Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МУТАНТОВ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ BACILLUS DIASTATICUS, ОБРАЗУНЦЕЙ АЛЬФА-АМИЛАЗУ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МУТАНТОВ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ BACILLUS DIASTATICUS, ОБРАЗУНЦЕЙ АЛЬФА-АМИЛАЗУ"

АКАДЕШЯ ДОК СССР ИНСТИТУТ ШСРОШШОШИ

На правах рукописи

МУШгаНА Валентина Павловна

УДК 575.24:576.851.5.095.14

ЙШШОГО-ЕИОШВШСКИЕ СВОЙСТВА МУТАНТОВ ТЕЕЫОИШйШ БАКТЕРИИ влс1шк г>1л2тат1стт5, ОБРАЗУЩЕЙ аС-ЫЖШ

(03.00.С7 - микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -академик А.А.ШИЕНЩКИЙ.

Москва - 1985

Работа выполнена в Институте цнкробмологж« АН СССР

Научный руководитель - академик А.А.Ишеяецкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук I.Г.Логинова

доктор биологических наук А.М.Безбородо».

Ведущее учреждение - Московский Государственный Университет и». М.В Ломоаосова.

специализированного Совета Д.002,64.01 при Институте микробиология АН СССР по адресу: 117312, Москва, В-312, проспект

60-летия Октября, д.7, корпус 2, Институт микробиология АН

СССР.

С диссертацией нохао ознакомиться в библиотеке Института шкробиологм АН СССР. ,

Автореферат разослан 1985 г.

Учений секретарь специализированного Совета

кандидат бяод.ваух старшей ааучвнй сотрудник ^¿¿¿¡^ 2.Н.Москаленко

Актуальность проблемы. В последнее время термофильные микроорганизмы, в том числе относящиеся к роду Bacillus, как продуценты tsttaоферентов (амилаз, протеаз, целлш&з и др) привлекают все большее внимание исследователей (Sonnleitner, 1984). Интерес вызван тем, что у термофилов процессы разложения субстратов протекают активнее, чей у ыезофилов, Термофильные микроорганизмы обладает высокой сяоростьп роста клеток и ускоренным биосинтезом ферментов. Высокие температуры выращивания предохраняют эти организмы от заражения посторонней микрофлорой. Ферменты термофилов по сравнении с ферментами хезофнльнше форы обладает более высокими темшратурньад! оптиыумаыи действия на субстрат (70-90°) и термостабильностью, что является ценный качеством для многих технологических процессов.

Уникальная термофильная бактерия Bacillus diastaticua быка ввделена и описана А.А.Йытенецким с сотрудниками в I94E году. Бактерия растет при 60° и образует терыостабильный фермент, относящийся к декстринирупцим амилазам (KS 3.2.I.I),. который расщепляет крахмал в интервале температур 50-95° с оптимумом 75-60°. Фермент активен при pH 4,6-7,9 и имеет оптимум pH 5,8 (Имшенец-кий, 1942, 1944; Кислухина, 1963). dL-Амилаза 3.diastaticua была рекомендована для применения в текстильной и спиртовой промышленности (ИышенецкиЯ, 1943; Улезло, 1961; Максимова, 1973),

Из природных источников выделены и описаны другие споровые бактерии, образующие вС-амклазу (Логинова, 1973; Цяпаина, 1983; .Виопосог^ 1975). Ваяно, однако, не только вьделение термофильных продуцентов из природных источников, но и получение у таких организмов высокоактивных мутантов. Число работ, выполненных в stow направлении, невел! ".о (Гендина, Логинова, 1974; Hartley , 1963). В отечественной литературе отсутствуют данные о получении более активных мутантов термофильных бактерий, образующих вС -шихазы. Поэтому селекция термофильных бактерий, образующие ферменты, с применением мутагенных факторов, а также изучение физиологии полученных форы является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена получению под действием мутагенов втамиов термофильной бактерии в. diastaticua с повышенным уровнем синтеза .¿.-амилазы и сравнительному изучению их фиэиолого-биохимическюс особенностей. Задачи исследования бши сдедущие:

I. Отобрать наиболее активный вариант в результате изучения

; ' LiK.Vl

; научна; i

естественной изменчивости в.ЗДаагаЗДсие по биосинтезу «£.-ш-лазы.

2. Подучить мутанты с измененным уровнем синтеза »¿-амилазы методом селекции активного варианта, с применением иутагеноа физической и химической природа.

3. Изучить физиодого-бнохимическне особенности подученных мутантов.

4. Изучить регуляцию биосинтеза о£»-амилазы у активны* мутантов факторами внешней среди.

Научная новизна, работы. Впервые изучалась естественная изменчивость термофильной бактерии в.а±аага(1сив по биосинтезу ' (¿-амилазы и была выявлена гетерогенность популяции по этому -признаку. Иэ популяции выделены активный по «¿-амилазе вариант 13 и неактивный - вариант 9.

Проведена селекция активного варианта 13 с применением цута-генньк факторов (УФ-дучи, новоэмбкшн, нитрозогуанидин) и получены высокоактивные по Л-амилазе мутанты УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8 и низкоактивный мутант УФ 60-1.

Впервые детально изучены морфология, ультраструктура и физио-лого-бкохишческие свойства высоко- и низкоактнвных штаммов. Установлено, что киэкоактивные штаммы - прототрофы, а активные -ауксотрофы, нуждающиеся в тиамине (наиболее важный фактор), биотине, ПАЁК, аланике, фенияаланине и метиошке. Показано, что различил в морфологии гигантских колоний, тонком строении клеток, интенсивности спорообразования, потребностях в фактор» роста атаммов коррелируют с различиями в уровне синтеза ряда гидролитических ферментов: амилазы, гдгасоамилазы, нальтаэы, транетликози-лазы, протеазы. Это признаки могут использоваться при отборе активных по оС-амилазе продуцентов . Родство ннзко-и высокоактивных штаммов с исходной культурой подтверждено геко-типическим анализом. Впервые обнаружена и экспериментально подтверждена лкзогенность термофильной бактерии. Обнаружено такте, что профаги мутанта НЗНГ 6-10.8, обладающего наиболее продукткв-иш синтезом ¿-амилазы - дефектные.

Предложен способ расчета разжижающей способности «с-амилазы при использовании вискозиметра Оствальда, что облегчает сравнение штаммов с разным уровнем синтеза этого фермента.

Практическая шнность исследований. В результате проведения ступенчатой селекции с применением мутагенов получены мутанты

термофильной бактерии в.<11аа*а«1сиз » превшахщне исходеуп культуру по уровни синтеза Л-амилазы на 52-6СЙ. Оптимизация состава сред методом математиче ского плакирования эксперимента позволяла увеличить ашлолитичесяуп активность наиболее продуктивных мутантов в 2,5-3 раза. Проведены успешные испытания цугента Н2НГ 6-10.6 в качестве продуцента ы,-аыияазы при выращивании в поду-производстве иных условиях. На а тот нггаш получена авторское свидетельство # 661014.

Апробация работы. Материалы диссертации были долшеньг на конференции Всесоюзного научно-исследовательского института продуктов брожения, Москва, 1976 год; на Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов ", Пущине, 1001 год; на Всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства", Москва, 1983 год; на конференции "Генетика и физиология микроорганизмов - перспективных объектов генной инженерии", Пущино, 1994 год; на Всесоюзном совещании "Цитология микроорганизмов", Пущино, 1984 год.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре статьи, тезисы четырех докладов; получено авторское свидетельство на шташ 3.<11 аз НШГ 6-10. в » 661014.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы (471 наименование работ отечественных и зарубежных авторов) и приложения. Работа изложена на 222 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 таблицами и 36 рисунками.

Место проведения работы. Работа проводилась в Институте микробиологии АН СССР в Отделе физиология цутантов микроорганизмов (заведущий отделом - академик А.А.Имшенещшй). Электронно-микроскопические исследования выполнены совместно с д.б.н. В,И.Бирюзовой и Н.А.Кострикиной. Определение состава ДОС и молекулярная гибридизация ДНК - да из клеток мутантных штаммов и исходной культуры Е.41ае1а1;1сиэ проведены совместно с к.б.н. А.Ы.Дысенко. Изучение лизогении термофильной бактерии в.ЛАйЕЛаъюив проводилось в Институте молекулярной биологии АН СССР в лаборатории электронной микроскопии (заведущая лабораторией - д.б.н. А.С.Тихоненно).

ЭКШЭДЩНШШЯ ЧАСТЬ.

Объект и методы исследования. Исследования проводили с тер-мофкиьной бактерией в.diastaticus, полученной от Л.И,Солнцевой (Институт микробиологии АН СССР). Культура хранилась с 1942 года на картофелъко-пептонном агаре с мелей (КПА) при 4-10° с пересевами 2-3 раза в год. Исходную культуру, варианты 9 и 13 и мутанты УФ 60-1, У4 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8, полученные на разных этапах отбора, поддерживали на КПА.

Для изучения естественной изменчивости в. dlaetaticue выделяли капельньм методой на чашах с КПА ыоноспоровыэ варианты из суспензии, содержавшей до 80& спор. Вегетативные клетки в суспензии предварительно разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе типа УЗДД-I в течение 20 ыкн при частоте колебаний 35 кгц и силе тока 0,2 аып. 1£аздиЯ из отобранных вариантов проверяли на способность образовывать -амилазу в яидной среде № I с картофельньы крахмалом, кукурузной мукой и кукурузный экстрактом (Максимова, 1973). (культивирование проводили в течение 18 часов при 60° на круговой качалке с 240 об/мш в конических колбах емкостью 2ЕО мл. В колбы наливали по 30 ыл среды.

Посевным материалом служили 18 часовые клетки (ранняя стационарная фаза роста), выращенные на скошенном ША при 60°.

Мутагенаьщ обрабатывали вегетативные клетки термофильной бактерии, предварительно выращенные в кидкой средз 9 3с глгкоаой, глутаминовой кислотой и дрозшеоым экстрактом Diico (Цашаша, 1972) в течение Л часов при 60° и разъединенные затем ультразвуком <35 КГЦ, 0,2 амп, 7 кик) на. одиночные. В качестве мутагенных факторов применяли УФ-лучи в дозах от 4,65xICr до 65,10x10^ эрг/кь^ (источником служили лампы ЕУВ 15, издучаицие преимущественно УФ-лучи с длиной волны 253,7 ны); новозмбихян 0,1$ и 0,5% растворы с экспозицией 30, 60, 90 икнут, китроэогуанидин в концентрации 100 ыкт/ш с экспозицией 20 минут. После обработки мугаге!1ами проверяли шкивае-мость клеток, высевая их на КПА и инкубируя 24 паса при 60°. Отбирали одиночные колонии, различающиеся по величине и консЕстенцяи. Первичный отбор активных варинатов проводили путем однократной проверки их акилолитической активности, выращивая варианты в жидкой среде № I или № 2-мальтозо-пептонная среда ( ваНеу.МагМмтеп , 1975), Активность всех проверенных вариантов рассчитывали в процентах к средней активности контроля, которую принимали за 10СЙ. Контролем служил вариант 13, не подвергавшийся действию мутагенов.

"Плюс* - и "минус" - вариантами считали те варианты, активность которых отличалась от среднего значения контроля (X) на » 2 б-' (удвоенное стандартное квадратичное отклонение). В работе применяли метод ступенчатого отбора. Стабильность высокоактивных штаммов проверяли в пяти пассадах.

Морфологии клеток и гигантских колоний у отобранных вариантов изучали на КПА через 48 часов роста при 60°.

Прототрофность культур выявляли) высевая клетки на минимальную агаризовакную среду V 4 с глпсозой или мальтозой. Состав среди (в источник углерода - 0,5; ш+с1 - 0,5;нн4ж>3 • - 0,1) Наг30л (беэв.) - 0,2; К^ИР04 (беэв.) - 0,3; Юу^ - ОД:

- 0,01; атар-агар-1,5, рН 6,6, среда готовится на дистал.воде. Потребность в факторах роста изучали на этой же среде, используя матрицу Холлидея (Кдаус, Хейс, 1970).

Нянякке источников углерода и азота на биосинтез амилазы у штампов В.41аага*1сие изучали в среде » 4 и № 5 (соответственно), добавляя еледущие факторы роста: тиамин, ПАЖ - 1,6-1,7 мкг/мл; биогин - 0,15-0,17 мкг/мл; аланин, фенилаланин и метконин - 3,5 мкг/мл для М- -фор». Состав среды # 5 (в %)'. мальтоза - 0,5; Иагго4 - 0,2; К^НИ^ - 0,3; Ме504 яШ^О - 0,01, рН 7,15, среда готовится на трис-буфере.

Оптимизацию питательных сред проводили методом ШЭ и ШЭ 24 (Ыаясямов, Федоров, 1969).

Дй^фвренциальнув скорость синтеза амилазы рассчитывали по формуле , где л Е прирост акилодитической активности; л В

- Прирост биомассы за это же время £ *е1кег,СатрЬе11 , 1963).

Индукцию биосинтеза акилазы изучали в минимальной хидкой среде № 4 по модифицированной методике Ииллера (1975).

Дизогенное состояние штаыаов выявляли перекрестным методом Фиска (Габрилович, 1973). Образование фагов индуцировали митомици-ном С в концентрации 10 и I шсг/ыл и УФ-лучами в дозах 1,2-4,£Сг10^ врг/мкГ. Титр фага определяли методом агарочых слоев. Морфологию клеток штаммов изучали в световом микроскопе с фаэово-контрастным устройством. Ультраструктуру клеток и фагов изучали в электронном микроскопе ¿ЕМ -100 и ¿ВЦ -100СХ при 80 кв.

Выделение .ДНК из клеток проводили по методу Марыура. (Мащшг, 1961); пуклеотидиый состав определяли по температуре плавления ДОС (кагташ- , 1362). Гибридизацию препаратов ДК проводили методом оптической реассоциации по Дэ Лею < веЬеу, 1970).

В процессе работы определяли в культурадьной жидкости: I) аьмлолитическуя активность по методу Мённинга и Кеыпбелла в кодификации Карпухиной (1969) - экспресс метод Для кассовых анализов; для более точных определений пользовались методом ГОСТ 202644-74 и методом Бендецяого, Павловой (1976); 2) раакнхавдуп способность

«¿-амилазы - с помощью вискозиметра Оствальда. Ейми предложена фо]д*ула расчета разжижапцеЯ способности: РС * ^^ nt *

где^к , оп , К£о - время истечения из капилляра диаметром 1,2 им контрольного, опытного раствора, води; п - количество культураль-ной жидкости, взятой на анализ с учетом разведения (общий объем реакционной смеси 15 мл); * - время гидролиза (5 или 10 мин); 3) махьтазнуо и трансгликозилаэчую активности - ПО методу Бендец-кого и Павловой (1976); 4) глхкоамилаэчую и цротаолитическую активности - по ГОСТ £0263-74.

Определяли также методом Шомоди-Налъсона общее количество редуцирующих веществ в гидралнзатах крахмала после прекращения действия на них ot-аыилазы B.diastaticus и количество образовавшейся глюкозы - по Ценсфорду ( Kansford, 1963). Белок в культурадьной жидкости и в клетках определяли по методу Лоури. Биомассу определяли на ЙЭК-56М по поглощение света суспензией клеток при длине волны 532 нм и весовым методом. Проводили подсчет клеток в камере Горяева; рН культурадьной жидкости определяли потекциоые-трически. Результаты экспериментальных данных обрабатывали статистически (Апшарин, Воробьев, 1962).

Лиофилиэацию штаммов -B.di&stoticua проводили на диофкльной установке Института микробиологии АН СССР.

Исходную культуру и полученные иэ нее штаммы хранили в лио-фияьно высушенном состоянии и на ША при 4°.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Селекция термофильной бактерш B.diaataticus, образующее d -амилазу.

Естественная изменчивое^ B.diaatatlcua по биосинтезу <L — амилазы. Было отобрано 102 моноспоровых варианта и определена экспресс-«етодом их аыилооштическая активность. Результаты исследований, представленные на рис.1, показывают, что 75,3* клеток активны по биосинтезу оС-амилазы, 21,5% - низкоактивны, а -неактивны. Границ изменчивости биосинтеза во-акилазы варьируют от О до 128%. Размах изменчивости обусловлен, главным образом, при-

а

й-

К'

Рио.1. Распределение мокоепоровьос вариантов в.<иа8^а*±сиз по активности биосинтеза оС-амилаэы при естествен, ной изменчивости культуры

сутетвивм в популяции низкоактивных и неактивных клеток, о чем убедительно говорит смещение вариационных рядов в сторону "минус" - вариантов (рис.1).

Дня дальне Лаге 2 селекционной работ был отобран вариант 13, несколько превьи&щий по вмилолитяческсй активности исходную культуру. Из неактивных по оС.-амилазе штаммов для сравнительного изучения был выбран вариант 9.

Изменчивость ^.а^аага^^цэ . индуцированная мутагенами. В качестве мутагенных факторов применяли УЗ-лучи, новоэмбихин и нитроз огуанвдин.

УФ-лушми и новозмбшснном действовал» на суспензию вегетативная клеток варианта 13, При самой низкой дозе ¿Ф-дучей (4,6x10^ эрг/мм^) выживаемость клеток составляла 34,С увеличением дозы облучения выживаемость резко падала (т&блД )»

Под действием ковоэмбихина в самой низкой конщгктрадеи (0,056) я налой экспозиции (30 мин) выживаемость клеток варианта 13 составляла 11,1?. С увеличением концентрации и длительности экспозиции выживаемость снижалась до 4,77% (табл.1).

Под действием УФ-лучей и новозмбихина увеличивалась изменчивость В.й1аа^а^1сиа по биосинтезу о1-аыилаэы. Границы амилодити-ческой активности под действием УФ-яучей варьировали от 2,2% до 158.7Й; под действием ковоэмбихина - от 53,866 до 207,7Х по сравнению с контролем без облучения. Это шире, чем при естественной изменчивости 8.<Иаз1аг1сиэ по биосинтезу об-амилазы.

Под действием УФ-лучей а дозах от 4,6 до 65,1x10^ эрг/мм^ выло получено 83,15% "минус"-вариантов и 1,25& - "шве"-вариантов (табл.1), При дозе 41,8х1Сг эрг/м^ был получен "плюс"-вариант ¥61, который превдаал амилояитическую активность родительского штамма при первичной проверке на ЕВ,1??. При дозах УФ-лучей 23- и 27,5х1Сг эрг/мм были подучена два "минус"-варианта, амилолитиче-ская активность которьсс составляла и 2,7% от активности родительского варианта 13. Один из них Ш 60-1) был выбран для сравнительного изучения.

Под действием новоэмбихина было получено 44,9$ "гиюс"-аари-антов (значительно больше, чем под действием УФ-дучей) и всего 956 "минус"-вариантов (табл.1). Все "плюс"-варианты, превыиащиз родительский итамм по амидолитической активности при первичной проверке на 33,5-107,7%, отобрали для дальнейших испытаний. Однако, большинство вариантов оказались при пересевах нестабильными. И только мутант НЭ 2 после пяти пассажей превшая родительский вариант 13 по амияолитической активности на 37,Этот штамм был отобран для проведения второй ступени селекции с применением нитрозогуанидина.

Нитроэогуанидином в концентрации 100 ихг/чш в течение 20 шш обрабатывали суспензию вегетативных клеток мутанта НЭ 2. Штамм оказался очень чувствительный к мутагену. При этих условиях обработки выживало 0,040$ клеток (табл.1). Размах изменчивости мутанта НЭ Z по биосинтезу -амилазы под действием нитрозогуанидина увеличивался меньше, чем под действием новоомбихина, Границы амилолитиче-ежой активности варьировали от 41,7 до 160, СЙ.

Под действием нитрозогуанидина получили 3,а£ "плес" - и 11,6^ "минус - вариантов. Из отобранных "плг»с"-вариантов в дальнейшей селекционной работе использовали наиболее стабильный и активный мутант НЭНГ 6.

Таким образом, изменчивость В.(51аа1аМеивПО биосинтезу ы, -амилазы под действием цутагенов увеличивалась. Наибольшее число " плюс"-вариантов у термофильной бактерии было получено под действием новоэмбихина, а наибольшее число "минус*-вариантов - под действием УФ-жучей,

Провели селекции активных по <?с-амилазе мутантов УЙ1 и НЭНГб без применения цутагентде факторов, вялшив, как этап, лиофюшзацив ят&мнов. На рис.2 изображена схема отбора вариантов в.<11аз1в*1сиа, обладающих повышению! и пониженным уровнем синтеза амихезы. В результате проведения селекции, о применением мутагенов было изучено

Таблица I, Влияние мутагенных факторов на выживаемость и амилолитическую активность в.

Выкивае-!Границы измен-[Частота воэник-мость,% ¡чквостн амило-.новения вариак-{лктической ак-.тов, % ¡тьшности, % 1 "плюс" 1 "минус"

Цутагенный фактор, доза

?бГЫ0г 34,9-0,05 £.2-158,7 врг/ий®

Новдамбихи^ вариант 11,1-4,77 53,8-207,4

таит 0,045 41,7-150,0

1,£5 83,15

44,9 9,0 3,3 11,6

экспозиция 20 мин

более 1000 вариантов и были отобраны два стабильных и активных: УФ 1-25.21, полученный на. первой ступени селекции, и НЭНГ 6-10.6, полученный на второй ступени селекции. Оба мутанта превышали по амвдолитической активности вариант 13 - на 39,1% и 32,а исходную культуру, не подвергавшуюся рассеву и обработке мутагенами, на 60,и 52,7% соответственно (при 99?. уровне достоверности).

•|ГК, ЧА ЮГ

ПрНОСПОРЭЬьИГ ЬАИММГ*,

О Г^О»

гтухнмл^ I ЛФМ-1 |

ЙмГ)

I НД-1 |

ж 1

1 1 (

КСММПОР 1 ч*<-гК1|

([«ВОТ»*

нэ^

ГДр!

«г 1

I НЭНГ8 | МСОД

дшяшилщш. РАИЩ!»» I

ТйГЕсЯ

Рис.Ступенчатый отбор вариантов термофильной бактерии , образующей -<с-амилазу.

П. ФиЭЯОЛОГО-ЙЮХИМИЧесКИе особенности вариантов B.diastaticua

Изучали в сравнительной аспекте морфологические« цитологические и физиолого-биохимические свойства штаммов B.diastatieua С повышенгеш и пониженным уровнем синтеза, л-амилазы для выявления признаков) способных облегчить отбор высокоактивных продуцентов.

Морфология. Родительский вариант 13 и активные по «¿-амилазе мутанты УФ-1-Й5.21 и НЗНГ6-10.8 образуют на КПА гигантские колонии компактные, с зубчатым краеи. Клетки варианта 13 по 4-8 и более соединены в цепочки, спорообразование снижено по сравнению с исходной культурой. Мутанты образуют цепочки, состоящие из 12-17 клетох, т.е. дефекты в делении клеток выражены у них ярче; спорообразование снижено ente больше, чем у родительского варианта 13.

Неактивный по «с-амилазе вариант 9 и низкоактквкый цуг ант ГО60-1 образуют на КПА. гигантские колонии в 1,5-2 раза крупнее колоний исходной культуры и активных штаммов, плоские с тонким фестончатым краем. Клетки, как правило, одиночные или соединены по две. Спорообразование интенсивное.

Цитология. Изучение ультрастружтуры клеток обнаружило следующие различия между активными и низкоактивныш штаммами. Tax для культур с пошлинной амклолитической активностью характерно: наличие ворсинчатой микрокапсулы, рыхлой клеточной стенки, интенсивное развитие внутриклеточных мембранных систем, дефектное спорообразование, экструзия пузырьков в периплазму.

Доя низкоактивяшс штаммов характерно: наличие более тонкой и плотной микрокапсулы, нормальной клеточной стенки, слабое развитие внутриклеточных мембранных систем, способность цитоплазмы к интенсивной фрагментации и образованию L -подобных $opi, образование фагоподобнъсс частиц, скопление в цитоплазме гранулезы, нормальная структура спор.

Отношение к температуре. Изучали отношение активных и ниэко-актквных штаммов к температуре, выращивал гигантские колонии на КПА в течение 48 часов в диапазоне температур 37-75° с интервалом 5°. Установлено, что активные по о(,-амилазе мутанты, в том числе родительский вариант 13 и исходная культура, являются текпературочув-ствительными штаммами. Температурные границы роста у них несколько сужены <40-65°) по сравнению с границами роста кизкоактивкых штаммов <37-75°).

Отношение к Факторам роста. Активные по о£-амииаэе вариант 13, мутанты У51-25.21, НЭКГб-10,8 и исходная культура на минимальной агаризованной среде с глшоэой или мальтозой давт очень слабый прозрачный рост, характерный для неполных ауксотрофов (leaky -цу-тентов). Для восстановления нормального роста на минимальной среде они нуждаются в тиамине, ДАЕК, биотине, аланине, фенилаланине и метионине. Из трех витаминов именно тиамин является наиболее важным для роста высокоактивных штаммов на минимальной среде. Низкоактивные вариант 9, мутант УФ60-1 являются прототрофами.

Гидролитические ферменты. образуемые вариантами B.diastaticus.

Обнаружены некоторые различия между штаммами по биосинтезу ряда гидролитических ферментов (табл.2). Ь^утанты УФ1-25.21 и НЭДГ 6-10.8, как и родительский вариант 13, обладает высоким уровнем активности oi.-амилазы (внеклеточной и связанной с клеткой) с высокой разжииапцей способностью. Существует прямая зависимость между глубиной раацешения крахмала и уровнем аыилолитической активности штаммов. Уровень активности про те азы у цутантов также высокий. Однако, они обладают невысоким уровнем активности глшоамнлазы, мальтазы и трансглккозилаэы. У кизкоактнвных по ¡¿-амилазе штаммов УФ 60-1 и варианта 9 обнаружена низкая разжихащая способность; в то же время они обладают более высоким уровнем активности мальтазы и трансгликозилаэы. Активность глтосоамидазы у них не обнаружена.

Гекотипический анализ. При всех выявленных различиях между высокоактивными и низкоактивныыи штаммами их родство с исходной культурой E.diastaticus подтверждается генотипичеодам анализом. Полученные штаммы обладает высоким уровнем гомологии ДИ - ДЦК с исходной культурой (табл.3). По содержанию ГЦ пар в JJK штаммы мало различаются,

Лизогения. Результаты исследований показывают, что появление низкоактивных вариантов в естественной популяции В.diastaticив и получение сходных с ними по свойствам ниэкоактивных штаммов из активного под действием УФ-лучей связаны, по-видимому, с аналогичными мутациями. Как известно, к факторам, вызывающим естественную изменчивость микроорганизмов, длительно хранящихся в лабораторных условиях, относят в первую очередь фаги и профаги, плазшды, транс-позоны, инсерционные элементы (Лируэян, 1982; Смирнов, 1984; Нваап-еу , 1976; Cfcernin, 1961). В термофильных споро об разущкх бактериях также обнаружены фаги, профаги и плазмиды (Шалаева, 1980; Rean-

Таблица 2. Гидролитические федоавти, образуемые некоторыми шгаьмаыи в. «Цавиисиз

Амшюлитическая активность Раэлщ- Ойнея Осаха- Глшо- Активность Протеолигачес-

(АА) жашш с те- рива- амя- ,т(14 р/.,л кая активность

---способ- пень щая лаз- ' а,Ш1 , , уцл ..

Внеклаточщя Связан, ность рас- его- яая иа„

-—-—-склзт. Ми щешг. собя. актив, рН рН

Б/мл Е/мг Е/мг 2/иг крах- $ ЕАи 5 5 7 2 белка сух, сухих мала (Ш клеток клеток клеток %

Исходная

попудвдЕЯ 29,860 19,760 15,900 0,042 225,0 21,00 0,870 0,049 1,490 0,425 0,102 0,079

Вариант 9 0,220 0,237 0,147 0,001 1,5 0,015 0,004 0 157,20 63,93 0,036 0,076 '

Вариант 13 31,695 29,063 18,310 0,038 231,0 35,75 0,900 0,048 1,470 0,400 0,039 0,100,

УФ 60-1 1,214 1,325 0,652 0,002 0,7 0,041 0,007 0 240,88 50,58 0,049 0,088

Ж-25,21 41,535 36,009 23,694 1,145 323,0 50,57 1,070 0,036 3,750 0,410 0,162 0,605

НЗНГ6-Ю.В 45,4П 45,493 26,068 0,976 328,7 50,00 1,570 0,036 1,920 0,280 0,252 0,612

Примечание: среда для выращивания - * 2; АА, КА, ТА в мкмоль/ЪияДш определяли по методу Бздэцкого ж Павловой (1976 г,)

Таблица 3. Нуклеотндный состав и гомология ДОК -Д№ штаммов B.diastaticus

Штаммы

1 Нумеотидный I Гомология I состав ыол.% 1 ДЖ, $ J_L+Л_I_

I. Исходная культура

52.7 52,9

54.1

52.2 52,9

53.8

100 86 100 69 94 92

2. Вариант 9

3. Вариант 13

4. У® 60-1

5. У& 1-25.21

6. НЗНГ 6-10,8

иеу, 1976;Sharp , 1979, 1980).

Опыты по перекрестной/ испытанию высоко- и низкоактивных вариантов и исходной культуры B.diastaticus, а также квдукция у ник фагов митоыицином С и УФ-лучами показали полилиэогенноеть термофильной бактерии. Низкоактивные штаммы оказались чувствительными при перекрестной проверке к профаган высокоактивных штаммов.

Классическим объяснением (Дурия, 1981) описанного факта чувствительности одних итаммов (в нашем случае низкоактивных) к фа» гам пли црофагам других (в нашем случае высокоактивных) является отсутствие (утрата) одного из фагов в бактериальной хромосоме (у низкоактивных штаммов), что может, в свою очередь, обусловить их фенотипические особенности.

Титр фагов у всех штаммов низкий, в зонах лизиса присутствует вторичный рост, повтору можно полагать, что фаги у в. di astatic us - ' умеренные. У штамма НЗНГ 6-10.9 индукция фёгов была малоэффективной, и обнаружение фагов под электронным микроскопом всегда было сопряжено с большими трудностями. Вероятно, у этого мутанта, полученного на второй ступени селекции под действием новоэм-бихина и нитрозогуанйдина, имеются дефекты в генах црофагов, отве-чапцюс за переключение развития латентной формы фага в вирулентную, т.е. вегетативное развитие фагов у НЭНГ 6-10.8 - репрессировано. Это предположение основывается на аналогичных результатах, отмеченных рядом исследователей ( Ptashne at al., 1980, 1982; shi-nizu - Kaflofca at al. , 1982, 1983).

Таким образом, различия, обнаруженные у высоко- и низкоактивных штаммов в морфологии гигантских колоний, способности клеток

образовывать цепочки, тонко» строении клеток, интенсивности спорообразования, потребностях в факторах роста, коррелируют с различиями в уровне синтеза ряда- гидролитических ферментов и могут использоваться при отборе активных по «¿-амилазе штаммов

Ш, Биосинтез л-амилазы активными штаммами в.ЗДавЪа^сиэ и его регуляция

Изучали динамику биосинтеза, а также влияние, температур! культивирования, факторов роста, источников углерода и азота на биосинтез л-амилаэы мутантами УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8 в сравнении с родительским вариантом 13.

Изучение динамики биосинтеза -амилазы активных мутантов: Уй 1-25,21 и НЭНГ 6-10.8 и варианта 13, выращенных в среде У 2, показало, что образование фермента у них начинается в ранней экспоненциальной фазе роста и достигает максимума к стационарной фазе (к 18-20 часам хульгивяровакия). Дифференциальная скорость синтеза фермента у мутантов в 4 и более раз превдаает дифференциальную скорость образования (¿-амилазы у варианта 13.

Влияние температуры культивирования на биосинтез (¿-амилазы.

Проведенные исследования показали, что у мутантов, как и у варианта 13, выращенных в среде М 2, температурный оптимум биосинтеза (¿-амилазы, равный 60°, не изменился. (Рис.3). Тем не менее, отклонение от оптимальной температуры культивирования на 5-10° приводит к 1,5-3 кратному снижению активности ¿¿-амилазы у мутантов УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8. Причем мутанты по сравнению с родительским вариантом 13 более чувствительны к повышению температуры, чем к ее понижению.

Влияние Дакторов роста на накопление биомассы и биосинтез с*- -амилазы высоко- и ниэкоантивными штаммами В.<31аз1а1;1вив представлено на рис.4. Без факторов роста в жидкой минимальной среде хорошо растут только низкоактивные штаммы (вариант 9 и цутант УФ 60-1), накапливая биомассу в 7-11 раз большую, чем высокоактивные (вариант 13 и мутанты УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8), Фермент на этой среде образуется только активными штаммами в небольших количествах. Добавление в минимальную среду дрожжевого экстракта Б1£со ведет к 6-8 кратному увеличению биомассы активными штаммами и увеличению биосинтеза Л-амилазы в 8-10-13 раз соответственно. Замена дрожжевого экстракта Б±гсо витаминами (тиамин,

Рис.3, Влияние температуры культивирования на биосинтез сС -амилазы B.diastatloue

4-

Iда

Г

F

в Аянчаееа ■ Аяянляоаяь

J

/ гл*

aap.iS аар.9

111 [In i

yfso-f

t23A 12$*t

vti-2S3t mm-ms

% \

tseo* шо 2

4900 |

Рис.4. Влияние факторов роста на биосинтез оС-амилазы и

накопление биомассы некоторыми штаммами B.diaetatioue на минимальной среде с мальтозой. I - контроль; 2 - дрожжевой экстракт: Dlfeo - 0,0QSS;

3 - mate«« ПАЖ - 1,5 ыкг/мл, биотин - 0,15 шг/мл;

4 - витамины те же + аланин, фенилаланин и метионин -3,5 шег/мя для DL -форм.

ПАЕК, Скотин) или витаминами (те же) и аминокислотами (аяанда, феншюланин и метионик), не влияя на накопление биомассы, в 2 раза интенсифицирует биосинтез оС^-аыидаэы у активных штаммов.

Таким образом, у мутантов УФ 1-25.21 и особенно у НЭНГ 6-10.8 выявлена большая зависимость биосинтеза ос-амклазн от факторов роста по сравнению с родительским вариантом 13.

Источники углерода. Изучали влияние на биосинтез л-амилаэы активных штаммов сахарозы, лактозы, мальтозы, цедлобиозм, рафинозы, и растворимого крахмала. Сахара со углероду) добавляли в ми-

нимальную среду № 4, содержащую факторы роста. Наилучшими источниками углерода для биосинтеза л-амилазы оказались мальтоза и крахмал. Продуктивность по об-амилазе клеток мутантов УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8 на мальтозе и крахмале наивысшая. На крахмале про-дударущая способность клеток в 1,8-2,8 раза вше, чем на мальтозе (рис.5). На сахарозе, лактозе, цаллобнозе И рафинозе уровень биосинтеза фермента низкий. Из перечисленных Сахаров только на целлобиозе штаммы растут хорошо и накапливает биомассу в 8-9 раз большую, чем на сахарозе, лактозе или рафинозе. На мальтозе и крахмале биомассы накапливается меньше, чем на целлобиозе, однако фермента на этих сахарах образуется в 30-70 раз больше, чем на целлобиозе.

Источники азота. Изучали влияние на биосинтез <&. -амилазы активных штаммов неорганических источников азота: йакОу кко^, ИН4И03, МН^СЦ, (КН4)21а>04• ^^гЁС)4 и органических; мочевины, пептона и ряда аминокислот. Штаммы выращивали в среде № 5 с добавлением факторов роста. Исследуемые соли вносили в среду в концентрации 0,2Й по азоту, мочевину - пептон - 0,2$. Аминокислоты вносили в среду в концентрации 0,14% по азоту на фоне постоянно присутствующего в среде аммония хлористого в концентрации 0,01%.

Из неорганических источников азота наилучшими для биосинтеза -амилазы оказались соли аммония ( НН^С1 и КН^КО3 ). Из органических - пептон я некоторые аминокислоты: метиошн, ормгош, аспа-рагиновая кислота или фенилаланин. Следует отметить, что продуктивность мутанта НЭНГ 6-10.8 при выращивании в средах с аминокислотами в качестве источника азота выше, чем продуктивность мутанта УЙ-25.21 и родительского варианта 13 (рис.6).

Таким образом, проведенные эксперименты выявили факторы, положительно влияющие на биосинтез «¿-амилазы активных штаммов (варианта 13, ьотадаов УФ1-25.21 я НЭНГ 6-10.8), К ним откосятся: продол-

ы

й

I /3. ■

I

На.. 151

|«4

Ж 3

ГС»

ш ш

Рас.5. Влияние источников углерода

на биосинтез оС.~емилаэы в.<ив8{вНсии а -вариант 13; 6 -УФ 1-^35.21; в - ВЭНГ 6-10,8.

I - сахароза, 2 -лактоза, 3 -мальтоза; 4 - цвллоОаоза; 5 -рафиаоэа; 6 -крашал растворшьй

?

i,

!

■*

I.

i

Js1

0- ¿ариант /5

ihl III lllll.l

3 -е- a i I, i В У Pi-25.2) yllll.l

a ■ - Ii НЭНГб-m

' il 1 II

H

wm

II

Ряс,6. Влияние аминокислот на биосинтез сС-аимаэы B.diastatíeua.

жительноеть и температура, выращивания, источники углерода и азота, витамины я аминокислоты.

Регуляция биосинтеза т/,-амилазы. Иа литературы известно, что синтез оС.-амилазы у большинства микроорганизмов, в том числе спорообразущих бактерий, находится под контролем индукции и ката-болитной репрессии < Ве1кег, 1963; РПев-Ъ , 1977), Проведенные эксперименты показали, что все активные по «¿-амилазе штаммы в.а1-аэга'Ысиэ обладают конститутивным синтезом фермента, поскольку образуют об-амилазу а среде без углевода в присутствии пептона (рис.7). В среде с пептоном и глшсозод с£-амидаэу у изучаемых штаммов обнаружить не удалось. При замене глюкозы фруктозой активные штаммы образовывали фермент, но уровень его был киев уровня, определенного в среде с пептоном без углевода. В присутствии мальтозы уровень биосинтеза «¿-амилазы был наивысшим, (Рис.7). Итак, если у активное штаммов З.й1азгам.сиз в среде с пептоном без углевода наблвд&ется конститутивный синтез еб-амилаэы, а в среде с пептоном и мальтозой индуцированный, то фермент, образуемый конститутивно составляет 10-1 К, а образуемый под действием индуктора - 90-895» от общего количества фермента, синтезированного клетками на мадьтозо-пептонной среде.

Таким образом, полученные результаты по регуляции биосинтеза Ы, —амилазы у термофильной бактерии В.<иаз'5аг±сиа подтвердили установленную для большинства мезофкльных продуцентов об-ашиаэы закономерность, что мальтоза, как и крахмал, является индуктором синтеза фермента, а глшоза - катаболктным репрессором. У в.зд&а-^а'Ыеиа катабогитным репрессороы биосинтеза сО-амияазы оказалась и фруктоза, что также подтверадает литературные данные ( ие1-Кег , СаирЬеИ , 1963).

Такие индукторы жак мальтоза и крахмал, как известно, используются клеткой для конструктивного и энергетического обмена. Поэтому в качестве неметаболизируемого индуктора нами было испытано соединение метил - оС, В -глшозид. Этот индуктор добавляли к минимальной среде № 4, содержащей катаболиткый репрессор синтеза ос-амилазы - глюкозу или фруктозу. И в присутствии глюкозы, и в присутствии фруктозы метил - . ¡3 -глшозид вызывал индукцию биосинтеза сС-амилазы у мутантов УЭ 1-25.21 и Н2НГ 6-10.8 (рис.8). В среде о глюкозой уровень синтеза фермента у штаммов УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8 был в 10 раз ниже, чем а среше с фруктозой. Дерепрессия синтеза амилазы более интенсивно проявлялась у клеток 14 часового возраста по сравнению с клетками 4-х часового возраста.

а -вариант 13; 6 - УФ 1-25,21; в - ЮНГ 6-10.8;

1 - среда с пептоном без углерода;

2 - пептон +глскоза; 3- пептон* -фруктоза; 4 - пептон шальтоза

, „ю го 4о то а» т ¡¡роеояжчмммоая* Лчстт мр^м, пик.

ряс.0 Индукция биосинтеза <£- элдаазн

В.а1ав1аисив метал-£А,0 -глскозидом на среде с фруктозой.

Изучение физиологических особенностей штаммов послужило основой для применения методов математического планирования в подборе сред для хультивирования продацентоа сС-амшгазы и позволило увеличить их аыклолиткческую активность в 2,5-3 раза во сравнению с исходной культурой. Для культивирования мутанта УФ 1-25.21 подобрана питательная среда следующего состава (в %): крахмал картофельный нерастворимый 0,7,МН+01 - 0,3,Маг504 - 0,2; м^О^ х ---7Е^0"^"0,0Х; К^НРО^ - 0,3; ИаСД.^ - 0,00б;сасо_ - ОД; 5Й экстракт солодовых ростков 3,83 мл, тиамин НС1 - Г,7 мкг/мл рН 7,5. Для культивирования мутанта НЕНГ &-Ю.8 подобрана по^производ-ственная среда следупцего состава (в %)•. крахмал картофельный нерастворимый 0,7; кн,С1 - 0,5;вн4но, - 0,3; ¡С^НРО^ - 0,3;"на2зо4 - 0,2; м^го^х 7^0 - 0,01;СаСо3 - 0,1; 5$ экстракт солодовых ростков 5 мл; тиамин НС1 1,7 ыкг/мл, рй 6,4. Имеется акт об успешных испытаниях штамма ЮНГ 6-10.8 в качестве продуцента ос-амилазы при выращивании в полупроизводственньа условиях на Московском опытном спиртовом заводе. На штамм НЭНГ 6-10.8 получено авторское свидетельство № 661014, 1979 г.

ВЫВОДЫ

1. Изучалась естественная и индуцированная мутагенами изменчивость термофильной бактерии В.41аа1;а-м.сиа По биосинтезу амилазы. В результате изучения естественной изменчивости выявлена гетерогенность популяции по этому признаку: 75,ЕЙ клеток активны по биосинтезу Л-амилазы, остальные - низкоактивны и неактивны. Показана возможность увеличения изменчивости в.й1аэ*а41сиэпо биосинтезу ¿¿-амилазы под действием цутагенов.

2. Подучены методом ступенчатой селекции с применением мутагенных факторов: УФ-лучей, новоэмбихина и нитроэогуанидина, мутанты УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8, превышающие исходную культуру по ами-лолитической активности на 60,3 и 52,7% соответственно.

3. Проведено сравнительное изучение штаммов в.ЗДае^аЗДсие, обладающих повышенным и потаенным уровнем синтеза об-амид азы. Установлено, что зти щтаюсы различаются по морфологии гигантских колоний, интенсивности спорообразования, потребностям в факторах роста, ультраструктуре клеток, уровню синтеза ряда гидролитических ферментов. Обнаружена лизогенность исходной культуры, высоко- и низкоактивных штаммов. Показано, что эти штаммы незначительно различаются между собой по содержанию ГЦ пар в ¿Щ и обладаю; высоким уровней гомологии ДЯС - ДОС с исходной культурой, что сви-

го

детедьствует о родстве штаммов.

4. Выявлены оптимальные условия для биосинтеза «о-амилазы активными штаммами. Показано, что наилучшими источниками углерода для биосинтеза oL-амилазы мутантами УФ 1-25.£1 и НЭНГ 6-10.8 является мальтоза и крахмал. Наилучшими неорганическими источниками азота - аммоний хлористый и аммоний азотнокислый. Из органических источников азота лучшими были пептон и аминокислоты: метионин, орнитин, аспарагнновая кислота или фенилаланин, Витамины: тиамин, ПАШ и биотин, в которых ведаются активные штаммы как в факторах роста, оказывало? положительное влияние на биосинтез оС-аыилазы. Фермент синтезируется активными штаммами в ранней экспоненциальной фазе роста и достигает максимума к началу стационарной фазы. Дифференциальная скорость синтеза ob-амилазы у мутантов УФ 1-25. 21 и НЭНГ 6-Ю.8 в среднем в четыре раза выше, чем у родительского шТошма 13. Синтез ы, -амилазы находится под контролем индукции и катаболитной репрессии.

5. Оптимизация сред методом математического планирования эксперимента позволила увеличить амилолитическую активность штаммов УФ 1-25.21 и НЭНГ 6-10.8 в 2,5-3 раза по сравнению с уровнем активности исходной культуры. Получены положительные результаты при проведают полупроизводственных испытаний штамма НЭНГ 6-10.8 (акт об этом прилагается).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. З^урыгина В.П. Влияние длительного хранения на терюфиль-ную культуру Bacillus dlaatatious»- Микробиология, 197?, т.46, в.6, С.П30-И32.

2. Уурыгина В.П. Естественная изменчивость термофильной бактерии Bacillus diaataticus, образующей амилазу. - Микробиология, 1978, т,47, s.I, с.I01-106.

3. Ыурыгкна В.П. Изменчивость геополитической термофильной бактерии Bacillus dlaetatious , ивдуцированная ультрафиолетовый» лучами. - Микробиология, 1978, т.47, в.2, с.286-292.

4. Иурьсгика В.П. Особенности физиологии питания и биосинтеза оС-амилазы у некоторых мутантов Bacillus diaataticus.- В сб.:

Конференция молодых специалистов и ученик ВНИИПрБ. - И., 1978, с.44-45.

5. ИишекецкиЯ A.A., Ц/рыгвна В.П., Яровенко В.Л. Штамм термофильной бактерии Bacillus diastaticucHSHT 6-10.8 - продуцент с/ -амилазы. - Авторское свидетельство V 66I0I4, 1979.

6. Цурыгина В.П. Биосинтез некоторых гидролитических ферментов лизогенншт мутантами Bacillus diasta-ticun В сб.: Вирусы микроорганизмов. - Дущино, 1981, е.31.

7. Мурыгина В.П. Физиологические, биохимические и цитологические особенности рад& штаммов термофильной культуры Bacillus dlastatiousr- В сб. ; Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства. - M., 1983, с.63.

8. Мурагина В.П. Ультраструктура клеток термофильной ами-лолитической бактерии Bacillus diastaticus*- В сб.: Цитология микроорганизмов. - Пудино, 1984, с.69.

9. Чурыгина В, П., Кострикина H.A., Еирюзова В.И. Цитология клеток ряда штаммов Bacillus diastaticus. - Микробиология, 1985, т.54, в.1, с.69-72.

Т-09513Г ПОДПИСАНО В ПЕЧАТЬ &.4.85гГ ЗАКАЗ Ы> в 36." ТИРАЖ 100 »дэГ

ВГТ7ТИ ЦСУ СССР