - - л - ззт! 4 —т-тв-----........................С—........К-.....СТТТШШСПТППТТСТСДИАТАА—А-----в-

i штссшсатетаадтесототтаг"Аш.ит«стта од

i l-l-C-----IS----T—«--«—№№-(------С-----6-С----------------------------------МП

i S--Í--C----lt-W-И-----GGGGC-----------(г С-------------------------------

i ÍMT

)----------------Folf(à)«» M»

Мал. 3. Шр1вняння нуклеотидних посл!довностей 3'-областей перепелиного (геномна ДНК С13) та курячого (геномна ДНК [4] 1 кДНК С33) ген!в c-src, а також v-src npoBípycy PR2257 (2). Вказана посл!довнхсть TGCAGGTT (box Р), пр представлена в 12-му экзон! c-src курки дв!ч! та мае дв! зам!ни у другому повтор! (box Р') в ген! c-src переп!лки (роль цього повтору в формуванн! 3'- К1НЦЯ v-src RSV обговорюеться Dodal et al. t19913). Шдкресдено 39-нуклеотидну д!лянку c-src курки, 1дентичну 3'-к!нцев!й д!лянц! v-src RSV, сигнал приеднання пол!(А)-поол!довност! ААТТАА i рег!они, як1 в!дпов!дають довг!й в!дкрит!й рамц! зчитування (orf) в кДНК. курки (Dorai et al., 1991) та коротким orf в геномн!й ДНК курки (або в jjpoBípycí PR2257) i в геномной ДНК лереШлки. Вказано також депк! фрагмента сиквенованих кодуючих нуклеотидних посл!дов-ностей переп!лки в пор1внянн! э в!дпов!дними д!лянками v-src PR2Z57 та c-sro курки, щр демонструе належн!сть визиачених в дан!й робот! посл!довностей саме гену c-src переп!жи.

Таким чином, нуклеотидн! nocaíRomoai 3' -некодуючих частин ген!в c-src курки та перепелки е кол!неарними посл!довност! 950 н. п., яка знаходиться ва терм!нуючим кодовом v-src PR2257 (мал. 3). Дэр1вняння цих посл!довноотей а сиквонсом кДНК курки дозволило встановити, щр вахоплений в!русом ген src не м!стить !нтронних посл!довностей i е не-

повйою Konieio мРШ c-src. Боя З'-кевдтеа чаеша гену

- 13 -

c-src входить до складу останнього 12-го екзону.

Враховуючи те, до PR2257 м!стить т!льки посл1довност! екзон!в гену c-src, здаеться ймов!рним такий механ!зм форму-вання Blpycy PR2257 (мал. 4): в ход! !нтеграцН npoBipyc td

А

LTg_____ ОАО POL ENV c"src

td da Pr-RSV-C

c-snc

ги5рЬ»да gag pol env f u3|rrPolx(A)n И da Pr-RSV-C

tRNA

»DNA r^pbs^ тшп^г

(-)ONA I

ЭМ1НЛ МАТРИЦ1 1 ___3JOP0TH0DjrPMCl®WITA30p___|

.U3 R U5"

PBS

SRC AENV U3

л™ ДЦ5 I Г(-)0(

PBS

5'-

)ONA

"PBS W°NA

Мал. 4. Ямов!рний шлях формування онкогенного Blpycy PR2257. А. Механ!зм формузания 5'-стику Bipyc-src, аапропонований на

основ! анал!зу структури PR2257. ГаФри л!воруч позначають етапи трансдукцП протоонкогену c-src: 1 - !нтеграц!я t.d da Pr-RSV-C перед екэоном '1 c-src; 2 - утворення химерной Bipyc-c-src РНК в результат! кр!зни1 транскрипц!!-, 3 - про-цесований транскрипт, утворений в результат! з'еднання Bipyciioro донорного та акцепторного гену src сайт!в сплайсингу (особливо через неефектшзке утворення субгеномно^ епу-спе1диф!чн01 РНК [Arrigo i Boemon, 1988; McNally i Beemon, 19921); 4 - етап утворення лров!русу PR2257, ме-хан!зм котрого мав бути встановлений, оск!льки 3'-в!русн! лослздовност! могли уже бути приоутШми на етап! 3 в результат! ионередньо! peKOMöiHauii на р!вн! ДНК Mix 3'-к!нцями c-src i td da Pr-RSV-C. Б. Завершальний етап формування Bipycy PR2257. R (г) - прям! повтори, шр знаходятьея на к!нцях геному HSV; U5 (üb), U3 (u3) - ун!кальн! посиидов-HOCTi 5'- та З'-KiHUiB геному; gag, pol, env - репл1катишП в!русн! гени (малими лiтерами зробден! надписи над РНК, великими - над ДИК); малий незафарбований прямокутник -пол!(А)-посл!довн!сть; великий незафарбований прямокутник -З'-некодуюча область гену c-src, з'еднаногй з в^русним д1де-ром (г!бридна РНК Bipyc-c-src); великий зафарбований прямокутник - кодуюча посл!довн!сть c-src в г!бридн!й РНК Bipyc-c-src; малий зафарбований прямокутник - сайт пакування Bipyciioii PI1K у BipioH (ps); TOHKi л!нН (не позначен! paHiine) - послгдовност! РНК; товст! л!н!1 - ДНК, строками вказано напрямок ix синтезу зворотною транскриптазою; пунктирна л!н!я е'еднуе точку переключения синтезу м!нус-ланцюга ДНК з td da Pr-RSV-C з точкою продовжешш синтезу на З'~к!нцев!й облает! c-src, яка не транслються; тонка л!н!Я !з етр1жою аказус на завершальну стад!ю синтезу ДНК PR2257.

da Pr-RSV-C ошняеться перед кодуючою посл1довн!стю гену c-src; в результат! делецП З'-частши npoBipycy або без neï (через кр!зну транскрипц!;о та пол!адек!лювання• у в!дпов!дно~ му сайт! поруч розташованого гену, оск!льки процесинг у в!русному сайт! приеднання полз (А) на 3'-к!нц! проходять лише близько 85% РНК RSV [Miller i Stoltzfus, 19921) форму-еться г!бридний транскрипт td da Pr-RSV-C-c-src, сплайсинг котрого э'еднуе Bipycny л!дерну посл!довн!сть з екзоном 1 гену c-src. Такий процесований транскрипт здатний достатньо ефективно пакуватися в BipioH, що в окремих випадках веде до формування гетерозиготних в!русних часток. Зворотна транскрипция димер!зованях р!зних РНК в результат! зм!ни матриц! (особливо вимушено! зм!ни матриц! в м!сц! покшдаеи-ня РНК [Luo i Taylor, 19901) на короткий д!лянцх гомолог!Ï двох молекул РНК веде до З'-з'еднання г!бриднох молекули РНК в!русний л!дер-с-згс з 3'-к!нцевою частиною Bipycuoro геному.

2. Шгзначешга внеску ам1н в окремих д1ляюгах гелоиу Blpycy da Pr-RSV-C в адалтацП до кл1тни качки.

Лдаптований вар!ант ВСР в!др!зняеться в!д вих!дного в!русу тим, що мае високмй потенциал в траясформац!!' качиних ембр!ональних ф!бробласт!в: фокуси а'являюгься ран!ше ! титр Bipycy значно вищий. TaKi властивост!, могли бути зумовлен! SMiHaMii онкогену src, кодуючого фосфотирозинк!назу, спе-циф!чна активн!сть kotpoï та виб!рков!сть в трансформацН певних кл!тин залежить в!д незначних ам!нокислотних зм!н, особливо в його модуляторних доменах SH3 та SH2 (Verderame et al., 1989; Hirai et al., 1990; Llebl et al., 1992).

Найб!лыя оуттевий вяесок в адаптац!» до нового хазя^на - качю!, м!г бути зроблений зм!нами в нуклеотидн!й посл!дов-

ноет! ёр85-кодуючого домену гену env (ßova et al. , 1988; Bova-Hill et al. , 1991). Зм1нен1 продукти гену env, як1 виступають над поверхнею в!русних часток da Pr-RSV-C, можуть 61 льш ефективно вп1знаватися рецепторами качшшх кл!тин н1ж курячих, що повинно зумовлювати ефективну 1нфекц1ю в!русом саме кл1тин качга.

Важливими для зм!ни троп!зму Blpycy могли бути нуклео-тидн! зам!ни в довгих к1нцевих повторах (LTR), а саме в д!лянках, як! одахHi взаемод!яти з ДНК-зв'язуючими б1лковими факторами кл!тини хазя!'на, шр корелюе з енхасерною ак-тивнЮтю цих д!лянок (Zachow 1 Conklin, 1992; Ryden et al., 1993). Яшцо нуклеотидн! посл1довност1 в1русного енхансера (BipycHHX енхансер!в) доз воля ють йому ( im) усп1шно конкуру-вати з енхансерами кл1тинних ген1в за зв'язування а в!дпов1дними б1лковими факторами, то це повинно привести до ефективно£ iHiuiauii транскрипц! i' з вирусного промотору, а значить 1 до ефективно* решпкац! i Blpycy.

Енхансерн! елементи знайден! також в ген! gag та перед 3'LTR (Ryden et al. , 1993). Не виключена Sx присутн1сть 1 в посл!довностях iHfflHX ген1в Blpycy.

В ген1 gag RSV виявлено рег1они, як1 виступають як не-гативн! регулятори сплайсингу .(Arrigo 1 Beemon, 1988; McNally i Веепюп, 1992), 1 реПони, як! сприяють процесингу 3'-к1нця в1русних РНК (Miller i Stoltzfus, 1992). Не викл»-чено, що певн! б1лки кл1тини, зв'язуючись 1э згаданими рег!онами, впливають на правильний процесинг 3'-к1нця в1русних транскрипт1в 1 на проходження ними сплайсингу, чим визначаоть сп!вв1дношення м!ж геномною та суОгеномними в!русними РНК. Очевидно, що иередбачувая1 б1лки у кл1тин р!зних вид!в можуть в1др!анятися 1 по р1вному взаемод!яти а

д!лянками, як! регулюють сплайсинг i процесинг в!русних РНК (напевно, ще не Bei TaKi д!лянки виявлен!), а це може приво-дити до pi3Ho£ ефективност! репл!кацН Bipycy в цих истинах.

В даной д1лянд! роботи зусилля були направлен!, на те, щоб звузити коло пошуку тих детерм!нант, кодованих рет-poBtpycHHM геномом, hki зумовлшгь видовий TponiaM Bipycy. Тому, для визначення рол1 зм!н в окремих рег1онах геному адаптованого Bipycy da Pr-RSV-C в адаптац!i до нового ха-зя!на (качки) було створено ряд химериих ретров!русних конструкц1й. Це було виконано таким чином: в npoBipyci da Pr-RSV-C по черз! зам!няли д!лянки значного розм!ру (О. 5-2. О Т.н.п.), як! в!дпов!дають LTR та генам sre, env, gag, pol, на TaKi з вих!дного Bipycy Pr-RSV-C (одержан! конструкцзi позначен! в!дпов!дно pdaCh-LTR. pdaCh-src, pdaCh-env, pdaCh-gag, pdaCh-pol [мал. 5)). Конструювання було виконане в результат! багатоетапних клонувань э використанням при-йом!в i техн!ки рекомб!нантних ДНК. В1дпов1дн1сть сруктур одерлуваних химерних npoBipyciB ! пром!жних ретров!русних клон!в оч1куваним структурам перев1ряли рестрикц!йним " аяал!зом (дан! не показан!).

Bei рекомб!нантн! плазм!ди були розмножен! в штам! Е. coil JM109, вид!лен! ! взят! для трансфекц!* курячих (CEF) та качиних (DEF) ембр!ональних ф!бробласт!в. Як контроль ви-користовували клоновану ДНК недефектного штаму Pr-RSV-C (рАРгС, С Мег VC et al., 1986)) та ДНК адаптованого до качок вар!анту da Pr-RSV-C (pDF3, [Кашуба та !н., 1993)). В деяких експериментах як контроль використовували ДНК pATV8 (м!стить npoBipyc Pr-RSV-C. клонований по сайту Hind III гену pol (Katz et а]. . 19821).

■»вяыгдтаяшаыЕрЗйшешййеевяееж^^т л ро1 к« «те 1.ТЛ

Рг-ПЗУ-С (рАТУВ)

ВаГЛ!

6рН| Р»и1,

ЕСО011 5р1Ч Р«и1

М&с! Нра И ЕсаМ Ворие) Ши1Есо<Л1

ЦТ Гп 1 1 и нН±

а»о ро(

Рс-ЯвУ-С <рАРгС)

I

$рМ

в^ш

БрМ

. £ас1{Х>( Нв»х1 Есоп» №м1|Вц)11«| М1и1Есоа((|

ИГ 1 ГгТ ) | и

о

ип а ад

ро!

йа РГ-П&Ч-С (рОГЗ)

С3=

йзСЬ-вгс ВдЩ

О

'IV ыс 1.1 Н

Е£0в1I В»р119|| М(и IЕС0811

=11иь

ОвШЬсоИУХЬо! ВгрП»1 6д(11

> 1 1 I

йаСЬ-епу

а

ЙаСп-1ЛТ15 5*с1 0г»| Нр»1

йзСЬ-дад

О

Нр»1М|в1В»1Ш1 N11*1 «

сз=

о

йаСЬ-ро!

Мал. 5. Штучно створен! ретров!русн! рокомО!нантн! ДНК для досл!дження внеску эм1н в р!зних дхлянках геному ПЗУ в адап-тацН до нового хазяИна. Наведен! неповн! рестрикц!йн! карти пров!рус!в (вказано т!льки т! сайти рестриктаз, котр! були використан! при конструюванн! ! анал!з! рекомб!нантних пров!рус!в. Заштрихован! прямокутники - нуклеотидн! посл!довност! !а Рг-ИЗУ-С.

- 19 -

В!дносна трансформуюча активн!сть ретров!русних ре-комб!нант!в виэначалась за к!льк!стю фокус!в, сформованнх у м'Я1Сому arapi трансфекованими курячими (СЕР) та качиними (DEF) ембрЮнальними ф!бробластами (пряме досл!дження). Частину трансфекованих СЕР та DEF на окремих чашках без агару пасували два рази на тиждень протягом 14-32 дн!в. Безкл!тинна культуральна р!дина використовувалась для визна-чення калькост! утворюваних фокусiв на щойно приготовлен:« вторинних культурах СЕР та DEF, шр св!дчило про трансформую-чу активность та, перш за все, реплИсац^йний потенШал утворюваних BipyclB.

В табл. 1 подан! дан!, якi демонструюгь, шр зам!на б!льшо1 частини гену src, яка включае регуляторн! доыени SH2 та SH3, не зм!нила ефективност! трансформацН качиних та ку-

Таблиця 1. Б!олог1чний анал!э рекомб!нантно1 пров!русно1 ДНК daCh-src та утворюваних п!сля трансфекц!! в!рус!в.

а Плаэи1пн1 днк Качкн1 ембр1снальв1 Курлч1 ембр1оиальп1 ф1бробласгм (DEF) фЮробластн (DEF) FFU/pg DNAC FFU/mlb FFU/f/g DNAC FFU/ffilb

pDF3 (da Pr-RSV-C) 30 4.0x103 6.0 2.7x104

pAPrC (Pr-RSV-C) 10 1.Sx1(? 30 4.2x1 §

pdaCh-src 40 4.5x1<? 7.0 1.9x104

a ITpoBipyCHi ДНК з тих, шр зображен! на мал. 5.

b В!рус, э!браний !з культурального середопища через 14 дн1в п!сля трансфекцН кл!тин.

о К!льв1сть фокус!в (фокус-формуючих одиниць CFFU] на мкг ДНК), утворених в агар! п!сля трансфекц!5; (пряме досл1дження).

-горячих kjiIthh адаптованого ретров!русу, що випливае як з результат! в прямого визначення числа фокусхв, сформованих в м'якому arapi, так i з результат!в !нфекцН тих же DEF та CEF Biрус«ими частками, з!браними з паралельних чашок з ш~ ношарними культурами трансфекованих кл!тин (б!олог!чн! по-казники для da Pr-RSV-C та daCh-src практично нев!дм!нн!,' але суттево • 1др1зняються в!д таких для Pr-RSV-C).

При трансфекцН химерною ДНК pdaCh-env (табл. 2) в!дно-шення к!лькост! фокус!в в чашках з курячими кл!тинами до та-Koi в чашках з качиними кл!тинами (1.34) залишалось близьким до под!бного сп!вв!дношення для ДНК da Pr-RSV-C (1.00).

Таблиця 2. Б!олог!чний анализ рекомб!нантно£ np0BipycH0l ДКК daCh-env (другий експеримент).

плазк!днХ днк

Качнн1 еибр1оиальн1 Куряч1 ембр1окальн! ф!6робяасти (DEF) $1бробласти (DEF) FfWps DNA FFU/ml I-FU/pg DNA FFU/ml

48 h / 72 h 48 h / 72 h

pDF3 (da Pr-RSV-C) pATV8 (Pr-RSV-C) daCh-env

50.0 400 450 50.0 1850

12.5 1000 1300 62.5 250

6.8 710 780 9.14 750

1700 1300 000

Позначення - як до табл. 1., але продукция в!русу виз-началась т!льки на короткому часовому в!др!зку п!сля трансфекцН: 48 та 72 год.

Аде при пор!внянн! трансформуючого титру в!русу daCh-env на СЕР та БЕР на 5-й. 7-й, 12-й, 14-й, 21-й, 27-й та 34-й дн! п!сля трансфекцН стае лом!тним, щр цей в! рус значно ран!ше виявляеться вже в культуральному середовищ! СЕР (5-й день), в той час як на ВЕР в1н виявлясться лише на 12-й день (табл.

3 [тут постановка експерименту була дещо 1ншою: 1) трансфор-мацШшй титр рекомбхнантних в!рус1в визначався на р!эних часових Интервалах з моменту трансфекцН, 2) для трансфекцН бралась менша к1льк1сть доелхджуванох ДНИ - 2 мкг эам1сть 10-20 мкг в перших двох експериментахЗ). До того ж цей вхрус швидше розмножуеться в СЕР, н!ж в СЕР (табл. 3). 3 цього сл!дуе, що зам!на одного гену епч' в Рг-ЯЗУ-С гомологом 1з Рг-1?ЗУ-С реадаптуе перший вхрус до ф!бробласт!в курки ! ро-бить його близьким до вих2дного курячого вирусу. Шм1тний ефект мае також замена ЬТЯ: а! рус йаСЬ-ЬТйз з'язляеться в культуральному середовишд на 7-й день (5 РРи/т1), тод! як йаСЬ-^аг (10 РРи/т1) та с1аСЬ-ро1 (40 РРи/т1) - на 12-й день, а ааСЪ-епу - на 5-й день при титр! уже 280 РРУ/т!.

Таблиця 3. Анализ реплхкацШгого та трансформуючого по-тенцх&лхв створених рекомбхнантних в1рус!в, зхбраних в р1зн! днх п!сля трансфекцН (трет!й досл!д).

Плаэм1л«1 Трансфе днка хлХтшш ковав! РРШт) на СЕЯ

1й 2 3 5 7 12 14 21 27 34

йаСИ-епу ОЕР 0 0 0 0 0 35 100 >1000 >1000 >1000

йаСИ-ИНз СЕР 0 0 0 0 5 440 660 ЫТ ЫТ 1000

йзСЬ-дад -//- 0 0 0 0 0 10 15 270 745 1300

йаС(1-ро1 0 0 0 0 0 40 40 690 500 380

daCh-env -11- 0 € 0 260 >1000 620 >1000 >1000 >1000 >1000

а Створен! ретров1русн! ДНК, зображен! на мал. 5. Ь Дн1 п1сля трансфекцН, в котр1 визначався титр в!русу.

- 22 -

Таким чином, одержан! дан! б!олог!чних досд!джень доз-воляють зробити висновок, що адаптация в!русу саркоми Раусу до кл!тин качки зумовлена, головним чином, зм!нами (в результат! рекомб!нац!ï з ендогенним в!русом i точкових му-тац!й (Риндич та in., 19893) гену env, кодуючого 0!лки BipycHoï оболонки. Чаетково ефективна репл!кац1я адаптовано-го BapiaHTy в кл!тинах качки i, як наел!док, ефективна трансформац!я цих юптин детерм!нуеться нукдеотидними эмками в ловгих К1нцевих повторах (LTR), як! м!стять сильн! BipycHi енхаисери. Не виключено, шр внесок в адаптац!ю до нового хозяина (качки) внесли дв! ам!нокислотн! зам!ни в к!назному домен! тирозинк!нази Src, б!олог!чний ефект котрих лерев!ряли разом з ефектом нуклеотидних зам!н довгих к!нце-вих повтор!в в химерному npoBipyci daCh-LTRs (Liebl et al. С1992], Foster i Martin [19921 показал«, що й окрем! мутанЦ в к1назному домен! фосфоб!лка Src приводять до хазя!£н-спо-Щ1ф!чно5! активацН).

висновки

1. В результат! клонування та сиквенування згс-спе-циф!чних геномних ДНК визначена струкура 3'-к!нцевих частил протоошсогенхв с-зга курки та перепелки. Встановлеко, шр довгий 3'-некодуючий регион с-згс е одним 12-м екзоном, 1 не м!стить додатково! в!дкрито£ рамки зчитувания.

2. Запропоновано ймов!рний механ!зм 3'-рекомб!нацН при формурованн! саркомного вирусу РР2257. В!к включае етап зм!ни матриц! зворотною транскриптазою в коротких д!лянках гомолог! !£ м!ж в!русною та г!бридною в!рус-с-згс РНК в ход! синтезу ДНК I в!добрадае природний шлях внникнення гострот-рансформуючих в!рус!в.

3. Для досл!дженяння рол! окремих ген!в та д!лянок геному ретров!рус!в у визначенн! Их видового троп!эму був сво-рений ряд рекомб!нант!в м!ж в!русом саркоми Рауса, Празький итам, тип С (Рг-КЗУ-С) та його адаптованим до качок вар!ан-том (сЗа Рг-ИЗУ-С) ± проведено *х б!олог!чний анал!з.

4. Встановлено, що серед нуклеотидних зам!н в геном! в1русу саркоми Рауса в процес! його адаптацН до нового хо-зяхка - качки, головну роль з!грали зм!ни гену епу, викли-кан!, як було показано ран!ше (Риндич та !н. , 1989), ре-комб!нац!ею з ейдогенним в!русом. У зм!ну троп1зму в!русу також зробили внесок нуклеотидн! зам!ни в из-район! довгих к!нцевих повтор!в. Ц! дан1 можуть св!дчити про те, шр зм!на хазя5!в ретров!русами визначаеться природою гену, кодуючого гл!копроте!ни в!русно£ оболонки, ! довгих к!нцевих повтор!в.

IfcpejiiK poOiT, onyQjiiKOBaiiHX sa MaTepianaMH flHcepTaniii:

1. Hlozanek I., Rynditch A. V. , Mikhailik A. Role of replaced v-src and env genes in the duck-adapted variant of Rous sarcoma virus // Folia Biologica - 1993. - v. 39, N4. -P. 203-210.

2. B. A. Yatsula, A. A. Mikhailik, A. V. Rynditch, G. Calothy, Ph. Deezelee. The 3' region of c-src gene mRNA is entirely included in exon 12 and does not encode another protein // Biochimica et Biophysica Acta - 1994. - N1218. -P. 473-477.

3. Rynditch A., Kashuba V., Zoubak S., Dostalova V., Mikhailik A. and Hlozanek I. Molecular basis of retroviral adaptation // The Twelfth Biennial Meeting of the EACH: Programme and Abstracts Book - Brussels, Belgium, 1993. -P. 116.

• 4. Yatsula B. , Rynditch A., Mikhailik A., Calothy 6., Dezzelle F. About the genomic structure of protooncogene c-src // Intern. Meet, on "Growth control and therapy of cancer": Abstracts - Budapest, Hungary, 1994.

Annotation.

Mikhailik A. A. Formation of avian sarcoma viruses during transduction of protooncogene src and adaptation to non-specific host.

Thesis for a degree of Candidate of biological science, Institute of Molecular Biology and Genetics, Kiev, 1994.

The thesis contains the results suggested the mechanism of formation of avian sarcoma virus PR2257 and pointed out the viral déterminantes responsible for the alteration of species tropism of RSV. To understand the mechanism of 3'-end of PR2257 formation the primary structure of 3'-untranslated regions of chicken and quail c-src genes lias been determined. It was shown that transduced by PR2257 c-src sequence is colinear with chicken src cDNA. This result suggests that PR2257 was generated by recombination at the RNA level during reverse transcription. It was determinated that the alterations in the env gene play a major role in process of RSV adaptation to the duck cells. The nucleotide substitutions in U3 region of LTR also are essential for this process.

АННОТАЦИЯ.

Михайлик А. А. Армирование ретровирусов сарком птиц при трансдукции протоонкогена вгс и адаптации к неспецифическому хозяину.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики, Киев, 1994.

Диссертационная работа содержит экспериментальные данные, отражающие механизм формирования саркомного вируса РЯ2257, а также указывающие на вирусные детерминанты, ответственные за изменение видового тропизма вируса саркомы Рауса (РЭУ). В частности, для выяснения формирования 3'-конца генома вируса, была определена структура 3-некодирумщих областей генов с-йго курицы и перепелки. Показано,что трансдуцированная в состав генома вируса РК2257 нуклеотидная последовательность гена зге курицы колинеарна его мРНК, на основании чего предложен вероятный механизм формирования указанного ретровируса, включающий этап смены матрицы обратной транскриптазой при правосторонней рекомбинации. Также установлено, что в процессе адаптации КЗУ к утиным клеткам главную роль сыграли изменения в гене епу. Существенное значение в этом процессе имеют и нуклеотидные замены в 113-райо-не ЬТР.

Ключов! слова: трансдукц!я, эге, ЯЭУ, адаптац!я, видо-вий тропхзм.