Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологическая характеристика защитных свойств гепарина при действии экзогенного этанола на организм

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологическая характеристика защитных свойств гепарина при действии экзогенного этанола на организм"



На правах рукописи

- ^ ^ • Л '! БАКАРИНОВ Павел Викторович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЗАЩЙТНЫХ СВОЙСТВ ГЕПАРИНА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННОГО-ЭТАНОЛА НА ОРГАНИЗМ

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2000

Работа выполнена в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор - < / А.Е.Хомутов

Научный консультант кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Ю.В.Зимин

Официальные оппоненты: . , .< , ).;!:■: ¡;У:'л.'-.ч•'"■' ■

доктор биологических наук ; ! ' '! 1 Д. Б. Гелашвили

доктор медицинских наук, ; ■ ■ ■ ,• г.

заслуженный врач Российской Федерации В. А. Беляков

Ведущая организация:

,. {!,т,и.лу ■■ .. ! ¡¡С;.- - а.ООЛ"

Государственный научно-исследовательский институт военной медицины Министерства Обороны Российской Федерации

Защита состоится " /а _ часов на заседании

диссертационного совета К 063,77.13 в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603600, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина,;23. ^• 'л

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан " 2. " 2000 г.

Ученый секретарь, диссертационного совета кандидат биологических наук 4-—' И.Ф. Александрова

Общая характеристика работы

Актуальной проблемой современной физиологии является изучение механизмов действия эндогенных биологически активных веществ, обладающих способностью повышать резистентность организма к экстремальным факторам среды. Имеющиеся в литературе сведения относительно свойств гепарина, указывают на возможность его участия в физиологических механизмах защиты организма от токсических соединений. Являясь естественным антикоагулянтом,, гепарин нашел широкое применение в физиологии и медицине. Однако за последнее время было показано, что он обладает широким спектром действия и играет немаловажную роль в поддержании гомеостаза организма. В настоящее время общепризнанно, что гепарин является универсальным регулятором функций организма. Показано, что он кроме антикоагуляционной активности обладает антилнпеммическим (Нака1а е1 а1., 1999), цитостатическим (К^Ьга-Согиг, Саз^ПоЦ 1999), бактериостатическим (воп е1 а1, 1999), радиопротективным действием (Лукашин, Софронов, 1996) действием, выявлены антиаллергический (Шее й а1., 1999) и гипотеюивный (ЬЦогоитсг е1 а1., 1998, БрсНп, Буешзоп, 1990) эффекты гепарина.

Одним из важных и сравнительно недавно открытых свойств гепарина явилась его способность 1 связывать и; инактивировать природные токсины, входящие в состав пчелиного яда и некоторых змеиных ядов (Хомутов и др., 1985). Кроме того, была показана его способность взаимодействовать с некоторыми фармакологическим веществами (Хомутов и др., 1998).

Цель и задачи работы. Исследования проведены с целью изучения физиологических механизмов защитного действия гепарина при действии экзогеного этанола на организм экспериментальных животных.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние гепарина на продолжительность этанолового сна у крыс.

2. Исследовать изменения поведенческой активности крыс через 24 ч после этанолового сна.

3. Исследовать изменения активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной и циторлазматической.фракциях клеток мозга и печени через 24 ч после этанолового сна.

4 Определить время восстановления поведенческой активность крыс и активности альдегиддегидрогеназы после введения животным экзогенного этанола.

5. При помощи физико-химических методов изучить возможность взаимодействия гепарина с этанолом и ацетальдегидом.

Научна^ новизна

В работё впервые проведено комплексное исследование защитных свойств гепарина в условиях воздействия на организм экзогенного этанола.

Установлено, что гепарин способен снижать продолжительность сн; вызванного внутрибрюшинным введением этанола в дозе 4,5 г/кг. Изученс отсроченное влияние внутрибрюишнного введения крысам этанола ,в дозе 4,: г/кг на изменение поведенческой активности жг^оршх. ,и!:гакгивносп альдегиддегидрогеназы в мигохондриальной и ц! гго плазматической фракциях ; клеток мозга и печени. Показано, что гётуин'.в' средних и больших ¡дозах способен эффективно устранять нега^ше'п^^^эр'^^^^рюфищсогс введения крысам этанола, а связывание протамин сульфатом эндогедаогс . гепарина усилйваетданный токсический эффект. ц ;кпо-о;: ■

Впервые показайо взаимодействие гепарину t/i, с. ,п; этанолом, и ацетальдегидом in vilr6 Данный процесс ^опровождастся. увеличением ■ оптической плотности раствора, а при взаимодействии гепарина с ацетальдегидом изменяется также спектральные характеристики исследуемого раствора.

Практическая значимость работы

Разработаны основы представлений о стабилизации физиолошчесигх ; функций организма гепарином в условиях действия на организм экзогенного ' ¡этанола. Полученные материалы расширяют и углубляют представления о физиологической роли гепарина. Практическая ценность результатов работы I, имеет важное значение для физиологии и клинической. медшхит^Вмтдане .понимания молекулярйоШ механизма действия' гепарин;}, где онпдшрдко . применяется как фармакологическое средство. , ,, д \

Положения выностСШгё на'защиту: ; ; '!,, ; • •

1. Гепарин' в дозе 250 и 2500 МЕ/кг эффективно снижает ¡ продолжительность этанолового ciia. Связывание эндогенного гепарина

протамин сульфатом в дозе 10 мг/кг увеличивает его продолжительность.

2. Внприбрюхшшное введение крысам этанола в дозе 4,5 i/кг .снижает их поведенческую •зктйвность в' тесте jng^" активность алъдегиддегидрогенайы в митохЬндриально'й 'фракции клеток мозга и дечени крыс через 24 ч после инъекции. Данные эффекты длягся не оодее двух суток. !i '■ .-.whvсм-оч' oi

3. Предварительное внутрибрюшинное введение гепарина в: дозе 250 и 2500 МЕ/кг способствует быстрейшему восстано^ерхда^ ловеденчеокой активности и активности' альдегиддегидрогеназы в,м,итрхдндриальной фракции клеток мозга и печени крыс. Предваритедьдо^., ¡связывание эндогенного гепарина протамин сульфатом замедляет данный процесс/,!,;!.

4. Внутрйбрюшинное введение крысам ацетальдегида в дозе О.^щ/кг резко снижает их поведенческую активность в тесте "Открытое: поле" и активность альдегиддегидрогеназы в митохондриальной фракции : клегок мозга и печени крыс. Предварительное введение животным гепарина в дозе 250 МЕ/кг способствует снижению токсического эффекта ацетальдегида, а

предварительное связывание эндогенного гепарина протамин сульфатом, напротив усиливает его.

5. Физико-химический указывает на возможность взаимодействия гепарина с ацетальдегидом в условиях in vitro.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Путинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 1999); III Всероссийском симпозиуме "Физиологические механизмы природных адаптации" (Иваново, 1999); Конференции "Химия для медицины и ветеринарии" (Саратов, 1998); III Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 1998).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, методик исследования, 5 глав собственных исследований и обсуждения результатов. Выводы содержат 8 основных положений. Работа содержит 23 рисунка, 14 таблиц и 2 схемы. Библиография включает 136 источников (из них 69 отечественных и 67 иностранных).

Материалы и методы исследования

Опыты были проведены на 160 белых беспородных крысах - самцах, массой 150- 200 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. 30% раствор этанола в дозе 4,5 г/кг, 10% раствор ацетальдетида в дозе 0,1 мг/кг, гепарин в дозах 25 - 2500 МЕ/кг и протамин сульфат в дозе 10 мг/кг вводился крысам внутрибрюшинно. Инъекции производились в утренние часы одним и тем же лицом. В экспериментах с этанолом фиксировали время потери рефлекса переворачивания и время восстановления этого рефлекса. Тестирование крыс в "открытом поле" производилось в зависимости от постановки эксперимента: в сериях с этанолом через 24 и 48 ч, в сериях с ацетальдегидом через 15 мин после введения. Регистрировались следующие элементарные поведенческие акты: локомоция- поступательное перемещение животного в горизонтальной плоскости; сидение на месте; вертикальная активность - вертикальные стойки на задних лапах; груминг (чистка, умывание), дефекация и уринация - показатели эмоционального состояния крысы.

Забой крыс производили декапитацией, после тестирования в "открытом поле".

Митохондрии мозга и печени крыс выделялись последовательным центрифугированием в 0,25 М растворе сахарозы, рН 7,4, при 2500 и 15000 об/мин в рефрежераторной центрифуге (Эванс, 1990). Определение

активности альдегиддспщрохеназы производили на спектрофотометре СФ-26 по стандартной методике (Кислова и др., 1995). Активность альдепщцегидрогеназы выражали в ¡¡.Моль НАДИ /' мин на мг белка. Количество белка в пробе определялось спектрофотометрическим способом (Северин, Соловьева, 1989).

Исследование спектрофотометркческих характеристик смесей гепарина с исследуемыми веществами производилось на фотометре КФК-3 - и спектрофотометре СФ-26. Статистическая обработка результатов была проведена с применением t- критерия Стыодента на компьютере IBM 386, с использованием статистической программы "STADIA".

Результаты исследования и их обсуждение

В нашем эксперименте, внутрибрюшинное введение крысам этанола в дозе 4,5 г/кг вызывало у них сон средняя продолжительность, которого составила 94,0 ± 8,8 минут. Предварительное внутрибрюшинное введение животным гепарина в дозе 25 МЕ/кг не оказывало заметного изменения в продолжительности этанолового сна. При введении крысам гепарина в дозах 250 и 2500 МЕ/кг наблюдалось достоверное (р<0,001), в обоих случаях, уменьшение продолжительности сна вызванного внутрибрюшинным введением этанола в дозе 4,5 г/кг. Для группы гепарин 250 МЕ/кг + этанол 4,5 г/кг продолжительность сна составила 45,8 ± 3,0 мин, а для группы 2500 МЕ/кг + этанол 4,5 г/кг - 39,7 ± 4,4 мин.

Для изучения влияния гепарина на отсроченные эффекты этанола нами было проведено исследование поведенческой активности крыс в тесте "Открытое поле" через 24 часа после этанолового сна. Через сутки после этанолового сна наблюдалось снижение локомоторной активности в группе крыс, которой вводился внутрибрюшинно этанол 4,5 г/кг и повысился показатель дефекации и уринации (рис. 1). По остальным элементарным поведенческим актам достоверных отличии между группами этанол 4,5 г/кг и контрольной группой не наблюдалось

Предварительное внутрибрюшинное введение крысам гепарина в дозе 25' МЕ/кг не оказывало заметного влияния на изменение поведенческой активности животных вызванное внутрибрюшинным введением большой дозы этанола (рис. 1).

""' В группах крыс, которым этанол в дозе 4,5 г/кг вводился на фоне 250 МЕ/кг и 2500 МЕ/кг гепарина, наблюдалась более высокая локомоторная активность по сравнению с группой, которой вводился только этанол. По сравнению с контрольной группой локомоторная активность животных, которым этанол вводился на фоне гепарина в дозах 250 и 2500 МЕ/кг, оставалась более ниже, для обоих групп (рис. 1). По ¡остальным поведенческим актам достоверных отличий между группами гепарин 250 МЕ/кг + этанол 4,5 г/кг; гепарин 2500 МЕ/кг + этанол 4,5 г/кг и группами

контроль, этанол 4.5 г/кг и гепарин 25 МЕ/кг + этанол 4,5 г/кг не наблюдалось.

Эт4.5гкг Ог4,5г*га 'Л4,5гТсг

□ Локомощи В Сцдешв на тете ЭГрумтг 0 Вертикальная В Дефзкащи.

активность \ринацня

Рис. 1. Поведенческая активность крыс в тесте "Открытое поле" через 24 часа после этанолового сна, вызванного внутрибрюшинным введением этанола в дозе 4.5 г/кг и этанола в дозе 4.5 г/кг на фоне различных доз гепарина

достоверное отличие от контрольной группы *- (р<0,05). **- (р<0.()]). ***- (р<0,001)

достоверное отличие от группы этанол 4.5 г/кг +- (р<(),05). ++-(р<0.01).+++- (р<0,001)

достоверное отличие от группы гепарин 25 МЕ/кг + этанол 4.5 г/кг о-(р<0.05), оо - (р<0,()1), ооо- (р<0.0()1)

В группе крыс, которым этанол в дозе 4,5 г/кг вводился на фоне протамин сульфата дозой 10 мг/кг продолжительность этанолового сна составила 233,6 ± 19,9 мин. что более чем в два раза выше по сравнению с показателем группы, которой вводился только этанол в дозе 4,5 г/кг. Анализ поведенческой активности, проведенный через 24 ч, показал, что у крыс, которым этанол вводился на фоне протамин сульфата (10 мг/кг). локомоторная активность была значительно ниже по сравнению с группой, которой вводился этанол в дозе 4.5 г/кг. Показатель дефекации и уринации

был выше по сравнению с группой этанол 4,5 г/кг (рис. 2). По остальным элементарным поведенческим актам достоверных отличий между гру ппами протамнн сульфат Юмг/кг + этанол 4.5г/кг. этанол 4.5 г/кг и контролем не наблюдалось.

0 Локомоция В Сидение на месте ШГруминг il Вертикальная Ш Дш|ска ция.

актнвносц, урииащщ

Рис. 2. Изменения поведенческой активности у крыс через 24 часа после внутрибрюшинного введения им этанола в дозе 4,5 г/кг и комбинированного введения протамин су льфата дозой 10 мг/кг и этанола 4.5 мг/кг

достоверное отличие от контрольной группы *- (р<0,05). **- (р<0.01). ***- (р<0,001)

достоверное отличие от группы этанол 4.5 г/кг +- (р<0,05), ++-(р<0,01), +++- (р<0,001)

Исследуя влияние экзогеного этанола на организм нельзя не обратить внимание на изменения происходящие в ферментных системах отвечающих за его биотрансформацию в организме. Многими авторами (Chroster and Szmitkouski. 1998. Murayama et al.. 1998. Itoli et al.. 1997, Shen et al.. 1997. Wall et al. 1997) отмечается, что чувствительность организма к этанолу во многом зависит от активности митохондриальной альдегиддегидрогеназы.

Исследование активности альдегиддегидрогеназы в митохондриях клеток мозга и печени крыс, через 24 ч после этанолового сна показало, что через сутки после внутрибрюшинного введения крысам этанола в дозе 4,5 г/кг у них наблюдалось снижение альдегиддегидрогеназной активности в

пссдсд\емых фракциях, по сравнению с контрольной группой (рис. 3). Предварительное введение крысам гепарина в дох 250 и 2500 МЕ/кг лриводпло к сохранению более высоких значении альдепгддепшрогеназнон активности в митохондриях клеток мозга и печени по сравнению с группой, которой вводился этанол.

Предварительное впутрибрюшшпюе введение гепарина в дозе 25 МЕ/'кг достоверно не увеличивало активность альдегпддегидрогеназы в митохондриях ¡слеток мозга и печени (рис. 3)

Эт-ЧЛ-т-л- 1 кг т-Ьг кг

О Митохондрии мотга □ Митохондрии пенсии

Рис. 3. Активность альдегпддегидрогеназы (нМоль НАДН / мин на мг белка) в митохондриях клеток мозга и печени крыс через 24 ч после внутрибрюшинного введения этанола 4,5г/кг, этанола 4,5 г/кг на фоне различных доз гепарина и этанола 4,5 г/кг на фоне протамнн сульфата дозой 10 мг/кг

достоверное отличие от контрольной группы *- (р<0.05). **- (р<0,01), ***- (р<(),001)

достоверное отличие от группы этанол 4.5 г/кг +- (р<0,05), ++-(р<0,01), +++- (р<0,001)

достоверное отличие от группы гепарин 25 МЕ/кг + этанол 4,5 г/кг о-(р<0,05), оо- (р<0,01), ооо- (р<0,001)

Таким образом, внутрибрюшинное введение крысам этанола в дозе 4,5 г/кг снижает их поведенческую активность и активность льдегиддегидрогеназы в митохондриях клеток мозга и печени.

Предварительное введение гепарина в дозе 250 и 2500 ME/кг частично снимает этот эффект, доза гепарина 25 ME/кг в данных условиях не эффекгивна.

Предварительное внутрибрюшинное введение протамин су льфата в дозе 10 мг/кг усиливает токсический эффект этанола, снижая поведенческую активность и активность адьдегиддегидрогеназы в митохондриях клеток мозга и печени. В связи с тем, что увеличение дозы гепарина с 250 ME/кг до 2500 ME/кг не даст каких-либо значимых результатов в дальнейших экспериментах мы использовали дозу гепарина 250 МЕ/кг.

Для исследования продолжительности эффектов вызванных внутрибрюшинным введением крысам этанола в дозе 4,5 г/кг и совместного введения гепарина в дозе 250 ME/кг с этанолом дозой 4,5 г/кг, а также совместного введения протамин сульфата в дозе 10 мг/кг с этанолом дозой 4,5 г/кг, мы провели тестирование животных в "открытом поле" и исследование альдегиддегидрогеназной активности в мигохондиальной фракции клеток мозга и печени через 48 часов после этанолового сна.

Данные по элементарным поведенческим актам и альдегиддегидрогеназной активности в митохондиальной фракции клеток мозга и печени, полученные в группах крыс, которым вводился этанол в дозе 4,5 г/кг и этанол 4,5 г/кг на фоне 250 ME/кг гепарина, через 48 часов, достоверно не отличались от данных контрольной группы.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что продолжительность эффектов виутрибрюшишюго введения этанола в дозе 4,5 г/кг длятся не более 48 часов. Предпринятое нами исследование поведенческой активности крыс в "открытом поле" и активности альдегиддегидрогеназы в митохондриях клеток мозга и печени через двое суток после совместного введения им протамин сульфата (10 мг/кг) с этанолом (4,5 г/кг) показало, что у животных данной группы к 48 часам наблюдалось восстановление поведенческой активности. Однако показатель активности альдегиддегидрогеназы в митохондриях клеток мозга составил 40,8±2,2, что достоверно (р< 0,05) ниже по сравнению с контрольной группой, а в митохондриях клеток печени - 106,8+4,8, что также достоверно (р<0,001) ниже по сравнению с контролем.

В предыдущих опытах мы показали, что гепарин способен устранять эффекты экзогенного этанола. Но, по мнению многих авторов (Тулий, Мельничук, 1995, Зиматкин, 1995, Wachtel et. al., 1998), сам по себе этанол не обладает токсическим действием, данный эффект обуславливается ацетальдегидом, который образуется из этанола в процессе его биотрансформации в организме. В связи с вышеизложенными фактами мы посчитали важным исследовать непосредственное влияние внутрибрюшинного введения ацетальдегида на поведенческую активность

крыс б "открытом поле" и на изменение альдегиддегидрогеназной активности в мнто.хондриальной фракции клеток мозга и пенсии у крыс. Исходя из того, что ацетальдегид является сильно токсичным веществом мы вводили его крысам в дозе 0,1 мг/кг внутрибрюшинно, так как эта доза является минимальной, при которой ацетальдегид обнаруживается в мозге крыс (Островский и др., 1988). Ацетальдегид вводился животным внутрибрюшинно за 15 минут до тестирования в "открытом поле".

Внутрибрюшинкое введение крысам 0.1 мг/кг ацетальдегида резко снижало общую поведенческую активность крыс (рис. 4). Предварительное внутрибрюшинное введение животным гепарина дозой 250 МЕ/кг увеличивало их общую поведенческую активность по сравнению с группой, которой вводился ацетальдегвд в дозе 0.1 мг/кг (рис. 4). При введении животным ацетальдегида 0,1 мг/кг на фоне протамин су льфата дозой 10 мг/кг наблюдается еще большее снижение общей поведенческой активности крыс, даже по сравнению с группой, которой вводился ацетальдегид (рис.4 ).

| Ац.А0,1мгЛсг AiiA0,1mtKt

t___________________________________________________________________________________________

О Локомоция □ Сидение на ncctc ОГрумииг 0 Вертикальная □ Дефекация,

активность урина тшя

Рис. 4. Изменения поведенческой активности у крыс после внутрибрюшинного введения им ацетальдегида в дозе 0,1 мг/кг и комбинированного введения гепарина 250 МЕ/кг и ацетальдегида 0,1 мг/кг достоверное отличие от контрольной группы *- (р<0.05). **- (р<0.0П. ***- (р<0.001)

достоверное отличие от группы ацетальдегид 0,1 мг/кг +- (р<0.05). ++-(р<0.()1).+++- (р<0,001).

Внутрнбрюшинное введение крысам 0.1 мг/кг ацетальдегида также вызывало у крыс и снижение активности альдегиддегидрогеназы в митохондриях и клеток мозга и печени. Предварительное введение гепарина в дозе 250 МЕ/кг снимало данный эффект (рис. 5). а предварительное введение протамин сульфата в дозе 10 мг/кг еще более усиливало его (рис. 5).

160У

Кипроль .-\iiUMTW 1«1250МЬн~Л1Д1 11рС10м ю'- А1Ш м1Кг

м: | .г

О Мшохс» ирии мга а ОМигоховдршшчии

Рис. 5. Активность альдегиддегидрогеназы (нМоль НАДН / мин на мг белка) в митохондриях клеток мозга и печени крыс после внутрибрюшинного введения ацетальдегида дозой: 0,1 .мг/кг, ацетальдегида дозой 0,1 мг/кг на фоне гепарина дозой 250 МЕ/кг "и" ацетальдегида дозой 0.1 мг/кг на фоне протамин сульфата в дозе 10 мг/кг

достоверное отличие от контрольной группы *- (р<0.05). **- (р<0.()1). ***- (р<0.001)

достоверное отличие от группы ацетальдегид 0,1 мг/кг +- (р<0.05). ++-(р<0,0(). +++- (р<0.001)

Способность гепарина взаимодействовать с различными высоко- и низкомолекулярными веществами отмечена во многих работах посвященных этом}' гликозаминогликану (Хомутов н др.. 1998. Бакаринов. 1998. Алекперов. Алиев. 1987, Никандров и др.. 1987. Хомутов. 1987. Кудряшов и

р 1980. Ерзинкян и др.. 1974). Именно данное свойство определяет его биологическую активность, которая весьма широка (Ляпина. Алиева. 1989).

Для того чтобы определить возможность взаимодействия гепарина с этанолом и аистальдегидом. нами было проведено исследование смеси гепарин - этанол. а также гепарин - ацетальдегид на фотоэлсктроколорпметрс. при длине волны 400 им. К 1 мл этанола (96%) добавляли возрастающие дозы стандартного раствора гепарина (в 1 мл 5000 МЕ). При добавлении к 1 мл 96% этанола 50 МЕ гепарина мы не наблюдали изменения оптической плотности смеси, ее заметное увеличение наблюдается при концентрации гепарина 1000 МЕ Далее при увеличении концентрации гепарина с 1000 МЕ до 5500 МЕ оптическая плотность раствора постепенно увеличивается. При дальнейшем увеличении концентрации гепарина в смеси с 6000 МЕ до 8000 МЕ наблюдалось уменьшение оптической плотности смеси гепарин-этанол (рис. 6). Подобный же эффект наблюдался при взаимодействии гепарина с некоторыми зоотоксинами (Хомутов. 1985).

На следующем этапе на эксперимента было проведено исследование изменения оптической плотности смеси гепарин-аиетальдегид. К I мл 100% ацетальдегида мы добавляли стандартный раствор гепарина (в 1 мл 5000 МЕ). Увеличение оптической плотности смеси генаркн-ацетальдегид наблюдалось у же при концентрации гепарина 50 МЕ (рис. 7).

Концентрация ( спзрнна'./М} р растисре

Рис. 6. Изменение светопоглощсния смеси гепарин-этанол при увеличении концентрации гепарина

С увеличением концентрации гепарина с 50 до 500 МЕ, наблюдалось постепенное ее увеличение. Максимального значения она достигла при 500. Далее с увеличением концентрации гепарина с 500 МЕ до 2000 МЕ наблюдалось уменьшение оптической плотности раствора (рис. 7). Таким образом, взаимодействие гепарина с ацетальдегидом происходит гораздо интенсивнее, чем с этанолом. Так резкое увеличение оптической плотности смеси гепарин-ацетальдегид наблюдалось уже при концентрации гепарина 50 МЕ, максимальной величины оптическая плотность смеси гепарина с ацетальдегидом достигает при концентрации гепарина 500 МЕ, что на порядок ниже по сравнению со смесью гепарин-этанол.

Концешрация гепарина (\1Е) в растворе

Рис. 7. Изменение свстопоглощения смеси гепарин-этанол при увеличении концентрации гепарина

Используя, в опытах по определению изменения оптической плотности, большие концентрации этанола и ацет альдегида мы показали возможность комплексообразования данных соединений с гепарином. Но в экспериментах т упо мы использовали гораздо меньшие концентрации данных веществ. Поэтому далее мы провели ряд опытов по определению спектрофотометрических характеристик растворов гепарина с этанолом и ацетальдегидом, где данные вещества брались в гораздо меньших концентрациях.

При исследовании спекгрофотометрической характеристики смеси гепарина и этанола нами были обнаружены незначительные изменения в УФ-области спектра (рис. 8).

""■""■'■■"Г'еплрш I

--- Этанол

......ГешЭт 10 мин

----I'entOi 30 мии

----Геп+Эг 60 мин

Рис. 8. Изменение спектра поглощения гепарина при совместном инкубировании его с этанолом при 37 °С

Исследования спектрофотометрических свойств смеси гепарин-ацетальдегид показало, что после 10 минутной инкубации смеси при температуре 37 °С, ощутимых изменений в светопоглощении раствора практически не наблюдалось.

После 30 минут инкубации изменения спектрофотометрических свойств в смеси также были незначительны, но после совместного 60 минутного инку бирования гепарина (0,1 мл стандартного раствора) и ацетальдегида (0,1 мл 10% раствора) при 37°С, мы наблюдали сильное изменение в спектрофотометрических характеристиках смеси гепарин-ацетальдегид (рис. 9). Резкое изменение спектра светопоглощения смеси гепарин-ацетальдегид, после 60 минутного инкубирования при 37°С говорит о возможности взаимодействия гепарина с ацетальдегидом (Никандров и др., 1987).

Подводя итоги физико-химическим исследованиям свойств смеси гепарин-этанол и гепарин-ацетальдегид, можно сказать, что гепарин гораздо активнее взаимодействует с ацетальдегидом, чем с этанолом.

Рис. 9. Изменение спектра поглощения гепарина при совместном инкубировании его с этанолом при 37 °С

Следующим' этапом наших экспериментов явилось исследование влияния смеси гепарнн-ацетальдегид на поведенческую активность крыс в "открытом поле" и альдегиддегидрогеназную активность митохондрий клеток мозга и печени. Крысам внутрибрюшинно вводилась смесь гепарин-ацстальдегид. Гепарин и ацетальдегид брались из расчета 250 МЕ/кг гепарина и 0.1 мг/кг ацетальдегида. Смесь инкубировалась в течении 60 минут при 37 °С. после чего вводилась животным.

В холе эксперимента нами были получены следующие результаты: в группе крыс, которым вводилась смесь гепарин-ацетальдегнд наблюдалось увеличение локомоторной активности, вертикальной активности, увеличение груминга по сравнению с группой аиетальдегид 0.1 мг/кг. Кроме того локомоторная активность крыс, вертикальная активность и груминг в группе крыс, которым вводилась смесь гепарин-ацетальдегнд. была также выше по сравнению с группой крыс, которой вводился ацетальдепи в дозе 0.1 мг/кг на фоне гепарина дозой 250 МЕ/кг (рис. 10).

I 1

ОЛокочиия : ОСюрввт \сстс ОГрумпг ИВерткачьтя О Делегация.

акпг.нехчь уришния

Рис. 10. Изменения поведенческой активности у крыс после внутрнбрюшинного введения им ацетальдепца в дозе 0.1 мг/кг, введения ацетальдегида 0.1 мг/кг на фоне гепарина 250 МЕ/кг и смеси гепарина с ацетальдегидом после 60 минутной инку бации при 37 °С

достоверное отличие от контрольной группы *- (р< 0.05). **- (р< 0.01). ***- (р< 0.001)

достоверное отличие от группы ацетальдегнд 0,1 мг/кг +- (р< 0,05), ++-(р<0.()|), +++- (р< 0.001).

достоверное отличие от группы гепарин 250 МЕ/кг + аиетальдегид 0.1 мг/кг о- (р< 0.05). оо- (р<0.01). ооо- (р< 0,001)

Исследование альдегиддегвдрогеназной активности в митохондриях и цитоплазме клеток мозга и печени у крыс, которым вводилась смесь гепарин-ацетальдегид. показало что во всех исследуемых фракциях она была достоверно выше по сравнению с группой, которой вводился ацетальдегнд и достоверно не отличалась от данных контрольной группы (рис. 11).

Контроль

АцЛОДмгкг

I "егС50Л Е'кг+ АиЛО. 1 ОяссьГеп-АцЛ Ml кг

В Мигохогариимвга □ Мшшэвдрииткчаи.

Рис. 11. Активность альдегиддегидрогеназы (нМоль НАДН / мин на мг белка) в митохондриях и цитоплазме клеток мозга и печени крыс после внутрибрюшинного введения ацетальдегида дозой 0,1 мг/кг, ацетальдегида дозой 0,1 мг/кг на фоне гепарина дозой 250 МЕ/кг и смеси гепарина с ацетальдегидом после 60 минутной инку бации при 37 °С

достоверное отличие от контрольной группы *- (р< 0,05), **- (р< 0,01), ***- (р< 0,001)

достоверное отличие от группы ацетальдегид 0,1 мг/кг +- (р< 0,05), ++-(р<0,01), +++- (р< 0,001).

достоверное отличие от группы гепарин 250 МЕ/кг + ацетальдегид 0,1 мг/кг о- (р< 0,05), оо- (р<0,01), ооо- (р< 0,001)

Таким образом, совместное инкубирование гепарина с ацетальдегидом еще более эффективно устраняет токсическое действие ацетальдегида. даже по сравнению с предварительным введением экзогенного гепарина.

Выводы

1. В экспериментах на крысах показано, что гепарин оказывает влияние на продолжительность этанолового сна, вызванного внутрибрюшинным введением этанола в дозе 4,5 г/кг. Выявлено снижение его продолжительности, у животных, которым предварительно вводился гепарин в дозе 250 и 2500 МЕ/кг.

2. Показано, что через 24 часа «осле внутрибрюшшшого введения этанола, в дозе 4,5 г/кг, у крыс наблюдается снижение поведенческой активности и активности альдегиддегидрогеназы митохондриальной фракции мозга, и печени. Показано, что данные эффекты длятся не более 48 часов.

3. Предварительное введение животным гепарина в дозе 250 и 2500 МЕ/кг частично снимает эффекты внутрибрюшшшого введения этанола в дозе 4,5 г/кг выражающиеся в снижении поведенческой активности животных в "открытом поле" и активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной фракции клеток мозга и печени.

4. Предварительное связывание эндогенного гепарина протамин сульфатом дозой 10 мг/кг приводит к увеличению продолжительности этанолового сна, и еще большему угнетению поведенческой активности и альдегиддепщрогеназной активности в митохондриальной фракции клеток мозга и печени.

5. Внутрибрюшиниое введение крысам ацетальдегида в дозе 0,1 мг/кг приводит к резкому снижению поведенческой активности и падению альдегиддегидрогеназной активности в митохондриальной фракции клеток мозга и печени.

6. Предварительное введение гепарина в дозе 250 МЕ/кг частично снижает токсический эффект внутрибрюшшшого введения ацетальдегида, что выражается в увеличении поведенческой активности животных и возрастании альдегиддегидрогеназной активности в исследуемых субклеточных фракциях.

7. Предварительное внутрибрюшиниое введение крысам протамин сульфата в дозе 10 мг/кг усиливает токсический эффект ацетальдегида. Это приводит к еще большему угнетению поведенческой активности и активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной фракциях клеток мозга и печени.

8. При взаимодействии гепарина с этанолом и ацетальдегидом наблюдается увеличение оптической плотности раствора. Причем ацетальдегид взаимодействует с гепарином в концентрации на порядок ниже, чем этанол.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бакаринов П.В. Влияние гепарина и протамн сульфата на продолжительность этанолового сна и поведенческую активность крыс //

Структура и регуляция биосистем: Сборник работ молодых ученых биологического факультета ННГУ (Труды биологического факультета Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. Вып.2) - Нижний Новгород - 1999. - С. 126 - 128.

2. Бакаринов П.В. Модифицирующее действие гепарина на продолжительность этанолового сна // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов". Выпуск 3. - М.: Изд-во МГУ. - 1999. - С. 9.

3. Бакаринов П.В. Модификация гепарином токсического действия ацетальдегвда // Материалы IV Пущинской конференции молодых ученых. -Пущино. - 1999. - С. 5.

4. Бакаринов П.В., Хомутов А.Е., Зимин Ю.В., Козин Д.В. Влияние экзогишого гепарина на физическое состояние крыс через сутки после этанолового сна // Материалы III Всероссийского симпозиума "Физиологические механизмы природных адаптаций" - Иваново. - 1999 - С. 56.

5. Бакаринов П.В. Торможение гепарином седативного действиядроперидола // Регуляция и управление в биосистемах: Сборник работ молодых ученых биологического факультета ННГУ (Труды биологического факультета Нижегородского государственного у ниверситета им. Н.И. Лобачевского. Вып.1) - Нижний Новгород - 1998. - С. 59 - 60.

6. Бакаринов П.В. Влияние дипептида Gly-Gly на поведение в открытом поле коротко- и долгоспящих крыс // Третья Нижегородская сессия молодых ученых. Сборник тезисов докладов. - Нижний Новгород - 1998. - С. 197.

7. .Зимин Ю.В., Бакаринов П.В., Баландина М.В. Регуляторный механизм действия пептидов на митохондриальные ферменты // Химия для медицины и ветеринарии: Сб. науч. трудов - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998.-С. 142 -143.

8. Хомутов А.Е., Зимин Ю.В., Бакаринов П.В. Механизм влияния гепарина на гиподинамию кроликов, вызванную дроперидолом // Химия для медицины и ветеринарии: Сб. науч. трудов - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - С. 203 -205.

9. Зимин Ю.В., Баландина М.В., Бакаринов П.В. Пептидная модуляция мигохондриальных ферментов мозга в условиях гипоксии // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Материалы Всероссийской конференции. -М.: БЭБиМ. - 1997. - С. 44-45.

10. Bacarinov P. V., Homutov А.Е. A Remedy against Stings // XXXVI-th Apimondialntemational Apicultural Congress. Vancouver, Canada. September 12-18, 1999. -Bucharest: Apimondia, 1999 - в печати

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл.печ. л. 1. Тир. 100 экз.

ЗАО «Инфо». г. Саровул. Московская, 17

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бакаринов, Павел Викторович

Обзор литературы

Глава 1. Химический состав и физиологическое действие гепарина

Глава 2. Физиологические свойства этанола

Собственные исследования

Глава 3. Материалы и методы

3.1. Этаноловый сон

3.2. Открытое поле

3.3. Метод выделения митохондрий

3.4. Определение активности альдегиддегидрогеназы

3.5. Спектрофотометрический метод определения количества белка

3.6. Исследование оптических свойств смеси гепарина с этанолом и ацетальдегидом

3.6.1. Определение оптической плотности смеси гепарин-этанол и гепарин-ацетальдегид

3.6.2. Исследование спектра поглощения смеси гепарин-этанол и гепаринацетальдегид

Результаты исследований

Глава 4. Модифицирующее действие гепарина на время этанолового сна и отсроченные эффекты экзогенного этанола

Глава 5. Модификация гепарином изменений вызванных ацетальдегидом

Глава 6. Исследование влияния гепарина и протамин сульфата на поведенческую активность крыс в тесте "Открытое поле" и на изменение активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракции клеток мозга и печени

Глава 7. Физико-химические смеси гепарина с этанолом и ацетальдегидом

Глава 8. Исследование физиолого-биохимических свойств смеси гепаринацетальдегид

Обсуждение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологическая характеристика защитных свойств гепарина при действии экзогенного этанола на организм"

Актуальной проблемой современной физиологии является изучение механизмов действия эндогенных биологически активных веществ, обладающих способностью повышать резистентность организма к экстремальным факторам среды. Имеющиеся в литературе сведения относительно свойств гепарина указывают на возможность его участия в физиологических механизмах защиты организма от токсических соединений. Являясь естественным антикоагулянтом, гепарин нашел широкое применение в физиологии и медицине. Однако за последнее время было показано, что он обладает широким спектром действия и играет немаловажную роль в поддержании гомеостаза организма. В настоящее время общепризнанно, что гепарин является универсальным регулятором функций организма. Показано, что он кроме антикоагуляционной активности обладает антилипеммическим (Нака1а е1 а1., 1999), цитостатическим (М^Ига-Оогиг, С^еПои 1999), бактериостатическим (Ооп й а1, 1999), радиопротективным действием (Лукашин, Софронов, 1996) действием, выявлены антиаллергический (Шее е1 а1., 1999) и гипотензивный (Ькопшюг е1 а1., 1998, БрсЦп, Буешзоп, 1990) эффекты гепарина. Одним из важных и сравнительно недавно открытых свойств гепарина явилась его способность связывать и инактивировать природные токсины, входящие в состав пчелиного яда и некоторых змеиных ядов (Хомутов и др., 1985). Кроме того, была показана его способность взаимодействовать с некоторыми фармакологическим веществами (Хомутов и др., 1998).

Цель и задачи работы. Исследования проведены с целью изучения физиологических механизмов защитного действия гепарина при действии 5 экзогеного этанола на организм экспериментальных животных.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние гепарина на продолжительность этанолового сна у крыс.

2. Исследовать изменения поведенческой активности крыс через 24 ч после этанолового сна.

3. Исследовать изменения активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток мозга и печени через 24 ч после этанолового сна.

4. Определить время восстановления поведенческой активность крыс и активности альдегиддегидрогеназы после введения животным экзогенного этанола.

5. При помощи физико-химических методов изучить возможность взаимодействия гепарина с этанолом и ацетальдегидом.

Научная новизна

В работе впервые проведено комплексное исследование защитных свойств гепарина в условиях воздействия на организм экзогенного этанола. Установлено, что гепарин способен снижать продолжительность сна вызванного внутрибрюшинным введением этанола в дозе 4,5 г/кг. Изучено отсроченное влияние внутрибрюшинного введения крысам этанола в дозе 4,5 г/кг на изменение поведенческой активности животных и активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток мозга и печени. Показано, что гепарин в средних и больших дозах способен эффективно устранять негативные последствия внутрибрюшинного введения крысам этанола, а связывание протамин сульфатом эндогенного гепарина усиливает данный 6 токсический эффект. Впервые показано взаимодействие гепарина с этанолом и ацетальдегидом in vitro. Данный процесс сопровождается увеличением оптической плотности раствора, а при взаимодействии гепарина с ацетальдегидом изменяется также спектральные характеристики исследуемого раствора.

Практическая значимость работы

Разработаны основы представлений о стабилизации физиологических функций организма гепарином в условиях действия на организм экзогенного этанола. Полученные материалы расширяют и углубляют представления о физиологической роли гепарина. Практическая ценность результатов работы имеет важное значение для клинической медицины в плане понимания молекулярного механизма действия гепарина, где он широко применяется как фармакологическое средство.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов"(Москва, 1999); III Всероссийском симпозиуме "Физиологические механизмы природных адаптаций" (Иваново, 1999); Конференции "Химия для медицины и ветеринарии" (Саратов, 1998); III Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 1998).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, методик исследования, 5 глав собственных исследований и обсуждения результатов. Выводы содержат 8 основных положений. Работа содержит 23 рисунка, 14 таблиц и

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Бакаринов, Павел Викторович

Выводы

1. В экспериментах на крысах показано, что гепарин оказывает влияние на продолжительность этанолового сна, вызванного внутрибрюшинным введением этанола в дозе 4,5 г/кг. Выявлено снижение его продолжительности, у животных, которым предварительно вводился гепарин в дозе 250 и 2500 МЕ/кг.

2. Показано, что через 24 часа после внутрибрюшинного введения этанола, в дозе 4,5 г/кг, у крыс наблюдается снижение поведенческой активности и активности альдегиддегидрогеназы митохондриальной фракции мозга, и печени. Показано, что данные эффекты длятся не более 48 часов.

3. Предварительное введение животным гепарина в дозе 250 и 2500 МЕ/кг частично снимает эффекты внутрибрюшинного введения этанола в дозе 4,5 г/кг выражающиеся в снижении поведенческой активности животных в "открытом поле" и активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток мозга и печени.

4. Предварительное связывание эндогенного гепарина протамин сульфатом дозой 10 мг/кг приводит к увеличению продолжительности этанолового сна, и еще большему угнетению поведенческой активности и альдегиддегидрогеназной активности в субклеточных фракциях клеток мозга и цитозоле печени.

5. Внутрибрюшинное введение крысам ацетальдегида в дозе 0,1 мг/кг приводит к резкому снижению поведенческой активности и падению альдегиддегидрогеназной активности в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток мозга и печени.

6. Предварительное введение гепарина в дозе 250 МЕ/кг частично снижает

109 токсический эффект внутрибрюшииного введения ацетальдегида, что выражается в увеличении поведенческой активности животных и возрастании альдегиддегидрогеназной активности в исследуемых субклеточных фракциях.

7. Предварительное внутрибрюшинное введение крысам протамин сульфата в дозе 10 мг/кг усиливает токсический эффект ацетальдегида. Это приводит к еще большему угнетению поведенческой активности и активности альдегиддегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток мозга и печени.

8. При взаимодействии гепарина с этанолом и ацетальдегидом наблюдается увеличение оптической плотности раствора. Причем ацетальдегид взаимодействует с гепарином в концентрации на порядок ниже, чем этанол. но

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бакаринов, Павел Викторович, Нижний Новгород

1. Алекперов А.Ф., Алиев A.M. Комплексообразование гепарина с органическими катионами // Фармация 1987 - т. 36, № 1 - с. 80 - 85.

2. Алиев H.A. Нейроэндокринная регуляция иммуногенеза при алкоголизации // Проблемы эндокринологии. 1988. - т. 34, №2. - с. 29 - 32.

3. Анохина И.П., Иванец H.H., Дробышева В.Я. Основные достижения в области наркологии, токсикомании, алкоголизма //Вестник РАМН. 1998. - №7. - С. 29 -37.

4. Анохина И.П., Коган Б.М., Маньковская И.В., Рещикова Е.В., Станшевская A.B. Общность патогенетических механизмов алкоголизма и наркоманий и пути поиска средств для лечения этих заболеваний // Фармакология и токсикология. 1990. - т. 53, №4. - С. 4 - 9.

5. Ашмарин И.П., Ляпина JI.A., Пасторова В.Е. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейств регуляторных пептидов // Вестник РАНМ. 1996. - №6. - С. 50 - 57.

6. Башков Г.В., Калишевская Т.М., Голубева М.Г., Соловьева М.Е. Низкомолекулярные гепарины: механизм действия, фармакология и клиническое применение // Эксперим. и клин, фармакол. 1993. - т.56, №4. - С.11166 76.

7. Беляев H.A., Петриченко О.Б. Влияние диазепама на специфическоелсвязывание Н (D-Ala-2, D-Лейо)- энкефалина мембранами стриатума крыс // Фармакология и токсикология 1988 - № 1 - С. 18-21.

8. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина. - 1983. -749 с.

9. Борисенко С.А., Толмачева Н.С., Ходорова H.A. Проницаемость гематоэнцефалического барьера для некоторых нейромедиаторов при алкогольной интоксикации / Фармакология экспериментального алкоголизма. -М. 1982. - С. 80 - 94.

10. Бородкин Ю.С., Усатенко М.С. Белки головного мозга при алкоголизме / Фармакология экспериментального алкоголизма. М. - 1982. - С. 74 - 79.

11. Буров Ю.В., Ведерникова H.H. Нейрохимия и физиология алкоголизма. М.: Медицина. -1985. - 232 с.

12. Бычков С.М. Новые данные о гепарине // Вопр. мед. химии. 1981. - т. 27, вып. 6. - С. 726 - 736.

13. Власова Т.И., Каменнский A.A., Ашмарин И.П. Влияние энкефалинов на двигательную активность и поведение крыс в условиях "открытого поля" // Журн. высш. нервной деятельности им И.П. Павлова 1983 - т. 33, вып. 6 - С.1121079- 1083.

14. Громов Л.А. Нейропептиды. 1992. - Киев: Здоров'я. - 248 с.

15. Езинкян К.Л., Розенфельд М.А., Тер-Маркарян А.Г., Пирузян Л.А., Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Спектрофотометрические исследования реакции комплексообразования фибриногена с антикоагулянтом гепарином (КФГ) // Изв. АН СССР 1974 - №6 - С. 920 - 924.

16. Жуков В.Н. (5- карболины при алкоголизме / Фармакология экспериментального алкоголизма. М. - 1982. - с. 60 - 73.

17. Зайцев C.B., Ярыгин К.Н., Варфоломеев С.Д. Наркомания. Нейропептид -морфиновые рецепторы. М.: Изд-во МГУ. - 1993. - 256 с.

18. Зиматкин С.М. Структурные изменения в коре мозга крыс, вызываемые алкоголем в сочетании с ингибиторами альдегиддегидрогеназы // Арх. анат., гистологии и эмбриологии 1989. - т.97., №3. - С. 13-20.

19. Зиматкин С.М. Метаболизм этанола в мозге // Нейрохимия 1995. - т. 12, вып. 1.-С. 19-26.113

20. Исаева И.В., Ковалева C.B., Патрики Е.В., Сеничева H.A., Плетень А.П., Прохоров Б.С., Плохой В.И. Физико-химические свойства и антигепариновая активность протаминов лососевых и осетровых рыб // Химикофармакоцевтический журнал 1989 - №6 - с. 686 - 691.

21. Карпова И.В. Влияние этанола на двигательную активность крыс и на содержание ГАМК, дофамина, его метаболитов в нигро-стриатной системе // Журн. высш. нервной деятельности им И.П. Павлова 1992 - т. 42, вып. 5 - С. 1027- 1030.

22. Кислова О.В., Виноградова Е.Г., Пхакадзе Г.А. Сравнительная характеристика мембранных форм альдегиддегидрогеназы // Укр. биохим. журнал 1995 - т. 67, № 6 - С. 38 - 45.

23. Кондрашевская М.В., Ляпина Л.А. Тромболитический и антитромбический эффекты комплексного соединения низкомолекулярного гепарина с серотонином // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1996 -т. 122, № 11 - С. 530 - 532.

24. Коханенко Э.М. Изучение участия пептидэргической и эндогенной опиатной системы в патогенезе ранних прроявлений алкогольного абстинентного синдрома // Проблемы эндокринологии 1988 - т.34, №2 - С. 24 - 29.

25. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Образование комплекса гепарина с кальцием // Вопросы мед. химии 1987 - т.28, № 5 - С. 112 - 115.

26. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Азиева Л.Д. Комплексное соединение гепарина с гистамином, его физико- химические и биологические свойства // Вопросы мед. химии 1987 - т.36, вып. 4 - С. 55 - 57.

27. Кудряшов Б.А., Шапиро Ф.Б., Ульянова A.M. Гормональная регуляция114клиренса гепарина при иммобилизационном стрессе у крыс // Проблемы эндокринологии 1980 - т.26, №5 - С. 59 - 62.

28. Кудряшов Б.А, Шапиро Ф.Б, Ульянова A.M. Гормональная обусловленность клиренса гепарина при иммобилизационном стрессе у крыс // Физиологический журнал СССР им. Сеченова. 1982 - т. 68, №11. - С. 11 - 16.

29. Кулагин Д.А, Федоров В.К. Исследование эмоциональности у крыс линий Вистар и Крушинского-Молдкиной методом "открытого поля" / Генетика поведения / От. ред. В.К. Федоров. Л.: Наука.- 1969. С. 35 - 42.

30. Лазаренко Н.С, Петров Е.С, Забродин И.Ю, Вартанян Г.А. Вероятностные характеристики поведения крыс в условиях "открытого поля" // Журн. высш. нервной деятельности им И.П. Павлова 1982 - т. 32, вып. 6 - С. 1096 - 1102.

31. Линдрос К.О, Синклер P.A. Альдегиддегидрогеназа мозга и ее возможное участие в патогенезе алкоголизма / Фармакология экспериментального алкоголизма. М. - 1982. - с. 54 - 58.

32. Лиопо A.B. Анализ свободного поведения у крыс с различным предпочтением и потреблением этанола / Медико- биологические и социальные аспекты наркологии. -М.: 1997. С. 51 - 57.

33. Лукашин Б.П. Роль гепарина в повышении неспецифической резистентности организма // Патофизиология и экспериментальная терапия 1982 - №5 - С. 81 -87.

34. Лукашин Б.П, Софронов Г.А. Радиозащитное действие цистамина и гепарина в опытах на мышах с различной резистентностью // Бюл.эксперим. биол. и мед. 1996 -т. 121, № 5 - С. 544 - 546.115

35. Ляпина Л.А. Физиологические функции гепарина // Успехи современной биологии. т. 103, вып. 1. - С. 66 - 80.

36. Ляпина Л.А., Азиева Л.Д. Ингибиторы гепарина и их физиологическое действие // Успехи современной биологии 1989 - т. 109, в.2 - с. 224 - 237.

37. Майский А.И., Ведерникова H.H., Чистяков В.В., Лакин В.В. Биологические аспекты наркоманий. 1982. - М.: Медицина. - 256 с.

38. Метаболические предпосылки и последствия потребления алкоголя/ Ю.М. Островский, В.И. Сатановская, С.Ю. Островский, М.И. Селевич, В.В. Лелевич. Мн.: Наука и техника.- 1988. - 263 с.

39. Нейрохимия / Под. ред. акад. И.П. Ашмарина и проф. П.В. Стукалова. М.: Изд. Ин-та биомед. химии РАНМ. - 1996. - 470 с.

40. Никандров В.Н., Вотяков В.И., Наумович С.А., Воробьева Г.В., Цыманович С.Г., Янковская Г.С. Исследование образования комплексов стрептокиназы и гепарина и их свойств // Вопросы мед. химии 1987 - т.ЗЗ, № 2 - С. 54 - 58.

41. Островский Ю.С., Горенштейн Б.И., Доста Г.А., Караедова Л.М., Нефедов Л.И. Свободные аминокислоты печени и особенности обмена аминокислот печени и мозга при введении циамида крысам // Фармакология и токсикология. -1990. т.53, №4. - с. 63 - 65.116

42. Островский Ю.М., Островский С.Ю. Аминокислоты в патогенезе, диагностике и лечении алкоголизма Минск: Навука i тэхтка. - 1995. - 280 с.

43. Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н. Биологический компонент в генезисе алкоголизма. Минск. - 1986. - 95 с.

44. Практикум по биохимии / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. М.: Изд-во МГУ, - 1989.- 509 с.

45. Рахимова М.М., Горбатая О.Н., Пенькова Л.П. Изменение фосфолипидного состава мембран митохондрий печени крыс при введении им этанола // Вопр. мед. химии. 1987. - т. 33, №2. - С. 417 - 422.

46. Сатановская В.И. Система обмена этанола и ацетальдегида печени крыс при развитии толерантности к этанолу // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1990 - т. 109, №2-С. 161 - 162.

47. Титов В.Н., Пицин Д.Г. О патогенезе гиперлипопротеидемии у крыс после введения этанола // Вопр. мед. химии. 1972. - т.24, №2. - с. 244 - 252.

48. Умарова Б.А., Шапиро Ф.Б., Струкова С.М. Участие гепарина тучных клетокв физиологических реакциях организма // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1994. - №3. - С. 18 - 24.

49. Умарова Б.А., Шапиро Ф.Б., Коган А.Е., Кулиева С.В., Струкова С.М. Участие тромбина в активации секреции гепарина тучными клетками при иммобилизационном стрессе у крыс // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1997 - т. 123, №2 -С. 143 - 145.

50. Хомутов А.Е. К вопросу о влиянии гепарина на течение эфирного наркоза / Сборник научных работ по реаниматологии (экспериментальные исследования) Саранск: Изд-во Саранск, ун-та, 1976. - С. 72 - 73.

51. Хомутов А.Е. Об участии эндогенного гепарина в детоксикации пчелиного яда / Механизмы действия зоотоксинов. Межвузовский сборник. Горький: Изд. ГГУ. - 1980. - С. 48 - 54.

52. Хомутов А.Е., Зимин Ю.В., Бакаринов П.В. Механизм влияния гепарина на гиподинамию кроликов, вызванную дроперидолом // Химия для медицины и ветеринарии: Сб. науч. трудов Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - С. 203 -205.

53. Хомутов А.Е., Орлов Б.Н. Физиологическая роль гепарина. Горький. - 1987. -11 с.

54. Хомутов А.Е., Ягин В.В., Некрасова JI.A. Физиологическая роль гепарина в условиях действия на организм зоотоксинов. / Механизмы действия зоотоксинов. Межвузовский сборник. Горький: Изд. ГГУ. - 1985. - С. 35 - 42.

55. Шапиро Ф.Б., Никитина М.М., Ульянов A.M., Кудряшов Б.А. Участие гепарина в реализации действия некоторых белковых гормонов // Проблемы эндокринологии. 1986. - т. 32, №6. - С. 62 - 65.118

56. Шапиро Ф.Б., Умарова, Б.А., Струкова С.М. Роль адренокортикотропного гормона в активации секреции гепарина тучными клетками при стрессорных воздействиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1995 - т. 70, № 10 - С. 349 - 351.

57. Шапиро Ф.Б., Умарова Б.А., Дугин Т.Н., Струкова С.М. Влияние экзогенного гепарина на секреторный статус тучных клеток крысы при иммобилизационном стрессе // Физиологический журнал. 1991 - т. 37., №5 - С. 11-16.

58. Шурин С.П., Мелешин С.В., Григорьев Ю.А. Некоторые данные о механизме регуляции гепаринового обмена / Вопросы физиологии и патологии гепарина. -Новосибирск. 1965. - С. 44 - 51.

59. Шушпанова Т.В. Свойства бензодиазепиновых рецепторов коры головного мозга крыс с разной степенью предпочтения к этанолу // Журн. невропаталогии и психиатрии им. Корсакова. 1989. - т. 89, вып. 2. - с. 122 - 124.

60. Эванз У.Г. Органеллы и мембраны животной клетки // Биологические мембраны. Методы: Пер с англ./ Под ред. Дж. Б. Финдлея, У.Г. Эванса. М.: Мир,- 1990.-424с. С. 13-61.

61. Юхананов Р.Ю., Рожанец В.В., Майский А.И. Влияние этанола на концентрацию нейропептидов, АКТГ и кортикостерона на фоне иммобилизационного стресса // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1988 - т. 57, №41191. C. 455 -456.

62. Aragon C.M., Pesold C.N., Amit Z. Ethanol-induced motor activity in normal and acatalasemic mice // Alcohol. 1992. - v. 9, №3. p. 207-211.

63. Bergen A.W., Kokoszka J., Peterson R., Long J.C., Virkkunen M., Linnoila M., Goldman D. Mu opioid receptor gene variants: lack of association with alcohol dependence // Mol.Psychiatry. 1997. - v.2, №6. - P.490 - 494.

64. Berman R.F., Lee J.A., Clson K.L., Goldman M.S. Effects of naloxone on ethanol dependence in rats // Drug Aic. Depend. 1984. - v. 13, №2. - P. 245 - 254.

65. Boesch J.S., Curtis Lee C., Lindahl R.G. Constitutive expression of class 3 aldehyde dehydrogenase in cultured rat corneal epithelium // J. Biol. Chem. 1996. -v. 271, №9. -p. 5150-5157.

66. Chrostek L., Szmitkowski M. Genetic evaluation of tolerance to alcohol // Postepy. Hig. Med. Dosw. 1998. - v.52, №1. - P.35-47.

67. Devoto P., Colombo G., Stefanini E., Gessa G.L. Serotonin is reduced in the frontal cortex of Sardinian ethanol-preferring rats // Alcohol Alcohol. 1998. - v.33, №3. - P.226-229.

68. Dyck L.E. Polymorphism of a class 3 aldehyde dehydrogenase present in human saliva and in hair roots // Alcohol Clin. Exp. Res. 1995. -v. 19, №2. - P.420-426.

69. Ekman A.C., Vakkuri O., Vuolteenaho O., Leppaluoto J. Delayed proopiomelanocortin activation after ethanol intake in man // Alcohol Clin. Exp. Res. -1994. v.18, №5. - P. 1226-1229.

70. Gill K., Menez J.F., Lucas D., Deitrich R.A. Enzymatic production of acetaldehyde from ethanol in rat brain tissue // Alcohol Clin. Exp. Res. 1992. - v. 16,1205. P.910-915.

71. Hakala J.K., Oorni K., Ala-Korpela M., Kovanen P.T. Lipolytic modification of LDL by phospholipase A2 induces particle aggregation in the absence and fusion in the presence of heparin // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. - v.19, №5. -1276-1283.

72. Heikkonen E. Ylikahri R., Roine R., Valimaki M., Harkonen M., Salaspuro M. Effect of alcohol on exercise-induced changes in serum glucose and serum free fatty acids // Alcohol Clin. Exp. Res. 1998. - v.22, №2. - P. 437-443.

73. Henn C., Loffelholz K., Klein J. Stimulatory and inhibitory effects of ethanol on hippocampal acetylcholine release // Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. -1998. v.357, № 6. - P. 640-647.

74. Hricovini M., Guerrini M, Bisio A. Structure of heparin-derived tetrasaccharide complexed to the plasma protein antithrombin derived from NOEs, J-couplings and chemical shifts // Eur. J. Biochem. 1999. - v.261, №3. - P.789-801.

75. Itoh S., Matsuyama T., Kamataki T. Low activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH) in liver of Suncus murinus: possible explanation for high sensitivity to alcohol // Toxicol.Sci. 1997. - v.22, №2. - P. 111-115.

76. Jaques L.B. Physiology of heparin // Angeologie. 1985. - v. 35, №5. - P. 145 -154.121

77. Kakuta Y, Sueyoshi T, Negishi M, Pedersen L.C. Crystal structure of the sulfotransferase domain of human heparan sulfate N-deacetylase/ N-sulfotransferase //J. Biol. Chem. 1999. - v.274, №16. - P. 10673-10676.

78. Kaneko H, Mitsuma T, Nagai H, Mori S, Iyo T, Kusugami K, Tache Y. Central action of adrenomedullin to prevent ethanolinduced gastric injury through vagal pathways in rats // Am. J. Physiol. 1998. - v.274, №6. - P. 1783-1788.

79. Khatani S, Hoffman P.L, Shibuya T, Sasfsky B. Selective effects of ethanol on opiate receptor subtypes in brain // Neuropharmac. 1987. - v. 26, №6. - P. 1503 -1507.

80. Koob G.F, Roberts A.J, Schulteis G, Parsons L.H, Heyser C.J, Hyytia P, Merlo-Pich E, Weiss F. Neurocircuitry targets in ethanol reward and dependence // Alcohol Clin.Exp. Res. 1998. - v.22, №1. P.3-9.

81. Kunitoh S, Imaoka S, Hiroi T, Yabusaki Y, Monna T, Funae Y. Acetaldehyde as well as ethanol is metabolized by human CYP2E1 // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1997 v.280, №2. - P. 527 - 532.

82. Larkin J.M, Oswald B, McNiven M.A. Ethanol-induced Retention of Nascent Proteins in Rat Hepatocytes Is Accompanied by Altered Distribution of the Small GTP-binding Protein Rab2 // J. Biol. Chem. 1996. - v. 98, № 9. - p. 2146-2157.

83. Lheureux P, Fontaine J, Askenasi R. Effect of flumazenil in a model of acute122alcohol intoxication in rats // Hum. Exp. Toxicol. 1993. - v. 12, №2. - P. 177-180.

84. Litorowicz A., Laudanska H., Kostrzewska A. The effects of heparin on intrauterine arteries of the human non-pregnant uterus: The action of clinically administered heparin // Ginekol. Pol. 1998. - v.69, №10. - P. 734-739.

85. Liu J., Desai U.R., Han X.J., Toida T., Linhardt R.J. Strategy for the sequence analysis of heparin // Glycobiology. 1995. - v.5, №8. - P. 765 - 774.

86. Liu Y., Deitrich R.A. Role of GABA in the actions of ethanol in rats selectively bred for ethanol sensitivity // Pharmacol. Biochem. Behav. 1998. - v.60, № 4. - P. 793-801.

87. Madeira M.D., Paula-Barbosa M.M. Effects of alcohol on the synthesis and expression of hypothalamic peptides // Brain Res. Bull. 1999. - v.48, №1. - P. 3-22.

88. Mantle D., Falkous G., Peters T.J., Preedy V.R. Effect of ethanol and acetaldehyde on intracellular protease activities in human liver, brain and muscle tissues in vitro // Clin. Chim. Acta. 1999. - v.281, №1-2. - P. 101-108.

89. Matsumoto H., Matsubayashi K., Fukui Y. Mitochondrial ALDH polymorphism affects ethanol-derived acetate disposition in Wistar rats // Alcohol Clin. Exp. Res. -1996. v.20, №9. - P. 284-288.

90. Medvedev A.E., Kirkel A.Z., Kamyshanskaya N.S., Gorkin V.Z., Anokhina I.P. Influence of ethanol administration on the activity and compartmentation of rat liver monoamine oxidases // Alcohol Alcohol. 1995. -v. 30, № 6. - P. 729-735.

91. Mikhailov D., Linhardt R.J., Mayo K.H. NMR solution conformation of heparin-derived hexasaccharide // Biochem. J. 1997. - №.328. - P. 51-61.

92. Mikhailov D, Mayo K.H., Vlahov I.R., Toida T, Pervin A., Linhardt R.J. NMR123solution conformation of heparin-derived tetrasaccharide // Biochem. J. 1996. -№318. -P.93-102.

93. Minnick S.A., Miller S.L., Wehner J.M. The effects of acute stress on ethanol absorption in LS and SS mice // Alcohol. 1995. - v.12, №3. - P. 257-263.

94. Miquel M, Aguilar M.A., Aragon C.M. Ascorbic acid antagonizes ethanol-induced locomotor activity in the open-field // Pharmacol. Biochem. Behav. 1999. -v. 62, №2,- P. 361-366.

95. Mishra-Gorur K., Castellot J.J. Jr. Heparin rapidly and selectively regulates protein tyrosine phosphorylation in vascular smooth muscle cells // J. Cell Physiol. -1999. v. 178, №2. - P.205-215.

96. Morzorati S., Kubek M.J. Septal TRH in alcohol-naive P and NP rats and following alcohol challenge // Brain Res. Bull. 1993. - v.31, №3. - P. 301 - 304.

97. Murayama M., Matsushita S., Muramatsu T., Higuchi S. Clinical characteristics and disease course of alcoholics with inactive aldehyde dehydrogenase-2 // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1998. - v.22, №2. - P.524-527.

98. Musshoff F. Determination of biological markers for alcohol abuse // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1998. - v. 713, №1. - P. 245-264.

99. Negoro M., Hatake K., Taniguchi T., Ouchi H., Minami T., Hishida S. Liver cytosolic aldehyde dehydrogenase (ALDH1) polymorphism and its inheritance in Wistar rats // Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi. 1997. - v.32, №3. - P. 182188.

100. Paille F., Gillet C., Pirollet P. Physiopathology of acute alcoholic intoxication and alcoholic withdrawal // Rev. Prat. 1993. - v.43, №16. - P.2035-2041.

101. Porrino L.J., Williams-Hemby L., Whitlow C., Bowen C., Samson H.H. Metabolic mapping of the effects of oral alcohol self-administration in rats // Alcohol Clin. Exp. Res. 1998. - v.22, №1. - P. 176 - 182.

102. Quinlan J.J., Homanics G.E., Firestone L.L. Anesthesia sensitivity in mice that lack the beta3 subunit of the gamma-aminobutyric acid type A receptor // Anesthesiology. 1998. - v.88, №3. - P.775-780.

103. Rice K.D., Tanaka R.D., Katz B.A., Numerof R.P., Moore W.R. Inhibitors of tryptase for the treatment of mast cell-mediated diseases // Curr. Pharm. Des. 1998.- v.4, №5. P.381-396.

104. Rivier C., Rivier J., Lee S. Importance of pituitary and brain receptors for corticotrophin-releasing factor in modulating alcohol-induced ACTH secretion in the rat // Brain. Res. 1996. - v.721, №1-2. - P. 83-90.

105. Rivier C. Alcohol stimulates ACTH secretion in the rat: mechanisms of action and interactions with other stimuli // Alcohol Clin. Exp. Res. 1996. -v. 20, №2. - P. 240-254.

106. Rosenberg R.D., Shworak N.W., Liu J., Schwartz J.J., Zhang L. Heparan Sulfate Proteoglycans of the Cardiovascular System // J. Clin. Invest. 1997 - v. 99, № 9. -P.2062-2070.125

107. Seitz H.K., Csomos G. Алкоголь(спирт) и печень: ethanol метаболизм и pathomechanism алкогольной печени повреждают// Orv. Hetil. 1992. - v. 133, №50. - P. 3183-3189.

108. Shimazaki K., Tazume Т., Uji K., Tanaka M., Kumura H., Mikawa K., Shimo-Oka T. Properties of a heparin-binding peptide derived from bovine lactoferrin // J. Dairy Sci. 1998. - v.81, №11. - P.2841-2849.

109. Siapin P.J., Chen J., Flinn D.A., Alkana R.C. Antagonism of ethanol induced depression of mouse locomotor activity by hyperbaric exposure // Life Sci. -1989. v. 43, №26. -P. 2221 -2229.

110. Sjodin L., Svensson U. Vasodepressor activity of pharmaceutical formulations of heparin // Acta. Pharm. Nord. 1990. - v.2, №2. - P.89-100.

111. Szabo G., Ко vacs C.L., Telegdy Gy. Brain monoamines are involved in mediating the action of neurohypophyseal peptide hormones in ethanol tolerance // Acta, physiol. hung. 1988. - V. 71, № 3. - P. 459 - 466.

112. Tanaka M. Stress and alcohol: research with experimental animals // Nihon126

113. Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi. 1998. - v.33, №1. - P.31-43.

114. Trudeau L.E, Aragon C.M, Amit Z. Involvement of endogenous opioid mechanisms in the interaction between stress and ethanol // Psychopharmacology. -1991. v.103, №3. - P.425-429.

115. Varga K, Kunos G. Cardiovascular effects of ethanol in rats selectively bred for high or low sensitivity to the hypnotic effects of ethanol // Alcohol Clin. Exp. Res. -1997. v.21, №6. - P.1024-1029.

116. Vendemiale G, Grattagliano I, Signorile A, Altomare E. Ethanol-induced changes of intracellular thiol compartmentation and protein redox status in the rat liver: effect of tauroursodeoxycholate // J. Hepatol. 1998. - v.28, №1. - P.46-53.

117. Visioli F, Monti S, Colombo C, Galli C. Ethanol enhances cholesterol synthesis and secretion in human hepatomal cells // Alcohol. 1998. - v. 15, №4. - P.299 - 303.

118. Vives R.R, Pye D.A, Salmivirta M, Hopwood J.J, Lindahl U, Gallagher J.T. Sequence analysis of heparan sulphate and heparin oligosaccharides // Biochem. J. -1999. v.339, №3. - P.767-773.

119. Yom Dahl S, Haussinger D. Bumetanide-sensitive cell swelling mediates the inhibitory effect of ethanol on proteolysis in rat liver // Gastroenterology. 1998. -v.114, №5.-P. 1046 - 1053.

120. Wachtel E, Borochov N, Bach D, Miller I.R. The effect of ethanol on the structure of phosphatidylserine bilayers // Chem. Phys. Lipids. 1998. - v.92, №2. -P. 127-137.

121. Wall T.L, Peterson C.M, Peterson K.P, Johnson M.L, Thomasson H.R, Cole M, Ehlers C.L. Alcohol metabolism in Asian-American men with genetic127polymorphisms of aldehyde dehydrogenase // Ann. Intern. Med. 1997. - v. 127, №5. - P.376-379.

122. Wang Y., Palmer M.R., Cline E.J., Gerhardt G.A. Effects of ethanol on striatal dopamine overflow and clearance: an in vivo electrochemical study // Alcohol. -1997. v. 14, №6.-P. 593-601.

123. Widdowson P.S. The effect of neurotensin, TRH and the opioid reseptor antagonist GCJ 174984 on alcohol -induced narcosis in rats // Brain. Res. - 1987. -v.424, №2. - P. 241 -247.