Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологическая и биохимическая характеристика штамма Aspergillus niger A3, продуцента целлюлаз и гемицеллюлаз

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савов, Валентин Александров

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Биоконверсия целлкшозосодержащих материалов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Штамм. - Aspergillus niger А^

3.2. Культуральная характеристика ^

3.3. Биохимические анализы

3.4. Статистическая обработка данных

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Культуральные и морфо-физиологические свойства штамма A.niger а^

4.2. Исследование физиологических особенностей штамма A.niger А^ в условиях лимитации углеродом и" азотом.

4.2.1. Углеродная лимитация

4.2.2. Азотная лимитация

4.3. Культивирование штамма A.niger А^ на целлюло-зосодержащие субстраты

4.3.1. Биосинтез целлюлазных энзимов и ксиланазы штаммом A.niger А^ на различных целлюлозосо-держащих субстратах

4.3.2. Динамика активнооти ферментов целлюлаз-ного комплекса и ксиланазы гриба A.niger А, в зависимости от питательной среды и углеродного источника.

4.3.3. Влияние возраста вегетативного посевного материала на динамику биосинтеза целлюлазных энзимов и ксиланазы A.niger А^

4.3.4. Влияние дрожжевого экстракта на биосинтез целлюлазных энзимов и ксиланазы A.niger А^

4.3.5. Активность некоторых внутриклеточных энзимов углеродного и азотного обмена при периодичном культивировании

4.3.6. Содержание N, Р, Сахаров и экзоклеточного протеина при культивировании A.niger на среде Мавдельс с микрицеллом и отрубями

4.3.7. Активность фермента супероксид-дисмутазы при культивировании A.niger на среде Мандельс с микрицеллом и пшеничными отрубями

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологическая и биохимическая характеристика штамма Aspergillus niger A3, продуцента целлюлаз и гемицеллюлаз"

Актуальность проблемы. В постановлении ХХУТ съезда Коммунистической партии Советского Союза подчеркивается необходимость "разработки биотехнологических процессов ^ для производства продукции, используемой в медицине, сельском хозяйстве и промышленности".

К важнейшим направлениям биотехнологии как в фундаментальном, так и в прикладном отношении следует отнести биоконверсию возобновляемого растительного сырья для пищевой, микробиологической, нефтехимической, энергетической, медицинской промышленности и сельского хозяйства.

Что касается микробиологического аспекта работ по биотехнологии, то здесь центральной задачей должна быть разработка фундаментальных подходов и получение полиферментных комплексов микробного происхождения, гидролизирукщих растительные биополимеры с заданными свойствами /термостабильность, адсорбционная способность, активность и т.д./ и ферментЦ-ифшм составом.

Различные виды микроорганизмов обладают неодинаковой способностью к гидролизу природных целлюлозосодержащих растительных субстратов. При этом наблюдаются различия не только в активности и свойствах целлюлаз, но и в характере роста, степени дезагрегации субстрата, способности использования продуктов гидролиза клетчатки. Одни виды целлюлозотрансформирующих микроорганизмов при разрушении v/целлюлозы и природных целлюлозосодержащих субстратов накапливают в значительном количестве сахара, другие - используя их, образуют обильную биомассу, содержащую белок, жиры, аминокислоты, витамины и другие полезные физиологически активные вещества. Таким образом, в зависимости от цели применения, используемый вид должен обладать специфической или комплексной ферментативной трансформирующей активностью. Пеллкшозотрансформирующие микроорганизмы и образуемые ими ферменты /целлюлазы/ могут быть использованы в разнообразных целях.

Из всехммикроорганизмов, которые могут усваивать целлкшозо-содержащие субстраты как единственный источник углерода и энергии, самый большой интерес представляют микроскопические грибы. Селекция таких микроорганизмов основывается на их биохимической характеристике, так как она является критерием прогнозирования конечного результата. Существенная оценка перспективности технологических возможностей штаммов заключается в познании физиологии и биохимии роста в различных условиях и на различных субстратах.

Цель и задачи исследования. В связи с изложенным, цель работы заключалась в изучении физиологических и биохимических свойств и оптимизации биосинтеза целлюлаз-ных и ксиланазных ферментов микромицетного штамма Aspergillus niger А^.

Впервые установлено, что штамм А^ синтезирует дополнительную ферментную систему глутамин/глутамат синтазы для усвоения азота в условиях азотной лимитации или высокой скорости роста.

Новизну представляют эксперименты по непрерывному культивированию микромицетов для определения практической ценности исследуемого штамма A.niger А^ - продуцента целлюлаз и ксиланаз.

В результате исследований получены данные, расширяющие представление о биосинтезе целлкшолитических ферментов грибов. Установлено, что существует корреляция между синтезом целлшазы A.niger А^ и активностью фермента супероксид-дисмутазы.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное изучение физиологического состояния гриба A.niger А^ позволило сделать выводы относительно функций и особенностей клеточной популяции.

Осуществленные в настоящей работе исследования показывают масштаб метаболических перестроек, происходящих при смене лимитирующих факторов.

Установлено, что лимитация роста является одним из необходимых условий, лежащих в основе управляемого культивирования микроорганизмов. Познание этого механизма дает возможность изучить физиологию микроорганизма - продуцента целлюлазных энзимов, так как их биосинтез является результатом питательной лимитации в экосистеме.

Исследуемый штамм A.niger А^ обладает свойством продуцировать целлюлазные и гемицеллюлазные энзимы, что представляет интерес как в практическом, так и в теоретическом аспектах.

Результаты исследования могут служить основой для эффективной биоконверсии растительных материалов.

Использованные методы могут найти применение в лабораторной практике и быть учтены при составлении методических рекомендаций по работе с микромицетами в учебном процессе.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Савов, Валентин Александров

выводы

Выполненные исследования позволяют сделать следующие научные и практические выводы:

1. Анализ результатов культуральных и морфо-физиологических исследований подтверждает, что использованный нами штамм является представителем отдела Basidiomycetes, класса Deyteromycetes, порядка Hyphales, семейства Phialospores, рода Aspergillus, вида niger. Ассимиляционная характеристика штамма показывает, что он хорошо усваивает арабинозу, ксилозу, левулезу, трегалозу и растворимый крахмал, а в отношении азотного питания, в одинаковой степени усваивает аммониевые и нитратные соли. Полученные данные подтвердили, что штамм A.niger А^ принадлежит к группе про-тотрофов и проявляет целлюлазную и гемицеллюлазную активность.

2. Изучен химический состав биомассы и аминокислотный состав белка A.niger ку В практике штамм А^ можно применить для получения белковой биомассы.

3. В условиях непрерывного культивирования изучена динамика активности ферментов гликолитического пути - гексокиназы, фосфо-глюкоизомеразы, глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы и 6 фосфо-глюконатдегидрогеназы в зависимости от скорости разбавления Д при лимитации среды источником углерода и азота. Показано, что повышение активности этих ферментов является результатом физиологического ответа клеток штамма на углеродную и азотную лимитацию.

4. Установлено, что пентозофосфатный цикл является главным источником НАДФ для гриба A.niger Ay

5. Впервые установлено, что штамм A.niger А^ синтезирует эффективную систему глутамин/глутамат-синтетазы для усвоения азота при азотной лимитации.

6. Установлена низкая активность НАД и НАДФ - зависимой аланиндегидрогеназы при лимитации среды по источнику углерода и азота, что свидетельствует о несущественной роли этого фермента.

7. Изучены оптимальные условия биосинтеза внеклеточных целлюлаз и ксиланаз штамма A.niger А^ при периодичном культивировании. Максимальную целлюлазную и ксиланазную активность штамм проявляет на среде Мандельс с пшеничными отрубями и кукурузными кочерыжками /2%- в качестве источника углерода.

8. Впервые изучена динамика активности внутриклеточных ферментов углеродного и азотного обмена штамма A.niger А^ при периодическом культивировании. Отмеченные особенности имеют связь с углеродлимитированной хемостатной культурой.

9. Изучено изменение активности фермента супероксид-дисмутазы в культуральной жидкости и в биомассе. Установлена корреляция между активностью супероксид-дисмутазы и биосинтезом целлюлаз,

10. На основании полученных результатов, можно рекомендовать штамм A.niger А^ для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ka# уже было отмечено в обзоре, целлюлоза и целлкшозосодер-жащие материалы, получаемые фотоеинтезом, имеют ряд преимуществ как нетрадиционные источники углерода и энергии. Мощные фотосинтетические системы могут быть компенсированы только мощными гидролитическими системами и за счет энзимов микробного мира. Но в природных условиях, например, в почве, разрушение растительных отбросов происходит очень медленно. Совсем иначе стоит вопрос о биоконверсии в реакторах при управляемых условиях. Под управляемой биоконверсией растительного субстрата мы понимаем превращение компонентов растительной массы с помощью микроорганизмов в различные полезные вещества и продукты в контролируемых условиях. Чтобы обеспечить этот процесс, существенным моментом является определение оптимальной величины этих параметров,влияющих на процесс культивирования используемых микроорганизмов.

Изучение физиологического состояния культуры особенно необходимо, так как включает все функции и особенности клеточной популяции, которые определяют ее метаболическое состояние I 97 I. Все это непосредственно определяет эффективность проводимого процесса, что в конечном счете является основной целью биоконверсии растительных материалов.

Анализ результатов культуральных и морфо-физиологических исследований штамма вырисовывает следующую картину.

Исследуемый штамм является представителем отдела Basidiomycetes, класса Deyteromycetes, порядка Hyphales, семейства Phialospores, рода Aspergillus, ВИДЭ A.niger.

Штамм A.niger A^ очень хорошо растет и развивается на жидких и твердых питательных средах, в условиях как поверхностного, так и глубинного культивирования.

При непрерывном культивировании на жидкой питательной среде Чапека-Докса / разбавления 0,1 час"V мицелий визуально различный по консистенции и форме - шарообразные, плотные "зерна". С увеличением скорости роста наступает расплетение зерен и мицелий приобретает рыхлую форму, похожую на вату.

Некоторые авторы считают, что глобулярная форма - это способ переживания неблагоприятных условий, как например, повышенная температура и неподходящее рН. В нашем случае образование глобулярного мицелия, по всей вероятности, это ответ на углеродную или азотную лимитацию, при которой растет культура.

При росте на твердой питательной среде /сусло-агар/ культура очень хорошо развивается. Чтобы провести морфологические наблюдения над культурой, был добавлен триптон Х-ЮО в количестве 0,1$ для ограничения роста. Здесь также наблюдаем в некоторых случаях диссоциацию штамма на две формы. Различия появляются при окрашивании мицелия и способе спорообразования. При новообразованной форме, мицелий окрашивается в желтый цвет и большая часть колоний образует споры.

Микроскопически наблюдалось образование и развитие конидиеносцев.

Конидиеносцы несептированы, неразветвлены и происходят из длинных, широких, толстостенных, а иногда разветвленных опорных клеток. Эти особенности используются основным признаком отличий рода Aspergillus от рода Penicillium /М.А.Литвинов/ I 52 I.

Ассимиляционная характеристика имеет существенное значение юз для ознакомления с физиологией штамма. При использовании сложных органических веществ, например, полисахаридов, первый этап метаболизма - это их превращение с помощью соответствующих энзимов в мономерные соединения с последующим усвоением. При утилизации мономера, как источника углерода, уровень роста мицелия зависит не только от способности гриба синтезировать энзимы, которые расщепляют полимеры до олигосахаридов и мономеров, но и от способности усвоения последних.

Из наших исследований видно, что штамм хорошо усваивает ара-бинозу, ксилозу, левулезу, трегалозу и растворимый крахмал.

В отношении азотного питания исследуемый штамм непретенциозен. С одинаковым эффектом усваивает как аммониевые, так и нитратные соли.

Витамины играют важную физиологическую роль в каждом организме. Грибы, как и другие микроорганизмы, в отношении витаминов подразделяются на две группы: витаминоауксогетеротрофные /т.е. неспособные синтезировать необходимые им витамины/ и витамино-ауксоавтотрофные, /обладающие способностью самостоятельно синтезировать витамины/.

Результаты исследований ауксотрофности показывают, что исследуемый штамм плохо растет и развивается в минимальной среде. Он относится к группе витаминоауксоавтотрофных микроорганизмов. Это определение немного условно, так как при добавлении в питательную среду витаминов, рост мицелия усиливается.

Рост и развитие грибов определяется и температурными условиями. Исследуемый штамм растет и развивается при температурном интервале от 22-40°С. Оптимальная температура культивирования -28°-30°С.

Одним из самых важных факторов, определяющих рост, является реакция среды. Изменение рН влияет на накопление продуктов обмена веществ в культуральной жидкости. Влияние рН на биосинтез энзимов A.niger рассмотрим позднее при анализе биосинтетических способностей культуры. Оптимальное значение рН для роста и развития штамма - 4-4,5.

В литературе почти нет данных о химическом составе биомассы представителей рода Aspergillus. При использовании исследуемого штамма для получения белково-витаминных концентратов, необходимо получение известной информации в отношении химического состава мицелия.

В сухой биомассе используемого нами штамма содержится 28,6% белка, 4,5% жиров и 5,1% зольных веществ.

Аминокислоты представляют ценный конструктивный материал' для каждого организма. В связи с этим интересно было изучение аминокислотного состава мицелия штамма A.niger. Результаты аминокислотного анализа показывают наличие 16 аминокислот, из которых 10 незаменимые. Из незаменимых кислот отсутсвуют цистин и триптофан.

Штамм A.niger ку исследованный нами, обладает свойством продуцировать целлюлазные и гемицеллкшазные энзимы, что представляет интерес, как в практическом, так и в теоретическом аспектах.

На развитие микроорганизмов в большой степени оказывает влияние окружающая среда. В связи с чем, мы не можем говорить об их свойствах, не учитывая характера внешних воздействий I 107,125, 226 I. В природе микроорганизмы редко находятся в оптимальных условиях. Обеспеченность субстратами и оптимальными условиями - это крайне редкий случай в развитии микроорганизмов в экосистеме I 79,153,207 I.

Среди параметров внешней среды, которые самым общим способом влияют на свойства микробных клеток в природных условиях -это концентрация питательных веществ. Естественные системы часто не содержат jro одному или более питательных веществ, как следствие метаболической активности местной микробной популяции. Вот почему, рост микроорганизмов в экосистеме почти всегда лимитирован и питательными веществами I 151,173 I.

Следовательно, наличие главных питательных веществ всегда будет лимитировать рост микробной популяции как в лабораторных, так и в естественной экосистемах I 84,151,164 I.

Поэтому с точки зрения экологии, очень важно понять как микроорганизм приспосабливается к дефициту питательных веществ, т.е. как он адаптируется к условиям внешней среды, когда концентрация одного или другого элемента ниже необходимой для насыщения его энзимной системы I 175 I.

Питательный лимит, как самое общее свойство экосистемы, оказывает сильное селективное влияние в отношении эволюции микроорганизмов для обособления механизмов приспособления к этим условиям. Таким адекватным ответом микробной экосистемы является появление целлюлолитической группы микроорганизмов, использующих в качестве источника питания растительных субстратов. Вот почему ферментативный гидролиз целлюлозы можно считать физиологическим ответом микробной популяции на питательную лимитацию.

Физиологию этих уникальных групп микроорганизмов необходимо изучать в условиях, близких к естественной среде, где это свойство селекционировалось в процессе эволюции. Экспериментально самые близкие условия к этим экосистемам могут быть созданы при непрерывном культивировании. Они дают возможность разрешить большее число физиологических проблем лимитированного роста и раскрытия некоторых механизмов приспособления к этим условиям.

Для этой цели мы исследовали a.niger в условиях углеродной и азотной лимитации при непрерывном культивировании в хемо-стате. Проследили влияние разбавления /Д/ на скорости роста / М / и активность энзимов, участвующих в углеродном и азотном обмене. Таким образом, получили информацию о steady-state реакции культуры при заданной питательной лимитации.

Из полученных результатов видно, что как при углеродной, так и при азотной лимитации исследуемые энзимы, участвующие в метаболизме углерода - гексокиназа, фосфоглюкоизомераза, глицераль-дегид-3-фосфат-дегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа и НАДФ - изоцитратдегидрогеназа, повышают свою специфическую активность с увеличением скорости роста . В обоих случаях, активность энзимов гексокиназы и глицераль-дегиддегидрогеназы выше, чем фосфоглюкоизомеразы. По всей вероятности, это связано с тем, что эти два энзима - общие для пути Эмбден - Майерхофа - Парнаса и пентозофосфатного цикла. Подобные исследования были проведены другими авторами, но при более низких скоростях роста. Как видно из литературных данных,, с увеличением Д происходит повышение активности этих ферментов I 76,81,86 I. Показано, что активность энзимов при азотном лимите более высокая, чем углеродном. Это особенное касается энзимов пентозофосфатного цикла - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа. Причина этой значительной активности пентозофосфатного цикла, вероятнее всего связана с повышенной потребностью клеток в редуцированных формах НАДФН. Известно, что основная функция пентозофосфатного цикла в клетках связана с генерированием редуцированного НАДФ, который необходим для биосинтетических целей. Редуцированный НАДФ, кроме этого, может быть и ко-фактором некоторых энзимов, ^функционирование пентозофосфатного цикла в клетках связано и с биосинтезом нуклеотидов, для которых он обеспечивает и прекурсоры I 87 I.

Другой возможный источник НАДФН в эукариотных клетках - это НАДФ - зависимая изоцитрат-дегидрогеназа I 97 I. В связи с этим исследовали активность Фермента, в зависимости от лимитирую щего фактора и скорости разбавления Д. Показано, что активность существенно не отличается при азотной и углеродной лимитации, а ее увеличение пропорционально Д. Этот факт оказывает на функционирование пентозофосфатного цикла, как главный источник НАДФ исследуемого микроорганизма и условий исследования культивирования. Значительно повышенная активность энзимов глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы и 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы при азотной лимитации, по всей вероятности, связана с использованием нитратного азотного источника. Исследования показали, что по сравнению с аммониевым азотным источником, активность пентозофосфатного цикла увеличивается в несколько раз I 124 I. Известно, что микроорганизмы усваивают нитратный азот, редуцируя его посредством энзимов нитрат и нитрит-редуктазы до ионов аммония I 90,190 I. Установлено, что у грибов эти энзимы НАДФН - зависимые I 124 I. Так, усвоение нитрата создает необходимость синтезирования в клетках большего числа редуцированных форм НАДФН. В результате этих потребностей активизируется деятельность пентозофосфатного цикла.

Общее для энзимов углеродного обмена A.niger /при исследуемом углеродном и азотном лимите/ характерно одноповышение их специфической активности с увеличением скорости роста.

По всей вероятности синтез этих энзимов может частично регулироваться с помощью индукции глюкозой или ее метаболитов. Аналогичные результаты получены I 86 I.

Значительный интерес представляют данные о влиянии природы лимитирующего фактора на физиологическое состояние культуры при исследовании энзимов азотного метаболизма.

Известно, что глутамат-дегидрогеназа имеет стратегическую позицию в азотном метаболизме и является важной разделительной точной между азотным и углеродным обменом I 71,136,189 I. Он ка

1 тализирует или редуктивное амминирование U-кетоглутарата до глутамата или окислительное дезамминирование глутамата, причем получается NH^ I 90 I. Neurospora crassa, Aspergillus nidulans и др. I 131,132 I имеют две глутамат-дегидрогеназы - НАДФ - зависимая с биосинтетической функцией и НАД - зависимая с катабо-литной функцией. Глутамат-дегидрогеназа Neurospora - самый изученный энзим грибов I 161 I. Кроме того, по всей вероятности, эти энзимы контролируются углеродным и азотным обменом.

В условиях углеродной лимитации, мы установили наличие НАД - зависимой глутамат-дегидрогеназы, причем ее активность повышается параллельно со скоростью разбавления. Подобное явление наблюдали Patheman et ai. I 130,135,190 I. Активность НАДФ - глутамат-дегидрогеназы в этом случае не обнаруживается. Наоборот, в условиях азотной лимитации наблюдали активность НАДФ - зависимая глутамат-дегидрогеназа, а НАД - зависимая форма не была открыта.

В нашем случае картина была более сложная. Мы рассматривали активность энзима глутамат-синтетаза-НАДФ-зависимой формы. Покат зано, что при скорости разбавления 0,1 и 0,2 час , активность энзима очень низкая, тогда как при Д - 0,3 час-* она достигает ту, измеренную у глутаматдегидрогеназы - НАДФ - зависимой. Кроме того, в этом случае активность НАДФ - глутаматдегидрогеназы не изменялась с увеличением Д.

Большинство микроорганизмов при аммониевой лимитации синтезируют специфический энзим НАДФ - зависимую глутаматдегидрогеназу, которая имеет низкое сродство к субстрату. Км для этого энзима имеет стоимости между I и 5 мкМ и следовательно механизм неэффективен для поддержания низкой интрацеллкшярной концентрации иона аммония, кроме того и не синтезируется в клетках в больших количествах I 125 I. Существует другая эффективная система фиксирова ния ионов аммония в клетках микроорганизмов - глутамин синтета-за /глутамат синтетаза, которая имеет низкую В^ стоимость для иона аммония. Эта система открыта Tempest et al. I 125 I при Klebsiela aerogenes. Есть сообщения и О наличии у Neurospora crassa и Sacch. cerevisiae I 142 I.

Очевидно, у исследованной азотной лимитации A.niger, ответ культуры выражен в биосинтезе этой более эффективной системы. Мы открыли НАДФН - глутаматсинтетазную активность, которая, по всей вероятности, компенсирует функцию НАДФ - зависимой глутамат-дегидрогеназы, чья активность не изменяется с увеличением Д. Возможно, что поддержание активности этого энзима на одном уровне было результатом дополнительной лимитации в клетке по НАДФН, чей дефицит увеличивается с увеличением скорости роста. По всей вероятности, система в клетках использует редуцированные формы НАДФ. Система, использующая НАДФ в клетке для биосинтетических целей и редуцирование нитрата до иона аммония, по всей вероятности, является лимитированной в отношении НАДФН в этих условиях. Вот почему микроорганизм не может синтезировать адекватно для данной скорости роста количество энзима НАДФ - зависимую глутамат-дегидрогеназу. Синтез НАДФ глутамат-синтетазы вероятно является одним адекватным механизмом приспособления микроорганизма, которым он отвечает на лимитирующих условиях. Вероятно, над какой-то скоростью разбавления /в случае 0,2 час"1/, скорость роста растет до точки, при которой редуцированные эквиваленты формируются со скоростью недостаточной, чтобы удовлетворить комплексную необходимость микроорганизмов в них. При скорости разбавления 0,3 час-*, НАДФН лимитация проявляется и микроорганизм обязан синтезировать энзим глутамат-синтетазу, который более экономичен из-за своего более высокого сродства с субстратом. Таким образом, через систему глутамин-синтетазу /глутамат-синтетазу/ A.niger обеспечивает себе эффективный материал при низких концентрациях азота и нитрат лимитированных условиях I 131,132 I.

Установлено также, что энзим глутамин-синтетаза увеличивает свою специфическую активность параллельно с увеличением Д, как при углеродной, так и азотной лимитации I 92 I.

Hummelt и сотр. I 131 I показали, что этот энзим синтезируется Neurospora crassa как в условиях азотной лимитации, так и при излишке аммония. Для него характерно то, что он существует в двух активных формах - тетраизмерякхцая и октаизмерявдая, причем его синтез при изменении условий лимитирования становится de novo I 132,188 I. Это ключевой энзим в азотном метаболизме не только потому, что продуцирует глутамин, но и из-за того, что служит как донор амминных групп при биосинтезе других аминокислот.

Низкие активности НАД И НАДФ аланин-дегидрогеназы, а также и НАДН и НАДФН - оксидазы показывают, что эти ферменты не имеют физиологического значения в метаболизме исследуемого штамма как при углеродной, так и азотной лимитации.

Приведенные выше данные показывают масштабы метаболических перестроек, происходящих при смене лимитирующих факторов. Они позволяют сформулировать следующий вывод. В основе простого кинетического феномена ограничения скорости роста микробной культуры путем уменьшения концентрации одного из компонентов питательной среды лежит сложная метаболическая адаптация культуры к этим условиям. Эта адаптация специфическая при различных лимитирующих факторах сопровождающаяся существенными перестройками метаболической системы, результатом чего являются значительные различия физиологического состояния культуры I 227 I.

Таким образом, лимитирование является одним из необходимых условий управляемого культивирования микроорганизмов. Глубокое познание механизма, лежащего-в основе этого явления, дает нам возможность сделать выводы, касающиеся роста микробной популяции в экосистеме, познакомиться с физиологией микроорганизма - продуцента целлюлазных энзимов, так как их биосинтез свойство, полученное в экосистеме и является результатом питательной лимитации.

Рост целлюлозоразрушающих грибов и активное образование внеклеточных целлюлаз имеет многофазовый характер и в основном характеризуется индукцией отдельных компонентов целлюлазы субстратом /целлюлозой и ее растворимыми производными/; ингибирование продуктами гидролиза /глюкозой, целлобиозой/, метаболизм глюкозы в среде с последующей индукцией из целлюлозы.

Таким образом регуляция процесса образования целлюлаз осуществляется через ивдукторно-репрессорные механизмы.

В большинстве случаев роль индуктора при биосинтезе целлюлаз осуществляется субстратом, а репрессоров - продуктами энзимного гидролиза.

Из предварительных исследований о влиянии количества углеродного субстрата на энзимный биосинтез A.niger установлено, что оптимальная концентрация для активного' биосинтетического процесса равна 2% I 78 I.

Обсуждая влияние использованных углеродных источников на энзимный биосинтез, приходим к выводу, что пшеничные отруби оказывают самый сильный эффект.

Наиболее высокая активность всего целлюлазного комплекса исследуемого штамма наблюдалась при культивировании на среде Ман-дельс с комбинированным источником углерода - кукурузными кочерыжками и пшеничными отрубями.

Высокая активность явно обязана не только индукции этих субстратов как углеродных источников. С их использованием, как источники углерода в питательной среде, кроме углерода, включаются и многие другие соли и-микроэлементы, которые дополнительно усиливают энзимный биосинтез.

Показательным является факт, что в остальных вариантах, где участвуют солома и микроцелли, как цглеродные источники, энзимная активность значительно слабее.

Кроме углеродных субстратов интенсивность биосинтеза целлюлаз микроорганизмами зависит от наличия доступных форм азота и других различных элементов минерального питания.

Исходя из этих основных положений, мы использовали в условиях наших опытов среду Чапека-Докса и Мандельс, различающихся источником азотного питания и содержанием некоторых элементов.

Во всех исследованных вариантах установлено преимущество на стороне аммонийных солей.

Самый лучший рост гриба и биосинтез целлюлазы и ксиланазы получается при использовании комбинированных азотных источников. Это видно из опытов, в которых применяется дрожжевой экстракт.

Природа углеродного субстрата /целлюлозосодержащих субстратов/ и его небольшая доступность для усвоения микроорганизмами за определенный интервал времени приближает условия периодического культивирования к этим, созданными нами при непрерывном культивировании с углеродной лимитацией.

Особый интерес представляла динамика активности внутриклеточных ферментов углеродного и азотного обмена штамма A.niger при периодичном культивировании.

Информацию о физиологическом состоянии целлюлазу-синтези-рующей культуры мы получили при определении активности некоторых энзимов углеродного и азотного обмена.

Очевидно, что как и в случае непрерывного культивирования, так и при периодическом культивировании, активно действуют путь Эмбдена-Майерхофа - Парнаса и пентозофосфатный цикл. Энзимная акг тивность вначале очень низкая и достигает максимума мевду 72 и 96 часами. НАДН - зависимая глутаматдегидрогеназа, также проявляет максимальную активность на 72-ом часу.

При периодичном культивировании специфические активности НАДФ - зависимая глутаматдегидрогеназа, НАД и НАДФ зависимая глутамин синтетаза и НАД и НАДФ - зависимая аланиндегидрогеназа не были обнаружены или их активности очень низкие, что свидетельствует об отсутствии их физиологической значимости в метаболизме исследуемого штамма.

Отмеченные особенности имеют связь с углеродлимитированной хемостатной культурой, и по всей вероятности, это обусловлено низким содержанием легко усвояемого углерода в среде в обоих случаях.

От возраста посевного материала, использованного для посева ферментационной питательной среды, существенно зависит процесс биосинтеза энзимов. Для посева питательных сред используются или суспензия спор или масса мицелия. При использовании вегетативного посевного материала наблюдается лучший синтез.

В наших опытах штамм A.niger показывает самые лучшие биосинтетические способности при использовании 24 часового посевного материала. При этом наблюдаем и сокращение времени ферментационного процесса.

Характерной особенностью изучаемого нами продуцента - это быстрое понижение энзимных активностей после достижения максимума. При этом в питательной среде остаются неусвоенные частицы углеродного субстрата. В связи с этим интересно изучение ферментационного процесса на более длительный период времени. В процессе культивирования устанавливаются два максимума. Это явление иногда наблюдается и до 144 часа. Некоторые авторы предполагают, что первый максимум связан с частичным автолизом культуры. За счет продуктов автолиза наступает усиление роста, культуры с последукь щим вторым максимумом в энзимных активностях. Это в известной степени подтверждается и динамикой рН в наших опытах.

Механизм целлюлолизы представляет интерес. Это вопрос дискуссии и в литературе третируется как секреция или лизис I 63 I.

Известное просветление в этом отношении мы получили через определение энзима супероксид-дисмутазы /СОД/, как в биомассе, так и в культуральной жидкости.

Установлена корреляция между активностью СОД и биосинтезом целлюлаз. Это дает возможность предположить, что данная зависимость имеет отношение к механизму выделения целлюлаз и ферментативному гидролизу.

Проведенные нами исследования подтвердили возможность эффективного синтеза целлюлолитических ферментов штамма A.niger ку

На основании полученных результатов можно рекомендовать штамм A.niger.1 А^ для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савов, Валентин Александров, Одесса

1. Основные направления экономического и социального развития СССР на I98I-I985 годы и на период до 1990 года,- М.: Политиздат, 198I, с.24.

2. Асатиъни B.C. Ферментативные методы анализа.- М.: Наука, 1969.- 740 с.

3. Атев А.П., Спасов С.Д., Панайотов Х.А., Бакалова Н.Г. Изоли-ране на микромицетни щамове синтезиращи целулазни ензими. Доклады Болгарской академии наук, 1983, т.36, 4, с.533-536.

4. Афанасьева В.П., Бурд Г.И. Транспорт глюкозы и катаболитная репрессия у дрожжей Endomycopsis fibuiigera.- Микробиология, 1980,т.49, 3, с.433-439.

5. Байер В. Биофизика.- И-во ИЛ, 1962, с.15,16.

6. Бекер М.Е. Микробная биоконверсия растительного сырья и перспективы ее использования.- Вестник 6, АН СССР, 1983, с.89-99.

7. Березин И.В., Мартенек К. Структура и функции активных центров ферментов.- М., 1974.

8. Березин И.В., Клесов А.А. Ферменты атакуют целлюлозу.- Наука в СССР, 1981, 3, с.6-15.

9. Березин И.В., Клесов А.А. Инженерна энзимология. Вестник 4, АН СССР.- М.: Наука, 1983, с.108-120.

10. Березин И.В., Клесов А.А. Биоконверсия растительного сырья. Вестник 4, АН СССР.- М.: Наука, 1983, с.109.ill. Билай Т.И. Термостабильные ферменты грибов.- Киев: Наукова думка, 1979, 246 с.

11. Билай В.И. Основы общей микробиологии.- Киев: Вища школа, 1980, 360 с.

12. Билай Т.И., Билай В.И., Мусич Е.Г. Трансформация целлюлозы грибами.

13. Брухман Э.Э. Прикладная биохимия. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981, 293 с.

14. Былинкина Е.С., Штоффер Л.Д. Непрерывная ферментация антибиотиков.- В кн.: Микробиология, т.4, Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов. М., 1975, с.107-123.

15. Бурачевский И.И. Непрерывное культивирование плесневых грибов.- В кн.: Инженерные проблемы микробиологического синтеза: Материалы Всесоюз. конф. биоинж. М., 1969, с,214-215.

16. Валдемар Й. Химия древесины.- М.: Лесная промышленность, 1982, 287 с.

17. Великая Е.й., Сухода В.Ф., Томашевия В.К. Общие методы контроля бродильных производств. Пищевая промышленность, 1969,

18. Виестур У.Э., Кристансонс М.Ж. Технические системы реализации процессов ферментации. М., ОНТИТЭИ Микробиопром, 1977, 76 с.

19. Генин Ж.С., Момот Н.Н., Еалинкин В.А. Изучение тормозящего влияния Са+ на целлюлазную активность. Биохимия, 1978, 43, I, с.170-173.

20. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М., Пищевая промышленность, 1975, 390 с.

21. Дончев К., Талева X. Изследване върху колориметричното опре-деляне на фосфорна киселина на почви и торове. Известия Пушка-ров, 1956, с.287.

22. Дреймане М.А., Межиня Г. Получение ферментных препаратов при непрерывном культивировании микроорганизмов. М., ОНТИТЭИ микробиопром, 1980, 26 с.

23. Егоров С.Н. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа,1969, 234 с.

24. Зелтинь Р.П. Подбор оптимальной среды для биосинтеза целлкъ лолитических ферментов Aspergillus terreus. Микробиология,1970, 89, 6, с.832-839.

25. Зелтинь Р.П., Эджинып И.М., Швинке В.Э. Получение ферментного препарата целлшазы.- В кн.: Влияние условий культивирования на активность продуцентов.- Рига: ЗИНАТНЕ, 1980, с.148-150.

26. Йерусалимский Д. Непрерывное брожение и выращивание микроорганизмов.- М.: Пшцепромиздат Мир, I960, 238 с.

27. Исмаилова Д.Ю., Бурденко Л.Г., Логинова Л.Г. Активность цел-люлозолитических ферментов и ксиланазы у термотолерантного гриба Aspergillus terreus 17 р длительно хранившегося в ли-офильно высушенном состоянии. Микробиология, 1974, 43, 10,с.992-994.

28. Исмаилова Д.Ю., Логинова Л.Г. Влияние некоторых веществ на биосинтез целлюлазы термотолерантного гриба Aspergillus terreus. Прикл.биохимия и микробиология, 1975, II, 5, с.676-681.

29. Калунянц К.А., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. Изд. Пищевая промышленность, М., 1979, 322 с.

30. Колев Д. Ензими. Наука и изкуство, София, 1976, 473 с.

31. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Синицын Н.П. и др. Ферментативный гидролиз целлюлозы I.Активность и компонентный состав целлголазных комплексов из различных источников.- Биоорган, химия, 1980, 6, с.1225-1242.

32. Клесов А.А., Григораш С.Ю. Взаимосвязь между кинетикой гидролиза растворимой и нерастворимой /природной/ целлюлозы под действием полиферментных целлюлазных комплексов.- Биохимия, 1980, 45, с,228-241.

33. Клесов А. А., Чурилова И.В. Гидролиз микрокристаллической целлюлозы под действием полиферментных целлюлазных комплексов различного происхождения.- Биохимия, 1980, 45, с.1685-1695.

34. Клесов А.А., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. III. Закономерности образования глюкозы и целлобиозы при действии полиферментных целлюлазных систем на нерастворимую /природную/ целлюлозу.- Биоорган, химия, 1981, 7, с.1528-1552.

35. Клесов А.А., Григораш С.Ю. Кинетические закономерности гидролиза нерастворимой целлюлозы под действием полиферментных целлюлазных систем в нестационарном режиме реакции.- Биохимия, 1982, 42, с.240-256.

36. Клесов А.А. Закономерности образования и расходования промежуточных целлоолигосахаридов и целлобиозы при ферментативном гидролизе нерастворимой целлюлозы.- Биохимия, 1982, 47, с.608-618.

37. Клесов А.А. Биокатализ и получение пищевых продуктов из непищевого /целлкшозосодержащего/ сырья.- В кн.: Биокатализ.- М.: Наука, 1984, с.226-260.

38. Книн Э. Амилазы их свойства и производство.- В кн.: Химия и технология крахмала.- М.; Пишепромиздат, 1956, с.338-366.

39. Коновалов С.А. Биосинтез ферментов микроорганизмами.- М.: Пищевая промышленность, 1972, 270 с.

40. Константинов Г. Ферменты углеводного обмена.- В кн.: Экспериментальная микробиология. София: Медицина и и физкультура, 1965, 485 с.

41. Кретович В.Л. Предисловие.- В кн.: Деллкшазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981.

42. Лобанок А.Г., Шкляр Б.Х. Пеллюлолитическая активность грибов, выделенных из торфа.- Весц. АН БССР. Сер. бял. навук. 1968,3, с.108.

43. Логинова Л.Г. Получение ферментов в условиях непрерывного культивирования.- В кн.: Микробиология, т.4. Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов-М., 1975, о.124-151.

44. Лозинов А.Б., Глазунова Л.М., Ермакова И.Т. Активность ферментов цитратного, глиоксалатного и пентозофосфатного циклов при росте дрожжей на гексадекане и на глюкозе.- Микробиология, 1976, 45, вып.I, с.33-39.

45. Лосякова Л.С., Мушникова Л.Н. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на ферментный комплекс гриба Aspergillus awamory 16.- В кн.: Ферменты микроорганизмов. -М.: Наука, 1973, с.105-111.

46. Лурье A.M., Верховцева Т,П., Левитов М.М. Управление процессом биосинтеза пеницилина.- В кн.: Управление биосинтезом микроорганизмов.- Красноярск, 1973, с.227-228.

47. Малек И. Роль непрерывных процессов и их изучение в развитии современной науки и производстве, ст. Непрерывное культивирование микроорганизмов. Изд-во Пищевая промышленность, М., 1968.

48. Малек И, Фенцел 3. Непрерывное культивирование микроорганизмов.- М.: Пищевая промышленность, 1968.

49. Минкевич И.Г., Ерошин В.К. Зкономерности внутриклеточногоматериально-энергетического баланса роста микроорганизмов. Успехи совр. биол. 1976, I, 4, с.203.

50. Пазларова Я., Фенцел 3., Паплина И.А.и др. Образование амилазы в периодической и непрерывной культуре Bacilus subti-lis.- Микробиология, 1977, т.46, вып.З, с.450-455.

51. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология.- М.: Колос, 1974, 560 с.

52. Работного И.Л., Позмогова И.Н., Баснякиян И.Н. Хемостатноеи периодическое культивирование при изучении физиологии микроорганизмов.- В кн.: Культивирование микроорганизмов.- М.: ВИНИТИ, 1985, 105 с.

53. Сарканен К.В. Биохимический процесс образования компонентов древесины.- В кн.: Химия древесины.- М.: Лесная промышленность, 1982, с.92.

54. Синицын А.П., Клесов А.А. Сравнительная роль экзо-1,4 -глго-козидазы и целлобиазы при ферментативном гидролизе целлюлозы.- Биохимия, 198I, 46, с.202-213.

55. Сихтола X., Макконен X. Целлюлоза.- В кн.: Химия древесины.-М.: Лесная промышленность, 1982, с.96.

56. Смирнов И.В. Теоретические основы культивирования одноклеточных водорослей, 1963. Биофизика, 8, 90.

57. Ташпулов Ж. Целлкшолитические ферменты термотолерантного и мезофильного грибов, близких к Aspergillus fumigatus.-B кн.: Ферментативное расщепление целлюлозы.- М.: Наука, 1967, с. 92102.

58. Фениксова Р.В., Двадцатова Е.А. Подбор питательной среды, обеспечивающей максимальное образование амилолитических ферментов.- Тр. ВНИИФС, I960, вып.9, 3, с.8-13.

59. Фениксова Р.В. Биосинтез ферментов микроорганизмами.- В кн.: Ферменты микроорганизмов.- М.: Наука, 1973, с.7-25.

60. Фениксова Р.В., Тиунова Н.А., Родионова Н.А. Определение активности целлюлазы.- В кн.: Методы современной биохимии.-М.: Наука, 1975, с.23-28.

61. Шиврина А.Н., Низковская О.П., Фалина Н.Н. и др. Биосинтетическая деятельность высших грибов.- I.: Наука, 1976, 171 с.

62. Abon-Zeid A.A. Selection of the cellulose decomposing fungi.- J. Microbiol. UAR, 1970, N 3,

63. Abon-Zeid A.A. Itilization of egyptian cane-sugar bagases for the production of tropical forages from their solubility in fuhgal cellulase solution.- J.Sci.Pood and Agr., 1977, 28, N4, p.776-785.

64. Achremowicz B. Studies on a Fusarium sp. strain during continuous cultivation, Contin. Cultiv. Microorganisms, Proc. 7th Symp. Prague, July 10-14-, 1978, Prague 1980.f-Vi

65. Ainsworth G.C. Dictionary of the fungi 6 . ed. by G.O.Ains-worth 1971.

66. Allen A.L., R.E.Andreotti. Cellulase Production in Continuous and Fed.Batch Culture by Trichoderma reesei MC G80. Biotechnology and Bioengineering Symp. N 12, 451-4-59» (1982).

67. AteV A.P., Spasov S.D., Panayotov H.A., Bakalova N.G. Mycro-mycetes strains synthetizing cellulose enzymes. Comptes rendys de l'Academie bulgare des Sciences 36, 1983, N 4,p.553-536.

68. Atkinson D.E. Regulation of enzyme function. Annual Review of Microbiology. 1969, 23, p.4-7-68.

69. Ayers A.R., Ayers S.B., Eriksson K.-E. Cellobiose oxidase purification and partial characterization of a hemoprotein for Sporotrichum pulverulentum.- Europ.J.Biochem. 1978,90, p.171-iaa.

70. Berg В., Hofsten A.V. The ultrastructure of the fungus Tri-choderma viride and investigation of its growth on cellulose.- J.Appl.Bacter., 1976, 41, N 2, p.395-399.

71. Berg B., Pettersson Ъ. Location and formation of cellulases in Trichoderma viride.- J.Appl.Bacter., 1977, 42, N 1, p.65-75.

72. Berg B. Cellulose degradation and cellulase formation by phialophora malorum.- Arch.Microbiol., 1978, 118, N 1, p.61-68.

73. Bhatnager G.M., Krishnan P.S. Enzymatic studies in spores of Aspergillus niger III.Enzymes of Embden-Meyerhof-Parnas pat-way in germinating spores. Archiv fur;Microbiologic, 1960, 37, p.211-214.

74. Brandsberg I. Fungi isolated from decomposing conifer litter. Mycologia, 1969, 61, N 2, p.373-381.

75. Brown C.M., Stanley S.D. Environment-mediated changes of the "pool" constituents and their associated changes in cell physiology." J.Appl.Chem.Biotechnol., 1972, 22, p.363.

76. Brown C.M., Herbert R.A., Herbert K. New reducing sugar essay for the study of cellulases. FEMS Microbiol. Lett., 1977, 1:39-42.

77. Brown D.E., Zainudeen. Growth Kinetics and Cellulase Biosynthesis in the Continuous Culture of Trichoderma viride. Biotechnology and Bioengineerung 1977, vol.XIX, p.941-958.

78. Bull A.T. Chemostasis and analysis of fungal growth. Abstracts2nd Intern Mycological Congress 1977, p.73.

79. Bull A.0?., Trinci A.P.J. The physiology and methabolic control of fungal growth. Advances in Microbial Physiol., 1977,15:1.

80. Bungay H.R. Commercializing biomass conversion, Environ. Sci.Technol., 1983, vol.17, p.1.

81. Carter B.L.A., Bull A.T. Studies of fungal growth and intermediary carbon methabolism under steady and non-steady state conditions. Biotechnology and Bioengineering 1969, II, p.785-804.

82. Carter B.b., Bull А.Т., Pirt S.J., Rowley B.T. Relationship between energy substrate utilization and specific growth rate in Aspergillus nidulans. J. of Bacteriol., 1971, 108, p.309-313.

83. Choi M.J., Kim L.M., Kim W.S. Influence of some metal ions on cellulase activity.- Korean J. Microbiol., 1976, 14, N 1, p.75-83.

84. Conri D., Racker E. The oxidative pentose phosphate cycle. V.Complete oxidation of glucose-6-phosphate in a reconstruc-tured system of the oxidative pentose phosphate cycle. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 883, 195-205.

85. Cove D.J. Genetic studies of nitrate assimilation in Aspergillus nidulans.- J.Bacteriol., 1979, 97:1374-1378.

86. Cowling E.B. Structural features of cellulose that influence its succeptibility to enzymatic hydrolysis of cellulose and related materials /Ed.E.T.Reese L.: Pergamon press, 1963,p.1-32.

87. Dantzig A.H., Weigmann P.L.J., Nason A. Regulation of £uta-mine dehydrogenase in nit-2 and am mutant frim Neurospora crassa.- J.Bacteriol., 1978, 137, p.1333-1339.126

88. Dawes E.A., Sekior P.J.-The role and. regulation of energy reserve polymers in microorganisms. Adv. in Microb.Physiol., 1973, 10, p.135-266.

89. Demain A.L. Comments on Cellulase Production, Biotechnol. Bioeng. Symp., 1976, N 6, p.79-81.

90. Eggleston L.V., Krebs H.A. Regulation of the pentose phosphate cycle. Biochem.J., 1974, 138, p.425-435.99» Emert G.H., Gum E.K., Lang J.A. et al. Cellulases.- Adv. Chem.Ser.,1974, 136, N 1, p.79-100.

91. Enzyme nomenclature, recommendations of the IUPAC and the international union of biochemistry Amsterdam: Elsevier 1973, p.443.

92. Enzyme nomenclature.- Biochem. et Biophys. acta, 1976, suppl. 1, 429, p.1-45.

93. Eriksson K.-E. Enzyme mechanisms involved in the degradation of wood components.- In: Symp. on Enzym.Hydrolysis of Cellulose Helsinki, 1975, p.263-380.

94. Eriksson K.-E. Enzyme mechanisms involved in cellulose hydrolysis by the root fungus Sporotrichum pulverulentum.- Biotechnol. and Bioeng., 1978, 20, N 2, p.317-332.

95. Eriksson K.E. Fungal degradation of wood components Pure & Appl. Chem., vol.53, p.33-43.

96. Eriksson K.E. Degradation of cellulose. Experienta 38 (1982),p.156-159.

97. Fahnrich P., Irrgang K. Cellulase and Protein production by chaetomium cellulolyticum strains grown on cellulosic substrates. Biotechnology Letters, 1981, vol.3, N 5, p.201-206.

98. Fenci Z., Sielinger V., Nus L., Malek J. Theory of semi-continuous and continuous cultivation applied to the yeast Torula utilis, Folia Microbiol., 1961, 6, p.94.

99. Fenci Z., Malek J., Novak M. Prediction of the course of continuous fermentation of the basis of analysis of the batch process Folia Microbiol., 1969, 14, p.314.

100. Fenci Z., Ujcova E., Machek L., Seichert L., Musilkova М» Continuous cultivation of fungi. Contin.Cultiv.Microorganisms, Proc. 7th Symp.Prague, July 1980, p.10-14.

101. Fiechter A., Ettilinger L. Continuous culture of Saccharo-myces cerevisiae Continuous cultivation of microorganisms, Proc.Symp. Prague, 1962, Publ. House Czechoslov. Acad. Sci. Prague, p.245.

102. Fiechter A., von Meyenburg K. Automatic analysis of gas exchange in microbiol. systems. Biotechnol. Bioengin.,1968, 10, p.555

103. Fiechter A. Continuous cultivation of yeasts, in methods in cell Biology XI, 1975, p.564.

104. Fliess A., Schugerl K. Characterization of Cellulases by HPLC Separation Eur.J.Appl.Microbiol. Biotechnol. 19S3, 17:31^318.

105. Garg S.K., Neelakantan S. Effect of Nutrional Factors on Cellulase Enzyme and Microbiol. Protein Production by Aspergillus Protein and its Evaluation. Biotechnology and Bioengineering, 1982, vol. XXIV, p.109-125.

106. Garg S.K., Neelakantan S. Studies on the Properties of

107. Cellulase Enzyme from "Aspergillus terreus GN1, Biotechnology and Bioengineering, vol.XXIV, 1982, p.757-742.

108. Gascoigue J.A., Gascoigue M.M. Biological decomposition of cellulose L: Butherworths, 1960, p.18$.

109. Ghosh B.b., Basu S.N. Protection, inhibition and stimulation of cellulase of Aspergillus terreus.- Sci.Cult., 1969, 35, N 1, p.59-61.

110. Ghose Т.К., Sahai V. Production of Cellulases by Trichoder-ma reesei QM 9414 in Fe-Batch and Continuous-Flow Culture with Cell Recycle., Biotechnology and Bioengineering 1979, vol.XXI, p.283-296.

111. Ghosh B.S., Kundu A.B. Induction of Cellulases and Hemi-cellulases by Tamerind (Tamarindus indica) Kernel Polysaccharide. J.Ferment.Technol., 1980, vol.58, N 2, p.1$5-141.

112. Gong Ch.-Sh., Ladisch M.R., Tsao G.T. Biosinthesis, purification and mode of action of cellulases of Trichoderma reesei.- Hydrolysis Cellul., Mech. Enzymatic and Acid Catal. Symp.Appleton.Wise.,1978, p.261-287.

113. Gray T.R.G., Baxby P. Chitin decomposition in soil.II. The ecology of chitinoclastic microorganisms in forest soil.- Trans. Brit. Mycol. Soc., 1968, 51 pt 2, p.293-$09.

114. Greene G.L. Enzymes of glucose catabolism pathways in Col-letotrichum and Gloeosporum.- Mycologia, 1969, 61, N 5,p.902-914.12$. Halliwell G. The enzymatic decomposition of cellulose.

115. Nutr.Abstr.Revs., 1959, 29, p.747-760. 124. Halliwell G. Measurement of cellulase and factors affecting its activity.- In: Advances in enzymic hydrolysis of cellulose and related materials /Ed.E.T.Reese b.: Pergamon press, 196$, p.71-91.129

116. Hankinson О., Cove D.J.-Regulation of the Pentose Phosphate

117. Pathway in the Fungus Aspergillus nidulans. The effect of Growth with nitrate. The J. of Biol.Chem. 1976, vol.249, N 8, p.2344-2353.

118. Harder W., Dia'khuiten L. Physiological Responces to nutrient limitation. Ann.Rev.Microbiol., 1983, 37:1-23.

119. Harrer W., Kubicek C.P., Rohr M., Wuth H., Marihart J. The Effect of CMC addition on Extracellular Enzyme Formation in Tr.pseudokoningii. Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol., 1983, 17:339-34-3.

120. Hash J.H., King K.W. On the nature of the -glucosidases of Myrothecium verrucaria.- J.Biol.Chem., 1958, 232, p.381-393.

121. Hecht V., Schiigerl W. Conversion of Cellulose into Fungal Cell Mass. Eur.J.Appl.Microbiol. Biotechnol., 1982, 16: 219:222.

122. Herbert D. The chemical composition of microorganisms as a function of their invironment, Symp.Soc.Gen.Microbiol., 1961, 11, p.391-416.

123. Horecker B.L., Kornberg A. The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides.- J. of Biol. Chemistry, 1948, 175, p.385-390.

124. Hummlet G., Mora J. NADH -dependent glutamate synthase and nitrogen metabolism in Neurospora crassa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, 92, p.127-133.

125. Hummlet G., Mora J. Regulation and function of glutamate synthase. Biochem. Biophys. Res.Commun., 1980, 96, 16881694.

126. Janssen D.B., Op Den Camp J.M., Leenen P.J.M., Van Der Drift C. The Enzymes of the Ammonia Assimilation in Pseudo-monas aeroginosa. Arch.Microbiol., 1980, 124, p.197-203.

127. Kato K., Koike S., Yamada K., Yamada H., Tanaka S. Di-and triphosphopyridine nucleotide-linked glutamic dehydrogenases of Piricularia oryzae and their behaviour in glutamate media. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1962, 98, p.346-347.

128. Kornberg A., Isocitric Dehydrogenase of yeast (TPN), Methods in Enzimol., 1955, 1, Р-705.

129. Khan A.W., L.van den Berg. Cellulase Production by the Anaerobic Digestion Process, Biotechnology and Bioenginee-ring Symp., 1981, N 11, p.325-331.

130. Khan A.W., Wall D., L.van den Berg. Fermentative Conversion of Cellulose to Acetic Acid and Cellulolytic Enzyme Production by a Bacterial Mixed Culture Obtained from Sewage Sludge. Applied from and Environmental Microbiology, May 1981,p.1214-1218.

131. Khan A.W., Myrray W.D. Isolation of a symbiotic culture of two species of bacteria capable of converting celluloseto ethanol and acetic acid. FEMS Microbiology Letters 1982, 13, p.377-381.

132. King K.W. Endwise degradation of cellulose.- In: Advances in enzymatic hydrolysis of cellulose and related materials /Ed. E.T.Reese. L.: Pergamon press, 1963, p.159-170.

133. Kinghorn J.K., Pateman J.A. Studies of partially repressedmutants of the tam A and are H loci in Aspergillus nidulans lacking nicotinamide adenine dinucleotide specific-glutama-te dehydrogenase.- J.Bacteriol., 1975, 125, p.42-47.

134. Kleinzeller A., Kotyk A. "Transport of monosaccharides in yeast cells and its relationship to cell metabolism".- In: Aspects of Yeast Metabolism/Mills A.K., Krebs H. eds/ 1967, p.33.

135. Klyosov A.A., Rabinowitch M.L. Enzymatic conversion of cellulose to glucose: Present state of the art and potential.-In: Enzyme engineering: Future directions/ Ed.L.B.Wingard, I.V.Berezin, A.A.Klyosov, N.T.Plenum press, 1980, p.83-165.

136. Kubicek D.E., Pitt C.P. Effect of Dilution Rate on -glu-cosidase Secretion and cell Wall Metabolism in Tr.aureovi-ride cultivated in a Continuous Air Lift fermentor. Eur. J.Appl.Microbiol.Biotechnol.v 1982, 16:189-196.

137. Kurtzman C.P. Fungi-sources of food, fuel and biochemicals, Mycologia 1983, 75 (2), p.375-382.

138. Kyslikova E., Volfova 0. Cell Growth and Cellulase Production in Trichoderma viride on Microcrystalline cellulose. Folia Microbiol., 1981, 26, 303-308.

139. Lowendorf H.S., Slayman C.L., Slayman C.W. Phosphate transport in Neurospora. Kinetic characterization of a constitutive, low affinity transport system, Biochem. Biophys. Acta 1974, 373:369.

140. Malca I., Erwin D.C., Sims J.J. et al. Repiratiory and Enzymatic studies with Verticillium albo-atum from cotton.-Phytopatology, 1968, 58, N 3, p.348-353.

141. Malek I., Penci L. Continuous cultivation of microorganisms, Pol. microbiol., 1961, 6, 192 p.

142. Malek I., Beran K. Continuous cultivation of microorganisms. A review, Pol. microbiol., 1962, 7, 388 p.

143. Malek I., Ricica J. Continuous cultivation of microorganisms. A review, Pol. microbiol., 1964, 7, 388 p.

144. Mandels M. Microbial sources of cellulase.- Biotechnol. and Bioeng. Symp., 1975, 5, p.81-106.

145. Mandels M., Reese E.T. Introduction of cellulose in Tricho-derma viride and influence by carbon sources and metal.

146. J.Bacterid., 1957, 73, p.269-278.

147. Mandels M., Medeiros R.E., Andreotti R.E., Bissett P.H. Enzymatic Hydrolisis of cellulose Filtrates under Use Conditions. Biotechnology and Bioengineering, 1981, vol.XXIII,p.2009-2026.

148. Marrluf G.A. Regulation of Nitrogen Metabolism and Gene Expression in Fungi. Microbiological Reviews, 1981, vol.15, N 3, p.437-461.

149. Marsden W.L., Dunn N.W., Gray P.P. Action of Tr.reesei QM 9414 and С 30 cellulase on substrates with varying crystal-linity, Enzyme Microb.Technol., 1983, vol.5, p.345-351.

150. Mehlberg R.L., Tsao G.T., Ladisch M.R., Dyck K.K. Selective Hydrolysis of Cornstover Hemicellulose: The Effects of Moisture 180th AOS Meeting Las Vegas, 1980, HE.

151. Meers J.L., Tempest D.W. The influence of growth limiting substrate amd medium NaCl concentration on the synthesis of magnesium binding sites in the walls of Bacillus subti-lis var. niger.- J.Gen.Microbiol., 1980, 63, p.325.

152. Meyer H.P., Humphrey A.E. Cellulase Production by a Wild and a New Mutant Strain of Thermonospora sp. Biotechnology and Bioengineering, 1982, vol.XXIV, p.1901-1904.

153. Miller G.L., Birzgalis R. KMC and cellopentase activities of electrophoretic fractions of cellulase.- Arch.Biochem. and Biophys., 1961, 95, p.1924.

154. Millet M.A., Baker A.J., Satter L.D. Pretreatment to enhance chemical, enzymatic and microbial attact of cellulosic materials.- Biotechnol. and Bioengin.Symp., 1975, 5, N 1,p.193-220.

155. Mitra G., V/ilke. Continuous Cellulase Production, Biotechnology and Bioengineering, 1975, vol.XVII, p.1-13.

156. Moldoveann N., Kluepfel D. Applied and Environmental Microbiology, July, 1983, p.17-21.

157. Monod J. The growth of bacterial cultures. Ann.Rev.Microbiol., 1949, 3, 371 p.

158. Monod J. La technique de culture continuee. Theorie et application. Ann.Inst.Pasteur., 1950, 79, 390 p.

159. Monod J. Cultivation of microorganisms. US Pat., 1958, 2, 822, 319.

160. Neijssel O.M., Tempest D.W. The physiology of metabolize overproduction.- In: Microbial Technology. Symposia of the Society for General Microbiology, 1979, 29, ed. A.T.Bull, D.C.Elwood, C.Ratledge, p.52-82.

161. Neilson M.J., Shafizadeh F., Aziz S., Sarkanen K.V. Evaluation of Organosolv Pulp as a Suitable Substrate for Rapid Enzymatic Hydrolysis. Biotechnology and Bioengineering, 1983, vol.XXV, p.669-612.

162. Nisizawa Т., Suzuki H., Nisizawa K. "De novo" synthesis of cellulase induced by sophorose in Trichoderma viride cells.-J.Biochem., 1971, 70, N 3, p.387-393.

163. Nisizawa Т., Suzuki H., Nisizawa K. Catabolite repression of cellulase formation in Trichoderma viride.- J.Biochem., 1972, 71, N 5, p.999-1007.

164. Norkraus B. Influence of cellulolitic enzymes from hemynomy-cetes on cellulose preparation of different crystallinity.

165. Physiol. plant., 1950, 3, p.75-78.

166. Novak M., Fencl Z. Kinetic analysis of the relationship between batce and continuous cultivation of Aspergillus niger.

167. Adv. in Microbial Engineering, 1973, 1, 43 p.

168. Novick A., Szilard L. Experiments with the chemostat on spontanens mutations of bacteria.- Proc.Acad.Sci.Wash., 1950, 36, p.708.

169. Novick A. Experimentation with chemostat Recent progress in microbiology, G.Tunevall, Stockholm, 1959, 463 .

170. Ohmiya K., Nokura S., Shimizu S. Enhancement of Cellulose Degradation by Ruminococcus albus at High Cellulose Concentration.- J.Ferment.Technol., 1983, vol.61, N 1, p.25-30.

171. Olutiola P.O. Cellulolytic enzymes in culture filtrates of Apergillus clavatus.- J.Gen.Microbiol., 1977, Ю2, N 1, u p.27-32.

172. Olutiola P.O. Cellulase enzymes in culture filttfetes of Aspergillus flavus.- Trans.Brit.Mycol.Soc., 1976, 67, N 2, p.265-268,

173. Ooshima H., Sakata M., Harano Y. Adsorption of Cellulase from Trichoderma viride on Cellulose. Biotechnology and Bioengineering, vol.XXV, 1983, p.3103-3114.

174. Patel G.B., Mac Kenzie C.R. Metabolism of Acetovibrio cel-lulolyticus During Optimized Growth on Glucose, Cellobiose and Cellulose, Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol., 1982, 16:212-218.

175. Pateman J.A. Regulation of synthesis of glutamate dehydrogenase and glutamine synthase in microorganisms. Biochem. J., 1970, 115, p.769-775

176. Pateman J.A., Kinghorn Dunn E., Forbes E. Ammonium Regulation in Aspergillus nidulans.- U. of Bacteriology, 1973, v.114, N 3, p.943-950.

177. Pateman J.A., Kinghorn J.R. Nitrogen metabolism in the filamentous Fungi. Biosynthesis and Metabolism, 1976, vol.11.

178. Peitersen N. Cellulase and Protein Production from Mixed Cultures of Trichoderma viride and a least, Biotechnology and Bioengineering, 1975, vol.XVII, p.1291-1299.

179. Peitersen N., Medeiros J., Mandels M. Adsorption of Trichoderma Cellulase on Cellulose. Biotechnology and Bioenginee-ring, 1977, vol.XIX, p.1091-Ю94.

180. Peitersen N., in Bioconversion of Cellulosic Substances into Energy, Chemicals and Microbial Proteins (Ghose, Т.К., et al.), Indian Institute of Technology Delhi, India, 1977, p.281.

181. Peitersen N., Ross E.W. Mathematical model for enzymatic hydrolysis and fermentation of cellulase by Trichoderma.-Biotechnology and Bioengineering, 1979, 21, N 6, p.997-1017.

182. Pirt S.J., Callow D.S. Studies on the growth of Penicillium ehrysogenum in continuous flow culture with reference to penicillin production.- J.Appl.Bacteriol., 1960, 123, N 1, p.87-98.

183. Pirt S.J. Microbial growth.- In: 19th Symp.Soc.Gen.Micro* biol.Cambridge, 1969, N 9, p.199-216.

184. Ratledge C. Fermentation substrates, Fermentatio processes,1977, vol.1, p.49-71.

185. Reese E.T., Gilligan W. Separation of components by cellu-lolytic systems by paper chromatography.- Arch.Biochem. and Biophys., 1953, 45, p.74-82.

186. Reese E.T. Enzymatic hydrolysis of cellulose.- Appl. Microbiol., 1956, 4, p.39-65.

187. Reese E.T., Maquire A. Surfactans as stimulanta of enzyme production by microorganisms.- Appl.Microbiol., 1969, N 17,p.242-245.

188. Eeese E.T., Mandels M., Weiss A.H. Cellulose as a novel energy source.- In: Anvances Biochemical Engineering /Ed.T.K.Ghose, A.Pietchez N.Blankenbrough. Heidelberg: Spring-Verl., 1972, vol.2, p.180-200.

189. Reuss N., Guieser J., Reng H.G., Wagner P. Extended culture of Candida boidinii on methanol, Eur.J.Appl.Microbiol.,1975, 1, 295 P.

190. Ricica J. Continuous culture techniques, Continuous Cultivation of microorganisms. A symposium, Publ.House, Czecho-slov. Acad. Sci. Prague, 1958, p. 75205. Ricica J. Continuous cultivation of microorganisms, Pol.microbiol., 1973, 18, p.418-448.

191. Righelato R.C., Trinci A.P.J., Pirt S.J., Peat A. The influence, of maintenance energy and growth rate on the metabolic activity morphology and conidiation of Penicil-lium chrysogenum,- J.GenMicrobiol., 1968, 50, N 3, p.399-412.

192. Rooiman P., Roelofen P.A., Sweeris S. Some properties of cellulase from Myrothecium verrucaria.- Enzymologia, 1953, 16, p.237-246.

193. Roon R.J., Evan H.L., Dunlop K., Larimore P.L. Methylamine and Ammonia Eransport in Saccharomyces cerevisiae.- J.Bacteriol., 1975, 122, p.502-509.

194. Ros A., Schiigerl K., Scheiding W. Cellulase Production by Trichoderma reesei.- Eur.J.Appl. Microbiol., 1983, 18:29-37.

195. Ryn D.D.Y., Mandels M. Cellulases: biosynthesis and applications, Enzyme Microb. T^chnol., 1980, vol2, p.91-102.

196. Ryn D.Y., Andreotti R., Medeiros J., Mandels M. Comparative quantitative physiology of high cellulase producing strainsof Trichoderma reesei,-'Enzyme Engineering, 1980, vol.5.

197. Ryn S.K., Lee J.M. Bioconversion of Waste Cellulose by Using an Attriton Bioreactor, Biotechnology and Bioengi-neering, 1983, vol.XXV, p.53-65.

198. Saddler J.N., Maria K-H., Chan and G.Lois-Seize. A one step process for conversion of cellulose to ethanol using anaerobic microorganisms in mono- and co-culture, Biotechnology Letters 1982, 3, p.321-326.

199. Sahai V., Ghose Т.К. In Bioconversion of Cellulosic Sub-stracts into Energy, Chemicals and Microbial Proteins (Ghose, Т.К. ed.) Indian Institute of Technology Delhi India 1977, p.266.

200. Selby K. The degradation of cotton cellulase by the extracellular cellulase of Myrothecium verrucaria.- Biochem. J.,1961, 79, p.562-566.

201. Sin R.G.H. Microbial decomposition of cellulose.- N.Y.: Rei-nold, 1951, 531 p.

202. Smith J.L., Valeuzuela-Perez J., Ng W.S. Changes in activities of the Embden-PIeyerhof-rParnas and Pentose phosphate pathways during the growth cycle of Aspergillus niger.-Trans.Brit.Mycol.Soc., 1971, 57, N 1, р.93-Ю1.

203. Smith M.J. Differences in the types of cellulose used in the detection of cellulolytic microorganisms on agar media. Rev.Ecol.Biol.Sol., 1983, 20 (1):29-36.

204. Somodgy M. Effect of insulih hypoglicemia on alimentary hyperglycemia.- J.Biol.Chem., 1952, 193, N 19, p.195

205. Spano L.A., Medeiros J., Mandels M. Enzymic hydrolysis of cellulosic wastes to glucose.- J.Wash.Acad.Sci., 1976, 66, p.279-294.

206. Sternberg. Production of Cellulase by Trichoderma, Biotechf nol. and Bioengineering, 1976, N 6, p.35-53i

207. Sutherland J.B., Cook R.J. Effect of Chemical and heat treatments on ethylen production in soil.- Soil Biol.Bio-chem., 1980, 12, p.357-362.

208. Szegi J. Data on the nitrogen metabolism of a few cellulose decomposing microscopic bungi. Soil nutrients.- Ann. Inst. Pasteur., 1968, 115, N 4, p.617-794.

209. Szedi J. Effect of some herbicides on the growth of cellu-losedecomposing microscopic fungi.- Mede.Fac., Landbouwet. RiOksuniv.Gent., 1970, 35, p.559-561.

210. Taniguchi M., Kometani Y., Tanaka M., Matsuno R., Kamiku-bo T. Production of Single-cell Protein from Enzymatic Hydrolyzate of Rice Straw.- Europ.J.Appl.Microbiol.Biotechnol., 1982, 14:74:80.

211. Tempest D.W., Neijssel O.M. Eco-physiological aspects of microbial growth in aerobic nutrient-limited environments.-Adv.Microbiol.Ecol., 1978, 2, p.105-153.

212. Thomulka K.W., Moat G.A. Inorganic Nitrogen assimilation in Yeasts Alternation in Enzyme Activities Associated with Changes in Cultural Conditions and Growth Phase. J. of Bacteriology, 1972, vol.109, N 1, p.25-33.

213. Thyasen A.C., Bunker H.J. The microbiology of cellulose, hemicelluloses, pectins and gums.- L.Oxford Univ. Press, 1927, 165 P.

214. Tomonaga G., Yamada T. A new method for the continuousproduction of protease by Aspergillus niger.- J.Gen. and Appl.Microbiol., 1968, 14-, N 3, p.321-524.

215. Vaheri M.P., Vaheri M.E.O., Kanppinen V.S. Formation and Release of Oellulolytic Enzymes During Growth of Tr.reesei on Cellobiose and Glycerol European J.Appl.Microbiol. Bio-technol., 1979, 8, p.75-80.

216. Virkola N-E. Available cellulosic materials.- In: Proc.

217. Symp.Enzym.Hydro1.Cellulose, Aulanko, Finland /Ed. M.Bailey, T.M.Enari, M.Linko, 1975, p.25-26.

218. Waksman S.A. Decomposition of cellulose and hemicelluloses by microorganisms.- In: Wood chemistry /Ed.L.E.Wiese.- N.Y: Reinhold, 1944, p.828-852.

219. Warzywoda M., Verre V., Pourqui J. Development of a Culture Medium for Large-Scale Production of Oellulolytic En-zames by Trichoderma reesei. Biothechnology and Bioenginee-ring, 1985, vol.XXV, p.5005-5010.

220. V/enzel H.F. The Chemical Technology of Wood Academic Press, N.Y., 1970, p.94-101.

221. Whitaker D.R. The steric factor in the hydrolysis of 1,4 -oligoglucosidases by Myrotzecium cellulase.- Canad.J.Biochem. and Physiol., 1955, 54, p.102-115.

222. Whitaker D.R. Purification of Myrothecium verrucaria cellulase Arch.Biochem. and Biophys., 1955, 4-5, p.253-268.

223. Whitaker D.R, Mutarotation after hydrolysis of cellopentao-se by Myrothecium verrucaria cellulase.- Arch.Biochem. and Biophys., 1954, 55, p.456-458.

224. Whitaker D.R, Hydrolysis of series of -1,4-oligoglucosi-dases by Myrothecium verrucaria cellulase.- Arch.Biochem. and Biophys., 195^, 55, p.439-449.

225. Whitaker D.R., Merler E. Cleavage of cellotriose by Myrothecium cellulase.- Canad.J.Biochem. and Physiol., 1954, 34, p.83-89.

226. Whitaker D.R. The mechanism of degradation of a cellodext-rin by Myrothecium cellulase.- Oanad.J.Biochem. and Physiol., 1956, 34, p.488-494.

227. Zetelaki-Harvath K. Continuous production of endo-polygalac-turonase by Aspergillus awmori. Contin.Cultiv.Microorganisms, Proc. 7th Symp. Prague, July 1978, p.10-14, Prague, 1980.