Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фиеронолизин чумного микроба: биохимические и иммунохимические аспекты

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фиеронолизин чумного микроба: биохимические и иммунохимические аспекты"

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРГО-

зшщЕзшшгачгхяшй надзор России ■

Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

На. правах рукописи

ШЛАГИН Александр Ерьевнч

•тибрив?;?,еин чушзго шшроеа: бюхиыичесние

К ¡ШУВЭтаОИЕКИЗ АСПЕКТЫ. 03. ГО. 04 - биохимия

Автореферат Н2. соисканиэ ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1993

¿Ь

■ / ;

/

-"Г

Работа выполнена: в Российском С Всесоюзном) научно-исследовательском протипсчушюм институте- "Ыикроб".

Научный руководитель: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Вэйнблат Б. И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор йуляя Ю.В., доктор биологических наук, с. н. с. Щербаков А. А. -

Ведущая организация: институт Оиешшии к физиологии растения и микроорган на мое ТАН.

Автореферат разослан "3" февраля 1993 г.

Защита диссертации состоится "12" нарта 1993 г. а "13" часов на заседании специализированного совета К 074.32.01. по защите диссертаций на■соискание ученой степени кандидата наук при Российское налаю-яссл-едавателъскоы противочумном институте "Цикроб" 4410071, т. Саратов» ул. Университетская, -46).

С диссертацией иптао- (ознакомиться в научной библиотеке института "Ишфоб"..

Ученый секретарь спрциадтавра&шшгц совета :

кякдидят иедицунглих наук * (Девдариани З. Л.)

- 3 -

СЕЦАЯ ХАРЛКГЕР'/ХГПЙД РАЗОТЫ *

А;;ттсль::ость проблаки опродадястся наличием дайствухтах природных очагов чуш в СССР и. друт;;х регионах мирз, виссютл патсгекыткчесгам потенциалам возбудителя одним ¡и кэлме-

нзэ жзучап.чьсс факторов патогсшюсти ¡соторога является фнСрияо-лйзии,_ перспективна, з частности,' для-разработки ¡'.ли усозер-секстзозакая днагпссгичосщгх.преяаратоз, копструирозакня химической вакцины. Известно, что фиЗрхнолизкя чумт-к ьписрсОов обладает способность» активировать плазм-.ксгеп кроаи, з конечном итоге прлподя к лзгаксу Фибрина, лпллвдэгсся естественном барьере« для проикгаозекия патогенных микроорганизмов в кровэ-кзсксе русло ;; аангцэ органа Однако пз-за отсутствия

гьвекзочэдзата препаратов фпбринолнгягна до последнего времени остаятся нехзвссгиздх молекулярные . механизмы, определяйте слеал&нгс-скую античность фи5р:п;олкз5?на и связь его с конкретном;: суб;.;олелуллрпкм:: структурами..

С другой сторон», ".'жю'и'.еся 2 ка^ем распсрягзк;:;; £акгы, поззоллст предполагать, что фзргактатизмая и антигенная акт'.т-нссть С:'-5р;:пол'.:з:::;а салзаны ¡.ихду осСоЯ сС^гостьа молекулярных д;тор:.ц'.накт, сЗуслазлпзасллх оса зт;1 ох'о снс::стза. Зго поззо-ллет, по-з::д::маму, использовал» '4;:ор;:кол'лзин не только длл постановки диагностических тестов в реакц;;;; фибркнодлза, ко я призлеча его кзк видосг.-зчиф-лчэския констктутданцй антиген для прозед-эп::я км.^унилопгчоеккя ксслэдсзанпЛ, з частности, для ни-яс"ек".;я "р::;лгл~нм5? О'^рпнел'/.з-кна в гдчестЕЭ инди-

катора сг.зцкСпческпх антител в производстве 1:'елуиоглооул:<нон чтшшх диагностических лнкннеецэгл'нах ишуксглсбуликоз (ЭД^Т), йспо-гьгуешх з ;:нд:::сащ::{ калсулышх л безкапсугьнкх стгммов возбудителя чуны.

Вопросы локздкзгц;:;: фкЗригвэЕгакка в клэт.чэ мзЗудителя чумы, его химической природы,. разработки методов ззыделекга з очвдзнксм в::дэ изучается пршгчгсэшги ешмгнта об.чарулй;п:л фийр::::олз:т55чеексй активности. Кзагыша А. С. и Чсргсасова К. II прязодлт сведения о фиСркнокггическэй агтг.г.кост:: фтльтратов бульспньа культур чумного- ыгкроЗа. в 5слее поздних работах До-•»¡арадского Я. В. .и Ярс.'-н;: Г. А. эти факты опровергается, фкОри-нолитичаекая актзюнссть. проявляется только при налички кгзток

возбудителя. Дальнейшее изучение . фибринолитических свойств чумного микроба показало", что эта акткзность связана с внешними мембранами возбудителя. Методы выделения, применяемые для изоляции фибринолизина, также подтверждает локализацию его на внешней мембране клетки (экстракция растворами мочевины, ДСН и др.;. Однако подучить из шчэымных и других экстрактов очищенные препараты фибринолизина, используя фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию на молекулярных ситах не удалось. СкСргаолизин образовывал макромолекулярный комплекс с балкам;! внешней мембраны.

Многие авторы отмечали, что Сибринолитичаехие свойства возбудителя чумы.является хоросим дифференциально-диагностическим признаком, так как псевдотуберкулезкый микроб и У. егЛегосоНгцса не обладапг -подобной активностью.

В генетических исследованиях удалось установить, что продукция фибринолизина определяется наличием плазмиды. ответственной также за синтез плазыокоагулазы и пестицина. Утрата этой плазмиды приводит к появлению штаммов, лишенных пести-цин-фибринолизин-коагулазного комплекса, что в значительней мерс усложняет дифференциацию возбудителей чумы и дсездотубер-кулеза по этому признаку.

Отдельные данные, имеющиеся в литературе, не даот полного представления о химическом составе, молекулярной массе, устойчивости фибринолизина чумного микроба к воздействию различных химических и физических факторов, протективности этого антигена. для лабораторных животных и других свойствах атогс антигена. Нет исчерпывающих данных также о методах выделения и получения в очищенном виде вышеуказанного антигена с сохранением всех его иммунобиологических характеристик. Мэтоды, применяемые для обнаружения фибринолизина и количественной характеристики' фибринолитической активности препаратов иг клеток чумного микроба весьма трудоемки и нестандартны,.носят скорее качественный характер. Бее эти вопросы, по нашему мнению, требует дальнейшей разработки.

Дель работы. Изучить физико-химические, иммукохимичесже у. иммунобиологические свойства фибрикслигина чумных микробов. Усовершенствовать методы выделения фибринолизина и тестирования его ферментативной и антигенной активностей.

- и -

Задачи работы. Для достилэкга указанием зьшо цели з райо-тэ репалп сладук^гз задач;::

1. изучить фасторы и. условия, при которых возможна соло-билпзапкя пропаратсз фнбриколизнка без ск:сяэния его сссшкри-чсс;активности;

2. разработать или усовершенствовать способы получения фибринолизина в растворимом и очинённом виде;

3. разработать микрометод, палуколичествекного определения ф;;5р!и-:слитичоскеД а:-сг:пшости препаратов из чумных микробов, еедэрхаапх фибринол;:зин;

4. разработать микронатод полугчоличзстввнкого определения ?нт:;т«л к ¡£;:брн:юлпз1шу вегбудютлл чумы;

0. разработать мотсдику ускоренного отбора полуфабрикатов прспз:;одстза диагностического препарата "иммуноглобулины

Д!1агпс',"г!г40с!с:а чучн-'Э лгминоецкруюиие".

исаизра работы, 3 результата проведенных иссгедо-занпП лолучзпы нозиэ данные о :£иаккз-химических, иммукохими-час:сс-: и иммунобиологических свойствах препаратоз фибриколизи-ка чумный микробов и обоснована его идентичность с видсспеци-Фичоским поЕерхксстно-сс^тзСйй! актш,(Мга\г возбудителя. чумы. Разработаны метода шпглошм. и очистки ссдЕбилмаированних препаратов фпбримоггаиза, микрСметОЗД- опрбдолаяия его споцифм--ческоя активнее?:: и- активности гомогэгищтх- алгитад Сформулированы ссназн^с- принципы усьйрзк:!сга отбора полур1'хахсй дли производства "иммуноглобулинов диагнсс?:гчгс:ск • чуьаых. ляш-нескгруЕ^нх".

Гсактическчл значимость. Составлены методические рвкомен-дацг-ш по получении солюбилизироваяных я очивэнных препаратов (¿ибринолизина зсз5уд:пг5ля чуг<ы, по олрэделециз специфической активности фиоринолизина :: гомологичных антител и ¡¿икрепробах. Составлены методически рекомендации и готовятся, изменения в регламенте по ускоренному методу отбора полуфабрикатов для производства ИДЧЛ Ъйтодичэские рекомендация утверждены директором, института 'Ч&кроб" 02.07. 1332 г.

На задит.у выкосятся плздутадие основные полегания:

1. Физико-химические особенности фибринолкзкна возбудите-

б -

ля чумы и связанные с этюд; особенностями.сложности в получении из чумных микробов солюбилизированных, считанных к высокоактивных ,препаратов фибринолизина;

2. Технология получения. очищенных препаратов фибршгализи-на чумных микробов;

3. Возможности использовак:и иммунобиологических сведений о фибринолизине возбудителя чумы в производстве "иммуноглобулинов диагностических чумных. лвминесцкрук^ж".

Апробация работы. .Основные положения и вывода доложены на научных конференциях Всесоюзного Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института "Микроб" в 1957-1990 г. г., а также на Есесошном симпозиуме по препаративной хроматографии физиологически активньа веществ на полимерных сорбентах (Ленинград, 1933). Диссертация обсуждена и рекомендована к-защите на научной конференции РЕШЧИ "1!ик-роБ".

Публикации результатов ^исследования. Результаты исследования опубликованы, в 4 печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из вгеде-щш, четырех глав, заключения,, выводов и списка использованной литературы. Текст работы изложен на____ мапинолиси, иллюстрирован 15 таблицами, 13 рисунками. - Библиографический указатель содержит 168 источников отечественной и зарубежной литературы.

>Азтериалы и методы. ,Е качестве объектов исследования использовали 21 штамм чумного микроба, выделенные в природных очагах чумы: Денхргльно-Казкагского,. Дагестанского предгор-но-горкого, Закавказского высокогорного, Приараксикского, Горно-Алтайского, Средне-Азиатского; вакцинный штамм ЕУ НИИЭГ.и его вариант Ел-2 (штаммы чумного микроба различались • мелду собой по наличию плазмид рРгИ и рГга/Тох); Б штаммов возбудителя псевдот^Оеркулааа пяти серотшоЕ; 8 штаммов У. епЬегосо1уиса; ' один штамм Р.. шНооуйа; 3,диких штама кишечной палочки; штамм кишечной палочки К302 с плазмидой рЕК4 (С+,

Р1+). Шазшда рЕК4 сконструирована на основе вектора рВН322 - и содержит ген фибринолизина и коагулазы возбудителя чумы (Попов Е А., Булгакова Е. Г.) •

Дея получения небольших количеств культуры в лабораторных условиях клетки выраащвзли в - бульона Хзттингера или ■ на пластинках агара Хаттикгера при 25 - 28°С или 28-37 С в течение 18 - 26 ч.

Для получения больших объемов клеточкой массы - вырашиванне микроорганизмоз при 25 - 22"С или 36 - 37°с проводили на плотной питательной среде з аппарате /Ш22! или в жидкой питательней среде на ферментере-"Хемап" 'СЩвейцария) .при.-аэрации среды.сте-ршъкш воздухом, подкормкой, бактерий глакозой. и постоянном контроле -зп и pH культуральней ладкости. Посевным материалом служила 2-х суточная-культура ягаыыа-ЕУ линии .НИНЗГ, . выращенная на тей же среде при 28°С. Концентрация микробов ■ в среде после посева около 60,2 млрд. м. т./мл. Через'36 - 48 ч. внращи-ванкя бактериальна массу отделяли.от-питательной среды на сепараторной центрифуге непрерывного действия лри 18 ООО. об/мин на холоде и использовали для.выделения -фгСрянодизяна. Клеточную массу применяли в нативном виде или. после ее обеспложивания и высушивания. охлаяденньм ацетонем..

Услотзия культивирования- ■ штамма-Е.. coli "802 р£К4: засевали 5 мл среды LE с адаицкллином (бакто-триптон 10 г, бакхо-драгокзой;.экстракт-.- 5.г, NaGl - Юг, ампициллин - 50 мкг/мл, дистиллированная. вода,до 1 л, рК 7,5) отдельной колонией Z. coli K8Q2 рЕК4. Ibces инкубировали-а.течение дачи лри 37 С и интенсивном-зстряхквании. • 50 vais; этой культуры засевали з 5 мл бульона LS с ампициллином* инкубировали, с аэрацией при 37 С до- поздней логарифмической фазы роста (СД«0,6). 5 мл этой культура засевали з 2С0 мл прогретой до 37°С среды LB разлитой з колба объемом 1л. Инкубировали 2,3 часа .при 37 С с интенсивной аэрацией (0.1=0,4). К'культурб добавляли хлорамфени-кол до конечной* концентрации- 20. жг/мл,- продолжали.культивиро-. ванне при 37°С с интенсивным-встряхиванием. 12 - 16 ч.. После этого бульонную культуру охяаяд?лй,до..4°0. Иг отделяли клетки при.12 ООО g в течение 20 мин. Супернатант осторожно сливали и фильтровали, через целлшозные - фмьтры с~ дладагроы пор, 0,22 мкм. . В дальнейшем- культуралькув лидкость использовали, для выделения фибринолизика.. .

Препараты фибринолизика, : свободные от- водорастворимых

- В -

макромолекулярных компонентов, получали из чумних микробов итамма ЕУ линии ШЙЗГ по способу опкоанному В. К. Ьзйнблатои к соавторами (1991).

Для получение фибринолизина из периплазм*.' клеток возбудителя чумы применяли методику, описанную к. А. Кувьыиченко с соавторами (1984).

Активность плазмокоагулазц определяли по ои:з--прл-:птому методу (сб. под ред. Е И Николаева,1572). Известный пробирочки. объемньй метод определения фибринолизкна имеет качественное диагностическое значение к мало пригоден из-за своей громоздкости (сб." под ред. а К. Шкалзсзгь, 1972) длк проведения о5=ир-нух зкспрэссных многосерийных акцизов, которые широко испол!-зургся б препаративной технике получения и очистки фермэнтог, §й?Р*рков, других биополимеров обдзвзетих специфическими ак-

т!шностями.

Пластинчатый, пленочный методу определения с точки адедюя чувствительности и экономичности.. О-л&е ьфф?к-?Щ>ИЦ. ИР р скяу особенностей методов пра.-*ти-кс!и; кь позволяв ПОДУЧа» иыееце количественное еш:ч=нп:.. к сразни-

с^агзш £ постановке особоккс. при арззед&ягс: многое&К1>':-ЙМлЖШ® Б.!1, ТараЕёнкв Т. У., Коцекко О. А .

йовов Ь А., 1355, Веез1у £.0., Вп&зкег Р.. к, 1257).

Учдавггя вкгезказалное, бцли прорэденг раОо-.-а по

разработке унифицированного и -простого в исполнении полуко-ш-чествэнкогс шкрометода определения спбринслпогла, • созт-ветствуккго целям кжогосеркйкых. исследований. Еолуколпчест-Ввшш изтод Оьа .обозначен по аналогии с другими методами таг-раини препаратов (чаще всего шмукокимическими ), когорт: ссгеркзш® активного вецзства определяется-с сгиэмй ивмзре-ГО'-Я, колеблющейся в пределах ± 2 раза

В результате"проведенных исследований'был принят следующий ыикрометод' полуколичественного определенияфпЗриколкти-чзской активности.

В лунки (II - образной формы) пластин микротитратора "Та-качи" раскапывают мерной микропипеткой по 0,025 мл водного раствора содержащего 0,ЗХ хлористого кальция, 0,85?. хлористого натрия и ,0,011 мертиолата натрия (рН 7,2), тирационными петля-

- 9 - .

ли с объемом головки-0,025 ил ргститровызаот .раствори {суспензии) исследуемых препаратов (разводящая жидкость - 0.В57. раст-зор хлористого натрия с 0,012 мертколата натрия и рН 7,2), в га .те лунки вносят по 0,025 мл раствсра-(рН 7.2), содержащего 3,67. коммерческого человеческого фибриногена; 0,35« хлористого ¡атрия, О,012 мертиолата. натрия. Пластинки встряхивают,.плотно закрывают криксами и оставляют при комнатной, температуре. из £0 - 30 мин проверяет наличие сгустков фибрина, снова иотно закрывает и оставляют при комнатной температура на 18 -М ч. По истечении ере;« в лунки добавляют по 0,05 мл раствора ! 3 и сразу жэ учитывают результат. В-лунках со. сгустками фиб-зина цвет индикаторного раствора, не меняется (ждть'й или оран-«эсс-яелтый) - результат РФ отрицательный, в лунках с лизиро-¡акг.^.'. сгустком жидкость окрашивается в фиолетовый цвет (ре-¡ультат РС5 положительная;. Ш конечному разведения исследуемо-•о препарата, при котором ека отмечается положительный резуль-■ат РФ, судят о фкбринолитичэсксй активности-или титре препа-¡атз. Сопоставление титра препарата и титра контрольного стан-;арт:юга препарата фкбринолиаика позволяет судить о его весо-;ом содержании в !',сследуемом.материале.

Контроля РФ. 1 - смесь раствора N 1 и раствора N 2; : - смесь раствора N 1 и разводящего раствора; 3 - смесь раз-одяшего раствора и раствора N 2; 4 - смесь раствора N 1 с аститрованыш! контрольным стандартным раствором фибриислизина раствора !1 ?.. Контроля учитываются одновременно с исследуе-ыми препаратами.

Результаты ?0 с нормально прошедшим:: контроля?д:;- 1 - "-" исходная скраска индикаторного раствора)*, 2 - "+" (фиолетовое крашгеание); 3 - "+" (фиолетовое окрашивание); 4 - в качаль-ых лупках затем "-" (в зависимости от. титра).'

Активность препаратов фибринолизина удобнее всегс зыра-ать в единицах активности (ЕЛ) - величине, обратной титру, гнесеикой или к единице объема (ял) раствора препаратаили к з:шице массы (мг) всего препарата или массы всего содержадэ-зся з нем белка (1 ЕА/мг белка - единица удельной актиз-эсти).

Диск-Электрофорез (Па-Пез ас., 1934) проводил:! в злект-

рофоретичсском приборе для вертикального фореза в слабо (К ЕС 01 2124) фирмы LKE или в аналогичном приборе отечественногс производства. В экспериментах использовали 7,51, 1U7. и 12, е; ПААГ, толаиной 0,75, 1,0 mi.{, содергасие 0,11 доделил сульфата натрия иди без него, ь трио-глициновом буфере рН е,3. Окрашивание злекгрофореграмм осуществляли в О,:", растворе Кумасс:-R-250 в 502 трихлоруксуской кислоте с последу&цэй стмывког красител;.' ке связавшегося с велком е 77. уксусной кислоте.

Гель-хроматографии, проводит при 4 - 6еС £ термзстстируе-ыом боксе "Ынишсолдлаб" фирмы ЛКЕ-Сармалин к кемнаткой температуре (Ьмкев О., Новак JL , Прохазка 3. и др. 15Б2, Остерма:-JL А. , 1985).

В качестве хроматографических носителей применяли ультрагели А-0,5 И, А-1,5 11, сефадексы Е-100, Е-200 и другие. В качестве подвижной фазы применяли 0,85% раствор хлористого натрия с бурафосфатным буфером (рК 7,75), 2,Б Ы раствор »»-¿евин-, с 0,5*. хлористого натрил и 0,01 11 фосфатным Оуфером (рК 7,2), 0,852 раствор НаС1 с 0,01 М фосфатним Суфе-ом (рН 7,2). Ъ: всех случаях в качестве ингибитора применяли азид натрия : гонцектрацли С.02Х. Более детальке применяемы? зл&гкты описав в главе 3 данной диссертации. Регистрацию профиля злвции npi. 280 им проводили в проточном спектрофотометре "Uvicoro П" фирмы ЛКБ. Запись проф;ьия злвцки проведи^! на Б канальном сако-писце мэдел;: 2055 С ЛКБ). Сракции собирал;: на коллекторе фракций -Ultrorae П".

Проточный распределительный злектрофэрез вели на аппарате Elfor VaF-5 (fender Hobeir, GrbH,1 при слэдуи^кх режимах разделена : сила токз 120 мА, - напряжение 800 в, скорость протока 5D0 ид/ч, температура буфера 6°С~ -'перед цепольгованиэм его фильтровали через стерилизующие фильтры "Еладипор" hjj; "ШШрог" с диаметром пор 0,22 мкм на системе "Amicon" (Брск Т., 138?). Образцу препарата фибринолиакна вводили в распределительную какеру в объеме 3 мл со скоростью 2,2 мл/ч, нагрузка по белку. Оыла в пределах Z - 4 мг/шь

Ионообменную хроматографию проводили на ионообменных се-фадексах QAE А-50 к СМ. С-50 фирмы "Pharmacia" (Швеция), подготовленных по общепринятой методике (Скоупс Р., 1935). Б ка-

честзе злюеита использовали 2,5 Ц растзс?р мочевины с 0,01 М фосфатного буфера и различными концентрациями ЫаС1. Градиенты моллрности хлористого натрия применяли ступенчатыэ. В препзра-тах определяли бэлок по Лоури или методом спектрофотометрии. полисахарид р пробах с антроновым реактивом, нуклеиновые кислоты - по методу А. С. Спир1ша, липид - методом гравиметрии, аминокислотный состав - при помоги бумажной хроматографии, мо-носахаридный состав - з тонкослойной хроматографии.

В работе использовали ишуносуспэнзионные реакции (РИГА), метод иммунафлусресценцик (Зильбер Л А., 1963, Никитин Р. ¡¿,1382, Николаев Ей., 1972). решению прзщшиации з агаре по Оухтерлони, иммукоферментные реакции, метод торможения реакции иммунофлюореецэяции препаратами ШЕА' (Тиненко М. ¡1). ^строчный кммунозлектрофорез осуществляли з планочном геле. Для постановки реакция использовали стандартны« коммерчесгае препараты и реактивы, иммупосуспэнзиоаныэ диагностикумы, агг-люггинирутсиаэ антисыворотки я выделений из них иммуноглобулины, бактериальные адсорбенты гетерогенных антител (микробные клетки возбудителя псевдатубергсулаза, кшеечной группы микроорганизмов и т. д.), изготовленные в лабораториях РНИПЧй "Микроб".

Для постановки реакции иммунодиффузии (РИД) использовали IX агар "Дифко", приготовленный на 0,155 М аабуферрнком растворе МаС1 СРН 7,2). Растворы АТ и АГ вносили- в дунки диаметром 5 - 6 мм, распололинные на расстоянии 4 - 5 ш друг от друга. Посла нанесения зсех компонентов чзгки цомецали в эксикатор С влажная камера) при комнатной температуре. Окончательный учет результатов производили на 2 - 4 сутки посла постановки • реакции.

Иммуноглсбулиновую фракцию 1гв для приготовления перокеи-дазных конькгатоз из кроличьих и лошадиных чумных гиперимыун-ных сызороток выделяли по методу N. Еэгзгшэ!, V- ЗсШШпг, 1970, с помощь», полиэтиленгямода (ПЗГ-6000).. Дан'этого в 5 мл. иммунной • сыворотки вносили равный объем . 232;. раствора полиэти-. ленгликодя и аидерхивали при комнатной тешературе 20 мин. Затем смесь цан?р::фугир стали при- 8. ООО а. 20 мин. . Осадок расгво-

ряди в первркачальном объеме 0,01 Ы КФБ (рН 7,4). Процедуру переосзддения проводили.дважды ь одинаковых условиях.

Полученную иммуноглобулвдовую фракцию,, содержащую в, основном IgG, »паизозалк при 4°С .против 0,01 U КФБ СрН 7,4) в течение 18 ч с двукратной сменой буфера.

Полученные фракции ^демуноглобулинов, разлитые по адикво-там, хранили в нативном виде при -20 С.

Еуход иммуноробулинов :при виде лени;! этим способом составлял 20 - 30 мг/мл, снижения серологической активности полуценньпс фракций, как правило, не наблюдалось.

Для получения диагностических иммунопероксидазных конь-пгатов в качестве ферментного маркера использоезли лиофнлиги-рованный препарат перокеидагы хрена (ПХ) фирмы "Sigma" с чистотой Rz= 2,0.

Б основу метода конъюгирования пероксидазы с &нтитела>.:и положзн метод P.K-Nakane и A. Kawaai, 1974. Навеску пероксидагы растворяли в 1,0 дистиллированной воды. Активность фермента оценивали по увеличению ОП при 490 нм и по отношению светопог-лащения при 403 нм к поглощению при 280 нм (R2). 403 нм. Для работы отбирали препараты с соотношением экстинкции 403/230 нм равным 0,3 - 0,5. Эти препараты объединяли и хранили по методу, предложенному S. Avrameas, 1S59.

' Постановку твердофазной кммунофгрменткзй реакции (TKDF) проводили в 95-луночных плашках отечественного производства объемом. 100 мкл в соответствии -с "Католическими рекомендациями по определений-АГ чумкого микроба и AT к ним иммунофэрментным ■методом" (Методические .рекомендации по определению антигенов чумного микроба и антител к ним кымукоферментнш методом, Иркутск, 1985).

Учет реакции проводили-визуально или на автоматическом 8 канальном фотометре Títernek líuItiSKan Plus фирмы "Flow Laboratories" (Великобритания) черва 20 - 20 мин после внесе-IÍP субстрста. .

Встречный иммукозлектрофзреа проводили по известному ме-. хору ( Фримель Т., 1087).

В ходе исследований нам удалось разработать полуколичест-)ве$шй метод титрации антител к фибринолизину чумннх микробов.

Метод основан на отмеченной наш идентичности антигенного и ферментного центров молекулы фибринолизина и практически обладает абсолютной специфичностью.

В окончательном варианте разработанная нами реакция имму-ноподааления (иммуноингибированвд, иммунотормоиения) фибрико-лнза (РИФ) проводится еле душим образом: в и-образные луига подистироловых пластин для микретитратора Такачи вносят по 0,025 !/л раствора, содержащего 0,3% хлористого кальция, 0,Е5% хлористого натрия, 0,01% мертиолата натрия, дистиллированную воду (рН 7,2). Затем раститрсвываот исследуемые сыворотки (в двукратной степени разведения) к добавляет в лунки по 0,025 ил раствора, содержащего 2-4 активных дозы (ЕА/мл) препарата $::5рикол:гзина (стандартизацию препарата по его специфической активности проводят при ПОМС131 постановки с препарате:.: нескольких параллельных реакций фкбриколиза, за 1 ЕА/мл принц-»еэт то ¡спгпыальиэе количество фибринолигина, при котором к-м^чается конечный положительный результат РЕ). Пластину встряхивал!:, плотно закрывали и выдерживали 60 мин при кемнатнел температура. За указанное врэ>.'л происходит прочнбе связывание фибринодкзкном антител сыворотки, в результате чего ферменть-тизная активность фибригализина снижается или исчезает. Ззтс м в лунга со смесью добавляли по 0,025 мл 0,3 - 0,6% раствор человеческого фибриногена. Шасткнку повторно встряхивали, закрывали и оставлял!! при комнзткой температуре на 12-2:8 ч (до зледуадэго дня). Параллельно ставили контрольные пробы на активность 1 исследуемого препарата фибркнолизика (реакция фкбрг,-кшза), отсутствие фибринолитической активности у' разводят., л тдкости, способности образовывать фибрин при взаимодействии ¡спользуемого фибриногена с хлористым кальцием, отсутствия кк-■ибирующх СВОЙСТВ у нормальной СЬШОрОТКИ от животного того лдэ и да, от которого были получены экспериментальные сыворотки ¡1 . д. О титре испытуемых сывороток судят по их конечному разви-ению, при котором еще отмечается наличие в лунке сгустка Фис-ина. Наличие или растворение сгустка фибрина устанавливают утем внесения в лунки цветного индикатора .

Иммунологическую активность препаратов и их протектш.-зсть определяли в опытах-на нелинейных ншах весом 18 - 2С г.

которых иммунизировали - однократно подкожно различна,« количествами антигена, - на каждую дозу брали не менее 10 животных, подкожное заражение опытных и контрольных жизотных проводили через 21 день посла ашшкащш 5 ООО м. к. вирулентного штачыа 231 возбудителя чумы выращенного на агаре Хэтткагера в течение 36-48 ч при 23°С. Результаты заражения учитывали в течение 11 дн наблюдения ва животным;:. Полученные результаты подвергал : статистической обработке с вычислением НМД и доверительных интервалов. Токсическую активность препаратов фибринолизина-определяли до результатам наблюдений за иммунизированными белым.I швами. Способность препаратов Сибриколизина стимулировать выработку антител у теплокровных животных определяли в опытах к и кроликах породы шишилла несом 2,5-3,0 кг, которых иммунизировали препарата;.« фибршгадкзина. подкожно, внутривенно, с применением адьшанта Фрэйнда или без адьюванта по разработанной наш схеме.

Излученные результаты исследований при необходимости подвергали статистическому анализу,- используя обсзприяятые методики (Ашарин И. П., Воробьев. А. А., 1062).

■ ШЛУЧЕНШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ К ОВСУЗДЕНИЕ.

Значстелъное внимание при проведении собственных исслед з-ванкй мы уделили сравнительному изучению различных способов извлечения фибрииолизнаа иа микробных клеток, очисти полученных препаратов от; гетерогенных примесей и изучении физико-химических свойств' полученных, препаратов. Было установлено, что фибринолиаин чрезвычайно прочно свяаан с микробной клеткой', возбудителя чумы., -фи культивировании микроорганизма фибрина-лизик не пзреходит в окружающую среду, .что свойственно большинству других Сйкщашшаров чуыкого микроба, хотя а располагается в наружных сдоях клеточной стенки (наружной мембране; микроорганизма. Ш удается извлечь фибринализин из чумных микробов и после иг обработки ацетоном-иди дезинтеграции при резком изменении градиентов давления в Х-прессе, в случае использования и. качестве энстрагентсв воды или растворов хлористого натрия при нейтральном, кислом или щелочном рЕ При этом, ка; показали нашиисследавания, дал» относительно небольшой сдвиг рН. зкстрагента в ту или иную сторону рт нейтрального приводит

к необратимей денатурации фибринолизина, проявляющейся в снижении или полной утрате им специфической активности. Нэ оказались эффективными з налах опытах и попытки водно-солевой зкетракцчи фибрккслигинэ из плеток при повышенной температуре '.60 - 1С0°С), ксторгя окзгывгга на фибрпнелнзик жесткое денг-туриругг-.-о воздействие, указывая на его выраг:нную термолс-бг-лькость (тзбл 1-3).

Ср-.ди испытанных на«: ионных и неионкых детергентов, наиболее чаете используемых в препаративном выделении макромоло-г.уллрньо: ксмпонентоЕ микробной клетки, наименьпей денатураци-озной щтгнвкостью обладали мочевина и дезоксихслат патрия (табл 4).

Однако с исмоою этих веществ удавалось 'извлечь из микробных золоток не белее 10-122 содержащегося в них фибринслизи-ка.. Основная масса его оставалась в водонерастворимом остатке чумных микробов. Несколько повышала выход фибринолизи-на микробных клеток (примерно, до 15-182) примененная нами зпервые ь сочетают! обработка микробов лизоцимом с ЭДТЛ, затем экстрагирование оставшейся бактериальной массы 2,5 М раствором моча в ипы. Интересно, что использование в качестве зг-страгечта додуцилсульфата натрия, который даже в минимальных концентрациях зачетно псвылал экстрагируемость Сбшего белка микробной клетки, относительно фибринолизина оказалось безуспешным в связи с необратимой денатурацией фибринолизина в присутствие ДСН. -

Практически неэффективными оказались также попытки полу-Ч1ггь из чумных микробов солибклизкрованный и активный фкбрчно-лизин ' при использовании таких детергентов, как Brij-5S, Теин-80, Тритон-X 100, таурохолат натрия. Эти вещества существенно не влияли на экстрагируемость белкз кз микробных клеток, ке вызывали заметной денатурации содержащегося в них ф::брино-лизина, но не. способствовали его солюбилизации и выделению из бактерий в экстракт. - В конечном стоге подученные нами в этих исследованиях данные позволили разработать основные критерии выделения фибринолизина из чуиных микробов и частичной его очистки, которое, по-сущгству, начинается с. использования строго определенных условий. культивирования чумньк микробов

Таблица 1.

Влияние экстрагекта на элюцию фибринолизина из чумных микробов.

Экстрагзнт

дистиллированная вода

NN л/п : исследован-: них экстра-: гсгов :

Содержание макромолекулярных компонентов в 7. от исходного сухого веса М.КЛ. (Щм)

Результаты РС ЕА/мг белка

1

2 3

17,0±3,0 5,0±1,0 1,0±0,2

О О О

0,92 раствор NaOl 1 18,0±2,£ 0

2 6,0*1,5 0

3 2,0±0,4 0

2,52 раствор NaCl 1- 20,0±3,0 0

2 4,0±0,8 0

3 0,7+0,2 0

10Z раствор НаС1 1 14,0+2,0 0

i - 2 *3,0±1,0 0

3 0,4±0,1 .0

20Z раствор NaCl 1 15,0Ц,0 0

2 6,0+1,0 0

3 1,5+0,4 0

контроль:

Исходные клетки - 100,0 40-80

Клетки после дву- - 7В,0±2,0 60 - 120

кратной, экстракции 2.5Z раствором NaCl и двукратной экстракции дистиллированной водой

Таблица 2.

Влияние температуры на зкстрагируеыость и 'активность фибринолизина.

Температура экстракции 2,57. раствором NaCl Препарат Фавриколитичаская : активность : ЕА/мг белка (láej

22е С *. Экстракт Остаток клеток 0 64 С 64-128)

60°С * Экстракт Остаток клеток " 0 8 (4-15)

100°С * экстракт Остаток клеток 0 2 (2-4)

100°С ** Экстракт Остаток' клеток 0 8 (4-8)

Примечание: 1) * - время экотралции 30 мнн ** - время экстракции 1 мин 2) концентрация микробных клеток в суспензии 10 ш'/мл.

Таблица 3.

^йри;!ОГ,:т1Г':гс!ЕЛ з^тгвпость чуыкых миксобов, обрабстанкых под давлением..

Прглг.ра ?

робныэ клетки v. контроль)

: ййркнслити-б-злка. мг/мз : - ческая актиз-: кость,

: ЕЛ/МЛ (Ms 85%)

: Удельная фя5-:■ркнолитическая : активность, : ЕА/мг (Ыэ)

15,012,0

54.0 (640-640) 40 (40-4.0)

"Клгтзчьх стенки"

Водно-СОЛ11, экстракт разрушенных тск

11,013,0 5,0+1,0

320 ( 320-640) С (О - 2)

30 ( 30-50)

2ш:дечшг»е: расл1яа!я з активности "клеточных стенок" кзктролй статистически не достоверны, Р>0,05

Таблица 4.

Эксграгиру-гкость ф::'ры.ел1изина кз чумных микробов поверхностно-активными вевествамк. '

йтзргек-

детергента в зг.сгра:с:5, Z

Выход белка в : Удельная фибри-экстракт з % : политическая

к содержании его в микробных клетках

актизпость, ЕА/мг белка

Лсдепклсуль^ст натрия

Грктон Х-1'

1езоксихолат

istpiïh

i343Si2ia

о.п 1,0 2,0 4,0

1.0 2,0 4,0_

0,5 1.0 2,0 •i. О

2,0 4,0 8,0

20,0 30,0 60,0 80,0

10,0 12,0 12,0

10,0 15,0 15,0 15,0

10,0 12,0 15,0

■i/54 2/16 2/16 0/8

0/64 0/64 2/16

8/64 8/64 2/32 0/22

4/64 8/64 8/64

аурохолат атркя

1.0 2.0 4,0

8,0 10,0 10,0

0/64 1/64 1/32

rrj-БВ

2/0 »4,0

10,0 „14,:0 1Б.0

0/48 '0/64 ' Е/ЗЕ

1 : 2 : 3 : 4

твин-ео 0,5 1.0 2,0 • » 1 ООО 0/64 0/64 2/64 '

Контроль раствор №С1 0,9 10,0 0/64

Примечание: активность экстракта/активность экстрагированных, микробных клеток

(26' -23°С, в жидкой высокопитательной .среде с ее пит е не йеной аэрацией). Уже на. этам. зтале микробные клетки освобоэдаится от части водорастворимых компонентов, которые мсгут загрязнять препараты фибринолязкна. Дальнейшее выделение и-очистка фибри-нолизина от водорастворимых фракций-достигается 3 - кратной экстракцией бактерий" водно-солевыми растворами,- дистиллированной водой,, после чего фаСранолизгн извлекается из микробных клеток при помоши.одного раствора мочевины или в сочетании- с предварительным - извлечением фибршюлизина при лиаоциыа

и ЭДГА-. При этом получают солюйилиаированный препарат фибрино-лизна, свободный от микробных клеток (рис. 1).

Нами было однозначно установлено, что для извлечения фиб-ринолшзшга из чумных микробов необходимо использовать годные растворы определенных, поверхностно-активных вещвста (табл 4).

Наш Сыяо установлено, что удаление из раствора фибриноли-зина детергента приводит к переходу препарата а зодонераство-ряыуп форму; с'одаой стороны, эта позволяет- освободить фиори-нодизин от' водорастворимых компонентов простыл их отмыванием водой, сг другой. делает практически невозможным -дальнейшую его очистку от водокерастворишх примесей, которые, как показали гель-хроматографическиэ и злвктрофсретическиэ опыты, окязывн-югел прочка связанными- с фиоринолизинои. и по данным -диск-электрофореза обладает высстш уровнем (молекулярной гетерогенности, - свойственным белкам наружной мембраны (Ш) клетки

Еыразцвание клеток

чумного, микроба *

Отмывание от

питательной среды *

Высушивание чумных микробов ацетоном

Удаление из бактериальной

массы водорастворимых белков ■ *

Экстракция микробных клеток раствором мсчевкки I

Удаление керастворившихся

ми;:ро5яых клеток из акстпакта +

Сракционкроваяие экстракта сульфатом аммслия I

Получение препарата фпСринолпзина

СолгаЗклизгция и консервация препарата фкбрияслизина

Рисунок 1. Этапы пслтчента солабклизироЕзякого препарата фкорино лизина.

¡умного микроба, что било установлено нами з параллельных ¡сследсваккях препаратов НМ.

Для получения солнйилизированных препаратов фибринолизива >ыли проведены испытания различных поверхностно-активных земств . Практически единственной пригодной для этих це^ей оралась мочевина, в растворах которой фнбршюлизия сохранял астворимость и специфическую активность в течение нескольких есг.цеЕ. В солаЗилизировачкых препаратах фибринолизина уста-з зле но присутствие 3-5 антигенов и 12 -.16 ыакромолекуляр-еле компонентов белковой природы. При сравнении различных мо~ эдов разделения,биополимеров (гель-хроматография,' ионообмен-зя хроматография, электрофорез, ,фракционирование сульфатом шония и т.. д.) наиболее аффективными в наших опьтах оказался зоточный электрофорез , позволиапий уменьшит! содержание ге' ¡рогепных примесей на б - 8 компонентов и пилучить увеличение I порядок шстивности очищенных препаратов фибриноЛизина, име-' 51>; преимущественно Оелкозую 'природу. Необходимо занетить, ■о исходые препараты также состоят преимущественно иг белка . 5±0,57.) и липвда (2,5+0,51.!. В белке идентифицировано 9 ами-кислот (цистеин, серин, треонин, тирозин, валин, гистадин.

аланик, мотионин, глицин.), в полисахариде 4 сахара (глюкоза, ксилоза, раулоза, галактоза) (Табл. Б).

-Из этих давних можно вывести заключение, что фибрине лизин имеет преимущественно белковую структуру. Еходящне в состав препаратов ыонссахра различались по своему составу в зависимости от способа извлечения фибриколизика из чумных микробов ("мочевннног о" и "лизоцшжого") в обоих случаях • общи.м для препаратов бшш рамкоза и глюкоза, по-видпмему, они а образуют тот полисахаридный компонент, который, возможно, входит в молекулярную структуру фибрпполизика чумных микробов. Неясна роль, которую играет, в препаратах фибрянолкзина липад. Не исключено, что именно с ним связаны гидрофобные свойства изучаемого наш вещества.

Таблица 5.

Результаты изучения химического состава препаратов фибрина лизина.

Еесрство.

Еелок-: Пслисаха-(.Щм) : рид (Ы±ы)

Липид : НК : Аминокис-: Мэносаха-(М±м) : С !.Ьм] : лоты : риды

Содержа--нке

Е5±5,0 4,5±0,5 2,5±0,5 следы

Цис., Гис., Сер. ,Гли., Тре.'.Ала., Ткр. ,Ыет., Езд., Г 1

глюкоза, ксилоза, рамноза, галактоза

Из результатов нагих опытов с гель-хроыатографией солхби-лизированных_препаратов следовало, что фибринолизин в изучаемом состоянии _имеет высокую молекулярную массу порядка нескольких миллионов - дзльтон. - Дезинтеграция препарата доде-цилсульфатом натрия приводила к его распаду на значительное количество фрагментов с широким спектром молекулярных масс. Идентифицировать среди этих фрагментов субъядияицы, специфичные для фиОринолизина, нем удалось, когда мы применили новта методику.получения водорастьоримой формы фибринолизиаа, которая стала возможной в результате создания методами, генной инженерии штамма килечной палочки К8С2 рЕК-4, несушей плаз мзду, кодирующую фибринолизин чумного 'микроба СПопов, Булгакова и

др., 1987). Важной осбенностью этого штамма оказалась его способность синтезировать и секретировать в культуральную жидкость водорастворимую форму фибринолизина Сизико-хиыичэские и иммунохкмические исследования подученных нами препаратов показали, что они имеют моноантигенный состав, и состоят из двух мажорных белковых субъединиц (А и В) с ЙГ 0,56 и 0,67 и молекулярной мзссой соответствующей 35 и 31 кПа Интересно, что в отсутствие ДСН те хг препараты в диск-электрофорезе образовывали одну зеку, з которой гистохимически, помимо белка, идентифицирован полисахарид. :

Препараты фибринолизина обладает, по-видимому, цито-токсичностью, могут в определенных дозах вызывать гибель белых мызей, а у зылкваих животных стимулирует- развитие иммунного состояния, предохраняющего от смертельного заражения чумой (Табл. 5). *

Таблица 6.

Результаты изучения протекгиввости и цитотоксичности препаратов фибринолизина.

Иммунизирую-: Результаты подкожного заражения (5x10 м.кл. виру-цзя доза, : лентнего втамма 231

мкг/0,2 мл :-------------------------------------------------

: Препарат фибринолизина : Препарат фибринолизина : иг 28°С культуры : из 37°С культуры

500 : 7/10 : 10/10

100 : 5/10 : 8/10

20 : 4/10 : 5/10.

4 : 2/10 : 5/10 '

0,8 : 1/10 : 3/10 - (конт- : . :

роль) : 0/10 : 0/10

1г ИВД ±9 : 2,279±0,5 : 1,Э19±0,5

ВД +П : 190,1±3,2 : 82,Э9±3,2

Примечание: павшие/всего.

Токсичность препаратов, судя по результату исследований, очевидно, не связана с фибринолизином, а зависит от состава примесей, которые попадают в тех или иных количествах я препарат при его выделении из клеток чумного микроба, ввыращенных в различных условиях культивирования.

Полученные нами сведения о свойствах фибринолизина возбу-

дителя чумы легли в основу разработанных нами микрометодов определения фибрииолиткчешмй активности фиЗршолизиаа и тятра-ции гуморальных антифиОршгализхяовых иммуноглобулинов и имму-нохимичесюто определения фибринолиаина в клетках чумкого микроба при помоги реакции иммупзподазлешм фибриколизз (PUS). Эп методы, в частности, легли в основу способа экспресс-отбора полуфабрикатов, используемых в производстве ВДЧЛ. В отличие от прикзняашх в настоящее время методик, наш способ позволяет провести в считанные часы анализ препаратов на содержание в них антифйбргдодивпка ("гомологичных антител) и определить уровень их специфической активности, что представляется особенно существенны:.! в изготовлении иммутюлщыэнисцентного диагностику-, ма. Немаловажную рель chocgG титрацик антифибринолизина и отбора наиболее аетшзных ааткфийриколитических гкперпммунны;: сывороток сыграл к при- изучении нами принципиальной еозмозиссти конструирования. универсального ю/муксферданткого коиьагата для индикации чумных к^кробсв в K'ïA Ене зависимости от условий их культнвкрозаша

ВЫВОДЫ.

1. Пэхазаяа, что сйбрияолкзкк ссзбтдягагя чуад эдекгичая вкдоспоцпфичэскоку поз?рхнаст:ю-сок£?::ч£!с:-:см/ антигену этого вида бактерий.

2. Разработаны или усовершенствованы способы извлечен;:;! из микробных клеток, сслкйкдизацкк и очистки препаратов Фибри-колгакка возбудителя чумы.

3. Установлено, что препараты фибринелнзииа из чумных микробов обладает высоким уровнем гвдюфоОноете, нмзпг сгонную молекулярную - и антигенную какромолэкулярную структуру, химический состав которой представлен преимущественно протеинами и в относительно небольших количествах полисахаридом и липидом.

4. 3 спш'ах с препаратами фкбринолизина, выделенными из штамма килечкой палочки со встроенной плазмидой пестищшоген-ности-, показана гидрофильность фкбринолизина, моноантигенный состав и наличие , в его молекуле двух основных еубъединиц с молекулярной массой 25 и 31 kDa.

3. Разработаны экспресс-микром&тоди определения фибрино-лизина в клетках чумного микроба, антифибринолизина ( г о уд ло-гичних антител; ь иммунных.-.гаягисывороиах, отбора качественных

- 23 -

полуфабрикатов для производства ЗДЧН.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ 1Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Разработка препаративных процессов получения физиологически зятееных очжцэккых препаратов фибринолизика возбудителя чумы. //1 Есесоаз. симпозиум по препаративной хроматограф:-® физиологически активных_ вешэств на полимерных сорбентах 11-13 окт. 19В8 г. Тез. докл. - Ленинград, 1938.- С. 45. (соавт. а И. Вейнблат, ЕЕКорсуков).

2. .Выделение и физико-химическая характеристика препаратов фийринолизина возбудителя чумы.//Шфобиол. .и Ойохим. особо опасных инф. - Саратов, 1988. '--С. 37-39 (соавт. Взйкблат В.И., Кронгауз И.Е, Лопаткин аЕ).

а Иммунобиологические'" свойства .препаратов фибринолизина чуиного микроба //Виотехгол., иммунол., бисхим. особо опасных инф. - Саратов, 1989.- С. 14-1В (соаат. ВеЛнблат З.Е., Вэренков 11 С., Лопаткин О. Е, Кронгауз И..Е , Дальвадянц С. Ы., Шшин А. Ю., Коровкин С. А.).

4. Выделение и очистка Цмбринолигина возбудителя чумы //Микробиол., биохим. и специфическая профилакт. карантинных инф.- Саратов, 1990. - а 44-48 (соавт. Вейнблат ЬИ., Булгакова Е Г., Шпов 10. А.). . ■' ' <